10. BIOSENZORY
Přednášející:
Prof. Ing. Miroslav Husák, CSc.
Biosenzor – rozměry a trh
Katedra mikroelektroniky
ČVUT FEL Praha
tel.: 2-2435 2267
[email protected]
http://micro.feld.cvut.cz
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
1
Trh s biosenzory v USA
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
2
S jakými rozměry
biosenzor pracuje
3
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
4
1. Biosenzor - úvod
‰ Biosenzory patří do skupiny chemických senzorů
‰ Využívají vysoké citlivosti a selektivity aktivních biologických látek
‰ Komunikace mezi biologickými organismy je založena na přenosu chemických
signálů
‰ Velké množství „bio – rozpoznávacích“ procesů Bvelké množství biosenzorů, např.:
– Senzory biologicko-chemické
– Anorganické
– Buněčné
– Tkáňové
– Obsahující organismy
‰ Další biosenzory na principech:
– chemicky citlivých polovodičů
– optických vláken
– Termistorů
– SAW
– piezoelektrických jevech
– a dalších.
Obecné schéma biosenzoru –
základní součásti
Historie:
První moderní biosenzor byl popsán v práci Clarka a Lyonse - vytvořili první
elektrodu s enzymy glukózy a elektrochemicky vázaným kyslíkem.
5
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Biosenzor jako komplexní systém
membrána
(biologicky
citlivá l.)
biologicky
citlivé
částice
senzor
(převodník
na elektrický
signál)
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
zpracování
signálu
6
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Obecné schéma biosenzoru
membrána konverze
substrátu na
produkt
(biologicky
citlivá l.)
zobrazení
7
senzor
(převodník
na
elektrický
signál)
Zesilovač
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
zpracování
signálu
zobrazení
8
Obecné schéma biosenzoru
Obecné schéma biosenzoru
A
-
Princip :
Chemický
+
Biodetekce
Optický
Výstupní signál
Tepelný
A
atd.
+
-
A
A
+
Biodetekční
Biodetekční
buněčná
membrána
membrána
Převodník
Převodník
2 základní části biosenzoru:
Biologicky citlivá „membrána“ - obsahuje biologicky citlivé částice, které
rozpoznají analyzovanou molekulu na základě vzájemné reakce, specifické
adsorbce nebo na základě dalších chemických či fyzikálních procesů.
Převodník na elektrický signál – převádí signál z membrány (chemický změna koncentrace, fyzikální, optický či tepelný - teplo uvolněné při reakci)
na výstupní signál většinou elektrický.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
9
10
2. Biologická část biosenzoru
(buněčná membrána)
Bio-rozpoznávací procesy
Tvarově-specifické-slučování. - Rozpoznávání molekul na základě
jejich tvaru.
Princip této metody je fakt, že vazbu tvoří molekuly, které mají
komplementární tvar, tj. chceme-li v prostředí detekovat (analyzovat )
určitou molekulu , použijeme ve snímací membráně molekuly tvarově
komplementární.
Látky detekovatelné pomocí biosenzorů
Biosenzory lze využít k detekci téměř všech typů látek a reakcí
probíhajících v biologických systémech.
2 základní bio-rozpoznávací procesy:
Slučovací – reakcí bioaktivní a analyzované molekuly se vytvoří
velmi silná vazba.
Převodník: vyhodnocuje přítomnost a množství párů tvořených
receptorovou a analyzovanou molekulou.
Metabolické - reakcí bioaktivní a analyzované molekuly vznikne
jiná molekula.
Převodník: vyhodnocuje přítomnost těchto molekul, vedlejších
produktů nebo teplo vzniklé při reakci.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Příklady analyzovaných látek biosenzory
Analyzovaná látka
Metabolické látky
Enzymy
Ligands
Antigeny a protilátky
Nukleové kyseliny
11
Příklad
Kyslík, metan, etanol a další
Glukóza, penicilin, močovina
Hormony, feromony, toxiny
Lidské Ig.
DNA, RNA
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
12
2.1 Detekční látky užívané v biosenzorech
2.2 Detekční látky užívané v biosenzorech
Detekční látky – velmi široký rozsah (od jednotlivých molekul
až po celé organismy).
Základních typů biologicky citlivých látek, převodních principů a příklady
převodníků
Biologické látky
Organismus
Tkáň
Buňka
Organická membrána
Enzym
Typ převodu
Elektrochemický:
- potenciometrický
- proudový
- impedanční
Optický
Receptor
Kalorimetrický
(termální)
Akustický (hmotový)
Protilátky
Nukleové kyseliny
Příklad převodníku
ISFET nebo
mikroelektrody
Luminiscence +
optická vlákny
Termistor
Povrchová nebo
objemová akustická
vlna
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
13
Poznámka k Tab. 2:
‰ Látky uvedené v tab. 2 mají prostorově větší strukturu
než detekované molekuly.
‰ Obsahují kromě vlastních bio-detekčních molekul ještě
látky vhodné k jejich prostorové fixaci (imobilizaci ) v
oblasti snímací membrány.
‰ Vytvářejí se tak buněčné a vícebuněčné struktury, které
tvoří biologickou část biosenzoru.
‰ V těchto strukturách probíhají chemické reakce s
detekovanými molekulami.
‰ Produkty těchto reakcí jsou vstupním signálem pro
převodník.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
14
Detekční látky užívané v biosenzorech
Dva základní typy chemických
reakcí využívaných v
biosenzorech (na buněčných
membránách)
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
15
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
16
adt a) Reakce antigen-protilátka
2.3 Základní chemické reakce probíhající v
biosystémech
Antigeny jsou vysokomolekulární látky bílkovinné povahy, které po
podávání vyvolávají v organismu tvorbu specifických protilátek
(očkování).
Nejdůležitější vlastností je schopnost reagovat pouze s těmi
protilátkami, které vznikají po jejich podání. Z toho také plyne vysoká
selektivita biosenzoru při detekci těchto látek.
Využití této reakce:
a) Jak pro detekci protilátek, kdy detekčními molekulami v biosenzoru
jsou antigeny,
b) tak pro detekci antigenů přičemž biosenzor obsahuje protilátky.
Základní reakční rovnice:
Biosenzory využívají chemických reakcí k detekci určitých
molekul v analyzovaných látkách.
Detekovaná molekula reaguje s detekční, biologicky aktivní
molekulou biosenzoru
2 základní typy reakcí :
a)
b)
antigen ⇔ protilátka
antigen ⇔ protilátka
enzym ⇔ substrát
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
17
Vazba antigen-protilátka
18
Enzymy - jsou jednoduché nebo složené bílkoviny, které v
organismu katalyzují a usměrňují metabolické reakce.
Substrát - je označení pro druhou látku vstupující do reakce s
enzymem.
Katalytická reakce – je základní chemická reakce enzymu se
substrátem a lze ji zapsat:
k1
k2
enzym ⇔ substrát
S + E ↔ E.S → P + E
k-1
TOT označuje celkové množství molekul (v tomto případě protilátek),
eq označuje rovnovážnou koncentraci molekul.
Poznámka:
Pro určení koncentrace detekovaných molekul (např. protilátek ) je
tedy nutné zachovat konstantní koncentraci detekčních molekul
(zde antigenů). Toho lze dosáhnout fixací molekul antigenů v
oblasti membrány.
Převodník pak detekuje množství komplexu antigen-protilátka.
S značí substrát, E enzym, E.S komplex enzym-substrát, P produkt
reakce, k1, k-1, k2 reakční konstanty.
Vztah mezi koncentrací detekčních molekul v detekční membráně
(zde antigenů) a koncentrací komplexu protilátka antigen:
Enzym způsobuje přeměnu substrátu, přičemž na konci procesu je
sám nezměněn a může se zapojit do dalších reakcí – viz rovnice.
[Ag] eq
_ . [Ab]TOT
(1/Ka) + [Ag]eq
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
adt b) Katalytická reakce enzym-substrát
Princip určení koncentrace detekovaných molekul:
[Ab]TOT = [Ag]eq + [Ab.Ag] eq
[Ab.Ag]eq =
ka
Ab + Ag ↔ Ab.Ag
Ka = ka = [ Ab . Ag ]
kd
kd
[Ab].[Ag]
Ab, Ag látky do reakce vstupující tj. protilátky resp. Antigeny, ka slučovací reakční
poměr, kd.rozštěpovací reakční poměr, ka.rovnovážná konstanta, [Ab], [Ag]
koncentrace protilátek resp. Antigenů, [Ab.Ag].koncentrace komplexu protilátka-antigen
Poznámka:
U živých organismů dochází k opotřebování enzymů a je nutné je
doplňovat.
19
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
20
2.4 Detekční buněčná membrána
(umělá biocitlivá struktura)
Detekční buněčná membrána
Detekční buněčná membrána – uměle vytvořená struktura biologických materiálů
k napodobení procesů vznikajících v buněčné membráně.
Jeden z nejsložitějších systémů v biosenzoru.
Iontové kanály - receptorové detekční molekuly v buňce dokáží rozpoznat jiné
molekuly, přitom dojde ke změně permeability membrány. Vzniká iontový kanál,
který může být ovládán buď přímo receptory, nebo nepřímo s využitím proteinů.
Buněčná membrána je tvořena bílkovinami umístěnými v dvojvrstvě fosfidických
molekul (BLM – bilayer lipid membranes – viz. obr).
Příčná vodivost je pro ionty velmi malá, bílkoviny mohou i nemusí přemostit tuto
dvojvrstvu fosficidů.
Princip detekce - jeden z používaných je, že reakcí molekul bílkovin s detekovanými
molekulami dojde ke vzniku a přerozdělení iontů, což má za následek vznik
potenciálu napříč membránou. Hodnota tohoto potenciálu se obvykle pohybuje v
rozmezí 40 - 90 mV.
Chemický zesilovač signálu - mnoho biochemických procesů se chová jako
„chemický zesilovač signálu“ se ziskem i > 1000.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
21
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
22
2.5 Fixace biologicky citlivých elementů, tj.
detekčních molekul
Fixace - udržení biologicky citlivých detekčních molekul na povrchu
převodníku
(klíčový faktor, ovlivňující citlivost a životnost biosenzoru).
Požadavky kladené na fixaci:
•Připoutat biologicky aktivní materiál (detekční molekuly) na povrchu
převodníku a zabránit jejich pronikání ven mimo oblast detekční membrány
po celou dobu života biosenzoru
•Umožnit kontakt analyzovaného roztoku s detekčními molekulami.
•Umožnit i zpětnou difúzi molekul analyzovaného roztoku ven z biosenzoru
• Nesmí denaturovat biologicky aktivní materiál (detekční molekuly) –
materiál je většinou tvořen či obsahuje bílkoviny, které jsou velice citlivé na
změnou pH, mechanické poničení, teplo, chlad, chemické látky).
Poznámka: Denaturace je změna struktury bílkovin, bílkoviny tak ztrácejí
své původní biologické vlastnosti
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Typy fyzické a chemické
fixace biologicky aktivních
látek na detekční buněčné
membráně
23
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
24
Základní typy fixace bioaktivních elementů
Základní typy fixačních technik
Polopropustná membrána
(selektivně propustná)
I) Fixace fyzickým držením - spočívá v separaci biologicky aktivní detekční látky
od analyzovaného roztoku separační vrstvou na povrchu biosenzoru.
•Vrstva je propustná pro analyzovaný roztok oběma směry,
• pro biologicky aktivní detekční látku se ale chová jako nepropustná stěna.
Používané typy:
a) membránová fixace (pomocí polopropustné membrány)
b) maticová fixace
membrána
Převodník
Převodník
a) zachycení membránou
II) Fixace chemickou vazbou –
•jedná se buď o přímé připojení biologicky aktivních detekčních molekul k povrchu
převodníku
•nebo o chemické navázání spodní vrstvy detekční membrány a povrchu
převodníku.
c) adsorpcí do materiálu
membrány
Převodník
Nejpoužívanější typy:
c) adsorbce
d) kovalentní vazba
Převodník
b) zachycení v membránových
maticových pastích
d) kovalentní vazbou
Poznámka: B označuje bioaktivní molekuly
25
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
adt b) Fixace v membránových maticových
pastích
adt a) Fixace polopropustnou membránou
Princip - použití selektivně propustné membrány, umístěné kolem
biologicky aktivního materiálu obsahujícího detekční molekuly.
Membrána umožní difúzi analyzované látky k detekčním
molekulám a zároveň dovolí výstup analyzované látky zpět ven z
biosenzoru.
Současně membrána nedovolí detekčním molekulám jejich difúzi
ven z biosenzoru.
Materiál membrány - porézní materiál s dostatečně velkými póry
aby jimi prošly částice zkoumaného roztoku (detekovaná
molekula) dovnitř, a zároveň malými pro biologicky aktivní materiál
(detekční molekuly), aby se nedostaly ven.
Obvykle se selektivní membrány vyrábějí z polymerů, polyamidů
nebo polyester sulfonů.
Selektivně propustná membrána
B
B
B
B
B
B
B
Princip - použití porézního objemového materiálu na povrchu
převodníku biosenzoru. V materiálu jsou rovnoměrně maticově
rozmístěny a drženy biologicky aktivní detekční molekuly (což
mohou být enzymy, antigeny nebo celé buňky)
Materiál - Pro velikosti pórů tohoto materiálu platí stejná pravidla
jako u selektivní membrány v předchozím případě. Materiál musí
umožňovat difůzi zplodin, vznikajících při reakcích.
Materiálem je obvykle porézní gel, přírodní materiály popř.
netoxické syntetické materiály.
Materiál nesmí být toxický vůči bioaktivní detekční látce, ani
produkovat škodliviny při polymerizaci.
B
B
Převodník
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
26
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
B
B
B
B
B
B
B
Převodník
27
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
28
Fixace adsorpcí
adt c) Fixace adsorpcí
Fixační vazby s různými silami
Nejednotnost v mechanizmech vazby je dána strukturou
biologicky aktivních detekčních molekul. Detekční molekula je
často tvořena velkým komplexem rozdílných částic jako např.
bílkovin, karbohydrátů apod.. To je důvodem, proč je každá část
detekční molekuly vázána k převodníku jinou silou.
Adsorbce – označuje proces hromadění molekul jedné látky na
povrchu druhé.
Realizace - povrch převodníku biosenzoru je po určitou dobu
ponořen v roztoku s bioaktivní látkou. Po vyjmutí a omytí od
zbytků roztoku je biosenzor realizovaný.
Mechanismy fixace - Biologicky aktivní detekční molekuly jsou na
povrchu převodníku drženy kombinací Van der Wallsových sil,
hydroponických sil a iontové vazby.
Výhoda
•Jednoduchost
•síly, které vážou detekční molekuly k povrchu převodníku jsou
relativně malé > nedochází ke změně tvaru molekul (mohlo by
ovlivnit jejich bioaktivní detekční funkce).
Bioaktivní detekční molekuly
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Membrána
Nevýhody
•síla vazby je silně závislá na teplotě, koncentraci analyzované
látky , pH apod.
•Je obtížné při výrobě určit jaké množství bioaktivních detekčních
molekul se skutečně na povrchu převodníku zachytí.
Převodník
29
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
adt d) Fixace kovalentní vazbou
B
B
B
B
Výhody
•Detekční molekuly bioaktivního materiálu jsou přímo na povrchu
převodníku > zkracuje se časová odezva biosenzoru (odpadá
difúze analyzované látky do fixační struktury, jak je tomu u metod
fyzického držení).
•Vazba je silnější > je i delší životnost biosenzoru.
Bioaktivní detekční molekuly
B
B
B
B
Hlavní nevýhoda
Vazba je mnohdy natolik silná, > že mění její prostorové
uspořádání, tím se molekule mění i její chemické vlastnosti a
může dojít částečné nebo úplné ztrátě schopnosti detekovat.
B
Převodník
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
30
Fixace kovalentní vazbou
Kovalentní vazba - je silnější vazbou než adsorbce, umožňuje
trvalejší vazbu mezi detekčními molekulami a povrchem
převodníku.
Povrch převodníku musí v tomto případě obsahovat molekuly
schopné vytvořit kovalentní vazbu s detekčními molekulami.
Kovalentní vazby
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
31
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
32
2.6 Transport látek v biosenzorech
Biosenzor je vlastně bioreaktor spojený s převodníkem.
Transport látek v biosenzorech ovlivňuje funkci biosenzoru.
Typy transportu v biosenzorech:
• transport analyzované látky k membráně
• transport produktů reakce k převodníku
• transport analyzované látky a vedlejších produktů ven z
biosenzoru
Základních fyzikální principy transportu :
• Difúze
• Proudění
• Migrace
Poznámka:
Migrace částic se většinou zanedbává, její přínos k celkovému
proudění látky je zanedbatelný.
Proudění analyzované látky je zajišťováno jinými způsoby než
samotným biosenzorem.
Základní fyzikální princip
transportu látek
v biosenzorech
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
33
3. Principy snímání reakcí na bioaktivních
elementech - převodníky
Difúze
Difúze - nejdůležitější princip transportu látek v biosenzorech.
Uplatňuje se při prostupu analyzované látky snímací membránou
oběma směry (tok částic z jednoho prostředí do druhého).
Je popsána Fickovým difuzním zákonem
j(x , t) = - D . d c( x , t )
dx
j(x,t) - tok částic plochou, c(x,t) – koncentrace, D - konstanta
úměrnosti, označovaná jako difúzní koeficient.
Difúze je přímo úměrná gradientu koncentrace analyzovaných
molekul, který je největší v místě styku analyzované látky a
biologicky aktivního materiálu na povrchu biosenzoru.
Velikost zpoždění resp. časové odezvy biosenzoru je právě
závislá na rychlosti difúze analyzované látky do detekční
membrány.
Zmenšení doby časové odezvy - tenčí membrány (doba difúze je
přímo úměrná tloušťce membrány).
Citlivé biosenzory - je nutná tlustá detekční membrána, protože
tloušťka membrány je dána počtem detekčních molekul.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
34
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Převodní principy biologické detekční reakce na měřitelný signál
V biosenzorech se používá mnoho metod pro převod signálu z biologické
snímací membrány na zpracovatelný signál
Neexistuje ideální metoda snímání, která by byla ideální pro všechny
způsoby biorozpoznávacích procesů.
Základní používané typy převodu:
1) Elektrochemický
a) Potenciometrický (potenciálový, napěťový)
b) Amperometrický (proudový)
c) Impedometrický (impedanční)
2) Optický
3) Tepelný
4) Rezonanční
Příklad
ISFET potenciometrický senzor je vhodný jako převodník pro enzymsubstrát reakci, naproti tomu nevhodný pro antibody-antigen absorpční
rozpoznávání.
A
Princip :
-
Chemický
Biodetekce
+
Optický
Výstupní signál
Tepelný
A
atd.
-
+
-
A
A
+
35
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
BBiodetekční
iode tek ční
buněč
ná
membrána
membrá
na
Převodník
Převodní
k
36
3.1 Elektrochemický převod signálu
•
Elektrochemický princip převodu biochemické detekční
reakce na elektrickou veličinu
•
Signály získané měřením pomocí tohoto principu z biologicky
rozpoznávací reakce mohou být přímo zpracovávány a
použity k vyhodnocení biologického systému
•
„elektrikářské“ metody
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
37
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
38
Potenciometrický princip převodu
3.1.1 Potenciometrický princip převodu
Nerstův vztah určuje napětí napříč buňkou
Princip převodu - je založen na měření napětí napříč buňkou,
která obsahuje biologicky aktivní detekční molekuly
U = U0 + R.T . ln ( aOx)
n .F
aRe
(bezproudové měření rozdílového potenciálu mezi měřicí a referenční elektrodou,
jejíž potenciál na styku s roztokem elektrolytu je nezávislý na koncentraci iontů)
U0 - příčné napětí na buňce bez přiložení analyzované látky, R - plynová
konstanta, T - termodynamická teplota, F - Faradayova konstanta, Ox,Re
- aktivity oxidované resp. redukované formy (za normálního stavu aOx =
aRe).
Definice měřeného napětí - je definováno jako potenciální rozdíl pracovní
elektrody s biologicky aktivními detekčními molekulami proti referenční elektrodě
Referenční elektroda - má konstantní potenciál
Ideální případ - buňkou neteče žádný proud a elektrody jsou v termodynamické
rovnováze.
Nevýhoda – vysoká citlivost na šum.
Detekční buňkou neprotéká téměř žádný el. proud, systém má vysokou
vnitřní impedanci. Zesilovač příčného napětí na buňce bude muset mít
proto vysokou vstupní impedanci - vysoká citlivost na šum.
(nutné používat speciální elektrody, stíněné kabely...)
Oxidačně redukční reakce – tvoří základ potenciometrického principu převodu i
principů dalších:
Ox + n.e ↔ Re
Ox - částice v oxidované formě, Re - částice v redukované formě, e - náboj
elektronu, n - počet elektronů v reakci
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Princip potenciometrického
převodu biochemické veličiny
39
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
40
Potenciometrický princip převodu
Typické potenciální senzorové elektrody
ISE (iontová selektivní elektroda)
ISFET (ion-selektive field-effect transistor). Výhodou ISFETu je impedanční
přizpůsobení přímo na čipu (převod do proudového režimu), takže výstupní
signál je méně náchylný šumu.
ESFET (Enzyme Field-Effect Transistor). Je nutná konstantní teplota, pH a
iontová koncentrace během měření.
Potenciometrický princip převodu
Příklad - potenciometrický biosenzor pro detekci v plynech
Fixace detekčních molekul
•pro roztoky - používají se všechny 4 uvedené typy fixací
•pro plyny - nejčastěji se používá fixace pomocí selektivní membrány.
Iontová selektivní elektroda
Měřicí rozsah - obecně 0,00001 až 0,1 mol / l.
Stabilita - řádově týdny až měsíce.
Vrstva enzymů
Příklady – potenciometrické biosenzory jsou vyráběny pro detekci
sledovaných molekul jak v roztocích tak též v plynech (např. čpavek, moč,
glukóza, aminokyseliny).
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Dialyzační membrána
41
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
42
Příklady polovodičových biosenzorů
Polovodičové senzory
•Rychlý rozvoj (nízká cena, a relativní přesnost)
•Technologie unipolárních tranzistorů MOSFET
•Modifikované struktury MOS
MOSFET tranzistor
(Metal Oxid Semiconductor Field Effect Transistor)
Struktura kov-izolant-kov (SiO2, TiO2 nebo ZnO)
Příčným elektrickým polem řídí vodivost kanálu v substrátu mezi
elektrodami (kolektorem a emitorem)
Elektrické pole je dáno potenciálním rozdílem mezi hradlem a
substrátem.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Princip činnosti
biochemického FET
(CHEMFET),
co to je ISFET
43
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
44
Příkl. - senzory pro vyhodnocování H2
CHEMFET senzory
CHEMFET (Chemically Sensitive Field Effect Tranzistor)
Řízení hradla - elektrickou dvojvrstvou na rozhraní kov-polovodič
v závislosti na absorpci některých plynů.
Absorpční kov hradla - nejčastěji Pd (citlivé na vodík a na plyny,
z nichž je možné vodík odštěpit (H2, H2S, NH3, aj).
Princip činnosti - molekuly H2 se na povrchu hradla rozkládají,
disociované atomy se absorbují a dále difundují až na rozhraní
kov-oxid. Zde se vytváří dipólová vrstva, která ovlivní vodivosti
kanálu FET struktury.
Chemické katalytické reakce na Pb vrstvě jsou ovlivňované i
oxidačními plyny, proto lze senzory používat i pro detekci O 2, Cl2
nebo při vyšší teplotě i pro redukční CO ve směsích s H2.
Příklad – měření množství H2 (2 typy senzorů)
a) MOS kondenzátor - k vyhodnocení používá C resp. U při
konstantním napětí resp. kapacitě.
b) CHEMFET - vyhodnocuje se posuv charakteristiky Ic = f (UGE)
při Prof.Ing.Miroslav
UCE = konst.
Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
a) MOS kondenzátor
b) CHEMFET
45
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
46
ISFET senzory
CHEMFET senzory
(Ion Sensitive FET)
Hradlová oblast – je vytvořená na přechodu elektrolyt - iontově
citlivá vrstva (ve vrstvě dochází k elektrochemické reakci
měřených iontů)
Referenční elektroda - vložena spolu se senzorem do elektrolytu
Citlivá vrstva hradla – volbou vhodného materiálu lze dosáhnout
selektivity na určitý iont nebo molekulu.
Selektivitu lze dále zlepšovat nanesením selektivně propustné
membrány, která propouští k vrstvě oxidů pouze vybraný druh
iontů (Na+, Ca2+, K+, Cl-, NH4+, NO3-).
Nejčastější aplikací ISFET senzorů je senzor pH s iontově citlivou
vrstvou z SiO2, nebo Ta2O5.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
47
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
48
Struktura senzoru ISFET
Co to je REFET, IMFET
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
49
REFET senzory
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
50
IMFET senzory
(Reference FET)
(Immuno FET)
Modifikovaný senzor ISFET
Oxid na povrchu hradlové oblasti je upraven tak, aby byla
maximálně potlačena citlivost na pH.
Docíleno pomocí iontové implantace do oxidu nebo přidáním krycí
vrstvy (např. Parylen).
ISFET s přizpůsobeným povrchem hradlové oblasti pro sledování
množství protilátek a antigenů v měřené látce.
Protilátky a antigeny jsou absorbovány nebo kovalentně vázány
na povrch IMFETu.
Posuv prahového napětí tranzistoru - je způsobeno reakcí
s antigeny nebo protilátkami
Použití - například jako referenční ISFET v diferenciálních
měřicích obvodech.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
51
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
52
BIOFET senzory
Chemický konvertor nahrazen biochemickým nebo tzv.
bioreaktorem.
Bioreaktor obsahuje různé druhy biologicky aktivních látek, včetně
bakterií, celých buněk a živých tkání.
Bioreaktor si lze představit jako biologický receptor, který může
velice selektivně monitorovat chemické nebo biochemické látky.
Základní princip
amperometrického převodu
biochemické veličiny
U tohoto typu senzoru se předpokládá veliký rozvoj
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
53
3.1.2 Amperometrický princip převodu
54
První „generace“s ampérometrickým převodem
Princip - ampérometrické biosenzory měří el. proud procházející
snímací elektrodou, která je pokryta biologicky aktivní detekční
látkou. Velikost procházejícího proudu je závislá na koncentraci
detekovaných molekul.
Princip je založen na oxidaci a redukci biologicky aktivních
materiálů (většinou enzym) na povrchu elektrody.
Nosiče náboje vzniklé touto reakcí jsou snímací elektrodě předány
buď přímo nebo nepřímo pomocí další látky tzv. prostředníku.
1.Generace – využívá se převodu biologických reakcí na oxidaci a
redukci u povrchu elektrochemické elektrody.
Základem je enzymaticky - katalycká reakce.
Princip: Biologicky aktivní materiál (enzym) převede analyzovanou
molekulu přímo na produkt, který může v oxidačně-redukční
reakci odevzdat do biologicky aktivní elektrody el. náboj.
Nevýhoda – existuje málo materiálů, jejichž produkty mohou přímo
redukovat (např. kyslík, hydrogen a hydrogen peroxid)
Příklad - Clarkova kyslíková elektroda která měří množství
spotřebovaného kyslíku při reakci s glukózou.
Fixace - využívá všech čtyř typů fixace detekčních molekul.
Navíc se většinou používá ochranná membrána kolem bioaktivní
vrstvy, která zabraňuje nežádoucím bílkovinám z analyzovaného
prostředí ve vstupu do aktivní vrstvy (zabraňuje možnost
interferencí detekčních bílkovinných molekul s cizími bílkovinami a
tím zhoršení vlastností biosenzoru).
CR red
S
Analyzovaný rozto
P
CR
ox
Membrána
CR red
Elektrochemická snímací elektroda je obvykle vyrobena z Pt, Au
nebo různých forem C. V současnosti se provádějí pokusy s
vodivými organickými solemi, které mají lepší mechanizmy
přesunu elektronů z enzymu do elektrody.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
S
CR ox
CR
CR red
CR ox
Elektroda
55
P
E
CR red
2e-
ox
CRred, CRox - redukovaná resp.
oxidovaná forma koreaktantu
S, P - analyzovaná molekula resp. její
produkt
E - enzym ve funkci bioaktivní detekční
látky
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
56
Druhá „generace“s ampérometrickým převodem
Třetí „generace“s ampérometrickým převodem
2.Generace - používá pomocnou látku, tzv. prostředníka pro přenos
elektronů z enzymu.
Princip - enzym reaguje s analyzovanou molekulou (substrátem) a
převede ji na produkt. Přitom sám přejde z oxidační formy do redukční.
Při reakci z prostředníkem pak enzym přejde zpět do výchozí formy a
je schopen opět reagovat se substrátem. Prostředník při této reakci
naopak přejde z oxidační formy do redukční. Při návratu prostředníku
do oxidační formy dochází k uvolňování elektronů, které přejdou do
Analyzovaný roztok
S
P
snímací elektrolytické elektrody.
Ered, Eox - enzym v redukované
Membrána
resp. oxidované formě
S
P
S - substrát (analyzovaná
E red
E ox
molekula)
M red
M ox
P - produkt
M red, M ox - prostředník
v redukované resp. oxidované
2eElektroda
formě
57
3.Generace - má modifikovanou elektrochemickou snímací
elektrodu. Do jejího povrchu jsou přidány molekuly, které dovolují
přímou oxidaci resp. redukci enzymu u elektrody.
Jednodušší - výroba elektrody je jednodušší, není potřeba
prostředníku (zprostředkovatelských molekul).
Materiály modifikující snímací elektrodu – nejčastěji vodivé
Analyzovaný rozto
organické soli.
S
P
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Membrána
S
E red
Modifikovaná
Elektroda
E ox
2e-
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Tři „generace“s ampérometrickým převodem
58
Amperometrický princip - prakticky
Měření proudu procházejícího mezi dvěma elektrodami ponořenými
do roztoku elektrolytu
Napájení obvykle stejnosměrným napětím
Polarizována elektroda - označována jako pracovní, měřicí, nebo
jako katoda, např. Pt, Au
Nepolarizovatelná elektroda - označovaná jako vztažná nebo jako
anoda, např. Pb, Ag/ AgCl, Zn aj.
Depolarisér (energetická bariéra) – se vytváří na rozhraní mezi
roztokem a měřicí elektrodou chemickou reakcí v roztoku do kterého
jsou elektrody ponořeny. Způsobuje nevodivost roztoku při malém
vstupním napětí.
Při zvyšujícím napětí se zde uplatňuje difúzní proud, takže proud
stoupá prakticky lineárně s napětím. Až při určité hodnotě napětí je
proud konstantní – označuje se jako proud difúzní ID
Závěr:
Detekční enzymy - používá se mnoho typů
Detekovatelné látky - např. glukóza, moč, cholesterol, fruktóza a
ethanol
Citlivost - v rozsahu až mol/l, tj. spodní detekovatelná mez
Lineární odezva - rozsahu až mol/l má amperometrický
biosenzor lineární odezvu v závislosti na koncentraci.
N - počet elektronů v chemické reakci, Di difúzní koef. (teplotně závislý), S - plocha měřicí
elektrody, d - tloušťka difúzní vrstvy
60
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
ID =
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
P
59
nFDiS
ci
d
Příklad - senzor O2
Amperometrický princip - prakticky
Pevný elektrolyt - Zr O 2.
Princip - O2 vniká do elektrolytu difúzním procesem. Na měřicí
elektrodě se katalyticky transformuje do iontové formy. Ionty
procházejí elektrolytem a na druhé elektrodě se chemickou reakcí
opět uvolňuje O 2. Senzor se zde chová jako ”kyslíková pumpa”.
Ampérometrický měřicí řetězec
ME - měřicí elektroda, SE - referenční elektroda
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
61
62
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Impedometrický princip
3.1.3 Impedometrický princip
Modelování struktury - pomocí pasivních prvků (ekvivalence
fyzikálních procesů probíhajících na elektrodě – obr. vlevo
Rozhraní s kovovou elektrodou - náboj na rozhraní elektrody
s roztokem je ve dvou vrstvách. Na povrchu elektrody jsou
absorbované anionty, tvořící vrstvu IHP (inner Helmholtz plane).
Druhou vrstvou OHP (outer Helmholtz plane), jsou neabsorbované
ionty, které jsou drženy elektrostat. silami k elektrodě – obr.vpravo
Impedometrická detekce - měří frekvenční odezvu
malé signálové impedance elektrochemické snímací
elektrody a biologicky aktivního materiálu.
Metoda vykazuje vysoké hodnoty poměru
signál/šum a proto je vhodná pro měření velmi
malých signálů (tj. velmi malých koncentrací
analyzovaných molekul).
Cd
Použití - není používaná v komerčních aplikacích
biosenzorů, protože výsledky lze obtížně získávat
(složitá analýza dat). Využívá se zatím jen
laboratorně pro určování struktur a procesů
probíhajících v elektrochemické elektrodě a jejím
okolí.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Rct
Rw
Cw
Rsol
Ekvivalentní obvod elektrochemické
elektrody - Rct – odpor přechodové
vrstvy z elektrody do roztoku, Cd –
kapacita vznikající mezi kovem a
roztokem, Rw, Cw – prvky reprezentující
impedanci vlivem transportu hmoty, Rsol
– odpor roztoku.
63
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
64
3.2 Optický převod signálu
Princip činnosti
• Změna vlastností záření, které prochází látkou (reagentem),
která je schopna reagovat s analyzovanou chemickou
látkou.
• Při reakci reagentu s analyzovanou chemickou látkou
dochází v reagentu ke změně optických vlastností, jako
např. útlum, polarizace, apod.
Princip přímého a nepřímého
optického převodu
biochemické veličiny
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
• Senzory založené na tomto principu mohou být navrženy
pro detekci různých chemických a biochemických látek
65
3.2 Optický převod signálu
66
adt a) přímá optická detekce
Princip - analyzované molekuly v biosenzoru reagují s biologicky aktivními
částicemi tzv. receptory, dochází ke sloučení analyzované molekuly a
receptoru:
A + R ⇔ A.R
Kr = [ A.R ]
[A][R]
A,[A] - analyzovaná molekula resp. její koncentrace, R,[R] - volný receptor,
resp. jeho koncentrace (celkové množství R v biosenzoru je konstantní)
[R]celk = [R]eq + [A.R]eq
eq značí rovnovážnou koncentraci.
Optická detekce - zahrnuje měření změn optické absorbce nebo
optické emise způsobených přítomností analyzovaných molekul.
Uvedené změny se projeví jen v určitých oblastech spektra.
Nejběžnější oblasti jsou : infračervená (IR) a ultrafialová viditelná
(UV - VIS), které se používají jak při optické absorbci tak při
optické emisi.
Dvě metody:
a) přímá optická detekce
b) nepřímá optická detekce
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Optický tok - je přímo závislý buď na rovnovážné koncentraci vzniklé
sloučeniny A.R:
[A]eq
_ . [R]celk
[A.R]eq = _
(1/Kr)+[A]eq
nebo na koncentraci volných receptorů :
1
_ . [R]celk
[R]eq = _
(1/Kr)+[A]eq
67
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
68
nepřímá optická detekce
adt b) nepřímá optická detekce
Princip činnosti - za nepřítomnosti analyzovaných molekul jsou
všechny analog. molekuly vázány s receptory a optický tok
procházející optickou komorou biosenzoru není ovlivňován. Po
proniknutí analyzované molekuly do optické komory, tak začínají
nahrazovat ve vazbách analog molekuly. Fluorescenční analog
molekuly jsou vytlačovány do prostoru optického paprsku a začínají
jej zesilovat. Procházející optický signál je tedy přímo úměrný počtu
analyzovaných molekul a jeho změny se měří optoelektronickými
detektory
Princip metody - využívá tzv. konkurenční chemické vazby. Tzn.,
že v bioaktivní části biosenzoru jsou jak molekuly receptorů, tzv.
Fluorescenční analogové molekuly. Tyto fluorescenční molekuly
mají podobnou strukturu jako molekuly analyzované a taktéž
vytvářejí vazbu s receptory.Rozdíl je v tom, že vazba analogreceptor je slabší.
Optické vlákno
Analyzovaná
molekula
Fixovaná detekční
molekula
L
L
A
A
L
A
L
L
A
Příklad - biosenzor s nepřímou optickou detekcí - senzor na určování
glukózy v dialyzační trubici. Jako receptor je použit konkavanalin-A,
který je fixován přímo na stěně dialyzační trubice. Funkci analog
molekuly plní fluorescenčně obarvený cukr FTIC dextrin. Jakmile
glukóza difunduje do trubice, nahradí ve vazbě dextrin. Ten pak
začne v optické komoře zesilovat procházející optický signál.
Fluorescenční analog.
molekula
L
L
L
Optická cesta
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
69
adt aa) Optické vláknové biosenzory s
měřením velikosti zpětného optického signálu
3.2.3 Vlastnosti optických biosenzorů
Výhody optických biosenzorů v porovnání s elektrochemickými :
•Referenční elektroda - není potřeba. Využívá se referenční
intenzity optického záření pro minimalizování vlivů okolního
prostředí.
•Imunní vůči elektrickému šumu
•Multidetekce - nezávislé detekování více typů analyzovaných
molekul. Jako analog molekuly se použijí látky různých barev a
měření procházejícího optického signálu se provádí na různých
vlnových délkách.
Princip - na konci optického vlákna je bioaktivní barvivo nebo
fluorophor.
Selektivně propustná membrána je vytvořena okolo bioaktivního
materiálu.
Měření – velikost optického signálu procházejícího zpětně do
Druhé části vlákna určuje množství analyzovaných molekul.
Základní typy optických biosenzorů :
a) Optické vláknové biosenzory – optody (dnes
nejpoužívanějsí)
a) měření velikosti zpětného optického signálu
b) měření útlumu vlákna (Měření evanescentní vlnou)
b) Na bázi fluorophoru a chromophoru
c) Bioluminiscenční a chemiluminiscenční
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
70
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
71
ØOUT
Optické vlákno
Bioaktivní materiál
ØIN
Membrána
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
72
adt aa) Optické vláknové biosenzory s
měřením velikosti zpětného optického signálu
adt ab) Optické vláknové biosenzory s
měřením útlumu vlákna
Princip - optické vlákno je na určité délce zbaveno pláště a
pokryto bioaktivním materiálem
Množství analyzovaných molekul mění velikost útlumu vlákna
Vlnové délky - optické vlastnosti jsou omezeny použitelnou
vlnovou délkou optického vlákna. Tím je limitována možnost
použití některých bioaktivních detekčních barviv.
plastová - 450nm
Plášť
Membrána
Optické vlákno
skleněná - 380nm
Jádro
Bioaktivní materiál
Vázané receptory
Zdroje záření - LED, laser
Detektory záření - fotodiody a fototranzistory
Výhody - relativně levné, výrobně nenáročné, malý elektrický příkon
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
73
adt b) Optické biosenzory na bázi fluorophoru
a chromophoru
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
74
adt c) Optické biosenzory na principu
bioluminiscence a chemoluminiscence
Princip - změna optické fluorescence resp. absorbce, způsobené
změnou koncentrace analyzovaných molekul.
Bioaktivní detekční materiál - jsou molekuly fluorophoru resp.
chromophoru, jejichž fluorescence resp. absorbce se na určitých
vlnových délkách mění když tyto molekuly oxidují.
Použití – např. zjišťování pH, určování přítomnosti čpavku či
kyslíku.
Princip - použití bioluminiscenčních a chemoluminiscenčních
molekul v biosenzorech
Nejnovější metoda
Největší dosud známá citlivost (řádově pikomoly)
Vznik světla v biologicky aktivním materiálu:
O2
Luciferin + Luciferase ↔ Oxyluciferin*
H2O
Oxyluciferin* → Oxyluciferin + světlo
Luciferin - molekula, která emituje světlo
Luciferase - enzym, který oxiduje luciferin do excitovaného stavu
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
75
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
76
Příklad - Fluorescenční senzor
Například senzor typu ENFET (Enzym FET).
Fixační vrstvička enzymu na membráně zajištuje potřebnou selektivitu
B je citlivý pouze na určité typy iontů.
Příklad - Fluorescenční senzor
Chemická reaktivní
komora s biomasou
Příklad - fluorescenční princip využívaný pro analýzu žijící biomasy
v enzymu.
Zářivý tok z ultrafialového zdroje záření UV (360 nm) je optickým
vláknem veden do chemické reaktivní komory s biomasou.
UV záření reaguje se specifickými molekulami biomasy - interakcí
záření s hmotou dochází k fluorescenci.
Vyhodnocování - fluorescenční tok se z důvodu potlačení teplotních
chyb vyhodnocuje poměrově při dvou různých vlnových délkách.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
77
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
78
Příklad - Optický senzor plynu CO2
Senzor má dvě pracovní komory, kterými prochází záření ze stejného zdroje
(dioda LED). Levá komora je vyplněna reagentem a zakryta membránou, kterou
analyzovaný plyn difunduje do reagentu. Pravá komora je referenční a není
vyplněna žádnou hmotou. Při reakci plynu s reagentem v levé komoře se mění
optické vlastnosti reagentu. Procházející záření je takto modulováno. Výsledný
signál se vytvoří porovnáváním signálu z fotodetektorů snímajících záření v levé
a pravé komoře.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Princip tepelného převodu
biochemické veličiny
79
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
80
Tepelný převod signálu
3.3 Tepelný převod signálu
Tepelná detekce měří entalpii detekované reakce.
Teplotní senzor – používají se termistory, umístěné v tepelně
izolovaných kalorimetrech.
Bioaktivní detekční látka – (jedná se obvykle o enzymy) je
fixována na skleněných korálkách uvnitř kalorimetrické trubice.
Princip činnosti - analyzovaný roztok teče nejprve přes tepelný
výměník, kde získá počáteční teplotu a teprve pak postupuje do
kalorimetrické trubice. Teplotní senzor měří teplotu roztoku
vytékajícího z trubice.
Měřený elektrický parametr termistoru je přímo úměrný a lineární
k množství analyzovaných molekul.
Rozlišovací schopnost termistoru - 0,01 °C.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
81
Celkové teplo uvolněné v chemické reakci enzymu a analyzované
molekuly je přímo úměrné molární entalpii :
Q = - n . ΔH
n - počet molů výsledného produktu chemické reakce, ΔH - změna
molární entalpie.
Výsledná změna teploty systému :
ΔT = Q = -n. ΔH
Cs
Cs
Cs - tepelná kapacita systému
Enzymatické reakce uvolňují velké množství tepla a proto jsou pro
tepelnou detekci vhodné.
Citlivost tepelných biosenzorů - v rozsahu až mol/l pro enzymatické
katalytické reakce.
Nevýhody:
•Větší rozměry než ostatní typy biosenzorů
•Složité udržování konstantní teploty analyzovaného roztoku
•Interference chemických reakcí a procesů v kalorimetru, které snižují
množství uvolněného tepla.
Výhoda
- velký rozsah
lineární
odezvy
Prof.Ing.Miroslav
Husák, CSc.
– ČVUT FEL
Praha a velká ampl. výstup. signálu 82
3.4 Rezonanční převod signálu
Rezonanční metoda – převod biochemických detekčních reakcí na
elektrickou veličinu je založen na změně rezonanční frekvence
mechanického rezonátoru.
Změna rezonanční frekvence – je způsobena adsorbcí
analyzovaných molekul na povrchu biologicky aktivní membrány
převodníku.
Dva základní typy rezonátorů :
a) Oscilátor s objemovou vlnou (BAW)
b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou (SAW)
Princip BAW a SAW převodu
biochemické veličiny
BAW – Bulk Acoustic Wave
SAW – Surface Acoustic Wave
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
83
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
84
adt b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou
(SAW)
adt a) Oscilátor s objemovou vlnou (BAW)
Piezoelektrický krystal - základ převodníku
U krystalu lze velmi přesně změřit změnu rezonanční frekvence:
Δf/f < 10-5 až 10-6
Rezonanční kmitočet krystalového oscilátoru :
fo = N = N.ρ .A
d
m
N - frekvenční konstanta 0,167 MHz·cm-1, ρ - hustota krystalu, A plocha krystalu, d - tloušťka krystalu, m - hmotnost krystalu.
Při detekování analyzovaných molekul dochází ke vzniku vazby
mezi analyzovanými molekulami a bioaktivní látkou umístěnou na
povrchu krystalu. Tím dochází k adsorbci analyzovaných molekul
na povrchu krystalu a tím vlastně ke zvětšování jeho hmotnosti o
Δm.
Pro změnu rezonanční frekvence v důsledku uvedené adsorbce,
za předpokladu Δm<< m, platí :
Δf = - f o Δm = -2,3*10-6 * f o2 Δm
m
A
m, Δm [g], f o, Δf [Hz], A [-]
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou - 2 hřebenové elektrody.
Konstantního zpoždění signálu při přechodu z jedné elektrody na
druhou.
Velikost zpoždění - zvětšování zpoždění při přechodu signálu
mezi elektrodami a díky tomu ke změně rezonanční frekvence v
důsledku adsorbce analyzovaných molekul.
Změna rezonanční frekvence :
Δf = (k1 + k2). Δm
A
k1, k2 - materiálové konstanty SAW substrátu.
Použití BAW a SAW
•hlavně pro detekci plynů (anorganických a organických).
•okrajově pro detekci v roztocích problémy (dochází k velkému
rozptylu energie z oscilátoru do roztoku a to často dokonce
znemožní vznik oscilací).
85
adt b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou
(SAW)
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
87
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
86
adt b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou
(SAW)
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
88
adt b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou
adt b) Oscilátor s povrchovou akustickou vlnou
(SAW)
(SAW)
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
89
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
90
Příklady pouzdření biosenzorů
Pouzdření biosenzorů
Základní funkce pouzdra:
1) Ochrana systému biosenzoru před vlivy prostředí
•
elektrická izolace, ochrana před vlhkem
•
mechanická ochrana pro zachování vnitřní struktury a
objemové stability
•
optická a tepelná ochrana před ovlivňováním signálu
•
chemická izolace
2) Ochrana prostředí před účinky materiálu biosenzoru
•
pouzdro a funkce senzoru takové, aby nevznikali toxické
produkty
•
použitý materiál je inertní k prostředí
•
možnost sterilizace senzoru
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
a) Struktura ISFET. Cesty od D a
S jsou vytvořeny difůzí pod SiO2.
Kontaktní plochy jsou pasivovány
silikonovou gumou nebo epoxidem.
Polymer na povrchu zamezuje
pronikání vlhkosti do struktury.
91
b) boční pohled na uspořádání
kontaktů ISFETu. Přední strana je
pokryta SiO2. Kontakty jsou vedeny
skrze substrát.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
92
Příklady pouzdření biosenzorů
Příklady pouzdření biosenzorů
c) „ Skryté “ přívody k elektronickým obvodům vyhodnocujícím signál senzoru
d) Vícevrstvové pouzdro ENFETu s kontakty chráněnými pod křemíkovou vrstvou a
aktivní oblast senzoru. Použitím různých membrán lze vyrobit více senzorů pro
detekci různých látek na jednom substrátu.
93
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Příklady pouzdření biosenzorů
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
94
Aplikace BIOSENZORŮ
e) Mikrokomůrka sloužící
k ochraně bioaktivní části
senzoru před nárazovými vlnami
měřeného roztoku a množstvím
proteinů.
f) Vícevrstvé ochranné
pouzdro biosenzoru
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
95
Měření pH
Hodnota pH se používá k analýze kyselosti nebo zásaditosti
roztoků. Pohybuje se v rozsahu od hodnoty 0 do 14.
Destilovaná voda pH = 7,
roztoky s pH > 7 jsou zásadité,
s pH < 7 jsou kyselé.
Základní princip měření pH:
dvě elektrody ponořené do elektrolytu.
Měřicí a referenční elektroda vytvářejí při ponoření do elektrolytu
elektrický článek
Napětí článku je dáno rozdílem potenciálů na obou elektrodách
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
96
Měření pH
Senzory pro měření glukózy v krvi
10-12
Proudové zatížení článku - I <
A, odpovídá vnitřnímu odporu
zesilovače Ri > 1012 Ω.
V současné době se obě elektrody vyrábějí v jediném pouzdru.
Vzhledem k teplotní závislosti potenciálu na teplotě je nutné
měřící řetězec doplnit senzorem teploty.
Klasický způsob měření pomocí dvou elektrod (první elektroda
z Pt a druhá z Ag, nebo AgCu. Membrána umístěná před těmito
elektrodami
.
Konstrukce - senzory
glukózy mohou být
konstruovány
například jako jádro
jehly. Takže pouhým
vpichem mužeme
analyzovat stav
glukózy v krvi.
1 - měřicí skleněná elektroda
2 - referenční kalomelová elektroda
3,4 - vnitřní elektrody
5 - pH citlivá membrána z křemičitého
skla
6 - roztok (pufer) s pevně definovanou
hodnotou pH
7 - nasycený roztok
8 - diafragma (nekovové a iontově
propustné spojení s analyzovaným
roztokem elektrolytu)
97
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Senzory pro měření glukózy v krvi
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
98
Katetrizační technika
Senzory ISFET (BIOFET)
V oblasti hradla se nachází speciální enzymová membrána, která
selektivnì reaguje na množství glukózy v měřeném roztoku.
Katetr - se skládá z pružné tenké trubičky, která lze vsunout do
některé z větších žil člověka.
Pomocí katetru dokážeme diagnostikovat aktuální stav krevního
řečiště v určitém místě, popřípadě i určitého orgánu (např. části
srdce).
Na konci katetru může být umístěna sonda na zjišťování O2, CO2,
pH, teploty, nebo tlaku.
Princip těchto senzorů je prakticky totožný s těmi, které byly
vysvětleny v předešlé části textu.
Senzor glukózy
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
Biosonda glukózy - Sonda na
měření glukózy je vyrobena na
tenké destičce plošného spoje.
99
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
100
Biosenzor umístěný v katetru
Co je to kateter
První oválné okénko zajišťuje kontakt senzoru s měřenou látkou
(krví).
Druhým okénkem lze do daného místa přivádět například infusi.
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
101
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
102
Biosenzor umístěný v katetru
SMART (inteligentní)
biosenzor
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
103
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
104
Telemetrický systém pro měření množství
glukózy v krvi
SMART Biosenzory pro implantáty
Implantáty biosenzorů - jsou operativně umístěny na příslušné
místo lidského těla (nejčastěji biosenzory O2 a glukózy)
Přenos signálu - je zde řešen elektromagneticky.
Implantovaný blok - pod kůži označený GTS1c slouží pouze
k předzpracování signálu.
Vyhodnocení signálu a uložení výsledků do paměti řeší vnější
zařízení.
Toto oddělení obou částí má výhodu jak minimalizování velikosti
implantovaného zařízení, tak v snadnější stabilizaci a teplotní
kompenzaci funkce vnějšího zařízení (především
mikroprocesoru).
Pomocné zařízení v kardiostimulátorech - senzory se začínají
používat například jako pomocné zařízení v kardiostimulátorech
pro sledování správné funkce organismu
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
105
Telemetr. systém pro měření množství glukózy
v krvi - hybridní blok ”GTS1c”
Blok GTSc
je implantován
kůži
Prof.Ing.Miroslav
Husák, CSc. pod
– ČVUT
FEL Praha
106
Nedostaky biosenzorů
Základem biosenzoru je živá organická struktura, a proto je biosenzor
velmi citlivý na pracovní podmínky, je nutné chránit zejména před:
- mrazem
- vysokými teplotami
- vysokými tlaky
- mechanickým poškozením
- toxickými látkami
- před nevhodnými organickými látkami
- atd.
Nestabilita biosenzorů - největší problém, je způsobena:
•degradací biomembrány (únik, denaturace aktivního materiálu)
•ovlivňováním aktivní vrstvy zanášením bílůkovin nebo mechanickým
poničením
•nestabilitou převodníku
•degradací pouzdra (vznik koroze, puklin... )
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
107
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
108
Závěry
Další vývoj a uplatnění
Problematika biosenzorů - je velmi rozsáhlá, pokrývá mnoho
vědních oborů.
Pole biosenzorů je stále v ranném stádiu vývoje. Obsahuje
obecné problémy, které vyžadují další výzkum v oblasti materiálů,
biochemie, senzorové techniky a v základních principech funkce
biosenzorů.
Oblast medicíny - používají se biosenzory pro snímání
množství cukru v krvi protékající dialyzačním přístrojem.
Implantace do pacientova těla - v budoucnu se počítá s
aplikací biosenzorů ve speciálních mikrosystémech,
které po implantaci do pacientova těla budou
kontrolovat a korigovat špatné funkce důležitých orgánů
(např. neustálé sledování hladiny cukru v krvi a pomocí
mikropump dávkování insulinu.
Požadavky
•vysoká spolehlivost senzoru i pouzdra
•dlouhá životnost
•zabudované samotestování a samokalibraci.
Použitelnost senzorů závisí na jejich citlivosti a selektivitě. Citlivost je
určena rozpoznávací úrovní kterou je ještě možno odlišit od šumu. Vyšší
citlivosti se dosáhne použitím převodní ku s větší účinností a potlačením
šumu. Pro potlačení šumu se používá metoda integrace více senzorů na
jednom substrátu a rozpoznávání vzorů včetně využití neuronových sítí
109
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
P
interface
pH
interface
micro
motor
interface
micro
valve
interface
Communication
unit
MUX
A/D
Control
unit
DEMUX
µ-ACTUATORS
µ-SENSORS
Microsystem = system in a miniature scale
interface
110
Přehled rozdělení
biosenzorů
Background
T
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
D/A
Power unit
Advantage for biomedical applications
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
111
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
112
NANOTECHNOLOGIE
NANOTECHNOLOGIE
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
113
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
114
Moderní technologie
NANOTECHNOLOGIE
Moderní technologie – nanotechnologie při
léčbě rakoviny
Advance Nanotech presentation.lnk
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
115
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
116
Moderní technologie
NANOTECHNOLOGIE
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
117
Otázky:
1. Obecné schéma biosenzoru – základní součásti
2. Dva základní typy chemických reakcí využívaných v biosenzorech
3. Typy fyzické a chemické fixace biologicky aktivních látek na detekční
buněčné membráně
4. Základní fyzikální princip transportu v biosenzorech
5. Princip potenciometrického převodu biochemické veličiny
6. Princip činnosti biochemického FET,
7. Co to je ISFET
8. Co to je REFET
9. Základní princip amperometrického převodu biochemické veličiny
10.Princip přímého a nepřímého optického převodu biochemické veličiny
11.Princip tepelného převodu biochemické veličiny
12.Princip BAW a SAW převodu biochemické veličiny
13.Co je to kateter
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
119
Prof.Ing.Miroslav Husák, CSc. – ČVUT FEL Praha
118
Download

10 Biosenzory.pdf - Katedra mikroelektroniky