2. Česká lipidomická konference
a Workshop ICCTI a INER
25. – 27. června 2012, hotel Prestige, Znojmo
PROGRAM KONFERENCE / SBORNÍK ABSTRAKT
Lipidomická sekce České společnosti pro biochemii
a molekulární biologii
Česká společnost pro genovou a buněčnou terapii
a
Mezinárodní konsorcium pro buněčnou terapii a imunoterapii
pořádají
2. Českou lipidomickou konferenci
a
workshop
Rekombinantní vakcíny, buněčné vakcíny
a transportní systémy
Znojmo, hotel Prestige
25. – 27. června 2012
Hlavní partner konference
Partneři
Distributor GE HC pro Českou republiku
Adresa:
Drahobejlova 27
Praha 9, 190 00
Tel.: + 420 220 518 399
E-mail: [email protected]
www.apczech.cz
2nd Czech Lipidomic Conference
Vědecký výbor konference
doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.
prof. Ing. Michal Holčapek, Ph.D. Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická, Katedra analytické chemie
Ing. Miroslav Lísa, Ph.D. Univerzita Pardubice, Fakulta chemicko-technologická, Katedra analytické chemie
prof. MUDr. Jaroslav Michálek, Ph.D. Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Farmakologický ústav
doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D. Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci, Ústav imunologie
RNDr. Jaroslav Turánek, CSc. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i.
doc. RNDr. Irena Valterová, CSc. Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.
Zvaní přednášející
Dr. Harald C. Köfeler Core Facility Mass Spectrometry & Lipidomics,
Medical University Graz, Center for Medical Research, Austria
doc. Ing. Vladimír Košťál, CSc. Biology Centre ASCR, Institute of Entomology, České Budějovice
Prof. Andrew David Miller Pharmaceutical Sciences Division, Franklin-Wilkins Building,
Waterloo Campus, King‘s College London
Dr. Jürgen Schiller University of Leipzig, Medical Department,
Institute of Medical Physics and Biophysics, Germany
Organizace
SYMMA, spol. s r.o.
Aleš Martinek
Kounicova 13
602 00 Brno
Tel., Fax. +420 549 123 256
E-mail: [email protected]
www.symma.cz
Programme
Monday, June 25, 2012
Monday, June 25, 2012
13:30 – 15:00 Registration
15:00 – 15:10 Conference opening
15:10 – 18:00 Section: LIPIDS IN LIVING SYSTEMS I.
Chairman: Irena Valterová
15:10 – 15:50 Keynote lecture - Adaptive changes in lipid composition of
biological membranes and storage fat reserves in animals
exposed to low temperatures
Košťál V.
Biology Centre ASCR, Institute of Entomology, České Budějovice
15:50 – 16:10 Dietary fatty acids in regulation of colon epithelial cell kinetics
Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Vaculová A.1,2, Tylichová Z.1,2,
Skender B.1,2, Slavík J.3, Ciganek M.3, Kozubík A.1,2, Machala M.3
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences
of the Czech Republic,v.v.i.1
Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of
Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy,
Veterinary Research Institute, v.v.i.3
16:10 – 16:30 Fatty acid modulatory effects on colon epithelial cell signaling
Tylichová Z.1,2, Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Kozubík A.1,2
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics,
Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1
Department of Animal Physiology and Immunology,
Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2
16:30 – 16:50 Docosahexaenoic acid-mediated changes in sphingolipid
metabolism and their role in trail-induced apoptotic signalling in
colon cancer cells
Skender B.1,2, Vaculová A.1, Slavík J.3, Machala M.3, Kozubík A.1,2,
Hofmanová J.1,2
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics,
Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1
Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of
Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy,
Veterinary Research Institute, v.v.i.3
16:50 – 17:20 Coffee break / Company exhibition
Programme
Monday, June 25, 2012
17:20 – 17:40 Ovlivnění cholesterolémie potkanů kyselinou
eikosapentaénovou a dokosahexaénovou
Komprda T., Zorníková G., Knoll A., Vykoukalová Z., Rozíková V.
Škultéty O.
Mendelova univerzita v Brně
17:40 – 18:00Složení zásobních látek v tukovém tělese u matek čmeláků
Bombus terrestris v průběhu života
Jiroš P., Bučánková A., Kofroňová E., Kudzejová M., Šobotník J.,
Komzáková O.,Valterová I.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.
18:00 – 18:15 Shotgun Lipidomics and High Mass Resolution
Pól J.
Thermo Fisher Scientific (Praha), s.r.o.
18:15 – 18:30 Stanovení od mastných kyselin přes Omega 3 až po
metabolomiku pomocí plynové chromatografie
Voldřichová M.
Pragolab, s.r.o.
18:45 – 21:00 WELCOME PARTY – HOTEL PRESTIGE
Tuesday, June 26, 2012
8:30 – 12:00 Section: LIPIDS IN LIVING SYSTEMS II.
Chairman: Michal Holčapek
8:30 – 9:10 Keynote lecture - Lipidomic profiling by high resolution mass
spectrometry
Köfeler H.C.
Medical University Graz, Center for Medical Research, Austria
9:10 – 9:30 Changes in urinary sulfatide isoform profile in metachromatic
leukodystrophy: diagnostic applications and pathological basis
Kuchař L.1, Tureček F.2, Asfaw B.1, Ledvinová J.1
Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine,
Charles University in Prague and General University Hospital in Prague1
Department of Chemistry, University of Washington, Seattle, USA2
9:30 – 9:50 Lipotoxicita a ektopické ukládání lipidů v patogenezi
metabolického syndromu a diabetu
Malínská H., Kazdová L.
Institut klinické a experimentální medicíny
2nd Czech Lipidomic Conference
9:50 – 10:10 Význam nitrovaných mastných kyselin jako endogenních
kardioprotektivních mediátorů
Pekarová M.1, Ambrožová G.1,2, Rudolph T.3, Ravekes T.3, Lojek A.1,
Kubala L.1
Biofyzikální ústav, Akademie věd České republiky v.v.i.1
Oddělení experimentální biologie a imunologie, Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita2
Oddělení kardiologie, Hamburg University Heart Center,
Hamburg, Německo3
10:10 – 10:40 Coffee break / Company exhibition
10:40 – 11:00 Degradační produkty peroxidace lipidů v krvi u Alzheimerovy
choroby
Skoumalová A.1, Illner J.1, Klusáčková Z.1, Topinková E.2,
Vyhnálek M.3, Lasz J.3, Hort J.3
Ústav lékařské chemie a biochemie, 2. LF UK1
Geriatrická klinika 1. LF UK a VFN2
Neurologická klinika 2. LF UK a FN Motol3
11:00 – 11:20 Metabolic fate of glucosylceramide: Unsolved puzzle in Gaucher
disease
Asfaw B., Kuchař L., Fialová M., Poupětová H., Ledvinová J.,
Elleder M.
Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine,
Charles University in Prague and General University Hospital in Prague
11:20 – 11:40 Nové anionické steroidní inhibitory fázicky a tonicky
aktivovaných NMDA receptorů
Kudová E.1, Chodounská H.1, Slavíková B.1, Vyklický V.2, Borovská J.2,
Krausová B.2, Vyklický L. Jr.2
Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v.v.i.1
Fyziologický ústav Akademie věd ČR, v.v.i.2
11:40 – 12:00 In Vivo zobrazovací metody v preklinickém výzkumu
Kopeček M.
BioTech a.s.
12:00 – 13:30 Lunch
13:30 – 17:00 Section: LIPID ANALYSIS & LIPIDOMICS
Chairman: Josef Cvačka
13:30 – 14:10 Keynote lecture - Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry
in Lipid Research
Fuchs B., Süß R., Schiller J.
Programme
Tuesday, June 26, 2012
University of Leipzig, Medical Department, Institute of Medical Physics
and Biophysics, Leipzig, Germany
14:10 – 14:30 Separation of Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers
using Chiral HPLC/MS
Lísa M., Holčapek M.
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of
Analytical Chemistry
14:30 – 14:50 Modern analytical methods in determination of polyunsaturated
fatty acids in intact lipid molecules
Tomčala A., Valterová I.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
14:50 – 15:10 Lipidomic analysis of vernix caseosa
Míková R.1, Vrkoslav V.1, Hanus R.1, Kaftan F.1,2, Rejšek J.2, Čmelíková T.3,
Horká P.1,2, Zábranská M.1,2, Doležal A.4, Plavka R.4, Cvačka J.1
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.1
Přírodovědecká fakulta UK v Praze2
Gymnázium Joachima Barranda Beroun3
Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN v Praze4
15:10 – 15:40 Coffee break / Company exhibition
15:40 -16:00 Identification and quantitation of lipids using high-performance
liquid chromatography and mass spectrometry
Cífková E., Lísa M., Holčapek M.
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of
Analytical Chemistry
16:00 – 16:20 New quantitation approaches in lipidomic analyses of patients
with cardiovascular diseases
Holčapek M.1, Cífková E.1, Červená B.1, Lísa M.1, Znaleziona J.2,
Vostálová J.2,Galuszka J.3
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology,
Department of Analytical Chemistry1
Palacký University Olomouc, Faculty of Medicine and Dentistry2
Faculty Hospital Olomouc, Czech Republic3
16:20 – 16:40 Steroidní sondy a standardy pro studium biologických dějů
Kapras V.1, Slavíková B.2, Slavíčková A.1, Rambousek L.2, Valeš K.2,
Vyklický V.2,Vyklický L. Jr.2 , Kudová E.1, Chodounská H.1
Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, v. v. i.1
Fyziologický ústav, AV ČR, v. v. i.2
2nd Czech Lipidomic Conference
16:40 – 17:00 Rapid Analysis of the Human Plasma Lipidome in a High
Resolution Acquisition Workflow
Simons B.1, Kauhanen D.2, Sylvänne T.2, Tarasov K.2, Duchoslav E.1,
Ekroos K.2
AB SCIEX, Canada1
Zora BioSciences, Finland2
17:00 – 18:00 POSTER SESSION
19:00 – 21:00 SOCIAL DINER IN THE LOUKA MONASTERY IN ZNOJMO
19:00 Performance of the GIDEON string trio
19:45 ZNOVÍN wine tasting
20:15 Social dinner in the Stucco hall
Wednesday, June 27, 2012
8:30 – 11:20 Section: LIPID STRUCTURES AND DRUG DELIVERY
SYSTEMS
Chairman: Jaroslav Turánek
8:30 – 9:10 Nanoparticle mediated delivery of therapeutic nucleic acids in
vivo; what does it take to move into clinic?
Miller A.D.
Pharmaceutical Sciences Division, Franklin-Wilkins Building, Waterloo
Campus, King‘s College London
9:10 – 9:30 Nanoliposomes for construction of recombinant vaccines and
delivery of anticancer and antiviral drugs
Turánek J.
Veterinary Research Institute, Brno
9:30 – 9:50 Significant synergism of antitumor activities of HPMA
copolymer-bound doxorubicin conjugate and IL-2/anti-IL-2 mAb
immunocomplexes: a concept of modern chemoimmunotherapy
Kovář M.
Institute of Microbiology ASCR, v.v.i., Prague
10
9:50 – 10:10 Liposomes as carriers for hydrophobic anticancer drugs:
paclitaxelas the example
Koudelka Š.1,2, Turánek Knötigová P.1,2, Mašek J.1,2, Plocková J.1,
Kulich P.1, Turánek J.1,2
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy,
Veterinary Research Institute, Brno1
Faculty of Science, University of South Bohemia, České Budějovice2
Programme
Wednesday, June 27, 2012
10:10 – 10:40 Coffee break / Company exhibition
10:40 – 11:00 Preparation and characterisation of recombinant OspC liposomebased experimental vaccine with entrapped lipophilic derivatives
of norAbuMDP against Borrelia burgdorferi
Mašek J.1, Bartheldyová E.1, Křupka M. 4, Turánek-Knotigová P.1,2,
Koudelka Š.1, Lukáč R.1, Kulich P.1, Turánek J.1,2, Ledvina M.3, Raška M.4
Veterinary Research Institute, Brno1
Faculty of Medicine, Masaryk University, Brno2
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry,
Czech Academy of Science, Prague3
Faculty of Medicine, University of Palacky, Olomouc4
11:00 – 11:20 Liposomes and microbubbles for in vivo MRI and ultrasound
diagnostics
Lukáč R., Turánek J.
Veterinary Research Institute, Brno
11:20 – 11:40 Vazba povrchových antigenů spirochety Borrelia burgdorferi
na metaloafinitní liposomy ovlivňuje typ vyvolané imunitní
odpovědi na myším modelu
Křupka M.1, Mašek J.1, Bartheldyová E.1, Koudelka Š.1, Ledvina M.2,
Turánek J.1, Raška M.1
Ústav imunologie Lékařské fakulty UP1
ÚOCHB AV ČR2
11:40 – 12.00 The effect of water-based medium on the structure of gemini
surfactant–DOPE–DNA complexes
Pullmannová P.1, Lacinová Ľ.2, Funari S.S.3, Murugova T.4,
Devínsky F.5, Uhríková D.1
Department of Physical Chemistry of Drugs, Faculty of Pharmacy,
Comenius University, Slovak Republic1
Institute of Molecular Physiology and Genetics, S
lovak Academy of Sciences, Slovak Republic2
HASYLAB at DESY, Hamburg, Germany3
Frank Laboratory of Neutron Physics, JINR, Dubna, Russia 4
Department of Chemical Theory of Drugs,Faculty of Pharmacy,
Comenius University, Slovak Republic5
12:00 – 12.20 Nové trendy ve vědě - Protilátkové čipy a revoluční povrchy pro
buněčnou kultivaci
Kalfiřtová P.
BARIA
12:20 – 13:30 Lunch
11
2nd ICCTI Workshop:
Wednesday, June 27, 2012,
LECTURES, Hotel Prestige
8:00 – 9:00 Registration
Section A
9:00 – 9:05 Opening of the workshop
Michálek J.
9:05 – 11:00 Round Table Discussion – all invited speakers
11:00 – 13:00 Lunch break
Section B
13:00 – 13:30 ICCTI consortium – mission and the first year of experience
Michálek J.
13:30 – 14.00 Genetically modified human adipose tissue-derived
mesenchymal stem cells for cancer treatment
Altaner C.
14:00 – 14:30 Transforming Regenerative Stem Cells to Cancer Immuneeffectors
Dominici M.
14.30 – 15.00 Cell-mediated enzyme/prodrug gene therapy in cancer
Kucerova L.
15:00 – 15:30 Coffee break
Section C
15:30 – 16:00 Bacterial ghosts as delivery systems
Kudela P., Lubitz W.
16:00 – 16:30 Phase I/II clinical trials of dendritic cell-based immunotherapy in
patients with the biochemical relapse of the prostate cancer and
hormone refractory prostate cancer
Spisek R.
16:30 – 16:50 In vivo tracking of dendritic cells and MSC
Skopalik J., Michalek J., Turanek-Knötigova P., Turanek J., Redova M.
16:50 – 17:00 ICCTI concluding remarks
Michálek J.
12
17:00 End of session
Recombinant Vaccines, Cellular Vaccines and Delivery Systems
Day 2, June 28, 2012
PRACTICAL PART, University Campus Bohunice, Brno
8:00 – 9:00 Registration
9:00 – 10:00 Mesenchymal stromal cell expansion systems and QuantumTM
Skopalík J.
10:00 – 16:00 Flow cytometry on FACS Canto II
10:00 – 11:00 Sample preparation and labeling (max. 5 persons)
Jelínek J.
11:00 – 12:00 Multicolor analysis on FACS Canto II (max. 5 persons)
Jelínek J.
12:00 – 13:00 Lunch break
13:00 – 14:00 Sample preparation and labeling (max. 5 persons)
Skopalík J.
14:00 – 15:00 Multicolor analysis on FACS Canto II (max. 5 persons)
Skopalík J.
15:00 – 16:00 Individual discussions with trainees
Skopalík P., Jelínek J.
16:00 End of workshop
13
Všeobecné informace
Místo konání
Hotel Prestige, Pražská 100, 669 02 Znojmo
Parkování
Možnost na hlídaném hotelovém parkovišti.
Registrační poplatky
Člen lipidomické sekce
Kč 1 250,- převodem
Kč 1 550,- na místě
Nečlen
Kč 1 600,- převodem
Kč 1 900,- na místě
Studenti Ph.D.
Člen lipidomické sekce
Kč 650,- převodem
Kč 950,- na místě
Nečlen
Kč 1 000,- převodem
Kč 1 300,- na místě
/v registračním poplatku je zahrnuto vstupné na konferenci, 2 x oběd, vstupenka na
společenský večer, občerstvení v průběhu konference, konferenční materiály a DPH /
Registrace účastníků
25. června 2012 12.00 – 16.00 hod
26. června 2012 8.00 – 15.00 hod
27. června 2012 8.00 – 10.00 hod
Registrace účastníků bude umístěna ve foyer hotelu Prestige. Registrující osoby, které Vám
budou k dispozici po celou dobu konání konference Vám rádi sdělí Vaše event. dotazy.
Oběd
Menu 26. června 2012
Menu 27. června 2012
Kuřecí vývar s masem a nudlemi
Bramborová polévka
150g Smažený kuřecí řízek
150g Přírodní vepřový plátek
Šťouchané brambory
Bylinková rýže
Nealkoholický nápoj
Nealkoholický nápoj
Obědy se vydávají oproti stravenkám, které obdržíte při registraci účastníků. Zájemce
o bezmasé nebo dietní jídlo žádáme, aby svůj požadavek nahlásili registrujícím osobám.
Společenský večer
Společenský večer formou rautu se koná dne 26. června 2012 v historických prostorách
Louckého kláštera. Vstupenku na společenský večer, která je zahrnuta v registračním
poplatku obdržíte při registraci účastníků. Odjezd autobusu, který bude přistaven před
hotelem Prestige do Louckého kláštera je naplánován na 18.30 hod.
Konferenční materiály
Při registraci obdržíte program konference vč. sborníku abstrakt, blok, tužku a jmenovku.
Konferenční technika
Dataprojektor, PC, bezdrátová myš, laserové ukazovátko a náhledový monitor. Techniku je
možné vyzkoušet před zahájením konference nebo v průběhu přestávek. Technická obsluha
bude k dispozici po celou dobu konání akce v přednáškovém sále.
Prezentace
Prezentace, které od Vás převezme technik v přednáškovém sále, prosíme dodat na CD/DVD
nebo USB Flash disku.
14
SBORNÍK ABSTRAKT
SBORNÍK ABSTRAKT
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
25. – 27. června 2012
ABSTRAKTA NEPROŠLA JAZYKOVOU ÚPRAVOU
15
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Obsah:
Adaptive changes in lipid composition of biological membranes and storage fat reserves in
animals exposed to low temperatures.................................................................................................................19
Dietary fatty acids in regulation of colon epithelial cell kinetics................................................................20
Fatty acid modulatory effects on colon epithelial cell signaling ...............................................................21
Docosahexaenoic acid-mediated changes in sphingolipid metabolism and their role in trailinduced apoptotic signalling in colon cancer cells ........................................................................................22
Ovlivnění cholesterolémie potkanů kyselinou eikosapentaénovou a dokosahexaénovou ............23
Složení zásobních látek v tukovém tělese u matek čmeláků Bombus terrestris
v průběhu života .........................................................................................................................................................24
Shotgun Lipidomics and High Mass Resolution...............................................................................................25
Stanovení od mastných kyselin přes Omega 3 až po metabolomiku pomocí plynové
chromatografie.............................................................................................................................................................26
Lipidomic profiling by high resolution Mass Spectrometry.........................................................................27
Changes in urinary sulfatide isoform profile in metachromatic leukodystrophy: diagnostic
applications and pathological basis . ...................................................................................................................28
Lipotoxicita a ektopické akumulace lipidů v patogenezi metabolického syndromu a diabetu ....29
Význam nitrovaných mastných kyselin jako endogenních kardioprotektivních mediátorů............30
Degradační produkty peroxidace lipidů v krvi u Alzheimerovy choroby . ............................................31
Metabolic fate of glucosylceramide: Unsolved puzzle in Gaucher disease ...........................................32
Nové anionické steroidní inhibitory fázicky a tonicky aktivovaných NMDA receptorů ....................33
In Vivo zobrazovací metody v preklinickém výzkumu....................................................................................34
Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Lipid Research............................................................35
Separation of Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers using Chiral HPLC/MS .......................36
Modern analytical methods in determination of polyunsaturated fatty acids in intact lipid
molecules . .....................................................................................................................................................................37
Lipidomická analýza novorozeneckého mázku ...............................................................................................38
New quantitation approaches in lipidomic analyses of patients with cardiovascular diseases . ...39
Identification and quantitation of lipids using high-performance liquid chromatography
and mass spectrometry ............................................................................................................................................40
Steroidní sondy a standardy pro studium biologických dějů .....................................................................41
Rapid Analysis of the Human Plasma Lipidome in a High Resolution Acquisition Workflow .........42
Nanoparticle mediated delivery of therapeutic nucleic acids in vivo; what does
it take to move into clinic?........................................................................................................................................43
Nanoliposomes for construction of recombinant vaccines and delivery of anticancer and
antiviral drugs................................................................................................................................................................44
16
SBORNÍK ABSTRAKT
Significant synergism of antitumor activities of HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate
and IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes: a concept of modern chemoimmunotherapy ...........45
Liposomes as carriers for hydrophobic anticancer drugs: paclitaxel as the example ........................46
Preparation and characterisation of recombinant OspC liposome-based experimental
vaccine with entrapped lipophilic derivatives of norAbuMDP against Borrelia burgdorferi ..........47
Liposomes and microbubbles for in vivo MRI and ultrasound diagnostics............................................48
Vazba povrchových antigenů spirochety Borrelia burgdorferi na metaloafinitní liposomy
ovlivňuje typ vyvolané imunitní odpovědi na myším modelu . .................................................................49
The effect of water-based medium on the structure of gemini
surfactant–DOPE–DNA complexes........................................................................................................................50
Lipid alterations induced by supplemented fatty acids in human colon fetal
and carcinoma cells.....................................................................................................................................................51
POSTEROVÁ SEKCE
Nové matrice pro MALDI-MS analýzu uhlovodíků .........................................................................................54
Essential fatty acid diagnostics using modern analytical methods for nutrition studies?................55
Application on fish.......................................................................................................................................................55
Alternativní přístupy strukturní analýzy uhlovodíků ....................................................................................56
A non-aterogenic and atherogenic lipoprotein profile in examined individuals with
dyslipoproteinemia.....................................................................................................................................................57
Vliv pohlaví potkanů na cholesterol v séru, játrech a exkrementech při dietě s cholesterolem ...58
Změny ve složení membránových fosfolipidů v erytrocytech u Alzheimerovy choroby .................59
Analýza kinetiky a tvorby oxidačních produktů mitochondriálních lipidů . ..........................................60
Influence of cholesterol on the solubilization of multilamellar and unilamellar liposomes
caused by N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide . .....................................................................................61
Klinické aspekty lipidomického profilování v kardiologii . ...........................................................................62
Recombinant CDO from T. mentagrophytes ....................................................................................................63
DNA vaccination of different glycosyltransferses induced immune response after
hydrodynamic DNA vaccination of mice ............................................................................................................64
N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide as a structural modulator of monoolein
cubic phases...................................................................................................................................................................65
17
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
REJSTŘÍK AUTORŮ
Befekadu Asfaw Debela, E-mail: [email protected]
Cífková Eva, Ing., E-mail: E-mail: [email protected]
Cvačka Josef doc., RNDr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Galuszka Jan, MUDr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Hofmanová Jiřina, doc., RNDr., CSc., E-mail: [email protected]
Holčapek Michal, prof., Ing., Ph.D., E-mail: [email protected]
Horká Petra, Mgr., E-mail: [email protected]
Hubčík Lukáš, Mgr., E-mail: [email protected]
Huláková Silvia, E-mail: [email protected]
Chodounská Hana, RNDr., CSc., E-mail: [email protected]
Jiroš Pavel, Mgr., PhD., E-mail: [email protected]
Kašperová Alena, E-mail: [email protected]
Klusáčková Zdeňka, Mgr., E-mail: [email protected]
Köfeler H.C.,
Kohutiar Matej, MUDr., E-mail: [email protected]
Komprda Tomáš, prof., MVDr., Ing., CSc., E-mail: [email protected]
Kopeček Milan, E-mail: [email protected]
Košťál Vladimír, doc. Ing., CSc., E-mail: [email protected]
Koudelka Štěpán, Ing., Ph.D., E-mail: [email protected]
Křupka Michal, Mgr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Kudová Eva, RNDr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Kuchař Ladislav, E-mail: [email protected]
Lísa Miroslav, Ing., Ph.D., E-mail: [email protected]
Lukáč Róbert, Mgr., E-mail: [email protected]
Malínská Hana, RNDr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Marounek Milan, prof., E-mail: [email protected]
Miller A.D., prof.,
Mašek Josef, PharmDr., E-mail: [email protected]
Oravec Stanislav, doc., MUDr., CSc., E-mail: [email protected]
Pekarová Michaela, Ph.D., E-mail: [email protected]
Pól Jaroslav, Ph.D., E-mail: [email protected]
Pullmannová Petra, Mgr., PhD., E-mail: [email protected]
Schiller Jürgen, Dr.,
Schneedorferová Ivana, Bc., E-mail: [email protected]
Skender Belma, E-mail: [email protected]
Skoumalová Alice, MUDr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Stuchlová Horynová Milada, Mgr., E-mail: [email protected]
Tomčala Aleš, Mgr., Ph.D., E-mail: [email protected]
Turánek Jaroslav, RNDr., CSc., E-mail: [email protected]
Tylichová Zuzana, Mgr., E-mail: [email protected]
Voldřichová Magdalena, E-mail: [email protected]
Vrkoslav Vladimír, Ph.D., E-mail: [email protected]
18
SBORNÍK ABSTRAKT
Adaptive changes in lipid composition of biological membranes and storage
fat reserves in animals exposed to low temperatures
Koštál V.
Biology Centre of the Academy of Sciences of the Czech Republic, Institute of Entomology
Animals living in temperate and polar zones have to cope with low temperatures on a seasonal
basis. This challenge is most important in ectotherms as their body temperature is dictated
by the environment and may even fall below the freezing point. Many species of insects are
known to overwinter in the field at body temperatures as low as -60°C and, in laboratory,
some show ability for cryopreservation in liquid nitrogen (-196°C). Insects evolved whole
array of evolutionary adaptations, including the capacity for rapid acclimatory changes, at all
levels of biological organization.
Lipidomic change represents a widespread feature of cold-acclimation in different ectotherm
animals and also in plants and microorganisms. In this lecture, basic theoretical paradigms
that adaptively explain seasonal changes in lipid composition of biological membranes and
storage fat reserves in animals will be summarized. These changes either help to maintain
and compensate physiological functions at low body temperatures in active animals (capacity
adaptation) or they help to prevent damage to the biological structures in those animals that
circumvent low temperatures by entering a state of dormancy (resistance response). Major
classes of seasonal modifications of lipid composition (such as desaturation; shortening the
fatty acyl chain length; reshuffling of fatty acids; phospholipid head group restructuring;
changes in sterol content) will be explained in mechanistic terms. Examples from research
conducted on insect models in the Laboratory of diapause, Biology Centre ASCR will be
presented.
19
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Dietary fatty acids in regulation of colon epithelial cell kinetics
Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Vaculová A.1,2, Tylichová Z.1,2, Skender B.1,2, Slavík J.3, Ciganek
M.3, Kozubík A.1,2, Machala M.3
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics,
Academy of Sciences of the Czech Republic,v.v.i.1
Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology,
Faculty of Science, Masaryk University2
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy,
Veterinary Research Institute, v.v.i.3
Dietary fatty acids, especially essential n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and shortchain fatty acid butyrate produced by microbial fermentation of fibre in the colon, appeared
to be important modulators of cell kinetics in colonic crypts. Thus, the significant role of these
compounds in colorectal carcinogenesis is supposed. Composition, structure, and metabolism
of cellular lipids are associated with membrane properties and intracellular signalling, thus
altering cell behaviour and response to various stimuli. We suggest that PUFAs and butyrate
may operate together and they can also modulate the effects of endogenous regulators, such
as apoptotic inducers of tumor necrosis factor (TNF) family cytokines. Moreover, their action
may be different in the cells on various level of malignant transformation.
First, we compared proliferative, differentiation and apoptotic response of the cell lines derived
from human colon fetal (FHC), adenoma (AA/C1, RG/C2), and carcinoma tissues (HT-29, HCT116) to treatment with sodium butyrate (NaBt) and n-3 (DHA, 22:6) or n-6 (AA, 20:4) PUFAs alone
or in combination. NaBt induced G0/G1 or G2/M arrest of the cell cycle, differentiation (FHC,
AA/C1, HT-29) and/or apoptosis (RG/C2, HCT-116) depending on the cell line. Combination of
NaBt with AA or especially with DHA suppressed differentiation in FHC, AA/C1 and HT-29 cells
and then evoked apoptotic response, particularly in FHC cells.
Searching for the attendance of cytokinetic modulation with cellular lipid alterations we
detected changes of plasma membrane lipid structure (flow cytometry, merocyanine 540),
cytoplasmic lipid droplet accumulation (flow cytometry, Nile red), reactive oxygen species
(ROS) production (flow cytometry, DHR-123) and fatty acid content and profile (LC/MS-MS, GC/
MS). Moreover, after treatment wih fatty acids and their combination we detected changes in
endogenous fatty acid synthesis associated with modulation of fatty acid synthase expression.
All these parameters were the most pronounced in the fatty acid sensitive FHC cells.
Fatty acids and their combination also activated nuclear receptor/tran­scription factor
PPARgamma and modulated expression of some specific proteins associated with cell growth
and death regulation and lipid metabolism.
Next, we showed that pretreatment with PUFAs sensitized relatively resistant colon epithelial
cell lines to subsequent treatment with endogenous apoptotic inducers anti-Fas antibody (CH11) and TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand).
In summary, our results imply that dietary fatty acids alone or especially in combination
significantly affect behaviour of colon epithelial cells depending on cell transformation status
and modulate cell sensitivity to endogenous apoptotic regulators.
Supported by grants Nos. P301/11/1730 and 303/09/H048 of Czech Science Foundation.
20
SBORNÍK ABSTRAKT
Fatty acid modulatory effects on colon epithelial cell signaling
Tylichová Z.1,2, Hofmanová J.1,2, Straková N.1, Kozubík A.1,2
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics,
Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1
Department of Animal Physiology and Immunology, Institute of Experimental Biology,
Faculty of Science, Masaryk University2
In colon epithelium, a balance between proliferation, diferentiation and apoptosis is essential
for maintaining homeostasis. Dysregulation of this condition substantially contributes
to colorectal carcinogenesis. The development and progression of this disease may be
significantly influenced by dietary lipids, especially by specific fatty acids required for a wide
range of physiological functions.
Thus, we investigated modulatory effects of short-chain fatty acid sodium butyrate (NaBt),
essential polyunsaturated n-3 docosahexaenoic acid (DHA) and their combination in colon
cancer cells with different grade of malignancy – human colon fetal (FHC) and adenocarcinoma
(HT-29).
Since hyperactivation of pro-survival PI3K/Akt signalling pathway is frequent in colorectal
cancer, we suppose that it may be involved also in the effects of NaBt and DHA. We used
specific Akt 1/2 inhibitor to block this PI3K/Akt pathway. First, we focused on cytokinetic
changes induced by NaBt and DHA. Using fluorimetry and western blotting methods we
investigated various parameters and found that NaBt decreased cell proliferation (CyQUANT),
induced differentiation (alkaline phosphatase activity) and/or apoptosis (caspase-3 and
PARP cleavage). Akt1/2 inhibitor increased fatty acid induced differentiation and decreased
apoptosis without changes of cell proliferation. Second, we were interested in fatty acid
induced lipid alterations. Membrane lipid structure changes - lipid unpacking (Merocyanine
540), lipid droplet accumulation (Nile red), reactive oxygen species production (DHR-123)
and decrease in mitochondrial membrane potential detected by flow cytometry were highly
influenced by combined NaBt/DHA treatment and Akt inhibition. Moreover, we detected
expression of proteins associated with lipid metabolism. Akt inhibitor additionaly reinforced
NaBt/DHA induced decrease in expression of Fatty Acid Synthase (FASN), an enzyme which
is often overexpressed in colon cancer cells. We also noticed NaBt/DHA increased activation
(Luciferase assay), but decreased expression of Peroxisome proliferator-activated receptor
gamma; (PPARgamma), nuclear receptor mediating the effects of fatty acids on transcription
level. Interestingly, activation of PPARgamma correlates with increased expression of caveolin1, protein connected with lipid droplet formation.
In summary, our results suggest that fatty acids induced antiproliferative, differentiation and/
or apoptotic effects are associated with specific cellular lipid alterations in colon cancer cells
and PI3K/Akt pathway plays the role in these effects.
Supported by grants Nos. 303/09/H048 and P301/11/1730 of Czech Science Foundation.
21
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Docosahexaenoic acid-mediated changes in sphingolipid metabolism and
their role in trail-induced apoptotic signalling in colon cancer cells
Skender B.1,2, Vaculová A.1, Slavík J.3, Machala M.3, Kozubík A.1,2, Hofmanová J.1,2
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics,
Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i.1
Department of Animal Physiology and Immunology,
Institute of Experimental Biology, Faculty of Science, Masaryk University2
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy,
Veterinary Research Institute, v.v.i.3
Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) including their n-3 series representative docosahexaenoic
acid (DHA) have been shown to influence the development of colorectal cancer. DHA has
unique structural and functional abilities, which allow it to affect diverse physiological and
pathological processes at the level of the cell membrane?asociated events and cell signaling
pathways involved in regulation of cytokinetics. It is documented that DHA can modulate
processes associated with regulation of cancer cell apoptosis. We hypothesized that DHA
exerts beneficial effects in sensitizing colon cancer cells to apoptosis induced by TRAIL (tumor
necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), thus contributing to their more effective
elimination.
TRAIL is a TNF family cytokine which selectively induces apoptosis in cancer cells while
sparing normal cells. Because of these unique effects, it is considered as a promissing
anticancer agent. However, some cancer cells such as colon are resistant to TRAIL-induced
apoptosis. We showed that pretreatment with physiological doses of DHA resulted in
significant enhancement of TRAIL-induced apoptosis of otherwise resistant human colon
cells, as documented by increased caspase activation and cleavage of their substrates.
Following the combined treatment, stimulation of mitochondrial apoptotic pathway and
activation of crucial proapototic effector molecules of the Bcl-2 family such as Bax and Bak
were demonstrated. Cellular lipid analyses (HPLC-MS-MS) revealed that treatment with DHA
resulted in changes of amount of specific classes of sphingolipids, which are suggested to
modulate the cancer cell sensitivity/re­sistance to TRAIL. Analysis of DHA-mediated changes
in sphingolipid metabolism, and their impact on apoptotic signaling induced by TRAIL will be
presented in our contribution.
This work was supported by grants Nos. 301/11/1730 and 303/09/H048 of the Czech Science
Foundation.
22
SBORNÍK ABSTRAKT
Ovlivnění cholesterolémie potkanů kyselinou eikosapentaénovou
a dokosahexaénovou
Komprda T., Zorníková G., Knoll A., Vykoukalová Z., Rozíková V. Škultéty O.
Mendelova univerzita v Brně
Jedním z rizikových faktorů kardiovaskulárních onemocnění (CVO) je zvýšená hladina
krevních lipidů (triacylglyceroly [TAG], cholesterol). K nutriceutikům s prokázanou historií
snížení rizika CVO patří rybí olej (RO) s vysokým obsahem kyseliny eikosapentaénové (EPA)
a dokosahexaénové (DHA). Ovlivnění triacylglycerolémie a cholesterolémie působením EPA
a DHA je na molekulární úrovni založeno na modulaci signálních drah zprostředkovaných
transkripčními faktory PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) a SREBP (sterol
response element-binding protein). Na rozdíl od jednoznačného snížení triacylglycerolémie
působením EPA/DHA, jsou výsledky epidemiologických studií ohledně cholesterolémie
kontroverzní.
Cílem experimentu bylo posoudit ovlivnění cholesterolémie potkanů krmených přídavkem
RO, včetně zjištění exprese genu insig (inzulinem indukovaný gen), v jehož promotoru se
předpokládá prvek odezvy pro PPAR-alfa, a který kóduje protein INSIG, jenž inhibuje signální
dráhu SREBP-2 s důsledkem potlačení exprese klíčových jaterních genů kódujících proteiny
řídící homeostázu cholesterolu: 3-hydroxy-3-metylglutaryl koenzym A reduktázu (HMG-CoAR) a receptor lipoproteinů nízké hustoty (LDL-R).
Byly použity dvě skupiny potkanů (Wistar albino) po 10 jedincích: kontrolní (K), krmená
standardní krmnou dávkou (SKD) a pokusná, krmená SKD s přídavkem RO (3 %) po dobu
48 dnů. Po odběru krve v anestezi a následném utracení zvířat byla odebrána jaterní tkáň.
Celkový plazmatický cholesterol, včetně jeho frakcí v LDL a HDL (lipoproteiny o vysoké
hustotě) byl stanoven enzymaticko-kolorimetrickou metodou. Z homogenizované jaterní
tkáně byla izolována mRNA, a pomocí metody qRT-PCR byla po korekci na expresi genu pro
β-aktin kvantifikována úroveň exprese genů kódujících PPAR-alfa, SREBP-2, INSIG, HMG-CoA-R
a LDL-R. Z alikvotního vzorku jater byly extrahovány celkové lipidy směsí hexan/isopropanol
a následně bylo stanoveno zastoupení mastných kyselin metodou plynové chromatografie.
U RO-potkanů byla oproti kontrole průkazně snížena (P<0,05) hladina celkového plazmatického
cholesterolu (1,07 vs. 1,19 mmol/l) a HDL-cholesterolu (0,75 vs. 0,85 mmol/l); hladina LDLcholesterolu nebyla ovlivněna (0,35 vs. 0,34 mmol/l; P>0,05). Zastoupení EPA+DHA v lipidech
jaterní tkáně bylo u RO-skupiny výrazně zvýšeno (P< 0,01) oproti kontrole: 10,9 vs. 4,9 % ze
sumy mastných kyselin. Relativní zvýšení exprese genu insig bylo v játrech RO-potkanů více
než šestinásobné oproti kontrole (P<0,05). Potlačení exprese genů pro HMG-CoA-R a LDL-R
působením EPA/DHA však nebylo prokázáno (P>0,05).
23
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Složení zásobních látek v tukovém tělese u matek čmeláků Bombus terrestris
v průběhu života
Jiroš P., Bučánková A., Kofroňová E., Kudzejová M., Šobotník J., Komzáková O., Valterová I.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
Životní cyklus matek čmeláka zemního (Bombus terrestris) je provázen fyziologickými
změnami, které jsou velmi výrazné. Pro tyto fyziologické pochody mají matky potřebu
akumulace značného množství energie. Zvláště pro hibernaci a dále také ve fázi kladení vajíček
musejí pokrýt značné energetické nároky. K pokrytí těchto nároků dochází prostřednictvím
zásob v tukovém tělese. Jedná se především o glykogen a triacylglyceroly.
Na definovaných jedincích z laboratorního chovu jsme pozorovali a stanovovali množství
(včetně složení) jednotlivých zásobních látek v 6 životních stádiích (farátní, čerstvě vylíhnuté,
před a po hibernaci, kladoucí a staré matky). Vedle chemicko-analytických metod bylo také
použito vyhodnocování z fotografií ultrastruktur tukového tělesa pořízených elektronovým
mikroskopem. Triacylglyceroly byly měřeny pro jednotlivá stádia pomocí LC-MS s APCI
ionizační technikou. Z výsledků vyplývá, že pro jednotlivé fyziologické etapy života matek jsou
různé potřeby využití zásobních látek, a také že se mění složení triacylglycerolů v průběhu
života.
Autoři děkují Technologické agentuře ČR (projekt č. TA01020969) za finanční podporu.
24
SBORNÍK ABSTRAKT
Shotgun Lipidomics and High Mass Resolution
Pól J.
Thermo Fisher Scientific (Praha), s.r.o.
25
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Stanovení od mastných kyselin přes Omega 3 až po metabolomiku pomocí
plynové chromatografie
Voldřichová M.
Pragolab s.r.o.
26
SBORNÍK ABSTRAKT
Lipidomic profiling by high resolution Mass Spectrometry
Köfeler H.C.
Medical University Graz, Center for Medical Research, Austria
27
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Changes in urinary sulfatide isoform profile in metachromatic
leukodystrophy: diagnostic applications and pathological basis
Kuchař L.1, Tureček F.2, Asfaw B.1, Ledvinová J.1
Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine,
Charles University in Prague and General University Hospital in Prague1
Department of Chemistry, University of Washington, Seattle, USA2
Metachromatic leukodystrophy (MLD, OMIM 250100) is caused by the deficiency of
arylsulphatase A (ASA) resulting in lysosomal storage of sulphatides. Three clinical forms of
MLD (late infantile, juvenile and adult) can be distinguished by symptoms manifestation.
Bone marrow transplantation is the only treatment approach in milder forms of MLD but
often with an uncertain outcome. Prenatal diagnosis prevents further occurrence in affected
families.
Intralysosomal storage of nondegraded sulphatides also occurs in disorders caused by defects
in the activator proteins, saposin B or its precursor prosaposin, necessary for arylsuphatase
A function.
Early diagnosis is important for genetic consulting in families of patients. Different diagnostic
approaches are known but only few of them are suitable for screening.
Previous diagnostic methods utilized HPTLC chromatographic evaluation of sulphatides
excreted in urine. We developed new method based on Folch extraction of urines followed
by flow injection analysis and multiple reaction monitoring in negative ion mode by tandem
mass spectrometry (FIA-ESI-MS/MS Evaluation of urinary sulphatides pattern in urines from
MLD patients.revealed isoform shift toward molecular species with long chain fatty acid.
Similarly altered sulfatide isoforms were also found in saposin B and prosaposin deficiences
– sulfatidoses of different origin.
Based on these data, we developed a new method of selected (primary elevated) urinary
sulphatides isoform measurement. In this procedure, DEAE membranes for selective
sulphatide binding were applied on week anex groups to simplify the to avoid liquid sample
transportation and to get sulfatide sample partialy purified.
We also found Percetually most stable C18:0 isoform was used as indigenous internal standard
thus avoiding the need for internal standards from commercial sources. This makes new
method simple, fast and reliable. Pathophysiological basis of isoform shift was proposed.
Urinary sulphatide profile was monitored over three years in a patient with juvenile form
of MLD after BMT to evaluate the efficiency of treatment. Results were consistent with the
patient´s clinical status while the results of ASA activity in leukocytes did not correspond.
We conclude that urinary sulfatide profiling offers a robust method applicable for screening
studies and treatment monitoring. The benefit is the usage of DEAE membrane that avoids
liquid transfers like DBS in enzymology, which is however still missing in the case of MLD.
//
This work was supported by the project PRVOUK-P24/LF1/3, the Grant SVV 264 502 from the
Charles University in Prague, Czech Republic.//
28
SBORNÍK ABSTRAKT
Lipotoxicita a ektopické akumulace lipidů v patogenezi metabolického
syndromu a diabetu
Malínská H., Kazdová L.
Institut klinické a experimentální medicíny
Metabolický syndrom, který postihuje v rozvinutých zemích až čtvrtinu populace, výrazně
zvyšuje riziko rozvoje diabetu a kardiovaskulárních chorob. Klíčovou úlohu v rozvoji
metabolického syndromu a s ním asociovaných poruch má nepochybně dyslipidémie a s ní
spojené zvýšené ukládání triglyceridů a jejich metabolitů (diacylglycerolů, mastných kyselin
s dlouhým řetězcem a ceramidů) mimo tukovou tkáň (ektopicky) do kosterních svalů, jater
a myokardu. Příčinou ektopické akumulace lipidů může být nadměrný kalorický příjem,
nerovnováha mezi syntézou lipidů a jejich nízkou oxidací při nízké fyzické aktivitě, snížená
diferenciační schopnost v tukové tkáni, nižší antilipolytický účinek inzulinu a řada dalších
příčin. Ektopicky uložené lipidy pak nejen vstupují do metabolických pochodů, ale ohrožují
i přímo existenci buněk a funkčnost celých orgánů.
Nadbytek lipidových metabolitů negativně ovlivňuje funkci buněčných organel, především
mitochondrií a endoplazmatického retikula a je spojena se zvýšenou produkcí reaktivních
metabolitů kyslíku (ROS-reactive oxygen species), oxidačním stresem a aktivací zánětlivých
procesů v metabolicky aktivních tkáních. Tento proces, označovaný jako lipotoxicita, může
hrát důležitou úlohu v patogenezi inzulínové rezistence v kosterních svalech, nealkoholické
jaterní steatóze, srdečním selhání a může vést k rozvoji renálních dysfunkcí. Přestože je
otázkám lipotoxicity věnována značná pozornost, zůstávají mechanizmy, kterými dyslipidémie
ovlivňuje zánětlivé procesy, oxidační stres a inzulinovou rezistenci neobjasněny.
Vliv ektopické akumulace lipidů jsme sledovali v našich studiích na kmeni potkanů s geneticky
fixovanou hypetriglyceri­démií, kteří vykazují většinu metabolických poruch spojených
s metabolickým syndromem (dyslipidémie, zhoršená glukózová tolerance, rezistence tkání
k účinku inzulinu, hypertenze). Výrazně zvýšené sérové hladiny triglyceridů u těchto potkanů
vedly k akumulaci triglyceridů v játrech, kosterních svalech a aortě. Chronicky zvýšené hladiny
NEMK pozorované u těchto potkanů jak při OGTT tak během 24 hodinového denního profilu
se rovněž mohou uplatnit v patogenezi lipotoxicity. Zvýšené hladiny NEMK u těchto potkanů
mohou být důsledkem jejich zvýšené sekrece z adipocytů a nižšího antilipolytického účinku
inzulinu.
K akumulaci lipidů může příspívat i jejich snížená oxidace sledovaná v kosterních svalech
podle inkorporace 14C-palmitátu do CO2 ve svalu. Dyslipidémie a ektopická akumulace
triglyceridů u těchto potkanů byla spojena s nižšími sérovými koncentracemi adiponektinu
a zvýšenými hladinami prozánětlivých faktorů C-reaktivního proteinu, TNF-&#61537;, a IL6. Zvýšené koncentrace lipoperoxidačních produktů a nižší aktivita antioxidačních enzymů
zjištěné ve tkáních hypertriglyce­ridemických potkanů svědčí pro oxidační stres.
Získané výsledky ukazují, že v negativních účincích lipotoxicity mohou hrát roli zvýšené
koncentrace NEMK ovlivňující negativně glukózovou homeostázu a utilizaci glukózy
v periferních tkáních. Rovněž se mohou uplatnit zánětlivé procesy indukované zvýšenou
produkci prozánětlivých cytokinů. Tyto poruchy spolu s oxidačním stresem mohou přispívat
k rozvoji inzulinové rezistence a s ní spojených orgánových komplikací, kterými je jaterní
steatóza, diabetes a kardiovaskulárních poruchy.
Studie byla podpořena projektem (MZ) rozvoje výzkumné organizace 00023001(IKEM)
a granty IAA 500110805 a P301/11/2418.
29
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Význam nitrovaných mastných kyselin jako endogenních kardioprotektivních
mediátorů
Pekarová M.1, Ambrožová G.1,2, Rudolph T.3, Ravekes T.3, Lojek A.1, Kubala L.1
Biofyzikální ústav, Akadenie věd České republiky v.v.i.1
Oddělení experimentální biologie a imunologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita2
Oddělení Kardiologie, Hamburg University Heart Center, Hamburg, Německo3
Srdeční selhání, jako časté a závažné onemocnění, je stále jednou z největších
ekonomických zátěží ve zdravotnictví. Příčinou tohoto patofyziologického stavu je narušení
fyziologických funkcí kardiomyocytů, buněk hladké svaloviny i endoteliálních buněk cév
a vznik kardiovaskulární dysfunkce. Klíčovým terapeutickým cílem moderní kardiologie je
minimalizace poškození srdeční tkáně. Pro úspěšné naplnění tohoto cíle je nezbytné pochopit
a objasnit, jak molekulární mechanizmy účastnící se poškození myokardu tak i biologické
principy uplatňující se v nově zaváděných terapiích. Proto je cílem tohoto projektu objasnění
role nitrovaných mastných kyselin (nitro-MK), jenž jsou endogenně produkovány v různých
tkáních a buněčných membránách, jako potenciálních kardioprotektivních látek, v srdečním
selhání. V posledních několika letech vícero studií potvrdilo protizánětlivé účinky nitro-MK
v různých in vivo a in vitro modelech, včetně modulace aktivace makrofágů, prevence aktivace
leukocytů, krevních destiček a rozvoje aterosklerózy. Tyto výsledky naznačují možný ochranný
účinek nitro-MK také u srdečního selhání. Naše předběžné studie ukázaly slibné výsledky
potvrzující, že tvorba nitro-MK během procesů srdečního selhání má kardioprotektivní účinky
zprostředkované především inhibicí transkripčního faktoru NF-kappaB a redukcí produkce
reaktivních metabolitů kyslíku a dusíku, což naznačuje jejich významnou roli v regulaci
intracelulárních signálních drah, jenž jsou spojeny s rozvojem kardiovaskulární a také imunitní
dysfunkce.
30
SBORNÍK ABSTRAKT
Degradační produkty peroxidace lipidů v krvi u Alzheimerovy choroby
Skoumalová A.1, Illner J.1, Klusáčková Z.1, Topinková E.2, Vyhnálek M.3, Lasz J.3, Hort J.3
Ústav lékařské chemie a biochemie, 2. LF UK1
Geriatrická klinika 1. LF UK a VFN2
Neurologická klinika 2. LF UK a FN Motol3
Mozková tkáň obsahuje vysoký podíl lipidů, z nichž významnou část tvoří polynenasycené
mastné kyseliny (PUFA). Změny v lipidovém složení hrají významnou úlohu v rozvoji
Alzheimerovy choroby (ACH). Peroxidace mozkových PUFA doprovází patogenezi ACH a vede
k tvorbě lipofilních produktů, které mohou difundovat do krve. Cílem naší práce je hledání
specifických degradačních produktů peroxidace mozkových lipidů v krvi u pacientů s ACH,
které by mohly sloužit jako biomarkery této choroby. Dále jsme se zaměřili na tzv. mírnou
kognitivní dysfunkci (MCI), která představuje prodromální fázi ACH a je z hlediska časného
záchytu ACH a terapie významným cílem v hledání biomarkerů ACH.
Do naší studie byli zařazeni pacienti s diagnostikovanou ACH, dále pacienti s MCI a kontroly.
Degradační produkty peroxidace lipidů byly stanovovány v erytrocytech. Celkem bylo
zpracováno 60 vzorků. Analýzy byly provedeny pomocí fluorescenční spektroskopie a na
základě zjištěných fluorescenčních maxim bylo provedeno kvantitativní srovnání jednotlivých
skupin. Pomocí matematického zpracování fluorescenčních spekter byly hledány rozdíly ve
složení degradačních produktů peroxidace lipidů u jednotlivých pacientů.
Získaná fluorescenční spektra ukazují na významnou kumulaci degradačních produktů
peroxidace lipidů u pacientů s MCI v porovnání s kontrolami (přibližně dvojnásobek) .
V erytrocytech pacientů s ACH byly také prokázány ve zvýšené míře tyto produkty, ale jejich
množství je nižší než u MCI. Matematické derivace fluorescenčních spekter ukazují změny
ve složení degradačních produktů peroxidace lipidů ve skupinách pacientů s MCI a ACH.
Nejvýznamnější změny byly prokázány při fluorescenčních maximech 310/360, 335/360
a 390/440 nm (excitace/emise).
Závěrem lze shrnout, že nejvyšší kumulace degradačních produktů v krvi byla prokázána
u pacientů s MCI, což má z hlediska hledání biomarkeru a zahájení včasné terapie s cílem
zmírnit progresi ACH velký význam.
Tato práce byla podporována grantem GAUK 604 912.
31
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Metabolic fate of glucosylceramide: Unsolved puzzle in Gaucher disease
Asfaw B., Kuchař L., Fialová M., Poupětová H., Ledvinová J., Elleder M.
Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine,
Charles University in Prague and General University Hospital in Prague
Beta-glucocerebrosidase (GBA1) is a key lysosomal hydrolase in catabolism of
glycosphingolipids, and removes glucose from glucosylceramide (GlcCer). The deficiency of
GBA1 activity causes a lysosomal metabolic defect known as Gaucher disease. Undegraded
substrate glucosylceramide accumulates in macrophage derived cells known as Gaucher
cells. Glucosylpsychosine (lyso-GlcCer), another substrate of GBA1 which is known for its cell
toxicity, is also elevated, e.g. in the plasma of Gaucher patients.
Although most aspects of Gaucher disease are well defined, still its molecular mechanism,
including macrophage specific accumulation of GlcCer and lack of visible storage in other
affected cells, is not clearly understood.
Therefore, we studied the fate of the critical substrates of GBA1, GlcCer and lyso-GlcCer, in
living cells using feeding experiments with mass labeled sphingolipids. Substrates and
degradation products were then analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS) .
We used skin fibroblasts from Gaucher type II patients ((L444P/S107L) including the most
severe phenotype (?Collodion baby?, R359X/V398F). Three types of materials were analyzed
in each in situ experiment: cells, supernatant and sediment (containing depleted cells) from
centrifuged cultivation medium.
Results: When cell homogenates were in vitro incubated with C12:0 GlcCer, Gaucher cells
samples showed almost zero enzyme activity. This is in agreement with the values measured
with fluorogenic substrate. In contrast, the same cell lines in situ revealed similar degree of
GlcCer degradation and pattern of products as in control cells.
A small quantity of lyso-GlcCer was measured in all cell lines. Tracking of lyso-GlcCer with
GlcCer precursor double-labeled on ceramide (C23:0-D2-Gb3Cer) confirmed that there is no
direct deacylation reaction forming lyso-GlcCer from GlcCer. Both GlcCer and lyso-GlcCer
were present only in cells and sediment from cultivation medium (consisting of detached and
dead cells). Higher concentration of GlcCer and lyso-GlcCer in the sedimented detached cells
of cultivation medium than in living cells suggests a direct connection between both lipids
and the pathology of the cells.
Conclusions: Application of natural mass labeled glycolipid substrates in combination with
MS/MS analysis represents more effective approach for evaluation of experiments in metabolic
studies than previous methods.
Since our results suggest that deacylation of GlcCer to lyso-GlcCer is not alternative
degradation route in GBA1 deficient cells, defining molecular mechanism of Gaucher disease
stays as challenge of our future studies.
This work was supported by the project PRVOUK-P24/LF1/3, the grant project of Ministry of
Education MSM 0021620806 and by the grant No 19509 from the Grant Agency of the Charles
University, Czech Republic
32
SBORNÍK ABSTRAKT
Nové anionické steroidní inhibitory fázicky a tonicky aktivovaných NMDA
receptorů
Kudová E.1, Chodounská H.1, Slavíková B.1, Vyklický V.2, Borovská J.2, Krausová B.2,
Vyklický L, Jr.2
Ústav organické chemie a biochemie Akademie věd ČR, v.v.i.1
Fyziologický ústav Akademie věd ČR, v.v.i.2
Receptory pro kyselinu N-metyl-D-asparagovou (NMDA) hrají klíčovou roli pro excitační
synaptický přenos a také při synaptické plasticitě. Přílišná aktivace NMDA receptoru způsobená
jeho vlastním agonistou (kyselinou L-glutamovou) vede k excitotoxické smrti buněk. Funkce
NMDA receptoru může být ovlivněna exogenními i endogenními ligandy, mezi které patří
neurosteroidy – endogenní sloučeniny, které jsou syntetizovány v mozku a ovlivňují činnost
CNS. 20-Oxo-5β-pregnan-3α-yl sulfát (pregnanolon sulfát; PA-S) je endogenní neurosteroid
schopný inhibovat NMDA receptory, který má také neuroprotektivní vlastnosti. Jeho nízká
biodostupnost a malá metabolická stabilita však limituje jeho in vivo užití.
Byla připravena série nových, metabolicky stabilnějších derivátů pregnanolonu s negativně
nabitým substituentem v poloze C-3, které se liší vzdáleností záporného náboje a steroidním
skeletem – hemiestery kyseliny šťavelové, malonové, jantarové, glutarové, adipové, pimelové
a suberové. Pro tyto látky byla metodou terčíkového zámku (patch-clamp) určena míra inhibice
a hodnoty IC50 na HEK293 buňkách o podjednotkovém složení NR1–1a/NR2B a také krysích
hipokampálních neuronech. Takto byla experimentálně určena přímá souvislost mezi mírou
inhibice a hodnotami IC50 a délkou řetězce substituentu na C-3, resp. jeho lipofilicitou pro
nově připravené syntetické analogy pregnanolon sulfátu. Taktéž bylo prokázáno, že se tyto
sloučeniny liší v míře inhibice tonicky vs. fázicky aktivovaných NMDA receptorů. Schopnost
predikovat míru inhibice a hodnoty IC50 nových syntetických analogů PA-S a zároveň zlepšení
jejich farmakologických vlastností by mohlo vést k praktickým výstupům v oblasti léčby
vážných neurologických onemocnění jako např. mozkové mrtvice, epilepsie, Alzheimerovy
choroby.
Práce byla provedena za podpory grantu GAČR 303/12/1464 výzkumného záměru RVO
61388963.
33
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
In Vivo zobrazovací metody v preklinickém výzkumu
Kopeček M.
BioTech a.s.
34
SBORNÍK ABSTRAKT
Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Lipid Research
Fuchs B., Süß R., Schiller J.
University of Leipzig, Medical Department, Institute of Medical Physics and Biophysics,
Leipzig, Germany
Although matrix-assisted laser desorption and ionization (MALDI) mass spectrometry (MS)
often but not exclusively coupled with a time-of-flight (TOF) mass analyzer is particularly
established in the protein field, there is increasing evidence that MALDI MS is also very useful
in lipid research: MALDI MS is fast, sensitive, tolerates sample impurities to a considerable
extent and provides very simple mass spectra with (often) negligible fragmentation of the
analyte. Additionally, MALDI mass spectrometers originally purchased for „proteomics“ can be
used also for lipids without the need of major system alterations.
After a short introduction into the method and the related ion-forming process, the MALDI
mass spectrometric characteristics of some selected glycero-(phospho)-lipids will be
discussed. Special attention will be paid to (a) the analysis of mixtures and (b) quantitative
aspects of MALDI MS because this is normally considered to be the „weak“ point of the
method. Although the detailed role of the matrix is not yet completely clear, it will be also
explicitly shown that the careful choice of the matrix is crucial in order to be able to detect all
compounds of interest in a mixture. This is particularly important regarding the detection of
less abundant compounds.
Two rather recent developments will be highlighted: „Imaging“ MS is nowadays widely
established and significant interest is paid in this context to the analysis of lipids because
lipids ionize particularly well and are, thus, more sensitively detectable in tissue slices than
other biomolecules such as proteins. It will also be shown that MALDI MS can be very easily
combined with thin-layer chromatography (TLC) allowing the direct „rasterizing“ of the TLC
plate and the detection of lipids with a higher sensitivity than common staining protocols.
35
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Separation of Triacylglycerol Enantiomers and Regioisomers using Chiral
HPLC/MS
Lísa M., Holčapek M.
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry
Triacylglycerols (TGs) are important components of human diet used as a source of energy,
fatty acids (including essential ones), fat soluble vitamins and other nonpolar compounds.
The variety of TG species is enormous due to a high number of fatty acids present in natural
samples differing in acyl chain lengths, their position on the glycerol skeleton (regioisomers,
enantiomers) and number, position(s) and cis-/trans- configuration of double bonds (DBs),
all having great differences in their biological and nutritional properties. The detailed
characterization of fatty acid composition including the determination of individual isomers
is important from the nutrition point of view due to their different biological activity. The
stereospecific analysis of individual TGs represents a challenging task in the lipidomics
due to different bioavailability of fatty acids on the glycerole skeleton in the stereospecific
environment of enzymes in the human body. We have optimized a chiral HPLC/MS analysis for
the separation of TG isomers using cellulose-based chiral HPLC column in the normal-phase
mode. Under optimized chromatographic conditions, both regioisomers and enantiomers are
separated in one analysis. The retention behavior of TGs is governed mainly by the number
of DBs, i.e., retention times of TGs increase with increasing number of DBs. At least partial
separation of TGs based on acyl chain lengths or position and configuration of DBs is also
achieved using optimized chiral HPLC method. TGs are identified based on their positiveion atmospheric pressure chemical ionization (APCI) mass spectra providing protonated
molecules and high relative abundance of fragment ions formed by the neutral loss of fatty
acid from the glycerol skeleton. The comparison of relative abundances of these fragment
ions is used for the differentiation of individual regioisomers, because the loss of fatty acid
from sn-2 position is less preferred, which results in a fragment ion with lower relative
abundance in comparison to sn-1 and sn-3 positions. No visible differences are observed in
APCI mass spectra of enantiomers identified based on retention times of identical standards.
We have developed a method for the synthesis of TG enantiomers with wide range of fatty
acids commonly present in natural samples (i.e., palmitic, stearic, oleic, linoleic, linolenic
and arachidic acids). The retention behavior of TGs isomers is also studied using mixtures
of TG isomers prepared by the randomization reaction of selected monoacyl TG standards
providing mixtures of all isomers in an equal amount. We have demonstrated the utilization of
developed chiral HPLC/MS method for the separation of complex natural TG mixtures of plant
oils or human plasma samples.
This work was supported by the project 203/09/0139 sponsored by the Czech Science
Foundation.
36
SBORNÍK ABSTRAKT
Modern analytical methods in determination of polyunsaturated fatty acids in
intact lipid molecules
Tomčala A., Valterová I.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR
Modern biological studies in the fields of health, nutrition, physiology, and pharmacology
require detailed chemical data obtained from appropriate methods of sample analyses.
Determination and quantification of biological sample composition on the molecular level is
essential. In this lipidomic study, we focused on glycerolipids (GLs). Recently, polyunsaturated
fatty acids (PUFAs) are in focus. PUFAs are essential for normal brain development and function.
Furthermore, they are tested for medical treatment of metabolic syndrome, a combination
of medical disorders that increase the risk of cardiovascular disease and diabetes. Central
adiposity is a key feature of the syndrome. Regular supply by &#969;-3 and &#969;-6 PUFAs
prevents occurrence of obesity in mice. PUFAs belong to essential fatty acids, i.e. they must
be taken from the diet as humans lack the &#916;12– and &#916;15-desaturases necessary for
inserting double bonds in the n-3 or n-6 (&#969;-3 or &#969;-6) positions. The most important
long chain n-3 PUFAs are eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3) and docosahexaenoic acid
(DHA, 22:6n-3).
We developed analytical methods suitable for PUFAs determination and quantification in
most biological samples. Firstly, we used the total lipid extraction method designed by Folch
followed by the solid phase extraction (SPE) which divides total lipid extract to three fractions:
non-polar lipids, free fatty acids, and phospholipids. The presence of PUFAs is determined by
high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with electrospray ionization (ESI)
and mass detection (MS). HPLC/ESI/MS provides us with information about the carbon chain
length, number of double bonds, origin (phospholipids or non-polar lipids), and position
of PUFA in the lipid molecule. Subsequent derivatization, namely acid transesterification of
a particular fraction, followed by gas chromatography and mass spectrometry (GC/MS), gives
us the information about position of double bond in the carbon chain.
These analytical methods represent an excellent tool for rapid and reliable determination and
quantification of PUFAs. Examples of analyses of different biological samples will be given.
Folch et al.: J. Biol. Chem. 1957, 226, 497.
Financial support by the Czech Science Foundation (# 502/10/1734) and Technological Agency
of the Czech Republic (#TA01020969) is gratefully acknowledged.
37
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Lipidomická analýza novorozeneckého mázku
Míková R.1, Vrkoslav V.1, Hanus R.1, Kaftan F.1,2, Rejšek J.2, Čmelíková T.3, Horká P.1,2,
Zábranská M.1,2, Doležal A.4, Plavka R.4, Cvačka J.1
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v.v.i.1
Přírodovědecká fakulta UK v Praze2
Gymnázium Joachima Barranda Beroun3
Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN v Praze4
Novorozenecký mázek (vernix caseosa, VC) je biofilm, který pokrývá lidský plod během
posledních stádií těhotenství a novorozence v prvních dnech po narození. Jeho hlavní funkcí
je ochrana kůže před macerací v plodové vodě, usnadnění porodu, adaptace kůže v prvních
dnech po narození a dočasná podpora imunitního systému. VC vykazuje antimikrobiální
a antioxidační vlastnosti a současně má pozoruhodnou schopnost urychlovat hojení ran.
Značná pozornost je proto věnována přípravě umělých náhražek VC, které by se uplatnili
v klinické praxi u předčasně narozených dětí s nezralou kůží nebo při léčbě popálenin. Z hlediska
chemického složení je VC tvořen vodou, bílkovinami a lipidy. Lipidy VC tvoří extrémně bohatou
směs, kterou se i přes značné úsilí dosud nepodařilo uspokojivě charakterizovat. Zároveň není
prakticky nic známo o změnách složení VC při jeho ontogenezi, o variabilitě mezi jednotlivci,
o vlivu různých onemocnění na jeho složení či o jeho možném využití v diagnostice.
V rámci projektu jsou charakterizovány lipidy VC s využitím standardních i nově vyvíjených
metod chromatografie a hmotnostní spektrometrie (MS). VC je studován v intaktní formě
metodami MS založenými na ambientní ionizaci (DESI, DAPPI) nebo MALDI. Účinnost různých
metod izolace lipidů (Folchova metoda, extrakce s MTBE apod.) je vzájemně porovnávána.
Lipidové extrakty jsou dále děleny do jednotlivých tříd pomocí adsorbční chromatografie
v kolonovém a TLC formátu. K podrobné charakterizaci lipidů v jednotlivých třídách je
používána buď přímá MS analýza nebo její kombinace s chromatografií, nejčastěji HPLC.
Jedním z prvních výsledků projektu je zjištění statisticky významných rozdílů ve složení
některých lipidů u vzorků VC chlapců a dívek.
Tato práce vznikla za podpory GAČR P206/12/0750 a projektu RVO 61388963.
38
SBORNÍK ABSTRAKT
New quantitation approaches in lipidomic analyses of patients with
cardiovascular diseases
Holčapek M.1, Cífková E.1, Červená B.1, Lísa M.1, Znaleziona J.2, Vostálová J.2, Galuszka J.3
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry1
Palacký University Olomouc, Faculty of Medicine and Dentistry2
Faculty Hospital Olomouc, Czech Republic3
Lipidomics contributes towards the understanding how lipids function in a biological system
and for the elucidation of the mechanism of lipid-related diseases, such as cardiovascular
diseases. For this purpose, a complex lipidomic approach using off-line 2D-LC/MS/MS is
developed together with the complementary information from conventional GC/FID profiling
of fatty acid methyl esters. The study design contains 5 groups (3 types of cardiovascular
diseases, subjects with class I obesity and healthy controls), 10 men per group aged between
40 and 55 and analyzed samples are plasma, erythrocytes, HDL, LDL and VLDL. Total lipid
extracts are fractionated using hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)
in the first dimension, which enables the isolation of more than 15 classes of polar lipids,
such as different classes of phospholipids, sphingolipids, glycolipids, etc. Non-polar lipids
(triacylglycerols, diacylglycerols, sterols, cholesterol esters) are separated and quantified by
fast normal-phase LC/MS method. Isolated fractions of individual lipid classes are separated
in the second dimension either using reversed-phase HPLC with C18 porous shell particles
column or with sub-2 &#956;m particles in UHPLC mode. Individual lipid species are separated
according to acyl chain lengths, number and position of double bonds in individual fatty acids.
All obtained data are statistically evaluated by principal component analysis with the goal to
identify lipid biomarkers of cardiovascular diseases. Finally, samples representing each of five
patient groups are characterized by multiple 1D and 2D LC/MS methods including silver-ion,
RP and chiral HPLC modes.
This work was supported by the project No. 206/11/0022 sponsored by the Czech Science.
39
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Identification and quantitation of lipids using high-performance liquid
chromatography and mass spectrometry
Cífková E., Lísa M., Holčapek M.
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry
The identification and quantitation of all lipids in complex biological tissues is the first step
towards the understanding how lipids function in a biological system and the elucidation of the
mechanism of lipid-related diseases including obesity, atherosclerosis, cancer, cardiovascular
diseases, etc. High-performance liquid chromatography and mass spectrometry coupling
(HPLC/MS) has the highest potential to obtain comprehensive information about the whole
lipidome. Our optimized HILIC-HPLC/MS enables the fractionation of more than twenty
individual lipid classes including 3 regioisomeric pairs in a wide range of polarities in one
analytical run. The development of method for the quantitation of main lipid classes and also
lipid species within these classes is a challenging task. For this reason, novel non-targeted
lipidomic quantitation was described and results were compared with the conventional
approach with multiple SRM scans measured on triple quadrupole analyzer. Concentrations
of individual lipid classes were obtained by the peak integration in the HILIC mode multiplied
by response factors calculated for individual classes and correlated with sphingosyletha­
nolamine (d17:1/12:0) as an internal standard. Non-targeted lipidomic quantitation is an
appropriate tool for the comprehensive lipidomic characterization of individual lipid classes
and the determination of all minor and unknown species inside these classes. Detailed
lipidomic analysis of various tissues has a potential for search of unknown lipid species at
trace concentrations, which may play an important role in the signaling of serious diseases.
This work was supported by the grant project No. 203/09/0139 (Czech Science Foundation).
40
SBORNÍK ABSTRAKT
Steroidní sondy a standardy pro studium biologických dějů
Kapras V.1, Slavíková B.2, Slavíčková A.1, Rambousek L.2, Valeš K.2, Vyklický V.2,
Vyklický L. Jr.2 , Kudová E.1, Chodounská H.1
Ústav organické chemie a biochemie, AV ČR, v. v. i.1
Fyziologický ústav, AV ČR, v. v. i.2
Steroidy a jim podobné sloučeniny jsou důležitou složkou téměř všech živých organismů.
Účastní se trávení, jsou důležitou součástí signálních drah i stavebními bloky biologických
membrán. Mnoho z těchto funkcí bylo podrobně prostudováno, ale stále se objevují další.
Jako příklad mohou sloužit tzv. neurosteroidy, které jsou mozkem produkovány pro regulaci
nervových procesů.
Nové objevy umožnil rychlý rozvoj sofistikovaných metod studia biologických dějů. Tyto
metody k optimálnímu fungování vyžadují vhodné standardy a molekulární sondy.
Připravili jsme izotopicky značené steroidní molekuly, fluorescenční a fotoaktivovatelné
steroidní sondy.
Syntetizované molekuly byly zatím použity pro stanovení farmakokinetiky steroidních
neuroprotektiv a pro studium kinetiky transportu neuroaktivních steroidů do neuronů.
41
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Rapid Analysis of the Human Plasma Lipidome in a High Resolution
Acquisition Workflow
Simons B.1, Kauhanen D.2, Sylvänne T.2, Tarasov K.2, Duchoslav E.1, Ekroos K.2
AB SCIEX, Canada1
Zora BioSciences, Finland2
Abstract:
Shotgun lipidomics has evolved into a variety of multi-dimensional strategies for molecular
lipid characterization that comprise bioinformatics tools for mass spectrum interpretation
as well as quantitative measurements to study systems-lipidomics in complex biological
extracts. Taking advantage of spectral mass accuracy, scan speed and sensitivity of improved
quadrupole linked time-of-flight mass analyzers, a bias-free global lipid profiling acquisition
technique of sequential precursor ion fragmentation called MS/MSALL was developed. This
generic information-independent tandem mass spectrometry technique consists of a Q1
stepped mass isolation window through a set mass range in small increments, fragmenting
and recording all product ions and neutral losses. The molecular lipid species, including
distinction of isomeric and isobaric species, are resolved based on the accurate MS and
MS/MS information, and then composed into more precise lipidomic outputs. The method
demonstrates good reproducibility and at least 3 orders of dynamic quantification range for
isomeric ceramides in human plasma. Over 400 molecular lipids in human plasma have been
uncovered and quantified in less than 7 minutes, including acquisitions in both positive and
negative polarity modes. We anticipate that the performance of the MS/MSALL technique both
in quality and throughput, will aid in uncovering of new avenues throughout the biomedical
research community, enhance biomarker discovery and provide novel information target
discovery programs as it will prospectively shed new insight into the affected metabolic and
signaling pathways.
42
SBORNÍK ABSTRAKT
Nanoparticle mediated delivery of therapeutic nucleic acids in vivo; what
does it take to move into clinic?
Miller A.D.1,2
Institute of Pharmaceutical Science, King‘s College London, Franklin-Wilkins Building Waterloo
Campus, 150 Stamford Street, London, SE1
GlobalAcorn Limited, London, W4 5NW, UK2
All biopharmaceutical agents such as plasmid DNA (pDNA) or RNA interference (RNAi)
effectors are capable of potent therapeutic effects at target sites in vivo but they need a
delivery system to help them get there. The creation of new, synthetic delivery technologies
has been the subject of intense interest in my laboratory for over 10 years now, and we
currently believe that the best opportunity lies with lipid-based nanoparticles that conform
to the synthetic, self-assembly ABCD nanoparticle paradigm. A number of ABC and ABCD
nanoparticles (100nm diameter, -potential near zero) can now be described that are able to
mediate successful, functional delivery of pDNA to lung and RNAi effectors to murine liver, and
to xenograft tumours in vivo. In addition, the ABCD nanoparticle paradigm can be adapted for
the development of imaging nanoparticles, leading to the creation of a number of magnetic
resonance imaging (MRI) active, fluorescent labeled ABC and ABCD nanoparticles for cancer
diagnosis. This has led on to the creation of theranostic nanoparticles that allow for functional
delivery of therapeutic agents with simultaneous real time diagnostic imaging. Experience
with all these nanoparticles suggests that there are basic biophysical and chemical guidelines
that underpin nanoparticle-mediated delivery to different organs. These basic rules can be
summed up in terms of the four “S’s” of nanotechnology (size, shape, surface, structure) and
the four “T’s” of nanodelivery (trafficking, triggerability, targeting and timing). With the use
of such emerging rule sets we can be confident of creating next generations of delivery
nanoparticle systems appropriate for routine clinical use.
43
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Nanoliposomes for construction of recombinant vaccines and delivery of
anticancer and antiviral drugs
Turánek J.
Veterinary Research Institute, Brno
Liposomes represent the oldest nanoparticle systems described for applications in biological
studies as model membranes and in medicine. Over nearly half a century, liposomes have
been shown to be suitable drug delivery systems for applications ranging from cosmetics and
dermatology through to medical applications in anti-infection therapy, anticancer therapy
and veterinary vaccination. Liposome-based vaccines have been around for about 30 years
and numerous products have been developed, some with evident immune-stimulatory
properties and attractive safety profiles hence resulting in registered products on the market
or preparations in advanced stages of clinical testing (e.g. Hepatitis A – HepA, Epaxal)
Liposomes represent almost ideal carrier/delivery systems for the components of synthetic
vaccines due to their ready biodegradability and their ability to retain/incorporate a variety of
essential vaccine components simultaneously, even components possessing quite different
physico-chemical properties (i.e., different size, hydrophobicity, charge etc.). Different
synthetic vaccine components can be encapsulated within the aqueous cavities of liposomes
(if hydrophilic) or associated with liposome bilayers (if at least partially hydrophobic in
character). Furthermore, essential components can be attached to either internal or external
outer leaflet membrane by electrostatic, covalent or metallochelation interactions. The
most diverse synthetic vaccine components are typically adjuvants needed to provoke
innate immune reactions (e.g. monophosphoryl lipid A [MPL A], CpG oligonucleotides,
muramyl dipeptide [MDP] and analogues). In addition, these can be combined with antigens
needed to provoke specific immunity such as soluble or membrane proteins, synthetic
peptides and oligosaccharide antigens. Finally, the liposome may present ligands to assist
functional delivery of antigens and adjuvants to antigen-presenting cells necessary to invoke
immunostimulation. Liposomes are compatible with various routes of application (i.n., i.m.,
i.d., p.o., s.c., etc.) This is the main advantage of liposomes over other adjuvants. At present,
there is a need of new vaccines against world spread or emerging infectious diseases as well
as cancer. This factor together with the stress on safety of vaccines drives the research in the
field of vaccine research. Many new synthetic components like cationic lipids, neoglycolipids,
activated lipids and metallochelating lipids are now available for construction of liposomal
carriers well tailored for specific antigen. Defined new synthetic adjuvants are designed and
tested, e.g. compounds based on muramyl or norAbu-muramyl peptides, CpG oligonucleotides
and MPL-A. The potential for the participation of liposome-based recombinant vaccines in the
human and veterinary vaccine market is very promising. New approach for construction of
recombinant vaccines will be presented and discussed.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by the following grants: the Grant Agency of the Czech Republic
(GAP304/10/1951), (GAP503/12/G147), the Grant Agency of the Academy of Sciences of the
Czech Republic (KAN200100801) to J.T., the Ministry of Agriculture of the Czech Republic
(MZE0002716202), and the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic
(CZ.1.07/2.3.00/20­.0164).
44
SBORNÍK ABSTRAKT
Significant synergism of antitumor activities of HPMA copolymer-bound
doxorubicin conjugate and IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes: a concept
of modern chemoimmunotherapy
Kovář M.
Institute of Microbiology ASCR, v.v.i., Prague
Resume
In this manuscript, we demonstrate that antitumor activity of advanced chemotherapy by
HPMA copolymer-bound doxorubicin conjugate synergizes with novel kind of immunotherapy
by IL-2/anti-IL-2 mAb immunocomplexes due to low immunosuppressive activity of the former
one and extraordinary high immunostimulatory activity of later one, which is moreover
selective for immune subsets with positive role in tumor immunotherapy, i.e. NK, memory and
recently activated CD8+ T cells. Thus, the concept of combining the chemotherapy having low
immunosuppressive activity with potent immunostimulation could be an efficient approach
to treat cancer.
Abstract
IL-2 has been approved for treatment of metastatic renal cancer and malignant melanoma.
However, its unfavorable pharmacologic properties, severe side effects and the negative
role of IL-2 in maintaining T regulatory cells are severe drawbacks. It has been shown that
immunocomplexes of IL-2 and certain anti-IL-2 mAbs possess selective and high stimulatory
activity in vivo. Here, we show that IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes expand not only
CD122high subsets and recently activated CD8+ T cells, but also NKT cells and γδ T cells. Further,
we demonstrate that NK cells expanded by IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes in vivo have
high cytolytic activity, which can be further increased by coadministration of IL-12. We also
demonstrate that IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes possess noticeable antitumor activity
in two syngeneic mouse tumor models, namely BCL1 leukemia and B16F10 melanoma,
but only if administered early in tumor progression. To effectively treat established tumors,
we administered the tumor-bearing mice first with HPMA copolymer-bound doxorubicin
conjugate, and subsequently with IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes alone or with IL-12 to
induce an efficient antitumor immune response. Importantly, we show that the conjugate has
significantly lower immunosuppressive activity than free doxorubicin when using dosage with
comparable antitumor activity, thus eliminating the majority of tumor cells while leaving the
immune system mostly unimpaired for stimulation with IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes.
Indeed, we demonstrate that the conjugate and IL-2/S4B6 mAb immunocomplexes together
have synergistic antitumor activity.
45
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Liposomes as carriers for hydrophobic anticancer drugs: paclitaxel as the
example
Koudelka Š.1,2, Turánek Knötigová P.1,2, Mašek J.1,2, Plocková J.1, Kulich P.1, Turánek J.1,2
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy,
Veterinary Research Institute, Brno1
Faculty of Science, University of South Bohemia, České Budějovice2
Liposomal carriers represent versatile and advanced nanodelivery systems for a wide range of
anticancer drugs. These relatively non-toxic systems have a considerable potential to entrap
both hydrophobic and hydrophilic drugs. The entrapment of the drug into the liposomes
is used to bypass the frequent generic toxicity associated with the drug. Thus, it represents
a very effective route that enhances the drug therapeutic effect. The final amount of the
encapsulated drug is affected by a selection of an appropriate preparation method providing
a preparation of liposomes of various size, lamellarity and physico-chemical properties. The
modification of liposomes permits a passive or active targeting of the tumour site. This effect
enables an efficient drug payload into the malignant cells of tumour, while the non-malignant
cells become minimally impacted.
Over the past three decades, taxanes represent one of the most important new classes of
drugs approved in oncology. Paclitaxel (PTX), the prototype of this class, is an anticancer drug
approved for the treatment of breast and ovarian cancer. However, notwithstanding a suitable
premedication, present-day chemotherapy employing a commercial preparation of PTX
(Taxol®) is associated with serious side effects and hypersensitivity reactions. The liposomebased carriers represent promising delivery systems of PTX superior to Taxol®. Generally,
in vivo mice tumour models demonstrated that liposomal PTX formulations significantly
increase a maximum tolerated dose (MTD) of PTX which outperform that for Taxol®.
We developed a stable lyophilized formulation of PTX (7 mol%) encapsulated in the liposomes
composed of SOPC/POPG/MOPC lipids (molar ratio, 60:20:20) and doped with vitamin E (5
mol%). The prepared liposomes had the size distribution of 180–190nm (PDI, 0.1) with potential of –31 mV. The stabilized PTX liposomes were prepared by lyophilization with sucrose
(lipid:sugar molar ratio, 1:5–1:10). The suppressed PTX crystallization as well as the original
size and morphology of liposomes were preserved for 6 months at 4oC. This liposomal PTX
formulation did not show any evidence of toxicity in C57BL/6 mice treated with the highest
doses of PTX (100 mg/kg administered as a single dose and 150 mg/kg as a cumulative dose
applied in three equivalent doses in 48-h intervals). A dose-dependent anticancer effect was
found in both hollow fibre implants and syngenic B16F10 melanoma mouse tumour models.
Generally, this developed liposomal PTX formulation demonstrated safety and efficacy profiles
and could be favourable for clinical applications.
Acknowledgement
This work was supported by the following grants: the Ministry of Agriculture of the Czech
Republic (MZE0002716202), the Technology Agency of the Czech Republic (TA01011165) to
J.T., the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (KAN200100801) to
J.T.
46
SBORNÍK ABSTRAKT
Preparation and characterisation of recombinant OspC liposome-based
experimental vaccine with entrapped lipophilic derivatives of norAbuMDP
against Borrelia burgdorferi
Mašek J.1, Bartheldyová E.1, Křupka M. 4, Turánek-Knotigová P.1,2, Koudelka Š.1, Lukáč R.1,
Kulich P.1, Turánek J.1,2, Ledvina M.3, Raška M.4
Veterinary Research Institute, Brno1
Faculty of Medicine, Masaryk University, Brno2
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, Czech Academy of Science, Prague3
Faculty of Medicine, University of Palacky, Olomouc4
Lyme disease caused by spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato is a tick-born illness that
can lead to chronic complications. The immune response to Borrelia is mediated by phagocytic
cells and by Borrelia-specific complement-activating antibodies associated with Th1-cell
activation. Liposomes represent almost ideal carrier system for the preparation of synthetic
vaccines due to their biodegradability and versatility as regards the incorporation of various
molecules having different physico-chemical properties.
A new experimental vaccine was constructed using a non-lipidized form of recombinant
OspC protein from B. burgdorferi s.l. and liposomes containing synthetic non-pyrogenic
lipophilic norAbuMDP analogues as immunopotentiating molecules. His-tagged OspC
protein was mounted onto the surface of liposomes by nickel-chelation bond. The His-tag
was attached either to N-terminus or to C-terminus providing two variants of OspC antigen.
These two forms exhibited different thermal stability profiles (free protein as well as liposomebound) as demonstrated by DSC and dynamic light scattering techniques. The structure of
proteoliposomes was determined by transmission electron microscopy.
New chemical modifications of synthetic norAbuMDP analogues and the application of
metallochelating lipid provide new ways of approaching the construction of safe recombinant
vaccines. Vaccines based on metallochelating liposomes were proved to be safe (a pig
intradermal model) as well as efficient (a mouse immunization model).
Acknowledgements
This work was supported by grants: GAČR P304/10/1951(to JT, ML and MR); TAČR TA01011165
(to JT, ML and MR); MSM 6198959223 (to MR); MZE 0002716202 (to JT); KAN 200520703 AVČR
and KAN 200100801 (to JT and ML); Grant of Faculty of Medicine and Dentistry, UP Olomouc,
CR LF_2012_11 (to MK).
47
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Liposomes and microbubbles for in vivo MRI and ultrasound diagnostics
Lukáč R., Turánek J.
Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic
Lipid-coated gas-filled microbubbles (MB) represent a new class of drug delivery systems with
both diagnostic and therapeutic applications. Considering drug delivery and targeting, the main
advantage of microbubble application is a reduction of undesired side effects such as toxicity.
Furthermore, the diagnostic application of ultrasound imaging using MB has become highly
popular because ultrasound is a non-invasive and relatively low-cost tool. It uses portable, real-time
imaging equipment and also avoids hazardous ionizing radiation. Considering MBs themselves,
they are small (typically 1-8 μm in diameter) microspheres filled with high-molecular-weight gases
like perfluorocarbons or sulfur hexafluoride, which results in decreased solubility and prolonged
lifespan of the MB within the circulation. Until now, MBs have been characterized by optical
microscopy, static light scattering, and flow cytometry. Following the reported studies, we applied
all the mentioned methods, and moreover, we attempted to preserve the MB using lyophilization
as described in a previous liposome study. Recently, targeting ligands that have been widely used in
cardiovascular system and tumour diagnosis and therapy were attached to the surface of the MBs.
Recently, magnetic resonance imaging (MRI) that is generally used to obtain three-dimensional
images of various organs and blood vessels proved useful as one of the leading non-invasive imaging
modalities. Safety, high resolution, and the ability to obtain a precise anatomical localization of
the lesion represent the advantages of MRI. However, there are serious difficulties in early tumour
detection related to contrast resolution, e.g, small tumours may have the same signal intensity (SI)
as the neighbouring tissue. In such a case, the use of paramagnetic contrast agents (CAs) is helpful.
Most CAs used in clinical applications consist of small, soluble molecules that can easily cross the
endothelial barrier of blood vessels. However, these CAs have a short lifetime and thus a narrow
time window of optimal contrast enhancement. These characteristics may not be advantageous as
regards the differences in the vascular properties of tumour tissue with respect to normal tissues.
While in normal tissues the tight barrier formed by the endothelial cells prevents the extravasation
of macromolecular CAs out of the vessels, in tumour tissues the leaky vessels may allow the
extravasation of objects hundreds of nanometers in size. It has been proposed that the increase
in weakness and permeability of the endothelial barrier of the tumour is the key to developing
new macromolecular CAs for tumour diagnosis. Macromolecular CAs may offer a greater contrast
enhancement between the tumour and surrounding tissue and a wider diagnostic-time window.
The use of paramagnetic contrast agents is required to obtain clinically significant images. Gd is the
most commonly used contrast agent for MRI.
References: Lukáč R, Kauerová Z, Mašek J, Bartheldyová E, Kulich P, Koudelka Š, Korvasová Z, Plocková
J, Papoušek F, Kolář F, Schmidt R, Turánek J. Preparation of metallochelating microbubbles and study
on their site-specific interaction with rGFP-HisTag as a model protein. Langmuir 2011;27:4829-37
Erdogan S, Roby A, Sawant R, Hurley J, Torchilin VP. Gadolinium-loaded polychelating polymercontaining cancer cell-specific immunoliposomes. J Liposome Res 2006;16:45-55
Bertini I, Bianchini F, Calorini L, Colagrande S, Fragai M, Franchi A,Gallo O, Gavazzi C, Luchinat
C. Persistent contrast enhancement by sterically stabilized paramagnetic liposomesin murine
melanoma. Magn Reson Med 2004;52:669-672
Acknowledgements:
This work was supported by grants: MZE 0002716202; KAN 200520703 AVČR; GAČR P304/10/1951
and TAČR TA01011165.
48
SBORNÍK ABSTRAKT
Vazba povrchových antigenů spirochety Borrelia burgdorferi na
metaloafinitní liposomy ovlivňuje typ vyvolané imunitní odpovědi na myším
modelu
Křupka M., Mašek J., Bartheldyová E., Koudelka Š, Ledvina M., Turánek J., Raška M.
Ústav imunologie Lékařské fakulty UP
Lymská borrelióza je multisystémové onemocnění vyvolávané spirochetami z druhového
komplexu Borrelia burgdorferi. Tato choroba je nerozšířenější antropozoonózou ve střední
Evropě a může způsobovat dlouhodobé komplikace navzdory antibiotické terapii. Protektivní
imunitní odpověď proti Borreliím je zprostředkovávána hlavně fagocytujícími buňkami
a komplement aktivujícími protilátkami asociovanými s typem imunitní odpovědi Th1. Lze
proto předpokládat, že vyvolání tohoto typu odpovědi je základem pro konstrukci účinné
preventivní vakcíně proti borrelióze.1
V naší studii jsme testovali imunomodulační působení liposomů v komplexu s metalochelatačně
vázanými rekombinantními antigeny a nepyrogenními lipofilními deriváty nor-aminobutyryl
muramildipeptidu (norAbuMDP). Liposomy byly připraveny ze směsi fosfatydilcholinu a nikl
chelatujícího lipidu DOGS-NTA. Vazba rekombinantních antigenů na liposomy byla umožněna
nekovalentní vazbou mezi polyhistidinovou sekvencí antigenu a molekulou chelatovaného
niklu2.
Jako antigeny byly použity rekombinantní nelipidizované apyrogenní proteiny OspA a OspC
izolované ze spirochety Borrelia burgdorferi sensu stricto. Vakcinační preparáty byly testovány
na myším modelu a byla vyhodnocována tvorba antigenně-specifických protilátek v isotypech
IgG1 (Th2 odpověď) a IgG2a (Th1 odpověď). Adjuvantní působení norAbuMDP bylo srovnáno
s hydroxidem hlinitým a muramyldipeptidem.
Preparáty obsahující deriváty nor-muramyl dipeptidu poskytovaly adjuvantní účinek
srovnatelný s muramyldepep­tidem, ale bez jeho typických vedlejších účinků. U těchto preparátů
došlo k výraznému zvýšení produkce specifických IgG2a spojených s Th1 typem imunitní
odpovědi. U proteinu OspC bylo navíc zjištěno, že imunogenita proteinu je silně ovlivněna
polohou histidinové sekvence na N- nebo C-konci proteinu. Využití metalochelatačních
liposomů s vázanými deriváty nor-muramyl dipeptidu se tak jeví jako slibná cesta pro vývoj
vakcín stimulujících tvorbu opsonizačních protilátek.
Tato byla podpořena granty LF_2012_011, MSM6198959223 a GAP304/10/1951..
LITERATURA
Krupka M., Zachova K., Weigl E., Raska M.: J Control Release, In Press (2011).
Mašek J, Bartheldyova E., Korvasova Z., Skrabalova M., Koudelka S., Kulich P.,Kratochvilova I.,
Miller A.D., Ledvina M., Raška M., Turanek J.: Anal. Biochem. 408 (2011).
49
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
The effect of water-based medium on the structure of gemini surfactant–
DOPE–DNA complexes
Pullmannová P.1, Lacinová Ľ.2, Funari S.S.3, Murugova T.4, Devínsky F.5, Uhríková D.1
Department of Physical Chemistry of Drugs, Faculty of Pharmacy,
Comenius University, Slovak Republic1
Institute of Molecular Physiology and Genetics, Slovak Academy of Sciences, Slovak Republic2
HASYLAB at DESY, Hamburg, Germany3
Frank Laboratory of Neutron Physics, JINR, Dubna, Russia 4
Department of Chemical Theory of Drugs,Faculty of Pharmacy,
Comenius University, Slovak Republic5
Gemini surfactant propane-1,3-diyl-bis(dodecyldimethylammonium bromide) (12-3-12) and
neutral lipid dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) were used for preparation of cationic
liposomes (CL). CL condense highly polymerized DNA forming complexes 12-3-12– DOPE–
DNA. Complexes of this composition were reported to have good transfection efficiency in
vitro and in vivo. Small angle X-ray diffraction was used to study the microstructure of 123-12–DOPE–DNA complexes with focus on the effect of different water-based media on
the arrangement of complexes. We compare the structure of complexes prepared in NaCl
solution (150 mmol/l) and commercial transfection medium Opti-MEM® combined with
DMEM (Dulbecco-modified minimal Eagle medium) and DMEM supplemented with 5 % of
FBS (fetal bovine serum), respectively. We examined the effect of medium on the structure
of the complexes as a function of the 12-3-12 molar fraction in CL, the amount of DNA, and
the temperature. The binding capacity of CL for DNA was determined spectrophotometricaly.
A condensed lamellar phase (LαC) was identified as dominant structural arrangement, although
at high 12-3-12 molar fraction (Φ = 0.5) we observed a coexistence of two lamellar phases.
Structural parameters of complexes were evaluated and thoroughly discussed concerning the
effect of various media.
Financial support provided by the European Community‘s Seventh Framework Program
(FP7/2007 2013) under grant agreement no 226716 (HASYLAB project II-20100372 EC), by the
JINR project 07 4 1069 09/2011, and by grants VEGA 1/1224/12 and APVV-0212 10 is gratefully
acknowledged.
50
SBORNÍK ABSTRAKT
LIPID ALTERATIONS INDUCED BY SUPPLEMENTED FATTY ACIDS IN HUMAN
COLON FETAL AND CARCINOMA CELLS
Josef Slavík1, Miroslav Ciganek1, J. Hofmanová2, Z. Tylichová2, Miroslav Machala1
Department of Toxicology, Pharmacology and Immunotherapy, Veterinary Research Institute,
v.v.i., Hudcova 70, 621 00 Brno, Czech Republic1
Department of Cytokinetics, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic,
v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic2
Dietary lipids, especially omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) and
butyrate, the short-chain fatty acid produced by microbial fermentation of fibre, are important
modulators of colon epithelial cell kinetics and play an important role in colon inflammation
and carcinogenesis.
Using cell lines derived from human colon fetal (FHC) and adenocarcinoma tissues (HCT116) we analyzed cellular fatty acid content and profile (GC/MS of FAME) and phospholipid
remodelling (LC/MS/MS) after treatment with sodium butyrate (NaBt, 3mM), arachidonic acid
(AA, 20:4, omega-6, 50µM), docosahexaenoic acid (DHA, 22:6, omega-3, 50µM) and/or their
combination (AA/NaBt, DHA/NaBt).
After 24 or 48 h samples from cell pellets containing 8 x 106 cells were prepared by modified
Bligh-Dyer extraction procedure. Total cell extract was divided into three aliquots for tandem
HPLC/MS/MS analysis (phospholipid classes and TAG profiling) and GC/MS analysis of total
fatty acid content and fatty acid content in polar and nonpolar fractions after SPE separation,
consequently. Fatty acids were always analysed by GC/MS in a form of fatty acid methylesters
(FAME).
NaBt treatment increased the concentrations of saturated (SFA) and monounsaturated fatty
acids (MUFAs) in both cell lines, which reflects de novo fatty acid synthesis. On the other hand,
both PUFAs as well as their combination with NaBt reduced this parameter in FHC, but not in
HCT-116 cells. Treatment of FHC as well as HCT-116 cells with AA or DHA considerably increased
the amount of the respective PUFAs and products of their metabolism. This is additionally
increased after combined fatty acid treatment except a combination of DHA/NaBt in FHC cells.
Subsequently, the ratio of n-3/n-6 was decreased after AA (or AA/NaBt) exposure or increased
after DHA (or DHA/NaBt). Moreover, the treatment with both PUFAs and their combination
with NaBt increased the unsaturation index (UI) and increased the SA:OA ratio, which reflects
changes of membrane properties (especially its fluidity) to a certain level.
Using LC/MS/MS we analyzed the composition of major PL classes (i. e. diacylglycerophosphocholines (PC), -ethanolamines (PE), -serines (PS), -inositols (PI) as well as
sphingomyelins (SM), and ceramides (Cer). Mass spectra showed that NaBt induced only
minor changes compared to control, but treatments with AA, DHA and their combination with
NaBt decreased the content of species containing dominant fatty acids and simultaneously
increased AA- or DHA-containing species, respectively. The modulations observed were most
pronounced in PC and PE, lower but with a similar tendency in PI and PS, and insignificant in
Cer or SM species.
In FHC cells, where more apparent changes in the lipid composition were detected after
treatment with fatty acids, additional detailed analyses verifying the distribution of AA and
51
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
DHA in polar (PLs) and neutral (mostly triacylglycerols - TAGs) lipid fractions were performed.
Compared to control, no significant changes of fatty acid distribution in both classes were
found after NaBt treatment. On the contrary, after treatment with AA or DHA a considerable
percentage of the respective fatty acid was detected in both polar lipids and TAGs supposed
to be located in cytoplasmic lipid droplets. After treatment with PUFA alone, more AA was
detected in polar lipids, whereas DHA was incorporated predominantly to TAGs. Moreover,
NaBt cotreatment with AA or DHA decreased the content of both PUFAs in the PL fraction and
increased their accumulation in TAGs.
In summary, our results confirmed significant changes in fatty acid content, spectra,
distribution and metabolism caused in colon cells by supplementation of AA, DHA and their
combination with NaBt. These changes may be associated with subsequent modulation of
cell proliferation, differentiation and/or apoptosis induced by these fatty acids.
Supported by grants Nos. P301/11/1730 and 303/09/H048 of Czech Science Foundation.
52
POSTEROVÁ SEKCE
POSTEROVÁ SEKCE
53
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Nové matrice pro MALDI-MS analýzu uhlovodíků
Horká P., Vrkoslav V., Pecková K., Cvačka J.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Ionizace/desorpce laserem za spoluúčasti matrice (MALDI) je stále důležitější ionizační
technikou pro analýzu látek s nízkou polaritou a molekulární hmotností, jako jsou např.
nepolární lipidy. Tato metoda je vhodná pro výzkum lipidových směsí přírodního původu
a nabízí velké množství výhod ve srovnání s jinými analytickými metodami. Ionizace zcela
nepolárních uhlovodíků nebo uhlovodíkových polymerů je náročná, jelikož tyto sloučeniny
postrádají polární skupinu vhodnou k protonaci nebo k vazbě s kationtem.
V oblasti lipidů, zejména u nízkomolekulárních nepolárních lipidů, bylo zatím popsáno jen
málo účinných matric. Ionizace nízkomolekulárních nepolárních látek je možná pomocí
iontů různých kovů, kdy dochází k tvorbě aduktů. K účinné ionizaci lipidů je možno využít
lithných kationtů za vzniku aduktu [M+Li]+. Pro zcela nepolární látky byla vyvinuta matrice
2,5-dihydroxybenzoan lithný (LiDHB). Tato matrice byla aplikována mimo jiné na analýzu
hmyzích kutikulárních uhlovodíků. Ačkoliv se LiDHB ukázala, jako velice účinná matrice pro
uhlovodíky, citlivost detekce není excelentní.
Během této práce zaměřené na výzkum nových efektivních matric pro MALDI-MS analýzu
uhlovodíků byla testována řada stříbrných a lithných solí organických kyselin (např. kyseliny
2,5-dihydroxybenzoové, 2,5-dihydroxytereftalové, 2,5-dimetoxybenzoové, α-kyano-4hydroxyskořicové, sinapové, benzoové, salicylové a vanilové) jako potenciálních MALDI
matric. U těchto látek byly vyhodnoceny „MALDI vlastnosti“ a porovnány s vlastnostmi 2,5dihydroxybenzoanu lithného. Také byl stanoven detekční limit pro uhlovodíky v jednotlivých
matricích.
Podařilo se najít několik účinných MALDI matric. Bylo zjištěno, že účinnost matrice je závislá
na přítomnosti hydroxylové skupiny v molekule matrice. Ukázala se i souvislost mezi účinností
a obsahem krystalové vody v matricích. Účinnost ionizace uhlovodíků vhodnými matricemi
byla ověřena na reálných směsích.
Tato práce vznikla za podpory GAČR P206/12/1093 a projektu RVO 61388963.
54
POSTEROVÁ SEKCE
Essential fatty acid diagnostics using modern analytical methods for nutrition
studies?
Application on fish
Schneedorferová I., Průchová M., Tomčala A., Valterová I.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Health and nutrition studies are nowadays based on sophisticated analytical chemistry data.
Determination and quantification of food composition on the molecular level are essential.
For nutrition, the polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are very important. We distinguish two
types of PUFAs: n-3 and n-6. These fatty acids are essential, i.e. they must be taken from the
diet because humans lack the &#916;12– and &#916;15-desaturases necessary for inserting
double bonds in the n-3 or n-6 (&#969;-3 or &#969;-6) positions of the FA carbon chain. The
n-3 PUFAs are the most studied class of PUFAs and have prevailing benefits for human health.
The most important long chain n-3 PUFAs are eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3) and
docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3). These PUFAs are essential for normal brain development
and function.
For determination of particular PUFAs, we used several analytical techniques that include
extraction according Folch, pre-separation due solid phase extraction (SPE), separation on
high performance liquid chromatography (HPLC) column, and detection by mass spectrometry
(MS). Gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) methodology with acid derivatization
was employed, too.
The primer producers of essential fatty acids are marine and freshwater algae. In the food
chain, fatty acids accumulate in fish, which is primary source of PUFAs for humans. PUFAs are
known to be sensitive to oxidation caused by light or heat. This study aims at finding which
fish species (both marine and freshwater) is a powerful source of PUFAs and which cooking
treatment is most suitable for fish preparation. Last but not the least, the influence of storage
on PUFAs levels will be discussed.
Present results show that marine fish is a better source of PUFAs, namely EPA and DHA, than
freshwater fish. Three cooking treatment were examined: preparation on grill, pan, and in
the oven. It seems that for each fish species, a different kind of cooking treatment is best for
preservation of EPA and DHA level and their ratio. The amounts and ratios of PUFAs are species
specific.
Folch et al.: J. Biol. Chem. 1957, 226, 497.
Financial support by the Czech Science Foundation (#502/10/1734) is gratefully
acknowledged.
55
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Alternativní přístupy strukturní analýzy uhlovodíků
Vrkoslav V., Cvačka J.
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Nejčastěji používanou metodou analýzy uhlovodíků je plynová chromatografie. Spojení
plynové chromatografie s hmotnostním detektorem (GC/MS) se využívá k jejich strukturní
charakterizaci. K ionizaci uhlovodíků se nejčastěji používá elektronová ionizace (EI), případně
chemická ionizace (CI). Metoda je ideální pro analýzu kratších uhlovodíků s menším počtem
dvojných vazeb. Z EI spekter je i v tomto případě poměrně složité, a někdy nemožné, s určitostí
popsat přesnou strukturu uhlovodíku, tj. polohy dvojných vazeb a větvení. Pro identifikaci
dvojných vazeb lze použít CI za využití acetonitrilu jako reakčního plynu. Fragmentací
molekulových aduktů vzniklých v iontovém zdroji z reakčního plynu a analytu lze získat
fragmenty charakterizující polohu dvojné vazby. Další možností je využití vhodné derivatizační
reakce a analýza produktů GC/EI-MS.
Výše popsané metody nelze použít pro analýzu uhlovodíků s větším počtem uhlíků nebo
s větším počtem dvojných vazeb. Tyto sloučeniny jsou při teplotách potřebných k jejich
eluci z GC kolony teplotně nestálé. Za vyšších teplot v GC může dojít k jejich degradaci.
Pro strukturní analýzu zvláště nenasycených uhlovodíků s dlouhým uhlíkovým řetězcem je
nutné využít principiálně jinou metodu. Tato práce popisuje využití ionizace laserem za účasti
matrice (MALDI) a chemické ionizace za atmosférického tlaku (APCI) pro ionizaci uhlovodíků
a jejich strukturní charakterizaci pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS).
Nedávno byla popsána metoda charakterizace poloh dvojných vazeb nenasycených
voskových esterů využívající tvorby molekulových aduktů [M+55]+. v APCI iontovém zdroji.
Molekulové adukty vznikají v případě, kdy je v mobilní fázi přítomen acetonitril. V MS/MS
spektrech aduktů [M+55]+. byly popsány ionty, které jasně definují polohu dvojné vazby
v původní molekule. Tvorba [M+55]+. byla pozorována i v APCI-MS spektrech nenasycených
uhlovodíků. Analogicky k voskovým esterům, fragmentací těchto aduktů byly získány ionty
charakterizující polohu dvojné vazby. Ke štěpení uhlovodíkového řetězce dochází před a za
dvojnou vazbou.
Pro MALDI uhlovodíků lze s úspěchem využít tvorby molekulárních aduktů s lithnými
a stříbrnými kationty [M+Li]+ a [M+Ag]+. Fragmentací molekulárních aduktů metodou LIFT
(Ultraflextreme, Bruker Daltonic, Brémy, Německo) vznikají fragmenty, ze kterých lze určit
polohu větvení uhlovodíkového řetězce, protože k fragmentaci dochází poblíž tohoto
větvení.
Tato práce byla financována z projektu RVO 61388963 a z grantu GAČR P206/12/1093.
56
POSTEROVÁ SEKCE
A non-aterogenic and atherogenic lipoprotein profile in examined individuals
with dyslipoproteinemia
Oravec S., Kučera M., Vacula I., Gašpar Ľ.
2nd Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Comenius University, Bratislava,
Slovak Republic
A new method of electrophoretic lipoprotein separation on polyacrylamide gel (PAG) with
the use of Lipoprint LDL System quantifies a non-atherogenic and atherogenic plasma
lipoproteins including small dense LDL, the strong atherogenic lipoprotein subpopulations.
With respect to the predominance of a non-atherogenic or an atherogenic lipoproteins in the
whole lipoprotein profile in plasma, this method distinguishes a non-atherogenic lipoprotein
profile phenotype A from an atherogenic lipoprotein profile phenotype B.
The contribution of this method is to confirm the existence of a non-atherogenic type of
hyper-betalipoproteinemia and the existence of normolipidemia with atherogenic lipoprotein
profile, along the common and well known atherogenic hyperlipoproteinemia and a nonatherogenic normolipoproteinemia.
According to our preliminary analysis of normolipidemic population, the atherogenic
lipoprotein profile was determined in more than 6 % of normolipidemic young healty
individuals and in more than 40% persons in the general group of subjects. These persons
represent a risk population. The facilities for identifying these normolipidemic individuals are
limited for the time being.
On the other site a non-atherogenic hyper-betalipoproteinemia can be identified, which
represents approx 20% of examined individuals with hypercholesterolemia and is not
combined with a premature development of atherosclerotic arterial vascular impairment.
Novo zavedená elektroforetická metóda na separáciu lipoproteínov na polyakrylamidovom
géli (PAG), Lipoprint LDL Systém, kvantifikuje neaterogénne a aterogénne lipoproteíny, včítane
malých denzných LDL, silne aterogénnych lipoproteínových subpopulácií. Z ohľadom na
prevahu v zastúpení neaterogénnych, alebo aterogénnych lipoproteínov v lipoproteínovom
spektre plazmy, táto metóda identifikje neaterogénny lipoproteínový profil, fenotyp
A a aterogénny lipoproteínový profil, fenotyp B.
Prínosom tejto metódy je potvrdenie existencie neaterogénneho typu hyper-betalipoproteinémie a existencie normolipémie s aterogénnym lipoproteínovým profilom, popri často sa
vyskytujúcej a dobre už charakterizovanej aterogénnej hyperlipoproteinémii a neaterogénnej
normolipémii.
Na základe naších predbežných analýz populácie normolipemikov, sa zistil aterogénny
lipoproteínový profil u viac než 6% normolipemických mladých probandov a u viac než 40%
osôb v randomizovanej vzorke obyvateľstva. Tieto osoby predstavujú rizikovú populáciu.
Možnosti k identifikácii týchto normolipemických osôb sú v dnešnej dobe ešte stale
obmedzené.
Na druhej strane sa dá identifikovať neaterogénna hyper-betalipoproteinémia, ktorá
predstavuje približne 20% vyšetrených subjektov s hypercholoesterolémiou a nie je spojená
s predčasným aterosklerotickým poškodením kardiovaskulárneho systému.
57
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Vliv pohlaví potkanů na cholesterol v séru, játrech a exkrementech při dietě
s cholesterolem
Marounek M., Volek Z., Skřivanová E.
VÚ živočišné výroby
Cholesterolemie u potkanů je stabilní a není snadné ji zvýšit přídavkem cholesterolu do krmiva.
Dietu potkanů obou pohlaví jsme doplnili o 10 g cholesterolu/kg. U samců tento doplněk
zvýšil cholesterolemii z 2,20 na 2,48 &#956;mol/ml a u samic z 2,06 na 2,92 &#956;mol/ml.
Cholesterol v játrech byl u samců zvýšen z 5,4 na 15,0 &#956;mol/g a u samic z 6,1 na 19,9
&#956;mol/g. Rozdíly mezi samci a samicemi byly statisticky významné. Doplněk cholesterolu
zvýšil fekální koncentraci cholesterolu desetinásobně u samců a dvanáctinásobně u samic.
Zvýšení fekální koncentrace žlučových kyselin bylo menšího rozsahu. Cholesterol zvýšil
expresi jaterní 7&#945;-hydroxylasy. Samice potkanů jsou proto více vhodné k pokusům
s cholesterolem než samci. Vyloučení cholesterolu výkaly je významnější způsob odstranění
přebytku cholesterolu než jeho konverze na žlučové kyseliny.
58
POSTEROVÁ SEKCE
Změny ve složení membránových fosfolipidů v erytrocytech u Alzheimerovy
choroby
Klusáčková Z.1, Vyhnálek M.2, Laczó J.2, Hort J.2, Topinková E.3, Skoumalová A.1
Ústav lékařské chemie a biochemie, 2. LF UK1
Neurologická klinika 2. LF a FN Motol2
Geriatrická klinika 1. LF a VFN3
Oxidační stres, který doprovází patogenezi Alzheimerovy choroby (ACH), se v mozkové tkáni
manifestuje peroxidací fosfolipidů, které se vyznačují vysokým podílem polynenasycených
mastných kyselin (PUFA). Díky oboustranné výměně mastných kyselin mezi mozkovou tkání
a krví změny v zastoupení PUFA v mozkové tkáni související
s oxidačním stresem ovlivňují složení PUFA v membránách erytrocytů. Naším cílem bylo
analyzovat složení mastných kyselin ve fosfolipidech membrán erytrocytů u pacientů s ACH,
a také u pacientů v prodromální fázi ACH představovanou tzv. mírnou kognitivní dysfunkcí
(MCI) a u pacientů se subjektivní poruchou paměti (SMC).
Izolovali jsme membrány erytrocytů u pacientů s různými typy neurodegenerativních chorob
a kontrol. Pacienti byli řazeni do skupin dle neuropsychologické diagnostiky, laboratorního
vyšetření a magnetické rezonance mozku. Skupiny zahrnovaly pacienty s diagnózami SMC,
MCI, ACH a kontroly. Membrány erytrocytů jsme následně podrobili analýze lipidového složení
pomocí plynové chromatografie.
Výsledky naší studie ukazují, že membrány erytrocytů u SMC a MCI vykazují největší
změny v zastoupení jednotlivých metylesterů mastných kyselin v porovnání s kontrolami.
Nejvýznamnější rozdíly jsou v zastoupení metylesterů kyselin linolové, linolenové
a arachidonové. Poměr nasycených a nenasycených PUFA je nejvyšší u SMC a MCI, klesá
u pacientů s ACH a nejnižší je u kontrol.
Závěrem lze shrnout, že v membránách erytrocytů u pacientů s SMC a MCI je obsah PUFA
snížen v porovnání s ACH a kontrolami. Tento fakt může ukazovat na to, že patologické
procesy v mozku doprovázené oxidačním stresem jsou nejvíce vyjádřeny v prodromálních
fázích ACH.
Tato práce je podporována grantem GAUK 604 912, European Regional Development Fund
- Project FNUSA-ICRC (No. CZ.1.05/1.1.00/02.0123) a grantem IPL 2/2012.
59
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Analýza kinetiky a tvorby oxidačních produktů mitochondriálních lipidů
Kohutiar M., Wilhelm J.
Ústav lékařské chemie a biochemie 2. LF UK1
Fyziologický ústav AV ČR2
Mitochondrie jsou neustále vystaveny působení ROS. Oxidační stres spojený s metabolizmem
mitochondrií má významný vliv na složení membránových lipidů. Produkty lipoperoxidace
vedou k alteraci biomolekul a změny v struktuře mají negativní dopad na fyziologii buněk.
V poslední době je věnována pozornost molekule peroxynitritu. Nedávné výzkumy naznačují,
že jeho vznik a reaktivita in vivo stojí v pozadí vzniku mnoha civilizačních nemocí. Cílem naší
práce je sledování kinetiky a tvorby oxidačních produktů mitochondriálních lipidů.
Pro experimentální sledování in vitro jsme izolovali mitochondrie z hovězího srdce. Vzorky
s obsahem proteinů 10 mg/ml jsme vystavili působení iniciátorů lipoperoxidace tertbutylperoxidu a peroxynitritu. Pro sledovávání kinetiky jsme použili řadu koncentrací tertbutylperoxidu (0,05 mM; 0,2mM; 0,5 mM; 1 mM; 2 mM a 4 mM) a peroxynitritu (0,05 mM; 1 mM;
2 mM; 3 mM a 4 mM). Alikvotní podíly peroxidovaných mitochondrií byly odebrány okamžitě
po přidání oxidačního činidla, následně po 1 a po 24 hodinách. Změny jsme sledovali
v porovnání s kontrolami z paralelních inkubací. Produkty oxidace jsme detekovali kyselinou
thiobarbiturovou (TBA). Změny v množství TBA-reaktivních ekvivalentech malondialdehydu
byly analyzovány spektrofotometricky při 532 nm.
Ve všech vzorcích inkubovaných s peroxynitritem jsme zaznamenali zvýšení absorbancí
s maximem po 1 hodině při koncentraci peroxynitritu 1 mM (vzestup o 380 %). V 0,05 mM
řadě jsme pozorovali okamžité zvýšení absorbancí v porovnání s kontrolou (vzestup o 252 %).
Toto pozorování naznačuje vysokou reaktivitu již při nízkých koncentracích řádově shodných
s koncentracemi in vivo. Nejvyšší absorbance v tert-butylperoxidové řadě jsme zaznamenali
při koncentraci 4 mM (vzestup o 1025 %) po 1 hodině inkubace. Na základě naměřených dat
se zdá být pravděpodobné, že množství oxidačních produktů stoupá v čase lineárněji a bez
přítomnosti výrazného maxima v porovnání s peroxynitritovou řadou. Snížení množství
TBA-reaktivních molekul v řadě peroxynitrit při vyšších koncentracích může být ve spojitosti
s doposud neznámými reakcemi peroxynitritu s produkty lipoperoxidace. Trend nárůstu
absorbancí u obou kontrol je mírně vzestupný, což souvisí s autooxidací během inkubace.
Sumárně, rozdíly v trendech naměřených hodnot naznačují variabilitu v chemizmu reakcí, což
je významné pro další studium mechanizmů lipoperoxidací.
Tato práce je podporována grantem GAČR P303/11/0298.
60
POSTEROVÁ SEKCE
Influence of cholesterol on the solubilization of multilamellar and unilamellar
liposomes caused by N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide
Huláková S.1,Gallová J.1, Balgavý P.1, Murugova T.2
Comenius University in Bratislava, Faculty of Pharmacy,
Department of Physical Chemistry of Drugs, Slovak Republic1
Frank Laboratory of Neutron Physics, Joint Institute for Nuclear Researche,
Dubna, Russia2
The aim of our study was to determine the effect of cholesterol on the solubilization of
multilamellar and unilamellar egg yolk phosphatidylcholine (EYPC) liposomes. Solubilization
was induced by N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide (C12NO), which is very potent
bactericidal and algicidal agent with amphiphilic character. It is supposed, that amphiphilic
charakter is related with the solubilization of membranes. Solubilization is characterized
by transformation from bilayers to mixed micelles. This transformation is accompanied by
a change in particle size, therefore a turbidimetry, spectroscopic method based on light
scattering, was used. We investigated influence of C12NO in concentration range 0–3 mmol/
dm3 on multilamellar and unilamellar liposomes, which contained cholesterol in different
molar ratios CHOL:EYPC= 0; 0,2; 0,6. Kinetics of solubilization was studied in time interval
from 0 to 72 hours after sample mixing. The solubilizing concentration (cS) was estimated
as the C12NO concentration causing the half-maximum decrease of turbidance. We found,
that cS grows linealy with increasing CHOL:EYPC molar ratio for both multilamellar and
unilamellar liposomes. Higher cS values with the increasing molar ratio CHOL:EYPC mean,
that a higher concentration of C12NO was needed for liposomes solubilization. We observed
approximately exponential decreases of cS in time. This decrease of cS was slower in the case
of multilamellar liposomes where the system reached equilibrium after cca 48 hours. In the
case of unilamellar liposomes, equilibrium was achieved in just 6 hours. We suppose, that
a greater number of lamelles in multilamellar liposomes, slows down the solubilizing effect of
C12NO. The equilibrium cS values for multilamellar liposomes were smaller than for unilamellar
liposomes.
The inclusion of cholesterol into EYPC bilayers makes the bilayers more resistant to
solubilization and long term exposure of C12NO. We suppose that it is connected with ordering
effect of cholesterol on EYPC acyl chains.
Acknowledgments:
This work was supported by 496/2012 FaF, VEGA 1/0159/11,
04-4-1096-2009/2014 grants.
61
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
Klinické aspekty lipidomického profilování v kardiologii
Galuszka J.1, Galuszková D.1, Holčapek M.2, Cífková E.2, Vostálová J.3, Lísa M.2, Červená B.2,
Znaleziona J.3, Netušilová K.2, Táborský M.1, Šimánek V.3
Fakultní nemocnice Olomouc1
Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice2
LF UP Olomouc3
Úvod: Účast látek lipidové povahy v etiopatogeneze řady kardiovaskulárních onemocnění je
nepochybná a přitom stále nedostatečně objasněná. Lipidomika jako obor přináší objevné
poznatky o nových lipidových species, jejich struktuře, funkci a metabolických interakcích.
Cíl: Porovnání lipidomického profilu osob subjektivně zdravých oproti skupině nemocných
s poruchami srdečního rytmu, srdečním selháním a překonaným infarktem myokardu.
Metoda: Lipidomické profilování za použití 1D a 2D LC/MS metod, zahrnujících metody silverion, RP a chiral HLPC.
Výsledky: Metoda lipidomického profilování byla ověřena na souboru 30 osob s onemocněním
kardiovaskulárního aparátu a 20 kontrol. Předběžné výsledky prvního ze tří plánovaných
odběrů naznačují diverzitu částí lipidového spektra mezi zkoumanými skupinami.
Závěr: Lipidomický přístup je příslibem nových poznatků , týkajících se palčivých problémů
současné kardiologie, jako jsou například srdeční infarkt, srdeční arytmie, srdeční selhání,
nebo kardiolipotoxicita. Dosavadní dílčí výsledky sledovaného souboru probandů doplníme
v roce 2012 o plánované kontrolní odběry s cílem statistického vyhodnocení.
Práce vznikla za podpory projektu GAČR č.206/11/0022.
62
POSTEROVÁ SEKCE
Recombinant CDO from T. mentagrophytes
Kasperova A.1, Cahlikova R.1, Kunert J.1, Sebela M.2, Raska M.1
Department of Immunology, Faculty of Medicine and Dentistry1
Department of Biochemistry, Faculty of Science, Palacky University in Olomouc2
Cysteine dioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20) catalyzes the oxygenation of cysteine to cysteine
sulfinic acid leading to the production of sulfite, sulfate, and taurine as the final metabolites
of cysteine catabolism. We produced the recombinant CDO protein from Trichophyton
mentagrophytes and analyzed the enzyme activity by monitoring the production of cysteine
sulphinate using mass spectrometry. To estimate the involvement of CDO in the biochemical
pathways leading to the reduction of disulphide bridges of proteins, we used the stimulation of
CDO synthesis in T. mentagrophytes cultures by application of L-cystine into growth medium.
CDO mRNA transcriptional activity was determined by real-time PCR after normalization to
housekeeping genes. To estimate the involvement of posttrasnlational regulation of CDO
activity, formerly identified in mammalian cells, we used hyperimmune serum from CDOimmunized BALB/c mice for western-blot analysis of CDO protein level in //T. mentagrophytes
//cultured with and without L-cystine supplementation.
This work was supported by MSM 6198959223 and MSM 6198959216.
63
2. ČESKÁ LIPIDOMICKÁ KONFERENCE
DNA vaccination of different glycosyltransferses induced immune response
after hydrodynamic DNA vaccination of mice
Stuchlová-Horynová M.1, Weigl E.1, Městecký J.1, Novák J.2, Raška M.1,2
Department of Immunology, Faculty of Medicine, Palacky University, Olomouc1
Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA2
We focus our work on the study of mechanisms involved in generation of galactose (Gal)deficient O-glycans on IgA1 molecules in patients with IgA nephropathy. O-glycosylation
is initiated by attachment of GalNAc to Ser/Thr residues of the hinge region by Nacetylgalactosaminyltransferase 2 (GalNAc-T2) followed by addition of Gal to the GalNAc
catalyzed by β1,3-galactosyltransferase 1 (C1GalT1). This structure can be modified by
attachment of SA to the Gal residues in a reaction catalyzed by a α2,3-sialyltransferase
(ST3Gal) and/or to the GalNAc residues catalyzed by α2,6-sialyltransferase II (ST6GalNAc II).
The cDNAs coding for transmembrane human glycosyltransferases (GalNAc-T2, GalNAcT14 and C1GalT1, ST6GalNac II, and ST6GalNac I) were cloned into mammalian expression
plasmid. Recombinant plasmids were administered by hydrodynamic application into BALB/c
mice. In parallel, the cDNAs coding for soluble portion of human glycosyltransferases GalNAcT2, GalNAc-T14 and C1GalT1, ST6GalNac II, and ST6GalNac I (without the transmembrane
domain) were cloned into mammalian expression plasmid behind sequences coding for
mouse immunoglobulin secretory signal and His tag. Respective recombinant proteins were
expressed in HEK 293T cells, isolated by affinity NiNTA chromatography, and identified by
Western blotting with anti-His-tag antibody. Their identity was verified by high-resolution
tandem mass spectrometry. Recombinant proteins served for evaluation of specific serum
antibodies from DNA-immunized mice using Western blotting techniques. Sera were also
tested in fluorescence microscopy for identification of respective glycosyltransferases. Our
data showed that hydrodynamic DNA vaccination induces high titers of specific antibodies to
respective recombinant enzymes.
This work was supported by grants GAČR P302/10/1055, IGA MZ NT11081 and LH11046.
64
POSTEROVÁ SEKCE
N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide as a structural modulator of
monoolein cubic phases
Hubčík L.1, Funari S.S.2, Devínsky F.1, Uhríková D.1
Faculty of Pharmacy, Comenius University, Bratislava1
Hasylab, DESY, Hamburg2
Monoolein or glycerol monooleate is a biodegradable polar lipid that has no marked toxic
effects. In excess of water monoolein forms a bicontinuous cubic phase of Pn3m symmetry
that shows good stability at wide range of temperatures from 20 °C to 85 °C (1,2). Pn3m
cubic phase of monoolein is formed by curved bicontinuous lipid membrane extending in
three dimensions, separating two congruent networks of water channels. Due to its unique
structure and high stability in excess of water the Pn3m cubic phase of monoolein is widely
studied as delivery system for drugs of various polarities (3). The encapsulation and release
of drugs from cubic phases can be controlled by the regulation of the diameter of water
channels by the addition of amphiphilic substances that incorporates into the lipid bilayer
and changes its curvature (4,5). In our work we study the effect of pH responsive surfactant
N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide (C12NO) on structural parameters of cubic phase
of monoolein. The microstructure of monoolein and mixtures of monoolein with C12NO in
excess of water was examined using synchrotron small angle X-ray diffraction (SAXD). At
pH&#8776;7, where C12NO is present in nonionic form, we have observed the Pn3m cubic
phase in mixtures of C12NO and monoolein up to molar ratio 0.2 mol/mol. At molar ratios
C12NO:monoole­in&#8805; 0.3 mol/mol the mixture has shown no regular arrangement. The
lattice parameter (a) of cubic phase of monoolein and its mixtures with C12NO depends on
both, temperature and C12NO:monoolein molar ratio. At 20 °C, the lattice parameter increases
from a=9.87 nm for Pn3m cubic phase of monoolein up to 16.92 nm for C12NO:monoole­in=0.2
mol/mol. With increasing temperature we have observed the decrease of lattice parameters
of cubic phases. For monoolein, a =7.56 nm at 80 °C, and for the mixture C12NO:monoolein=
0.2 mol/mol we determined a=8.92 nm. Changing pH into acidic (pH ~4), C12NO becomes
cationic, and the regular structure of C12NO:monoolein has disappeared. Our experiments
show that pH responsive C12NO can significantly affect the structural parameters of cubic
phase of monoolein and can be potentially used for regulation of drug binding and release
into monoolein cubic phase systems used for drug delivery.
Acknowledgement. The research leading to these results has received funding from the
European Community‘s Seventh Framework Programme (FP7/2007–2013) under grant
agreement n° 226716 (HASYLAB project II-20100372 EC), by the VEGA grant 1/1224/12 to DU
and grant FaF UK/46/2012 to LH.
References
1. Larsson K., Journal of Physical Chemistry 1989; 93: 7301–7314.
2. Larsson K., Current Opinion in Colloid and Interface Science 2000; 5: 64–69.
3. Shah J.C., Sadhale Y., Chilukuri D.M., Advanced Drug delivery reviews 2001; 47: 229–250.
4. Angelov B., Angelova A., Garamus V.M., Journal of the American Chemical Society 2007;
129: 13474–13479.
5. Angelov B., Angelova A., Vainio U. et al., Langmuir 2009; 25: 3724–3742.
65
2. Česká lipidomická konference
Workshop ICCTI
25. – 27. června 2012, Znojmo, hotel Prestige
ODBORNÝ PROGRAM, SBORNÍK ABSTRAKT
Editoři: Holčapek M., Cvačka J., Turánek J.,
Michálek J., Valterová I., Lísa M.
Nakladatel:
MSD, Lidická 23, 602 00 Brno
Rok vydání: 2012
ISBN: 978-80-7392-194-1
66
PUSHING THE LIMITS IN SENSITIVITY
Exceedingly sensitive.
Sharply focused.
THE 6500 SERIES WITH IONDRIVE ™ TECHNOLOGY
See what couldn’t be seen. Until now. The new AB SCIEX 6500 LC/MS/MS series with
multi-component IonDrive™ technology is the world’s most sensitive triple quadrupole,
improving sensitivity up to 10X and detector dynamic range by 20X over the best selling
high performance triple quad – with no compromise in mass range.
Unique QTRAP® linear ion trap technology and optional SelexION™ differential ion
mobility technology help enhance data quality and improve throughput while reducing
the need for sample preparation. With ultra-sensitivity and unrivaled robustness the
6500 Series enables scientists to push the limits in LC/MS/MS sensitivity and achieve the
lowest limits of quantitation for today’s most challenging quantitative assays.
The new AB SCIEX 6500 Series. It’s the farsighted successor to a long line of leading
AB SCIEX mass spec systems.
Explore visionary sensitivity at www.absciex.com/6500
© 2012 AB SCIEX. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. The trademarks mentioned herein are the property of AB SCIEX Pte. Ltd. or their respective owners.
You are
ready
Building on industry-leading capabilities, our new line of mass spectrometers
identify, quantitate and confirm compounds in the most demanding samples.
Whether unraveling protein structures, developing new drugs, or analyzing
trace pesticides, we help move your science and productivity forward with
industry-leading technology and expertise. And as you drive discovery and face
new unknowns, our advanced systems and software provide unprecedented
confidence in the final result. Whatever challenges arise in the future, you’ll be ready.
for the toughest challenges
in mass spectrometry
UÊsee our new line up at www.thermoscientific.com/ready
Orbitrap™ Elite Hybrid LC-MS
Gold standard for accurate mass
and now to 240,000 resolution
© 2011 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.
Q Exactive Benchtop Orbitrap
High resolution, accurate mass and
simultaneous qual/quan
Velos Pro Ion Trap
Fastest, most sensitive ion trap
with HCD fragmentation
TSQ Quantum XLS Ultra
GC-MS/MS
High sensitivity and selectivity in
GC and LC triple quadrupole MS
Download

program