Práce s inkluzními tělísky
Inkluzní tělíska
Refoldování
A
Agregáty
át proteinů
t i ů s nesprávnou
á
kkonformací
f
í v cytoplazmě
t l
ě
nebo jádru buněk
Fúzní proteiny
Autokatalitická technika odštěpení fúzní kotvy a její
p
od
separace
rekombinantního proteinu
Původ:
Virové infekce – akumulace virových kapsidových proteinů
Např. Negriho těliska (Vzteklina), Guarnieriho tělíska (Neštovice), Cucumber mosaic
virus…
Jiné patologické stavy
Např. Lewyho tělíska uvnitř neuronů (Parkinsonova choroba), inkluze hemoglobinu
(thalasémie)…
Mgr. Michal Křupka
Ústav imunologie LF UP
Ústav
Agregace
g g
rekombinantního p
proteinu v expresních
p
buňkách E. coli
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Inkluzní tělíska
Nativní
at
lyzát
y át
Cílový protein v
Částice tvořené agregovaným rekombinantním
proteinem
peletě
Rozpustný
p
ý
Nerozpustný
protein
Protein v inkluzních
tělíscích
Purifikace za
Protein je obsažen zpravidla v chybné
konformaci a není funkční
V některých
ěkt ý h případech
ří d h llze ttvorbě
bě inkluzí
i kl í
zabránit např. kultivací za nižší teploty, fúzí s
„tagy“, koexprese chaperonů….
Cílový protein v
supernatantu
t t
Až 70 % rekombinantních proteinů (hlavně
eukaryotického původu) je exprimováno v E.coli
ve formě inkluzních tělísek
Pro získání funkčního produktu je třeba
solubilizace inkluzních tělísek a následná
renaturace produktu
Centrifugace
Purifikace za
Denaturačních
Denaturačních
podmínek
podmínek
Photo from Webpages of The Working Group Downstream Processing at
the Department of Biotechnology, University of Natural Resources and
Applied Life Sciences Vienna , Vienna, Austria
Nativní čistý
produkt
Renaturace
Denaturovaný čistý
produkt
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Kultivace expresního kmene E. coli do O.D.600 = 0,6
Indukce exprese (1mM IPTG), kultivace indukovaných E. coli 3 – 4 hod. 37°C
Inkluzní tělíska
Denaturace a solubilizace (8M Urea
Urea, 6M Guanidin hydrochlorid,
hydrochlorid
mercaptoethanol)
Izolace bakteriální biomasy (centrifugace)
Lýza buněk – Lysozym, sonikace, opakované zamražení
Centrifugace, promytí pelety pufrem
Inkluzní tělíska
Renaturace (refolding
refolding))
Rekonstituce nativní (funkční) konformace proteinu po předchozí
denaturaci
Převedení do nativních podmínek, odstranění chaotropního (denaturačního)
činidla a jjeho nahrazení p
pufrem (PBS,
(
, Tris…,, fyziologické
y
g
pH
p a osmolalita))
Cílem je získat rozpustný protein v aktivní formě, tj. plnící svoji biologickou
funkci (antigen, enzym…)
Úspěšnost procesu obtížně predikovatelná
Průměrná výtěžnost bioaktivního proteinu
kolem 25 %
http://www.news.cornell.edu/stories/Aug06/ProteinFoldingScheraga.kr.html
Purifikace za denaturačních podmínek
(afinitní chromatografie)
Čistý denaturovaný solubilní protein
Renaturace…
Metody renaturace proteinů
Dialýza – odstranění nízkomolekulárních látek přes membránu o definované
pórovitosti jednoduchá nebo gradientová
pórovitosti,
Ředění – postupné přidávání roztoku proteinu do nadbytku pufru
Renaturace na koloně - afinitní nebo gelová chromatografie
Aditiva přidávaná do renaturačních pufrů (snižují agregaci proteinů,
umožňují tvorbu disulfidických vazeb)
Arginin (0,5 – 1M)
Glycerol
Oxidovaný a redukovaný glutathion
Dithiotreitol
Polyethylen glykol
Detergenty
EDTA
Metody ověření nativní konformace renaturovaných proteinů
Výsledek renaturace výrazně variabilní mezi jednotlivými proteiny – nutná
optimalizace metodiky pro každý jednotlivý protein
Enzymová aktivita
Imunogenita
Reakce s protilátkami proti konformačním epitopům
Protein refolding kits - komerční sady pufrů s gradientem koncentrací
jednotlivých složek - usnadnění nalezení optimálních renturačních podmínek
Vazba na receptor nebo ligand
Spektroskopické metody
Databáze renaturačních postupů pro jednotlivé proteiny:
http://clims.med.monash.edu.au/
Chow MK, Amin AA, Fulton KF, Whisstock JC, Buckle AM, Bottomley SP.
(2005) REFOLD
REFOLD: An
A analytical
l ti l database
d t b
off protein
t i refolding
f ldi methods.
th d Protein
P t i
Expr Purif.
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Zabránění tvorby inkluzních tělísek v E.coli
- Exprese při nižší teplotě – laboratorní teplota přes noc x 37°C 4 hodiny
- Koexprese chaperonů
- Výběr vhodného fúzního peptidu
- Použití speciálních kmenů bakterií pro expresi eukaryotických proteinů
-Exprese
p
v eukaryotických
y
ý vektorech – Pichia, Saccharomyces,
y
savčí a hmyzí
y
Kmeny E. coli vhodné pro expresi eukaryontních proteinů
Origami – kmen odvozený z E. coli K-12 mutantní v genu pro thioredoxin
reduktázu (trxB) a glutathion reduktázu (gor), zvyšuje tvorbu cysteinových můstků
v cytoplasmě
Rosetta – obsahuje sekvence pro tRNA pro kodony AUA, AGG, AGA, CUA, CCC
a GGA vzácné u E. coli
systémy
Rosseta – gami – kombinuje vlastnosti obou předchozích kmeny, tj, tvorbu
disulfidových můstků s rozeznáváním eukaryotických kodonů
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
„Tagy“ (značky, kotvy) fúzované s rekombinantními
Fúzní proteiny
p
y
proteiny
Proteiny vzniklé na základě spojení dvou nebo více genových
sekvencí původně kódujících odlišné produkty
Význam:
- Identifikace, vizualizace a kvantifikace exprimovaných proteinů pomocí
protilátkových nebo ligandových konjugátů
- Umožnění afinitní purifikace
Požadavky:
-Možnost jednokrokové afinitní purifikace
-Minimální
Minimální efekt na terciální strukturu proteinu a jeho aktivitu
-Možnost snadného a specifického odstranění z molekuly proteinu
-Možnost snadné a přesné detekce proteinu v průběhu purifikace
-Použitelnost v prokaryotických i eukaryotických expresních systémech
Sekvence plasmidu (Novagen)
Krátké oligopeptidové značky
Peptidový řetězec
thrombin
enterokinase
C- term
N- term
GST
His S
His
His-tag
Hi
t
Hi Hi Hi Hi Hi Hi (0,84
His-His-His-His-His-His
(0 84 kD
kDa))
T7-tag Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly (1 kDa)
V5-tag
g Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr
y y
y
p
Xpress epitope Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
S-tag Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser (1,75 kDa)
pancreatic ribonuclease
C-myc Glu-Gln-Lys-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (1,2 kDa)
SBP-tag Met-Asp-Glu-Lys-Thr-Thr-Gly-Trp-Arg-Gly-Gly-His-Val-Val-Glu-Gly-LeuAl Gl Gl L Gl Gl L A Al A L Gl His-His-Pro-Gln-Gly-Gln-ArgAla-Gly-Glu-Leu-Glu-Gln-Leu-Arg-Ala-Arg-Leu-GluHi Hi P Gl Gl Gl A
Glu-Pro (4,03 kDa)
Poly-arginine-tag Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (0,8 kDa)
Strep-Tag Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (1kDa)
FLAG-Tag N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C (1 kDa)
Calmodulin binding peptide Lys
Lys-Arg-Arg-Trp-Lys-Lys-Asn-Phe-Ile-Ala-Val-SerArg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser
Ala-Ala-Asn-Arg-Phe-Lys-Lys-Ile-Ser-Ser-Ser-Gly-Ala-Leu (2,96 kDa)
Doménové a proteinové značky
Celulose binding domains (3 – 20 kDa)
Glutathione S-transferase tag (GST) N-term protein (26 kDa)
Maltose-binding protein (MBP) protein (40 kDa)
Thioredoxin (TrxA) protein
Transcription termination anti-termination factor (NusA) protein
Protein disulfide isomerase I (DsbA) protein
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
His tag
Purifikace s použitím
metaloafinitní
t l fi it í chromatografie
h
t
fi
Krátká sekvence (6 aa)
ý
j neovlivňuje
j vlastnosti
Většinou výrazněji
proteinu – enzymová aktivita, struktura,
imunogenita
Afinita k atomům přechodných kovů Ni2+, Co2+, Zn2+, Cu2+ - purifikace
pomocí metaloafinitní chromatografie,
metodiky pro nativní i denaturační
postup, kovy kotveny nejčastějí pomocí
NTA ((nitrilotriacetic acid).
) Ni a Cu –
silnější vazba, Zn a Co slabší – nižší
výtěžek, ale vyšší čistota
Anti-His
A
i Hi protilátky,
ilá k Ni
Ni-NTA
NTA konjugáty
k j á –
umožňují detekci na Western blotu i
kvantifikaci rekombinantního proteinu
(ELISA, Dot blot)
Obrázky převzaty z webů Qiagen a KPL
Různé formáty, nejčastěji vázáný kov
Ni nebo Co, opakované použití
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Proteinové „tagy“ (GST, MBP,TrxA, NusA,
DsbA)
Schéma p
purifikace proteinu
p
fúzovaného s Maltose
binding protein na
imobilizované amylóze
Z š jí rozpustnost
Zvyšují
t
t exprimovaných
i
ý h proteinů
t i ů v E.
E coli,
li mohou
h zabránit
b á it ttvorbě
bě
inkluzních tělísek
GST a MBP mohou sloužit k afinitní p
purifikaci, k TrxA, NusA a DsbA musí být
ý
připojena peptidová značka
Velice často ovlivňují aktivitu a imunogenitu rekombinantního proteinu – nutno
odstranit po purifikaci
Web of New England Biolabs
Štěpné místo
Odstranění fúzních značek
thrombin
enterokinase
Vložení nukleotidové sekvence pro peptid rozeznávaný specifickou proteázou
GST
Používané proteázy:
Enterokináza
Th
Thrombin
bi
Faktor Xa
Tobacco etch virus (TEV) proteáza
His S
enterokináza
thrombin
GST
S
His
GST
His S
+
+
+
+
enzym
enzym
Oddělení p
produktů štěpné
p reakce
N t éd
Nutné
další
lší purifikační
ifik č í kroky
k k
- odstranění značek – afinitní nebo gelová chromatografie
-odstranění
d t ě í enzymu – vhodné
h d é použít
žít značený
č ý enzym – afinitní
fi it í metody
t d
Tag•off™ rEK Cleavage/Capture Kit
Kit založený na purifikované katalytické jednotce lidské enterokinázy
Obsahuje ředící a reakční pufry, kontrolní protein a EKapture™ agarózu
Umožňuje rychlé a snadné odstranění enzymu
- metody iontoměničové nebo gelové chromatografie
Pro některé aplikace stačí inaktivace proteázy
- inhibitory však jsou často toxické (PMSF – T+)
Protein p24 HIV/pET200 před a po
odstranění afinitního tagu, reakce 16 hod
při pokojové teplotě
Někdy je možno provést štěpení již na afinitní
koloně – eluční krok
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Komplikace proteázového odštěpení značek
-
Oddělení proteázy, odštěpeného peptidu a nerozštěpených proteinů od
správně štěpeného proteinu vyžaduje další purifikační kroky
-
Proteázy mohou štěpit protein nespecificky
nespecificky, případně může protein přirozeně
obsahovat rozeznávanou sekvenci
-
Štěpné místo může být nepřístupné díky konformaci proteinu
-
Štěpení vyžaduje dlouhou dobu, často při pokojové teplotě – problém u málo
stabilních proteinů
-
Metoda je relativně nákladná
Autokatalitická technika odštěpení
p
fúzní kotvy
y
Samoštěpící moduly, aktivace nízkomolekulární látkou po odmytí
kontaminujících proteinů
Inteiny
„proteinové introny“, popsány roku 1987
S
Samoštěpící
ště í í aktivita
kti it
Fúze s rekombinantními proteiny – spojka
mezi cilovým proteinem a značkou
značkou, např
např.
Chitin binding protein
Štěpení po přídání thiolu – DTT,
mercaptoethanol
Web of New England Biolabs
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Systém
y
založený
ý na autokatalytickém
y
jádře
j
sortázy
yA
Staphylococcus aureus (SrtAc)
Self processing module
(SPM)
Základem doména proteinu FrpC
Neisserie meningitidis
Štěpení indukováno vápenatými
ionty
Ostatní možnosti tvorby
y fúzních p
proteinů
„Trimer tag“ – kolagenová doména
C- terminální repetitivní sekvence kolagenu
- Ovlivnění struktury vzniklého proteinu
- Sekrece proteinu v savčích buňkách – sekvence odvozené z
imunoglobulinů
Humanizace“ produktu – monoklonální protilátky
-„Humanizace
- Ovlivnění imunogenity proteinu – „molekulární adjuvans“
- a mnoho
h d
dalších
lší h
Imunomodulační fúzní proteiny
Tvorba chimerických a humanizovaných monoklonálních
protilátek
Fúze antigenu s imunomodulačním proteinem – cytokiny, chemokiny, heat shock
proteins, kostimulační molekuly….
ATG
ATG
ATG
ATG
hsp70mm
p24
p
p24
hsp70mm
p
hsp70mm
p24
His
V5
His
V5
His
V5
STOP
His
V5
STOP
STOP
STOP
DNA constructs used in the experiment
Autor prezentace: Mgr. Michal Křupka
Děkuji za pozornost
Download

Mgr. Michal Křupka