NASTAVNO-NAUČNOM VEĆU HEMIJSKOG FAKULTETA
UNIVERZITET U BEOGRADU
Predmet: Izveštaj Komisije za ocenu i odbranu doktorske disertacije
Aleksandre N. Radovanović, magistra hemijskih nauka
Odlukom Nastavno-naučnog veća Hemijskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, sa
sednice održane 13.9.2012., imenovani smo za članove Komisije za ocenu i odbranu doktorske
disertacije mr Aleksandre N. Radovanović, pod naslovom: “Karaterizacija i korelacija
boiaktivnih fenolnih jedinjenja i antioksidativne i antimikrobne sposobnosti crvenih vina
Balkana”.
Kandidat mr Aleksandra N. Radovanović temu pod naslovom: “Karaterizacija i
korelacija boiaktivnih fenolnih jedinjenja i antioksidativne i antimikrobne sposobnosti crvenih
vina Balkana” prijavila je na Hemijskom fakultetu Univerziteta u Beogradu 13. septembra 2012.
godine. Naučno veće je prihvatilo izveštaj komisije za ocenu ispunjenosti uslova i opravdanosti
teme doktorske disertacije na sednici 8.11.2012. Na osnovu date odluke, Veće naučnih oblasti
prirodnih nauka Univerziteta u Beogradu 29.11.2012. god. je odložilo razmtranje zahteva i
naložilo fakultetu da u primerenom roku ispravi naslov teme i sugerisala naslov koji je i
prihvaćen na narednoj sednici 26.12.2012:
“Karakterizacija i korelacija bioaktivnih fenolnih jedinjenja crvenih vina Balkana i
njihova antioksidaciona i antimikrobna svojstva”
Nakon pregleda i analize ove disertacije podnosimo Veću sledeći
IZVEŠTAJ
A. Prikaz sadržaja doktorske disertacije
Doktorska disertacija mr Alaeksandre N. Radovanović je napisana na 200 strane formata
A4, sa prosekom 1,5. Podeljena je na 6 poglavlja u kojima se nalaze 74 tabele, 89 slike i 141
1
literaturni navod. Disertacija sadrži: Rezime (2 strane), Abstract (2 strane), Uvod (2 strane),
Opšti deo (19 strana), Eksperimentalni deo (13 strana) Rezultati i diskusija (139 strana),
Zaključak (9 strana), Literatura (15 strana), kao i Biografija autora (1 strana).
Predmet ove doktorske disertacije je bio ispitivanje fenolnog sastava, antioksidativnih i
antimikrobnih delovanje crvenih vina, dobijenih iz vinogradarskih i vinskih rejona Balkana i
uspostavljanje korelacija između nađenih koncentracija fenolnih komponenata i biohemijskog
delovanja vina. U tu svrhu su analizirana polusuva i kvalitetno suva crvena vina sa poznatim
geografskim poreklom iz Bosne i Hercegovine, Hrvatske, Srbije, Crne Gore, Makedonije i
Bugarske, proizvedenih u periodu od 2007 do 2011 godine od različitih vinarija. Izabrana su
crvena vina dobijena od internacionalnih: Cabernet Sauvignon, Merlot, Pinot Noir, Frankovka i
Game i autohtonih Vitis vinifera sorti grožđa: Vranac i Kratošija. Određivanje fenolnih jedinjenja
izvršeno je spektroskopskim metodama analize i HPLC-om. Primenom dva različita HPLC
detektora (DAD i fluorescentnog) identifikovano je više od pedeset fenolnih komponenata.
Antioksidativna
aktivnost
izabranih
uzoraka
vina
je
određena
primenom
dve
spektrofotometrijske metode: DPPH antiradikalne i nove redoks metode, koja se zasniva na
oksidacionoj sposobnosti bakra (II)-1,10-fenantrolin agensa. Antimikrobna aktivnost izabranih
uzoraka vina je ispitivana primenom disk-difuzionom i mikro-dilucionom metodom prema šest
gram-pozitivnih (Clostridium perfringens ATCC 19404, Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria
innocua ATCC 33090, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Sarcina lutea ATCC 9341 and
Micrococcus flavus ATCC 40240) i šest gram-negativnih (Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Shigella sonnei
ATCC 25931, Klebsiella pneumonia ATCC 10031 i Proteus vulgaris ATCC 8427), kao i prema
kvascu – Candida albicans. Korelacionom analizom je ispitivana mogućnost postojanja
korelacije između antioksidativnog kapaciteta vina i spektroskopskih, odnosno HPLC
detektovanih koncentracija nekih fenolnih grupa i najzastuljenih i/ili biohemijskih najznačajnijih
fenolnih komponenata u vinima. Korelacionom analizom, takođe je ispitivana mogućnost
korelacije između antimikrobnog delovanja vina prema testiranim bakterijskim vrstama i
glivama i detektovanih koncentracija nekih fenolnih grupa i nekih najzastuljenih fenolnih
komponenata u vinima.
2
B: Prikaz postignutih rezultata
Dobijeni rezultati spektroskoske analize sadržaja ukupnih fenola (na 280 nm), estra
vinske kiseline (na 320 nm) i flavonola (na 360 nm) u svim ispitivanim uzorcima vina pokazuju
da su zavisni od sorte grožđa, mestopoložaja vinograda, agrohemijskih uslova zemljišta, vreme
sazrevanja i branja grožđa, godine berbe grožđa, procesa vinifikacije, načina čuvanja,
skladištenja itd. Na osnovu praćenja promena fenolnog sadržaja istosortnih vina, dobijena u
istim vinarijama, u toku 2008. i 2009. godine, utvrđeno je da 2009. godina bila ekološki
povoljnija za njihovu biosintezu.
HPLC analiza je pokazala da koncentracije hidroksibenzoevih i hidoksicimetnih kiselina
(galna, vanilinska, siringinska, hlorogenska, elagilna, trans-kaftarna, trans-kutarna, trans-kafena,
p-kumarna i ferulna kiselina) detektovanih na 280 i 320 nm DAD-om zavisne su od više faktora.
Procentni odnos između hidroksibenzoevih i hidroksicimetnih kiselina sje promenljiv i nalazi se
u intervalu od 41,45 do 75,04 % u zavisnosti sastava vina, godine berbe grožđa, vinifikacije itd.
Maksimalna koncentracija ukupnih fenolnih kiselina je nađena u Vranac vinima (204,60 mg/L).
Zajednička karakteristika svih ispitivanih vina je da je galna kiselina najdominantnija i dostiže
maksimalnu vrednost od 88,75% u Kratošiji vinima.
HPLC identifikacija koncentracije
trans-rezveratrola na 320 nm, biohemijski
najznačajnije fenolno jedinjenje u svim crvenim vinima, je pokazala da u ispitivanim uzorcima
vina može da bude od 0,74 mg/L do 2,41 mg/L (vino Merlot iz vinarije Tikveš, Makedonija).
HPLC analiza flavonoidnih jedinjenja izvršena je na 275/322 nm sa fluorescentnim detektorom
(flavan-3-oli) i na 360 nm sa DAD-om (flavonoli, flavoni i flavanoni). Koncentracija ukupnih
detektovanih flavonoida u Cabernet Sauvignon vinima dostiže maksimalnu vrednost do 166,63
mg/L, u Vranac vinima do 157,78 mg/L, u Kratošija vinima do 112,92 mg/L, u Merlot vinima do
200,26 mg/L i u mešanim vinima iz Župskog regiona je najmanja do 86,25 mg/L.
Određene koncentracije flavan-3-ola ((+)-katehina, procijanidina B2, (-)-epikatehina i (-)epigalokatehingalata) se veoma razlikuju i dostižu maksimalnu vrednost u Cabernet Sauvignon
do 143,75 mg/L. Zajednička karakteristika svih ispitivanih uzoraka vina je da je (+)-katehin
najdominantniji i to u Cabernet Sauvignon do 55,30%, u Merlot i Kratošija do 52,09%, u Vranac
do 51,59%, u Frankovka do 62,00%, dok u mešanim vinima iz Župskog regiona i do 83,13%
(vino Medveđa krv iz vinarije Rubin).
3
Određene koncentracije flavonola (kvercetin-3-glikozida, rutina, miricetina, morina,
kvercetina i kemferola), takođe se razlikuju i dostižu maksimalnu vrednost u Vranac vinima do
55,05 mg/L. U svim ispitivanim uzorcima vina najdominantniji je kvercetin u obliku kvercetin-3glikozida i njihovo maksimalno procentno prisustvo u Vranac vinima je 60%, a u ostalim
jednosortnim vinima iznad 60%. HPLC analiza je pokazala da ostala flavonoidna jedinjenja:
flavoni i flavanoni su prisutni u manjim koncentracija u svim uzorcima vina.
Veoma značajna flavonoidna grupa koja utiče na boju, senzorna i biohemijska svojstva
crvenih vina su antocijani (malvidin-3-glikozid, peonidin-3-glikozid, delfinidin-3-glikozid,
cijanidin-3-glikozid i petunidin-3-glikozid, njihovi 3-acetilglikozidi i p-kumaroilglikozidi
derivati, kao i Vitisin A i malvidin-3-vinilfenolglikozid) detektovani na 520 nm. Njihovo
prisustvo je najveće u Cabernet Sauvignon (do 1480,56 mg/L) i u Vranac vinima (do 1501,79
mg/L). U svim ispitivanim uzorcima vina najdominantniji je malvidin-3-glikozid i tako da
ukupni procenat malvidin derivata u Cabernet Sauvignon dostiže do 86,47 % , a u Vranac vinima
do 100,00 %.
Ispitivani uzorci crvenih vina pokazuju antioksidativno delovanje na DPPH radikale u
širokom opsegu EC50 vrednostima od 47,17 mL/g do 145,83 mL/g ili u procentima od 91,83 do
69,55%. Ispitivanje antioksidativne aktivnosti crvenih vina, izvršeno je i sa novom redoks (CR)
metodom, odnosno primenom bakar (II)-1,10-fenatrolina kao oksidanta. Uporedbena analiza je
pokazala da postoji odlična korelacija među rezultatima dobijenim DPPH i CR metodom (0,9775
-0,9776). Takođe, korelacionom analizom je utvrđeno da postoji dobra korelacija (0,6060)
između antioksidativne aktivnosti ispitivanih vina
i spektroskopskih nađenih koncentracija
ukupnih fenola, estara vinske kiseline i flavonola, kao i odlična korelacija (0,8595) sa HPLC
detektovanih koncentracija ukupnih fenolnih kiselina, flavan-3-ola, flavonola, antocijana i
flavonoida. Takođe, utvrđena je dobra korelacija (0,6917 - 0,7719) između antioksidativnee
aktivnosti ispitivanih uzoraka vina i koncentracija sledećih fenolnih komponenata: galne
kiseline, (+)-katehina, kvercetin-3-glikozida i trans-resveratrola.
Antimikrobna aktivnost izabranih uzoraka crvenih vina prema šest gram-pozitivnih i šest
gram-negativnih bakterija, kao i prema kvascu Candida albicans je pokazala da redosled
minimalne inhibitorne (MIC) i minimalne bakterijske koncentracije (MBC) u zavisnosti sorti
grožđa je sledeći: Cabernet Sauvignona > Vranac > Merlot > Pinot Noir ~ Frankovka ~ Mešana
vina iz
Župskog regiona. Raspored antimikrobnog delovanja vina prema gram-pozitivnim
4
bakterijama je: C. perfringens > B. subtillis ~ L. monocytogenes ~ S. lutea > S. aureus ~ M.
flavus, a prema gram-negativnim bakterijama: P. vulgaris > P. aeruginosa ~ S. enteritidis > K.
pneumonia > S. sonnei. Najjače antimikrobno delovanje je pokazalo Cabernet Sauvignon - Terra
Lazarica vino i to prema prema gram-pozitivnim: B. subtillis (19,0 mm) i B. subtillis (18,6 mm)
i prema gram-negativnim bakterijama: E. coli (20, 0 mm) i S. sonnei (18,0 mm), što je u
saglasnosti sa njegovom najvećom koncentracijom ukupnih flavonoida (163,63 mg/L), fenolnih
kiselina (143,19 mg/L) i antocijana (1480,56 mg/L), detektovanih HPLC metodom.
Korelacionom analizom je potvrđeno da postoji dobra korelacija između antimikrobnog
delovanja prema E. coli i S. aureus i nađenih koncentracija za (+)-katehina u svim ispitivanim
vinima (0,6625 i 0,7433). Urađena analiza antioksidativne i antimikrobne aktivnosti svih
ispitivanih vina je pokazala da najbolje korelacije se uspostavljaju sa ukupnom koncentracijom
detektovanih flavonoida, pa se može zaključiti da je biohemijsko delovanje crvenih vina,
posledica sinergestičkog delovanja većeg broja biološkoaktivnih komponenata.
C. Uporedna analiza rezultata sa rezultatima iz literature
Poznato je da fenolna jedinjenja nemaju nutritivni značaj, ali pomažu u očuvanju
ljudskog organizma zbog visokog antioksidativnog potencijala [Hertog i sar. 1995]. Različita
istraživanja su dokazala da fenolna jedinjenja pozitivno deluju na krvne sudove, štite od štetnog
sunčevog i radioaktivnog zračenja, deluju antioksidativno, antiinflamatorno, antimikrobno i
antikancerogeno [Bravo, 1998; Gey, 1999; Daglia i sar., 2007; Gry i sar., 1998; Hou, 2003;
Macheix i Fleuriet, 1998; Renaud i de Lorgeril, 1992; Rice-Evans i sar., 1995; Soleas i sar, 2002;
Wang i sar., 1997].
Fenolna jedinjenja u vinu su veoma značajna, kako za kvalitet vina jer utiču na njihovu
boju i senzorna svojstva, tako i za njihovo blagotvorno biološko dejstvo po ljudski organizam.
Njihova oksidativna moć je dvadeset puta veća nego vitamina E i pedeset puta veća nego
vitamina C [Van Asker i sar., 1996]. Umereno konzumiranje crvenog vina (oko 120 mL dnevno)
može da dovede do smanjenja rizika od kardiovaskularnih bolesti od 25 do 60 % [Bertelli, 2007;
Gey, 1990; Doll, 1990; Mimić-Oka i sar., 1999].
Ispitivanje uticaja određenih fenolnih grupa ili fenolnih komponenata na antioksidativni
potencijal crvenih vina je tema interesovanja zadnjih dve decenija. Neki smatraju da
5
najzaslužniji su monomerni katehini, proantocijanidoli, monomerni antocijani i neke fenolne
kiseline [Gil-Munoy i sar., 2010; De Galulejac i sar., 1999; Jackson, 2008; Luiz, 2011; Harris i
sar., 2010; Macheix i Fleuriet, 1998; Minussi i sar. 2003; Singleton i Trousdale, 1992; Soleas i
sar., 1997; Taha i sar., 2008; Van Asker i sar., 1996; Wang i sar, 1997]. Značajna antioksidativna
aktivnost (-)-epikatehina je pripisana njegovom konvertovanju u obliku antocijana pod dejstvom
slobodnih radikala [Luiz 2011; Katalinić i sar., 2004].
Takođe, već je utvrđena pozitivna
korelacija između sadržaja antocijana i antioksidativne aktivnosti nekih svetskih crvenih vina
[Lila, 2004; Mazza i sar., 1999; Mazza i Miniati, 1993; Meiers i sar., 2001; Munoz-Espada i
sar., 2004; Wang i sar.,1997]. Primećen je veći antioksidativni potencijal vina od iste sorte
grožđa i to starenjem vina dolazi do njegovog pojačanja, smatra se kao posledica povećanja
koncentracije tanina, koji nastaju tokom sazrevanja vina [Piljac i sar., 2005].
Na osnovu heliotermičkih uslova, vinogradarski regioni Balkana imaju kontinentalnu
klimu i uslovi gajenja grožđa su veoma slični klimatskim uslovima u regionima Cotes du Rhone
u Francuskoj, Barolo i Chianti u Italiji, Porto i Vinho Verde u Portugaliji [Jones i sar., 2005].
Budući da je grožđe i vino značajan izvor biološki aktivnih fenolnih jedinjenja, izučavanje
fenolnih komponenata i biohemijskog delovanja crvenih vina sa naših prostora, Balkanskog
vinogradarskog i vinskog regiona je bilo značajno sa više aspekata.
Urađena analiza fenolnih jedinjenja, antioksidativne i antimikrobne aktivnosti crvenih
vina sa poznatim geografskim poreklom iz šest zemalja Balkana, proizvedenih u periodu od 2007
do 2011 godine od različitih vinarija, daje nam mogućnost za proizvodnju kvalitetnih crvenih
vina sa povećanim fenolnim sadržajem, koji uz boljeg marketinga bili bi konkurentni na
svetskom tržištu.
D. Objavljeni ili saošteni rezultati koji čine deo teze
Rezultati istraživanja predstavljenih u okviru teze su već publikovani u naučnim
časopisima i materijalima naučnih skupova:
Rad u istaknutom međunarodnom časopisu (M 22):
1. Radovanović A., Jovančičević B., Radovanović B., Mihajilov-Krstev T., Zvezdanović J.
(2012) Antioxidant and antimicrobial potentials of Serbian red wines produced from
6
international Vitis vinifera grape varieties, Journal of the Science of Food and
Agriculture, 92/10, 2154–2161.
2. Radovanovic B, Radovanovic A., Tomic V. (2012). Relations between the phenolic
composition and free radical scavenging and antibacterial activities of red wines from
different cultivars of Vitis Vinifera L., International Journal of Food Properties, 15/ 4,
725-735.
Rad u međunarodnom časopisu (M 23):
1. Radovanović A., Jovančičević B., Radovanović B., Mihajilov-Krstev T. (2014)
Antimicrobial effectiveness of selected Vranac wines against six Gram-positive - and six
Gram-negative bacterial strains, Tropical Journal of Pharmaceutical Research (No.
MRN2083643, prihvaćen)
Rad u časopisu nacionalnog značaja (M 52):
1. A. Radovanović, B. Radovanović, B. Jovančićević (2013) Influence of ripening stage on
phenolic composition and antioxidant activity of Vitis vinifera L. red grape varieties, The
Journal of Ege University Faculty of Agriculture, (Turkey), ISSN: 1018-8851, Vol II,
685-689.
Rad saopšten na skupu međunarodnog značaja štampan u celini (M 33):
2. A. Radovanović, B. Jovančićević, B.Radovanović, T. Mihajilov-Krstev, Determination of
phenolic compounds and antioxidant and antimicrobial potentials of some Serbian red
wines, International Symposium for Agriculture and Food,, 12-14.12.2012., Skoplje
(Republic of Macedonia), 33-36.
3. A. Radovanović, J. Bojić, B. Jovančićević, B. Radovanović, The use of new
spectrophotometric assays for the determination of antioxidant activity of red wines,
International Symposium for Agriculture and Food, 12-14.12.2012., Skoplje (Republic of
Macedonia), 36-39.
4. B. Radovanović, A. Radovanović, J. Bojić, J. Zvezdanović, B. Jovančićević, Total
antioxidant capacity of red wines, III International Congresss on Enginnering,
Environment and Materials in Processing Industry, 4.3-6.3.2013. Jahorina (BiH), 452457.
7
E. Zaključak
Na osnovu izložene analize doktorske disertacije mr Aleksandre N. Radovanović,
Komisija je došla do zaključka da ona predstavlja originalan i značajan doprinos u naučnoj
oblasti primenjene hemije. Deo rezultata istraživanja iz teze kandidat je publikovao u vidu 4
naučna rada, od kojih dva u kategoriji M22 i po jedan u kategorijama M23 i M52. Saopštila je 4
rada na medjunarodnima naučnim skupovima koji su štampani u celosti (M33).
Imajući u vidu rezultate do kojih je kandidat došao u svom istraživanju, kao i njihov
naučni i praktični značaj, predlažemo Nastavno-naučnom veću Hemijskom fakultetu
Univerziteta u Beogradu da disertaciju mr Aleksandra N. Radovanović pod naslovom:
“Karakterizacija i korelacija bioaktivnih fenolnih jedinjenja crvenih vina Balkana i
njihova antioksidaciona i antimikrobna svojstva“ prihvati i odobri njenu javnu odbranu u
cilju sticanja naučnog stepena doktor hemijskih nauka.
Beograd, 10.2.2014. godine
ČLANOVI KOMISIJE:
Dr Branimir Jovančičević, redovni profesor,
Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu, mentor
Dr Vele Tešević, vanredni profesor,
Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu
Dr Miroslav Vrvić, redovni profesor,
Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu
Dr Vlatka Vajs, naučni savetnik,
IHTM-Centar za hemiju
8
Download

nastavno-naučnom veću hemijskog fakulteta