INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE
aneb
CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI O
(BIO)MOLEKULÁCH
Vladimír Baumruk
Seminář BCM094 „Úvod do problémů současné biofyziky“
Metody
vibrační spektroskopie
¾
infračervená spektroskopie (IČ)
¾
Ramanova spektroskopie (RS)
vibrační optická aktivita (VOA)
¾
vibrační cirkulární dichroismus (VCD)
¾
Ramanova optická aktivita (ROA)
2
Vibrační spektroskopie – princip
CO2
- lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie
n = 3 ⇒ 3n – 5 = 4
⇒ 2 valenční vibrace ⇒ nesymetrická ⇒ aktivní v IČ
⇒ symetrická ⇒ aktivní v RS
⇒ 2 deformační vibrace (degenerované) ⇒ aktivní v IČ
střed symetrie ⇒ alternativní zákaz
vibrace aktivní v IČ spektru nejsou
aktivní v Ramanově spektru a vice versa
(tedy komplementarita IČ a Ramana)
frekvence vibrace
f – silová konstanta (síla vazby)
μ – redukovaná hmotnost
(průměrně velký protein má přibližně 20 000 vibračních stupňů volnosti !!!)
3
Vibrační spektroskopie – princip
hν R = hν0 ± ( E 2 − E1 )
Ramanův posuv νvib = ν0-νR
⇒ vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu)
⇒ vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti)
4
intenzita rozptylu
propustnost (%)
Vibrační spektroskopie – spektra
IČ
daleká IČ
Raman
Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové
5
Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl4)
ν2 214 cm-1
2x degenerovaná
ν4 313 cm-1
3x degenerovaná
ν1 460 cm-1
plně symetrická
ν3 780 cm-1
3x degenerovaná
polarizované spektrum
depolarizované spektrum
6
Detailní pohled na ν1 pás v Ramanově spektru CCl4
C
35Cl 37Cl
2
2
C 35Cl337Cl
C 35Cl4
ν1 - symetrická valenční vibrace
C 35Cl 37Cl3
Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl
(jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou
izotopů v molekule CCl4)
7
Proč vibrační spektroskopie ?
9 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto
nachází využití například v proteomice)
9 neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám,
možnost dynamických studií)
9 velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí
nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)
9 je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi
strukturou a funkcí biomolekul
8
Výhody vibrační spektroskopie
¾
RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity
po skončení měření).
¾
Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné,
suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro
biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich
struktura v krystalu a v roztoku.
¾
Nenáročné na objem vzorku (cca 10 μl pro konvenční RS, 20 μl pro IČ).
¾
Rychlá časová škála absorpce i rozptylu (≈ 10-15 s) - využití vibrační
spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné
pomocí fluorescence či NMR.
¾
Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení
pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).
9
Specifické výhody Ramanovy spektroskopie
¾
Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii
(na rozdíl od IČ).
¾
Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při
kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické
molekuly).
¾
Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1,
daleká IČ oblast)
¾
Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).
¾
Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)
10
Nevýhody vibrační spektroskopie
¾
Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale
nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně
kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová
mutace) modifikací.
¾
Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku (≈ 10-100 μg/μl) byť
v malých objemech.
¾
Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii
(na rozdíl od Ramanova rozptylu).
¾
Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve
srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota
vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).
11
Vibrační konformační markery
‹ Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“
dané molekuly.
‹ Složité molekuly ⇒ vibrační módy a jim příslušející spektrální pásy
nemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduše
vypočítány.
⇒ vibrační spektrum nelze použít pro výpočet struktury.
⇒ Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako
„otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislé
metody.
⇒ Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží struktury
určené pomocí difrakčních nebo NMR metod.
⇒ Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv.
normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickými
charakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.) ⇒ správně přiřazený
pás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohoto
strukturního rysu.
12
Vibrační strukturní markery
Ve vibračních spektrech nukleových kyselin rozlišujeme dva základní
typy strukturních markerů:
¾ nukleosidové konformační markery jako indikátory konformace cukru a
torze glykosylu citlivé k torzním úhlům δ (C2´-endo nebo C3´-endo
konformace cukru) a χ (anti nebo syn orientace báze)
¾ páteřní konformační markery jako indikátory fosfodiesterové torze
citlivé k torzním úhlům α a ξ popisujícím rotaci kolem esterových vazeb
5´O-P a 3´O-P)
Ve vibračních spektrech proteinů rozlišujeme řadu strukturních
markerů, které jsou citlivými indikátory bezprostředního okolí
postranních řetězců, jejich interakce s ním a konformace (Trp, Tyr,
Cys). Pásy amidu I, II a III jsou citlivými indikátory sekundární
struktury.
13
Kanonické struktury DNA
Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA,
a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA a
A-DNA obsahuje 20 nukleotidů
stejné sekvence. Z-DNA je
tvořena alternujícími GC páry.
B-DNA
C2’ endo/anti
A-DNA
C3’ endo/anti
Z-DNA
C2’ endo/anti (pyrimidiny)
C3’ endo/syn (puriny)
14
Kanonické struktury DNA
Deoxyguanosine
v
B-DNA
C2´endo Sugar Pucker
Deoxyguanosine
v
Z-DNA
A.
Poloha osy helixu (+) v rovině páru bazí pro B-DNA,
A-DNA a Z-DNA.
B.
Konformace nukleosidů v kanonických DNA
strukturách. Nahoře: C2’ endo pucker s anti torzí
glykosylu vyskytující se u všech reziduí v B-DNA a u
pyrimidinových reziduích v Z-DNA. Diagram také ilustruje
páteřní (α, β, γ, δ, ε, ζ) a glykosylové torzní úhly (χ).
Dole: C3’ endo/syn vyskytující se v purinových
reziduích v Z-DNA. V A-DNA všechna rezidua zaujímají
C3’ endo sugar pucker s anti glykosylovou torzí.
C3´endo Sugar Pucker
15
Spektra kanonických struktur DNA
Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označeny
jsou nukleosidové a páteřní konformační markery.
16
Určení struktury RNA·DNA hybridu v roztoku
A·B hybrid
B-form
A-form
A-form
Ramanova spektra
A.
B.
C.
D.
poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura)
poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form)
poly(dA-dT).poly(dA-dT) fiber při 75% RH (A-form)
poly(rA).poly(dT) fiber při 75% RH (A-form)
17
Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku
Intensity (relative units)
200
0%A
5%A
10 % A
15 % A
20 % A
24 % A
30 % A
36 % A
42 % A
50 % A
56 % A
65 % A
75 % A
85 % A
95 % A
100 % A
Raman spectra of poly(rA)+poly(rU) mixtures
150
100
50
0
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
1800
Raman shift (cm-1)
Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se
měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA)
(fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.
18
Interakce poly(rA)
s poly(rU)
Výsledky faktorové analýzy
aplikované na první derivaci
souboru Ramanových spekter
směsi poly(rA) s poly(rU) s
měnícím se poměrem A:U.
19
Interakce poly(rA)
s poly(rU)
1.0
Relative fraction
Calculated fractions of species
0.8
single str. poly(rA)
single stranded poly(rU)
duplex poly(rA).poly(rU)
triplex poly(rU).poly(rA).poly(rU)
0.6
0.4
0.2
0.0
60
1579
1305
1484
1509
1338
100
Absorbance / rel. units
20
1425
644
40
1177
1219
1252
811
60
1098
80
1008
727
100
80
0
0
220
1687
1627
240
260
wavelength / nm
280
300
Constructed UV abs. spectrum
of poly(rU)
2
20
0
600
800
1000
1200
wavenumbers / cm -1
1400
1600
240
260
wavelength / nm
280
300
Constructed UV abs. spectrum
of poly(rA).poly(rU)
1
0
1600
1576
1615
1670
1694
1729
1183
1091
1102
816
869
923
981
1006
632
727
782
Constructed RS of
poly(rU).poly(rA).poly(rU)
1400
jednovláknová poly(rU),
poly(rA).poly(rU) duplex a
poly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex.
2
220
Absorbance / rel. units
1200
1480
1513
1000
wavenumbers / cm-1
1236
800
1262
1301
1348
1381
600
Absorbance / rel. units
1574
1622
1482
1510
1689
220
3
Byly identifikovány 4 složky:
jednovláknová poly(rA)
1
1600
1338
1378
1302
919
985
1008
1232
784
814
630
647
80
1400
wavenumbers / cm-1
727
100
Intensity / rel. units
1
1600
1471
1397
1200
Constructed RS of
poly(rA).poly(rU)
120
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
2
3
1092
998
1000
1101
Intensity / rel. units
1400
wavenumbers / cm-1
782
800
140
40
1200
Constructed UV abs. spectrum
of poly(rA)
0
600
60
1000
Constructed RS of
poly(rU)
643
Intensity / rel. units
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
800
1230
600
3
Absorbance / rel. units
40
poly(rA) content / %
Constructed RS of
poly(rA)
120
918
Intensity / rel. units
140
20
1379
0
3
240
260
wavelength / nm
280
300
Byla izolována spektra čistých
komponent
Constructed UV abs. spectrum
of poly(rU)poly(rA).poly(rU)
2
1
0
220
240
260
wavelength / nm
280
300
20
Vibrační spektroskopie proteinů
IČ spektrum proteinu v H2O (tučně) a D2O (slabě).
Tloušťka kyvety byla cca 6 μm (H2O) respektive 20 μm (D2O).
21
Vibrační spektroskopie proteinů
Ramanovo spektrum (R2R3) fragmentu proteinu c-Myb
200
540
400
677
643
200
νS-H
823 (Y)
759 (W18)
400
600
cysteine
876 (W17)
853 (Y)
600
1060
1011 (W16)
800
amide III
1175 δCH3
1126 (W13)
800
amide I
c-Myb(R2R3) fragment
1267
1000
1360 (W7)
1340 δCH2+ W7
1000
1461 δCH3
1446 δCH2
1200
1553 (W3)
1200
1654
1400
1621 (W1)
1579 (W2)
1400
2554
Raman intensity
(minimální sekvence pro specifickou vazbu k cílové sekvenci DNA)
0
0
2600
2400
-1
wavenumber (cm )
1600
1400
1200
1000
-1
800
600
wavenumber(cm )
Fragment c-Myb(R2R3) obsahuje 6 tryptofanů (3 v R2 i R3), 2 tyrosiny (1 v R2 i R3),
a 1 cystein (v R2). Jejich pásy v Ramanově spektru dominují.
22
Ramanova a rezonanční Ramanova spektroskopie
Volba excitace ⇒ selektivita !!!
Rezonance s aromatickými zbytky (229 nm)
– spektru dominují pásy Trp (W) a Tyr (Y)
proteinových podjednotek
Nerezonanční excitace (514,5 nm) – spektru
dominují pásy proteinových podjednotek obálky
viru (tvoří cca 88% hmotnosti viru)
Phe
Rezonance s virovou DNA (257 nm ) spektru dominují pásy bazí jednovláknové
DNA (A,G,T,C)
G @ 668 cm-1 ⇒ 3´endo/anti (A marker)
amid I @ 1651 cm-1 ⇒ α helix
Ramanova spektra (600-1800 cm-1) fd viru excitovaná 514.5 nm
(dole, 50 mg/mL), 257 nm (uprostřed, 0.5 mg/mL) a 229 nm
(nahoře, 0.5 mg/mL).
23
Vibrační spektroskopie a struktura peptidů a proteinů
Schematické znázornění vibračních módů amid I, amid II a amid III v molekule
N-methylacetamidu, modelu peptidové skupiny v trans konformaci. Jejich frekvence
odrážejí strukturu polypeptidového řetězce (NH2-CαHR1-CO-NH-CαHR2-CO-) nezávisle
na typu postranního řetězce (R1, R2, …).
24
Vibrační spektroskopie a struktura proteinů
Distribuce sekundárních struktur v referenčním souboru 19 proteinů
(v % zastoupení jednotlivých konformací).
Kabsch a Sander
sekundární struktura
helix
β-struktura
obrátka
ohyb
ostatní
minimum
0
0
6,9
1,9
11,1
maximum
77,1
47,7
20,9
20,5
33,0
střední hodnota
26,7
23,1
12,8
13,7
23,7
směrodatná odchylka
20,4
14,5
3,8
4,8
5,9
FT- IČ spektra
diferenční FT- IČ spektra
0.3
VCD spektra
0.2
0.8
5
ΔA x10
0.4
5
0.1
0.6
ΔA
absorbance
1.0
0.0
-0.1
0.2
-5
-0.2
0.0
0
-0.3
1700
1650
1600
1550
vlnočet (cm-1)
1500
1700
1650
1600
1550
vlnočet (cm-1)
1500
1700
1650
1600
1550
1500
vlnočet (cm-1)
Tvarová variabilita FT-IČ (vlevo), diferenčních FT-IČ (uprostřed) a VCD (vpravo) spekter
referenčního souboru 19 proteinů v H2O v oblasti amidu I a II. FT-IČ spektra jsou normalizována na Amax = 1 amidu I. Diferenční spektra byla získána odečtením průměrného FT-IČ
spektra referenčního souboru od jednotlivých spekter.
25
Stabilita proteinů (folding ↔ unfolding)
WT (přirozený)
mutant (Pro → Ala)
26
Vibrační spektroskopie a počítačové modelování proteinů
27
Vazba progesteronu s orosomukoidem
Vlevo: kyselý α1-glykoprotein (orosomukoid) v nativním stavu.
Vpravo: vazba progesteronu vede k transformaci α-helikálního segmentu ve smyčce nad
β-barelem na antiparalelní β-strukturu (označeno šipkou).
28
Side-Chain Conformations and Local Environments
Cysteine
S-H stretching vibration (2500 - 2600 cm-1)
Dependence of the Raman S-H frequency and bandwidth on hydrogen bonding
Raman spectrum (670-2800 cm-1) of the P22 trimeric tailspike protein at 10°C. The inset at upper
right, which shows an amplification of the spectral interval 2480-2620 cm-1, exhibits the composite
S-H stretching profile (bands at 2530, 2550, 2565 and 2585 cm-1) of the eight cysteine residues per
unit. The data are not corrected for solvent contribution. From Raso et al. J. Mol. Biol. 307 (2001) 899.
29
Side-Chain Conformations and Local Environments
Cysteine
Spectral contributions and hydrogen-bond
strengths of cysteine sulfhydryl groups of
the native P22 tailspike protein
S-H Raman signatures (2480-2630 cm-1)
of tailspike cysteine residues
A.
The Raman S-H profiles observed for the
wild-type tailspike and for each of eight
Cys → Ser mutants, as labeled.
B.
Raman difference spectra computed as
mutant minus wild-type, for each of the
eight Cys → Ser mutants. In each trace,
the S-H Raman signature of the mutated
Cys site is revealed as a negative band.
30
Vibrační optická aktivita - princip
pro molekulu (+)
ΔI = I R (+ ) − I L ( + )
pro molekulu (-)
−ΔI = I R (−) − I L(−)
20
L-Alanyl-L-Alanin
ROA
-5
I -I (x10 )
10
R L
0
-10
-20
D-Alanyl-D-Alanin
Raman
-8
40
R
I +I (x10 )
60
L
80
20
L-alanyl-L-alanin
(+)
D-alanyl-D-alanin
(-)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
-1
vlnočet (cm )
31
Vibrační optická aktivita (VOA)
¾ diferenční metoda – měříme rozdílnou odezvu chirální molekuly vůči pravo- a
levotočivě kruhově polarizovanému záření,
¾ spojuje stereochemickou citlivost konvenční optické aktivity s vyšším
rozlišením a tudíž i bohatším strukturním obsahem a konformační citlivostí
vibrační spektroskopie,
¾ v případě konformačně flexibilních molekul můžeme pomocí VOA rozlišit
konformace, jež jsou stabilní z hlediska časové škály vibračních pohybů (na
rozdíl od NMR, kde díky pomalejší časové škále (v porovnání s konformační
konverzí) může dojít k vyrušení strukturních rysů, je vibrační spektrum
váženým průměrem spekter jednotlivých konformerů).
¾
vibrační cirkulární dichroismus (VCD)
¾
Ramanova optická aktivita (ROA)
32
ROA – základní aplikace
¾ stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
33
ROA – určení absolutní konfigurace
Chirálně deuterovaný neopentan
vlnočet (cm-1)
(R)-[2H1, 2H2, 2H3]-neopentan
vlnočet (cm-1)
Ramanova a ROA spektra (R)-[2H1,2H2,2H3]-neopentanu. Dvě horní křivky ukazují změřená spektra. Spodní křivky
ukazují jednotlivá vypočítaná spektra devíti rotamerů R1 to R9 a zprůměrované spektrum směsi všech rotamerů.
Haesler et al., Nature 446, 526 (2007).
34
ROA – základní aplikace
¾ stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
¾ přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnosti
separace enantiomerů
35
Měření enantiomerní čistoty
ROA
f EE =
enantiomerní čistota
1.0
0.5
[%]
Lineární regrese
0.4
from ROA data
R = 0.99912
0.0
0.2
score Vi1
( IR-IL) x 10-6
c R − cS
c R + cS
-0.5
0.0
-0.2
-1.0
-0.4
-100
-50
0
50
100
enantiomeric excess (%)
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
-1
-1)]
wavenumber
[cm
vlnočet
(cm
Soubor ROA spekter 19 vzorků trans-pinanu
o různé enantionerní čistotě.
J. Hrudíková, Bakalářská práce (2007).
36
ROA – základní aplikace
¾ stanovení absolutní konfigurace bez krystalizace
¾ přímé měření enantiomerního přebytku bez nutnosti
separace enantiomerů
¾ určení konformace biologických molekul v roztoku
(proteinů, nukleových kyselin, cukrů, virů …)
37
Simulace Ramanových a ROA spekter
(1S)-(-)-α-pinene
exp
exp
ROA a Ramanova spektra (1S)-(-)-a-pinenu: (a) zjednodušený (tzv. polární) a
(b) konvenční model výpočtu ROA intenzit, (c) experimentální ROA spektrum,
(d) simulované a (e) experimentální Ramanovo spektrum.
38
Ramanova optická aktivita peptidů
PLP in TFE
ROA spektra poly-L-prolinu v TFE
PLP in H2O
I -I
R L
ROA spektra poly-L-prolinu ve vodě
hinge peptide in H2O
200
500
800
1100
1400
ROA spektra hinge peptidu,
paralelního dimeru oktapeptidu
Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro
ve vodě
1700
wavenumber (cm-1)
39
ROA proteinů
X-ray PDB:
69,2% α-helix
™ valenční vibrace skeletu
1,7% 310-helix
(νCα-C, νCα-Cβ, νCα-N)
~ 870 – 1150 cm-1
™ rozšířená oblast amidu III
(νCα-N, + δN-H a δCα-H)
~ 1230 – 1340 cm-1
™ oblast amidu I
(νC=O)
Amid III
Amid I
43,5% β-list
1,7% α-helix
1.3% 310-helix
~ 1630 – 1700 cm-1
28,7% α-helix
10,9% 310-helix
6,2% β-list
40
ROA proteinů – PCA (Principal Component Analysis)
disorder
order
α-helix
β-list
41
L-Alanine
¾ the simplest amino acid
¾ ideal benchmark system for studying:
ƒ conformational behavior
ƒ interaction with solvent
42
L-Alanine – potential energy surface
1D scan
B3LYP/6-31G**
B3LYP/6-311G**
B3LYP/6-31++G**
2D scan
B3P86/6-31G**
B3P86/6-311G**
B3P86/6-31++G**
3
E (kcal/mol)
B3LYP/COSMO/6-31++G**
ϕ, ψ
0
2
ϕ (NH3+)
ψ (COO-)
1
-30
0
60
90
120
150
180
60
90
χ (CH3)
E (kcal/mol)
150
180
45
90
χ (CH3)
8
ϕ, χ
ϕ (NH3+)
χ (CH3)
-30
6
4
-60
2
0
-90
-45
0
45
90
-90
-45
ψ (COO-)
0
ψ (COO-)
3
E (kcal/mol)
120
Dependencies of molecular energy (E, left)
and dihedral angles (right) on the angles ϕ, ψ,
and χ. The remaining coordinates in the onedimensional scans were allowed to fully relax.
ψ, χ
0
2
ψ (COO-)
χ (CH3)
-30
1
-60
0
0
30
60
ϕ (NH3+)
90
120
0
30
60
ϕ (NH3+)
90
120
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
43
Mode number:
3 4
5
6
7
8
9
10 11 12,13
I +I
L
105
60 115
0
R
R
L
(I - I ) × 10
4
0
400
1
Wavenumber
400
-60
Wavenumber
10
20
4
R
L
(I - I ) × 10
400
60
800
70
-15
60
70
-55
-30
25
-40
15
400
25
-25
60
-25
ψ (COO-)
-351600 45
COO-
25
85
10
65
25
-35
1200
R
I +I
4
15
1600
55 to 90
-90 to -30
60
1600
χ (CH3)
Wavenumber
175
128
0
L
30
30
1200
-60
15
800
L
70
0
60
35
20
25
Wavenumber
-15
0
NH3+
1600
85
-40 to -90
-75
-65
10
-5
1200
70
-55
-80
R
I +I
L
-35
80
105
55
800
0
40
15
25
25 60
1200
20
20
R
115
70
5
4
(I - I ) × 10
10 75
85
60
-1
4
20,21
22,23 24 25,26
55
95
20
800
0
-1
17 18,19
25
25
60
1
16
ϕ (NH3+)
4
0
14,15
1
400
68
153
800
65 to 85
Wavenumber
128
1200
135
113
1600
85
CH3
88
0
-1
98
138
400
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
800
113
140 180
105
1200
-1
Wavenumber (cm )
173
135
1600
44
L-Alanine
7
4
0
5
5
6
8
9
400
17
14
11 12,13
Wavenumber
15
1200
1600
D-Ala
17 18
14
4
8
16
9
-5
12,13
10
ROA
1600
Wavenumber
I +I
R
0
5
2,3
4
8
400
0
11 12,13
9
800
18
14
15 16
-5
14
Wavenumber 15
24 25,26
1600
23
17
16
12,13
800
19
20,21
18
10
400
17
1200
11
8
9
L-Ala
1200
7
4 5 6
22
20,21
80010
Calculation
19
L
3
R
23
0
400
(I - IL) × 104
20,21
24 25,26
15
11
800
Raman
22,23
-5
19
18
R
L
(I - I ) × 10
10
Experiment
22,23
2
L
(I + IR) × 10-9
¾ Raman and ROA spectra can be reliably interpreted if
the movement of flexible molecular parts is considered
1200
22
19
20,21
1600
-1
Kapitán et al., J. Phys. Chem. 110 (2006) 4689
Wavenumber (cm )
45
Model dipeptides
There is a significant difference between
Ala-Pro x Pro-Ala
Gly-Pro x Pro-Gly
ROA (Raman) can directly reflect flexibility of the molecule
46
Model dipeptides
rigidity
Gly-Pro
ψ
×ϕ
×
flexibility
Pro-Gly
ψ
ϕ
47
Hinge peptide and its analogs
HINGE peptide is a fragment 225-232/225’-232’ from the core of human immunoglobulin IgG1. It acts in this parent
molecule as a swivel point crosslinking two rather heavy peptide chains. Being a parallel dimer of the octapeptide
H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH (C2 symmetry). The sequence is rich in proline residues and is
expected to be quite rigid also due to a presence of two disulphide bridges. The peptide offers several advantages
for use as a universal carrier of various active sequences (immunologically neutral, possesses six independent
terminal groups: -NH and -OH on Thr residues and C-terminal carboxyl).
S-S bridged
single thread
hinge peptide
tetrapeptide
Met analog
(double thread)
(H-Gly-Cys-OH)2
T
T
T
S Model of an entire human IgG1 molecule.1
1Padlan
E.A, Mol. Immunol. 31 (1994) 169.
48
0
200
400
600
wavenumber (cm )
-1
4
800 1000 1200 1400 1600 1800
-2
200
400
-1
(H-Gly-Cys-OH)2
600
wavenumber (cm )
-1
1606
1459
1327
1622
1481
1351
1195
1453
1205
1255
1612
-1
1683
1415
poly(L-Pro)
1162
1003
1643
1481
1282
1320
1193
938
976
1352
1162
892
1
1208
946
978
-2
924
3
1328
1393
-1
1000
1
900
(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2
1456
1258
1612
1683
1415
924
834
95
1643
1480
1283
1320
1352
1162
1193
981
659
523
212
1454
893
937
IR-IL (x10-6)
1655
1205
1004
322
δ(CH2)
-1
1182
1230
1
523
2
922
-3
1037
-2
970
Amide I
668
2
535
0
403
Amide I
327
8
325
4
145
10
IR-IL (x10-6)
12
220
115
6
1655
H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OH
1452
14
Amide I
IR-IL (x10-6)
2
δ(CH2)
2
1
834
(H-Gly-Cys-OH)2
Amide III
IR-IL (x10-6)
1633
poly(L-Pro)
1453
1252
657 ν(C-S)
510 ν(S-S)
(H-Thr-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro-Ala-Pro-OH)2
1286
2
1685
0
δ(CH2)
IR+IL (x10-9)
6
667
1
501
IR+IL (x10-9)
4
ν(C-S)
6
510
IR+IL (x10-9)
0
16
ν(S-S)
IR+IL (x10-9)
8
0
0
H-Thr-Met-Pro-Pro-Met-Pro-Ala-Pro-OH
0
0
800 1000 1200 1400 1600 1800
49
Download

Vibrace BCM094.pdf