Sborník přednášek
Květen 2012
1
2
BEST servis Ústí nad Labem
Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha
Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno
Sborník přednášek
mezinárodní odborné konference
XXXII.
Moderní Elektrochemické Metody
Jetřichovice 21. – 25. května 2012
Uspořádali:
Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav
ISBN 978-80-905221-0-7 (Brož.)
1
Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací.
Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla
odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za
předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či
převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je
možný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí
pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní potřebu).
ISBN 978-80-905221-0-7(Brož.)
2
BEST servis Ústí nad Labem
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Prague
Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Brno
Collection of Conference Proceedings
International Conference
Modern Electrochemical Methods XXXII
Jetřichovice, Czech Republic
May 21st - May 25th, 2012
Editors:
Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav
ISBN 978-80-905221-0-7
3
4
Obsah
Str.
A. M. Ashafi, J. Đorđević, V. Guzsvány, T. Trtić-Petrović, K. Vytřas
Determination of Carbendazim Fungicide by Differential Pulse Stripping Adsorptive
Voltammetry at a Tricresyl Phosphate-Modified Carbon Paste Electrode in
Presence of 2-Hydroxypropyl Beta Cyclodextrin
10
M. Bartoš, I. Žertová
Determination of Formaldehyde Using Capillary Isotachophoresis
14
A. Danhel, H. Pivonkova, V. Raindlova, M. Hocek, M. Fojta
Nitro-Hydrazine Derivatives Electrochemically Reducible DNA Labels
19
H. Dejmkova, L. Houskova, J. Barek, J. Zima
Electrochemical Determination of Chlortoluron on Carbon Paste Electrode
23
D. Deýlová, J. Barek
Voltammetric Determination of 5-Nitrobenzimidazole at a Carbon Film Electrode
Deposited on a Silver Solid Amalgam Electrode
27
J. Fischer, G. Tsimogianni, V. Vyskočil, A. Economou, J. Barek
Voltammetric Determination of 3-Nitrobiphenyl on Meniscus Modified Silver Solid
Amalgam Electrode
32
M. Fojta, L. Havran, H. Pivoňková, P. Vidláková, P. Orság, M. Plucnara, P.
Horáková, V. Raindlová, J. Balintová, M. Hocek
Next Generation of Electrochemically Active Labels for DNA Analysis. How to
Utilize Electrochemical Conversions for the Improvement of Signal Resolution
35
M. Gál, R. Sokolová, F. Kielar
Electrochemistry of Potential Eu MRI Complexes
38
L. Havran, V. Tichý, J. Špaček, H. Macíčková-Cahová, P. Horáková, H. Pivoňková,
M. Fojta, M. Hocek
Electrochemical Analysis of Terminal Deoxynucleotidyl Tranferase Reaction
Products
42
J. Hrbáč, L. Trnková
The Implementation of Elimination Voltammetric Procedure into Electrochemical
Analyzers
45
M. Jakl, R. Norková, T. Navrátil, J. Jaklová Dytrtová, J. Balík
Investigation of Complexes of Tebuconazole with Zinc
50
J. Jaklová Dytrtová, M. Jakl, R. Norková, T. Navrátil
Optimization of a Flow Rate for a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray
Ionization Mass Spectrometry
54
A. Liška, J. Ludvík
Electrochemistry of Polynitrocalix-[4]-arenes
58
K. Lušpai, P. Rapta, V. Brezová, A. Staško
Redox Behavior of New Quinolone Derivatives Studied by in situ ESR-UV-VIS
Spectroelectrochemistry
63
J. Matějčková, M. Jaček, J. Málek, E. Samcová
Determination of Midazolam by HPLC with UV Detection and by GC with NitrogenPhosphorus Detector in Rabbit Plasma
68
5
R. Metelka, P. Vlasáková
Screen-Printed Carbon Electrodes with Porous Copper Film
73
T. Mikysek, M. Stočes, I. Švancara, K. Vytřas, J. Ludvík
New Characterisation Approaches for Carbon Ionic Liquid Electrodes (CILES)
77
T. Navrátil, I. Švancara, K. Mrázová, K. Nováková, J. Chýlková, D. Pelclová
Assessment of Potential Risk Connected with the Use of Mercury and Mercury
Electrodes
82
K. Nováková, T. Navrátil, J. Jaklová Dytrtová, J. Chýlková
Use of Copper Solid Amalgam Electrode for Determination of Triazolic Fungicide
Tebuconazole
87
L. Novotný, L. Dušek, B. Vystrčilová, R. Petráňková
Possible Application and Monitoring of Electrochemical Treatment of Waters Using
Special Electrodes and Techniques
91
V. Novotný
Direct Voltammetric Determination of Aclonifen in Natural Waters at a Silver Solid
Amalgam Electrode
94
P. Orság, M. Fojta, L. Havran, Z. Vychodilová, M. Plucnara, T. Komárek, J. Riedl,
M. Hocek, H. Pivoňková
Chemically Modified DNA for DNA-Protein Interaction Studies: Electroactive and
Luminescent Labeling Versus Specific Molecular Recognition
98
M. Parisová, T. Navrátil, I. Šestáková, V. Mareček
Transport of Copper Ions in the Presence and Absence of Ionophore Calcimycin
and the Influence of LMWOAs on this Transport
102
V. Pavlíček, K. Málková, E. Samcová, P. Tůma
Fast Determination of Uric Acid in Human Serum and Urine by Capillary
Electrophoresis
107
I. Pilařová, L. Trnková
Diffusion Characteristics of Chlorine and Methoxy Derivatives of 6–
benzylaminopurine Studied by Voltammetric Methods
112
H. Pivoňková, K. Němcová, P. Šebest, L. Havran, P. Orság, M. Fojta
Oligonucleotide Probes End-Labeled with Oxoosmium Complexes for
Electrochemical Analysis of Sequence and Structure-Specific Interactions of p53
Protein with DNA
117
B. Silver, K. Holub, V. Marecek
Ion Current Rectification Behavior at Novel Borosilicate Glass Capillaries
120
M. Stočes, I. Švancara
Carbon Paste Electrode Modified with Bismuth Trifluoride and its Applicability in
Electrochemical Stripping Analysis for Determination Heavy Metals
125
L. Šimková, E. Dmitrieva., J. Klíma, L. Dunsch, J. Ludvík
FOX-7 – Study of Reduction Products by Spectroelectrochemical Methods
130
I. Švancara, K. Kalcher, A. Walcarius, K. Vytřas
Electroanalysis in a Monothematic Book.
Recent Experiences from Making of a Monograph
134
6
Ľ. Švorc, J. Svítková, P. Tomčík, M. Rievaj, D. Bustin
Voltammetric Determination of Caffeine in Commercial Beverages on Bare BoronDoped Diamond Electrode
138
P. Tůma, F. Opekar, E. Samcová
The Use of a Multi-Channel Capillary and a Capillary with Two Different Inner
Diameters for Electrophoretic Separation of Neurotransmitters
143
P. Vidláková, J. Balintová, R. Pohl, L. Havran, M. Hocek, M. Fojta
Voltammetric Analysis of Anthraquinone- and Nitrophenyl-Labeled Nucleotide
Triphosphates and Oligonucleotides
148
B. Vochyánová, F. Opekar, P. Tůma, K. Štulík
Rapid Determination of Saccharides in High Energy Drinks by Electrophoresis in a
Short Capillary
151
B. Yosypchuk, V. Mareček, O. Yosypchuk
(Strept)avidin–Biotin Interactions at Amalgam Electrodes Covered by Thiol
Monolayer
155
J. Zavázalová, H. Dejmková, J. Barek, K. Pecková
Voltammetric Determination of Amino Derivatives of Naphthalenes Using BoronDoped Diamond Film Electrode
159
7
8
Stejně jako v minulých více než třech desetiletích i letos se scházíme, abychom podiskutovali,
vzájemně se poinformovali o nejnovějších výdobytcích spojených s moderními
elektrochemickými metodami. Až na několik málo výjimek se tato setkání konala v jarních
měsících a v posledních letech se ustálil termín jejich uspořádání v posledních květnových
týdnech. Můžeme si proto jen se zpožděním připomenout 90. výročí naměření první
polarografické křivky (14. února) – tuto bezesporu klíčovou událost jsme si ovšem již
připomněli v patřičný den a ještě si ji letos určitě několikrát připomeneme. Při současném
nahlédnutí do kalendáře a do seznamu účastníků zjistíme, že již téměř tradičně můžeme
v průběhu „Jetřichovic“ popřát ke jmeninám všem Janám, které bývají většinou hojně
zastoupeny a ani letošek není výjimkou, zatímco Emil tentokrát mezi námi chybí. Co
v kalendáři na první pohled nenajdeme, je jubileum připadající na 29. května, které tak bohužel, musíme si přiznat - zůstává mírně ve stínu. A je nám ctí a potěšením, že tuto situaci
můžeme napravit. Je spojeno s člověkem velice skromným, tichým, dalo by se říci až
nenápadným. Toto polední slovo ovšem nemůže být nijak spojováno s jeho prací, s jeho
publikacemi a především jeho celkovým významem. Patří k pravidelným „kmenovým“
účastníkům, bez nichž bychom si nedovedli „Jetřichovice“, ale ani jiné akce vůbec představit.
Je to osoba, která nikdy neodmítne podat pomocnou ruku, s entuziasmem a nadšením pomáhá
korigovat a vylepšovat publikační výstupy svých spolupracovníků blízkých i vzdálených, je
jim vždy po ruce s radou, informací. Trpíme vždy výčitkami svědomí, když jej žádáme o
překlady našich textů z naší „angličtiny“ do angličtiny. Je třeba přiznat, že jej obdivujeme za
citlivý přístup, kterým nám vysvětluje kde a jakých chyb (jazykových i odborných) jsme se
dopustili. Jeho informační databáze se zdá nevyčerpatelná. Jeho nadšení pro vědu i vitalitu je
třeba obdivovat. Proto všichni si přejeme, abychom měli možnost ještě po mnoho
„Jetřichovic“ uvítat mezi námi pana doktora Michaela Heyrovského, jemuž touto cestou
přejeme vše nejlepší, hodně zdraví, štěstí, pracovní i osobní spokojenosti k jeho
80. narozeninám.
„Jetřichovičtí“ přátelé
9
Determination of Carbendazim Fungicide by Differential Pulse Stripping Adsorptive
Voltammetry at a Tricresyl Phosphate-Modified Carbon Paste Electrode in Presence of
2-Hydroxypropyl Beta Cyclodextrin
(Stanovení fungicidu Carbendazimu diferenční pulzní rozpouštěcí adsorptivní
voltametrií na uhlíkové pastové elektrodě modifikované trikresylfosfátem v přítomnosti
2-hydroxypropyl beta cyclodextrinu)
a
Amir M. Ashafi , Jelena Đorđević c, Valéria Guzsvány b , Tatjana Trtić-Petrović c, and Karel
Vytřas a
a
University of Pardubice, Department of Analytical Chemistry, 532 10 Pardubice, Czech
Republic
b
Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Novi Sad,
Trg D. Obradovića 3, 21000 Novi Sad, Serbia
c
Laboratory of Physics, Vinča Institute of Nuclear Sciences, P. O. Box 522,
110 01 Belgrade, Serbia
Abstract
In this study, carbon paste electrode based on tricresyl phosphate (TCP-CPE) as a binding
liquid has been applied as working electrode for the voltammetric characterization and
determination of the Carbendazim. Effects of both the pH value of the supporting electrolyte
and the presence of cyclodextrin on the electrochemical behaviour of Carbendazim were
investigated. The developed method offered a good linearity in the concentration range of
5·10-7 – 1·10-5 M with the limit of detection of 3·10-7 mol dm-3. Satisfactory recovery was
achieved with spiked water, inferring that the established method can be applied to real
sample analysis.
Key Words: Carbendazim, Carbon paste electrode, Adsorptive stripping voltammetry.
Introduction
Carbendazim (methyl 1H-benzo [d] imidazol-2-ylcarbanate), a toxic class IV pesticide, is a
benzamidazole fungicide that plays an important role in plant disease control. It is used to
prevent and cure of disease on corp. The compound is chemically stable and can be filtered in
the crop through laminas and seeds. The rudimental determination was very important
because of its water resistance, long residual period and toxicity. Therefore, the development
of rapid, simple, sensitive and selective methodologies for Carbendazim analysis is still
required 1.
Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides which are toroidal in shape with a
hydrophobic inner cavity and a hydrophilic outer side 2-4. CDs are able to bind selectively
various organic, inorganic and biological guest molecules into their cavities to form stable
host–guest inclusion complexes, providing good opportunities for applications in the fields of
sensors, electrocatalysis, luminescence and electronics, etc. 5.
This paper deals with the differential pulse adsorptive stripping voltammetric (DPASV)
method development of Carbendazim determination using a tricresyl phosphate-based carbon
paste electrode (TCP–CPE) in presence of 2-hydroxypropyl beta cyclodextrin as a
complexing agent and its application in a spiked water sample.
Experimental
Reagents and Apparatus
Carbendazim (95% purity) was obtained from Fitofarmacija a.d. (Zemun, Serbia). The
Carbendazim stock solution was (0.01 M), prepared by dissolving this fungicide in N, N-
10
dimethylformamide (Sigma-Aldrich) and kept in dark at -4 oC. The pH values of the
Carbendazim solutions were adjusted using Britton–Robinson (BR) buffer solutions ranging
from pH 2 to pH 11. NaBr, K2SO4, NaCl, NaI, NaNO3, 2-hydroxypropyl beta cyclodextrin
(Sigma-Aldrich) were of analytical grade and used without further purification.
Voltammetric experiments were performed on an Autolab (Metrohm Autolab, Utrecht, The
Netherlands) electrochemical analyzer operated via GPES 4.9 software (Metrohm Autolab,
Utrecht, The Netherlands). The conventional three-electrode configuration with a carbon
paste electrode was employed throughout the work .The Ag/AgCl saturated electrode and a Pt
plate served as the reference and auxiliary electrodes.
Preparation of working electrode TCP-CPE
Three different carbon pastes were made by intimate hand-mixing of CR 5 graphite powder
(Lučební závody Kolín, Czech Republic) with tricresyl phosphate (TCP), paraffin oil, or
highly viscous silicone oil as liquid binders as described elsewhere 6.
The model system was carried out in 10.00 mL of Britton–Robinson buffer solution and the
optimum concentration of cyclodextrin was added. Then, a desired amount of Carbendazim
solution was injected. The solution was deaerated by passing an argon stream for 2-3 min.
Deposition potential was applied during accumulation time while the solution was stirred and
after an equilibrium period, the voltammogram was recorded. Before addition of
Carbendazim, the voltammogram of the blank solution was recorded under the same
conditions.
Results and Discussion
Effect of the various binders
Different binders like paraffin, silicon, and tricresyl phosphate were used as pasting liquid,
the resulted CPEs were inserted in the solution containing 0.01 M Carbendazim, and cyclic
voltammograms were recorded. As can be seen in (Figure 1), there is one redox couple which
can be used for determination of Carbendazim. Obviously, the peaks are higher and well
shaped for determination purpose in the case of TCP-CPE. Considering the shape and
highness, the oxidation peak has been chosen for quantitative determination of the compound.
Influence of the pH on the oxidation peak
DPAS voltammograms of Carbendazim were recorded in the pH range from 2.0 to 11.0 using
Briton-Robinson buffers to study the influence of the pH on the shape and highness of
3·10-6 M its oxidation peak. To investigate effect of the buffer, some measurements were also
carried out in the pH 4 acetic buffer. The results indicated that the best peaks shape and the
maximum peaks current occurred in the pH 4.0 Briton-Robinson buffer.
Effect of the potential and time and cyclodextrin
The oxidation peak was found to be influenced by applied potential and time. With shifting
the potential to more negative potentials, the peak current also increased until -0.35 V and
then leveled off which could be caused by saturation of the electrode surface. The peak
current highness increased with increasing deposition time to 180 s, and further time
prolongation (till 300 s) did not bring any positive effect on the peak current. Thus, time of
120 s was selected as an optimum. As shown (Figure 2), increasing the CD concentration the
peak current increased evidently to 3.6·10-5 M CD; further increase of CD did not have any
special effect on the peak current.
11
Fig.1. Cyclic voltammograms of Carbendazim (5.2·10-4 M) in Briton–Robinson pH 8 buffer
on a CPE electrode with (a) TCP, (b) paraffin or (c) silicon oil. Scan rate, 100 mV s-1. Inset:
voltammograms of 5.2·10-4 and blank in the same buffer with scan rate 50 mV s-1
at TCP-CPE.
8
7.5
18
7
16
a
14
I(µA)
12
6.5
I(µA) 10
8
6
4
6
2
0
0.5
1
1.5
E(V)
5.5
0
10
20
30
40
c CD µM
50
60
70
Fig.2. Influence of cyclodextrin addition on the peak height 1·10-5 M Carbendazim.
Inset: (a) Carbendazim alone; (b) the same with 3.6·10-5 M cyclodextrine . Measured in pH 4
Britton-Robinson buffer; Eacc = -0.35V; tacc=120 s; equilibrium time 5 s; amplitude potential
25 mV and step potential 4 mV.
Calibration
Under optimized conditions, DPAS voltammograms were recorded for increasing
Carbendazim concentration in the range of 5·10-7 to 1·10-5 M and corresponding calibration
plot was constructed (Figure 3). The dependency is linear and can be described by the
equation I[µA] = 0.541 ccarbendazim + 0.530; with R2 = 0.995; detection limit (evaluated as 3σ)
3.0·10-7 M; and RSD = 4.9% (for 2·10-6 M and 8 different measurement).
12
Conclusion
The TCP-CPE electrode was found to be efficient for the adsorptive stripping voltammetric
determination of Carbendazim in presence of cyclodextrin. High sensitivity, good
reproducibility, simple instrumentation, and rapidity of the procedure may additionally be
appreciated. No interferences were observed when some various ions as well as one other
similar organic compound (Linuron herbicide) were added to 1·10-3 M Carbendazim solution.
The accuracy of the method was verified applying the method for the determination of
Carbendazim in spiked water sample. Corresponding standard addition plot showed good
linearity with R2 = 0.994; recovery rate was calculated to be 101.9 %.
25
y = 0.5414x + 0.5295
R² = 0.995
7
6
23
5
4
I(µA)
3
21
2
1
0
0
19
2
4
6
8
c CBZ (µM)
10
12
17
I(µA)
15
13
11
9
0.5
0.6
0.7
0.8
E(V)
0.9
1
1.1
Fig. 3. Construction of the calibration plot for determination of carbendazim in the
concentration range of 5·10-7 - 1·10-5 ppb. Measured in pH 4 Briton-Robinson buffer in the
presence of 3.6·10-5 M cyclodextrin; Eacc -0.35 V, tacc120 s, teq, 5 s; other parameters as given
under Fig. 2.
References
1. The European Union On-Line, Official Documents, European Communities, 2000,
http://europa.eu.int.
2. Rekharsky M., Inoue Y., Chem. Rev, 98, 1875 (1998).
3. Wang F., Khaledi M.G., Anal. Chem. 68, 3460 (1996).
4. Freeman R., Finder T., Bahshi L., Willner I., Nano Lett. 9, 2073 (2009).
5. Guo Y., Guo S., Ren J., Zhai Y., Dong S., Wang E., ACS Nano, 4, 4001 (2010).
6. Švancara I., Vytřas K., Metelka R., Czech. Patent CZ 301714 (appl. 2 Dec 2002, adm. 22
Apr 2010).
13
Determination of Formaldehyde Using Capillary Isotachophoresis
(Stanovení formaldehydu kapilární izotachoforézou)
Martin Bartoš and Iva Žertová
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of
Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
In this article, formaldehyde is determined in commercially marketed gargle. Determination is
based on the reaction of formaldehyde with ammonia, when urotropine (hexamine) is formed.
Optimum conditions are: sample + 0.02 mol L-1 NH4Cl, pH 10 (adjusted by KOH solution),
analysis day after using capillary isotachophoresis. The optimal isotachophoretic electrolyte
system comprised 0.01 mol L-1 KOH + 0.02 mol L-1 acetic acid + 0.1% hydroxyethylcellulose
(pH 4.75) as the leading electrolyte and 0.01 mol L-1 acetic acid as the terminator. The
calibration / detection characteristics are as follows: linearity over the concentration range of
90–600 mg L-1 formaldehyde, limit of detection ca. 30 mg L-1, limit of quantification of ca.
90 mg L-1 formaldehyde. The procedure is suitable for samples containing higher amount of
formaldehyde, and after proof, it is possible to use it for analysis of samples where other
methods fail or a separation from interferences is necessary.
Key Words: Capillary isotachophoresis, Formaldehyde, Determination.
Úvod
Formaldehyd je považován za látku ohrožující lidské zdraví a to především pro jeho výskyt v
ovzduší, ve kterém je jeho obsah nejčastěji sledován. Ke stanovení formaldehydu byla
vypracována celá řada metod, využívajících značnou část analytických technik. K nejčastěji
používaným technikám patří spektrofotometrie, fluorimetrie a plynová i kapalinová
chromatografie 1-3.
Obvykle je formaldehyd z ovzduší zachycován do absorpčního roztoku nebo na vhodný
sorbent 1-3. V těchto případech má vzorek resp. roztoky před analýzou jednoduchou nebo
účelově nastavenou matrici, která pokud možno neruší nebo dokonce napomáhá při
následném stanovení formaldehydu. V některých vzorcích jsou ale přítomny látky, které tvoří
s formaldehydem více či méně stálé sloučeniny mající charakter aduktů, které mohou výrazně
zkomplikovat stanovení. Takovou směsí je i tzv. Kutvirtovo kloktadlo, používané ke zmírnění
bolesti v krku při nachlazení, které obsahuje kromě formaldehydu ještě mentol, třísloviny
(polyfenoly), etanol a vodu. Obsah formaldehydu v tomto kloktadle se nepodařilo stanovit ani
jodometrickou titrací, ani plynovou chromatografií (bez derivatizace).
Formaldehyd je sice elektroneutrální v celém rozsahu pH použitelném při izotachoforetických
analýzách, vhodnou derivatizací je ale možné jej převést na formu nesoucí elektrický náboj,
čehož bylo využito při jeho elektroforetickém stanovení. Jako derivatizační činidlo byl použit
například siřičitan, hydrazinobenzensulfonová kyselina, dinitrofenylhydrazin, dansylhydrazin,
atd.1
Jednou z dalších možností je reakce s amoniakem, při které vzniká z formaldehydu urotropin
(CH2)6N4. Ten se ve slabě kyselém prostředí protonizuje (v silně kyselém prostředí se
rozkládá 4) a protonizovaný urotropin lze izotachoforeticky stanovit 5. V této práci je popsáno
stanovení formaldehydu po jeho převedení na urotropin.
14
Experimentální část
Chemikálie a roztoky. Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. Hydroxyethylceluloza
pocházela z firmy Serva (Heidelberg, Německo). Všechny ostatní chemikálie byly z Lachemy
(Brno, ČR).
Modelové vzorky formaldehydu, použité k optimalizaci parametrů analýzy, měření
kalibračních řad a dalších parametrů analýzy, byly připravovány ředěním zásobních roztoků
formaldehydu a chloridu amonného o koncentracích 0,5 mol L-1. Zásobní roztok urotropinu o
koncentraci 0,01 mol L-1, sloužící k porovnávání účinnosti konverze formaldehydu na
urotropin, byl připravován denně čerstvý - stáním dochází k jeho pomalému rozkladu 5.
Izotachoforetická analýza probíhala na jednokolonovém přístroji Agrofor (JZD Odra,
Krmelín, ČR), vybaveném dávkovacím kohoutem s fixním objemem a vodivostním
detektorem. Signál detektoru a absolutní hodnota jeho derivace byly zaznamenávány na
dvouliniovém zapisovači TZ 4620 (Laboratorní přístroje Praha, ČR).
Urotropin, vzniklý reakcí formaldehydu s amoniakem, byl stanovován za následujících
podmínek: vedoucí elektrolyt obsahoval 0,01 mol L-1 hydroxid draselný, 0,02 mol L-1
kyselinu octovou a 0,1 % hydroxyethylcelulozu, jeho pH bylo 4,75 (vedoucím iontem byl
K+); koncovým elektrolytem byla kyselina octová o koncentraci 0,01 mol L-1 (koncovým
iontem byl H+). Separační proud byl 60 μA.
Příprava zkušebních a kalibračních roztoků (není-li řečeno jinak). V kádince bylo smícháno
přibližně 40 ml demineralizované vody, 2 ml 0,5 mol L-1 chloridu amonného a vhodný objem
0,5 mol L-1 formaldehydu. Postupnými malými přídavky roztoku hydroxidu draselného o
koncentraci 1 mol L-1 bylo nastaveno pH na hodnotu 10. Roztok byl převeden do 50 ml
odměrné baňky, doplněn na jmenovitý objem, promíchán a ponechán ve tmě do druhého dne.
Před analýzou byl vhodně zředěn demineralizovanou vodou.
Vzorek. Formaldehyd byl stanovován v Kutvirtově kloktadle, připravovaném a dostupném v
lékárnách, jehož složení je podle údajů na etiketě: Levomentholum 20,0 g, Ratanhiae tinctura
50,0 g, Formaldehyd solutio 35% 100,0 g, Ethanolum 96% (V/V) 525,0 g, Aqua purificata
305,0 g. Levomentholum je jedním z izomerů mentolu (2-isopropyl-5-methylcyklohexanolu),
Ratannae tinctura je alkoholový extrakt z kořene kramerie trojmužné, obsahující především
třísloviny (tj. polyfenoly) v množství minimálně 1 %.
Příprava vzorku k analýze. V kádince bylo smícháno přibližně 40 ml demineralizované vody,
2 ml 0,5 mol L-1 chloridu amonného a 0,5 ml vzorku kloktadla, přídavky 1 mol L-1 hydroxidu
draselného bylo nastaveno pH na hodnotu 10. Roztok byl převeden do 50 ml odměrné baňky,
doplněn na jmenovitý objem, promíchán a ponechán ve tmě do druhého dne. Před analýzou
byl zředěn v poměru 1 : 4 demineralizovanou vodou.
Výsledky a diskuse
Formaldehyd pravděpodobně nereaguje s amonnými ionty, ale pouze s amoniakem.
6 CH2O
+ 4 NH3
+ 6 H2O
15
Reakce probíhá až po dosažení pH vyššího než 5, maxima dosahuje při pH 9 až 10,
pKA(NH4+) = 9,25. Při pH vyšším než 10 účinnost tvorby urotropinu mírně klesá
pravděpodobně v důsledku disociace formaldehydu, pKA(CH2O) = 13,3 6 (Obr. 1).
Nejvhodnějším způsobem alkalizace reakční směsi je nastavování pH na hodnotu 10 přídavky
roztoku KOH. Méně vhodné je přidávání konstantního dostatečně velkého objemu roztoku
KOH bez ohledu na výsledné pH. Náhrada chloridu amonného roztokem amoniaku se
neosvědčila.
Obr. 1. Závislost relativní délky zóny urotropinu (vzniklého reakcí amoniaku s
formaldehydem) na pH reakční směsi. A - nastavená hodnota pH, B - pH roztoku po cca 20
hodinách. Délka zóny je vztažena k délce zóny 0,5 mM urotropinu. Podmínky: 0,02 M NH4Cl
+ 0,09 M CH2O (trojnásobný nadbytek), pH nastaveno přídavky 1 M KOH, analyzováno
druhý den po přípravě, před analýzou 10x zředěno.
Rychlost reakce formaldehydu s urotropinem roste s teplotou a s koncentrací reagujících
složek. Přesto je poměrně nízká, a pokud je to možné, je vhodné ponechat roztok reagovat
minimálně do druhého dne.
Kvantitativního průběhu reakce nelze dosáhnout ani zahříváním, ani vhodným nastavením
pH, nadbytkem amonných iontů nebo delším stáním roztoku. Urotropinu vzniká při pH 10 po
přibližně 20 hodinách asi 60 až 70 % teoretického množství. Závislost délky zóny urotropinu
na koncentraci formaldehydu při konstantní koncentraci amonných iontů lze považovat za
lineární do asi 60 % teoretického množství formaldehydu k amoniaku (Obr. 2).
Koncentrace amonného iontu v reakční směsi byla především s ohledem na dobu trvání
měření zvolena 20 mmol L-1 (což odpovídá 5 mmol L-1 urotropinu, resp. 30 mmol L-1
formaldehydu). Vzhledem k rozsahu lineární části kalibrace by koncentrace formaldehydu v
reakční směsi neměla překročit cca 20 mmol L-1 (600 mg L-1).
Kalibrační závislost neprochází nulou, což je pravděpodobně další důsledek relativně pomalé
reakce formaldehydu s amoniakem. Úsek na ose x lze zkrátit prodloužením reakční doby
(Obr. 3).
Relativní odchylka 5x opakovaného měření standardního roztoku o koncentraci 12 mmol L-1
formaldehydu byla 0,5 %. Citlivost stanovení (směrnice kalibračního grafu) neředěného
16
roztoku je přibližně 10 mm na mmol L-1 formaldehydu. Detekční limit 1 mmol L-1 a limit
stanovení 3 mmol L-1 jsou vzhledem k nelinearitě počátku kalibrace jen hrubými odhady.
Obr. 2. Závislost délky zóny urotropinu na koncentraci formaldehydu. A - teoreticky
dosažitelná hodnota, B - naměřené hodnoty. Podmínky: 20 mM NH4Cl + 6 až 45 mM CH2O,
pH 10, analyzováno další den, před analýzou 5x zředěno.
Obr. 3. Délka zóny urotropinu při nízkých koncentracích formaldehydu. A - analyzováno
druhý den, B - analyzováno po třech dnech. Podmínky: 0,02 M NH4Cl + 0,6 až 6 mM CH2O,
pH 10, dávkováno bez ředění.
Analýza reálného vzorku. Obsah formaldehydu v Kutvirtově kloktadle byl stanoven metodou
kalibrační křivky a standardního přídavku. Průměrná hodnota, zjištěná pomocí kalibrační
křivky, byla 1,25 mol L-1 formaldehydu, tj. 4,1 %, hodnota zjištěná metodou standardního
přídavku byla 1,18 mol L-1, tj. 3,9 %. Jmenovitý obsah formaldehydu v Kutvirtově kloktadle
je podle údajů na etiketě 3,5 %. (Hustota kloktadla, potřebná pro výpočet hmotnostních
procent, byla zjištěna pyknometricky.)
17
Závěr
Uvedené stanovení formaldehydu je příkladem použitelnosti izotachoforézy i pro stanovení
látek, které nemají iontovou povahu, které ale lze více či méně úspěšně převést (derivatizovat)
na jinou, izotachoforeticky stanovitelnou formu.
Popsaný postup sice není použitelný pro stanovení stopových obsahů formaldehydu, lze jej
ale po odzkoušení použít i pro matrice, ve kterých jiné postupy selhávají nebo vyžadují
oddělení rušivých složek vzorku.
Obdobným postupem lze izotachoforeticky stanovit i amonné ionty a amoniak, pro které ale
existuje řada jiných (i izotachoforetických) metod, které mají po všech stránkách výhodnější
parametry.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou studentského grantu Univerzity Pardubice SGFChT06/2012.
Literatura
1. Motyka K., Mikuška P.: Chem. listy 99, 13 (2005).
2. NIOSH Manual of Analytical Methods, http://www.cdc.gov/niosh/docs/2003-154/,
staženo 31.3.2012.
3. Ferus M., Cihelka J., Civiš S.: Chem. listy 102, 417 (2008).
4. Tada H.: J. Am. Chem. Soc. 82, 255 (1960).
5. Martinková Z., Bartoš M., Mikysek T., Švancara I.: Sensing in Electroanalysis 6, 369
(2011).
6. http://en.wikipedia.org/wiki/Formaldehyde, staženo 31.3.2012.
18
Nitro-Hydrazine Derivatives - Electrochemically Reducible DNA Labels
(Deriváty nitrovaných hydrazínů - elektrochemicky redukovatelné DNA značky)
Ales Danhel a, Hana Pivonkova a, Veronika Raindlova b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i.,
Kralovopolska 135,612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
Electrochemical properties of recently designed DNA-labels: 2,4-dinitrophenylhydrazine
(DNFH) and 4-(1-methylhydrazino)-7-nitrobenzofurazan (NBF) were studied at mercury
meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) using cyclic voltammetry,
adsorptive stripping voltammetry (AdSV) and transfer stripping voltammetry (TSV) in this
work. These electrochemically reducible DNA labels offer cathodic and also anodic signals at
more positive potentials than DNA itself. They are sufficiently adsorbed at m-AgSAE using
AdSV. Sensitivity may be increased about 10x for DNFH and 1.5x for NBF. The labels are
just weakly adsorbed at m-AgSAE using open circuit adsorption, what may be applied for
sufficient separation of the large biomolecules (nucleotides, nucleic acids) from their
mixtures. These DNA labels were found to be convenient for modification of the nucleotides
via specific linker. Such labeled nucleotides may be further enzymatically incorporated to
oligonucleotides or DNA using modern biochemical methods.
Key Words: Voltammetry, Silver solid amalgam, DNA-labels, nitro- and benzofurazanderivatives.
Introduction
Modern electrochemical methods represent simple and fast tool in analysis of biological
molecules, e.g. nucleic acids and their constituents 1, proteins 2, enzymes 3, 4,
polysaccharides 5. Electrochemical activity of the nucleic acids may be applied in the
completion of genome sequencing and subsequently utilized for identification of the
relationship between the individual genome characteristics, cellular functions and disease, and
in development of widely accessible and decentralized diagnostic methods. For these
purposes, mercury electrodes have been used since E. Palecek discovered electrochemical
activity of the DNA in 1950’s 6. Since 1990’s, when mercury use has started to be regulated,
due to its toxicity risks and mechanical instability, a lot of novel electrode materials have been
presented 7. Silver solid amalgam electrodes (AgASE) were found to be suitable non-toxic
alternatives to hanging mercury drop electrodes (HMDE) with good mechanical stability and
with high hydrogen overpotential comparable with that obtained at HMDE in aqueous media,
even if the AgSAE exhibits lower sensitivity. Application of DNA labeling significantly
increases sensitivity and selectivity of utilized sensors and it also influences diverse responses
of the observed bio-molecules. DNA labeling in combination with AgSAE may be used for
development of novel, and sufficiently sensitive and robust sensors, and detectors for
bioassays in toxicological, biological, and medicinal applications 8-10.
Voltammetric behaviour of selected DNA labels, coming from a group of nitro-hydrazine
derivatives (Fig. 1), was observed before their incorporation to nucleotides and/or nucleic
acids. Parameters of adsorptive stripping voltammetry (AdSV), usability of a transfer
stripping voltammetry (TSV), and parameters, such as potential window and scan rate of the
cyclic voltammetry (CV), were observed and optimized for detection and specific control of
appearance and/or disappearance of the proper cathodic and anodic signals. This approach
19
may be used for signal control and may increase information diversity of the voltammetric
measurements in the biological and/or medicinal samples.
H2N
H2N
NH
NO2
N
CH3
N
O
N
b)
NO2
a) NO2
Fig. 1. Structure formulae of the observed DNA labels: a) 2,4-dinitrophenylhydrazine,
b) 4-(1-methylhydrazino)-7-nitrobenzofurazan.
Experimental
Methanolic stock solutions of studied compounds: 2-mM 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)
and 5-mM 4-(1-methylhydrazino)-7-nitrobenzofurazan (NBF) were obtained from Michal
Hocek’s collaborative research group coming from the Institute of Organic Chemistry and
Biochemistry 11. Supporting electrolyte, 0.3M ammonium formate/disodium hydrogen
phosphate buffer (AFP buffer) pH 6.95,was prepared from ACS grade chemicals purchased
from Sigma-Aldrich, Germany, using deionized water produced by Milli-Q plus system
(Millipore, USA), and utilized during all the experiments in this work. Oxygen was removed
from the measured solutions by 5 min of deaeration with Argon (99.998 %, Air Products,
Czech Republic).
Voltammetric measurements were carried out by an electrochemical workstation CHI440
(CH Instruments, USA) using a three electrode system consisted of platinum wire auxiliary
electrode, silver chloride reference electrode (Ag|AgCl|3M KCl, both Monokrystaly, Czech
Republic) and m-AgSAE working electrode in 1-ml glass vessel. A mercury meniscus was
prepared from a three times distillated polarographic mercury (99.999 %, Polarografie–Praha,
Czech Republic) on AgSAE polished before an amalgamation on wet filter paper everyday.
The CV, AdSV and TSV methods were used at scan rates with in 0.1 – 100 V s–1.
Results and discussion
According to results from cyclic voltammetry of studied DNFH and NBF, sample CVs see on
Fig. 2, their reduction mechanisms could be proposed. The DNFH and NBF are reduced in
first negative scan at m-AgSAE in two steps (two CV peaks) and in case of DNFH also
oxidized in first positive scan, see reaction schemes 1 for DNFH and 2 for NBF (Fig. 3).
Raising peaks of hydroxylamines corresponding to reduction of the DNFH (Ik1 and Ik2) are
consequently oxidized to nitroso-derivatives in the first positive scan (green color in scheme
1), these anodic signals around −180 mV and −20 mV are dependent on scan rate and
potential of negative turn. However cathodic peaks corresponding to reduction of nitrosogroups to hydroxylamines do not rise in second cycle; in case of negative turn behind the
second peak Ic2. If the turn is proceeded behind the first cathodic peak (Ic1), responses
quasireversible peaks Iqr and Ia1 appear around −20 mV. This quasi-reversible peak is
influenced by the scan rate and the electrode reaction is obviously driven by an adsorption
process of the analyte at m-AgSAE. This was confirmed by evaluation of the peak heights on
a scan rate, which was found to be linear. The NBF offer only its reduction peaks Ik1 and Ik2 at
potentials −400 mV and −1000 mV. No other oxidative peaks were observed in first positive
scan or in second cycle.
20
-500
BE
DNFH
NBF
Ic2
-400
I, nA
-300
Ic1
-200
Ic2
-100
Ic1
0
100
0.00
-0.20
-0.40
-0.60
-0.80
-1.00
-1.20
-1.40
E, V
Fig. 2. Cyclic voltammograms of: base electrolyte (BE), 40μM DNFH and 40μM NBF
at m-AgSAE in 0.3M AFP buffer pH 6.95, scan rate 100 mV s−1.
H2N
Ic1
NH
NO2
H2N
Ic2
NH
NHOH
+4H+, +4e-H2O
NH
NHOH
+4H+, +4e-H2O
NO2
NO2
H2N
NHOH
+
NHOH
+2H+, +2e-
-
-2H , -2e
NH
Iqr
H2N
H2N
Ia2
(1)
NO
-2H+, -2e-
NH
NO
Ia1
NO
H3C
N
Ic1
NH2
N
O
N
NO2
H3C
+4H+, +4e-H2O
N
Ic2
NH2
N
O
N
NHOH
H3C
N
NH2
+6H+, +6e-
NH2
-H2O
NH2
(2)
NHOH
Fig. 3. Proposed reduction/oxidation mechanism of the DNFH (1) and NBF (2) at m-AgSAE
in aqueous media (description see in text).
21
Affords to increase sensitivity of detection of selected DNA labels were done using adsorptive
stripping voltammetry. Sensitivity of the DNFH and NBF detection may be ten times and
about 50% increased using accumulation potential −0.1 V during 60s and 30s, respectively, at
scan rate 1.0 V s−1. This method may be used for detection of higher volumes of the DNA
labels, about 1 ml. On the other hand, TSV is more convenient method for analysis of small
volume samples, around 30 μl. However, this method is sufficient only for strongly adsorbed
analytes on the electrode surface using an open circuit adsorption. In this case, the DNFH and
NBF are just weakly adsorbed on the m-AgSAE, but the TSV may be used for analysis of
bigger molecules (e.g. labeled nucleotides or nucleic acids) strongly adsorbed on the
m-AgSAE in presence of the labels.
Conclusion
Thanks to the cathodic/anodic signals, corresponding to the reduction/oxidation of the studied
nitro-hydrazine derivatives DNFH and NBF, these compounds may be used for labeling of
nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, and/or nucleic acids, and further applied in
bioanalytical applications engaged in DNA hybridization, primer extension, polymerase chain
reaction (PCR), single nucleotide polymorphism (SNP) typing, DNA damage and/or DNA–
protein interaction.
Acknowledgment
Financial support from The Czech Science Foundation GACR (project P206/12/G151) and
GA ASCR (IAA400040901) is gratefully acknowledged.
References
1. Fojta M.: Electroanalysis 14, 1449 (2002).
2. Doneux T., Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 56, 9337 (2011).
3. Li H. H., Liu S. Q., Dai Z. H., Bao J. C., Yang X. D.: Sensors 9, 8547 (2009).
4. Bistolas N., Wollenberger U., Jung C., Scheller F. W.: Biosens. Bioelectron. 20, 2408
(2005).
5. Trefulka M., Palecek E.: Electroanalysis 22, 1837 (2010).
6. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011).
7. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
8. Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936
(2011).
9. Labuda J., Brett A. M. O., Evtugyn G., Fojta M., Mascini M., Ozsoz M., Palchetti I.,
Palecek E., Wang J.: Pure Appl. Chem. 82, 1161 (2010).
10. Fojta M., Jelen F., Havran L., Palecek E.: Curr. Anal. Chem. 4, 250 (2008).
11. Raindlova V., Pohl R., Sanda M., Hocek M.: Angew. Chem., Int. Ed. 49, 1064 (2010).
22
Electrochemical Determination of Chlortoluron on Carbon Paste Electrode
(Elektrochemické stanovení chlortoluronu na uhlíkové pastové elektrodě)
Hana Dejmkova a, Lucie Houskova a, Jiri Barek a, and Jiri Zima a
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Methods for the electrochemical determination of chlortoluron, phenylurea herbicide applied
against broadleaf weeds, were developed, using differential pulse voltammetry on carbon
paste electrodes of two diameters. Optimum determination medium was selected and the
possibility of determination in model samples of river water was confirmed. The
determination limits reached submicromolar concentration. The performance of both
electrodes was comparable; electrode of smaller dimensions was able to work in sample
volume of 0.25 mL.
Key Words: Chlortoluron, Pesticide, Differential pulse voltammetry, Carbon paste electrode.
Úvod
Chlortoluron (N,N-dimethyl-N-(3-chlortolyl)močovina) je kontaktní postřikový herbicid
používaný proti širokolistým a travním plevelům pěstování obilovin a máku 1. Je součástí
mnoha komerčně dostupných přípravků, například Dicuranu, Syncuranu, Tolurexu, Lentipuru,
a dalších. V některých aplikacích je pro zvýšení účinnosti chlortoluron kombinován s jinými
herbicidy, nejčastěji ze skupiny sulfonylmočovin. Jako mnoho jiných herbicidů s sebou i
chlortoluron nese zdravotní rizika; předpisy Evropské unie ho uvádí jako potenciální
karcinogen, kromě toho je to látka riziková pro životní prostředí, zejména z hlediska
znečištění vod 2.
Běžné způsoby stanovení chlortoluronu zahrnují zejména metody kapalinové
chromatografie 3-5 a imunoafinitní metody 6, 7, jež mohou obsah analytu určit s velkou
citlivostí a lze je použít i ve složitých matricích. Elektrochemické metody mohou, vzhledem
ke své miniaturizovatelnosti a portabilitě, rozšířit tuto škálu možností o rychlé orientační infield stanovení. Pro vývoj metody byla jako pracovní elektroda vybrána uhlíková pastová
elektroda; důvodem byla snadná obnovitelnost jejího povrchu, stejně jako její výhodné
elektrochemické vlastnosti 8, 9. V běžném uspořádání jsou ovšem uhlíkové pastové elektrody
pro polní stanovení zbytečně robustní a je proto vhodnější zvolit některou
z miniaturizovaných konstrukcí elektrody 10-12.
Cílem práce je nalézt vhodné podmínky pro voltametrické stanovení chlortoluronu
v povrchových vodách s použitím uhlíkové pastové elektrody a ověřit vliv miniaturizace
elektrody na získané výsledky.
Experimentální část
Zásobní roztok chlortoluronu (99,7%, Sigma-Aldrich) o koncentraci 100 μmol L–1 byl
připraven rozpuštěním přesně odváženého množství látky v methanolu. Jako základní
elektrolyt byl použit Brittonův-Robinsonův (BR) pufr; chemikálie pro přípravu pufru byly
v kvalitě p.a. zakoupeny od Lachema Brno. Uhlíková pasta byla připravena smísením 0,25 g
mikrokuliček skelného uhlíku (průměr 0,4 – 1,2 μm, Alfa Aesar, USA) a 0,1 mL minerálního
oleje (Fluka, Švýcarsko).
23
Byly použity dva typy uhlíkové pastové elektrody; v jednom případě byla pasta naplněna do
obvyklého teflonového těla s nerezovým pístem, s aktivní plochou o průměru 2 mm,
v druhém případě byla jako pouzdro na pastu použita teflonová kapilára o vnitřním průměru
0,5 mm. Povrch konvenční uhlíkové pastové elektrody (CPE) byl obnovován otřením vlhkým
filtračním papírem, povrch miniaturizované uhlíkové pastové elektrody (mCPE) byl
obnovován uříznutím tenkého plátku kapiláry.
Měření na CPE byla prováděna přístrojem Eco-Tribo-Polarograph (Polaro Sensors, Praha)
v roztoku o objemu 10 mL. K měření na mCPE byl využit přenosný přístroj PalmSens
(PalmSens, Nizozemí) v roztoku o objemu 0,25 mL. V obou případech byla použita platinová
pomocná elektroda a konvenční argentochloridová referentní elektroda. Diferenční pulsní
voltametrie (DPV) probíhala s parametry: rychlost scanu 100 mV s–1, výška pulsu 50 mV,
šířka pulsu 100 ms. Všechna měření byla opakována třikrát. Koncentrační závislosti byly
vyhodnoceny metodou nejmenších čtverců; mez stanovitelnosti byla spočítána jako
koncentrace analytu, jehož výška píku odpovídá desetinásobku směrodatné odchylky
nejmenší vyhodnotitelné koncentrace.
Říční voda byla odebíraná z Vltavy na Výtoni. 5 mL spikovaného vzorku bylo před
voltametrickým stanovením doplněno BR pufrem do 10 mL; dále uvedené hodnoty
koncentrací se vztahují ke koncentraci ve vzorku před tímto ředěním.
Výsledky a diskuse
Prvním krokem při optimalizaci DPV stanovení bylo určení vhodného pH měřeného roztoku.
Ze série voltamogramů, změřených při hodnotách pH roztoku 2 až 12, vyplývá, že průběh
závislosti signálu na pH se shoduje u obou použitých pracovních elektrod; proudová odezva je
nejvyšší při silně kyselých pH; kromě toho se výrazně zvýší u silně zásaditých pH. Pro další
měření bylo zvoleno pH 3, při kterém dosahovala výška píku maximální hodnoty.
Opakovaným měřením byla zjištěna relativní směrodatná odchylka měření, která činila 5,6 %
v případě CPE a 8,3 % v případě mCPE (n = 10). Tento výsledek zřejmě souvisí s různým
mechanismem obnovy povrchu elektrody.
Ve vybraném prostředí byla změřena koncentrační závislost chlortoluronu na obou
elektrodách; parametry získaných lineárních závislostí jsou shrnuty v Tabulce I. Odezva
mCPE je úměrně k ploše elektrody menší než v případě CPE, stejný vliv ovšem snížil i proud
pozadí; na velikost šumu měla pravděpodobně vliv i použitá instrumentace. Dosažená mez
stanovitelnosti v obou případech dosáhla submikromolární koncentrace, konkrétně
0,72 μmol L–1 v případě CPE a 0,29 μmol L–1 v případě mCPE.
Obdobných výsledků bylo dosaženo při stanovení chlortoluronu v modelových vzorcích říční
vody (Tabulka I). Mez stanovitelnosti je v tomto případě ovlivněna ředěním vzorku pufrem
před samotným měřením; v případě obou elektrod je její velikost mírně větší než při stanovení
v laboratorních podmínkách. Matrice stanovení pozorovatelně neovlivňuje, jak je zřejmé i
z voltamogramů látky v nejnižším změřeném koncentračním rozmezí (Obr. 1).
24
9
350
B
A
8
I (nA)
7
I (nA)
300
6
5
250
4
3
200
2
150
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
E (V)
1
0.8
0.9
1.0
1.1
E (V)
1.2
Obr. 1. DP voltamogramy koncentračních závislostí modelových vzorků chlortoluronu v říční
vodě na CPE (A) a mCPE (B), c = 10; 8; 6; 4; 2; 0 μmol L–1. 5 mL vzorku říční vody
doplněno do 10 mL BR pufrem pH 3.
Tabulka I.
Parametry koncentračních závislosí chlortoluronu. DPV, BR pufr pH 3.
Elektroda
Matrice
Koncentrační
Směrnice,
Úsek, nA Korelační
rozsah,
mA L mol–1
koeficient
-1
μmol L
CPE
Deionizovaná
100 – 0,8
7,8
18
0,9929
voda
Říční voda
100 - 2
5,2
7,7
0,9941
mCPE
Deionizovaná
100 – 0,4
0,45
0,80
0,9975
voda
Říční voda
100 - 2
0,22
0,38
0,9952
Mez
stanovitelnosti,
μmol L-1
0,72
1,6
0,29
0,35
Závěr
Technika diferenční pulsní voltametrie na uhlíkových pastových elektrodách se ukázala být
vhodnou pro stanovení chlortoluronu i v submikromolárních koncentracích a v matrici
reálných vzorků povrchových vod.
Poděkování
Tato práce vznikla byla finančně podpořena Ministerstvem školství, mLádeže a tělovýchovy
ČR (projekt MSM 0021620857), Univerzitou Karlovou v Praze (projekt SVV 2012-265201) a
Technologickou agenturou ČR (projekt TA01020565).
Literatura
1. Pesticide properties Database, http://sitem.herts.ac.uk/aeru/projects/ppdb/index.htm,
Downloaded 29th March 2012
2. EU
Pesticides
Database,
http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm,
Downloaded 29th March 2012.
25
3. Wang Y., You J. Y., Ren R. B., Xiao Y., Gao S. Q., Zhang H. Q., Yu A. M.: Journal of
Chromatography A 1217, 4241 (2010).
4. Mou R. X., Chen M. X., Zhi J. L.: Journal of Chromatography B-Analytical Technologies
in the Biomedical and Life Sciences 875, 437 (2008).
5. Losito I., Amorisco A., Carbonara T., Lofiego S., Palmisano F.: Analytica Chimica Acta
575, 89 (2006).
6. MartinEsteban A., Kwasowski P., Stevenson D.: Chromatographia 45, 364 (1997).
7. Mouvet C., Broussard S., Riolland H., Baran N., Abuknesha R., Ismail G.: Chemosphere
35, 1099 (1997).
8. Svancara I., Vytras K., Barek J., Zima J.: Critical Reviews in Analytical Chemistry 31,
311 (2001).
9. Zima J., Svancara I., Barek J., Vytras K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009).
10. Wang J., Zhang X. J., Prakash M.: Analytica Chimica Acta 395, 11 (1999).
11. Baldrianova L., Svancara I., Sotiropoulos S.: Analytica Chimica Acta 599, 249 (2007).
12. Hocevar S. B., Ogorevc B.: Talanta 74, 405 (2007).
26
Voltammetric Determination of 5-Nitrobenzimidazole at a Carbon Film Electrode
Deposited on a Silver Solid Amalgam Electrode
(Voltametrické stanovení 5-nitrobenzimidazolu na uhlíkové filmové elektrodě
deponované na stříbrné pevné amalgámové elektrodě)
Dana Deýlová and Jiří Barek
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8, 128 43 Prague 2,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Optimal conditions were found for the determination of 5-nitrobenzimidazole by direct
current and differential pulse voltammetry at a polished silver solid amalgam electrode
modified by carbon film in the concentration range from 1·10–7 to 1·10–4 mol L–1 in the
Britton-Robinson buffer solutions and model samples of drinking and river water.
Key Words: 5-Nitrobenzimidazole, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry,
Polished silver solid amalgam electrode modified by carbon film.
Introduction
5-Nitrobenzimidazole (5-NBIA) is a genotoxic substance which belongs to a group of the
nitrated heterocyclic compounds. The occurrence of 5-NBIA in environment is expected in
connection with chemical processes during fossil fuels combustion 1. 5-NBIA was
polarographically determined as a part of photographic processing solutions in the Seventies
of the last century 2 and its properties were studied in the area of metal corrosion protection 3.
5-NBIA is known as a proven carcinogen and mutagen 4.
O 2N
N
N
H
Fig. 1. Structural formula of 5-nitrobenzimidazole.
In the last decade, increasing fears of the toxicity of liquid mercury 5 – one of the best
electrode materials for measurement of this group of substances – led us to try to find out
novel suitable nontoxic materials with similar or better quality as mercury. One of them could
be a carbon film deposited on a conventional working electrode providing a carbon film
electrode (CFE) 6. It was designed as a film containing some conductive particles (the carbon
ones in this case) incorporated in an insulating matrix of a polymer covering a surface of any
solid electrode. Solid electrode serves here only as a conductor and electrochemical properties
of the CFE thus depend entirely on the character of conductive particles. This concept is
mainly profiting from the possibility of an easy renewability of the film (electrochemically
active surface of the electrode). The film can be easily removed by wiping it off by a filter
paper and reformed by immersing the electrode surface into the carbon ink created from a
carbon powder homogenously mixed with some polymer dissolved in a solvent in an exact
ratio. Renewing the film is a way how to eliminate the influence of the electrode history
completely, however, electrochemical regeneration on the film is also applicable to receive
better repeatability of measurement. Regarding the preparation of the carbon ink, the density
of carbon material is relatively low and just appropriate in order to create a homogenous
mixture (heavier particles would sediment).
27
This work aims at developing direct current voltammetric (DCV) and differential pulse
voltammetric (DPV) methods for the determination of trace amounts of genotoxic 5-NBIA
using CFE.
Exprimental
Reagents
5-NBIA (98%, CAS Name: 5-nitrobenzimidazole, CAS Registry number: 94-52-0) was
supplied by Sigma Aldrich in the form of nitrate. A 1·10–3 mol L–1 stock solution was
prepared by dissolving an exactly weighed amount of the substance in water. Diluted
solutions were prepared by exact dilution of the stock solution. The solutions were stored in
refrigerator. The dilute solutions were prepared every day.
The Britton-Robinson (BR) buffer solutions were prepared in a usual way by mixing a
0.04 mol L–1 solution of phosphoric acid, acetic acid and boric acid with an appropriate
amount of 0.2 mol L–1 sodium hydroxide, using analytical-reagent grade chemicals obtained
from Merck. Deionized water was produced by Milli-Q Plus system, Millipore.
The carbon film containing 0.01 g of polystyren, 0.09 g of carbon powder CR2 with particle
sizes 2 μm (Maziva Týn, Týn nad Vltavou, Czech Republic) and 0.5 mL 1,2-dichlorethane
(Merck, Darmstadt, Germany) was prepared. This mixture was homogenized for five minutes
on Vortex Genie 2 (Scientific Industries, USA).
Apparatus
Voltammetric measurements were carried out using an Eco-Tribo Polarograph driven by Polar
Pro 5.1 software (all Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The software worked under
the operational system Microsoft Windows XP (Microsoft Corporation). All measurements
were carried out in a three-electrode system using a platinum electrode PPE (Monokrystaly,
Turnov, Czech Republic) as an auxiliary electrode and a silver/silver chloride electrode RAE
113 (3 mol L–1 KCl, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) as a reference electrode. As a
working electrode, polished silver solid amalgam electrode (the disc diameter, 0.5 mm)
modified by carbon film was used. For both DCV and DPV, a scan rate 20 mV s–1 was used
and, moreover, for DPV, a pulse amplitude –50 mV and a pulse width 100 ms were used.
Procedures
For voltammetric measurements, an appropriate amount of 5-NBIA stock solution was
measured into a voltammetric vessel and filled up to 10 mL with BR buffer of appropriate pH.
Oxygen was removed from the measured solutions by bubbling with nitrogen for five
minutes. All curves were measured 3 times.
At the beginning, p-AgSAE was polished on the alumina with particle size 1.1 μm. The film
was formed by immersing the electrode surface in the conductive ink (the active part of the
electrode just touched the surface of the ink). Two minutes after immersing,
1,2-dichloroethane evaporates and the film, resp. the electrode is ready to use. When it is
necessary to renew the old film (for example because of the passivation), it can be easily
removed by wiping it off with a filter paper. The regeneration was carried out by periodical
switching every 0.1 s between potentials –100 mV and –900 mV during 30 s. Regeneration
always ended at a more negative potential.
Drinking water from the public water pipe line in the building of Faculty of Science of the
Charles University in Prague, spiked with appropriate amounts of stock solutions of test
compounds, were used as model samples. The procedure for the DPV determination of
28
5-NBIA in the model samples was as follows: 9.0 mL of a model water sample were diluted
to 10.0 mL with 0.01 mol L–1 and, after deaeration with nitrogen, DP voltammograms were
recorded.
The parameters of calibration curves (e.g., slope, intercept, limit of determination) were
calculated using statistic software Adstat which uses confidence bands ( = 0.05) for
calculation of the limit of determination (LQ). It corresponds to the lowest signal for what
relative standard deviation is equal 0.1 (ref. 7).
Results and discussion
Initially, the influence of pH on DCV and DPV curves (see Fig. 2) of 1·10–4 mol L–1 5-NBIA
at CFE was investigated in BR buffer with pH values from 2.0 to 12.0. 5-NBIA yielded one
cathodic peak over the whole pH region and, with the increasing pH value, second peak
appeared at more negative potential at pH from 7.0 to 12.0.
-6000
I (nA)
-5000
pH2
pH3
pH4
pH5
pH6
pH7
pH8
pH9
pH10
pH11
pH12
-4000
-3000
-2000
-1000
0
-200
-400
-600
-800
-1000
-1200
E (mV)
Fig 2. DP voltammograms of 5-NBIA (c = 1×10–4 mol L–1) at CFE in the BR buffer;
polarization rate 20 mV s–1.
-600
I (nA)
-700
I (nA)
-600
Ip -200
(nA)
-100
-400
0
0
5
10
c ( mol/l)
-200
-500
5
4
3
2
1
0
-160
Ip -120
(nA) -80
-40
0
0
-400
-300
4
3
2
1
0
-200
0
-200
5 c ( mol/l)10
5
-100
-400
-600
-800
-1000 -1200
E (mV)
-400
-600
-800
-1000
-1200
E (mV)
Fig 3. DC and DP voltammograms of 5-NBIA at CFE in BR buffer pH 7.0, c5-NBIA = 0 (0), 2
(1), 4 (2), 6 (3), 8 (4), and 10 µmol L–1. The corresponding calibration straight lines are given
in the insets.
29
Like the best pH for following measurement was selected pH 7.0. Then, DCV and DPV
calibration curves were measured over concentration ranges (2–10)·10–7, (2–10) 10–6, and
(2 –10) 10–5 mol L–1 for 5-NBIA at CFE (see Fig. 3). The parameters of the calibration curves
obtained are summarized in Table I.
Table I.
Parameters of the calibration straight lines for the determination of 5-NBIA in BR buffer pH
7.0 using DCV and DPV at CFE.
Concentration
Slope
Intercept
LQ
Method
R
–1
–1
(mol L )
(nA mol L)
(nA)
(mol L–1)
(2–10)·10–5
–4.56 107
367.2
–0.9987
–
–6
7
DCV
(2–10) 10
–1.92 10
–3.8
–0.9874
–
(2–10) 10–7
–4.54 107
8.6
–0.9832 6.2 10–7
(2–10) 10–5
–4.50 107
530.5 –0.9995
–
DPV
(2–10) 10–6
–1.47 107
3.2 –0.9971
–
–7
7
(2–10) 10
–1.57 10
–0.9 –0.9990
3.1 10–7
In order to verify practical applicability of the developed DCV and DPV methods, the
determination of 5-NBIA was carried out in model samples of drinking and river water in a
submicromolar concentration range under optimum conditions. Calibration curves were
measured in a mixture of 9.0 mL of a spiked model water sample and 1.0 mL of BR buffer pH
7.0. DP voltammograms of 5-NBIA in spiked drinking and river water in the concentration
range of 0.2–1.0 µmol L–1 are depicted in Fig. 4. The parameters of the calibration curves
obtained are summarized in Table 2. These results confirm the possible application of tested
electrode for the determination of micromolar concentrations of substance under investigation
in drinking and river water.
-250
I (nA)
-200
-350
I (nA)
-120
Ip
-80
(nA)
-40
5
0
0
-300
4
5
10
c ( mol/l)
3
2
-150
-150
5
4
3
2
-250
1
-200
Ip
-100
(nA)
-50
0
0
5
10
c ( mol/l)
1
0
0
-150
-100
-400
-600
-800
-1000
E (mV)
-400
-600
-800
-1000
E (mV)
Fig 4. DP voltammograms of 5-NBIA at CFE in model samples of drinking (A) and river (B)
water, c5-NBIA = 0 (0), 2 (1), 4 (2), 6 (3), 8 (4), and 10 µmol L–1. The corresponding calibration
straight lines are given in the insets.
Conclusion
It has been demonstrated that a carbon film electrode (CFE) represents suitable non-toxic
alternative to the traditional mercury electrodes. This electrode, combined with direct current
30
voltammetry or differential pulse voltammetry, is suitable sensor for the determination of
submicromolar concentrations of 5-nitrobenzimidazole. It provides stable and reproducible
responses during measurements within one concentration range by DCV and DPV techniques.
The applicability of the electrode for determination of 5-nitrobenzimidazole in model samples
of drinking and river water has also been verified. Therefore, this electrode should be
preferred for practical applications.
Table II.
Parameters of the calibration straight lines for the determination of 5-NBIA in model samples
waters using DCV and DPV at CFE.
Concentration
Slope
Intercept
LQ
Water
Method
R
(mol L–1)
(nA mol–1 L)
(nA)
(mol L–1)
DCV
(2–10) 10–7
–1.29 107
–3.4
–0.9953
2.5 10–7
Drinking
DPV
(2–10) 10–7
–2.89 107
–2.4
–0.9992
1.3 10–7
–7
7
DCV
(2–10) 10
–3.06 10
2.4
–0.9998
1.9 10–7
River
DPV
(2–10) 10–7
–1.56 107
–0.4
–0.9989
2.2 10–7
Acknowledgement
This research was supported by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech
Republic (MSM 0021620857), by the Charles University in Prague (SVV 2012-265201) and
by The Grant Agency of the Czech Republic (P206/12/G151).
Literatura
1. Barek J., Cvacka J., Muck A., Quaiserova V., Zima J.: Electroanalysis 13, 779 (2001).
2. Canterford D. R.: J. Photogr. Sci. 26, 65 (1978).
3. Popova A., Christov M., Raicheva S., Sokolova E.: Corr. Sci. 46, 1333 (2004).
4. Rosenkranz H. S., Karol M. H.: Mutat. Res. 431, 81 (1999).
5. Boyd A. S., Seger D., Vannucci S., Langley M., Abraham J. L., King L. E.: J. Am. Acad.
Dermatol. 43, 81 (2000).
6. Yosypchuk B., Barek J., Fojta M.: Electroanalysis 18, 1126 (2006).
7. Meloun M., Militky J., Forina M.: Chemometrics for Analytical Chemistry, PC-Aided
Regression and Related Methods, Vol. 2, p. 1–175. Ellis Horwood, Chichester 1994.
31
Voltammetric Determination of 3-Nitrobiphenyl on Meniscus Modified Silver Solid
Amalgam Electrode
(Voltametrické stanovení 3-nitrobifenylu na meniskem modifikované stříbrné pevné
amalgámové elektrodě)
a
Jan Fischer , Genovefa Tsimogianni b, Vlastimil Vyskočil a, Anastasios Economou b,
and Jiří Barek a
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Praha 2,
Czech Republic,
Email: [email protected]
b
Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Athens,
Athens 15771, Greece, Email: [email protected]
Abstract
Voltammetric determination of 3-nitrobiphenyl was studied using DC voltammetry (DCV)
and differential pulse voltammetry (DPV) at a meniscus modified silver solid amalgam
electrode (m-AgSAE). Optimal conditions were found for its determination by DCV and DPV
on m-AgSAE in mixture Britton-Robinson (BR) buffer pH 6 an methanol (MeOH) in ratio 4:1
within the concentration range 1.10-4 – 4.10-7 mol L-1.
Key Words: 3-Nitrobiphenyl, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Meniscus
modified silver solid amalgam electrode
Introduction
Nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons (NPAH) are well known suspicious or proven
chemical carcinogens which can be found in incinerators emissions, exhaust gases, fossil fuel
combustion products and cigarette smoke or in natural waters, river sediments, river water and
food. There is an ever-growing demand for new and more sensitive analytical methods for the
determination of this kind of substances 1. Electrochemical methods, such as voltammetry are
especially suitable for the determination of nitrated chemical carcinogens since they are
inexpensive and sensitive 2. The meniscus-modified silver solid amalgam electrode (mAgSAE) is suitable for the determination of electrochemically reducible carcinogens since it
is based on the non-toxic solid amalgam so it can be applied where the work with traditional
electrodes with liquid mercury is forbidden or undesirable.
Experimental
All reagents were of analytical grade. A stock solutions of 1·10-3 mol L-1 3-nitrobiphenyl was
prepared by dissolving 0.0100 g of the substance (C. A. S. Registry Number: [2113-58-8];
99%, Sigma-Aldrich, Germany) in 50 ml of deionized water. Britton–Robinson buffer was
used as a supporting electrolyte. Methanol was from Merck (Germany), deionized water was
produced by a Milli-Q plus system. Other chemicals were obtained from Lachema Brno
(Czech Republic) in p.a. purity. All the chemicals were used without any further purification.
Voltammetric experiments were performed using computer controlled Eco-Tribo Polarograph.
The working electrode was meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE).
The polished silver solid amalgam electrode was immersed into a small volume of liquid
mercury and agitated for 15 seconds to form m-AgSAE. This process, denoted as
amalgamation, was repeated every week. Before starting the experiment for each new surface
of m-AgSAE the electrochemical activation was carried out in 0.2 mol L-1 KCl at –2200 mV
under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. Work with
m-AgSAE was carried out at a scan rate of 20 mV.s-1, pulse amplitude of –50 mV, pulse
32
duration of 100 ms, sampling time of 20 ms beginning 80 ms after the onset of the pulse and
interval between pulses of 100 ms. In the case of electrode passivation, a short
electrochemical regeneration of m-AgSAE lasting about 30 s preceded each measurement.
The regeneration was carried out by periodical switching every 0.1 s between potentials
100 mV more positive (Ereg1) than the potential of hydrogen evolution and 100 mV more
negative (Ereg1) than the potential of amalgam dissolution and in the given base electrolyte.
Results and discussion
As the first step of method’s optimization, the effect of pH in range 2 – 12 of Britton Robinson buffer to sensitivity of voltammetric determination of 3-nitrobiphenyl was
investigated. Because of low solubility of the substance it was necessary to work in the
presence of 20% MeOH. For further measurements pH 6 was used where the substance gave
well developed wave/peak for the both voltammetric techniques, DCV and DPV. Afterwards,
repeatability of measurements at m-AgSAE was checked. For DPV the repeatability was on
acceptable level, but for DCV at pH 6 was necessary to use regeneration of electrode surface
using potentials 130 mV (Ereg1) and –1640 mV (Ereg2), see in Fig. 1. Found optimal conditions
were used for measuring calibration dependences in the concentration range from 1.10-4 to
2.10-6 mol L-1 with DCV and from 1.10-4 to 2.10-7 mol L-1 with DPV. According to obtained
results, DPV seems to be more sensitive and gives more linear calibration curves then DCV,
see in Table I.
-300
2
Iw, nA
1
-150
0
0
10
20
Number of Measurements
Fig. 1. Dependence of wave current of 3-nitrobiphenyl (c = 10-4 mol L-1) on serial number of
repetitive measurements using DCV at m-AgSAE in mixture Britton-Robinson buffer pH 6.0
and MeOH (4:1). Measurement without regeneration (1) and with regeneration (2) at
potentials Ereg1 = 130mV and Ereg2 = –1640mV.
Table I.
Comparison of developed methods for determination of 3-nitrobiphenyl in mixture BrittonRobinson buffer pH 6.0 and MeOH (4:1) on m-AgSAE.
Method
Regeneration
Calibration range,
LOD,
mol L-1
mol L-1
DCV
Ereg1 = 130mV, Ereg2 = –1640mV
2.10-6 – 1.10-4
1.6.10-6
-7
-4
DPV
not necessary
2.10 – 1.10
4.3.10-7
33
Conclusions
Newly developed methods could be applied for the determinations of 3-nitrobiphenyl in
simple environmental matrix like of drinking and river. The m-AgSAE in combination with
electrochemical regeneration showed good response towards 3-nitrobiphenyl with good
reproducible results without any surface passivation. This indicated that m-AgSAE is a
suitable sensor for the determination of micromolar concentrations of this substance. The limit
of determination was on micromolar level for both used voltammetric techniques and
sensitivity of these methods could be further increased by a preconstruction step 3.
Acknowledgements
Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic
(project MSM 0021620857), from Charles University (project UNCE 2012/44), and from the
Grant Agency of the Czech Republic (project P206/10/P087) is gratefully acknowledged.
References
1. Barek J., Moreira J. C., Zima J.: Sensors 5, 148 (2005).
2. Vyskocil V., Barek J.: Curr. Org. Chem. 15, 3059 (2011).
3. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ.
Chem. Lett. 9, 83 (2011).
34
Next Generation of Electrochemically Active Labels for DNA Analysis. How to Utilize
Electrochemical Conversions for the Improvement of Signal Resolution
(Další generace elektroaktivních značek pro analýzu DNA: jak využít
elektrochemických přeměn k lepšímu rozlišení voltametrických signálů)
Miroslav Fojta a, Luděk Havran a, Hana Pivoňková a, Pavlína Vidláková a, Petr Orság a,
Medard Plucnara a, Petra Horáková a, Veronika Raindlová b, Jana Balintová b,
and Michal Hocek b
a
Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, 612 65 Brno, Czech Republic
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2,
16610 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Novel types of electroactive DNA labels have been introduced and applied in electrochemical
DNA sensing. We demonstrate an easy detection of organic oxygenous or nitrogenous
functional groups attached to DNA, such as anthraquinone (AQ), formyl, hydrazone, aromatic
moieties bearing various numbers of nitro groups and furazane heterocycle. Discrimination
between redox tags giving electrochemical signals at close potentials (such as AQ and
nitrophenyl), as well as discrimination between intrinsic and extrinsic moieties in labeled
DNAs (such as guanine and AQ), can be improved via their controlled in situ electrochemical
conversion.
Key Words: DNA electrochemistry, DNA modification, Redox labels, DNA hybridization,
Nucleobase coding.
Introduction
Nucleic acids have been reported to possess intrinsic electrochemical activity due to
electrochemically reducible or oxidizable nucleobases, and a number of label-free
electrochemical DNA assays and sensors have been designed 1. Labelling of DNA with
electroactive moieties represents a convenient way to more specific and more sensitive
electrochemical detection in applications related to sequence-specific DNA sensing, including
DNA hybridization, detection of single nucleotide polymorphisms, as well as in some
techniques of DNA damage sensing 2-3. Combination of several redox tags differing in their
redox potentials (and/or character of electrode process they undergo) allows parallel analysis
of multiple nucleotide sequences or specific coding of individual nucleotides. In our previous
work we proposed2 a palette of DNA tags producing electrochemical signals distinguishable
from each other as well as from intrinsic DNA (nucleobase) signals. Quite recently we
extended possibilities of DNA labelling and electrochemical detection by novel types of
labels and analytical procedures to improve versatility of the approach.
Experimental
Labeled single-stranded oligonucleotides were prepared through primer extension
incorporation of modified deoxynucleotide triphosphates (dNTPs; for more details see 4) and
the following magnetoseparation procedure: reaction mixture (50 μL) was added to DBStv
[25 μL of the stock solution washed three times by 150 μL of buffer (0.3 M NaCl, 10 mM
TRIS, pH = 7.4)]. After binding (30 min at room temperature on shaker), the DBS tv were
washed three times with 200 μL of PBS solution (0.14 M NaCl, 3 mM KCl, 4 mM sodium
phosphate, pH = 7.4) with 0.01% Tween 20 and then three times by 200 μL of buffer (0.3 M
NaCl, 10 mM TRIS, pH = 7.4) and finally by ddH2O (200 μL). Labeled single-strands were
released by shaking and heating the sample at 75 °C for 2 min.
35
Electrochemical analysis: PEX products were analysed by ex situ (adsorptive transfer
stripping) cyclic voltammetry (CV). The oligonucleotides were accumulated 60 s from 5 L
aliquots containing 0.2 M NaCl at the surface of the working electrode (hanging mercury drop
electrode, HMDE, or basal-plane pyrolytic graphite electrode, PGE). The electrode was then
rinsed with deionized water and placed in the electrochemical cell. CV settings: scan rate 0.5
V/s, initial potential 0.0 V, for switching and final potentials see Results and discussion and
figure legends. Background electrolyte: 0.5 M ammonium formate, 0.05 M sodium phosphate,
pH 6.6 (for measurements at HMDE) or 0.2 M sodium acetate pH 5.0 (for measurements at
PGE). All measurements were performed at room temperature using an Autolab analyzer (Eco
Chemie, The Netherlands) in connection with VA-stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland)
and a three-electrode system with Ag|AgCl|3M KCl electrode as a reference and platinum
wire as an auxiliary electrode.
Results and discussion
Our previous work resulted in application of several electroactive DNA tags [such as
ferrocene, nitro- and aminophenyl, M(bpy)3 complexes of Ru or Os, 7-deazaguanine] 2
available in the form of base-modified dNTP conjugates and incorporable by DNA processing
enzymes such as DNA polymerases or terminal deoxynucleotidyl transferase, etc.). Facile
distinction among these labels has been attained through different redox potentials at which
these moieties are reversibly or irreversibly reduced or oxidized. More recently we have
introduced next generation of electroactive DNA labels 5. Our experiments revealed an easy
detection of various oxygenous or nitrogenous functional groups attached to DNA or nucleic
acids components, including formyl (via reduction of C=O double bond), hydrazone (C=N),
nitro derivatives bearing various number of nitro groups and yielding characteristic signal
patterns, and furazane heterocycle representing a quite novel electroactive label giving very
sensitive signal due to 6-electron reduction, via their electroreduction at mercury or carbon
electrodes. Albeit the aldehyde and hydrazone groups are rather reactive and/or unstable to
serve, by themselves, as electroactive labels for biosensing applications, their specific
electrochemical properties can be used for monitoring of the preparation of functionalized
DNA to attach further electroactive tags 5.
Improved resolution of analytical signals conferred by intrinsic and extrinsic moieties in
chemically modified DNAs can be also attained through their controlled electrochemical
conversion into products exhibiting electrochemical properties distinct from that of the
original forms. For example, anthraquinone (AQ) produces at mercury-based electrodes a
reversible pair of peaks around -0.4 V. Close to the hydroquinone oxidation potential, a peak
due to guanine occurs which can be observed only when the electrode is prepolarized to
potentials ≤ -1.6 V to convert guanine to 7,8-dihydroguanine, which is in turn anodically
oxidized back to guanine around -0.3 V. On the other hand, such negative polarization
“switches off” the AQ/AQH2 couple due to reductive destruction of the AQ moiety. Thus,
both signals can be detected without mutual interference in two consecutive potential cycles,
the first between 0 and -1.0 V (to observe AQH2 oxidation) and the other between 0 and
-1.85 V (to observe the guanine peak, Fig. 1). Another tag used recently as a DNA label,
nitrophenyl (PhNO2), is irreversibly reduced with four electrons to hydroxylamine (NHOH)
close to -0.5 V (inset in Fig. 1). When PhNO2 is combined with AQ, their reduction signals
overlap considerably. On the other hand, using the AQ anodic peak and a peak due to NHOH
reversible oxidation close 0 V, one can easily measure both signals independently.
36
0.1
st
1 scan
nd
2 scan
0.0
40
1
I [ A]
-0.3
NHOHox
st
1 scan
nd
2 scan
20
-0.2
0
-20
-0.4
NOred
NO2red
-40
-0.5
G
AQred
-0.1
I [ A]
AQH2ox
-60
-0.6
CA
-1.5
-1.2
-0.9
-0.4
E [V]
-0.6
-0.2
0.0
-0.3
0.0
E [V]
Fig. 1. Two successive cyclic voltammograms of AQ-labeled PEX product measured at
HMDE. Dashed curve was measured first with switching potential at –1.0 V. Then, the solid
curve was measured with switching potential -1.85 V without the electrode renewal (i.e. with
the same adsorbed DNA layer). Inset: Ex situ CVs responses of PhNO2 labeled PEX product
at HMDE. Two consecutive scans at the same HMDE; initial potential +0.05 V, switching
potential -0.7 V. For other conditions see Experimental.
Conclusion
Labeling of DNA with electrochemically active moieties proved to be a convenient way to
development of electrochemical bioassays and biosensors for the analysis of nucleotide
sequences. Through combinations of various labels differing in redox potentials and through
controlled in situ electrochemical conversions of specific intrinsic and extrinsic DNA
components, highly specific electrochemical analysis of DNA sequences can be attained.
Electrochemical techniques have also been applied as a potent tool for monitoring of
preparation of functionalized DNA and its subsequent post-modification.
Acknowledgment
Financial support from The Czech Science Foundation GACR (project P206/12/G151) and
GA ASCR (IAA400040901) is gratefully acknowledged.
References
1. Paleček E., Bartošík M.: Chem Rev 112 (2012), published ASAP - DOI:
10.1021/cr200303p.
2. Hocek M., Fojta M. Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011).
3. Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936
(2011).
4. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Fojta M., Hocek M.: ChemEur. J. 17, 14063 (2012).
5. Raindlová V., Pohl R., Klepetářová B., Havran L., Šimková E., Horáková P., Pivoňková
H., Fojta M., Hocek M.: ChemPlusChem, accepted.
37
Electrochemistry of Potential Eu MRI Complexes
(Elektrochemie potenciálních MRI komplexů europia)
Miroslav Gál a, Romana Sokolová a and Filip Kielar b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the ASCR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Department of Chemistry, Duke University, Box 90354, 27708-0354 Durham NC, USA
Abstract
Properties of the several potential contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI) with
Eu(III)/Eu(II) redox couple were investigated by means of the electrochemical methods.
Cyclic voltammetry, phase sensitive AC voltammetry, and DC polarography were utilized to
elucidate the mechanism of the reduction/oxidation of Eu ion in the presence of these
compounds. Moreover, the stability constants of the Eu(II)-MRI agent complexes were also
determined. Some suggestions on the chemical structure of the potential contrast agents for
MRI are also made.
Key words: Contrast agent, MRI, Cyclic voltammetry, Reaction mechanism, Cyclodextrin,
Poly(aminocarboxylate) ligands.
Introduction
The electrochemical behavior of biologically active compounds has been in the focus of
interest for many years 1-10. The predominant stability of the Eu(III) oxidation state for all
lanthanide ions is well known. The Eu(III)/Eu(II) reduction has been studied both by means of
calorimetry and electrochemistry. Several reports have dealt with the redox kinetics of the
europium aqua ion at various electrode materials and with different supporting electrolytes 1117
. As reported by Weaver et al., the Eu(III)aq/ Eu(II)aq couple shows a small heterogeneous
electron transfer rate constant, which results in a chemically reversible and electrochemically
irreversible process 18. The reduction of europium seems to be an interesting problem because
of its exceptional electronic structure. As pointed out in many papers numerous conflicting
results have been published concerning the reduction mechanism of europium 19-23. Recently,
the interest in this class of compounds has been stimulated by the current research in contrast
media for magnetic resonance imaging (MRI) 24. New applications are under evaluation
which requires paramagnetic probes whose response is a controlled function of a well-defined
biochemical parameter 25. A very efficient system could be provided by Eu(III)/Eu(II)
complexes, for which relaxivities analogous to Gd(III), the typical metal used for traditional
CA, would be expected for the lower oxidation state. Toth and co-workers have pioneered the
investigation of the relaxometric and structural properties of Eu(II) complexes in aqueous
solution 26. Here, we report a study of the electrochemical behavior of several Eu complexes
with ligands with the aim of improving our understanding of the general properties of this
class of compounds in view of their potential future applications in biomedical studies.
Experimental
The
ligands
diethylene
triamine
pentaacetic
acid
(DTPA),
1,4,7,10,13,16hexaazacyclooctadecane (HEXACYCLEN), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (CYCLAM),
1,4,7,10-Tetraazacyclododecane (DOTA), α, β-cyclodextrin, respectively and EuCl3.6 H2O
were purchased from Aldrich. The stock solution of the Eu(III) aqua-ion was prepared by
dissolving EuCl3.6H2O in distilled water. The complexes have been prepared by mixing of
desire amounts of the Eu aqua-ion and of the ligand, at pH 6.5, and by stirring the resulting
aqueous solution for about 1 h to ensure complete complexation.
38
Electrochemical measurements were performed using AUTOLAB instrument PG STAT 30
equipped with FRA2 module (ECO Chemie, The Netherlands). An electrochemical data from
cyclic voltammetry (CV) and DC polarography were analyzed using AUTOLAB software. A
three electrode electrochemical cell was used for all experiments. The reference electrode (RE),
Ag|AgCl|1 M LiCl, was separated from the test solution by a salt bridge. The working electrode
(WE) was a valve-operated static mercury drop electrode (VA Stand 663, Metrohm). The
counter electrode (CE) was a platinum sheet with area approximately 200 times higher than that
of WE. Total volume of the measured solution was 10 ml. All measurements were carried out in
the physiological solution at 25 ± 1°C.
Results and discussion
The aim of this work is to determine the stability of Eu(II) with several chelators using
electrochemical methods (mentioned above). Another point is to elucidate the redox
mechanism of Eu in the presence of chelators.
The molecules of CD form truncated cones which allow them to accommodate guest
molecules selectively according to their size and polarity. For our study -cyclodextrin and
-cyclodextrin, respectively were chosen. In the pure 0.1 M KCl well-developed DC
reduction wave of Europium(III) at about -0.67 V vs. RE was obtained. After addition of
-cyclodextrin to the solution of Eu(III) the slight shift of the reduction half-wave potential of
the Eu-β-CD complex to the more negative values is observed (Fig.1). However, the limiting
current remains almost the same. The logarithmic analysis of Eu-β-CD complex with 58 mV
slope (inset of Fig. 1) confirms one electron reduction process of Eu(III)-β-CD to complex
Eu(II)-β-CD. The slope of the shift of the half-wave potential of the reduction Eu(III) to
Eu(II) in the presence of various β-CD concentrations was found to be 26 mV/decade. The
reduction process is controlled by dissociation of complex. From the dependence of half-wave
potential on the concentration of ligand is possible determine stability constant and
stoichiometry of complex. The height of polarographic wave of europium remains the same at
the presence of -cyclodextrin. The cyclic voltammetry measurements were carried out in the
solution containing of 2 10-4 M EuCl3, 0.1 M KCl and different -cyclodextrin
concentrations. One cathodic peak and two anodic peaks were observed. Each of them
increases with increasing concentration of Eu. It was found that the potential of cathodic peak
is moved to the negative values with increasing concentration of -cyclodextrin. The limiting
process is dissociation of complex Eu(III)- -CD. Complex of europium is probably formed by
interactions with oxygen bridges of the cyclodextrin. The adsorption of of -CD can be
excluded. The dependence of cathodic current on the scan rate v1/2 is linear and that indicate
that the process is diffusion-controlled.
39
i/ A
-3
log [ i / ( id - i ) ]
3
-4
2
1
0
-1
-2
-0.6
-0.7
E/V
-0.8
-2
-1
0
-0.4
-0.6
-0.8
-1.0
E/V
-1.2
Fig.1. Polarographic waves of 1 10-4 M Eu(III) in 0.1 M KCl at the presence of
-cyclodextrin at concentration: ■ 0; ○ 1 10-5 M; ▲ 5 10-5 M; * 3 10-4 M. Inset: the
logarithmic analysis of DC polarograms.
Similar mechanism of Eu reduction/oxidation can be observed in the case of other chelators
utilized in this work. It is clear, that other peaks, which correspond to the reduction of the
respective electrochemically active groups, are also visible. In some cases (α-CD,
Hexacyclen…) the adsorption of the complexes plays the important role in the redox
mechanism. However, none of these phenomena influences the overall stability of the
respective Eu complexes.
K / M-1
The big difference is observed in the stability of the Eu complexes (see Fig. 2).
10
10
7
10
4
10
1
10
a-CD
b-CD
Cyclam
HEXACYCLEN
DTPA
DOTA
Fig.2. The stability constant of Eu(II)-chelator complexes.
Conclusion
The Eu(II) complexes with acyclic poly(aminocarboxylic) ligands are characterized by lower
stability constants than the corresponding Eu(III) complexes. The K values increase with
denticity. The more oxygen and nitrogen atoms are presented in the chelators’ structure, the
40
more stable is the final complex. However, the relative stability of Eu(II) vs. Eu(III)
complexes is lower probably as a consequence of the increase of the overall negative charge
that stabilizes preferentially the harder metal ion. To summarize, a potential use of the
Eu(III)/Eu(II) redox couple as a diagnostic probe in living systems requires some structural
modification of ligands to stabilize preferably the lower oxidation state of Eu.
Acknowledgement
This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (203/09/1607).
Literature
1. Hromadova M., Pospisil L., Fanelli N., Giannarelli S.: Langmuir 21, 1923, (2005).
2. Ramesova S., Sokolova R., Degano I., Bulickova J. et. al: Anal. Bioanal. Chem. 402, 975,
(2012).
3. Sokolova R., Degano I., Ramesova S., Bulickova J. et. al: Electrochim. Acta 56, 7421,
(2011).
4. Hromadova M., Kolivoska V., Gal M., Pospisil L. et. al: J. Incl. Phenom. 70, 461, (2011).
5. Gal M., Sokolova R., Kolivoska V., Turonova A. M. et. al: Collect. Czech. Chem.
Commun. 76, 1607, (2011).
6. Gal M., Kolivoska V., Ambrova M., Hives J. et. al: Collect. Czech. Chem. Commun. 76,
937, (2011).
7. Gal M., Hromadova M., Pospisil L., Hives J. et. al: Bioelectrochemistry 78, 118, (2010).
8. Pospisil L., Hromadova M., Gal M., Bulickova J. et. al: Carbon 48, 153, (2010).
9. Pospisil L., Teply F., Gal M., Adriaenssens L. et. al: Phys. Chem. Chem. Phys. 12, 1550,
(2010).
10. Gal M., Hives J., Sokolova R., Hromadova M. et. al: Collect. Czech. Chem. Commun.
74, 1571, (2009).
11. Shults W. D.: Anal. Chem. 31, 1095, (1959).
12. Kolthoff I. M.,.Coetzee J. F.: J. Am. Chem. Soc. 79, 1852, (1957).
13. Coetzee J. F.,.Siao W. S.: Inorg. Chem. 2, 14, (1963).
14. Coetzee J. F., Mcguire D. K., Hedrick J. L.: J. Phys. Chem. 67, 1814, (1963).
15. Gaur J. N.,.Zutshi K.: J. Electroanal. Chem. 11, 390, (1966).
16. Chlistunoff J.,.Galus Z.: J. Electroanal. Chem. 193, 175, (1985).
17. Hush N. S.,.Dyke J. M.: J. Electroanal. Chem. 53, 253, (1974).
18. Yee E. L., Cave R. J., Guyer K. L., Tyma P. D. et. al: J. Am. Chem. Soc. 101, 1131,
(1979).
19. Gierst L.,.Cornelissen P.: Collect. Czech. Chem. Commun. 25, 3004, (1960).
20. Vlcek A. A.: Chem. Listy 52, 214, (1958).
21. De Kreuk C. W., Sluyters-Rehbach M., Sluyters J. H.: J. Electroanal. Chem. 28, 391,
(1970).
22. Niki K.,.Mizota H.: J. Electroanal. Chem. 72, 307, (1976).
23. Ikeda O., Tsuura K., Tamura H.: B. Chem. Soc. Jpn. 54, 661, (1981).
24. Kielar F., Tei L., Terreno E., Botta M.: J. Am. Chem. Soc. 132, 7836, (2010).
25. Parker D., Dickins R. S., Puschmann H., Crossland C. et. al: Chem. Rev. 102, 1977,
(2002).
26. Toth E., Burai L., Merbach A. E.: Coordin. Chem. Rev. 216, 363, (2001).
41
Electrochemical Analysis of Terminal Deoxynucleotidyl Tranferase Reaction Products
(Elektrochemická analýza produktů terminální deoxynukleotidyl transferázy)
Luděk Havran a, Vlastimil Tichý a, Jan Špaček a, Hana Macíčková-Cahová b,
Petra Horáková a, Hana Pivoňková a, Miroslav Fojta a, and Michal Hocek b
a
Institute of Biophysics of the ASCR v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR v.v.i., Flemingovo nám. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
For application of electrochemical approaches in analysis of DNA sequences or interactions it
is convenient to use DNA probes containing electroactive tags. Using terminal
deoxynucleotidyl tranferase (TdT) reaction is one from methods for preparing such probes.
TdT is an enzyme attaching nucleotides at the 3’-OH terminus of DNA using dNTPs as
substrates. Not only natural dNTPs, but also chemically modified dNTPs bearing different
electroactive groups can be used as substrates of TdT. This contribution brings new
information on the electrochemical behavior of TdT tailing reaction products containing
attached natural nucleosides, deaza analogs of purine nucleosides, and selected chemically
modified nucleosides.
Key Words: Labelling of DNA, Electrochemical DNA sensors, Terminal deoxynucleotidyl
tranferase.
Úvod
Nukleové kyseliny jsou přirozeně elektroaktivní látky poskytující řadu vlastních
elektrochemických signálů na různých typech pracovních elektrod 1. V případě konstrukce
elektrochemický senzorů hybridizace DNA je výhodné pracovat s DNA značenou
elektroaktivní značkou. Inkorporace nukleosidtrifosfátů (dNTP) nesoucích různé
elektroaktivní skupiny pomocí DNA polymeráz je v současnosti jednou z často používaných
metod pro přípravu takto značené DNA 2. Další metodou, vhodnou zvláště pak pro přípravu
koncově značených oligonukleotidů používaných jako signální sondy v DNA hybridizačních
senzorech, je inkorporace značených dNTP pomocí terminální deoxynukleotidyl transferázy
(TdT).
TdT je enzym, který prodlužuje 3’-OH konec DNA 3. Jako substrát mohou být použity jak
přirozené dNTP, tak i dNTP značené různými elektroaktivními skupinami. Takto značené
ODN mohou být použity jak pro analýzu nukleotidových sekvencí, tak i pro studium interakcí
DNA s proteiny 4.
V tomto příspěvku budou prezentovány výsledky elektrochemické analýzy produktů TdT
reakce, které obsahují přirozené nukleosidy, deaza analogy purinových nukleosidů nebo
chemicky modifikované nukleosidy. Elektrochemické chování těchto produktů TdT reakce
bude studováno v závislosti na typu inkorporovaného nukleosidu a struktuře prodlouženého
segmentu.
Experimentální část
TdT (New England Biolabs) reakce byla prováděna 60 minut za teploty 37 oC. Jako substráty
byly použity přirozené dNTP, 7-deaza-dGTP (dG*TP) (Obr.1A) a 3-nitrofenyl-7-deaza-dGTP
(dGNO2TP) (Obr.1B). Produkty enzymatické reakce byly z reakční směsi izolovány pomocí
magnetických mikrokuliček nesoucích oligo dT řetězce (Invitrogen, USA). dGNO2TP byl
připraven pomocí Suzukiho cross-coupling reakce 7-I-7-deaza-dGTP s 3-nitrofenylboronovou
42
kyselinou ve vodném prostředí. Produkty TdT reakce byly analyzovány na visící rtuťové
kapkové elektrodě (HMDE) a elektrodě z pyrolytického grafitu (PGE) za použití různých
voltametrických technik. Všechna voltametrická měření byla prováděna pomocí
potenciostatu/galvanostatu Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) a elektrodového systému
663 VA-stand (Metrohm, Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako referenční elektroda
byla použita Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát.
O
A
O
HN
O
H2N
O
HO P O P O P O
OH
O
B
OH
N
N
O
O
O
H2N
O
HO P O P O P O
OH
OH
OH
OH
NO2
HN
N
N
O
OH
OH
Obr. 1. Strukturní vzorce dG*TP (A) a dGNO2TP (B).
Výsledky a diskuze
Pomocí TdT byl prodloužen modelový ODN A25. V závislosti na použitém substrátu (dGTP,
dTTP, dG*TP) byly při jeho studiu aplikovány různé voltametrické techniky. Pro analýzu
produktů obsahujících oligo dG a oligo 7-deaza-dG (G*) řetězce byla použita adsorptivní
přenosová rozpouštěcí voltametrie s vnuceným pravoúhlým napětím (AdTS SWV) na PGE.
Takto byly měřeny signály oxidace G a G* (Obr. 2A). Pro analýzu produktů obsahujících
pouze oligo G řetězce byla také použita adsorptivní přenosová rozpouštěcí cyklická
voltametrie (AdTS CV) na HMDE, kde byl měřen G pík (signál vznikající v důsledku oxidace
redukčního produktu G na HMDE) (Obr. 2Ai). V případě produktů TdT reakce se směsí
dGTP a dTTP bylo pro analýzu použito značení thyminových zbytků komplexy oxidu
osmičelého 5 a jejich následné analýzy na PGE pomocí AdTS SWV (Obr. 2B).
Ze získaných výsledků vyplývá, že studovaná enzymatická reakce je ovlivněna jak
koncentrací použitého substrátu, tak také jeho typem. Například, pokud je modelový ODN
A25 prodlužován dGTP dochází k prodloužení pouze o několik nukleosidů, zatímco je-li
substrátem dG*TP dochází k významnému nárůstu délky řetězce. Vzhledem k tomu, že úseky
DNA bohaté na guanin tvoří G-tetraplexy (na rozdíl od DNA úseku bohatých na
7-deaza-guanin), může v tomto případě tvorba těchto alternativních sekundárních struktur
DNA silně ovlivňovat průběh enzymatické reakce.
Dále bylo použito prodlužování oligonukleotidových řetězců pomocí TdT k přípravě ODN
značených nitrofenylem. dGNO2TP se ukázal jako vhodný substrát pro TdT. Připravené
koncově značené ODN, pak byly používány jako signální sondy pro elektrochemickou
detekci hybridizace DNA a také pro studium interakce DNA s proteinem p53.
43
Obr. 2. A) AdTS SWV záznamy A25 prodlouženého TdT reakcí se 7 M dGTP (plná čára),
neprodloužená kontrola (čárkovaná čára). PGE, Ei = 0.2 V, Eend = 1.6 V, amplituda 25 mV,
frekvence 200 Hz, elektrolyt: 0,2 M acetátový (pH 5,0), ta = 60s. i) AdTS CV záznamy A25
prodlouženého TdT reakcí se 7 M dGTP (plná čára), neprodloužená kontrola (čárkovaná
čára). HMDE, Ei = 0 V, Esw = -1.85 V, rychlost scanu 1 V/s, elektrolyt: 50mM fosfátový pufr
+ 0,3M mravenčan amonný (pH 6,9), ta = 60s. B) AdTS SWV záznamy A25 prodlouženého
TdT reakcí s dGTP a dTTP v molárním poměru 1:3 po modifikaci komplexem OsO4 s 2,2’bipyridinem (2 mM Os,bipy, 37oC, 30 min.) (plná čára), neprodloužená kontrola (čárkovaná
čára). PGE, Ei = -1 V, Eend = 0.2 V, amplituda 25 mV, frekvence 200 Hz, elektrolyt: 0,2 M
acetátový (pH 5,0), ta = 60s.
Závěr
Pomocí různých voltametrických metod na HMDE a PGE byly studovány produkty TdT
reakce. Jako substráty byly použity přirozené nukleosidy, deaza analogy purinových
nukleosidů a chemicky modifikované nukleosidy. Bylo zjištěno, že daná enzymatické reakce
je ovlivněna koncentrací a typem použitého substrátu. Ze získaných výsledků vyplývá, že
tvorba alternativních sekundárních struktur DNA v prodlužovaném úseku silně ovlivňuje
studovanou reakci. Reakce katalyzovaná TdT je také vhodná k inkorporaci chemicky
modifikovaných dNTP do DNA.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu GAČR (P206/12/2378, P206/12/G151).
Literatura
1. Paleček E., Jelen F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards
electrochemical sensors for genomics and proteomics Palecek, E., Scheller, F., Wang, J.,
Elsevier, Amsterdam, 2005
2. Hocek, M.; Fojta, M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011).
3. Famulok M., Hartig J. S., Mayer G. Chem. Rev.: 107, 3715 (2007).
4. Horáková P., Macíčková-Cahová H., Pivoňková H., Špaček J., Havran L., Hocek M.,
Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011).
5. Fojta, M.; Kostečka, P.; Pivoňková, H.; Horaková, P.; Havran, L.: Curr. Anal. Chem. 7,
35 (2011).
44
The Implementation of Elimination Voltammetric Procedure into Electrochemical
Analyzers
(Implementace procedur eliminační voltametrie do elektrochemických analyzátorů)
Jan Hrbáč a and Libuše Trnková b,c
a
Department of Physical Chemistry, Faculty of Science, Palacky University,
tr. 17. Listopadu 12, Olomouc, Czech Republic E-mail: [email protected]
b
Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5,
625 00 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected]
c
CEITEC, Brno University of Technology, Technická 3058/10, 616 00 Brno,
Czech Republic
Abstract
A Labview - based application was developed to implement elimination voltammetry method
into electrochemical analyzers. Current version of the software performs two elimination
procedures on three voltammograms recorded at different scan rates. The parameters
belonging to most widely used elimination functions (“E4” and “E6”) are pre-defined, but can
be manually changed. The changes in the parameters’ values are instantly reflected on a graph
displaying the elimination voltammograms.
Key Words: elimination voltammetry, electrochemical analyzer, Labview.
Introduction
Electrochemical analyzers in general are working in both potentiostatic and galvanostatic
modes. The aim of the contribution is the implementation of the Eliminination voltammetry
with linear scan (EVLS) for potentiostatic methods, namely LSV (Linear sweep
voltammetry), CV (Cyclic voltammetry) and SWV (Square wave voltammetry). Processing
the experimental data by EVLS1-7 can enrich the analytical information obtained from
voltammetric experiments namely through (a) improvement in peak shape and resolution, (b)
ability to subtract the baseline without the necessity to measure blank voltammogram, (c)
expansion of the accessible potential window, (f) increasing the sensitivity of the
voltammetric method (LSV, CV) and consequently reducing the detection limit for certain
analyses, especially in the case of adsorbing species, etc. Furthermore, EVLS analysis can
contribute to better understanding of the studied electrode process, e.g., (a) gives the
possibility to obtain additional information about proceeding processes at an electrode
surface, especially by comparing the different elimination functions, (b) provides the
information on the slowest (control) step in the electrode process, (c) allows for the
calculation of the diffusion-controlled process charge transfer coefficient, (d) reveals the
processes behind the process through elimination of kinetic currents (e.g., the elimination of
hydrogen evolution currents), (e) points to a system of interacting processes (catalysis,
coherence, synergy) of electrode processes, (f) quickly reveals an electrode process in the
adsorbed state of the investigated analyte with greater sensitivity than semi-integration
method, (g) reflects the roughness of electrode surfaces, etc.
The EVLS procedure is based on different scan rate dependence of the individual current
components (diffusion, kinetic and capacitive) constituting the total current measured during
the voltammetric experiment. Some partial currents can be eliminated by conventional
voltammetric methods, such as pulse techniques reducing the capacitive component of current
to a negligible value. The elimination (EVLS) procedure allows performing the similar task
by mathematical treatment of a set of conventional voltammograms. Additionally, EVLS
allows also eliminating other sub-currents from the measured current-voltage curves. The
45
transformations used in EVLS are based on two assumptions. The first assumption is that the
total current I consists of component (particular) currents:
I
n
Ij
Id
Ic
Ik
.......
(1)
j 1
where Id is the diffusion current, Ic is the charging (capacitive) current and Ik is the kinetic
current. The second assumption is that each particular current can be expressed as the product
of two independent functions – the scan rate function Wj(ν) and the potential function Yj(E):
Ij
Y j (E) W j ( )
or
Ij
Y j (E)
x
(2)
Specifically, for the individual sub-current (diffusion, capacitive, kinetic):
Id
Yd ( E )
1/ 2
Ic
Yc ( E )
1
Ik
Yk ( E)
0
(3)
By solving the sets of combinations of eq. 1 and eq. 3 for individual voltammograms recorded
at different scan rates the transformed voltammograms can be obtained, in which some
current components are conserved and some eliminated. EVLS function eliminating the
kinetic and capacitive current components (Ik, Ic) and conserving the diffusion current (Id)
component (usually denoted as E4 in the associated literature) is the most widely used one to
study the redox processes.
Experimental
The electrochemical experiments were performed using a preliminary version of the
electrochemical analyzer developed within the framework of MPO FR-TI4/457 project. This
instrument can measure voltammograms/amperograms at current ranges from 10 pA to
0.1 mA with the smallest measurable value about 1 pA and highest measurable value of
1 mA. For current ranges above 1 µA, voltammetric scan rates up to 200 V.s-1 are available.
Ag/AgCl was used as a reference electrode (CHI111, CH Instruments, Inc.), platinum wire
served as an auxiliary and glassy carbon disk electrode (3 mm in diameter, CHI104, CH
Instruments, Inc.) as a working electrode. Working electrode was repolished using alumina
slurry (0.05 µm) on Microcloth pad (both Buehler, U.S.A.) before each scan. Voltammograms
of Trolox (Fluka) were measured in acetate buffer (pH 3.6, 50 mM) as a supporting
electrolyte prepared from acetic acid and NaOH (Lach-Ner, p.a.) in deionized water
(Millipore). The measurements were carried out at room temperature (25°C).
Results and discussion
A routine performing the elimination procedure on three voltammograms recorded at different
scan rates has been developed using NI Labview 2011 SP1, released as a part of the software
package of the analyzer and also as a standalone application. LabviewTM enables a rapid
application development by wiring graphical objects performing particular tasks, contrary to
conventional programming tools which use program code composed of individual textual
commands. The EVLS software consists of a front panel in which original set of
voltammograms and two elimination voltammograms are displayed in separate graphs, taking
the advantage of powerful Labview graphing options. A four-column ASCII file containing
common potential values in its first column and voltammograms’ current data in second to
fourth column serves as an input file. Two pre-defined sets of parameters belonging to
elimination functions E4 (only diffusion current is conserved provided that the set of
46
voltammograms belongs to a reversible electrochemical process) and E6 (only charging
current remains after the application of the elimination procedure in the case of a reversible
process) are available to obtain the aforementioned transformations. The predefined
parameters are valid for voltammograms recorded at scan rates of 2v, v and v/2 (“integer 2”),
where v is the base scan rate value; e.g. for 200 mV·s-1 base scan rate the input set of
voltammograms contains (in this order) current data for 400, 200 and 100 mV·s -1 in the
second, third and fourth column of the input data file. An important feature of the application
is the possibility to fine-tune the elimination parameters and to observe the impact of each
parameter’s change on the resulting elimination voltammograms in real time. A screenshot of
the EVLS application is shown in Fig. 1 with Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman2-carboxylic acid, a water-soluble derivative of vitamin E, Fig. 2) voltammograms as a
working example. In this particular transformation we used two elimination functions; except
for E4 which eliminates simultaneously I d + I k and conserves I c the E6 transformation was
also used, which conserves a background (capacitive) current in the case of a simple
reversible redox process:
E4. f ( I )
11.657 I1 2
E6. f ( I ) 4.8284I1 2
17.485 I
8.2426I
5.8284 I 2 ,
3.4142 I 2
f ( I ) is EVLS function, I is the total voltammetric current measured at reference scan rate,
I 1 2 and I 2 are total voltammetric currents measured at half and twice values of the reference
scan rate.
Fig. 1. A screenshot of EVLS software showing cyclic voltammograms of trolox (left) and
elimination voltammograms (E4 and E6, right).
47
HO
CH3
H3C
O
O
CH3
HO
CH3
Fig. 2. The structure of Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid).
While the E4 transformation yields a pair of sharp peaks easier to use for analytical purposes
than the original voltammograms, the E6 function reveals that the redox process does not
pertain to a simple redox transformation. Indeed, the electrochemical behavior of Trolox
(TrOH) 7 is characterized by the mechanism involving one electron oxidation (TrOH →
TrOH. + e-), followed by a rapid deprotonation TrOH. → TrO. + H+ and second electron
transfer TrO. → TrO+ + e-. TrO+ is subsequently transformed by a follow-up nucleophilic
reaction into a non-electroactive species.
For user’s convenience, several ways of handling the output data containing voltammograms
transformed by elimination procedures are available. Besides the classical Save data button,
the curves on graph can be transferred into Excel or into clipboard by right-clicking on graph
canvas and choosing Export data to clipboard / Excel from the shortcut menu.
Currently, the software is being further developed to be able to calculate the elimination
coefficients and to perform desired elimination procedure for a set of voltammograms with
arbitrary combination of scan rates. The final version of EVLS implementation will include
the sequence of steps, starting from the selection of scan rates, measurement of three
voltammograms using e.g. three electrodes in one body, postprocessing of the acquired
experimental data if necessary (smoothing or noise filtering), selection of desired elimination
procedure, calculation of the elimination coefficients corresponding to selected scan rates,
execution of the EVLS curve(s) calculation and displaying the results in a graph.
Conclusions
In this contribution the implementation of EVLS, as a mathematical procedure of processing
the voltammetric data, was discussed and a standalone windows application performing
EVLS was introduced. Until now, the individual steps leading to elimination voltammograms
were realized using macro commands in Excel. The new software is easily implementable
into software packages of the electrochemical workstations. The standalone version of the
software is available from the authors at no cost upon request.
Acknowledgements
This research was supported by the MPO FR-TI4/457 project from the Ministry of Commerce
and Trade of the Czech Republic, CEITEC – Central European Institute of Technology
Project CZ 1.05/1.1.00/02.0068, and by the project MUNI/A/0992/2009 of the Ministry of
Education, Youth and Sports of the Czech Republic. The authors wish also to thank the
Metrohm company for the possibility to present these results.
References
1. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996).
2. Trnkova L., Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996).
3. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000).
48
4.
5.
6.
7.
8.
Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001).
Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005).
Trnkova L.: Application of Elimination Voltammetry with Linear Scan in
Bioelectrochemistry, in Utilizing of Bio-Electrochemical and Mathematical Methods in
Biological Research (Eds.: Adam V., Kizek R.), p. 51. Research Signpost, Kerala, India,
2007.
Trnkova L., Jelen F., Ozsoz, M.: Electrochemical transducer for oligonucleotide
biosensor based on the elimination and adsorptive stripping techniques, in
Electrochemical DNA Biosensors, M. Ozsoz (Ed.). Pan Stanford Publishing, Singapore,
2012.
J. Malyszko, M. Karbarz: J. Electroanal. Chem. 595, 136 (2006).
49
Investigation of Complexes of Tebuconazole with Zinc
(Studium komplexů tebukonazolu se zinkem)
a
Michal Jakl , Renáta Norková b, Tomáš Navrátil c, Jana Jaklová Dytrtová b, and Jiří Balíka
a
Czech University of Life Sciences Prague, Faculty of Agrobiology, Food and Natural
Resources, Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Kamýcká 129,
165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo
náměstí 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic
c
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic
Abstract
Tebuconazole is one of the most utilized triazole pesticides in agriculture. Its stability is
highly affected by complexation with metals. Moreover, it creates more or less stable
complexes with essential elements that become unavailable to plants. In the system with
overabundant tebuconazole, an inert (very stable) complex with Zn was found. Elimination
voltammetry with linear scan was used for revealing of the electrode processes on the
mercury surface. The relatively slow kinetically controlled step in tebuconazole/Zn complex
formation indicates the great ability of Zn-tebuconazole system to react with more ligands.
Therefore, multiligand Zn-tebuconazole complexes with other ligands are expected in the
nature.
Key Words: Elimination voltammetry with linear scan, Voltammetry, Pesticide, Triazol,
Metal.
Úvod
Tebukonazol
(Teb;
(RS)-1-p-chlorofenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)pentan-3-ol) je velmi rozšířený fungicid používaný jak v zemědělství k ochraně celé řady
plodin (obilniny, chmel, réva vinná, ovocné stromy) proti plísním, tak i jako přípravek
k ochraně dřevěných povrchů.
Oproti tomu zinek je esenciální prvek, který bývá často pro plodiny (kukuřice, chmel, réva
vinná, ovocné stromy), především vlivem jeho snížené dostupnosti z půdy, v deficitu
narušujícím jejich základní životní funkce 1. Snížená biodostupnost Zn může být způsobena
tvorbou komplexů či nerozpustných solí s látkami přítomnými v půdě.
Na základě dříve realizovaných výzkumů bylo potvrzeno, že tebukonazol tvoří s kationty
kovů komplexy 2-4, čímž může po průniku do půdy snižovat biodostupnost jak esenciálních,
tak i rizikových prvků. Studiem komplexů tebukonazolu se kationty zinku (octanem
zinečnatým) v krystalech se zabývali Evans et al. 5. Z jejich výsledků plyne, že v krystalickém
stavu mají komplexy strukturu [ZnAc2(Teb)2], kde se dvě molekuly tebukonazolu váží přes
dusík v triazolové skupině a dvě molekuly octanu se váží přes kyslík; atom Zn je tak zcela
obklopen, což znemožňuje jeho interakci s okolím.
Tato práce se zabývá studiem komplexů tebukonazolu se zinečnatými ionty v roztoku pomocí
elektrochemických metod s uplatněním eliminační voltametrie s lineárním scanem
(EVLS) 6-11 pro popis dějů na rtuťové elektrodě. Díky této metodě lze eliminovat jednotlivé
proudy a na základě jejich průběhů v závislosti na potenciálu pak určit řídicí elektrodové
děje 9.
50
Experimentální část
Měření byla prováděna na počítačem řízeném analyzátoru PC-ETP (Polaro-Sensors, Praha)
vybaveném programem MultiElchem v. 2.3 (ÚFCHJH AVČR, v.v.i.) 12 a POLAR.PRO v. 5.1
(Polaro-Sensors, Praha) v tříelektrodovém zapojení na tužkové visící rtuťové kapkové
elektrodě (HMDE; Polaro-Sensors, Praha) vs. Ag/AgCl/KClsat. (10-20+; Elektrochemické
detektory, Turnov) s pomocnou Pt elektrodou, v základním elektrolytu 0,1 mol·L-1 KCl. Byla
použita diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie (DPASV) a katodická diferenční
pulsní voltametrie (DPCV). Pro určení dějů probíhajících na rtuťové kapce bylo využito
voltametrie s lineární změnou napětí (LSV) a EVLS 6.
Zásobní roztoky, ze kterých byly bezprostředně před vlastní analýzou míchány modelové
roztoky, byly připraveny ze ZnCl2 (99,999% TMB), tebukonazolu (PESTANAL®), HPLCgrade methanolu (vše Sigma-Aldrich, ČR), KCl (Suprapur®, Merck) a deionizované vody
(18,2 MΩ; Millipore Milli-Q).
Výsledky a diskuse
V rámci LSV byly zaznamenávány voltamogramy při polarizačních rychlostech 10 –
160 mV·s-1 (v násobcích 2). Při aplikaci EVLS při nižších rychlostech polarizace (10, 20 a
40 mV·s-1 byla zvolena referenční rychlost 20 mV·s-1 (Obr. 1a). Z voltamogramů
eliminovaných proudů (Obr. 1a) vypočtených na základě matematických vztahů 6 lze dovodit,
že pík 1 odpovídá difúzně řízenému procesu redukce volných zinečnatých iontů. Pík 2 lze
interpretovat dvěma způsoby: a) děj probíhající na elektrodě je redukce v adsorbovaném
stavu, na kterou navazuje další redukce, jejímž řídicím dějem je difúze, nebo b) jedná se o
difúzí řízený děj (u -1130 mV), za nímž následuje další difúzí řízený děj, kterému je
předřazena kineticky řízená reakce. Pokud byla aplikována EVLS při vyšších rychlostech
polarizace (40, 80 a 160 mV·s-1, při referenční rychlosti 80 mV·s-1; Obr. 1b), nebyl
zaznamenán již eliminační pík u -1130 mV a celý probíhající proces bylo možno popsat jako
difúzně řízený děj, kterému je předřazena kineticky řízená reakce. Z toho je možno usoudit, že
difúzně řízený děj u -1130 mV je pomalý.
a
I (nA)
40
0
1
2
-40
20 mV/s
Ic
Id
Ik
-80
-120
-1400
-1300
-1200
-1100
51
-1000
-900
E (mV)
-800
b
120
80 mV/s
Ic
Id
Ik
80
I (nA)
40
0
-40
1
2
-80
-1400
-1300
-1200
-1100
-1000
-900
-800
E (mV)
Obr. 1. Záznam LSV při polarizační rychlosti a) 20 mV·s-1, resp. b) 80 mV·s-1 a eliminační
voltamogramy při koncentraci Zn2+ 1·10-5 mol·L-1 a Teb 4·10-5 mol·L-1 v základním
elektrolytu 0,1 mol·L-1 KCl; Ic – kapacitní proud, Id – difúzní proud, Ik – kinetický proud.
Další informace o probíhajících dějích by mohla přinést DPASV. V případě, že by se jednalo
o případ bez účasti adsorpce, pak by registrovaný proud nezávisel na době akumulace.
V případě b by pak proud závisel na době akumulace. Pokud by se jednalo o redukci produktů
nějaké pomalé předchozí reakce, s rostoucí dobou akumulace by narůstalo také množství
produktů, které by se akumulovaly na elektrodě. V tomto případě se tedy nejspíše jedná o
variantu b, protože výška píku 2 se s rostoucí dobou akumulace nemění (Obr. 2).
a
2
120
I (nA)
120
1
b
I2
300s
80
I (nA)
80
120s
40
40
60s
30s
10s
I1
0s
0
-1200
-1100
-1000
0
-900
-800
E (mV)
0
100
tacc(s)
200
300
Obr. 2. a) Voltamogramy DPASV pro směs tebukonazol (5·10-5 mol·L-1) a ZnCl2
(1·10-7 mol·L-1) v základním elektrolytu 0,1 mol·L-1 KCl při různých dobách akumulace; Ein =
-1500 mV, Efin = -750 mV, Ea = -1500 mV, tacc = 0-300 s, rychlost polarizace 10 mV·s-1,
výška pulsu 50 mV, šířka pulsu 80 ms, klidový čas 15 s; b) Závislost výšek píků 1 a 2 na době
akumulace.
Další informace vedoucí k objasnění registrovaných dějů by mohly přinést výsledky získané
pomocí DPCV. Bylo zjištěno, že výška píku u ca. -1100 mV se s rostoucí koncentrací
zvětšuje (Obr. 3).
52
-60
-40
I (nA)
-80
-20
0
c teb
-1200 -1100 -1000
-900
-800
E(mV)
Obr. 3. Záznam DPCV voltamogramů při přídavcích tebukonazolu. Výchozí koncentrace
Zn2+ 1·10-6 mol·L-1 v základním elektrolytu 0,1 mol·L-1 KCl, poměry Zn2+ a Teb 1:1 až 1:100
s přídavky 10 µL Teb (10-3 a 10-2 mol·L-1), Ein = -750 mV, Efin = -1500 mV, rychlost
polarizace 10 mV s-1, výška pulsu -50 mV, šířka pulsu 80 ms, klidový čas 15 s.
Závěr
Redukce zinku, vázaného v komplexu s tebukonazolem, je reprezentována na voltamogramu
píkem u potenciálu přibližně -1100 mV na HMDE. Vrchol tohoto píku se posouvá s rostoucí
koncentrací zinku směrem k negativním potenciálům, zatímco redukční pík volných
zinečnatých iontů není potenciálově (ca. -900 mV) ani proudově závislý na koncentraci Zn2+.
Signál redukce iontů vázaných v komplexu je složen pravděpodobně z několika dílčích reakcí
řízených difúzí, přičemž alespoň jednomu z nich je předřazen kineticky řízený děj.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou grantů GA AV ČR (IAA400400806 a RVO61388963), GA ČR
(P206/11/1638 a P208/12/1645) a S grantu MŠMT ČR.
Literatura
1. Vaněk V., Balík J., Pavlíková D., Tlustoš P.: Výživa polních a zahradních plodin. Profi
Press, Praha 2007.
2. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Čadková E., Komárek M.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 25, 1037 (2011).
3. Jakl M., Jaklová Dytrtová J., Čadková E.: An electrochemical approach to study biscoordinated copper/tebuconazole complexes. BEST servis, Ústí nad Labem, Jetřichovice
2011.
4. Norková R., Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D.: Water, Air, Soil Pollut. in press
(2012).
5. Evans P. D., Schmalzl K. J., Forsyth C. M., Fallon G. D., Schmid S., Bendixen B.,
Heimdal S.: J. Wood Chem. Technol. 27, 243 (2007).
6. Dračka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996).
7. Skopalová J., Navrátil T.: Chemia Analityczna (Warsaw) 52, 961 (2007).
8. Sander S., Navrátil T., Novotný L.: Electroanalysis 15, 1513 (2003).
9. Trnková L., Kizek R., Dračka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000).
10. Trnková L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005).
11. Serrano N., Klosová K., Trnková L.: Electroanalysis 22, 2071 (2010).
12. Navrátil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009).
53
Optimization of a Flow Rate for a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray
Ionization Mass Spectrometry
(Optimalizace průtoku pro spojení amperometrie s hmotnostní spektrometrií s ionizací
elektrosprayem)
a
Jana Jaklová Dytrtová , Michal Jakl b, Renáta Norková a, and Tomáš Navrátil c
a
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí
2, 166 10 Prague 6, Czech Republic, [email protected]
b
Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Faculty of Agrobiology,
Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences Prague, Kamýcká 129,
165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic
c
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic
Abstract
The hyphenation of an electrochemical cell prior to mass spectrometer with electrospray
ionization allows studying of products and/or of intermediates of electrode reactions. The
measurement is realized in a flowing system. The flow rate of the sample markedly influences
the MS signal intensity of the product. The calculated optimum value for the electrochemical
cell with the sweep volume 0.72 µL is in the range from 0.4 to 0.5 mL h-1. The experimental
optimal value is 0.45 mL h-1. The optimization of the flow rate has to be provided individually
for each product, because the intensity also depends on the rate of the electrode reaction and
product stability.
Key Words: Electrochemistry, Amperometry, ESI-MS, Tebuconazole, Copper, Silver.
Úvod
Spojení elektrochemických metod (EC) a elektrospraye s hmotnostní detekcí (ESI-MS) je
v současnosti velmi slibným cílem 1-4. Lze tak rozšířit využití EC metod zejména ke
kombinovanému studiu elektrochemických reakcí či k přímému studiu produktů těchto reakcí
5
.
Spojení EC s ESI-MS má samozřejmě několik omezení, které vycházejí z experimentálního
uspořádání obou metod 6-8. Cílem této studie bylo optimalizovat průtok vzorku obsahujícího
tebukonazol pro experimentální uspořádání: elektrochemická cela následována
electrosprayem s hmotnostní detekcí.
Experimentální část
Konstrukce cely (Obr. 1a) byla použita stejná jako bylo popsáno v cit. 9, 10, pro jejíž vnitřní
objem byl spočítán optimální průtok 0,4 až 0,5 mL h-1. Tělo cely bylo zhotoveno
z fitinkového kříže (P-729 PEEK Cross 0.020” thru-hole with F-300 Fittings, Upchurch
Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science), jehož efektivní objem je 0,72 µL. Přívod a
odvod vzorku do/z cely byl realizován kapilárou o průměru 0,25 mm (Upchurch Scientific
Rheodyne, IDEX Health & Science). EC cela pracovala v dvouelektrodovém zapojení
počítačem řízeného polarografického/voltametrického analyzátoru (PC-ETP, Polaro-Sensors,
ČR), s programem MultiElchem 2.3 (ÚFCHJH AVČR, v.v.i., ČR) 11 a POLAR.PRO 5.1
(Polaro-Sensors, ČR). Měděný drát (průměr 1 mm, Lachema, ČR) a stříbrný drát (průměr
1mm, Goodfellow, USA) byly použity jako elektrody. Ty jsou v cele umístěny naproti sobě,
což zaručuje rovnoměrnou polarizaci elektrod a minimální nekompenzovaný ohmický spád
(Obr. 1b). Z důvodů kompatibility EC s ESI-MS bylo nutné použít průtok cca 0,5 mL h-1. Při
takto nízkém průtoku nabývá tloušťka hydrodynamické hraniční vrstvy milimetrových
rozměrů 12. Problém byl částečně minimalizován použitím elektrod malých průměrů 13.
54
K míchání bylo dále využito turbulencí v proudícím roztoku, které vznikající na elektrodách
vyčnívajících do roztoku (Obr. 1b).
Vzorek byl připraven ze zásobního roztoku tebukonazolu v methanolu (10-2 mol L-1),
0,1 mol L-1 vodného roztoku acetátového pufru, 99,9% methanolu (vše Sigma-Aldrich, ČR) a
deionizované vody. Použitá koncentrace tebukonazolu ve vzorku byla 2,5 10-4 mol L-1 a
koncentrace acetátového pufru 25 mmol L-1. Vzorek byl dodáván vždy s kontinuálním
průtokem z Hamiltonovy stříkačky (Thermo Fisher Scientific, ČR) pomocí pumpy
(KD Scientific, USA).
a
b
Obr. 1. (a) Zapojení elektrochemické cely; (b) Schéma umístění elektrod v cele, vznik
turbulentního proudění na nerovnostech.
Pro optimalizaci podmínek průtoku bylo využito akumulačního kroku, při němž byla
oxidována pracovní elektroda a na ní se vytvářely komplexy tebukonazolu (1). Tyto byly
odnášeny proudícím elektrolytem a následně byly zaznamenávány změny v intenzitě
komplexů metodou ESI-MS. Při vkládání kladného potenciálu (700 mV) byl pomocí ESI-MS
detekován [Cu(1)]+, při vkládání záporného potenciálu (-850 mV) byl detekován [Ag(1)]+.
[Cu(1)]+ je jedním z komplexů tebukonazolu s mědí 14. Měď se zde vyskytuje jako Cu+,
protože během procesu elektrospraye 15 a také během reakce s tebukonazolem 14 dochází
k redukci mědi z Cu2+ na Cu+. Následně získaný DC voltamogram sloužil k posouzení vlivu
průtoku na elektrochemickou reakci. Polarizační rychlost byla 50 mV s-1.
ESI-MS experimenty byly provedeny na hmotnostním spektrometru s iontovou pastí (Thermo
Finnigan LCQ Advantage MS System; ThermoFinnigan, USA) se zdrojem elektrospraye
s možností polarizace v záporném i pozitivním modu 16. Optimalizované podmínky pro
detekci [Cu(1)]+, byly následující: napětí ve sprayi 5,0 kV, napětí na kapiláře 100 V, teplota
v kapiláře 250°C, průtok ochranného a pomocného plynu 10–50 arbitrárních jednotek.
Výsledky a diskuse
Obr. 2 ukazuje závislost logaritmu intenzity [Cu(1)]+, jehož velikost je závislá na efektivitě
elektrodové reakce (Cu0 → Cu2+) a přítomném množství [Na(CH3COONa)4]+, který pochází
ze základního elektrolytu a není zavislý na průběhu elektrodové reakce. Z Obr. 2 je patrné, že
již průtok 0,2 mL h-1 poskytuje signál dostatečné intenzity. Nejvyšší intenzita [Cu(1)]+
vztažená k intenzitě [Na(CH3COONa)4]+ byla získána pro průtok 0,45 mL h-1. Proto se tato
hodnota zdála být optimální.
55
log (intenzita)
7
6
[Na(CH3COONa)4]
5
+
+
[Cu(1)]
0,0
0,2
0,4
0,6
-1
průtok (ml h )
0,8
Obr. 2. Závislost logaritmu intenzity [Cu(1)]+ a intenzity [Na(CH3COONa)4]+ na rychlosti
průtoku vzorku.
norm. intenzita
Výsledný signál [Cu(1)]+ je tedy ovlivněn zejména (i) efektivitou elektrodové reakce, která je
vyšší při nízkých průtocích, a (ii) množstvím prošlého vzorku; s vyšším průtokem stoupá i
intenzita. Tento trend je patrný i z Obr. 3.
45
40
35
30
0,2
0,3
0,4
-1
mL h
0,5
0,6
+
Obr. 3. Závislost normalizované intenzity [Cu(1)] na průtoku vzorku.
Na získaných voltamogramech (Obr. 4) je patrné, že se zvyšujícím se průtokem vzorku klesá
redukční pík (při -500 mV), což potvrzuje předpoklad (i). Oproti tomu situace během oxidace
není na první pohled jednoznačná. Při průtocích do 0,3 mL h-1 je okolo potenciálu 0 mV
patrný pík. Se zvyšujícím se průtokem (nad 0,35 mL h-1) tento pík narůstá, mění svůj tvar (zdá
se, že obsahuje více než jeden pík) a posouvá se ke kladnějším potenciálům. Pro průtok 0,45
mL h-1 se tvar oxidačního píku blíží tvaru píku získaného při nízkých průtocích. Tímto tedy
byla ověřena experimentálně vhodnost průtoku 0,45 mL h-1. Přičemž toto je hodnota
z intervalu vypočítaného optimálního průtoku pro daný objem cely.
Závěr
Zapojení elektrochemické cely před hmotnostní spektrometr s ionizaci elektrosprayem skýtá
velký potenciál pro možnosti studia produktů i meziproduktů elektrodových reakcí. Měření je
realizováno v průtoku, jehož hodnota značně ovlivňuje nejen intenzitu specií přítomných ve
vzorku, ale především intenzitu specií vzniklých během elektrodové reakce. Hodnotu průtoku
je třeba optimalizovat pro každý produkt elektrodové reakce zvlášť, protože výsledná
intenzita je zejména ovlivněna rychlostí vzniku tohoto produktu, případně jeho stabilitou.
56
15
-1
i/ A
0,35-0,43 mL h
-1
0,47-0,60 mL h
10
-1
0,25-0,30 mL h
-1
0,45 mL h
5
0
-5
-500
0
E/mV 500
1000
Obr. 4. Voltamogramy 700 až -850 mV pořízené při různých průtocích vzorku. Polarizační
rychlost 50 mV s-1.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou grantů GA ČR (P208/12/1645), GA AVČR (IAA400400806 a
RVO61388963) a S grantu MSMT ČR.
Literatura
1. Jaklová Dytrtová J., Šestáková I., Jakl M., Navrátil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009).
2. Navrátil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009).
3. Šestáková I., Navrátil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005).
4. Čížková P., Navrátil T., Šestáková I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007).
5. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Navrátil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2970 (2011).
6. Ma L., Iezzi M., Kaucher M. S., Lam Y. F., Davis J. T.: J. Am. Chem. Soc. 128, 15269
(2006).
7. Blades A. T., Ikonomou M. G., Kebarle P.: Anal. Chem. 63, 2109 (1991).
8. Arakawa R., Abura T., Fukuo T., Horiguchi H., Matsubayashi G.: Bull. Chem. Soc. Jpn.
72, 1519 (1999).
9. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D.: Modern Electrochemical Methods XXX,
Jetřichovice, (Eds: Navrátil T., Barek J.), BEST servis, Ústí nad Labem, p. 89,
Jetřichovice 2010.
10. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D.: Modern Electrochemical Methods XXXI,
Jetřichovice, (Eds: Navrátil T., Barek J.), BEST servis, Ústí nad Labem, p. 69,
Jetřichovice 2011.
11. Navrátil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009).
12. Gunasingham H., Fleet B.: Anal. Chem. 55, 1409 (1983).
13. Gunasingham H.: Anal. Chim. Acta 159, 139 (1984).
14. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Čadková E., Komárek M.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 25, 1037 (2011).
15. Tintaru A., Charles L., Milko P., Roithová J., Schröder D.: J. Phys. Org. Chem. 22, 229
(2009).
16.
der D., Charles L., Jusinski I.
M.: J. Phys. Chem. 112, 12097 (2008).
57
Electrochemistry of Polynitrocalix-[4]-arenes
(Elektrochemie polynitro-kalix-[4]-arenů)
Alan Liška and Jiří Ludvík
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejskova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Calix[4]arene is a suitable inert and stable frame for building "smart" molecules and
supramolecular assemblies. Polynitrocalix[4]arenes where reducible nitro groups are located
at the upper rim are promising precursors for aimed development of sensors. In this work a
series of mono-, di-, tri- and tetra nitroderivatives was reduced, the sequence of individual
steps was described and the mechanism discussed. It was found that in this molecule with
several redox centers all nitro groups are electronically isolated and thus are reduced
independently yielding poly-radical ions. Two different couples of equivalent nitro groups
were proved in tetranitro derivatives. The experimental results were confirmed by quantum
chemical calculations.
Introduction
During last ten years, design of various sensors including anion or cation receptors have
become one of the most investigated and fast developing area of analytical chemistry1-2. The
specific formation of a complex between a receptor and an analyzed anion (or cation),
accompanied by a change of an optical or electrochemical response, is the main goal of this
research. Calixarenes 3-7 – cyclic compounds prepared by a condensation procedure between
p-tert.butylphenol and formaldehyde– have suitable properties for this use. The number of
phenol units in a molecule is depicted in brackets – in this work only calix[4]arenes will be
used.
Calix[4]arenes may occur in four possible conformations: cone, partial cone, 1,2-alternate
and 1,3-alternate (Fig. 1). A calix[4]arene unsubstituted at the lower rim is conformationally
mobile and in solution an equilibrium mixture of conformers is formed (by oxygen-throughthe-annulus mechanism) 8. However, by an appropriate substitution with bulky substituents
(for example propyl or 2-ethoxy group) a desired conformer may be obtained and stabilized
(in this study only compounds with fixed cone conformation were used. The oxygen at the
lower rim can be substituted by another nucleophile (e.g. nitrogen) under formation of a
polydentate ligand cavity being able to coordinate cations. In the case of a modification of the
lower rim by thiols, a self-assembled monolayer can be formed at a gold electrode.
HO
HO OH
HO
OH HO
OH
cone
HO
partial cone
OH
OH HO
HO
OH HO
OH
HO
1,2-alternate
1,3-alternate
Fig. 1. Calix[4]arene and its four possible conformers.
58
A possibility which attracts our attention is to substitute the upper rim by electrochemically
reducible nitro groups. This choice has several reasons: a) calixarenes are not
electrochemically active; b) by reduction of the nitrogroup, an imino-intermediate or aminoproduct is formed which is able to serve as a ligand or as a precursor for further prolongation
of the pendant being able to form a hosting space for analyzed molecules.. The aim is to
design an electrosynthetic “one-pot” procedure of calixarenes modification.; c) a calixarene
substituted by several nitro groups represents a molecule having specific properties due to
multiple redox centers. The presence of four nitro groups in tetranitrocalixarene molecules
provokes many principal questions: Are they reduced simultaneously or stepwisely? Which
part of the molecule is reduced first? How the nitro groups influence each other? What is the
impact of the reduction on the molecular geometry? What are the properties or reactivity of
poly-radical anion intermediates? What is the role of the lower rim substitution in the
reduction of the nitro groups?
Since the number of published papers dealing with electrochemical studies of calixarenes is
very scarce and only several contributions is devoted to electrochemical oxidation of nonsymetric sulfonated or hydroxylated calixarenes, the aim of this contribution is to use the nitro
groups as “electrochemical probes” in order to answer the above mentioned fundamental
questions. In order to stabilize radicalic species, the reduction experiments were performed in
aprotic media.
Experimental
Acetonitrile (AN) 99.8% Lachema, dried by distillation with P2O5, or dimethylformamide
(DMF) dried by azeotropic distillation with benzene and water were used as solvents,
tetrabutylammonium hexafluorophosphate (TBAHFP)
pure, Fluka, recrystalized from
EtOH, or tetrabutylammonium tetrafluoroborate, (TBATFB) pure, Fluka served as
electrolytes in conc. 0.1M. Seven nitrocalix[4]arenes were received from the Department of
organic chemistry at the Prague Inst. of Chem. Technology (Prof. P. Lhoták) or from the
department of inorganic chemistry at the Faculty of Sciences, Charles University Prague
(Prof. P. Vojtisek) and used in conc. 0.1-1 mM. They involve four tetranitro derivatives with
different lower rim (II-V) and a series of tetra-, tri- di- and mono-nitroderivatives with the
same lower rim (V-VIII) – cf. Table I. The model compound (I) was prepared in our
laboratory by a standard procedure. The solutions were deaerated by argon before the
experiment.
The measurements proceeded in a two-compartment cell with separated reference electrode,
using the potentiostat Polarographic analyzer PA3 (Laboratorní přístroje Praha) equipped with
an XY-recorder. A three-electrode system was used for dc-polarographic and
cyclovoltammetric (CV) experiments with dropping mercury electrode (DME), hanging
mercury drop electrode (HMDE) or stationary platinum disk as working electrodes, platinum
wire as auxiliary electrode and saturated calomel electrode (SCE) as a reference.
Results and discussion
"Monomer" model
Before the investigation of the authentic nitrocalix[4]arenes, the electroreduction of a model
compound - 1-methoxy-2,5-dimethyl-4-nitrobenzene (I), representing one building block of
studied molecules was electrochemically reduced in DMF under the same conditions. The
behaviour corresponds to the literature about reduction of nitroaromates in aprotic media 9 and
the mechanism of a 1-electron reversible process followed by an irreversible 3-electron one,
was obtained.
59
R-Ph-NO2 + e‾  [R-Ph-NO2]‾•
E1- reversible
[R-Ph-NO2]‾• + 3 e‾ + 4 SolvH  R-Ph-NHOH + H2O + 4 Solv‾
Table I
Studied compounds and their electroreduction potentials.
No. upper rim
lower rim
E1
E2
Ia
NO2
p-O-Me
-1.16
II
4x NO2
4x -O-Me
-1.17 -1.34
III
4x NO2
4x -O-Oct
-1.15 -1.41
IV
4x NO2
4x -O-CH2-COOEt -1.14 -1.35
V
4x NO2
4x -O-Pr
-1.16 -1.41
VI
3x NO2
4x -O-Pr
-1.19 -1.41
VII 2x NO2
4x -O-Pr
-1.19 -1.38
VIII 1x NO2
4x -O-Pr
-1.25
a
the model compound – a "monomer" building block
E3
E2-E1
E3
E3-E2
0.17
0.26
0.21
0.25
0.22
0.19
-2.13
-2.44
-2.59
-2.50
-2.53
-2.38
-2.40
-2.27
1.10
1.18
1.15
1.12
0.97
1.02
1.03
(1)
(2)
Tetranitrocalix[4]arenes
The polarographic reduction of the tetranitrocalix[4]arenes (II-V) starts always with two 2electron fully reversible waves E1 and E2 (the reversibility was proved by cyclic voltammetry
even at the scan rate of 50 mV/s). This fact excludes the model of four equivalent nitro groups
on the upper rim because two nitro groups are reduced more easily than the other two. The
limiting current of each wave corresponded to two electrons (in comparison with the oneelectron reduction wave of the standard I). It is evident that this four-electron reversible
reduction represents four one-electron reversible electron transfers giving the corresponding
stable anion radical of each nitro group; hence, tetranitro tetraanion tetraradical is formed. The
finding, that two one electron reductions proceed at a single potential shows that two
equivalent non-interacting nitro groups are reduced and the observed two-electron reversible
wave is, in fact, a one-electron reversible wave of double concentration. The presence of two
such processes means that two different couples of two equivalent nitrogroups are reduced.
This finding, however, suggests that in the solution the upper rim of calixarenes cannot have
the C4 symmetry and two types of nitro groups with different properties and reduction
potentials exist.
This electrochemical result is in full agreement with the x-ray crystal structure analysis: the
“calix” in crystal as well as in the solution has a pinched shape with a "π-stacking" of the
opposite benzene rings. Two nitrobenzenes are thus practically parallel whereas the other two
are nearly in a plane. At more negative potentials a single, broad and irreversible
multielectron wave E3 appears, the limiting current of which corresponds approx. to 12
electrons (4x 3 electrons). This observation suggests that the four nitro radical anions are
further independently reduced according to the expected mechanism "1+3" 9 by other three
electrons, each yielding the tetra hydroxylamino derivative, either at the same potential or at
potentials very close to each other. Due to the broadness of this wave and proximity to the
cathodic potential limit, it is impossible to distinguish these two possibilities.
60
Mono-, Di-, Tri- and Tetranitro derivatives
Besides various tetranitro derivatives, we investigated also mono-, di- and trinitro[4]calix
arenes with the same lower rim substituent, enabling their mutual comparison in the
homologous series V-VI-VII-VIII.
The mononitro calix[4]arene VIII is reduced just in the same way as the above mentioned
monomeric model molecule (I): a one-electron reversible wave is followed by a three electron
irreversible one. The first reduction potential of the compound VIII is localized between the
first and the second reduction of all other calixarenes, the three-electron wave is about 0.2 V
less negative. As a result, however, the potential difference between the processes E1 and E3
in compound VIII is the same like the difference between E2 and E3 in all other calixarenes.
The 1,2-dinitro calix[4]arene (VII) is bearing two different nitro groups due to the pinched
shape. As a result, two reversible one-electron reduction waves separated by ca. 200 mV were
observed. About one volt more negatively a single six-electron irreversible wave appeared
corresponding to simultaneous reduction of two nitro radical anions. The compound VII
behaves similarly like tetranitro calixarenes I - IV, but with the half current.
The reduction of trinitro calix[4]arene (VI) fits well to the suggested model: Since it contains
two equivalent and one different nitro groups, the reduction process starts with a two-electron
reversible wave which is followed ca. 200 mV more negatively by a one-electron reversible
step. These three reversibly transferred electrons represent a formation of a tris-radical anion
which is reduced at about -2.4 V in a single nine-electron irreversible wave.
The reduction of the tetranitro calix[4]arene V was already discussed and fits to the suggested
pattern.
Fig. 2. Schematic picture of polarographic waves of compounds I, V-VIII.
The values of all reduction potentials are summarized in the Table I and the polarographic
curves are schematically presented at the Fig. 2. Striking (remarkable) feature following from
the table is that the respective reduction potentials of all polynitrocalixarenes (II-VII) are very
similar: The first reduction E1 is around -1.17 V (± 0.02 V), the second one E2 occurs at
about -1.38 V (±0.03V) and the broad wave E3 is always near to -2.46 V (± 0.08V). Thus, the
potential differences E1-E2 and E2-E3 remain approximately the same. This finding says that
the neither the number of nitro groups at the upper rim, nor the different substitution at the
lower rim (namely its volume) play an important role in reducibility of the whole molecule.
Due to a relatively rigid and electronically non-conjugated skeleton of calix[4]arenes, the
nitro groups on the upper rim do not interact electronically along the bonds in any stage of
their reduction with the neighboring parts of the molecule.
61
Theoretical treatment
In order to check the relevance of the presented interpretation of electrochemical data and in
order to answer the question put in the introduction about the sequence of the reduced nitro
groups, quantum chemical calculations of the tetranitrocalixarenes as well as of all radical
intermediates have been performed. At the Fig. 3, the localization of HOMO and LUMO in
the dianion-biradical of the parent tetranitrocalixarene shows unambiguously that the first
reductions occur at the distant nitrogroups.
Fig. 3. Localization of HOMO (left) and LUMO (right) in dianion-biradical of the parent
tetranitro[4]calixarene
Conclusions and perspectives:
The first electrochemical investigation of polynitrocalix[4]arenes was performed. The
“pinched” shape of calix[4]arenes in the solution was experimentally proved showing that the
nitrogroups exist in two energetically different forms, where a π-stacking of two opposite
parallel rings makes their reduction more difficult. It was found that in the frame of tetranitro
calix[4]arenes no electron delocalization takes place and the nitrogroups do not mutually
interact. This is the reason for formation of various stable multi-radical intermediates. Their
existence was supported by quantum chemical calculations.
The recent preliminary experiments show that the reduced form of calix[4]arenes interact with
alkali metals. This feature is continuously studied aiming to the explanation of this effect and
to design of a respective sensor.
Acknowledgement: The authors are grateful to prof. Al Fry (Wesleyan University,
Middletown, Connecticut, USA) for quantum chemical calculations and prof. P. Lhoták and
P. Vojtíšek for granting the compounds. This work is supported by the grant KONTAKT ME
09002 (MŠMT).
References
1. Beer P. D., Gale P.: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 486 (2001).
2. Schmidtchen F. P., Berger M.: Chem. Rev. 97, 1609 (1997).
3. Gutsche C. D.: Calixarenes. Monographs in Supramolecular Chemistry. The Royal
Society of Chemistry, (Stoddart J. F., Ed.), Cambridge 1989.
4. Kyrš M., Svoboda K., Lhoták P., Alexová J.: J. Radioanal. Nucl. Chem. 258, 497 (2003).
5. Lhoták P., Zieba R., Hromádko V., Stibor I., Sýkora J.: Tetrahedron Lett. 44, 4519
(2003).
6. Dudič M., Lhoták P., Stibor I., Lang K., Prošková P.: Org. Lett. 5, 149 (2003).
7. Šťastný V., Lhoták P., Michlová V., Stibor I., Sýkora J.: Tetrahedron 58, 5475 (2002).
8. Shinkai S., Ikeda A.: Chem. Rev. 97, 1713 (1997).
9. Lund H.: Cathodic Reduction of Nitro and related Compounds. Organic
Electrochemistry. Fourth Edition, (Lund H., Hammerich O., Eds.), p. 389 and following.
Marcel Dekker, New York 2001.
62
Redox Behavior of New Quinolone Derivatives Studied by in situ ESR-UV-VIS
Spectroelectrochemistry
(Použití in situ ESR-UV-VIS spektroelektrochemie k objasnění redoxního chování
nových chinolonových derivátů)
Karol Lušpai, Peter Rapta, Vlasta Brezová, and Andrej Staško
Institute of Physical Chemistry and Chemical Physics, Faculty of Chemical and Food
Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, SK-812 37
Bratislava, Slovak Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
In situ spectroelectrochemistry brings new dimensions into a conventional electrochemical
experiment. Quinolone derivatives are for many years well known and important group of
drugs. Two groups of novel quinolone derivatives with various structure and substituents were
studied by spectroelectrochemical techniques in order to better understand their redox
behavior. ESR spectroscopy provides valuable information about paramagnetic species
(radical ions) generated upon electrochemical oxidation/reduction. On the basis of spectral
and electrochemical data we proposed the mechanism of electrochemical reduction of
presented quinolone derivatives.
Key Words: Spectroelectrochemistry, Cyclic Voltammetry, ESR, EPR, UV-VIS, Quinolones,
Selenadiazoloquinolones.
Introduction
In situ spectroelectrochemistry represents conventional electrochemistry enriched by different
spectral methods, i.e., the products of electrochemical reactions on working electrode are
simultaneously detected by spectroscopical techniques. Most often spectral method for use in
spectroelectrochemistry is ESR or UV-VIS-NIR spectroscopy 1,2. Other techniques, like IR,
Raman spectroscopy, can be also used, but more complicated and expensive equipment is
needed 3. Every additional spectral technique used in the spectroelectrochemical
investigations brings one more dimension to the electrochemical experiments. Therefore
spectroelectrochemistry is very useful for investigation of complex reaction mechanisms with
variety of consecutive reactions. Quinolone derivatives are for many years group of wellknown therapeutic agents 4. The understanding of the electrochemical reduction mechanism
of quinolones can bring, along with photochemical research 5, more light into their reactions
coupled with electron transfer.
Experimental
The spectroelectrochemical experiments were carried out in special flat (0.1 mm cell path
length) spectroelectrochemical cell (Fig. 1, left), suitable for an optical transmission ESR
resonator (ER 4104OP) of X-band ESR spectrometer Bruker EMX, Germany. The working
electrode was laminated Pt mesh with small hole in the foil serving for light beam and for
limiting the active surface area of the electrode. Pt wire as auxiliary (counter) electrode and
Ag wire covered by oxides layer as pseudoreference electrode, were used. Because of using
pseudoreference electrode, all potentials were recalculated vs. ferrocene/ferrocenium (Fc/Fc+)
redox couple on the basis of the performed cyclovoltammetric measurements in the presence
of ferrocene internal standard. Both spectroelectrochemical and cyclovoltammetric
experiments were carried out under inert argon atmosphere. Potentiostat Heka PG285,
Lambrecht, Germany was used. Optical ESR resonator cavity was connected to the diodearray UV-VIS spectrometer Sentronic S2000 by using optical fibers. Deuterium-halogen lamp
DH 2000 (Sentronic, Germany) was used as a light source. Dimethylsulphoxide (DMSO) of
SeccoSolv® quality was purchased from Merck and used in all experiments as received.
63
Tetrabuthylammonium hexafluorophosphate (TBAPF6) from Fluka dried in vacuum oven for
16 hours at 120°C was used as supporting electrolyte.
Fig. 1. Scheme of the ESR-UV-VIS spectroelectrochemical experiment.
Investigated quinolones were synthesized at Department of Organic Chemistry, Catalysis and
Petrochemistry, Slovak University of Technology [7]. Quinolone concentration of 10–4 M and
10–3 M in DMSO was used in cyclic voltammetry and spectroelectrochemistry, respectively.
Due to the limited solubility of quinolones their saturated solutions were prepared.
Results and discussion
Four representative derivatives of quinolone derivatives (selenadiazoloquinolones) EQ1,
EQN1, SeQ1, SeQN1 (Scheme 1, left) were chosen to study the mechanism of their
electrochemical reduction with aim to obtain the relationship between their molecular
structure and electrochemical behavior. The cyclic voltammetry of the samples EQ1 and
EQN1 possessing ethyl substitution at nitrogen atom of 4-pyridone ring shows only one
reversible peak in the cathodic part (not shown). For these samples with substituted nitrogen
(EQ1 and EQN1) a formation of the stable radical anion in the region of the first reversible
reduction step was confirmed by ESR spectroelectrochemistry. High stability of the
corresponding radical anions is probably due to the steric effect of bulky substituent on the
nitrogen (see Scheme 1).
Samples from series SeQ and SeQN show similar redox behavior upon reduction.
Characteristic cyclic voltammogram (CV) for this series of quinolones is shown in Fig. 2 for
SeQ1 reduction in TBAPF6/DMSO. The first reduction step is irreversible and is followed by
the nearly reversible reduction step at more negative potentials. During the second and the
third cyclovoltammetric cycle for the same sample, the current of the first irreversible CV
peak decreases. This indicates the consecutive chemical reactions of the formed radical anions
near the electrode surface. We propose that for all investigated quinolone samples the first
reduction step is associated with the formation of radical anion. However, the stability of this
radical anion for samples SeQ1 and SeQN1 with imine groups is too low and was not
observed in ESR spectroelectrochemistry at the first reduction peak.
64
2
1
0
3
-1
I/ A
2
-2
1
-3
-4
-5
-6
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
+
E / V vs. Fc/ Fc
Fig. 2. Cyclic voltammetry (three repeated scans) of 10–3 M SeQ1 sample in 0.1 M TBAPF6
in DMSO (scan rate 100 mV s–1).
We assume that the radical anions generated upon cathodic reduction of SeQ1 and SeQN1
(SeQ) undergo consecutive dimerization reaction leading to the dimer dianion (Scheme 1,
right) [5].
Scheme 1. Schematic structure of the investigated selenadiazoloquinolone samples and the
reaction mechanism proposed for their electrochemical reduction in non aqueous media.
This dimer dianion can be reduced to the stable dimer radical trianion in the region of the
second reversible (or quasireversible for some samples) cathodic voltammetric peak at more
negative potential comparing to the first reduction peak. The generation of stable radical at the
second voltammetric peak was unambiguously confirmed by in situ ESR
spectroelectrochemical experiment as shown in Fig. 3 for SeQ1N sample in 0.2 M TBAPF6 in
65
DMSO (scan rate 4 mV s–1). Interestingly, the dimer dianion can be reversibly reoxidized
back to the neutral initial compound at strongly anodically shifted potentials (Fig. 3c) what
clearly indicates that the proposed dimer dianion is of sigma type dimer ( -dimer). It should
be noted that complexity of the cyclovoltammetric curve in the anodic part indicates also
other follow up products in addition to the dimers.
a)
10
b)
10
0
0
-10
-10
I/ A
I/ A
-20
-30
-20
-40
-30
-50
-60
-2.6
-2.4
-2.2
-2.0
-1.8
-1.6
E / V vs. Fc/Fc
c)
-1.4
-1.2
-40
-2.6
-1.0
-2.4
-2.2
+
-2.0
-1.8
-1.6
E / V vs. Fc/Fc
60
d)
-1.4
-1.2
-1.0
-1.4
-1.2
-1.0
+
50
0
40
I/ A
I/ A
-50
20
-100
0
-150
-20
-200
-1.5
-1.2
-0.9
-0.6
-0.3
E / V vs. Fc/Fc
0.0
0.3
0.6
-2.6
+
-2.4
-2.2
-2.0
-1.8
-1.6
E / V vs. Fc/Fc
+
Fig. 3. In situ cyclic voltammograms of SeQ1N sample taken during spectroelectrochemical
experiment (scan rate 4 mV s–1, Pt-mesh working electrode) with representative ESR spectra
measured in the region of the second cathodic peak during the (a) first, (b) second, (c) back
reoxidation and (d) third voltammetric scan.
Conclusions
On the basis of the EPR spectroelectrochemical measurements possible reaction mechanisms
for quinolones under study was proposed. The results confirmed the importance of nitrogen
substitution (R) at nitrogen of 4-pyridone ring and its influence on stability of the radical
anions generated from selenadiazoloquinolones SeQ, SeQN, EQ and EQN by electrochemical
reduction. For quinolone derivatives with unsubstituted nitrogen stable sigma dimer dianion is
formed from the corresponding primarily formed radical anions. Dimer-dianion can be
reversibly reoxidized back at strongly positively shifted potential comparing to the monoanion
reduction peak.
Acknowledgement
This study was financially supported by the Scientific Grant Agency (Project VEGA
1/0289/12) and the Research and Development Agency of the Slovak Republic (contract No.
APVV-0339-10). Maroš Bella and Viktor Milata are gratefully acknowledged for
selenadiazoloquinolones synthesis.
66
References
1. Gale R. J.: Spectroelectrochemistry: Theory and Practice. New York: Plenum Press 1988.
2. W. Kaim, A. Klein: Spectroelectrochemistry. Cambridge: RSC Publishing 2008.
3. Dunsch L.: J. Solid State Electrochem. 15, 1631 (2011).
4. Boteva A., Krasnykh O.: Chem. Heterocycl. Compd. 45, 757 (2009).
5. Nishinaga T., Komatsu K.: Org. Biomol. Chem. 3, 561 (2005).
6. Barbieriková Z., Bella M., Kučerák J., Milata V., Jantová S., Dvoranová D., Veselá M.,
Staško A., Brezová V.: Photochem. Photobiol. 87, 32 (2011).
7. Bella M., Schultz M., Milata V., Koňariková K., Breza M.: Tetrahedron 66, 8169 (2010).
67
Determination of Midazolam by HPLC with UV Detection and by GC with NitrogenPhosphorus Detector in Rabbit Plasma
(Stanovení anestetika midazolamu pomocí HPLC s UV detekcí a GC s dusíkofosforovým detektorem v krvi králíka)
Jana Matějčková a, Martin Jaček a, Jiří Málek b, and Eva Samcová a
a
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Department of Biochemistry, Cell
and Molecular Biology, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic
E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Anaesthesiology and
Resuscitation, Šrobárova 50, 100 34 Prague 10
Abstract
A HPLC method with UV detection and GC method with nitrogen-phosphorus detector for
determination of anesthetic midazolam were developed. The LOD for HPLC method is
3,4 ng/ml and for GC method is 0,34 ng/ml. Repeatability of both methods are satisfactory for
monitoring midazolam in plasma. Both methods were used for determination of midazolam in
rabbit blood samples after nasal application (1 mg/kg). Both methods give comparable results.
Key Words: Midazolam, Fentanyl, GC, NPD, HPLC-UV.
Úvod
Midazolam (MDZ – Obr. 1) je látka ze skupiny benzodiazepinů, která se používá pro
navození sedace a anestezie při lékařských zákrocích. MDZ má anxiolytické, antikonvulzivní
a myorelaxační účinky. MDZ je v organismu rychle metabolizován za vzniku
1´-hydroxymidazolamu jako hlavního produktu, v malém množství vzniká též
4-hydroxymidazolam a 1´, 4-dihydroxymidazolam 1,2.
Obr. 1. Struktura anestetika midazolamu a interního standardu fentanylu.
Pro stanovení benzodiazepinů v biologickém materiálu je možné využít imunnoassay metody,
známé pod zkratkami EIA, ELISA a RIA. Nevýhodou těchto metod je jejich nízká
selektivita 2. Pro stanovení MDZ v biologických vzorcích se využívá vysokoúčinných
separačních technik jako je plynová chromatografie (GC) s dusíko-fosforovým detektorem
(NPD) 3, s detektorem elektronového záchytu (ECD) nebo hmotnostní detekcí 4. Další
metodou je kapalinová chromatografie (HPLC) s UV detekcí při 200 nm nebo s hmotnostní
detekcí 5-7.
Cílem této práce je vývoj HPLC a GC metody pro stanovení plazmatických hladin MDZ
v krvi králíka po netradičních způsobech aplikace. Jde především o nazální, konjunktivální či
transbukální podání, které nachází uplatnění v medicíně katastrof, kdy nejsou běžné způsoby
aplikace dosažitelné.
68
Experimentální část
Klinický experiment
MDZ byl aplikován pomocí mikrostříkačky s kanylou do jedné nozdry králíka (plemeno,
činčila šedá) v množství 1 mg/ kg tělesné váhy. Krev byla odebírána ve třech intervalech do
ztráty reflexu polohy. Odběr krve byl proveden z aurikulární žíly kanylou. Odběry byly
provedeny ve 3., 14. a 30. min po podání anestetika. Odebraná krev byla centrifugována
a oddělená plazma byla ihned zamražena tekutým dusíkem. Jako interní standard byl použit
fentanyl (obrázek 1). Kalibrační roztoky byly připravovány pomocí standardního roztoku
MDZ (Midazolam, 5 mg/ml, Torrex CHIESI Pharma GmBh, Rakousko). Tento roztok byl
naředěn na různé koncentrace a ty pak byly přidávány ke krevní.
HPLC stanovení
HPLC měření byla provedena na přístroji HPLC (Schimadzu, Japonsko), zahrnujícím pumpu
LC-10ADvp, autosampler SIL-10ADvp, UV/Vis detektor SPD-10Avp. Použita byla kolona
Ascentis Express RP-Amide 10 mm x 3 mm, s velikostí částic 2,7 m. Mobilní fáze byla
míchána z acetonitrilu (LachNer, 99%) a deionizované vody (okyselené HClO4 na pH 2,7) v
poměru 30:70 (v/v) po celou dobu analýzy. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min s maximálním
tlakem 23 MPa. Odezva detektoru byla zaznamenávána při vlnové délce 200 nm. Pro ovládání
přístroje a vyhodnocení chromatogramů byl použit software LCSolution verze 1.11SP1.
Vzorky krevní plazmy byly připraveny odpipetováním 500 l plazmy, 100 l interního
standardu (fentanyl, 2 g/ml) a 100 l 1,5 M NaOH. Směs byla promíchána a extrahována
2 x 2 ml hexanu. Extrakt byl vysušen proudem dusíku při 40 oC, rozpuštěn v 50 µl mobilní
fáze a 10 µl takto připraveného vzorku bylo nadávkováno na kolonu.
GC stanovení
GC měření byla provedena na přístroji GC-17A (Shimadzu, Japonsko) s dusíko-fosforovým
detektorem FTD-17. Použita byla kolona Zebron ZB-5 (Phenomenex, USA) 30 m x 0,25 mm,
0,25 m. Jako nosný plyn bylo použito He (99,996%, Linde) o průtoku 2,4 ml/min a lineární
průtokové rychlosti 53 cm/s. Nástřikový port pracoval ve splitless režimu s vložkou
s deaktivací Siltek. Teplota nástřikového portu byla 340 oC a teplota detektoru 370 oC. Proud
NPD lože byl nastaven v rozmezí 20-40 pA podle stupně opotřebení. Průtok vodíku
a vzduchu detektorem byl nastaven na hodnoty 3,4 ml/min a 125 ml/min. Průtok He
detektorem byl nastaven manometrem na 80 kPa. Teplotní program začal na 180 oC po dobu
1,5 min s následným gradientem 20 oC/min na 230 oC držených 9 min a gradientem 5 oC/min
na 270 oC držených 1 min. Poslední gradient 80 oC/min na 340 oC držených 7 min sloužil
k rychlému odstranění nečistot z kolony před další analýzou.
Vzorky krevní plazmy byly připraveny odpipetováním 200 l krevní plazmy, 50 l interního
standardu (fentanyl, 200 ng/ml), 40 l 10M NaOH a 600 l 5% isopropanolu v butylchloridu.
Směs byla 5 min protřepávána a následně krátce centrifugována. Horní organická frakce byla
odebrána do vialky se 400 l 1M HCl. Směs byla znovu 5 min třepána a krátce
zcentrifugována. Horní organická frakce byla odstraněna a zbylý roztok byl alkalizován
přídavkem 100 l 10M NaOH. Vzorek byl poté 40 min třepán. Ke směsi bylo napipetováno
600 l butylchloridu a 5 min protřepáváno. Po krátké centrifugaci byla organická fáze
odebrána a vysušena proudem dusíku při 40 oC. Odparek byl rozpuštěn ve 20 l toluenu
a 4 l byly nastříknuty na GC.
Výsledky a diskuse
Při stanovení MDZ v krevní plazmě metodou HPLC byla použita krátká separační kolona,
která umožňuje rychlou analýzu. Při vývoji metody byl sledován vliv průtoku mobilní fáze
69
(0,7 - 0,3 ml/min), složení mobilní fáze (acetonitril:methanol:voda) a množství dávkovaného
vzorku (5 - 20 l vzorku). Nejoptimálnější stanovení bylo za podmínek složení mobilní fáze
acetonitril:voda (okyselená HClO4 na pH 2,7) v poměru 30:70 (v/v). Optimální průtok mobilní
fáze byl 0,4 ml/min. Pro úplné oddělení MDZ od všech ostatních komponent krevní plazmy
bylo dávkováno 10 l vzorku.
Metoda použitá při GC stanovení MDZ byla původně používána pro stanovení fentanylu
v krevní plazmě 9. Po optimalizaci přípravy vzorku však dává velmi dobré výsledky i při
stanovení MDZ. V posledním kroku alkalizace bylo nutné rozdělit vzorek od extrakce
chlorbutanem a ponechat dostatečný čas pro opětovný vznik benzodiazepinového cyklu.
Tímto krokem byla zvýšena výtěžnost extrakce vzorku z původních 80 % na 99,6 %. Zlepšila
se i přesnost výsledků udaná jako variační koeficient z původních 20 % na 3,4 %. Důvod
použití zpětné extrakce byla snaha získat co nejčistší extrakt s minimálním množstvím dalších
látek (např. látek lipidové povahy). To vede také k udržení větší čistoty NPD lože
a prodloužení jeho životnosti.
Ukázkový GC- (graf A) a HPLC-chromatogram (graf B) krevní plazmy králíka o koncentraci
MDZ 75 ng/ml je uveden na Obr. 2.
Obr. 2. Stanovení MDZ v krevní plazmě činčily o koncentraci 75 ng/ml. A – GC stanovení
s NPD detekcí; B – HPLC stanovení s UV detekcí při 220 nm. Identifikace píků: 1 –
midazolam, 2 – fentanyl.
Parametry kalibrační závislosti vypočtené z plochy píku pro vzorek MDZ v krevní plazmě pro
HPLC i GC stanovení jsou shrnuty v Tabulce I. Pro sestrojení kalibrační závislosti v plazmě
byla použita metoda přídavku standardu MDZ k biologickému materiálu. Limity detekce,
vypočítané z výšky píku odpovídající trojnásobku šumu detektoru, jsou pro obě metody
dostatečně nízké pro stanovení MDZ v krevní plazmě králíka po nazálním podání MDZ. Pro
GC stanovení je limit detekce 0,34 ng/ml, což je 10x nižší než u HPLC stanovení. Zároveň je
pro GC stanovení použito pouze 200 l krevní plazmy a k HPLC stanovení 500 l plazmy.
V klinických pokusech na zvířatech je vždy výhodnější použití menšího množství
biologického materiálu.
70
Tabulka I.
Parametry kalibrační závislosti HPLC a GC metody pro MDZ v krevní plazmě. V závorkách
jsou uvedeny hodnoty směrodatných odchylek.
Parametr
HPLC stanovení
GC stanovení
Retenční čas MDZ (min)
3,39 (0,01)
14,52 (0,03)
Testované koncentrační rozmezí (ng/ml)
10 - 1280
7,5 - 600
-1
645 (4)
1479 (25)
Citlivost ( V s ng ml)
2714 (1178)
-3422 (4322)
Úsek ( V s)
Korelační koeficient R
0,99989
0,99914
LOD (ng/ml)
3,7
0,34
Celková doba stanovení včetně přípravy vzorku je 60 min. pro HPLC a 120 min. pro GC.
Opakovatelnost chromatografických stanovení byla testována na 6 analýzách vzorku krve.
Hodnota opakovatelnosti metody s koeficientem variace pro koncentraci 75 ng/ml je pro
HPLC 2,0 % a pro GC stanovení 3,4 %. Obě hodnoty jsou vyhovující a odpovídají
opakovatelnosti chromatografických metod. Hodnoty analytické výtěžnosti pro přídavek
MDZ 75 ng/ml ke krevní plazmě jsou pro HPLC stanovení 104,4 % a pro GC stanovení
99,6 %.
Pomocí HPLC i GC metody bylo změřeno 18 reálných vzorků krve králíka po předchozí
aplikaci MDZ. Stanovené koncentrace MDZ se pohybovaly v rozmezí 37 – 289 ng/ml pro
HPLC 47 – 332 ng/ml pro GC. Jednovýběrový t-test na hladině významnosti 0,05 neprokázal
statisticky významný rozdíl mezi oběma metodami. Provedená klinická studie ukázala, že po
3 min od nazálního podání anestetika je plazmatická koncentrace MDZ 171 ± 87 ng/ml, po 14
min 132 ± 66 ng/ml a po 30 min 81 ± 41 ng/ml. MDZ je v těle rychle metabolizován a jeho
plazmatická koncentrace klesá po 30 min. od aplikace na 50%.
Závěr
Pro stanovení plazmatických hladin anestetika midazolamu v krvi králíka byla vyvinuta
metoda HPLC s UV detekcí a metoda GC s dusíko-fosforovým detektorem. Stanovení pomocí
HPLC je rychlejší (10 min) s menšími požadavky na úpravu vzorku v porovnání s 30 min
dobou stanovení pomocí GC. Na druhou stranu GC metoda poskytuje 10krát nižší limit
detekce a má širší klinické uplatnění. Obě metody byly použity při stanovení MDZ v reálných
vzorcích krve králíka a poskytly srovnatelné výsledky. Z provedené klinické studie vyplynulo,
že MDZ je v těle rychle metabolizován a po 30 min od aplikace klesá jeho koncentrace na
polovinu.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektu IGA NT-11284-4-2010.
Literatura
1. Juřica J., Dostálek M., Konečný, Glatz Z., Hadašová E., Tomandl J.: J Chromatogr. B
852, 571 (2001).
2. Drummer O. H.: J Chromatogr. B 713, 201 (1998).
3. Raikos N, Theodoridis G., Alexiadou E., Gika H., Argiriadou H., Parlapani H., Tsoukali
H.: J. Sep. Sci. 32, 1018 (2009).
4. Kaartama R., Jarho P., Savolainen J., Kokki H., Lehtonen M: J Chromatogr. B 879, 1668
(2011).
5. Hamdy D. A, Brocks D. R.: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 53, 617
(2010).
71
6.
7.
8.
9.
Svanstrom C., Hansson G. P., Svensson L. D., Sennbro C. J.: Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis 58, 71 (2012)
Portier E. J. G., de Blok K., Butter J. J., van Boxtel C. J.: J Chromatogr. B 723,
313(1999).
Dussy F. E., Hamberg C., Briellmann T. A.: Int J Legal Med 120, 323 (2006).
Choi H. S., Shin H. C., Kyany G., Rhee J. M., Lee H. B.: J Chromatogr. B 765, 63(2001).
72
Screen-Printed Carbon Electrodes with Porous Copper Film
(Uhlíkové tištěné elektrody s porézním filmem mědi)
Radovan Metelka and Pavlína Vlasáková
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical
Chemistry, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
Porous copper films were formed on the surface of screen-printed carbon electrodes via
colloidal crystal template technique. The template made of self-assembled monodisperse
polystyrene spheres of 200 nm or 500 nm diameters was coated by the copper using
galvanostatical deposition from a plating solution. The porous structure was revealed after
dissolution of spheres in toluene. The morphology of the final deposit was ascertained with
the aid of SEM. Analytical performance of prepared porous electrodes was tested in
hydrodynamic amperometry of glucose and other saccharides in alkaline solution and
compared to that of screen-printed carbon electrodes with ex situ copper film. Increased
current responses were observed at porous electrodes due to the enlarged surface area.
Key Words: Porous electrodes, Copper, Colloidal crystal templating, Screen-printed carbon
electrodes, Glucose.
Úvod
Úprava pracovního povrchu elektrody je jednou z cest pro zlepšení analytických parametrů
elektrochemického senzoru. Vhodnou technologií lze několikanásobně zvětšit elektroaktivní
povrch elektrody v porovnání s její geometrickou plochou. Z řady dostupných možností se
často využívá tvorby porézních vrstev různými postupy 1. Jednoduchou technikou pro
přípravu uspořádaných porézních struktur se širokými možnostmi je vzorování koloidního
krystalu (z angl. colloidal crystal templating) 2. Při ní vytvářejí monodisperzní kulové částice
o průměru stovek nanometrů samouspořádáním nebo mechanickým působením koloidní
krystaly. Do volného prostoru mezi částicemi je poté vpraven kapalný prekurzor, který je
následně vhodným způsobem převeden do pevného stavu a po odstranění vzoru rozpuštěním
nebo vyšší teplotou se získá vrstva porézního materiálu. Velikost pórů je pak dána průměrem
použitých kuliček.
Vylučování požadovaného materiálu elektrodepozicí přináší řadu výhod. Lze snadno
kontrolovat množství vyloučeného depozitu, proces probíhá rychle v celém objemu mezer
vzoru, který tak není mechanicky namáhán a je možné připravovat porézní vrstvy z kovů,
jejich slitin a oxidů, polovodičů a vodivých polymerů 3. Výsledné strukturované materiály
jsou použitelné v optice, katalýze, palivových článcích nebo senzorech. Využití výše uvedené
techniky k přípravě kovových porézních elektrod pro elektrochemické senzory bylo
publikováno pouze v několika málo případech. Jsou popsány (bio)senzory na bázi
modifikovaných zlatých elektrod 4-6 a porézní bismutové 7 a antimonové 8 filmové elektrody
pro stanovení těžkých kovů.
Tento příspěvek se zabývá přípravou a možným analytickým využitím měděných porézních
vrstev, vytvořených na substrátu uhlíkové tištěné elektrody vzorováním koloidního krystalu
z monodisperzních kuliček polystyrenu. Byla sledována elektrochemická oxidace vybraných
sacharidů na těchto elektrodách v alkalickém prostředí 9 a zjištěné charakteristiky byly
porovnány s uhlíkovými tištěnými elektrodami s neporézním filmem mědi, vytvořeným
elektrodepozicí ex situ z pokovovacího roztoku.
73
Experimentální část
Příprava uhlíkových tištěných elektrod s filmy mědi
Uhlíková tisková pasta (typ C10903P14, Gwent Electronics Materials, Velká Británie) byla
vytištěna na keramické substráty (typ CLS 641000396R, Coors Ceramics, USA) pomocí
poloautomatického tiskového stroje UL 1505 A (Tesla, Česká republika). Vytvořená vrstva
byla poté vytvrzována 30 min při 60 °C v sušárně. Pro přípravu porézní vrstvy mědi byly na
povrch elektrody umístěny kruhové formy s plochou 0,1 cm2 a do nich napipetováno 30 µl
0,3 – 1% vodné suspenze monodisperzních polystyrenových kuliček (Sigma-Aldrich,
Německo) o průměru 200 a 500 nm. Po odpaření rozpouštědla a vytvoření koloidního krystalu
samouspořádáním kuliček byly formy odstraněny a elektroda byla opatrně ponořena do
pokovovacího roztoku 0,1 M Cu(NO3)2, okyseleného na pH 2 přídavkem konc. HNO3. Po
delším ponechání elektrody v roztoku k dostatečné penetraci roztoku do struktury koloidního
krystalu byla přes něj galvanostaticky vyloučena měď proudem -1,5 mA s různým časem
depozice. Následně byly polystyrenové kuličky odstraněny ponořením elektrody do toluenu
na 15 min a po opláchnutí destilovanou vodou a osušením byla elektroda izolována
bezbarvým lakem na nehty. Pro srovnávací měření byly připraveny také uhlíkové tištěné
elektrody s filmem mědi, vytvořeným galvanostatickou depozicí proudem -1,5 mA po
zvolenou dobu ve výše uvedeném pokovovacím roztoku. Před vlastní depozicí byla vymezena
plocha pracovní elektrody 0,1 cm2. Morfologie depozitů byla sledována rastrovacím
elektronovým mikroskopem JSM-5500LV (JEOL, Japonsko) se zobrazením pomocí
sekundárních elektronů a urychlovacím napětím 15 a 20 kV (porézní elektrody).
Elektrochemická detekce sacharidů
Cyklické voltamogramy byly měřeny na elektrochemickém analyzátoru BAS 100B/W
s drátkovou Pt pomocnou a Ag/AgCl/3 M KCl referentní elektrodou (vše BASi, USA). Byly
použity následující experimentální parametry: počáteční potenciál 0 V, koncový potenciál
800 mV a rychlost polarizace 50 mV s–1. Při technice hydrodynamické amperometrie byl
měřený roztok míchán teflonovým míchadlem při 600 ot min–1 a proud byl zaznamenáván při
potenciálu detekce +600 mV vs. Ag/AgCl. Modelové roztoky galaktózy, fruktózy (obě
Sigma-Aldrich, Německo), glukózy a sacharózy (obě Lachema, Česká republika) o
koncentraci 1 mM byly připraveny v základním elektrolytu 0,1 M NaOH a po zředění
dávkovány po ustálení základní linie. Hodnota proudu byla poté odečítána 50 s po
nadávkování přídavku sacharidu.
Výsledky a diskuse
Morfologie výsledných porézních vrstev mědi na heterogenním uhlíkovém substrátu je do
značné míry ovlivněna průměrem použitých polystyrenových kuliček. Sice se podařilo
vytvořit požadovanou strukturu i s kuličkami o průměru 200 nm, avšak výsledná vrstva byla
značně nesourodá. Na ploše elektrody se vytvořily různé agregáty, obsahující jak porézní, tak
i neporézní depozit mědi spolu s nerozpuštěnými shluky uspořádaných kuliček (Obr. 1).
Naopak při použití částic o průměru 500 nm a stejné době rozpouštění v toluenu byly
v závislosti na koncentraci polystyrenových kuliček a času depozice pozorovány izolované
porézní ostrůvky mědi až rozsáhlé souvislé oblasti s pravidelnou porézní strukturou (Obr. 1).
Pouze tento průměr kuliček byl proto dále používán pro přípravu porézních elektrod.
Měděné filmové elektrody byly charakterizovány cyklickou voltametrií některých sacharidů
v alkalickém prostředí. Pro tento účel byly připraveny porézní vrstvy z 1% suspenze částic a
provedena galvanostatická depozice mědi po dobu 120 s při -1,5 mA. Za stejných parametrů
byl vytvořen i neporézní film mědi. Na obr. 2 jsou uvedeny získané záznamy pro roztok
glukózy, kde lze pozorovat významné zvýšení proudové hustoty (přepočítané na
74
geometrickou plochu) na porézní elektrodě. Podobný charakter záznamů poskytují i ostatní
měřené sacharidy. Při jejich elektrochemické oxidaci se předpokládá interakce s vrstvou
oxidu/hydroxidu, vytvořenou na povrchu elektrody, dochází k adsorpci a následné oxidaci 9.
Pro tento typ elektrochemické reakce s adsorpcí sledované látky se uvádí nárůst měřených
proudů až o dva řády pro případ makroporézních elektrod (póry větší než 50 nm) 2.
Obr. 1. SEM fotografie porézní (vlevo) a neporézní měděné filmové SPCE (vpravo). Vzor ze
suspenze 0,5 % polystyrenových kuliček o průměru 500 nm, depozice mědi 60 s.
Obr. 2. Cyklické voltammogramy 1 mM glukózy v 0,1 M NaOH na porézní (plná čára) a
neporézní měděné filmové SPCE (čerchovaná čára) a na čisté SPCE (tečkovaná čára).
Při amperometrickém sledování oxidace glukózy za míchání roztoku základního elektrolytu
jsou patrné větší odezvy porézní elektrody na zvyšování koncentrace analytu oproti ex situ
filmové měděné elektrodě. Směrnice kalibrační přímky je zhruba čtyřikrát větší a tento poměr
je víceméně zachován i při měření roztoků glukózy až do koncentrace 2 µM. Pro sacharózu a
galaktózu byly zjištěny podobné závislosti, u fruktózy nebyl proudový nárůst na porézních
elektrodách tak výrazný jako u ostatních sacharidů.
75
Obr. 3. Hydrodynamická amperometrie glukózy na a) čisté SPCE, b) neporézní a c) porézní
měděné filmové SPCE spolu s odpovídajícími kalibračními závislostmi.
Závěr
Porézní vrstvy různých materiálů připravené technikou vzorování koloidního krystalu
umožňují další zvýšení citlivosti elektrochemických senzorů zvětšením jejich dostupné
elektroaktivní plochy. Vlastní provedení není experimentálně náročné ani nákladné, je nutná
pouze opatrná manipulace se senzorem po odpaření rozpouštědla před depozicí materiálu, aby
nedošlo k mechanickému poškození koloidního krystalu a rozpadu celé struktury. Získané
výsledky na porézních měděných elektrodách jsou slibné např. pro detekci glukózy
v klinických vzorcích.
Poděkování
Příspěvek vznikl za podpory Grantové agentury ČR (projekt P206/12/0381) a Interní grantové
agentury Univerzity Pardubice (projekt SGFChT06/2012).
Literatura
1. Walcarius A.: Anal. Bioanal. Chem. 396, 261 (2010).
2. Walcarius A., Kuhn A.: Trend. Anal. Chem. 27, 593 (2008).
3. Bartlett P. N., Baumberg J. J., Birkin P. R., Ghanem M. A., Netti M. C.: Chem. Mater. 14,
2199 (2002).
4. Szamocki R., Reculusa S., Ravaine S., Bartlett N. P., Kuhn A., Hempelmann R.: Angew.
Chem. Int. Edit. 45, 1317 (2006).
5. Szamocki R., Velichko A., Holzapfel C., Mücklich F., Ravaine S., Garrigue P., Sojic N.,
Hempelmann R., Kuhn A.: Anal. Chem. 79, 533 (2007).
6. Ben-Ali S., Cook A. D., Evans S. A. G., Thienpont A., Bartlett N. P., Kuhn A.:
Electrochem. Commun. 5, 747 (2003).
7. Urbanová V., Bartoš M., Vytřas K., Kuhn A.: Electroanal. 22, 1524 (2010).
8. Urbanová V., Vytřas K., Kuhn A.: Electrochem. Commun. 12, 114 (2010).
9. Sun F, Li L., Liu P., LianY.: Electroanal. 23, 395 (2011).
76
New Characterisation Approaches for Carbon Ionic Liquid Electrodes (CILES)
(Nové přístupy k charakterizaci uhlíkových elektrod s iontovými kapalinami)
Tomáš Mikysek a, Matěj Stočes a, Ivan Švancara a, Karel Vytřas a, and Jiří Ludvík b
a
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical
Chemistry, Studentská 573, 53210 Pardubice,Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Within this study, some new approaches to characterize the carbon paste mixtures and the
respective carbon ionic liquid electrodes (CILEs) are presented and their properties discussed.
Particular attention has been paid to the changes of the resistivity, relative to the dependence
on composition of the CILE. Three types of carbon ionic liquid pastes were examined, and for
the interpretation of experimental data, the results were compared with those of "classic"
carbon paste electrode (CPE) based on graphite powder. Some problems connected with
homogeneity and stability of carbon pastes are also discussed.
Key Words: carbon, paste, electrode, ionic liquid, characterisation.
Úvod
Uhlíkové pastové elektrody (CPEs) se staly nedílnou součástí elektroanalytické chemie a na
toto téma vyšla od roku 1958, kdy byla publikována první práce R. N. Adamsem 1, celá řada
prací 1-5. Nicméně při přípravě každé „nové“ uhlíkové pastové elektrody je nezbytné provést
její základní charakterizaci. V minulosti byly popsány některé charakterizační přístupy2, 6, 7,
které se postupem času měnily s různými složkami pastových směsí.8 V současné době byla
řada prací, popisující charakterizace nových typů CPE, rozšířena o měření ohmického odporu
v závislosti na složení a zároveň byly zveřejněny některé nové aspekty, které je nutné brát
v úvahu při přípravě „kvalitní“ uhlíkové pastové elektrody 9, 10.
Charakterizace je stále aktuálním tématem, jelikož se stále objevují nové uhlíkové materiály
spolu s novými typy pojiv, které tvoří hlavní složky pastové směsi. Prvním významným
krokem vpřed bylo využití uhlíkových nanotrubiček v elektrochemii a elektroanalýze
s uhlíkovými pastovými elektrodami. Uhlíkové nanotrubičky (CNTs) přinesly nové možnosti
a v případě CNTPEs (z angl. “Carbon Nanotubes Paste Electrodes“) nahradily tradiční
grafit 11, 12. Později byly uhlíkové nanotrubičky využity spíše jako modifikátor CPEs 4.
V posledních deseti letech se staly populárními iontové kapaliny RTILs (“Room-Temperature
Ionic Liquids) a díky jejich vlastnostem došlo i na jejich využití v oblasti uhlíkových
pastových elektrod 13-15. Použitím iontových kapalin jako pojiva CPE se ve svých pracech
věnovali Liu 14 a Safavi 16 a stejně jako v případě uhlíkových nanotrubiček vznikly dva typy
nových uhlíkových pastových elektrod: (i) CILEs (“Carbon Ionic Liquid Electrodes“); (ii) ILCPEs (“Ionic Liquid-Modified Carbon Paste Electrodes“) 3, přičemž v druhém případě bývá
iontová kapalina použita jako další složka a slouží jako speciální modifikátor. U všech výše
uvedených typů nových CPEs byla provedena nezbytná základní charakterizace, jelikož
iontové kapaliny významně mění vlastnosti elektrodového materiálu (např. změny vodivosti,
elektrokatalytické jevy, aktuální intenzita nabíjecího proudu, aj.) 16-18.
V tomto příspěvku je prezentována charakterizace CILEs z pohledu zkoumání fyzikálněchemických vlastností, které korespondují s elektrochemickými měřeními. Výsledky a
pozorování byly srovnány s předchozími výsledky publikovanými pro CPE a CNTPEs 9, 10.
77
Experimentální část
Chemikálie
Hexakyanoželezitan draselný (p.a. kvalita), chlorid draselný, KCl (Suprapur) obojí dodáno
firmou Merck. Všechny potřebné roztoky byly připraveny z deionizované vody pomocí
systému Milli-Q od firmy Millipore.
Instrumentace
Všechna elektrochemická měření byla prováděna na přístroji AUTOLAB (model "PGSTAT128"; Metrohm - Autolab B.V., Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla připojena měřicí cela
s tří-elektrodovým systémem obsahujícím pracovní elektrodu (viz. níže), referentní elektrodu
Ag | AgCl | 3 M KCl a pomocnou elektrodu (Pt).
Uhlíkové pastové elektrody
Směsi uhlíkových past byly připravovány smísením určitého množství uhlíku s pastovou
kapalinou a následnou homogenizací v třecí misce. Během experimentu byly používány dva
typy uhlíku: a) "CR-5" (spektroskopický grafit s velikostí částic 5 m; Maziva Týn nad
Vltavou, Česká republika) b) skelný uhlík ("Sigradur-G", HTW Meitingen, Německo).
Pastovou kapalinou byl buď (i) trihexyltetradecylfosfonium dicyanamid (označen v textu jako
"IL-1"; od Merck), nebo (ii) 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorofosfát ("IL-2"; SigmaAldrich). Po homogenizaci byla směs naplněna do teflonového pouzdra s otvorem o průměru
2 mm. Z kombinací uhlíkového materiálu a pastové kapaliny byly připraveny následující
směsi: CR-5/IL-1, CR-5/IL-2, GC/IL-2 s různým procentuálním zastoupením pastové
kapaliny ve směsi. U čerstvě připravené série elektrod byl změřen ohmický odpor a následně
byl obnoven povrch otřením o filtrační papír.
Postupy
Měření ohmického odporu
Ve všech případech tělo elektrody bylo umístěno vertikálně tak, aby se elektrodový povrch
dotýkal vodivé podložky. Kovový píst (součást elektrodového těla) byl druhým kontaktem
připojeným na multimetr (“Voltcraft“; Conrad Electronics, SRN).
Cyclická Voltametrie (CV)
Tyto experimenty byly prováděny v roztoku 0,1 M KCl obsahujícího 5 mM K3Fe(CN)6. U
většiny experimentů počáteční potenciál byl 0,0 V vs. Ag/AgCl a změna potenciálu probíhala
v katodickém směru a následně pak v anodickém při rychlosti polarizačního napětí 50 mV/s;
vše při trojím opakování. Před každým měřením byl roztok důkladně probublán argonem a
čerstvě obnoven povrch elektrody.
Výsledky a diskuse
Tato studie navazuje na předchozí charakterizace 9, 10, které byly prováděny jak s tradičními
uhlíkovými pastovými elektrodami, tak s elektrodami z uhlíkových nanotrubiček (CNTPEs).
První část experimentů byla zaměřena na měření ohmického odporu. Podle modelu
nejtěsnějšího možného uspořádání částic 9 dochází k tomu, že měrný odpor se nijak
dramaticky nemění s rostoucím množstvím pojiva v pastové směsi až do „mezní“ hodnoty,
kde dochází k prudkému zvýšení měrného odporu (viz. obr.1 vlevo). Tento efekt byl
pozorován jak u klasických CPE tak u CNTPE a také u zde prezentovaných CILEs. U CPE se
tato mezní hodnota (zlom) pohybuje kolem 25% (hm.) pojiva ve směsi, a překvapivě
v případě CNTPE tato hodnota je až u 60% (hm.), u CILEs pak hodnota „zlomu“ je někde
kolem 40-45% (hm.).
78
Vysvětlení samotné existence zlomu vychází z výše uvedeného modelu nejtěsnějšího
možného uspořádání částic9, kde v případě CPE dochází, během přídavku 20-30% pojiva,
k tomu, že pojivo nejprve vyplní všechen zbývající prostor mezi uhlíkovými částicemi, které
zůstávají ve stálém kontaktu. Po překročení této hranice částice začnou „plavat“ v pastové
kapalině, dojde k postupnému snižování míry kontaktu mezi nimi, což má za následek prudký
nárůst ohmického odporu. V případě CNTPEs lze výrazný posun hodnoty zlomu vysvětlit
faktem, že uhlíkové nanotrubičky jsou schopny adsorbovat poměrně velké množství pojiva
díky velkému lipofilnímu povrchu a také díky jejich vláknité struktuře, zabraňující
samovolnému vytékání pojiva („krvácení“ elektrody).
Experimenty s oběma typy CILEs (CR-5/IL-1, CR-5/IL-2) v kombinaci se spektroskopickým
grafitem ukázaly, že „zlom“ se pohybuje někde u 40-45 % (hm.), tedy mezi oběma dříve
prezentovanými typy uhlíkových past (CPE, CNTPE). Při provedení stejného experimentu se
skelným uhlíkem (směs GC/IL-2) se ale ukázalo, že zlom nastává již kolem 30 % (hm.) stejně
jako v předchozích případech směsi grafitu CR-5 s jinými pojivy (silikonový, parafínový
olej) 9.
Posunutí „zlomu“ na 40-45% (hm.) pastové kapaliny u kombinace CR-5/IL-1 a CR-5/IL-2
(oproti CR-5/SO či CR-5/PO) ukazuje na to, že iontová kapalina výrazněji proniká do
grafitického materiálu (resp. silněji se adsorbuje na jeho povrchu). Na druhé straně samotná
vodivost iontové kapaliny zde zřejmě nehraje klíčovou roli, neboť při použití skelného uhlíku
zlom nastává při zhruba stejném složení pasty jako s tradičními pojivy.
Obr. 1. Závislost měrného odporu (rezistivity) uhlíkové pasty typu CR-5/IL-1 na množství
použitého pojiva (vlevo); závislost rozdílu katodického a anodického píku systému
Fe(CN)6 4 / Fe(CN)6 3 pro směs CR-5/IL-1 na množství použitého pojiva (vpravo).
Podmínky měření – viz. experimentální část.
Druhou částí charakterizace bylo zkoumání elektrochemického chování jednotlivých typů
připravených elektrod. K těmto účelům bylo využíváno cyklické voltametrie (CV) a
standardního elektrodového systému Fe(CN)6 4 / Fe(CN)6 3 (5 mM v 1 M KCl), jehož
chování na běžných elektrodách je takřka ideálně reverzibilní (tj. rozdíl potenciálů
anodického a katodického píku, EP = 59 mV), zatímco na površích uhlíkových past příslušná
hodnota EP dosahuje 150 mV anebo i více. Tento vyšší rozdíl mezi anodickým a katodickým
píkem odráží nárůst odporu (= pokles vodivosti) elektrody způsobený nadbytkem pojiva a
v případě výše uvedeného elektrochemického měření nastává při překročení hodnoty zlomu.
79
Elektrochemický „zlom“ u CPE koresponduje se zlomem zjištěným při měření odporu,
podobně jako v případě CNTPE. U past připravených z nanotrubiček je rozdíl katodického a
anodického potenciálu píku nižší než u klasické CPE, což je opět způsobeno vláknitou
strukturou uhlíkových nanotrubiček, které mají lepší celkovou vodivost než grafitové shluky
v případě CPE.
V případě testovaných CILEs je situace poněkud složitější. Zatímco v případě CPE, CNTPE a
také CR-5/IL-1, „elektrochemický zlom“ koresponduje se „zlomem“ získaným při měření
odporu, u směsi CR-5/IL-2 tato skutečnost neplatí a zatímco s nárůstem pojiva IL-2 nad 45%
(hm.) dochází k nárůstu měrného odporu (poklesu vodivosti), rozdíl katodického a
anodického potenciálu se výrazněji nemění i když dochází k poklesu proudu v důsledku
nižšího obsahu uhlíku ve směsi. Tento problém a jeho vysvětlení spočívá pravděpodobně
v tom, že IL-2 v měřeném roztoku (K3Fe(CN)6 v KCl) přestavuje fázové rozhraní dvou
navzájem nemísitelných elektrolytů a tudíž může být uvažován elektrodový děj s přenosem
náboje na tomto rozhraní. Rozdílné chování dvou zkoumaných iontových kapalin může být
způsobeno jejich rozdílnou strukturou a rozpustností, což je výzva pro další studie.
Pomocí cyklické voltametrie bylo také možno sledovat časovou stabilitu elektrodového
materiálu. Elektrochemické chování jednotlivých elektrod v systému modelovém systému
bylo zkoumáno ihned po jejich přípravě a poté se elektrody nechaly 5 dnů ve vertikální poloze
za laboratorní teploty na vzduchu a následně pak byla zkoumána jejich elektrochemická
aktivita v tomtéž sytému (viz. Obr. 1 vpravo). Výsledky ukázaly, že u elektrod s výrazně
vyšším obsahem pastové kapaliny dochází k postupnému vytékání pojiva z elektrody, čímž se
mění poměr uhlíkového materiálu a pastové kapaliny. Na základě měření odporu a vodivosti
bylo možno rovněž ověřit, zda nedochází ke změnám složení a porušení homogenity
elektrodového materiálu (např. ztráta pastové kapaliny) CILEs. U past s vyšším obsahem
pojiva (60 hm.% a více) po určité době dochází ke „krvácení“ elektrody. Naopak u past
s minimem pastové kapaliny docházelo vysypání elektrodového materiálu z těla elektrody,
plnění a vlastní příprava byla obtížná. Fyzikálně-chemické vlastnosti jsou jakýmsi prvním
vodítkem k volbě a následné přípravě past.
Závěr
Jak ukázaly výše uvedené experimenty, měření ohmického odporu a rozdílu potenciálů píků
modelového reverzibilního redox systému nabízejí základní informace o kvalitě a stabilitě
uhlíkové pasty a zároveň vedou k nalezení optimálního poměru uhlíkového materiálu a
pastové kapaliny.
Prezentované výsledky dále poukazují na fakt, že optimální poměr jednotlivých komponent se
může lišit pro různé druhy uhlíkových pastových elektrod. Hlavní pozornost byla věnována
studiu CILEs a lze konstatovat, že optimální konzistence a složení směsí CR-5/ IL-1 a CR-5/
IL-2 je přibližně 35-40% (hm.) iontové kapaliny, zatímco při použití skelného uhlíku je lepší
použít méně iontové kapaliny (pod 30% hm.), vždy před zlomovým bodem závislosti odpormnožství pastové kapaliny. Je-li obsah pastové kapaliny za uvedeným zlomem, pak naplnění
pouzdra je obtížnější a pastová kapalina vytéká z elektrody. Na druhou stranu příliš málo
pastové kapaliny vede k tomu, že pasta má spíše drobivou konzistenci a elektrodový materiál
má tendenci se vysypávat z elektrody.
Již osvědčená 5,9,10 a zde opět použitá charakterizace nabízí srovnání různých typů uhlíkových
past (CPE, CNTPE, and CILE). K podrobnějšímu zkoumání mohou pomoci i některé další
diagnostické techniky, jako např. electrochemická impedanční spektroskopie (EIS).
80
Poděkování
Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České
Republiky projektu CZ.1.07/2.3.00/30.0021 "Posílení excelentních týmů výzkumu a vývoje
na Univerzitě Pardubice".
Literatura
1. Adams R.N.: Analytical Chemistry 30, 1576 (1958).
2. Olson C., Adams R.N.: Analytica Chimica Acta 22, 582 (1960).
3. Švancara I., Walcarius A., Kalcher K., Vytřas K.: Central European Journal of Chemistry
7, 598 (2009).
4. Švancara I., Kalcher K., Vytřas K., Walcarius A.: Electroanalysis with Carbon Paste
Electrodes. CRC Press, Boca Raton 2012.
5. Kalcher K., Švancara I., Metelka R., Vytřas K., Walcarius A., Heterogenous carbon
based sensors, in: Grimes C.A., Dickey E.C., Pishko M.V. (Eds.) The Encyclopedia of
Sensors, vol. 4, American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, 2006, pp. 283-430.
6. Rice M.E., Galus Z., Adams R.N.: Journal of Electroanalytical Chemistry 143, 89 (1983).
7. Švancara I., Schachl K.: Chemicke Listy 93, 498 (1999).
8. Švancara I., Vytřas K., Kalcher K., Walcarius A., Wang J.: Electroanalysis 21, 7 (2009).
9. Mikysek T., Švancara I., Kalcher K., Bartoš M., Vytřas K., Ludvík J.: Analytical
Chemistry 81, 6327 (2009).
10. Mikysek T., Stočes M., Švancara I., Ludvík J.: RSC Advances DOI:
10.1039/C2RA20202F (2012).
11. Rubianes M.D., Rivas G.A.: Electrochemistry Communications 5, (2003).
12. Valentini F., Amine A., Orlanducci S., Terranova M.L., Palleschi G.: Analytical
Chemistry 75, (2003).
13. Tiyapiboonchaiya C., Pringle J.M., MacFarlane D.R., Forsyth M., Sun J.:
Macromolecular Chemistry and Physics 204, 2147 (2003).
14. Liu H., He P., Li Z., Sun C., Shi L., Liu Y., Zhu G., Li J.: Electrochemistry
Communications 7, 1357 (2005).
15. Rozniecka E., Shul G., Sirieix-Plenet J., Gaillon L., Opallo M.: Electrochemistry
Communications 7, 299 (2005).
16. Maleki N., Safavi A., Tajabadi F.: Analytical Chemistry 78, 3820 (2006).
17. Liu H., He P., Li Z., Liu Y., Li J., Zheng L.: Electrochemical and Solid-State Letters 8,
J17 (2005).
18. Shul G., Murphy M.A., Wilcox G.D., Marken F., Opallo M.: Journal of Solid State
Electrochemistry 9, 874 (2005).
81
Assessment of Potential Risk Connected with the Use of Mercury and Mercury Electrodes
(Zhodnocení potenciálního rizika spojeného s použítím rtuti a rtuťových elektrod)
Tomáš Navrátil a, Ivan Švancara b, Karolina Mrázová c, Kateřina Nováková a,
Jaromíra Chýlková b and Daniela Pelclová c
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Studentská 573, HB/C,
532 10 Pardubice, Czech Republic
c
Toxicological Information Centre, Department of Occupational Medicine of the First
Faculty of Medicine, Charles University in Prague, 120 00 Prague 2, Czech Republic
Abstract
This contribution tries to asses critically the danger connected with utilization of mercury in
different branches of human activities. The main attention was devoted to electrochemistry,
mainly to voltammetry and polarography. However, the other branches were characterized as
well: dentistry, in battery production, mining industry, and a few others. The most toxic and
contrarily almost nontoxic forms of mercury and of its compounds were characterized. Some
interesting cases of exposure to mercury, according to the database of the Czech
Toxicological Information Centre (TIC) (from years 1995 – 2011), have been reported.
Key Words: Mercury, Polarography, Voltammetry, Poisoning, Toxicity of mercury, Czech
Toxicological Information Centre.
Introduction
Mercury is present in our environment as the only liquid metallic element under room
temperature. For some people, it represents high danger in any form and dose. Nevertheless,
the specialists know that this danger is relatively limited. For the people dealing with
electrochemistry, the utilization is of mercury connected with the worldwide famous
polarography and voltammetry. However, the human life has been accompanied with mercury
for many hundreds or even for thousands of years. Even, the anthropogenic sources of
mercury cover 60 - 80 % of its present amount in the environment. In other words, up to about
40% of the total amount of this metal in the man’s neighborhood is occurring without
connection with human activities (soil erosion, volcanic activity, wood fires, evaporation of
oceans, etc.) 1.
On the other hand, there are many branches, where this very unique metallic element can find
its field of application. We can mention the most important ones 1:
- Measuring devices (thermometers, tonometers, barometers, electrochemical devices,
mainly polarographic and voltammetric analyzers);
- Mining industry;
- Electrolyzers;
- Batteries;
- Drugs;
- Paints;
- Dentistry.
We are witnessing increasing fears of toxicity of mercury in the last decades, which has
resulted in almost “mercury-phobia”, nowadays even reflected in resolutions of European
parliament 2. Strict ecological and safety rules introduced in the world, as well as popular
prejudices, fears and faults, essentially complicate the use of mercury (thermometers,
manometers, tonometers for blood pressure, etc.) or liquid mercury containing electrodes
82
(including hanging mercury drop electrode (HMDE)). Thus, it is prohibited to sell the body
thermometers containing mercury and the other similar devices (thermometers, barometers,
sfygmomanometrs) 3, the batteries and accumulators containing more than 0.0005 (m/m) % of
mercury 2, the button cells containing more than 2 % of mercury 2, and many other (mostly
liquid) mercury containing devices. On the other hand, it is allowed to use and sell compact
fluorescent lamps with mercury content below 5 mg per lamp 4, straight fluorescent lamps for
general purposes with mercury content below 10 mg per halophosphate lamp, triphosphate
lamp with a normal life time with mercury content below 5 mg per piece 4, special fluorescent
lamps and other lamps for special purposes containing mercury 4, etc. 1.
Experimental
Methods of Mercury Determination
It is necessary to take into account that mercury is present in different forms and
concentration levels in the environment. Probably, the most common methods of mercury
determination utilize spectroscopic techniques, more precisely, atomic absorption
spectroscopy (AAS). It is applicable for the determination of mercury vapors as well as for
the determination of this metal in solid forms (the solid or liquid material is thermally
decomposed, the generated vapors are concentrated in the form of the gold amalgam from
which mercury is released and determined using AAS (e.g., AMA 254, Altec, Czech
Republic) 5. Limit of detection (LOD) of Hg amounts to 0.01 ng Hg, in urine 0.1 ng.L-1.
Voltammetric techniques are applicable for Hg determination, too. For that purposes,
commonly used mercury electrodes must be replaced by a gold electrode (similarly as in case
of arsenic 6 determination) or by a glassy carbon electrode. Application of the respective
methods is more complicated, because the electrode surfaces must be mechanically polished
and finally electrochemically cleaned from the oxidation products and other rests of previous
analyses. The LODs amount to about 0.03 to 0.1 μg L-1.
Data Collection
Data concerning mercury intoxication were extracted from the special database (programmed
in MS Access) of the calls to the Czech TIC, Prague, between 1995 and 2011; the institution
of choice being the only center in CR. In each inquiry, several data concerning the exposure
were recorded according to the standard protocol, e.g., age and sex of the patient, time of the
intoxication, dose and symptoms of intoxication and whether first aid and any treatment has
already been administered. In addition, the prognosis of the patient at the time of the call was
considered and, if needed, further management and therapy were recommended. In case that
the patient needed a hospitalization, the discharge report from the hospital was asked for.
Results and Discussion
Various hygienic and similar limits valid for utilization of mercury, based on information
gained from databases available in the Czech TIC, were summarized in 1, 7. We can mention
some of them:
Urine: Normal population level: 3-7 µg L-1, biological limit in urine (for workers
according to the Czech legislation) 0.1 mg g-1 of creatinine (0.056 µmol mmol-1 of
creatinine) 8, 9.
Blood: Population level 4 – 10 µg L-1; biological limit for workers limit in Czech Republic
is not given, in USA population level 8 µg L-1 and occupational limit in exposed workers
15 µg L-1; in case of acute intoxications 9 the levels are > 95 µg L-1.
Air: Maximal allowed concentration: on average: 0.05 mg m-3; ceiling: 0.15 mg m-3, or
0.025 mg m-3 in the USA (ACGIH) 10.
83
Toxicity of Various Forms of Mercury
According to the general rule valid in toxicology: the doses are the most important. On the
other hand, it is necessary to add that the form is very important, too. The pattern and severity
of toxicity are highly dependent on the form of mercury and the route of exposure 1, 10.
The toxicity of the liquid mercury is connected with many fears and disinformation and
therefore, it is a very frequently discussed topic 10. Liquid metallic mercury is poorly absorbed
by the gastrointestinal tract, and acute ingestion has been associated with poisoning only in
the presence of abnormal gut motility that markedly delays normal fecal elimination or after
peritoneal contamination 7.
On the other hand, inhalation of Hg vapors is very dangerous, because they are absorbed
practically completely by lungs 1. Acute inhalation of high concentrations of mercury vapor
may cause severe chemical pneumonitis and noncardiogenic pulmonary edema 11. Chronic
intoxication from inhalation of mercury vapor produces a classic triad of tremor,
neuropsychiatric disturbances, and gingivostomatitis 10. Mercury molecules, soluble in fats,
come into brain circulation. They cross hematoencephalic barrier and they act neurotoxically.
Hg is oxidized to Hg2+ in brain tissue (these ions cross hematoencephalic barrier back only
less easily) which accumulates in cortex and basal ganglions 11. Similarly, mercury is
transformed using catalase to Hg2+ in erythrocytes, these ions are distributed into tissues and
they interact with –SH groups of enzymes. The highest depot is present in kidneys, mostly in
adrenals. Kidneys react by production of metallothioneins (MT) –cysteine rich proteins 12 which bind mercury 1. Therefore, the activities of some ecologists in removing of practically
nontoxic liquid mercury are very “interesting”, more precisely controversial e.g. from
thermometers, i.e., in small scale. On the contrary, they are much more active in introduction
of mercury containing saving bulbs and fluorescent tubes. Some of these controversial steps
were mentioned in 1, e.g., the example of usual 23 W saving light bulb (equivalent to
classical, totally mercury free, 100 W bulb) contains 5-10 mg of mercury 13. It is necessary to
take into account huge amount of produced saving light bulb and the fact that only 10 % of all
saving light bulbs is disposed ecologically 13. Moreover, it is necessary to take into account
that mercury is present in the form of vapors in fluorescent tubes.
The various amalgams have been present in human life for hundreds of years 7, e.g., Hg-Ag
mixtures used in dentistry 14, amalgamation processes in mining industry 11 and recently also
in polarography/voltammetry 15-31. In case of these alloys, many fears were introduced by
non-specialists. However, we can conclude that the dental amalgams used as dental fillings
and in voltammetry can be seen, from toxicological point of view as almost nontoxic 7.
The inorganic compounds which contain mercury are considered as highly toxic.
Nevertheless, it is necessary to differentiate among those soluble (e.g., HgCl2, Hg(NO3)2) and
insoluble (Hg2Cl2) in polar solvents (water). The oral lethal dose of white precipitate
(calomel, Hg2Cl2) amounts to 2-3 g, on the other hand sublimate, HgCl2, may kill in the
amount of 0.2-1 g, similarly as 0.4-2 g of Hg(NO3)2. Depending on the dose and time latency
since the ingestion, treatment with chelating antidotes may be successful 1. Therefore, very
controversial are tendencies of some research workers to replace the mercury electrodes
containing liquid mercury by mercury film modified solid electrodes, which are prepared by
deposition of mercury from plating solutions with soluble salts.
Organo-metallic compounds (RHgX or RHgR' -R and R' are hydrocarbon rests, mostly CH3-,
C2H5-, and X anion is halogenide, nitrate, sulfide or sulfate) are highly toxic. Especially,
84
methyl mercury, CH3Hg+, is highly dangerous due to its bioaccumulation capabilities. The
efficacy of chelating antidotes is not sufficiently proven and very low doses can be lethal 7, 32.
Dimaval (DMPS, unithiol) is the chelating antidote of choice. Compared with previously used
antidotes (such as BAL), it has many advantages, such as lower toxicity and the availability of
both oral and parenteral preparations. More is known about the pharmacokinetics of DMPS
(given p.o. or i.v) in human body than about any other dimercapto chelating agent. Another
possibility is to use DMSA (dimercaptosuccinic acid, succimer) 5, 33.
Conclusions
The human life is cross-linked with the existence of many chemical elements in their various
forms. Some of them are essential. Generally, mercury does not belong to them. In spite of
fears about high toxicity of mercury in all forms, it is necessary to differentiate among its
different forms and of course, very important role plays the dose of its toxic forms (organic,
soluble inorganic salts, and mercury vapors) to which the subject has been exposed. The
article tries to disprove the currently perceived information about high toxicity of amalgams
and ingested liquid mercury. We can conclude that the fields of application of mercury are
very wide. In some applications, it could be replaced by other substances (by ethanol in
thermometers) or technologies (e.g., in production of sodium hydroxide and chlorine).
However, it is necessary to consider the forms of mercury which should be replaced without
delay and others that do not represent a serious danger. Finally, there are some historical
aspects that could be considered with some benevolence. It is mainly polarography and the
use of the mercury drop-based electrodes whose modern
and often miniaturized
constructions
do not seem to represent any serious danger for environment and human life
as being used on specialized locations only and operated by the authorized and experienced
personnel. In order to tolerate the use of both HMDE and DME in reasonable scope, it also
requires a certain compromise with the eager propagators of new non-mercury electrodes in
electroanalysis, such as bismuth-based electrodes and related sensors 34, 35.
Acknowledgement
The authors gratefully acknowledge financial support from the GA AV CR (projects No.
IAA 400400806), the GA CR (project No. P206/11/1638, project No. P208/12/1645), and the
Ministry of Education, Youth, and Sports of the CR (project KONTAKT, No. MEB 091139).
References
1. Navratil T., Svancara I., Mrazova K., Novakova K., Sestakova I., Heyrovsky M.,
Pelclova D., v knize: Sensing in Electroanalysis Vol. 6.; (Kalcher K., Metelka R.,
Svancara I., Vytras K., Eds.),sv.Vol. 6 University Press Centre, Pardubice, 2011.
2. http://www.europarl.europa.eu/news/expert/infopress_page/064-6115-073-03-11-91120060309IPR06021-14-03-2006-2006-false/default_en.htm, Downloaded: 15.2.2007.
3. European_Commission, Commission Regulation (EC) No 552/2009 of 22 June 2009
amending Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council
on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) as
regards
Annex
XVII
(Text
with
EEA
relevance),
http://www.europarl.europa.eu/news/expert/infopress_page/064-6115-073-03-11-91120060309IPR06021-14-03-2006-2006-false/default_en.htm, 2009.
4. European_Commission, Consolidate Guide to EuRoHS Application Exemtions
2002/95/EC
of
January
27
2003,
http://www.europarl.europa.eu/news/expert/infopress_page/064-6115-073-03-11-91120060309IPR06021-14-03-2006-2006-false/default_en.htm, 2003.
85
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
Nerudova J., Cabelkova Z., Frantik E., Lukas E., Urban P., Blaha K., Pelclova D.,
Lebedova J., Cikrt M.: Int. J. Occ. Med. Env. Health 13, 131 (2000).
Navratil T., Kopanica M., Krista J.: Chem. Anal. (Warsaw) 48, 265 (2003).
Navratil T. In Medical Chemistry and Biochemistry; Institute of Medical Biochemistry
and Laboratory Diagnostic, 1st Faculty of Medicine, Charles University in Prague:
Prague, 2012.
MZ_CR, Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 432/2003 Sb., kterou se stanoví
podmínky pro zařazování prací do kategorií, limitní hodnoty ukazatelů biologických
expozičních testů a náležitosti hlášení prací s azbestem a biologickými činiteli, 2003.
http://www.drcranton.com/mercury/Mercury_test_results.htm, Downloaded: 7.11.2011.
Olson K. R.: Poison&Drug Overdose, 5th ed.; McGraw-Hill, USA 2007.
Navratil T., Rakovcova H., Senholdova Z.: XXIV. Modern Elektrochemical Methods,
Does represent mercury a danger in the polarographic laboratory?, Jetrichovice, 3.6.5.2004, (Barek J., Labuda J., Navratil T., Novotny L., Eds.), SES logis, p. 42.
Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005).
Vespalcova R.; Usporim.cz, Downloaded: 7.11.2011.
Tucek M., Bencko V., Krysl S.: Chem. Listy 101, 1038 (2007).
Yosypchuk B., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1739 (2002).
Yosypchuk B., Novotny L.: Chem. Listy 96, 756 (2002).
Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19,
2003 (2007).
Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009).
Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011).
Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ.
Chem. Lett. 9, 83 (2011).
Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy
103, 236 (2009).
Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007).
Danhel A., Peckova K., Cizek K., Barek J., Zima J., Yosypchuk B., Navratil T.: Chem.
Listy 101, 144 (2007).
Fischer J., Vanourkova L., Barek J., Navratil T., Novotny L., Yosypchuk B., Zima J.:
Chem. Listy 98, 612 (2004).
Peckova K., Navratil T., Yosypchuk B., Moreira J. C., Leandro K. C., Barek J.:
Electroanalysis 21, 1750 (2009).
Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007).
Vankova L., Maixnerova L., Cizek K., Fischer J., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B.:
Chem. Listy 100, 1105 (2006).
Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J.,
Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011).
Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010).
De Souza D., de Toledo R. A., Galli A., Salazar-Banda G. R., Silva M. R. C., Garbellini G.
S., Mazo L. H., Avaca L. A., Machado S. A. S.: Anal. Bioanal. Chem. 387, 2245 (2007).
Mikkelsen O., Schroder K.: Anal. Lett. 33, 3253 (2000).
Pelclova D., Lebedova J., Fenclova Z., Lukas E.: Nemoci z povolání a intoxikace
Karolinum, Prague 2006.
Gonzalez-Ramirez D., Zuniga-Charles M., Narro-Juarez A., Molina-Recio Y., Hurlbut K.
M., Dart R. C., Aposhian H. V.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 287, 8 (1998).
Svancara I., Vytras K.: Chem. Listy 100, 90 (2006).
Svancara I., Prior C., Hocevar S. B., Wang J.: Electroanalysis 22, 1405 (2010).
86
Use of Copper Solid Amalgam Electrode for Determination of Triazolic Fungicide
Tebuconazole
(Využití měděné amalgámové elektrody pro stanovení triazolického fungicidu
tebuconazolu)
a,b
Kateřina Nováková , Tomáš Navrátil a, Jana Jaklová Dytrtová c, and Jaromíra Chýlková b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic
c
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí
2, 166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
With the use of the newly developed mercury meniscus-modified copper solid amalgam
electrode (inner diameter 1.5 mm), the voltammetric behaviour of fungicide tebuconazole was
researched by differential pulse voltammetry (DPV) and cyclic voltammetry (CV). Applying
CV and elimination voltammetry with linear scan (EVLS), the reaction mechanism was
investigated. The optimum conditions for DPV determination of this triazolic fungicide were
identified in Britton-Robinson buffer/methanol (1:1, v/v) of pH 6.3. DPV with optimized
parameters (Ein = +400 mV, Eacc = +400 mV vs. Ag/AgCl/3M KCl, scan rate 20 mV s-1) was
used for determination of tebuconazole in analyzed solutions. Application the prolonged time
(60 s), the limit of detection 2·10-7 mol L-1 was reached. The applicability of the developed
method was verified on the analysis of the real soil solution sample.
Key Words: Tebuconazole, Copper solid amalgam electrode, Fungicide, DPV, Elimination
voltammetry with linear scan. Cyclic voltammetry.
Úvod
Použití pesticidů v zemědělství je z hledista maximalizace výnosů dnes již běžnou praxí 1.
Většina těchto látek je však lidskému zdraví škodlivá. Proto jejich analýza v biologických
matricích je v popředí zájmu analytické chemie. Nepřiměřené a nadměrné používání pesticidů
vede k jejich akumulaci v životním prostředí a má za následek značnou zátěž pro všechny
složky biosféry. Studie ukazují, že cílového škůdce zasáhne méně než 0,3% použitých
pesticidů, zbývajících 99,7 % je uvolňováno do životního prostředí, což představuje
potenciální riziko pro necílené organismy, člověka nevyjímaje 2.
Tebukonazol ((RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-pentan-3ol; Obr. 1) je běžně používaný fungicid. Používá se v zemědělství k ochraně rostlin proti
patogenním houbám a plísním. Zejména se využívá k ochraně z hlediska výživy významných
plodin jako je vinná réva, ječmen, kukuřice a pšenice. Tento fungicid inhibuje biosyntézu
ergosterolu a tím zabraňuje rozvoji mycelia 3, 4. Studie poukazují na to, že by mohl vyvolávat
hypertrofii nadledvin (ukázáno při chronických testech na psech) a mohl mít teratogenní
účinky na myši 5. Tebukonazol je v některých publikacích veden jako potenciální
neurotoxická látka, která by mohla mít za následek funkční endokrinní a imunitní změny 6.
Také je jednou z mnohých substancí, které jsou toxické pro vodní živočichy, a mohl by vést k
dlouhodobým nepříznivým vlivům na vodní prostředí. Z literatury přitom není jasné, jaký je
jeho poločas rozpadu v životním prostředí. Údaje se velmi různí, udává se 40 a 120 dní 7,
přičemž jeho stabilita je výzazně ovlivněha (zvýšena) přítomností kationtů v prostředí 8. Častá
aplikace tohoto fungicidu vede k akumulaci tebukonazolu v půdě a může ohrozit půdní
ekosystém, podzemní a povrchové vody 9. Tebukonazol může reagovat také se základními
prvky v půdě (jako je měď) 10 či například s nebezpečnými těžkými kovy jako kadmium 8.
87
Měď a tebukonazol spolu za pokojové teploty tvoří několik rozdílných komplexů s vysokou
stabilitou.
Cl
HO
N
N
N
Obr. 1. Strukturní vzorec fungicidu tebuconazolu.
Experimentální část
Zásobní roztok tebukonazolu (Sigma-Aldrich, CR) o koncentraci 0,0162 mol L-1 byl
připraven rozpuštěním 260 mg v 50 ml metanolu (Penta-Švec, CR), byl uchováván při teplotě
5°C a ve tmě. Analyzovaný roztok byl ředěním denně připravován, aby bylo minimalizováno
riziko adsorpce tebukonazolu na sklo. Brittonův-Robinsonův pufr (dále pak BR) v rozsahu pH
2-12 byl připraven ze zásobních roztoků kyselé (0,04 mol L-1) a zásadité složky (0,2 mol L-1).
Všechny roztoky byly připraveny v metanolu a všechny použité chemikálie byly čistoty p.a.
Voltametrická měření byla prováděna na Eco-Tribo polarografu (Polaro-Sensors, Praha, ČR)
řízeném programem MultiElChem 2.3 pro Windows 7 (Ústav fyzikální chemie
J. Heyrovského AV CR). Pracovní elektroda (p-CuSAE) měla vnitřní průměr 1,5 mm
(pracovní povrch měl velikost 1,8 mm2). Pracovní povrch použité meniskové měděné
amalgámové elektrody (m-CuSAE) byl 2,1 mm2 (opakovatelnost < ±5 %). V popisovaných
experimentech byla jako referentní elektroda použita Ag/AgCl/3M KCl, platinový drátek byl
použit jako elektroda pomocná (obě dvě z Elektrochemické detektory, Turnov, CR). Měření
byla prováděna při pokojové teplotě (23 ± 2°C). Kyslík byl odstraňován z měřeného roztoku
pomocí probublávání dusíkem (o čistotě 4.6, Messer Technogas, Praha, CR) po dobu 10
minut. Hodnoty pH byly měřeny s použitím pH metru Jenway 3505 (Bibby Scientific
Limited, UK). Pro všechna měření byla použita deionizovaná voda (Milli-Q-Gradient,
Millipore, Praha, CR).
Jako pracovní elektroda byla použita m-CuSAE. Elektroda se skládala z protáhlé skleněné
trubičky, jejíž užší konec byl naplněn měděným amalgámem a elektrický kontakt zajišťován
propojením s měděným drátkem. Poté byla elektroda ponořena do malého množství rtuti a po
dobu 15 sekund s ní v rtuti bylo mírně mícháno, čímž došlo k vytvoření rtuťového menisku.
Před začátkem práce, stejně jako po pasivaci elektrody či po každé přestávce mezi
jednotlivými měřeními, která byla delší než jednu hodinu, byla provedena elektrochemická
aktivace m-CuSAE v prostředí KCl při potenciálu -2200 mV za míchání po dobu 300 s, poté
byla elektroda opláchnuta vodou.
Většina měření pro studium voltametrického chování tebukonazolu na m-CuSAE byla
provedena pomocí metody diferenční pulzní volumetrie (DPV). Optimální parametry byly
nalezeny: počáteční potenciál Ein = +400 mV a konečný potenciál Efin = -2000 mV. Potenciál
akumulace byl optimalizován na Eacc = +400 mV. Jako nejvhodnější prostředí se jeví pufr
BR/metanol (1:1, v/v) o pH 6,4 a rychlost polarizace 20 mV s-1. Dusík byl přiváděn do měřicí
nádobky přes probublávačku, ve které byla směs metanol/destilovaná voda (1:1,v/v), přes
vzorek byl dusík veden vždy 10 minut před každým měřením. Každé měření bylo opakováno
nejméně 3krát a minimální počet standardních přídavků bylo 7. Získané výsledky byly
hodnoceny dle 11 a pomocí QC Expert software (Trilobyte, CR).
88
Výsedky a diskuze
Voltametrické chování tebukonazolu v závislosti na pH bylo studováno pomocí metody
cyklické voltametrie (CV) na m-CuSAE. Použitá koncentrace pro optimalizaci měřicích
parametrů činila 3,2·10-5 mol L-1. Nejvíce zřetelný a nejlépe reprodukovatelný pík byl
registrován v prostředí BR pufru s metanolem (1:1,v/v) při pH = 6,4. Toto pH bylo následně
použito ve všech měřeních. Pík (náležící komplexu tebukonazolu a mědi) nebyl pozorován ani
v silně kyselém (pH = 2) a ani v silně alkalickém prostředí (pH = 12). Polohy všech píků byly
posouvány se zvyšujícím se pH k záporným hodnotám potenciálů. Závislost na rychlosti
polarizace byla zjištěna také pomocí CV. Závislosti na rychlosti polarizace byly lineární jak
pro oxidační, tak pro redukční píky v rozsahu 10 – 160 mV s-1, jako nejvhodnější byla
vybrána hodnota 20 mV s-1.
EVLS byla použita pro charakterizaci procesů probíhajících na povrchu rtuťového menisku
CuSAE (v průběhu katodického i anodického scanu). S použitím této techniky byly křivky
hodnoceny v rozsahu rychlostí polarizace 10 - 160 mV s-1. V katodickém směru DC
voltamogramu jsme byli schopni rozeznat 6 signálů, které patří jednotlivým procesům. Ionty
Cu2+ jsou uvolňovány z měděného amalgámu při pozitivním potenciálu (během akumulačního
kroku). Můžeme tedy předpokládat, že dva nejvíce pozitivní signály (-90 mV a -170 mV)
patří k tvorbě buď dvou různých komplexů iontů Cu2+ s ionty tebukonazolu nebo tvorbě
komplexů Cu2+ a Cu+ s tímto ligandem. V souladu s touto hypotézou, dva nejvíce negativní
signály (-400 mV a -500 mV) patří k rozkladu těchto komplexů, přičemž měděné kationty se
opět redukují na kovovou měď. Signály okolo -250 mV a -290 mV, které jsou registrovány i
v základním elektrolytu, lze vysvětlit jako píky odpovídající redukci mědi z Cu2+ na Cu+ a z
Cu+ na Cu0.
Koncentrační závislosti byly měřeny za optimálních podmínek. Po vložení potenciálu
akumulace byla zjištěna nejnižší stanovitelná koncentrace o hodnotě 2·10-7 mol L-1. Stanovená
koncentrace tebukonazolu v reálném vzorku půdního výluhu činila (7,15·± 0,56)·10-4 mol L-1
(R = 0,998).
Závěr
V této práci bylo hlavním cílem vypracovat metodiku stanovení tebukonazolu pomocí CuSAE
na základě tvorby jeho komplexů s mědí. Pomocí vyvinutého postupu lze na použité
m-CuSAE stanovit tebukonazol v submikromolárních koncentracích při reprodukovateknosti
lepší než 5 %. Aplikovatelnost této metody byla vyzkoušena na reálném vzorku.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou grantů GA AV CR (IAA400400806), GA ČR (P206/11/1638
a P208/12/1645), S grantu MŠMT ČR a Studentského grantu UPa (SGFCHT05/2012).
Literatura
1. http://www.epa.gov/pesticides/, 27.3.2012.
2. Munoz-Leoz B., Ruiz-Romera E., Antiguedad I., Garbisu C.: Soil Biol. Biochem. 43,
2176 (2011).
3. Wang X., Wang X., Zhang H., Wu C., Wang X., Xu H., Wang X., Li Z.: Chirality 24,
104 (2012).
4. Sehnem N. T., Souza-Cruz P., Peralba M. D. R., Ayub M. A. Z.: J. Env. Sci. Health - Part
B 45, 67 (2010).
5. WHO, v knize: Pesticide residues in food 2008; (World Health Organization, Rome,
Italy, 2008.
89
6.
7.
8.
Filipov N. M., Lawrence D. A.: Toxicol. Sci. 62, 185 (2001).
Shen Z., Zhu W., Liu D., Xu X., Zhang P., Zhou Z.: Chirality 24, 67 (2012).
Norkova R., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Water, Air, Soil Pollut.,
10.1007/s11270 (2012).
9. Jakl M., Jaklova Dytrtova J., Cadkova E.: An electrochemical approach to study biscoordinated copper/tebuconazole complexes BEST servis, Ústí nad Labem, Jetřichovice
2011.
10. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Cadkova E., Komarek M.: Rapid Commun.
Mass Spectrom. 25, 1037 (2011).
11. Miller J. N., Miller J. C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 2nd ed.;
Pearson Education, Harlow 2005.
90
Possible Application and Monitoring of Electrochemical Treatment of Waters Using
Special Electrodes and Techniques
(Možnosti provádění a sledování elektrochemické úpravy vod s využitím speciálních
elektrod a technik)
Ladislav Novotný, Libor Dušek, Barbora Vystrčilová, and Renáta Petráňková
University Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Environmental and
Chemical Engineering, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
History and possible application and monitoring of electrochemical treatment of waters using
special electrodes and techniques were described. Use of electrooxidation processes,
mechanisms and products for cleaning waters or aqueous solutions was discussed. Ready
analysis of dissolved iron (the electrooxidation product) using voltammetry with a hanging
mercury drop electrode or special amalgam electrodes, or potenciometric pH-measurements
have proved suitable for the mentioned purposes.
Key Words: Electrochemical cleaning waters, Voltammetry, Special mercury or amalgam
electrodes, Potenciometric (pH) measurements.
Úvod
Chemické úpravy pitných a užitkových vod byly v minulosti vedeny zejména snahou o
zajištění jejich zdravotní nezávadnosti. Jejich historie sahá do období poloviny 19. století, kdy
byl v Londýně použit chlor pro dezinfekci veřejné studny, označené jako zdroj epidemie
cholery 1,2. Průběžná dezinfekce vody ve vodojemech byla pak představena v r. 1910 v USA.
V Čechách byla tato vodárenská technologie zavedena zpočátku nepravidelně a později
systematicky 3 od r. 1924; poprvé se tak stalo v pražské Vršovické vodárně. Zmíněné
chlorování přineslo do vodárenství výrazné zkvalitnění pitných a užitných vod. Má se též za
to, že se podstatně zasloužilo o prakticky vymýcení řady infekčních chorob (zejm., cholery) v
oblastech, kde bylo aplikováno. Současně však výzkum a praxe ukázaly, že obsah volného
chloru ve vodě regulovaný stanovenými limity 4 (např. v pitné vodě 0,3 mg L-1) musí být
sledován, nemá-li být sám příčinou zdravotní závadnosti vody. Je známo, že vedle jeho
přímého působení na organizmy může např. v jeho přítomnosti docházet k vytváření řady
nebezpečných chlorderivátů eventuálně přítomných stop organických látek, jako jsou fenoly,
huminové kyseliny, polyaromáty apod. V průmyslově vyspělých zemích je proto snaha
vyvíjet a aplikovat takové technologie, které minimalizují riziko tvorby zmíněných
chlorderivátů. Mezi nadějné směry se v tomto směru řadí využití elektrochemických metod.
Cílem práce bylo posouzení možností provádění a sledování elektrochemické úpravy vod s
využitím speciálních elektrod, elektrochemických případně i analytických technik a podle
možností i návrh dalšího postupu výzkumu, umožňující návrh vhodných uspořádání a režimů
pro čištění specifikovaných typů vod, např. znečištěných oleji, ropnými látkami ap.
Experimentální část
Průzkumné experimenty byly prováděny zejména s využitím sestav nebo komponent
polarografu PC-ETP (po rekonstrukci společností ECO-TREND PLUS s.r.o., Praha), popř. i
PA4 (Laboratorní přístroje LP, Praha), s miniaturizovanou rtuťovou tužkovou elektrodou, se
stříbrnou amalgamovou elektrodou ve variantě se rtuťovým meniskem 5. Podle potřeby byla
též využita elektrodová uspořádání s plastovými nástavci či zakončeními a s modifikovanými
amalgamy dle užitných vzorů 8-10. Voltametrická měření byla prováděna v tříelektrodovém
uspořádání v režimu DPV, výška pulzu 50 mV, frekvence 5 Hz, popřípadě i v režimu DCV;
91
roztoky obsahující rozpuštěné železo byly analyzovány v prostředí 0,1 M chloracetátového
pufru pH 3 obsahujícího 0,1 M chelaton III. Pro měření pH byly použity upravené elektrody
od spol. Elektrochemické detektory, Turnov. Použité elektrolyzéry (např. typu 6,7) mohly
pracovat buď v potenciostatickém nebo galvanostatickém režimu. Čistota použitých
chemikálií byla p.a.; podle potřeby byly měřené roztoky probublány dusíkem.
Výsledky a diskuse
Posouzení možností využití elektrochemických metod pro čištění vymezených typů vod bylo
zaměřeno jak na oblast uplatnění vhodných procesů, tak na možnosti alespoň orientační
analýzy či sledování zvolených složek roztoků. Pro naše potřeby byly uvažovány takové
postupy, do nichž bylo možné začlenit vhodné elektrochemické kroky, nebo které přímo
využívaly elektrochemických mechanizmů k degradačním dějům. Při tom byly ověřeny resp.
modelově odzkoušeny např. následující možnosti: Je známo 11, že v přítomnosti Cl lze za
vhodného režimu generovat elektrooxidací "in-situ" Cl2 a současně omezit i riziko přesycení
roztoku plynným chlorem. V závislosti na pH dochází pak k tvorbě různě zastoupených
dalších iontových složek roztoku, např. ClO , v silně kyselé oblasti i Cl3 , v alkalickém
prostředí ve větší míře ClO2 , ClO3 a ClO4 a vedle toho k případnému fotorozkladu ClO na
O2, ke zpětné elektroredukci ClO na Cl , apod. V našem případě jsme testy prováděli za
použití železné katody i anody s využitím upraveného průběhu střídavého proudu tak, aby
současně docházelo k intenzivní elektrooxidaci Fe s následnou koagulací, dík tvorbě sraženin
hydroxidů. Zvolené podmínky odpovídaly představám o modelu anodicko-katodické
polarizace obou železných elektrod a dosažení ustálených polarizačních cyklů,
doprovázených tvorbou příslušných oxidačních a redukčních produktů. Použité proudové
hustoty byly pod úrovní příp. na úrovni 0,1 A cm-2, kdy např. v oblasti pH 5-6 docházelo k
výrazné tvorbě elektrooxidačních produktů železa, schopných mj. účinně sorbovat nežádoucí
složky roztoku. Poměrně vysoká proudová hustota v galvanostatickém uspořádání (příp.
poměrně vysoké efektivní napětí v řádu několika voltů v potenciostatickém uspořádání)
umožňovaly souběžné využití dalšího elektrochemického mechanizmu, a to elektrooxidace
přítomných OH na hydroxylový radikál OH 12 na povrchu kovu (podobně jako v 13). Tento
meziprodukt se pak mohl uplatnit jak přímo jako reaktivní degradační činidlo, tak nepřímo v
rámci interakce s Cl za tvorby Cl2 či ClO .
V případě orientační elektroanalýzy pro sledování průběhu (resp. postupu) uvedené
elektrolýzy se ukázaly jako aplikovatelné např. stanovení Fe2+ v odebraných a vhodně
upravených vzorcích (po vhodné úpravě, např. silném okyselení ap.) pomocí technologicky
využitelných řešení rtuťových, amalgamových, speciálních hybridních amalgamových nebo
podobných elektrod, nebo nepřímo na základě měření změn pH roztoku. V posledně
uvedeném případě bylo využito přibližně lineárního posuvu pH z neutrální do kyselé oblasti
při přídavku roztoků obsahujících Fe2+, vlivem tvorby hydroxyoproduktů; při změnách
koncentrace 0 až 0,01 gion·L-1 Fe2+ činil např. posuv pH = 1,6.
Závěr
Provedený rozbor i experimenty potvrdily možnosti provádění a sledování elektrochemické
úpravy vod s využitím speciálních elektrod, elektrochemických mechanizmů a technik a
umožnily zvolit další postup výzkumu v uvedeném směru.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou projektů VZ 0021627502-UPa a TACR TA01020730.
92
Literatura
1. Rideal S.: Disinfection and Disinfectans. C. Lochwood and son, 1895.
2. Rideal S.: Water and its purification, C. Lochwood and son, 1902.
3. Z expozice Muzea pražského vodárenství a vodárny v Podolí, 20.3.2010 Praha, zřizovatel
expozice Pražské vodovody a kanalizace a.s.
4. Nařízení vlády č. 61/2003 Sb. Příloha 3.
5. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002).
6. Dušek L.: Chem. Listy 104, 846 (2010).
7. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2006-18099, UV 17030.
8. Novotný L.: ÚPV Praha, P 2001-1, č. 298 623.
9. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2007-19501; UV 19062.
10. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2009-22130; UV 21734.
11. Klikorka S., Hájek B., Votinský S.: Obecná a anorganická chemie. SNTL, Praha 1985.
12. Bonfatti F., Ferro S., Lavezzo F., Malacarne M., Lodi G., Battisti A.: J. Electrochem. Soc.
147, 592 (2000).
13. Novotný L., Navrátil T.: Chem. Listy 90, 121 (1996).
93
Direct Voltammetric Determination of Aclonifen in Natural Waters at a Silver Solid
Amalgam Electrode
(Přímé voltametrické stanovení aclonifenu v přírodních vodách na pevné stříbrné
amalgámové elektrodě)
Vít Novotný
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Department of Analytical
Chemistry, Charles University, Albertov 2030, 128 43 Prague 2, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
Abstract
A method for the SPE extraction and determination of Aclonifen in drinking water and Vltava
river water by differential pulse voltammetry on a meniscus modified silver solid amalgam
electrode is described. SPE preconcentration from 100 mL to 10 mL, 1 L to 10 mL and 1 L to
1 mL has been used. All measured calibration dependencies are linear. The detection limit for
the determination of AC in Vltava river water is 2·10-9 mol L-1. Lower concentrations could
not be determined due to unknown interfering substances. The detection limit for the
determination of AC in drinking water is 2·10-10 mol L-1. SPE followed DPV AgSAE is
therefore a suitable method for determining trace amounts of Aclonifen in environmental
waters.
Key Words: Aclonifen, Solid phase extraction, Silver solid amalgam electrode, Drinking
water, River water.
Introduction
Aclonifen (AC) is a preemergent diphenyl ether herbicide (DPhEH) used to combat weeds in
potatoes, peas, carrot, corn, rice and sunflowers 1. DPhEHs inhibit plant growth via their
photodegradation products that inhibit the activity of protoporphyrinogen oxidase. As other
DPhEHs AC exhibits some side effects 2, such as high toxicity for aquatic organisms and
hepatotoxicity in mammals in high doses 3. It is listed as a suspected human carcinogen and
substances with similar structures are endocrine disruptors and have adverse effects on blood
formation 4, 5. It has been registered for use in the European Union since 2008 under the trade
names Bandur, Bander or Mikado. Silver solid amalgam electrodes (AgSAE) have already
proved themselves to be suitable sensors for the determination of trace amounts of pollutants
in the environment 6 including the determination of some DPhEHs at a meniscus modified
AgSAE (m-AgSAE) 7, 8. Among their advantages are low price, high sensitivity, easy
handling and mechanical robustness. Various methods for the determination of AC are
described in the literature 9-13, some use SPE but none uses voltammetry at AgSAE.
Materials and methods
The stock solution (c 1·10-3 mol L-1) of Aclonifen (2-chloro-6-nitro-3-phenoxybenzenamine
99%, Sigma–Aldrich Laborchemikalien, Germany.) has been prepared by dissolving 0.02648
g of AC in 100 mL of methanol. Stock solutions of lower concentrations were prepared by
precise diluting of the stock solution with methanol. The stock solution was kept in the dark in
the refrigerator. The stability of the stock solution has been checked by UV-VIS
spectrophotometric measurements. The stock solution was stable for at least 6 months in the
conditions under which it was kept. Other used chemicals were boric acid, acetic acid (99%),
phosphoric acid (85%), sodium hydroxide, potassium chloride, all chemicals p. a., Lachema
Brno, Czech Republic. Methanol p.a. Merck, Germany was used. Britton-Robinson buffers of
the desired pH were prepared by mixing of 0.2 mol L-1 NaOH with a solution containing
0.04 M boric acid, phosphoric acid and acetic acid. Measurements of pH were performed on a
Jenway 3510 (Jenway, Essex, Great Britain) pH-meter with a combined glass membrane
94
electrode (type 924 005). The electrode was calibrated by standard buffer solutions in water.
Deionized water (Millipore, USA) was used as a solvent. Palmsens Electrochemical Sensor
Interface (Palm Instruments BV, Ruitercamp, The Netherlands) and the PalmsensPC software
was used for all voltammetric techniques. The software was running under the Windows XP
(Microsoft Corp.) operating system. Pulses of width of 80 ms and height of –50 mV were
used while performing DPV. A polarization rate of 20 mV.s-1, and potential resolution of
5 mV were used. All measurements were performed using a three electrode system. A silver
chloride electrode (1 mol L-1 KCl) type RAE 113, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic, a
platinum wire auxiliary electrode and a meniscus modified silver solid amalgam electrode that
was purchased from Polaro Sensors, Prague, Czech Republic. After extended periods of
storage and if the behavior of the electrode starts changing the meniscus is renewed by
immersing the electrode in a vial containing a small quantity of mercury, the process is called
amalgamation. Each day at the start of using the electrode it was activated in 0.2 M KCl
solution by applying of a potential of -2200 mV for 300 s, as described in 14.
For the SPE preconcentration 3 mL 200 mg Lichrolut® (Merck, Germany) RP-18E cartridges
were used. The cartridges were conditioned by passing 10 mL methanol and 10 mL deionized
water through them. After the extraction they were washed by 10 mL deionized water and
dried in air for 5 min. The trapped analyte was then eluted by 2 ml methanol.
In the concentration range 2·10-8 - 1·10-7 mol L-1 samples were prepared by dissolving the
appropriate amount of 1·10-4 mol L-1 AC stock solution in 100 mL dinking water, performing
SPE, eluting by 2 mL methanol into a 10 mL volumetric flask and filing up to 10 mL by BR
buffer pH 12. This solution was then used for measurement. The drinking water was taken
after letting it flow for 5 minutes to remove any impurities or gas pockets in the tubing (SPE
1). In the concentration range 2·10-9 - 1·10-8 mol L-1 samples were prepared by dissolving the
appropriate amount of 1·10-5 mol L-1 AC stock solution in 1000 mL dinking water, adding 10
mL methanol, performing SPE, eluting by 2 mL methanol into a 10 mL volumetric flask and
filing up to 10 mL by BR buffer pH 12 (SPE 2).
In the concentration range 2·10-10 - 1·10-9 mol L-1 samples were prepared by dissolving the
appropriate amount of 1·10-6 mol L-1 AC stock solution in 1000 mL dinking water, adding 10
mL methanol, performing SPE, eluting by 2 mL methanol into a 5 mL volumetric flask. The
methanol solution was then dried at room temperature by a flow of nitrogen and then
dissolved in 1 mL of a mixture of 20% methanol and 80% BR buffer pH 12 (SPE 3).
Analogous procedures were used for the determination of AC in Vltava river water. The pH
of the river water model samples was adjusted to 8 by adding 20 mL BR buffer pH 8 and they
were filtered using Macherey-Nagel GF 3 glass filters to remove mechanic impurities.
Values of points in calibration curves are arithmetic averages of 3 measurements. Error bars
are derived from the same data. Detection limits are calculated according to the formula
LD = 3.3·σ/S 15 where σ is the standard deviation of 10 measurements of the lowest
concentration when the signal can still be evaluated and S is the slope of calibration curve in
the vicinity of that concentration.
Results and discussion
The voltammograms of AC in the concentration range (2·10-10 - 1·10-9) mol L-1 in drinking
water can be seen in Fig. 1. The calibration dependences is linear in the concentration range
from 2·10-10 mol L-1 to 10·10-7 mol L-1 and lower concentrations could not be determined. The
95
detection limit reached is 1.6·10-10 mol L-1. The voltammograms of AC in the concentration
range (2·10-9 - 1·10-8) mol L-1 in Vltava river water can be seen in Fig. 2. The calibration
dependence is linear in the concentration range from 2·10-9 mol L-1 to 10·10-7 mol L-1 and
lower concentrations could not be determined due to interfering substances present in the
matrix. The detection limit reached is 1.9·10-9 mol L-1. The parameters of the calibration
dependencies in real samples can be found in Table I.
-12
-2,0
6
I [nA]
-1,5
-1,0
-11
5
-0,5
0,0
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
4
1,0
-1
c [nmol.L ]
-10
3
2
1
-9
-600
-700
-800
E [mV]
-900
Fig. 1. DP voltammograms of AC at m-AgSAE after SPE extraction from 1 L drinking water.
The corresponding calibration dependence is in the inset. Measured in a solution obtained by
dissolving the dried eluate after SPE in 1 mL of solution of BR buffer pH 12 and MeOH (8:2).
AC concentration in drinking water 0 (1), 2·10-10 (2), 4·10-10 (3), 6·10-10 (4), 8·10-10 mol L-1
(5), and 1·10-9 mol L-1 (6).
-15,0
I [nA]
6
-4
5
-3
-13,5
-2
4
-1
-12,0
0
0
2
4
6
8
10
3
-1
c [nmol.L ]
2
-10,5
1
-9,0
-600
-700
-800
-900
E [mV] -1000
Fig. 2. DP voltammograms of AC at m-AgSAE after SPE extraction from 1 L drinking water.
The corresponding calibration dependence is in the inset. Measured in a solution obtained by
diluting 2 ml of the methanol eluate in a 10 mL volumetric flask by BR buffer pH 12. AC
concentration in river water 0 (1), 2·10-9 (2), 4·10-9 (3), 6·10-9 (4), 8·10-9 mol L-1 (5), and
1·10-8 mol L-1 (6).
Conclusions
A method for the determination of AC in model samples of drinking water using SPE
preconcentration followed by DPV at m-AgSAE has been successfully developed. The
calibration dependences in drinking water are linear in the concentration range from 2·10-10 to
1·10-7 mol L-1. The detection limit reached is 1.6·10-10 mol L-1. A method for the
determination of AC in model samples of Vltava river water by SPE preconcentration
followed by DPV at m-AgSAE has been successfully developed. The calibration dependences
in Vltava river water are linear in the concentration range from 2·10-9 to 1·10-7 mol L-1. The
detection limit reached is 1.9·10-9 mol L-1. Further attempts to decrease the detection limits in
drinking water even lower seem impractical, as they would involve extracting the substance
96
from volumes higher than 1 L or performing DPV measurements in volumes lower than
1 mL. In river water a procedure to identify and remove the interfering substances would have
to be developed in order to reach lower concentrations.
Table I.
Parameters of the calibration dependences of AC in Vltava river and drinking water.
c denotes the investigated concentration range, k denotes the slope of the calibration curve, q
the intercept, σ the standard deviation of 10 measurements of the lowest concentration, R the
correlation coefficient and LD the limit of detection.
c
procedure
water
k
q
σ
R
LD
-1
-1
[mol L ]
[nA mol L]
[nA]
[nA]
[mol L-1]
(2-10)·10-8
SPE 1
deionised -3.52·107
0.08
0.288 -0.9918
2.7·10-8
-8
7
(2-10)·10
SPE 1
drinking -4.15·10
0.014
0.296 -0.9988
2.4·10-8
(2-10)·10-9
SPE 2
drinking -4.90·108
0.61
0.13
-0.9954
9·10-10
-10
9
(2-10)·10
SPE 3
drinking -1.65·10
0.001
0.08
-0.9961
1.6·10-10
(2-10)·10-8
SPE 1
river
-4.66·107
-0.51
0.304 -0.9986
2.2·10-8
-9
8
(2-10)·10
SPE 2
river
-3.83·10
-0.034
0.218 -0.9952
1.9·10-9
Acknowledgements
Financial support of this work, provided by The Ministry of Education, Youth and Sports of
the Czech Republic (project MSM 0021620857), Technological Agency of Czech Republic
(project TA01020565), Charles University in Prague (project SVV 2012-265201) and Grant
Agency of Czech Republic (project P206/12/G151) is gratefully acknowledged.
References
1.
Cobucci T., Prates H.T., Falcão C.L.M., Rezende M.M.V.: Weed Sci. 46, 258 (1998).
2.
Kilinc Ö., Reynaud S., Perez L., Tissut M., Ravanel P.: Pestic. Biochem. Physiol. 93, 65
(2009).
3.
Scrano L., Bufo S.A., D’Auria M., Meallier P., Behechti A., Shramm K.W.: J. Environ.
Qual. 31, 268 (2002).
4.
Teshima R., Nakamura R., Nakajima O., Hachisuka A., Sawada J.-I.: Toxicol. Lett. 150,
277 (2004).
5.
Francis B.M., Metcalf R.L., Lewis P.A., Chernoff N.: Teratology 59, 69 (1999).
6.
Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
7.
Novotný V., Barek J.: Chem. Listy 103, 217 (2009).
8.
Cabalková D., Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B.: Chem. Listy
103, 236 (2009).
9.
Laganà A., Fago G., Fasciani L., Marino A., Mosso M.: Anal. Chim. Acta 414, 79
(2000).
10. Sheu H.-L., Sung Y.-H., Melwanki M.B., Huang S.-D.: J. Sep. Sci. 29, 2647 (2006).
11. Pang G.-F., Liu Y.-M., Fan C.-L., Zhang J.-J., Cao Y.-Z., Li X.-M., Li Z.-Y., Wu Y.-P.,
Guo T.-T.: Anal. Bioanal. Chem. 384, 1366 (2006).
12. Perreau F., Einhorn J.: Anal. Bioanal. Chem. 386, 1449 (2006).
13. Sagratini G., Ametisti M., Canella M., Cristalli G., Francoletti E., Giardina D., Luminari
M.C., Paparelli G., Picó Y., Volpini R., Vittori S.: Fresenius Environ. Bull. 16, 973
(2007).
14. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 14, 1733 (2002).
15. Hayashi Y., Matsuda R., Ito K., Nishimura W., Imai K., Maeda M.: Anal. Sci. 21, 167
(2005).
97
Chemically modified DNA for DNA-protein interaction studies: electroactive and
luminescent labeling versus specific molecular recognition
(Chemicky modifikované DNA pro studium interakcí DNA s proteiny: elektroaktivní a
luminiscenční značení versus specifické molekulární rozpoznání)
Petr Orság a, Miroslav Fojta a, Luděk Havran a, Zdenka Vychodilová a, Medard Plucnara a,
Tomáš Komárek a, Jan Riedl b, Michal Hocek b, and Hana Pivoňková a
a
Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135,612 65 Brno,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2,
166 10 Prague 6, Czech Republic
Abstract
Labeled nucleic acids bearing various electroactive (7-deazaguanine, anthraquinone,
nitrophenyl or an oxoosmium complex) or luminescent (phtalimide derivatives) moieties were
applied in DNA-protein interaction studies. Diverse effects of the modifications on sequencespecific recognition and/or non-specific DNA binding by tumor suppressor protein p53 were
observed, which has been taken into consideration in selection of electroactive tags suitable
for construction of labeled ON substrates for DNA-protein interaction probing.
Key Words: Modified DNA, Labeling, Molecular recognition, Electrochemical detection,
Luminescence.
Introduction
Modified/labeled nucleic acids are widely used as a potent tool for various bioassays,
including techniques designed for nucleotide sequence analysis (DNA hybridization,
detection of mutations/polymorphisms, gene expression assay) as well as DNA-protein
interaction experiments 1. Synthetic oligonucleotides (ONs) bearing various modified
components (sugars, nucleobases) are utilized to optimize specific properties of the ONs and
their interactions in the given assay (such as stability of hybrid duplexes, prevention of
Hoogsteen pairing) while extra functional groups are often attached as anchors (to immobilize
ON probes at surfaces) or as labels producing well detectable signals in connection with a
proper detection platform (e.g., optical or electrochemical). However, chemical modification
of DNA may change its molecular recognition features which in turn may affect its
interactions with other molecules, such as complementary DNA strands (in DNA
hybridization studies) or proteins. In this work we studied effects of ON modifications,
applicable as electroactive or fluorescence labeling, on sequence-specific and non-specific
interactions of the modified ON with tumor suppressor p53 protein 2.
Experimental
Labeled oligonucleotides (ONs) were prepared through primer extension incorporation of
modified deoxynucleotide triphosphates (dNTPs; for more details see 3), terminal
deoxynucleotidyl transferase (TdT) tailing reaction (details in 4) or chemical modification of
oligoT overhangs with an oxoosmium complex (see contribution by Pivoňková et al. in this
proceedings).
DNA-protein binding studies were conducted using electrophoretic mobility shift assay
(EMSA) and/or electrochemical immunoprecipitiation assay with magnetic beads (MBIP).
Purified p53 protein was incubated with labeled DNA substrate and unlabeled non-specific
competitor DNA in 50 mM KCl, 5 mM Tris pH 7.6, 2 mM DTT, 0.01% Triton-X100 for
30 min on ice, followed by separation in 5 % native polyacrylamide gel and autoradiography.
For details of the MBIP assay, see contribution by Pivoňková et al.
98
Electrochemical analysis: Modified dNTPs were analysed by conventional cyclic
voltammetry (CV) while oligonucleotides by ex situ (adsorptive transfer stripping) CV at
hanging mercury drop electrode (HMDE), or basal-plane pyrolytic graphite electrode (PGE).
Oligonucleotides were accumulated at the electrode from 5 L aliquots containing 0.2 M
NaCl, followed by the electrode rinsing with deionized water and transfer into standard
electrochemical cell. CV settings: scan rate 0.5 V/s, initial potential 0.0 V, for switching and
final potentials see figures. Background electrolyte: 0.5 M ammonium formate, 0.05 M
sodium phosphate, pH 6.8 (for measurements of DNA at HMDE) or 0.2 M sodium acetate pH
5.0 (other measurements). All measurements were performed at room temperature using an
Autolab analyzer (Eco Chemie, The Netherlands) in connection with VA-stand 663
(Metrohm, Herisau, Switzerland) and a three-electrode system with Ag|AgCl|3M KCl
electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode.
Results and discussion
In our previous work we applied various base-modified nucleotides (such as
7-deazaguanosine 5, nucleotide conjugates with nitrophenyl or anthraquinone 3, or thymidine
adducts with oxoosmium moieties 6) as redox DNA labels suitable for electrochemical
monitoring of DNA hybridization, single nucleotide polymorphism typing, enzymatic DNA
synthesis via primer extension or via PCR. The above mentioned species produce specific
electrochemical signals due to reduction or oxidation, allowing their distinction from one
another as well as from natural DNA components being in general reduced/oxidized at more
negative/positive potentials. Here we focused on the effects of ON modifications on the
interactions of p53 protein with the modified ONs, and in some cases on their applicability in
novel DNA-protein interactions assays.
1
2
3
4
5
p53-DNA
Fig. 1. Binding of wild type p53 protein to 50-mer ONs involving (lanes 1-3) or lacking
(lanes 4-5) a specific p53 binding site (p53CON). Lane 1 and 4: unmodified ONs; lane 2: ON
in one strand globally modified with 7-deaza guanine; lanes 3 and 5: ONs in one strand
globally modified with 4-aminophthalimide (API) attached to cytosine at 5-position via
propargyl linker (structure of corresponding dNTP shown on the right).
Effects in internal modifications of ON substrates encompassing or lacking specific
recognition site for the p53 (p53CON) was tested. We observed that global substitution of
guanine residues within the entire p53CON with 7-deazaguanine resulted in a loss of
sequence-specific recognition of the modified DNA by the protein (resulting in disappearance
of a specific band on the autoradiogram resulting from EMSA, Fig. 1, lane 2). On the other
hand, substitution of guanines with 7-deazaguanines in a stretch flanking the p53CON (i.e.
outside the p53CON) did not affect the sequence-specific p53-DNA binding, offering a
possibility of using the 7-deazaguanines as an electrochemical label.
Analogous experiments were performed with cytidine conjugates bearing fluorescent
phtalimide derivatives [4-aminophthalimide (API) or 4-(N,N-dimethylamino)phthalimide
99
(dAPI), see an example in Fig. 1). Surprisingly, p53CON with cytosines fully substituted with
cytosine-API conjugate retained p53 binding (Fig. 1, lane 3). Control experiment with nonspecific ON (lacking p53), which was not bound by the protein in its unmodified form (Fig. 1,
lane 4) showed a strong binding after incorporation of the API-labeled cytosine. Hence, this
observation demonstrates an example of augmentation of non-specific protein-DNA binding
due to the DNA modification, which may compensate for a loss of the specific binding and
strongly suggests necessity of conducting careful control experiments before applying new
types of labeled DNA in biosensing. Formation of stable complexes of p53 with the APImodified DNA has nevertheless recently been utilized in studies of the protein binding on the
API fluorescence7. In addition, the phtalimide exhibit electrochemical activity at both mercury
(Fig. 2) and carbon electrodes, offering possibilities of electrochemical monitoring of DNA
modification with these species and distinction between API and dAPI-modified DNAs
(Fig. 2).
0
-20
0.0
C red
-40
I[ A]
I[ A]
-0.5
API
-1.0
dA TP
dAPI
dA TP
API
dC TP
dAPI
dC TP
Ared
-1.5
-60
Xred
-2.0
-1.4
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E [V]
-80
-1.8
-1.6
-1.4
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
E [V]
Fig. 2. Cyclic voltammograms of cytosine or 7-deazaadenine dNTPs labeled with API or
dAPI at HMDE (inset shows detail of the curves). Peaks Ared and Cred correspond to reduction
of the respective nucleobases, peak Xred is probably due to reduction of the C-C triple bond
within the propargyl linker (see Fig. 1). The strong catalytic effects at potentials more
negative than -1.2 V are specific for the dAPI conjugates.
Experiments with tail-labeled ON probes bearing or lacking p53CON revealed diverse effects
of various types of modifications on the specificity of binding. Since such modifications do
not introduce chemically modified nucleotides within the specific sequence, the sequencespecific binding is retained. On the other hand, increased affinity of the protein to the labeled
single-stranded tail may increase the overall binding and result in false-positives. We have
observed that modification of single-stranded oligoT tails with oxoosmium complexes did not
significantly change recognition properties of the respective ON probes in the MBIP assay
(see contribution by Pivoňková et al.). On the other hand, analogous probes tail-labeled with
athraquinone exhibited, under the same conditions, considerable non-specific protein binding
and/or adsorption on the magnetic bead surface.
100
Conclusion
Modified ONs were applied as labeled probes in various bioassays utilizing electrochemical
and/or luminescence detection platform. Besides DNA hybridization, the labeled DNAs
proved useful also in DNA-protein interactions studies. Depending on the modification type,
introducing nucleotide derivatives into DNA substrates may affect DNA-protein recognition
either via a loss of sequence-specific binding or via augmentation of sequence non-specific
interactions. These phenomena should be considered and tested carefully for any newly
introduced DNA labeling approach.
Acknowledgements: This work was supported by the Czech Science Foundation (grant
P301/11/2076 to H.P., P206/12/G151 to M.F.) and by the Grant Agency of the ASCR (grant
IAA400040901 to M.F.), and by RVO 68081707.
References
1. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011).
2. Pivonkova H., Sebest P., Pecinka P., Ticha O., Nemcova K., Brazdova M., Brazdova
Jagelska E., Brazda V., Fojta M.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 894, (2010)
3. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Fojta M., Hocek M.: ChemEur. J. 17, 14063 (2012)
4. Horakova P.; Macickova-Cahova H.; Pivonkova H.; Spacek J.; Havran L.; Hocek M.;
Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011).
5. Pivonkova H.; Horakova P.; Fojtova M.; Fojta M.: Anal. Chem. 82, 6807, (2010)
6. Fojta M., Kostecka P., Pivonkova H., Horakova P., Havran L.: Curr Anal Chem, 7, 35
(2011).
7. Riedl J., Ernsting N.P., Orság P., Fojta M., Hocek M.: Chem Sci., submitted.
101
Transport of Copper Ions in the Presence and Absence of Ionophore Calcimycin and the
Influence of LMWOAs on this Transport
(Transport měďnatých iontů v přítomnosti a nepřítomnosti ionforu calcimycinu a
ovlivňování tohoto transportu LMWOAs)
Martina Parisová, Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, and Vladimír Mareček
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
This work was focused on preparation of model membranes formed on porous polycarbonate
substrate. 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine was used to form stable lipid bilayers
in hydrophilic pores of polycarbonate membrane. For their characterization, electrochemical
impedance spectroscopy (EIS) and voltammetry were applied. The transport of copper ions
across these membranes in presence and absence of ionophore calcimycin has been studied.
The effect of LMWOAs on transporting processes was investigated too.
Key Words: Membranes, Phospholipids, Heavy metals, Copper, Transport across the
membrane, Voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy.
Úvod
Těžké kovy představují stále větší problém v životním a pracovním prostředí. S rozvojem
společnosti, průmyslu a dalšími pokroky neustále stoupá spotřeba kovů a polokovů,
organických a anorganických sloučenin. Rychlá a intenzivní industrializace způsobuje
kontaminaci půdy, vody a vzduchu látkami, které nelze biologicky rozložit. V některých
případech se jedná o látky toxické a karcinogenní. Do této skupiny látek patří zejména
kadmium, měď, olovo, zinek, nikl a jejich sloučeniny, s nimiž se pracuje například
při povrchové úpravě kovů, v těžebním a hutnickém průmyslu, zemědělství či chemickém a
elektronickém průmyslu, a které představují významnou hrozbu pro životní prostředí a zdraví
člověka. Uvedené látky mohou přecházet do živých organizmů, přesněji do buněk, ve kterých
se částečně akumulují a ovlivňují nejen jejich růst, ale také morfologii či biologickou aktivitu.
Pro normální životní funkce buňky je nezbytný transport různých anorganických a
organických látek do a ven z buňky nebo do různých intracelulárních buněčných struktur,
realizovaný transportem přes biologickou membránu. Touto cestou získává buňka nejen
potřebné živiny a jiné pro ni potřebné látky, ale bohužel jsou takto transportovány i nežádoucí
ionty těžkých kovů 1. Základní procesy a mechanismy transportu, na nichž je založen přenos
mnoha různorodých látek, jsou zajišťovány různými systémy a pro jejich studium lze použít
různé techniky. Příslušná měření v této práci byla prováděna pomocí elektrochemických
metod - voltametrie, elektrochemická impedanční spektroskopie, konduktometrie,
potenciometrie, které jsou vysoce citlivé a poskytují velmi přesná a reprodukovatelná data 2-4.
Biologické membrány ohraničují buňku, oddělují vnější, entropické prostředí buňky od
vnitřního prostředí a jsou tedy klíčové pro existenci života na Zemi. Plazmatická membrána je
velice unikátní struktura s řadou specifických vlastností (mechanická odolnost, flexibilita,
plasticita), které ji poskytují amfipatické molekuly – fosfolipidy tvořící základ struktury
buněčných membrán. Hydrofobní části těchto molekul se k sobě spontánně orientují a vytváří
strukturu dvojvrstvy. Hydrofilní konce molekul jsou orientovány do vodného prostředí. Jedná
se tedy o tenkou vrstvu lipidových molekul o tloušťce asi 5-7 nm, která slouží jako
semipermiabilní bariéra zajišťující transport živin a odpadních látek do a z buňky.
Protože práce s přirozenými buňkami, a tedy skutečnými biologickými membránami, je velmi
komplikovaná, je pro studium transportu látek do buňky, mechanismu pronikání a dalších
102
dějů spojených s buňkou využíváno modelových membrán. Tato měření bývají realizována
pomocí stabilizované černé lipidové dvojvrstvy (BLM) v mikrometrových pórech (2 – 8 μm)
polykarbonátového nosiče, který se vkládá mezi dvě části cely (teflonové) propojené malým
otvorem. Na obě strany takovéto porézní polykarbonátové membrány se nanáší roztok
příslušného fosfolipidu a obě cely se následně zaplní roztokem elektrolytu 2, 5.
Transport mědnatých iontů byl studován v přítomnosti ionoforu calcimycinu 6. Protože těžké
kovy v podstatě neexistují v životním prostředí ve formě iontů, ale často jsou vázány
v komplexech s různými látkami, jako jsou nízkomolekulární organické kyseliny (low
molecular weight organic acids, LMWOAs), je velice důležité objasnit transport těchto
komplexů přes studované biologické membrány. Transport mědnatých iontů byl studován
v přítomnosti kyseliny šťavelové, citronové a jablečné, a to při různém pH prostředí.
Experimentální část
Aparatura
Pro kvantifikaci elektrochemických impedancí byly jako pomocné a referentní elektrody
použity Ag/AgCl elektrody (stříbrný drát, průměr 1 mm potažený AgCl) a jako pomocná
elektroda sloužil platinový drát o průměru 1 mm. Tato měření byla realizována pomocí CHI
650C Electrochemical Analyzer/Workstation, Software: CHI v. 8.1 (IJ Cambrija Scientific,
Carms, UK).
Stanovení měďnatých iontů bylo provedeno voltametricky pomocí PC-řízeného
voltametrického analyzátoru ECO-TRIBO polarografu (Polaro-Sensors, Praha, ČR), který je
vybaven MultiElchem v. 2.3 softwarem (J. Heyrovského, Ústav fyzikální chemie AV ČR,
v.v.i., ČR). Rtuťová kapková elektroda HMDE byla použita jako pracovní elektroda,
Ag/AgCl/KCl (3 mol.L-1) (Elektrochemické detektory, Turnov, ČR) jako referentní elektroda
a jako pomocná elektroda byl použit platinový drát (průměr 1 mm). Analyzovaný vzorek,
obsahující příslušný iont a KCl, p.a. (Merck, Praha, ČR), byl vždy okyselen 100 µl HNO3,
p.a., probublán dusíkem a analyzován pomocí diferenční pulsní anodické rozpouštěcí
voltametrie (DPASV) za následujících podmínek: počáteční potenciál -800 mV, konečný
potenciál +150 mV, doba akumulace 120 s, potenciál akumulace -800 mV, rychlost scanu
20 mV.s-1, výška pulzu 50 mV, šířka pulzu 80 mV, klidová doba 15 s. Stanovení
nízkomolekulárních organických kyselin (LMWOAs), vázaných v komplexu s měďnatými
bylo prováděno pomocí DC voltametrie.
Činidla a materiály
Základní roztok elektrolytu 0,1M KCl byl připraven z KCl, p.a. (Merck, Česká republika).
Všechna rozpouštědla čistoty p.a. byla získána z Penta-Švec, Praha, ČR. Pro všechna měření
byla použita deionizovaná voda z Milli-Q-filtru (Millipore, ČR) (vodivost <0,05 µS.cm-1).
Pro přípravu modelové membrány byl použit fosfolipid 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3fosfatydilcholin (lecithin, DPPC, GPCho (16:0/16:0), CAS No. 63-89-8) (Sigma-Aldrich,
Prague, Czech Republic). Fosfolipidová dvojvrstva (PLBs) se vytvářela v pórech
polykarbonátové membrány po nanesení roztoku fosfolipidu na její obě strany. Byly použity
hydrofilní polykarbonátové membránové filtry (nosiče) (Millipore, USA) s velikostí pórů
8 µm, plocha jednoho póru je 50µm2 a pórovitost je 25 – 45 %. Transportní procesy
příslušných iontů byly studovány v přítomnosti ionoforu calcimycinu (ionofor vápníku,
antibiotikum A23187) čistota > 98% (Sigma-Aldrich, ČR) 7, který byl přidán k roztoku
příslušného fosfolipidu před jeho nanesením na polykarbonátový nosič.
103
Příprava stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy
Alikvotní množství fosfolipidu bylo rozpuštěno ve 100 µl N-heptanu a 10 µl ethanolu, ohřáto
v teplé vodě a z takto připraveného roztoku fosfolipidu (20 mg/ml v N-heptanu) bylo
pipetováno 20 µl na obě strany polykarbonátové membrány umístěné mezi dvě části cely
(teflonové) propojené malým otvorem. Poté se nechalo rozpouštědlo odpařit a membrána se
nechala 30 minut v klidovém stavu. Následně byly obě části cely zaplněny roztokem
elektrolytu. Před každým experimentem byla cela řádně promyta koncentrovanou HNO3 a
opláchnuta destilovanou vodou. S takto připravenou celou byl ještě proveden slepý pokus za
stejných podmínek jako u experimentálního měření, pouze byly obě části cely oddělené
nepotaženou polykarbonátovou membránou a nebyly k elektrolytu přidávány ionty. Odebraný
roztok byl poté opět vyhodnocen pomocí DPASV.
Roztok ionoforu byl přidán k roztoku fosfolipidu před jeho aplikaci na polykarbonátovou
membránu. Calcimycin byl rozpuštěn v ethanolu a N-heptanu (koncentrace ionoforu v lipidu
činila 2·10-4 mol/l). Obě části cely, a tedy obě strany membrány, byly zaplněny po 30
minutách roztokem elektrolytu.
Cela pro elektrochemická impedanční měření (EIS)
Cela je tvořena dvěma teflonovými kroužky s malým otvorem v jejich středu, mezi které je
umístěna polykarbonátová membrána. Oba kroužky jsou k sobě těsně přichyceny a do
každého kroužku jsou ze strany zasunuty skleněné cely s malými otvory pro elektrody. Cela je
znázorněna na Obr. 1.
Obr. 1. Elektrochemická cela pro EIS měření, levá polovina – cela 1, pravá polovina – cela 2.
Náhradní elektrické obvody
Pro charakterizaci stabilizovaných PLBs (SPLBs) byly využity dva obvody, které byly
podrobně popsány v ref. 3, 8, 9. Jednodušší obvod (Obr. 2A) sloužil pro charakterizaci
nepokryté polykarbonátové membrány, kde Rs představuje odpor elektrolytu, kapacita
kondenzátoru odpovídá kapacitě polykarbonátové membrány a Rp odpor samotné membrány.
Druhý obvod (Obr. 2B) byl pro charakterizaci SPLB, vytvořené na polykarbonátové
membráně, vhodnější. Tento obvod obsahuje komponenty podobné jednoduššímu obvodu a
navíc jeho součástí je paralelní kombinace kondenzátoru C2 a odporu R2 popisující elektrické
vlastnosti fosfolipidové membrány.
Výsledky a diskuse
Při aplikaci výše uvedeného postupu se podařilo vypracovat metodiku tvorby
reprodukovatelné a stabilní SPLB na polykarbonátovém nosiči. Dále byl studován transport
měďnatých iontů přes tyto membrány, tvořené DPPC, v přítomnosti a nepřítomnosti ionoforu.
Pokud byl calcimycin součástí lipidové dvojvrstvy bylo množství transportovaných
104
měďnatých iontů 4-5%, v nepřítomnosti ionoforu nebyly transportovány žádné ionty a jejich
množství ve vzorku bylo stanoveno na 0,3-0,5 %. Tato hodnota představuje chybu, která
může být způsobena špatným promytím cely nebo její částečnou destrukcí v některých pórech
polykarbonátového nosiče.
Obr. 2. A) jednoduchý obvod B) složený obvod.
Dále byl studován transport měďnatých iontů z cely 1 (elektrolytu 1) do cely 2 (elektrolytu 2)
v přítomnosti LMWOAs přes DPPC v přítomnosti ionoforu při různém pH. Při kyselém pH
nedochází ke vzniku komplexů měďnatých iontů s příslušnými kyselinami a nemají tedy vliv
na transport měďnatých iontů do elektrolytu 2. Množství transportovaných Cu2+ iontů je
přibližně stejné jako v nepřítomnosti LMWOAs. Pokud bylo v cele 1 pH elektrolytu 5,8-6,5,
vytvářely se měďnaté ionty komplexy se šťavelovou, citronovou a jablečnou kyselinou. Díky
vzniku těchto komplexů se snížilo množství prošlých Cu2+ iontů přes fosfolipidovou
dvojvrstvu. Množství Cu2+ iontů bylo stanoveno voltametrickou analýzou elektrolytu
přítomného v cele 2 (elektrolyt 2). Zda byl komplex měďnatých iontů s příslušnými
kyselinami přítomen v elektrolytu 2, bylo zjišťováno pomocí DP voltametrie v případě
kyseliny šťavelové a DC voltametrie s adsorpční akumulací v případě jablečné a citronové
kyseliny. Kyselina šťavelová byla v obou případech rozdílného pH v elektrolytu 2 přítomna.
Kyseliny jablečná a citronová se za kyselého a téměř neutrálního pH v elektrolytu 2
nenacházely.
Závěr
Během této studie se zjistil vhodný způsob přípravy a charakterizace stabilních
fosfolipidových membrán a pro tyto účely byla sestavena vhodná měřicí aparatura. Dále bylo
prokázáno, že EIS měření umožňuje sledovat vznik a vlastnosti stabilizovaných lipidových
membrán a také studovat transport iontů přes tyto membrány. Úspěšné zabudování ionoforu
calcimycinu do lecitinové membrány umožnilo transport měďnatých iontů přes tuto
membránu. Přítomnost LMWOAs ovlivňuje transport Cu2+ iontů přes SPLBs a tyto procesy
mohou být charakterizovány vyhodnocením parametrů náhradních elektrických obvodů
získaných během EIS měření.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou grantů GA AV CR (IAA400400806) a GACR (P206/11/1638
a P208/12/1645).
Literatura
1. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Energy Env. 5, 337 (2011).
2. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010).
3. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: WSEAS Trans.
Environ. Dev. 6, 208 (2010).
105
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI,
Transport of divalent cations across the gel supported phospholipid membranes,
Jetrichovice, 23.-27.5.2011, (Navratil T., Barek J., Eds.), BEST servis, p. 91.
Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX,
Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes,
Jetrichovice, 24.-28.5.2010, (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST servis, p. 119.
Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T.: Development, Energy,
Environment, Economics (DEEE '10), The electrochemical assessment of cadmium and
lead mobility in the rhizosphere, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis
N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), p. 186.
Taylor R. W., Pfeiffer D. R., Chapman C. J., Craig M. E., Thomas T. P.: Pure Appl.
Chem. 65, 579 (1993).
Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Kohlikova E., Petr M.: Atherosklerosa 2011,
Artificial phospholipid membranes as models of real membranes and trasnport of
charged particles across them, Prague, 7.-9. 9. 2011, (Tvrzicka E., Eds.), 4th Department
of Internal Medicine of First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and the
General Teaching Hospital in Prague, p. 38.
Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011).
106
Fast Determination of Uric Acid in Human Serum and Urine by Capillary Electrophoresis
(Rychlé stanovení kyseliny močové v lidském séru a moči pomocí kapilární elektroforézy)
Václav Pavlíček, Klára Málková, Eva Samcová, and Petr Tůma
Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Third Faculty of Medicine, Charles
University in Prague, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic,
e-mail: [email protected]
Abstract
Capillary electrophoresis with (DAD) was used for the determination of uric acid and
allantoin. CE separation was successfully performed in CHES/NaOH and MES/NaOH
solutions. The developed method is characterized by a separation time shorter than 1 min. and
limit of detection 0.8 mg L-1. The method was applied to the determination of uric acid in
human serum and urine.
Key Words: Capillary electrophoresis, Diode array detector, Uric acid, Allantoin
Úvod
Kyselina močová (KM) (Obr. 1) je u člověka a primátů konečným metabolitem purinů, které
jsou součástí nukleových kyselin a řady koenzymů (ATP, NAD+, aj.). Ostatní savci ji dále
přeměňují na alantoin 1,2 (Obr. 2). Malé množství alantoinu lze prokázat i v krvi člověka, kde
je ukazatelem zátěže organismu volnými radikály, jejichž účinkem na KM alantoin vzniká 2.
KM je považována za významnou antioxidační látku, ovšem nedávné studie naznačily, že KM
vstupuje do buněk prostřednictvím specifických transportérů a vyvolává zde prozánětlivé
a prooxidační reakce 3. Porucha metabolismu KM souvisí se vznikem řady onemocnění jako
je dna, Lesch-Nyhanův syndrom, aj. Zvýšená koncentrace KM v organismu (hyperurikémie)
indikuje hypertenzi, kardiovaskulární a renální onemocnění.
V klinické praxi se stanovení KM provádí enzymatickými metodami. Nejběžnější z nich
využívá oxidace kyseliny močové kyslíkem za katalýzy enzymem urikázou na alantoin
a peroxid vodíku. Využít lze však i řadu dalších metod, jako jsou vysoce účinná kapalinová
chromatografie (HPLC) 3, plynová chromatografie (GC) 4, hmotnostní spektrometrie (MS) 5
a kapilární elektroforéza (CE) 6.
A
B
OH
H
N
N
N
OH
HO
N
N
H
H
N
O
Obr. 1. Strukturní vzorec kyseliny močové (A) a alantoinu (B).
NH2
O
N
H
O
Experimentální část
Elektroforetická měření byla provedena na přístroji kapilární elektroforézy HP3DCE (Agilent
Technologies, Německo) s integrovaným detektorem diodového pole (diode-array detector DAD) a kontrolovaným softwarem ChemStation. Elektroferogramy byly zaznamenávány
a vyhodnocovány při vlnové délce 191 nm a 292 nm. K analýze byla použita křemenná
kapilára (Composite Metal Services, Velká Británie) s vnější ochrannou vrstvou polyimidu,
o celkové délce 32,5 cm, vnitřním průměru 50 m a vnějším průměru 360 m. Vzdálenost
k detektoru od krátkého konce kapiláry činila 8,3 cm. Před použitím byla nová kapilára
aktivována promýváním 0,1 mol L-1 NaOH po dobu 10 min., poté byla 10 min. promývána
deionizovanou vodou a na závěr 10 min. separačním elektrolytem. Vybraná měření byla
107
prováděna v kapiláře pokryté pomocí INST coating solution (Biotaq, USA). Před každou
separací modelového vzorku i biologického materiálu byla pokrytá kapilára promyta
v sekvenci: 2 min. deionizovaná voda a 2 min. separační elektrolyt. Nepokrytá kapilára byla
promyta v sekvenci: 30 s 0,1 mol L -1 NaOH, 30 s deionizovaná voda a 30 s separační
elektrolyt. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky z krátkého konce kapiláry. Separace
probíhaly při napětí 30 kV a konstantní teplotě 25 °C. Pro statistické zpracování dat byl použit
program Origin 8.0 (OriginLab Corporation, USA).
Veškeré použité chemikálie vykazovaly analytický stupeň čistoty: kyselina močová (Fluka),
hydroxid sodný (Fluka), kyselina p-aminosalicylová (PAS, Sigma - Aldrich), 2-(Nmorpholin)ethansulfonová kyselina (MES hydrát, Sigma – Aldrich), alantoin (Fluka), 2(Cyclohexylamino)ethansulfonová kyselina (CHES, Sigma - Aldrich). K přípravě separačních
elektrolytů a zásobních roztoků standardů byla použita deionizovaná voda (Millipore,
Bedford, USA). Standardní roztok kyseliny močové (1 mg.ml-1) a 4-aminosalicylové kyseliny
(1 mg.ml-1) byl získán rozpuštěním pevných látek v deionizované vodě s přídavkem NaOH do
úplného rozpuštění. Separační pufry o složení 60 mM MES + 30 mM NaOH (pH = 6,0) a
80 mM CHES + 40 mM NaOH (pH = 9,6), byly připravovány každý den čerstvé. pH bylo
měřeno laboratorním pH metrem pMX 3000 WTW (Německo).
Vzorky krevního séra a moči byly odebrány nalačno. Krevní sérum bylo získáno odebráním
srážlivé krve do vakuových zkumavek; centrifugace při 4 000 ot. min-1 po dobu 15 minut.
Vzorky krevní plazmy byly uchovány v 0,5 ml nádobkách Eppendorf při teplotě - 20 °C,
naopak vzorky moči v plastových uzavíratelných zkumavkách při teplotě 2 °C. Před
elektroforetickou separací byly vzorky temperovány na laboratorní teplotu, poté zpracovány
dle následující metodiky: 50 l vzorku bylo smícháno s 10 l 10 mg L-1 roztoku kyseliny paminosalicylové (PAS), 10 l 1 mol L-1 NaOH a 930 l deionizované vody. Tímto postupem
je získán 20krát zředěný vzorek. Výsledná koncentrace PAS je 10 mg L -1 a koncentrace
NaOH 0,01 mol L -1. PAS je použita jako vnitřní standard pro zvýšení přesnosti
elektroforetického stanovení a NaOH je přidáván z důvodu malé rozpustnosti KM ve vodě 7.
Výsledky a diskuze
KM je slabá dvojsytná kyselina s hodnotou pKA pro první disociační stupeň 5,4. Pro CE
stanovení kyseliny močové byly testovány dva separační elektrolyty o složení: 60 mM MES +
30 mM NaOH (pH 6,0) a 80 mM CHES + 40 mM NaOH (pH 9,6). Kyselé složky separačních
pufrů (MES, CHES) vykazují nízkou iontovou vodivost a mohou být tedy použity ve
vysokých koncentracích 7,8. V koncentrovaných pufrech dochází k zaostření zón
analyzovaných látek, které se od sebe snáze oddělí, což má zásadní význam při separaci
biologických vzorků7. Vysoké koncentrace složek separačního elektrolytu mohou též bránit
adsorpci proteinů přítomných v biologickém vzorku na stěnu kapiláry 8. Separace
v MES/NaOH (pH 6,0) byla prováděna v pokryté kapiláře se zastaveným elektroosmotickým
tokem při použití negativního separačního napětí (-30 kV). Naopak separace v CHES/NaOH
(pH 9,6) byla prováděna v nepokryté kapiláře při pozitivní polaritě (+30 kV); za těchto
podmínek migruje KM proti elektroosmotickému toku. Záznamy separací jsou uvedeny na
obr. 2 a 3. Parametry kalibračních závislostí pro obě metody jsou shrnuty do Tabulky I.
108
Obr. 2. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči (A, 541 mg L-1)
a v krevním séru (B, 49,8 mg L-1). Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 60 mM
MES + 30 mM NaOH (pH 6,0), hydrodynamické dávkování 200 mbar.s, napětí +30 kV, UV
detekce při 292 nm, indentifikace píků; PAS (1) a KM (2).
Obr. 3. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči (A, 322 mg L-1)
a v psí moči (B, 11,2 mg L-1). Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 80 mM CHES
+ 40 mM NaOH (pH 9,6), hydrodynamické dávkování 100 mbar.s, napětí - 30 kV, UV
detekce při 292 (A) a 191 (B) nm, indentifikace píků; PAS (1), KM (2) a alantoin (3).
Obě metody jsou lineární v testovaném koncentračním rozsahu 2,5 – 10 mg L-1 s hodnotou
korelačního koeficientu (R) větší než 0,999 a s limitem detekce (LOD) 5 μmol L-1. Při
stanovení kyseliny močové ve stejném vzorku lidské moče se výsledek nelišil o více jak 3 %.
Pro kontrolu bylo stanovení kyseliny močové prováděno i standardní enzymatickou metodou
(KM, Urikáza – PAP (146200), Greiner Diagnostic GmbH, Německo) používanou
v klinických laboratořích, která poskytla hodnoty lišící se o 7 % pro krevní sérum a o 4 % pro
moč. V alkalickém separačním elektrolytu složeném z CHES/NaOH (pH 9,6) lze vedle
kyseliny močové stanovovat i alantoin (pKA 8,5), jak je demonstrováno na analýze psí moči
(obr. 3B).
109
Tabulka I.
Parametry lineárních regresních závislostí výšky píku na koncentraci KM. Parametry byly
získány ze čtyř různých koncentrací v rozmezí 2,5 až 10 mg L-1.
Separační
elektrolyt
Citlivost
[mAU mg L-1]
Úsek
[mg L-1]
R
LOD
[mg L -1]
LOD
[µmol L-1]
MES/NaOH,
pH 6,0
0,318
-0,135
0,9991
0,8
4,8
CHES/NaOH,
pH 9,6
1,071
-0,048
0,8
4,7
0,9997
Obě metody byly porovnány z hlediska migračního času, separační účinnosti a rozlišení
blízkých píků, viz Tabulka II. V alkalickém separačním elektrolytu CHES/NaOH (pH 9,6)
s rychlým elektroosmotickým tokem bylo dosaženo nejkratšího migračního času pro KM cca
20 s; s rozlišením, KM/PAS, 1,2. Při použití MES/NaOH (pH 6,0), kdy je separační kapilára
pokrytaa je zastaven elektroosmotický tok, vzroste doba separace pro KM dvojnásobně na cca
40 s, s rozlišením, KM/PAS, 12,1. Z těchto dat vyplývá, že pro aplikace, u kterých je
limitujícím faktorem doba separace a nezáleží na separační účinnosti, je vhodnějším
prostředím CHES/NaOH, ve kterém lze kromě KM stanovit i alantoin. V případech, kdy je
potřeba dosáhnout vyššího rozlišení, je vhodnějším separačním elektrolytem MES/NaOH.
Předností nově vyvinutých elektroforetických metod pro stanovení KM na krátké efektivní
dráze v porovnání s tradičním CE stanovením v dlouhé kapiláře (efektivní délka 69 cm)
vyplývá8, že zkrácením separační dráhy lze několikanásobně zredukovat dobu separace
(z původních cca 11 min. na méně než 1 min.), při zachování totožné separační účinnosti.
LOD na dlouhé separační dráze jsou přibližně 4krát nižší, což souvisí s větším množstvím
vzorku nadávkovaným do kapiláry.
Tabulka II.
Migrační čas, separační účinnosti, rozlišení a LOD.
Efektivní délka
Separační
Migrační čas
kapiláry
elektrolyt
[s]
[cm]
MES/NaOH,
8,3
38
pH 6,0
CHES/NaOH,
8,3
20
pH 9,6
MES/Tris
+ polybren,
69,0
660
pH 6,1
N
[m-1]
R
LOD
[µmol L-1]
321000
12,1
4,7
210000
1,2
4,8
229000
5,6
1,2
Závěr
Dávkováním vzorku z krátkého konce kapiláry lze docílit sub-minutových separačních časů,
jak bylo demonstrováno u dvou nově vyvinutých metod pro stanovení kyseliny močové
v moči a séru. Dále bylo ukázáno, že i na krátké separační dráze lze dosáhnout dobrého
rozlišení, které je dostatečné pro analýzu biologických vzorků. Velmi rychlé elektroforetické
separace se v budoucnu mohou stát silným nástrojem v klinické analýze.
110
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy, grant č. 389111
a UNCE 204015.
Literatura
1. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harperova biochemie.
Nakladatelství a vydatelství H & H 1998.
2. Racek J. et al.: Klinická biochemie. Galén, Karolinum 1999.
3. Kanďár R., Žáková P., Mocová P., Skalický J., Kovařík J.: Klin. Biochem. Metab. 18, 167
(2010).
4. Lakshmi D., Whitcombe M. J., Davis F., Skarun P. S., Prasad B. B.: Electroanalysis 23,
305 (2011).
5. Chen X. B., Calder A. G., Prasitkusol P., Kyle D. J., Jayasuriya M. C.: J. Mass Spectrom.
33, 130 (1998).
6. Pormsila W., Krähenbühl S., Hauser P. C.: Anal. Chim. Acta 636, 224 (2009).
7. Tůma P., Samcová E.: Chem. Listy 103, 919 (2009).
8. Matějčková J., Tůma P., Samcová E., Zemanová Z.: J. Sep. Sci. 30, 1947 (2007).
111
Diffusion Characteristics of Chlorine and Methoxy Derivatives
of 6–benzylaminopurine Studied by Voltammetric Methods
(Difuzní charakteristiky chlor a methoxy derivátů 6-benzylaminopurinů studované
voltametrickými metodami)
Iveta Pilařová a,b and Libuše Trnková a,c
a
Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5,
625 00 Brno, Czech Republic, E–mail: [email protected], [email protected]
b
Central European Institute of Technology – CEITEC, Masaryk University, Zerotinovo
namesti 617/9, 601 77 Brno, Czech Republic
c
Central European Institute of Technology – CEITEC, Brno University of Technology,
Technicka 3058/10, 616 00 Brno, Czech Republic
Abstract
The metal complexes of chlorinated and methoxylated derivatives of 6–benzylaminopurine
(6–BAP) can be used as potential antineoplastic agents. From this point of view, the
knowledge of the ability of these substances to diffuse into the intracellular area is very
important. This property is characterized by the diffusion coefficient. The aim of our research
is to determine the diffusion coefficients D of 6–BAP and its derivatives in buffered solutions
(pH 3.21) containing 10% v/v CH3OH for two ionic strengths. Using the Delahay equation
involving the reduction peaks of BAP derivatives on a mercury electrode we calculated D and
the charge transfer coefficients α we obtained from the elimination functions E1 and E4. The
effect of some experimental parameters on D values was monitored.
Key Words: Chlorine and Methoxy derivatives, Diffusion coefficient, Delahay equation,
Linear sweep voltammetry, Elimination voltammetry with linear scan.
Introduction
6–benzylaminopurine (6–BAP) is the most important adenine–type cytokinin. Cytokinins are
phytohormones that promote cell division, growth of plants, bud development, and branching
of stems 1. Nowadays, great attention has been paid to chlorinated and methoxylated
derivatives of 6–BAP. These derivatives, which in protonated state readily form complexes
with divalent metals (Cu, Co, Pt, Pd, Fe), are used as potential antineoplastic agents. Their
antitumor activity was monitored primarily for the treatment of breast carcinoma, chronic
myelogenous leukemia, and osteogenic sarcoma 2-5 1-4.
From the electrochemical point of view, purines and their substituted derivatives are
substances with electroactive properties. The redox behavior of purine derivatives on mercury
and graphite electrodes was studied previously5, 6. The electrochemical methods enable to
determine not only the redox potentials of electrochemical reactions but also to analyze the
mechanism of electrode processes. The knowledge of the redox responses is necessary also
for the determination of important parameters of substances such as the diffusion coefficient 6.
And, because of the utilization of these derivatives as potential cytostatics, diffusion plays a
crucial role in the transport of these drugs across cell membranes into the intracellular area,
where they undergo biotransformation.
The aim of our research is to determine the diffusion coefficients (D) of chlorinated and
methoxylated derivatives of 6–BAP using linear sweep voltammetry (LSV) in connection
with elimination voltammetry with linear scan (EVLS). Using the elimination of one of the
partial current components (diffusion, capacity, kinetics) EVLS, as a mathematical procedure,
allows to sensitively detecting the hidden minority processes in the major processes. It is an
easy tool for fast detection of the depolarizer adsorption on the electrode surface7-135.
112
Moreover, the adsorption process can be determined by diffusion. Our research was aimed to
submit the diffusion characterization of 6-BAP and its derivatives showing all parameters that
affect the values of diffusion coefficients.
Experimental
Chemicals
Because of the solubility of 6–BAP (Lachema, Brno) and methoxy and chlorine derivatives of
6–BAP (synthetically prepared at the Department of Inorganic Chemistry, Faculty of Science,
Palacky University, Olomouc, Czech Republic), their stock solutions were prepared in the 100
% v/v CH3OH (p.a.; Penta, Chrudim, Czech Republic). For the preparation of phosphate –
acetate buffer a mixture of acetic acid (glacial; Sigma Aldrich; ACS reagent), phosphoric acid
(84%; p.a.; Penta) and sodium hydroxide (Sigma Aldrich; 97%; p.a.) was used. The ionic
strength was adjusted by NaCl (Sigma Aldrich; ACS reagent; ≥ 99%; p.a.). Solutions of acetic
acid, phosphoric acid, sodium hydroxide, and sodium chloride in distilled MILI Q water were
prepared.
Methods
The voltammetric experiment was performed using an electrochemical analyzer AUTOLAB
PGSTAT 302 N (Metrohm) in connection with VA Stand 663, controlled by GPES Manager
software. The typical three-electrode set was used: a mercury drop electrode (HMDE) with an
effective area of 0.3 mm2 as a working electrode, the Ag/AgCl/3M KCl and platinum wire as
a reference and an auxiliary electrode, respectively. The supporting electrolyte was
phosphate–acetate buffer (pH 3.21) containing 10% v/v CH3OH. Ionic strength was adjusted
to 0.1 and 1 M NaCl. The concentration of 6–BAP and its derivatives was 1·10-5 mol·L-1. The
LSV curves were measured in the range of potentials from –1 to –1.7 V at scan rates from 100
to 800 mV.s-1 at 23 °C. From the smoothed LSV curves (Sawitzky–Golay filter; level 2)
measured at scan rates 200, 400, and 800 mV.s-1 the elimination functions E1 and E4 with the
conservation of the diffusion current were used. While EVLS function E1 eliminates only the
kinetic current component, EVLS function E4 eliminates simultaneously the kinetic and
charging current components corresponding to equations:
E1: f(I) = 3.4142I – 3.4142 I1/2 and E4: f(I) = 17.485I – 11.657I1/2 – 5.8584I2 7, 8, 12, 13.
Results and discussion
Linear sweep voltammetry (LSV) and elimination voltammetry with linear scan (EVLS)
The LSV curves for chlorine and methoxy derivatives of 6–BAP at ionic strengths of 0.1 M
and 1 M (NaCl) in phosphate–acetate buffer (pH 3.21) containing 10% v/v CH3OH, in the
range of potentials from –1 to –1.7 V at scan rates from 100 to 800 mV/s were measured.
In the case of 6–BAP and 2’–methoxy and 4’–methoxy derivatives the LSV experiment
indicates a new process. This new process proceeding in the adsorbed state (EVLS peak–
counterpeak) was sensitively detected by elimination voltammetry (EVLS) as a second peak
in the region of more negative potentials. In the case of 3' –methoxy BAP the EVLS also
provides a readable peak–counterpeak signal showing the presence of the substance in the
adsorbed state. It can be observed that the substituent on the benzene ring in the molecule of
6–BAP causes a shift to more negative potentials. Simultaneously, with increasing distance of
the methoxy substituent from the basic aminopurine skeleton, the height of the reduction
signal is increasing (Figs. 1A1 and 1B1). The increasing ionic strength causes a decrease of
the height of the reduction peaks, but without any potential shift. The methoxy derivatives of
6–BAP provide a four times higher EVLS signal than does the unsubstituted 6–BAP.
113
Fig. 1. LSV (A1, B1) and EVLS E4 (A2, B2) curves for 6–BAP and its methoxy derivatives
at two ionic strengths.
In comparison with the redox behavior of methoxy derivatives of 6–BAP, the chlorinated
derivatives, presented here, show a different behavior. The chlorine on the benzene ring
causes a shift of the reduction signals to more negative potentials, resulting in the LSV and
EVLS curves. It is evident that chlorine derivatives of 6–BAP provide higher reduction
signals than does unsubstituted 6-BAP. In the case of 6–BAP, the LSV experiment indicates a
new process, not occurring in the case of chlorine derivatives. For 6–BAP and its chlorinated
derivatives EVLS yields peak–counterpeak signals confirming an adsorbed state. Moreover,
in the case of 6–BAP the EVLS indicates a second peak at more negative potentials. While
the height of the reduction signals of methoxy derivatives increases with the distance of the
substituent from the aminopurine skeleton, the height of the reduction signals of chlorinated
derivatives is not increasing (Figs. 2C1 and 2D1). Concerning the influence of ionic strength
it can be concluded that the higher ionic strength causes only a decrease of the height of the
reduction signals without any potential shift.
Fig. 2. LSV (C1, D1) and EVLS E4 (C2, D2) curves for 6–BAP and its chlorine derivatives at
two ionic strengths.
114
Using the Delahay equation 5 for an irreversible system:
1/ 2
Ip 2.99 105 n na
A D1 / 2 C v1 / 2 , where n and αna is the total electron number and
the product of the charge transfer coefficient with the number of electrons participating in the
slowest step respectively, A is the electrode area (cm2), D is the diffusion coefficient (cm2.s-1),
C (mol.cm-3) is the bulk concentration of the analyte, and v (V.s-1) is the scan rate. Applying
the LSV reduction peak heights, the diffusion coefficients of 6–BAP and of its chlorinated
and methoxylated derivatives were calculated. The charge transfer coefficient together with
the number of electrons participating in the slowest step (αna) was estimated from the
difference between E1 and E4 elimination peak potentials. The D values for all derivatives,
extrapolated to zero scan rates, are presented in the following Tables.
Table I.
Diffusion coefficients for methoxy derivatives of 6–BAP.
I = 0.1 M
I=1M
5
2
Dextrapol. (10 cm /s) Dextrapol. (105 cm2/s)
6–BAP
7.90
4.60
4’ – OCH3 BAP
12.50
7.23
3‘ – OCH3 BAP
6.24
5.04
2‘ – OCH3 BAP
5.18
3.48
It follows from Table I that the binding of the methoxy group in position 4 '(para) causes a
substantial increase of the diffusion coefficient, but, with a decreasing distance of the
substituent from the aminopurine skeleton, the value of the diffusion coefficient decreases. In
the case of the substituent in position 2' (ortho) the D value is the lowest. It was found that the
influence of ionic strength can be generalized for all derivatives: the diffusion coefficients
have lower values at higher ionic strengths. From Table II it is evident that the trend valid for
methoxy derivatives is analogous for chlorine derivatives. It is worth noting that the para
substituent shows the highest D values. In the case of 3'–Cl BAP the D value is lower than for
3'–OCH3 BAP for both ionic strengths.
Table II.
Diffusion coefficients for chlorine derivatives of 6–BAP.
I = 0.1 M
I=1M
D extrapol. (105
D extrapol. (105
cm2/s)
cm2/s)
6–BAP
7.90
4.60
4’– Cl BAP
23.00
7.74
3‘– Cl BAP
6.10
4.60
2‘– Cl BAP
6.08
4.40
Conclusion
The redox behavior of 6–BAP and its methoxylated and chlorinated derivatives on a mercury
drop electrode (HMDE) using linear sweep voltammetry (LSV) in connection with
elimination voltammetry with linear scan (EVLS) was studied. For further evaluation of the
electrode processes the elimination function E4 was calculated. For all studied derivatives the
EVLS provided readable peak–peak counter signals and indicated the presence of the
substance in an adsorbed state. Moreover, in the case of 6–BAP and 2'–OCH3 BAP, EVLS
sensitively revealed a new process in the form of a second peak in the more negative potential
region. Generally, due to increasing ionic strength the height of the reduction signal
115
decreases. Using the Delahay equation for an irreversible process the values of the diffusion
coefficient were estimated. It was observed that D is influenced not only by the substituent,
but also by its position on the benzene ring. The substituent (methoxy or chlorine) binding
into the para position causes a substantial increase of the D value. It therefore follows that the
substituent in the para position allows the best diffusion transport of the substances studied to
the electrode surface. With a decreasing distance of the substituent from the aminopurine
skeleton the D values decrease. Simultaneously, the increasing ionic strength contributes to
the decrease of the diffusion coefficient. We can conclude that there is one important fact to
be noted. For a given pH (3.21) all derivatives are in protonated forms 5 and their diffusion
mass transport could be influenced by electrostatic interactions between the derivatives and
the negatively charged electrode surface and also by their adsorption.
Acknowledgment
This research was supported by Project 106/09/H035 of the GA CR and by the CEITEC –
Central European Institute of Technology Project CZ.1.05/1.1.00/02.0068, and by the project
MUNI/A/0992/2009 of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic.
The authors thank Professor Zdeněk Trávníček (Dept. of Inorganic Chemistry, Faculty of
Science, Palacky University, Olomouc, Czech Republic) for the synthesis of 6–BAP
derivatives and the Metrohm Company for the possibility of presenting these results.
References
1. Malon M., Travnicek Z., Marek R., Strnad M.: J. Inorg. Biochem. 99, 2127 (2005).
2. Malon M., Travnicek Z., Marysko M., Marek J., Dolezal K., Rolcik J., Strnad M.: Trans.
Metal Chem. 27, 580 (2002).
3. Malon M., Travnicek Z., Marysko M., Zboril R., Maslan M., Marek J., Dolezal K.,
Rolcik J., Krystof V., Strnad M.: Inorg. Chim. Acta 323, 119 (2001).
4. Klanicova A., Travnicek Z., Vanco J., Popa I., Sindelar Z.: Polyhedron 29, 2582
5. Dryhurst G.: Electrochemistry of Biological Molecules London 1977.
6. Tarkowska D., Kotoucek M., Dolezal K.: Collect. Czech. Chem. Commun. 68, 1076
(2003).
7. Dracka O., Trnkova L.: J. Electroanal. Chem 413, 123 (1996).
8. Dracka O.: J. Electroanal. Chem 402, 19 (1996).
9. Trnkova L., Jelen F., Postbieglova I.: Electroanalysis 15, 1529 (2003).
10. Trnkova L., Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 348, 265 (1993).
11. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000).
12. Trnkova L., v knize: Utilizing of bio-electrochemical and mathematical methods in
biological research. (Adam V., Kizek R., Eds.), sv.Vol. Research Signpost, Kerala, 2007.
13. Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001).
116
Oligonucleotide Probes End-Labeled with Oxoosmium Complexes for Electrochemical
Analysis of Sequence and Structure-Specific Interactions of p53 Protein with DNA
(Oligonukleotidové sondy koncově značené komplexy oxoosmia pro elektrochemickou
analýzu sekvenčně a strukturně specifických interakcí proteinu p53 s DNA)
Hana Pivoňková, Kateřina Němcová, Peter Šebest, Luděk Havran, Petr Orság,
and Miroslav Fojta
Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
In this paper, we extend the area of utilization of electrochemically active compounds for
probing DNA-protein interactions, using immunoprecipitation of protein-DNA complexes at
magnetic beads covered with protein G. We use double-stranded oligonucleotides bearing a
dT20 single-stranded overhangs which are selectively labeled with Os,bipy adducts and are
specifically recognized by the tumour suppressor p53 protein according to the presence or
absence of a specific binding site (consensus sequence, p53CON) and in dependence on
antibody used. The labeled probes recovered from immunoprecipitated complexes are
determined voltammetrically at hanging mercury drop electrode, using a catalytic peak
produced by the osmium marker.
Key Words: Electrochemical analysis, Osmium complex, Protein p53, DNA-protein
interaction, Immunoprecipitation.
Introduction
Osmium tetroxide complexes with nitrogen ligands (such as 2,2´-bipyridine, Os,bipy) have
been widely used as electroactive labels of DNA 1. It was found that Os,bipy covalently binds
to pyrimidine bases (especially thymines) in single-stranded DNA forming stable adducts and
at mercury based electrodes gives well developed peaks. Since that, Os,bipy was often used as
a sensitive and highly selective probe of DNA structure and was used in connection with
DNA sensors. Electrochemical methods used for detection of DNA hybridization often utilize
labeling of DNA (oligonucleotides) with electroactive moieties which results in better
discrimination between labeled and non-labeled DNA and improves sensitivity and selectivity
of the analysis. Specific labels can be introduced into nucleic acids during chemical synthesis
of oligonucleotides, through enzymatic incorporation of modified nucleotides or via chemical
modification of natural nucleic acids.
Tumor suppressor protein p53 is one of the most important stress-induced transcription
factors involved in the cell defense against genomic instability and malignant transformation.
Its functions are closely connected with its ability to bind DNA. Protein p53 consists of
several domains; two of them are involved in DNA binding. Central domain is responsible for
sequence-specific DNA recognition (binding to p53 consensus sequence, p53CON) and Cterminal DNA binding site (CTDBS) is responsible for structure-specific DNA binding.
DNA-protein interactions can be modulated in many ways (posttranslational modification of
protein, binding of monoclonal antibodies and influence of environment, e.g. salt
concentration, presence of divalent ions or oxidative agents). DNA-protein interactions are
studied primarily using electromobility shift assay (EMSA) in agarose gels. Nevertheless, this
technique is not suitable in all cases, e.g. when using non-purified proteins, cell lysates or
DNA topoisomers. Recently, a new “capture-release” technique was introduced 2, assessing
recognition of various targets sites within DNA by the protein p53 using immunoprecipitation
of protein-DNA complexes at magnetic beads via specific anti-p53 antibodies. Here we
117
present combination of this technique with electrochemical detection of captured DNA
modified with osmium complexes.
Experimental
Synthetic 70-mer oligonucleotides, either containing or lacking p53CON and both containing
single-stranded dT20 overhang, were annealed with complementary 50-mer strands and mixed
with 2 mM Os,bipy to introduce osmium labels within the oligoT tail. After 2-hour incubation
at 20 °C in 100 mM Tris buffer pH 7.0, unreacted Os,bipy was removed by dialysis.
The p53 immune complexes were prepared by mixing of a monoclonal antibody (DO-1 or
Bp53-10.1) with the protein in binding buffer (50mM KCl, 5mM Tris and 0.01% Triton X100, pH 7.6) in a total volume of 20 l, followed by 20-min incubation. Then, 10 ng of the
modified probe and/or 600 ng (equimolar amount) of the competitor plasmid DNA /sc or lin
were mixed with the immune complex and incubated in the binding buffer for 30 min on ice.
Magnetic beads (12.5 L of the stock suspension per sample) coated with protein G (DBG,
Dynal/Invitrogen), were washed three times with 100 L of the binding buffer. The beads
were separated from the supernatant using magnetic particle concentrator. Then the binding
reaction mixture was added and incubated with the beads for 30 min at 10 °C whilst shaking
mildly. Finally, after triplicate washing with the binding buffer, the DNA was released from
the beads and analyzed electrochemically.
Electrochemical responses of Os,bipy modified ODN probes were measured by means of
adsorptive transfer stripping differential pulse voltammetry (AdTS DPV) at hanging mercury
drop electrode (HMDE). The three-electrode system was used. The working electrode was
HMDE, the reference electrode was Ag/AgCl/3M KCl electrode, and platinum wire was used
as the auxiliary electrode. Following settings were used: room temperature, accumulation time
(ta) 60 s, initial potential -0.4 V, end potential -1.6 V, amplitude 50 mV, background
electrolyte Britton-Robinson buffer pH 4.0. The analyte solution was deaerated before each
experiment by bubbling argon.
DBG
dissociation
antibody
washing
p53
detection
Os-labeled probe
Fig. 1. Scheme of the electrochemical magnetic beads-based immunoprecipitation assay of
the p53–DNA binding. Immune complex antibody-protein-labeled DNA is formed in solution
and captured at magnetic beads covered with protein G. After repeated magnetic separation
and washing steps, the p53-DNA complex is dissociated and the labeled probe determined by
AdTS DPV at HMDE.
Results and discussion
Binding of the osmium labeled oligonucleotide probes resulted, after the MBIP procedure
depicted in Fig. 1 and subsequent AdTS DPV analysis of output samples, in appearance of
characteristic voltammetric peak around -1.2 V corresponding to catalytic hydrogen evolution
that is known to accompany last reduction step of the osmium-DNA adduct1 (Fig. 2). In the
absence of any unlabeled competitor DNA, both non-specific and specific probes were bound
118
by the protein, while in the presence of long plasmid DNA competitors binding of the protein
to the short oligonucleotide probes was depressed, resulting in diminution of the osmium
signal after the MBIP procedure. For the non-specific probe, any (specific or non-specific)
competitor DNA caused disappearance of the osmium peak. For the specific probe, the result
depended on presence of p53CON in the competitor DNA and on antibody used. In general,
antibody Bp53-10.1 potentiated binding of the protein to the specific probe in agreement with
a known activation effect of the antibody towards the sequence specific binding. However,
when specific plasmid competitor was added to the reaction mixture, binging of the p53
protein to the short probe was depressed, in contrast to a considerable signal observed with
the specific labeled probe while competing with non-specific plasmid DNA (Fig. 2).
-1.6
-1.2
I[ A]
1
-0.8
2
-0.4
el
0.0
-1.6
-1.4
3
-1.2
-1.0
-0.8
-0.6
E [V]
Fig. 2. AdTS DPV responses resulting from competition MBIP assay with antibody Bp5310.1, labeled specific (curves 1,2) or non-specific (curve 3) probes and unlabeled plasmid
DNA non-specific (curve 2) or specific (curve 3) competitors. Curve 1 is positive control
(specific probe in the absence of any competitor), el stands for blank background electrolyte.
Conclusion
We successfully connected simple electrochemical detection of tail-labeled DNA (using both
mercury and carbon electrodes) with “capture-release” technique suitable for studying
protein-DNA interactions. We found, that protein p53 retains its DNA binding features
including the ability to modulate sequence- and structure-specific interactions through
antibody blocking of its C-terminal DNA binding site and that modification of single-stranded
overhangs doesn´t influence protein-DNA recognition. Measurement of Os,bipy-modified
DNA at the mercury-based electrodes, allow facile determination of subnanogram or even
tens-of-picogram quantities of the labeled probes. This approach can easily be used also for
other DNA-binding proteins.
Acknowledgements: This work was supported by the Czech Science Foundation (grant
P301/11/2076 to H.P.) and by the Grant Agency of the ASCR (grant IAA400040901 to M.F.),
and by RVO 68081707.
Literature
1. Fojta M.; Kostecka P.; Pivonkova H.; Horakova P.; Havran L. Curr Anal Chem, 7, 35
(2011).
2. Pivonkova H., Šebest P., Pecinka P., Ticha O., Nemcova K., Brazdova M., Brazdova
Jagelska E., Brazda V., Fojta M.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 894, (2010).
119
Ion Current Rectification Behavior at Novel Borosilicate Glass Capillaries
(Usměrněný transport iontů v borosilikátových kapilárách)
Barry Silver, Karel Holub, and Vladimir Marecek
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
We present an easy methodology to produce novel, robust and reusable borosilicate glass
microcapillaries. Using these capillaries we investigate ion current rectification behavior
using DC and AC electrochemical techniques. We find that two non-ohmic behaviors can
manifest. The presence of low frequency inductive loops on the Nyquist plot tentatively
suggests electrokinetic mass transport processes may be present at the capillary wall.
Key Words: Ion, Rectification, Impedance, Capillary.
Introduction
Glass electrodes, fabricated from glass capillaries (typically from quartz, borosilicate or
aluminosilicate glasses) filled with electrolyte solutions, have found extensive use in a wide
range of electrochemical applications within the life and physical sciences 1, 2. Capillary-based
electrodes have been used as nanosensors 3, for scanning ion conductance microscopy
applications4, as microelectrodes for electrophysiological patch-clamp measurements1 and for
the study of ion-transfer reactions at the interface between two immiscible electrolyte
solutions (micro-ITIES) 5. Glass microcapillaries are easily produced (with a laser puller)
which facilitates even heating of the glass surface with simultaneous application of tensile
force6. The combination of even heating and tensile stress leads to the production of a fragile
micron to nano-sized orifice at the tip of a pulled glass capillary 6. Capillaries thus made are
seldom re-useable without tip breakage.
Microcapillaries with orifice diameters of approximately 20 microns typically produce an
ohmic current response to the applied potential 2. In this size range, contributions to the total
cell impedance from the double-layer capacitances (of both the capillary and reference
electrodes) are usually negligible and can often be disregarded2. Also often neglected in
impedance calculations are contributions from rapid charge transfer reactions taking place at
the reference electrodes 2.
Capillary tip geometries of nanoscale dimension (typically tens of nanometres), have been
found to exhibit non-ohmic current response behaviors to an applied potential
difference 2, 7-9. Perhaps the most well-known example of the non-ohmic response is ion
current rectification (ICR) 8, 10. ICR has been frequently reported and studied at nano-sized tip
geometries 2, 7, 8. A major characteristic of classical ICR7 is that currents produced under
positive bias (polarity of reference electrode within the capillary) is lower than that produced
at negative bias 7.
The majority, but not all 11, of previous simulation and experimental work has been conducted
on tip geometries which are of definite nanoscale dimension. The fabrication of robust nano to
micron-sized pore geometries usually involves a set of complicated manufacturing procedures
(involving pulsed lasers 11 and heavy ion track etching 12 for example). In this paper we show
that non-ohmic effects are still very much evident at borosilicate glass capillaries exhibiting
orifice diameters in size ranges in the order of 1 μm.
Using EIS, we corroborate findings concerning the existence of low-frequency inductive
loops on unmodified glass capillaries which exhibit non-ohmic behavior. Equivalent circuit
120
modeling of this impedance data suggests the existence of a possible, often ignored
electrokinetic mass transport effects.
Experimental
All electrolyte solutions were made using reagent dissolved in distilled water (Goro, Prague,
Czech Republic). LiCl (Fluka, Biochemika, 62476, > 99% purity) was used throughout.
Methodology outlined herein for capillary fabrication (vide infra) is based upon that
previously reported 13. A Sutter Model P-2000 laser pipette puller (Sutter Instruments Co.)
was used to produce pulled glass capillaries with an abnormally long shank length.
Borosilicate capillaries (Hilgenberg, Germany, # 1406119; o.d. of 1 mm and wall thickness of
0.21 mm) were used for this purpose. Using long shank geometry, the glass is slowly ‘bulbed’
by hand (Fig. 1a) (vide infra).‘Bulbed’ capillaries were subsequently rough grinded by
sanding on a home-made grinding apparatus. Successive grades of sandpaper were used to
reveal an opening in the tip region (Fig. 1c). Variation in tip geometry may be obtained by
varying pulling parameters and by variation of the ‘bulbing’ stage (Fig. 1d and 1e).
The clean and polished glass capillaries were then filled with electrolyte solution via ‘rapid
boiling’ in electrolyte solution (typically 10 mM LiCl). Capillaries can at this stage be
examined via optical microscopy to see if any trapped air-bubbles are present.
Micron-sized orifice diameters were measured using optical microscopy. Capillaries were
removed from the heated electrolyte solution and left to cool at room temperature in an
electrolyte bath (containing the same electrolyte at room temperature). Capillaries thus
fabricated may be re-used a number of times after washing (in water and acetone for
example).
A small chlorodized silver wire (smaller than the i.d. of the capillary) was inserted into the
back of the capillary (after electrolyte filling) and served as a quasi-reference electrode
(Ag/AgCl). Another chlorodized silver wire served as a quasi-reference electrode in the outer
solution. A 1 mm diameter plain silver wire served as a counter electrode and located in the
outer solution.
The 3- electrode electrochemical cell, which was housed within a Faraday cage, and used
throughout was of the following form:
Ag/AgCl (capillary) / 10 mM LiCl / 10 mM LiCl(outside solution) / AgCl/Ag (outside solution)
Electrochemical polarization curves were produced using a Solartron SI1287 electrochemical
interface (Solartron Analytical, U.K) controlled via in-house, custom-built Labview (National
Instruments, USA) control software.
Electrochemical impedance spectroscopy was conducted on a SI1287 electrochemical
interface in conjunction with a SI1255 frequency response analyseds (Solartron Analytical,
U.K). Both instruments were controlled via in-house, custom-built Labview control software.
Electrochemical impedance spectra were analyzed and modeled using LEVM / LEVMW ver.
8.11 (a well-known complex non-linear least squares fitting program made freely available by
J .Ross Macdonald 14).
121
Results and discussion
Fig. 1 (a) An optical micrograph indicating a pulled glass capillary which has been ‘bulbed’.
A red line indicates an arbitrary point to which the capillary may be machined to reveal an
orifice (b) An black arrow points to the location of an orifice produced after rough grinding
the ’bulbed’ section back to an arbitrary point. Diameter of the orifice shown by black arrow
in (b) is 20 µm. (c) and (d) indicate two of many possible tip geometries that can be easily and
quickly produced using methodology reported herein.
Conclusions
We have presented a methodology which enables the facile production of robust and reuseable borosilicate glass capillaries with micro- to nanosized tip geometries. Using these
easily fabricated glass capillaries (with orifice diameters of well over 500 nm), two nonohmic current response behaviors have been produced. The presence of low frequency
inductive behavior in the ‘enhanced’ current arm of non-functionalized borosilicate capillaries
exhibiting non-ohmic behavior has been observed. This observation corroborates findings of
recent studies. The existence of low frequency inductive behavior tentatively suggests a role
for cation-specific electrokinetic effects in ICR. The effects of the non-ohmic behavior on ion
transfer processes occurring at the interface between two immiscible electrolyte solutions will
form the basis for future work.
122
Fig. 2. (a) and (b) a capillary exhibiting higher currents at positive potential than at negative
potential. The unpolarised capillary resistance derived from modelling impedance spectra
(denoted EIS) at zero potential provides a useful datum line. Potential was scanned from 0 V
to -1 V (2(a)) and from 0 V to +1 V (2b) respectively at varied scan rate. Electrolyte 10 mM
LiCl. Capillary orifice diameter was approximately 1.8 µm. 2(c) and 2(d) impedance spectra
collected from capillary featured in 2(a) and 2(b). The impedance modulus 2(c)
(Z
Re(Z ) Im(Z ) ) is shown versus the log of the frequency for potentiostatic EIS
conducted at +1V , 0V and -1V respectively. 2(d) Nyquist plot representation of the
impedance data. The line in 2(c) denotes the frequency at which the three potentiostatic
impedance spectra begin to depart from each other (approx. 300 Hz). The horizontal line in
2(d) indicates a horizontal dividing line between the point of negative and positive imaginary
impedance , and is shown as a guide for the eye. Electrolyte 10 mM LiCl. Fig. 2(e) and 2(f) a
capillary exhibiting classical rectification behavior. The unpolarized capillary resistance
derived from modeling impedance spectra (denoted EIS) at zero potential provides a useful
datum line. Potential was scanned from 0 to -1 V (e) and 0 to +1 V (f) respectively at varied
scan rate. 10 mM LiCl as the electrolyte. Capillary orifice diameter 1.83 µm. Impedance
spectra for the capillary featured in 2(g) and (h) The impedance modulus 2(g)
(Z
Re(Z ) Im(Z ) ) is shown versus the log of the frequency for potentiostatic EIS
conducted at 0V and -1V respectively. 2(h) Nyquist plot representation of impedance data. A
horizontal line in 2(h) indicates a horizontal dividing line between the point of negative and
positive imaginary impedance , and is shown as a guide for the eye. EIS spectra collected for
the -1 V case was conducted at 20 mV signal perturbation whilst that of 0 V was conducted at
10 mV perturbation. 10 mM LiCl as the electrolyte.
123
References
1. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F. J.: Pflüg. Arch. Eur. J.
Physiol. 391, 85 (1981).
2. Wei C., Bard A. J., Feldberg S. W.: Anal. Chem. 69, 4627 (1997).
3. Piper J. D., Clarke R. W., Korchev Y. E., Ying L., Klenerman D.: J. Am. Chem. Soc.
128, 16462 (2006).
4. Hansma P., Drake B., Marti O., Gould S., Prater C.: Science 243, 641 (1989).
5. Shao Y., Osborne M. D., Girault H. H.: J. Electroanal. Chem. Inter. Electrochem. 318,
101 (1991).
6. Instruments S.; Sutter Instruments: Novato, CA , USA; Vol. REV. 2.2 (20100629)
7. Momotenko D., Cortes-Salazar F., Josserand J., Liu S., Shao Y., Girault H. H.: Phys.
Chem. Chem. Phys. 13, 5430 (2011).
8. White H. S., Bund A.: Langmuir 24, 2212 (2008).
9. Bhattacharya A. A., Curry S., Franks N. P.: J. Biol. Chem. 275, 38731 (2000).
10. Kubeil C., Bund A.: J. Phys. Chem. C 115, 7866 (2011).
11. Yusko E. C., An R., Mayer M.: ACS Nano 4, 477 (2009).
12. Siwy Z., Apel P., Dobrev D., Neumann R., Spohr R., Trautmann C., Voss K.: Nucl. Inst.
Met. Phys. Res. Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms 208, 143 (2003).
13. Gao C., Ding S., Tan Q., Gu L.-Q.: Anal. Chem. 81, 80 (2008).
14. http://www.jrossmacdonald.com/levminfo.html, Downloaded: 4.4.2012.
124
Carbon Paste Electrode Modified with Bismuth Trifluoride and its Applicability
in Electrochemical Stripping Analysis for Determination Heavy Metals
(Uhlíková pastová elektroda modifikovaná fluoridem bismutitým a její využití
v elektrochemické rozpouštěcí analýze pro stanovení těžkých kovů)
Matěj Stočes and Ivan Švancara
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice,
532 10, Pardubice, Czech Republic. Email: [email protected]
Abstract
Basic characterization of carbon paste electrodes bulk-modified with solid bismuth trifluoride
("BiF3-CPE" type) has been carried out, when investigating mainly the optimal amount of
BiF3 in the carbon paste mixture. As the most suitable electrode for detection of Cd(II) and
Pb(II) at the low microgram-per-litre concentration level, the configuration of 10%BiF3-CPE
was found showing good stability and linearity within 2-12 μg/L. This novel type of bismuthbased electrode was then tested to determine lead in sewage sludge and the content of lead
found has corresponded well to the certified value for this type of reference material.
Key Words: Stripping analysis, Bismuth trifluoride bulk-modified carbon paste electrode,
characterisation, Determination, Cadmium and lead.
Úvod
Bismutové filmové elektrody (BiFE; z angl. "Bismuth Film Electrode") jsou v moderní
elektroanalýze známy přibližně jedno desetiletí, ale i za tak krátkou dobu si již vydobyly
uznávanou pozici. Poprvé byla BiFE představena na lokální konferenci v rakouském Grazu
v roce 2000 1, krátce poté i na mezinárodním poli 2. Dokladem toho, o jak dynamický obor se
jedná, je nedávný přehledový referát z roku 2010, který bilancuje dekádu bismutových
elektrod v elektroanalýze 3 z pohledu faktů a čísel; standardním způsobem je problematika
shrnuta již v předchozích referátech 4-6.
Bismutové povlaky na pracovních elektrodách lze vylučovat za použití metod in situ a ex
situ 6,7. Příprava bismutového filmu in situ spočívá v elektrolytickém vylučování bismutu
redukcí bismutité soli na povrchu pracovní elektrody přímo v měřeném roztoku; děje se tak za
současného nahromadění analytu. Zdrojem bismutového filmu u těchto postupů bývá
dusičnan bismutitý, Bi(NO3)3, jenž se do měřeného roztoku přidává o koncentraci deseti až
dvacetinásobně převyšující koncentrační úroveň stanovovaného analytu, obyčejně vybraného
těžkého kovu 8. Trojmocný bismut pak redukován potenciostaticky během nahromaďovacího
kroku v režimu stripping analýzy, kdy kromě bismutového povlaku dochází k vyloučení a
nahromadění analyzovaných kovů. Filmy připravované metodou in situ jsou v drtivé většině
případů používány pouze pro jedno měření – na konci voltametrické analýzy je film
elektrochemicky odstraněn a při dalším měření je film vytvořen znovu (během nahromadění).
Jsou-li podmínky analýzy nezměněny, jsou vlastnosti jednotlivých bismutových filmů
srovnatelné. V druhém případě jsou bismutové filmy na povrchu pracovních elektrod
deponovány ze speciálního pokovovacího roztoku, obvykle s vyšším obsahem BiIII. Variantou
přípravy BiFE in situ je přístup, kdy bismutitá sůl není přítomna v roztoku, ale vhodná
sloučenina je obsažena přímo v materiálu pracovní elektrody. Takový modifikátor je během
nahromaďovacího kroku redukován na elementární bismut, který se vyloučí na povrchu
elektrody (in statu nascenti). Z toho hlediska našly své velké uplatnění elektrody na bázi
uhlíkové pasty a uhlíkové inkoustu, které lze velmi jednoduše modifikovat. První experimenty
tohoto druhu byly prováděny s pevným oxidem bismutitým 9,10.
125
Modifikované uhlíkové pastové elektrody (CPE) 11-13 a uhlíkové tištěné elektrody (SPCE) 14 s
příměsí 1–5% hm. Bi2O3 vytvářejí bismutový film při potenciálu –1,0 až –0,8 V, jehož tvorba
je ovlivňována pH elektrolytu:
Bi2O3 + 6H+ + 6e- → 2Bi + 3H2O
Bi2O3 + 3H2O + 6e- → 2Bi + 6OHPři použití modifikovaných CPE a SPCE odpadá nutnost přidávat do analyzovaného roztoku
bismutitou sůl, což stanovení zjednodušuje. Slabinou takto připravovaných BiFE se může
jevit vyšší pozadí a problémy s heterogenitou modifikovaných uhlíkových past či uhlíkových
inkoustů. Hledání nových typů modifikátorů uhlíkové pasty není omezeno pouze na
práškovité formy příslušných kovů či příslušné oxidy. V principu lze použít jakoukoli
sloučeninu bismutu, která je stabilní a z materiálu neuniká. (V případě, kdy je modifikátor
zčásti rozpustný ve vodě, může být vyluhován z nitra pasty a elektroda „krvácet“.) Jedním
z příkladů atypických modifikátorů je nedávno vyvinutá elektroda NH4BiF4-CPE15.
Podmínku nerozpustnosti ve vodě splňuje i fluorid bismutitý (BiF3) a charakterizací elektrody
typu "BiF3-CPE" se zabývá právě tato studie, která navazuje na některé předchozí studie (viz
např. 10,14,15) a rozšiřuje tak i paletu stávajících, objemově modifikovaných uhlíkových
pastových elektrod.
Experimentální část
Chemikálie
Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. od firmy Aldrich nebo Merck. Standardní
roztoky olova a kadmia o koncentraci 1000 mg/L (Merck) byly ředěny dle potřeby.
Příprava pracovních elektrod
Uhlíková pastová byla připravena důkladným smícháním 2 g uhlíkového prášku (CR-5,
Lučební závody Kolín) s 0,860 g vysoce viskózního silikonového oleje (SO, typ LUKOIL
MV 8000; Lučební závody Kolín). Z této uhlíkové pasty byly připraveny tři pracovní
elektrody přimíšením a homogenizováním BiF3 o obsahu 1%, 3% a 10% hm. (dále označené
jako 1, 3 nebo 10%BiF3-CPE). Zhotovené pasty byly vpraveny do pouzder vlastní konstrukce.
Instrumentace
Pro všechna měření v režimu stripping voltametrie bylo použito elektrochemické pracovní
stanice Autolab PGSTAT12 (Eco Chemie / Metrohm) ovládané pomocí softwaru NOVA
(tentýž výrobce). Pracovní elektrodou byla příslušná modifikovaná uhlíková pastová
elektroda; referenční (ref.) elektrodou pak Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda
(PtE). Všechna měření byla prováděna ve voltametrické nádobce o kapacitě 20 ml při
konstantní laboratorní teplotě (20 ± 2 ºC).
Postup a měření
Všechna měření probíhala v režimu anodické stripping voltametrie. Nahromadění analytu na
pracovní elektrodě probíhala při potenciálu –0,9 až –1,4 V vs. ref., po dobu 20 až 900 s.
Po době klidu (15 s) bylo provedeno voltametrické měření technikou square-wave voltametrie
(frekvence 50 Hz, amplituda 50 mV). Před každým měření byla rovněž prováděna
kondicionace elektrody po dobu 30 s při potenciálu +0,2 V vs. ref.
126
Výsledky a diskuse
První předběžná měření s BiF3-CPE byla prováděna v modelovém roztoku 0,2 M octanového
puru, který obsahoval 90 μg/L olova a kadmia. Uhlíková pasta s příměsí jednoho procenta
BiF3 (1%BiF3-CPE) prokazovala nejnižší citlivost k oběma stanovovaným kovům.
10%BiF3-CPE v porovnání s ostatními BIF3-CPE poskytovala jednoznačně za daných
podmínek nejvyšší hodnoty proudových signálu daných kovů. Vyšší obsah BiF3 v uhlíkové
pastě již měl za následek nejen pokles signálu olova a mírný pokles signálu kadmia, ale
zejména zvýšení proudové pozadí. S ohledem na tato pozorování byla k dalším studiím
používána 10 %BiF3-CPE.
Vedle víceméně standardního octanového pufru byly zaznamenány odezvy i v roztocích
minerálních kyselin (pH 1), které nejsou typickým prostředím při analýzách s BiFE. Jak
ukazuje Obr. 1, vývoj vodíku ve všech kyselých prostředích je posunut k pozitivnějším
hodnotám a znemožňuje tak např. stanovení zinku. Bylo také zjištěno, že s elektrodou
10%BiF3-CPE je možno pracovat kaj v bazickém, tak i silně alkalickém prostředí. Odezva
Pb(II) v amonném pufru byla však velmi malá a roztok 0,1 M NaOH byl vhodný ještě méně,
neboť oba signály byly deformovány nepříznivým průběhem základní linie (Pozn: Oba
experimenty nejsou na obrázku znázorněny).
Obr. 1. Chování 10%BiF3-CPE v rozličných typech elektrolytů v kyselé oblasti pH.
Experimentální podmínky: c(cd), c(pb)= 90 μg L-1, Edep = -1,1 V, tdep = 120 s).
Při optimalizaci celého postupu elektrochemické rozpouštěcí analýzy bylo zjištěno, že ani
dlouhé depoziční časy akumulačního kroku nevedly k saturaci povrchu elektrody. Závislost
výšky píků Cd(II) a Pb(II) na době depozice je v případě Pb(II) lineární až do hodnoty 1800 s
(30 min), zatímco v případě Cd(II) je pro čas od 900 s pozorována jistá odchylka od linearity.
Citlivost 10%BiF3-CPE byla natolik vysoká, že bylo možné provést kalibrační měření na
koncentrační úrovni 2 μg L-1 až 12 μg L-1, lineární odezva pak dosahovala u obou kovů stejné
hodnoty korelačního koeficientu R2 = 0,9987. Hodnota reprodukovatelnosti pro deset
127
identických měření s koncentracemi Cd(II) a Pb(II) = 100 μg L-1 dosahovala hodnot ±1,1 %
pro Pb(II) a ±1,4 % pro Cd(II). Posledním a důležitým krokem bylo ověření funkčnosti
10%BiF3-CPE při analýze Pb(II) v reálném vzorku (viz Obr. 2). K tomuto účelu byl použit
certifikovaný referenční materiál (CRM) z kategorie odpadních kalů. (Vzorek tohoto typu byl
zvolen záměrně, protože příslušné CRM obecně obsahují množství kovů, z nichž některé na
poměrně vysokých koncentračních úrovních a velmi dobře poslouží především při ověřování
selektivity měření.) Po mikrovlnném rozkladu byl vzorek analyzován metodou standardního
přídavku a nalezená hodnota 227,55 μg L-1 odpovídala certifikovanému obsahu
235,28 ± 11,0 μg· L-1. Tento výsledek naznačil, že nový typ elektrody 10%BiF3-CPE je
využitelný pro analýzu reálných vzorků podobného původu, a to bez nutností jakýchkoli
speciálních úprav.
y = 0.01936x + 1.08092
2
R = 0.9997
Plocha píku ( A)
4
3
2
1
0
-50
0
50
100
koncetrace ( g/l)
150
Obr. 2: Stanovení olova v odpadního kalu po jeho mikrovlnném rozkladu metodou standardního
přídavku. Legenda:
... vzorek,
... std. přídavky. Experimentální podmínky: 10%BiF3CPE; jednotlivé přídavky odpovídají c(pb)= 50 μg L-1, Edep = -1,1 V, tdep = 300 s.
Závěr
V předložené studii bylo ukázáno, že bismutová elektroda připravená objemovou modifikací
uhlíkové pasty BiF3 má v prostředí octanového pufru všechny předpoklady pro elektroanalytické stanovení Pb2+ a Cd2+ ve směsích, a to až na atraktivní mikrogramové koncentrační
úrovni. Na základě předchozích zkušeností 12,14,15 se plně potvrdilo, že množství modifikátoru
v uhlíkové pastě zásadně ovlivňuje výsledný signál daných kovů, přičemž jako nejvhodnější
se jevila konfigurace 10%BiF3-CPE s optimálním poměrem „signál-vs-šum“, ale i nejvyšší
citlivostí ke stanovovaným kovům.
Poděkování
Tato práce vznikla s podporou MŠMT a AIP ČR v rámci bilaterálního programu KONTAKT,
ev. č. MEB091139.
128
Literatura
1. Hočevar S.B., Ogorevc B., Wang J. 7th YISAC 00, (2000) Graz: UNI Graz.
2. Wang J., Lu J.-M., Hočevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B. Anal. Chem. 72, 3218
(2000).
3. Švancara I., Prior C., Hočevar S.B., Wang J. Electroanalysis 22, 1405 (2010).
4. Economou A. TrAC – Trends Anal. Chem. 24, 334 (2005).
5. Wang J. Electroanalysis 17, 1341 (2005).
6. Švancara I., Vytřas K.: Chem. Listy 100, 90 (2006).
7. Economou A., Fielden P.R. Analyst 128, 205 (2003).
8. Baldrianová L., Švancara I., Vlček M., Economou A., Sotiropoulos S. Electrochim. Acta
52, 481 (2006).
9. Pauliukaitė R., Kalcher K. Worshop on Electrochemical Sensors – Prague, Book of
Abstracts p30 (2001). Praha: Česká společnost chemická.
10. Pauliukaitė R., Kalcher K. 8th YISAC 01, (2001) Pardubice: Univerzita Pardubice.
11. Królicka A., Pauliukaitė R., Švancara I., Metelka R., Norkus E., Bobrowski A., Kalcher
K., Vytřas K. Electrochem. Commun. 4, 193 (2002).
12. Pauliukaitė R., Metelka R., Švancara I., Królicka A., Bobrowski A., Vytřas K., Norkus E.,
Kalcher K. Anal. Bioanal. Chem. 374, 1155 (2002).
13. Švancara I., Metelka R., Stibůrková M., Jansová G., Seidlová J., Vytřas K., Pihlar B. Sci.
Pap. Univ. Pardubice Ser. A 8, 19 (2002).
14. Pauliukaitė R., Metelka R., Švancara I., Królicka A., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher
K., Vytřas K. Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 10, 47 (2004).
15. Sopha H., Baldrianová L., Tesařová E., Grincienė G., Weidlich T., Švancara I., Hočevar
S.B. Electroanalysis 22, 1489 (2010).
129
FOX-7 – Study of Reduction Products by Spectroelectrochemical Methods
(FOX-7 – Studium produktů redukce pomocí spektroelektrochemických metod)
Ludmila Šimková a, Evgenia Dmitrieva b, Jiří Klíma a, Lothar Dunsch b, and Jiří Ludvík a
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23
Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Leibniz Institute for Solid State and Materials Research Dresden (IFW), Center of
spectroelectrochemistry, Department of Electrochemistry and Conducting Polymers,
Helmholtzstraβe 20, 01069 Dresden
Abstract
A new energetic material 2,2-dinitroethene-1,1-diamine (FOX-7) is recently broadly tested
because of its high performance and very low sensitivity. On the other hand, its
electrochemical and redox properties have not been studied yet. Our results show that FOX-7
is reduced in aprotic solvents only by two one-electron steps up to –2.9 V. The color changes
during reduction of FOX-7 and reversibility of the redox process indicate the presence
of radical intermediates. Therefore in situ UV-vis-NIR and ESR spectroelectrochemical
investigations were performed. The products after exhaustive electrolyses were separated by
HPLC and are identified by mass spectrometry. The possible formation of gaseous products
was followed by online EC-GC.
Key words: FOX-7, 2,2-dinitroethene-1,1-diamine, Spectroelectrochemistry, ESR
spectroscopy, UV-vis-NIR, Reduction, Mechanism.
Introduction
2,2-Dinitroethene-1,1-diamine (FOX-7), acronym DADNE or DANE, is a recently
synthesized 1 material with significant potential for application due to its excellent properties
– high detonation energy and velocity and simultaneously low impact and friction sensitivity.
Its chemical and physical properties have been recently extensively reviewed 2. From
the electrochemical point of view, FOX-7 is a very interesting molecule with multiple redox
centers. Its structure is remarkable due to the combination of geminal reducible nitro-groups
in neighborhood of geminal oxidizable amino-groups. This combination represents a typical
case of “push-pull” delocalization which allows an intramolecular electron transfer.
Therefore FOX-7 can be presented in several different mesomeric, tautomeric and also
acidobasic forms (Fig. 1).
O 2N
NH
OH
NH2
H
-
C
O 2N
-
O 2N
NH2
O 2N
NH2
+
H
+
+
O 2N
NH3
O 2N
NH2
Fig. 1. Acidobasic equilibria of FOX-7.
Redox properties of FOX-7 have not been studied yet. Recently we found that
electrochemical reduction in aqueous solutions is able to provoke the chain of follow-up
processes leading to the total degradation of the parent substance 3. The results of the
electrochemical reduction of FOX-7 in non-aqueous media are also surprising. In aprotic
solvents FOX-7 is reduced in only two one-electron steps with reversible character.
This number is lower than theoretical expectations. In addition to this its electrolysis
is accompanied by color changes. For better understanding of reduction mechanism of FOX-7
in aprotic solvents the UV-vis-NIR and ERS spectra were continuously recorded during
electrolysis.
130
Experimental
The sample of FOX 7 was received directly from the laboratory of organic synthesis at the
University of Pardubice. As aprotic solvents dimethylforamide (DMF) or acetonitrile (AN)
were used with 0.1 M terabutylammoniumtetrafluoroborate (TBATFB) or tetrabutylamoniumhexafluorophosphate (TBAHFP). For all electrochemical experiments three-electrode system
was used.
Dc-polarography, cyclic voltammetry, differential pulse polarography (DPP) and preparative
electrolysis were conducted by the analog potentiostat Polarographic analyzer PA 4 with XYrecorder (laboratorní přístroje Praha). Classical dropping mercury electrode (DME) with
a controlled drop time was used for dc-polarography and DPP. A hanging mercury drop
electrode (HMDE) was used for cyclic voltammetry. For these experiments a stock solution of
0.01 mol.L-l FOX-7 in DMF was every day freshly prepared and diluted according to the
need. The preparative electrolysis on mercury pool (area cca 1 cm2) proceeded in a divided Htype cell, where anodic and cathodic parts are separated by a dense frit. Concentration of
FOX-7 in these experiments was less than 0.05 mol.L-l.
In situ ESR/UV-vis-NIR spectroelectrochemical experiments were performed in the optical
ESR cavity (ER 4104OR, Bruker Germany), ESR spectra were recorded by the EMX X-band
CW spectrometer (Bruker, Germany). UV-vis-NIR spectra were measured by Avantes
spectrometers AvaSpec-2048x14-USB2 with the CCD detector and AvaSpec-NIR256-2.2
with the InGaAs detector applying the AvaSoft 7.5 software. Both the ESR spectrometer and
the UV-vis-NIR spectrometers were linked to a HEKA potentiostat PG 390. Triggering was
performed by the software package PotMaster v2x40 (HEKA Electronic, Germany).
A spectroelectrochemical flat cell with a three-electrode arrangement consisting
of a laminated working electrode with a gold mesh, a platinum wire as a counter electrode,
and a silver chloride-coated silver wire as a pseudoreference electrode was used. The scan rate
for in situ spectroelectrochemical measurements was around 4 mV/s. All solutions were
prepared in glove box.
Results and discussion
The reduction of FOX-7 on mercury electrode in aprotic media (AN, DMF) proceeds in two
or three waves (up to the potential – 2.9 V) in dependence on concentration (Fig. 2). The first
reduction wave (E1/21 = – 0.75 V) appears at concentration lower than 1·10-4 mol.L-1. At
higher concentration its limiting current i1 remains constant and a second reduction wave is
formed at E1/22 = – 1.1 V. Its limiting current, i2 increases linearly with concentration.
The sum i1 + i2 is proportional to the concentration and corresponds to consumption of one
Faraday per mol. These two reduction waves represent the first reduction step of FOX-7,
where the first wave is an adsorption pre-wave. One can conclude that the product of the first
electron transfer is adsorbed at the electrode. This finding was also proved by DPP.
The limiting current of the third reduction wave, i3 is linearly dependent on concentration of
FOX-7, equals to the sum of i1 and i2 and represents the second reduction step. Whole process
is controlled by diffusion.
131
Fig. 2. The polarography curve of FOX-7 in AN + 0.1 M TBATFB. Concentration of FOX-7
is 6·10-4 mol.L-1.
The electrolysis of FOX-7 in AN (as well as in DMF) is dependent on applied potential and
corresponds to the voltammetric results: For electrolysis at the limiting current of i 2, one
electron per molecule is consumed. Electrolysis at potentials corresponding to the limiting
current i3, requires two electrons and proceeds in two phases (cf. Fig. 3). From the shape
of the i-t curve it is evident that the reaction mechanism is complicated and involves
consecutive reactions.
-0,0040
-0,0035
current [A]
-0,0030
-0,0025
-0,0020
-0,0015
-0,0010
-0,0005
0,0000
0
1000
2000
3000
4000
5000
time [s]
Fig. 3. The chart of dependence of current on time during electrolysis of FOX-7 in AN +
0.1 M TBAHFP in potential –1.8 V. The concentration of FOX-7 is 0.00264 mol.L-1.
During electrolysis in both aprotic solvents the solution changes its color – from yellow
through orange to green color upon electrolysis at higher potentials. Therefore in situ UV-visNIR spectra were continuously recorded during electrolysis up to –2.0 V. The spectra show
increase of new absorption bands in UV as well as in visible area and the changing shape of
the spectrum points to the presence of at least two different stable intermediates (products)
when the potential is kept in the region of limiting current i2. The reduction at the most
negative potentials (i3) is accompanied by decomposition of one stable intermediate generated
at i2 and a new product is formed with characteristic bands at 306 and 710 nm. These
wavelengths belong to the radical(s) which was proved using in situ EC-ESR experiments.
The electrolyzed solutions of FOX-7 in AN were continuously analyzed by dc-polarography
during the electroreduction. From the first moment of electrolysis a new oxidation wave at
potential – 0.2 V was observed (Fig. 4), the current of which increased with time.
132
Fig. 4. The chart of dependence of current on potential. (a) Polarography curve of sample
before electrolysis. (b) Polarography curve after electrolysis of FOX-7 in AN + 0.1 M
TBAHFP in potential – 1.3 V.
In addition to this, formation of gaseous products during electrolysis was observed, similarly
like in acidic aqueous solutions3. The isolation (by liquid or online gas chromatography) and
identification (by mass spectrometry) of all products after exhaustive electrolysis are now
under way.
Conclusion
Based on the results of cyclic voltammetry, dc-polarography and controlled potential
electrolysis, FOX-7 is reduced in aprotic solvents by only two electrons in contrary to the
experiments in aqueous media. The electrochemical reduction is accompanied by changing
of colors pointing to the participation of radical species in the degradation mechanism, where
several follow-up reactions take place. In situ UV-vis-NIR/ESR spectroelectrochemistry show
that upon the first reduction step at least two different stable intermediates are formed. During
the second – reversible – reduction step an ESR signal is observed. As a result, instead of a
standard electrochemical reduction of the title dinitro-compound, an electrochemically
initiated degradation process occurs. Due to the presence of gaseous products, an eventual
analogy with the mechanism during explosion should be considered, where the primary
reduction serves as an activation impulse initiating a chain of intramolecular redox reactions
leading to total degradation of FOX-7.
Acknowledgements
This work is supported by the project P206/11/0727 Grant Agency of the Czech Republic
(GAČR). The authors are grateful to Ing. Zdeněk Jalový from the University Pardubice for
granting the sample and to Prof. F. Liška for valuable consultations.
References
1. Latypov N. V., Bergman J., Langlet A., Wellmar U., Bemm U: Tetrahedron, 54, 11525
(1998).
2. Šimková L., Liška F., Ludvík J.: Current Organic Chemistry, 15, 2983 (2011).
3. Šimková L., Klíma J., Sazama P., Ludvík J.: J. Solid State Electrochem., 15, 2133 (2011).
133
Electroanalysis in a Monothematic Book: Recent Experiences from Making of
a Monograph
(Elektroanalýza v monotematické knize aneb Nedávné zkušenosti z přípravy
monografie pro zahraničního nakladatele)
Ivan Švancara a, Kurt Kalcher b, Alain Walcarius c, and Karel Vytřas a
a
Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of
Pardubice, 532 10, Pardubice, Czech Republic. Email: [email protected]
b
Institute of Chemistry – Analytical Chemistry, Karl-Franzens-University of Graz,
Universitaetsplatz 1, A-3000 Graz, Austria.
c
Laboratory of Physical Chemistry and Microbiology for the Environment,
UMR 7564 CNRS – University of Nancy I, Villers-les-Nancy, France.
Abstract
On one example of the just-released book, the adventure of issuing a scientific monograph in
cooperation with a renowned publishing house is overviewed. The process is described and
discussed in its entirety, from the initial impulse, official administration and communication
with the publisher, via the individual steps of preparation, scheduling (as authors teamwork),
and proper making of, up to the final compilation of the manuscript and its release as a book.
Key Words: Electroanalysis, book, preparation and making of, retrospective insight.
Úvodem
V tomto poněkud neobvyklém příspěvku by se autoři rádi podělili o své čerstvé zkušenosti
s přípravou odborné knihy typu tradiční monografie – tj. spisu na jedno ucelené téma, na
jehož náplni se každý ze čtyř autorů podílel průběžně v celém textu. Není tajemstvím, že
podobný počin bývá ve vědecké sféře považován za jakési vyvrcholení publikačních snah o
dané problematice, obvykle jako bilancování určité etapy daného oboru nebo naopak
poukázání na nejnovější trendy; obojí v šíři, kterou autoři ve standardních přehledných
referátech obsáhnout nemohou nebo ani nechtějí.
K tomu, aby nějaká monografie vůbec vznikla, je samozřejmě zapotřebí příznivá konstelace
celé řady faktorů. Mezi rozhodující určitě patří aktuální situace v oboru a tím i potenciální
poptávka po zamýšleném díle, potřebná erudice autorů a od ní odvislá podpora vydavatele,
vítány jsou určitě dlouhodobější zkušenosti a bohaté kontakty s obdobně zaměřenými
pracovišti. A i toto nemusí stačit, pokud nejsou potřebné časové možnosti a s tím související
odhodlání autorů obětovat část svých soukromých aktivit. Prakticky se vším jsme se během
práce na knize setkali, což dokládá i stručný přehled toho podstatného
anebo i méně
podstatného, ale o to zajímavějšího
co se událo během přípravy, vlastního sepisování a
konečné kompletace naší debutové monografie.
Poznámka: Pro případ, že by byl tento příspěvek zpřístupněn odborné veřejnosti v plném
rozsahu, popisovaná kniha není v textu jmenována z důvodu publikační / autorské etiky.
Specifikovány nejsou ani údaje, které by mohly vést k její jednoznačné identifikaci.
Jak kniha vznikala
Počáteční impuls
Ke vzniku knihy přispěla zvláštní shoda okolností; šlo o kompenzační nabídku vlivného
zástupce vydavatele z konce roku 2008, který spis typu monografie navrhl jako protihodnotu
za odmítnutí předem vyžádaného referátu; ten totiž svojí přílišnou délkou i značně širokým
záběrem nevyhovoval představám nových majitelů vydavatelství.
134
Komunikace s vydavatelem
Nabídka, jakožto příležitost, která se již nemusí opakovat, byla okamžitě přijata; vše
související přišlo až poté. Šlo však o promyšlené rozhodnutí, neboť stejný autorský kolektiv
v minulosti nejednou spolupracoval na rozsáhlejších referátech1-3 a případná „opravdová“
monografie byla také nejednou uvažována. Poté následovala oboustranná intenzivní emailová
korespondence, během níž si dvojice do projektu zasvěcených redaktorů postupně vyžádala:
(i) podrobná CV, (ii) seznamy publikačních aktivit a (iii) předběžnou podobu zamýšleného
obsahu knihy. Následovalo první schválení a hned poté podrobný (iv) marketingový dotazník,
jehož úplné vyplnění vyžadovalo plnou součinnost všech zainteresovaných autorů. Klíčovou
částí dotazníku bylo zdůvodnění, v čemž autoři spatřují hlavní priority jejich projektu a která
literatura může představovat případnou konkurenci chystanému spisu. Posledním důležitějším
požadavkem vydavatelství byl (v) návrh pěti až šesti recenzentů, kterým byl předložen
vypracovaný předběžný obsah. (Autorům dodnes není známo, jestli doporučenou pětici
doplnili ještě nějací další recenzenti, vybraní samotným vydavatelstvím.)
Smlouva o projektu
Po několika měsících, konkrétně v polovině léta 2009, přišel definitivní souhlas vydavatele
s projektem, což každý autorů ztvrdil svým podpisem na vlastním exempláři oficiální
smlouvy (Ve světle příštích událostí je na tomto místě dobré uvést, že smlouva zahrnovala jak
časový plán, včetně konkrétní uzávěrky, tak i přibližný stránkový rozsah rukopisu.) Po
parafování smluv dorazila obratem poslední zásilka – série oficiálních brožurek
z nakladatelství s podrobnými pokyny pro formální stylizaci rukopisu a způsobu jeho
ukládání do konečné elektronické podoby. A mohlo se začít...
Přípravné práce a pracovní plán
Po rozdělení všech částí textu mezi jednotlivé autory nebylo podrobněji určeno, v jaké podobě
mají své příspěvky připravit; byly zde předchozí zkušenosti a respektovat se měl jen společný
obsah a předem přibližně určený počet stran, obrázků a tabulek. Určitě největší část
přípravných prací pohltila nutná aktualizace dostupné literatury a její roztřídění, což si
vyžádalo min. půl roku intenzivní práce (Zde poprvé přišel zákon schválnosti – zatímco
v celém předchozím období 1990-2005, které jsme mapovali společně1, přibývalo ročně 100120 nových publikací (viz Obr. 1), tak ve všech následujících letech to bylo až 5 více. Na
jedné straně to svědčilo o novém rozmachu oboru a správném načasování knihy, na straně
druhé to znamenalo obrovské množství práce navíc, přičemž velkou měrou se na tom
„podepsalo“ tehdejší lavinovité šíření nových on-line časopisů.)
Obr. 1. Osvědčená papírová kartotéka prvního z autorů se záznamy o publikacích
z předešlých čtyř dekád zůstala během práce na knize téměř nedotčena. Přednost již dostaly
vesměs zkompletované elektronické databáze.
135
Seznam literatury
Přípravná fáze byla završena domluvou o podobě citované literatury a způsobu uvádění v
textu, jež byla dána striktním požadavkem nakladatelství používat "full-text" citace. Kvůli
úspoře místa bylo nutno upustit od pohodlnějšího citování po kapitolách a pracovat
s předběžnými dílčími soubory referencí s dohodnutým kódováním a počítat s jejich
pozdějším sloučením v jeden celek. (To nás čekalo až v závěrečné fázi práce a i když jsme
tušili, že nepůjde o zrovna snadný úkol, pozdější realita překonala veškerá očekávání.)
Sepisujeme ve čtyřech, ale víceméně každý sám
Tento podtitulek věrně vystihuje průběh vlastního psaní, které probíhalo od podzimu 2009 až
do února 2011, a nepotřebuje další komentář. Snad jen poznámku, že původní představy o
širším využívání předchozích textů vzaly u všech autorů brzy za své při potřebě zapracovat do
textů enormní množství nové literatury a nesčetných novinek v jednotlivých oblastech.
Nestíháme, ale jinak se daří
Jak čas plynul a jednotlivé kapitoly či podkapitoly získávaly svoji konkrétní podobu,
ukazovalo se, že původně dohodnutý termín odevzdání rukopisu i předběžně stanovený
celkový rozsah rukopisu se nepodaří splnit. Občasné poraženecké nálady naštěstí vždy
rozptýlil vstřícný přístup nakladatelství, ale i některé další výdobytky, které dodávaly
potřebný elán. V této souvislosti je nutno vzpomenout úspěch při získání zřejmě posledního
žijícího svědka úplných začátků oboru k napsání ryze autentického Úvodu, vyslyšena byla i
žádost u jiné osobnosti oboru o shlédnutí a komentář k pracovní verzi jedné
z nejproblematičtějších podkapitol. Do stejné kategorie patřila i nabídka představitelů fakulty
k využití zvláštní dotace MŠMT ČR k pokrytí nákladů s tiskem barevných předloh obrázků a
schémat. (V tomto případě, v duchu rčení „o zabití dvou much jednou ranou“, získal
obrázkový materiál na přitažlivosti a dodatečným vybarvením již existujících obrázků bylo
také možno obejít nepříjemnou povinnost žádat o "copyright" pro své vlastní ilustrace.)
Dáváme vše dohromady
Jak již bylo naznačeno, všechny dílčí příspěvky shromažďované na přelomu let 2010/2011
byly skládány dohromady až v samotném závěru, což se neobešlo bez drobných kolizí, ale u
textů, tabulek a obrázků vše proběhlo nad očekávání uspokojivě. Příslovečným hororem však
byly soubory citací a jejich slučování, kdy konečný aglomerát čítal na 3300 odkazů.
S odstupem času lze konstatovat, že i přes několikadenní manuální kontroly a posléze i
použití speciálně navrženého počítačového programu nebyla závěrečná verze Seznamu
použité literatury vydařená a stále obsahovala řadu zdvojených citací. Naštěstí a díky
profesionálnímu přístupu nakladatele byly duplikáty vesměs objeveny a odstraněny ještě před
finálními korekturami. Jinak by v původním souboru a v konfrontaci se sloučeným textem a
sérií rozsáhlých tabulek byly všechny následné úpravy nadlidským úkolem.
Kniha je tu !
Hotový rukopis byl vydavateli odeslán v polovině dubna 2011 (viz Obr. 2, na předchozí
straně, vlevo). S malou duší, protože šlo o více jak půlroční zpoždění a konečný rozsah byl
překročen skoro o 100 %. Zodpovědní pracovníci nakladatelství tuto skutečnost velkoryse
přešli a bezproblémová komunikace pokračovala i v průběhu dvojích korektur. Fázi několikaměsíční výroby knihy ještě doprovázely některé upřesňující e-maily z obou stran, aby během
druhého týdne března 2012 byly bezpečně doručeny slíbené autorské výtisky do rukou
každého z autorů (viz Obr. 2 vpravo).
136
Obr. 2. Přesto, že kniha vznikala hlavně z elektronických předloh, nakladatelství si vyžádalo
také tištěný manuskript; ten čítal přes tisíc stran a celá zásilka vážila 4,5 kg (vlevo). Autorské
výtisky knihy byly právě doručeny poštou (vpravo).
Závěr
Rozbalením plastového pytle z obrázku skončila tři a půlletá peripetie jménem „Naše první
odborná monografie“. Výše uvedené vzpomínání je jen heslovitou zkratkou všeho dění
kolem, ale případné zájemce o podobný počin z řad účastníků jetřichovického semináře rádi
zasvětíme do podrobností. Monografií z elektroanalýzy není zase tak mnoho, aby nás někdo
další nemohl následovat...
Poděkování
Na tomto místě by autoři opět rádi poděkovali za finanční podporu Ministerstvu školství,
mládeže a tělovýchovy České republiky (projekt č. MSM0021627502), díky níž mohla být
kniha vytištěna ve stávající grafické úpravě.
Literatura
1. Kalcher K., Švancara I., Metelka R., Vytřas K., Walcarius A.; in: Encyclopedia of
Sensors, Vol. 4 (C.A. Grimes, E.C. Dickey, M.V. Pishko, Eds.), pp. 283-430. American
Scientific Publishers, Stevenson Ranch, 2006.
2. Švancara I., Walcarius A., Kalcher K., Vytřas K. Cent. Eur. J. Chem. 7, 598 (2009).
3. Švancara I., Vytřas K., Kalcher K., Walcarius A., Wang J. Electroanalysis 21, 7 (2009).
137
Voltammetric Determination of Caffeine in Commercial Beverages on Bare BoronDoped Diamond Electrode
(Voltampérometrické stanovenie kofeínu v komerčných nápojov na bórom dopovanej
diamantovej elektróde)
a
Ľubomír Švorc , Jana Svítková a, Peter Tomčík b, Miroslav Rievaj a, and Dušan Bustin a
a
Slovak University of Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of
Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic,
E-mail: [email protected]
b
Catholic University in Ružomberok, Faculty of Education, Department of Chemistry,
Hrabovská cesta 1, 034 01 Ružomberok, Slovak Republic
Abstract
A sensitive and selective electrochemical method for the caffeine determination using bare
boron doped diamond electrode was developed. The effects of supporting electrolyte, pH and
scan rate on the voltammetric response of caffeine oxidation were studied to select the
optimum experimental conditions. Linear response of peak current on the concentration in the
range from 0.4 to 25 μmol L-1, good repeatability (RSD of 2.1 %) and the detection limit of
0.15 μmol L-1 without any chemical modifications and electrochemical surface pretreatment
were observed by differential pulse voltammetry. The effect of possible interfering
compounds appeared to be negligible which evidently proved good selectivity. The proposed
method was successfully applied for the caffeine determination in commercially available
beverages, with results in a close statistical agreement to those declared by manufacturer.
Key Words: Caffeine, 1,3,7-trimethylxantine, Boron-doped diamond electrode,
Voltammetry.
Introduction
Caffeine (1,3,7-trimethylxantine) is a natural alkaloid belonging to N-methyl derivatives of
xanthine. It is found in various kinds of beverages and food such as coffee, coca-cola, tea,
cocoa beans and chocolate. Because of high popularity of coffee and other caffeine containing
beverages including soft and energy drinks, caffeine is the most commonly used psychoactive
substance in daily human life. Caffeine has many important physiological effects, such as
stimulation of the central nervous system, diuresis and gastric acid secretion 1,2. However,
high amounts of caffeine can cause trembling, nausea, nervousness, and seizures 3. Due to the
above mentioned facts detection and quantification of caffeine is important and does not have
only clinical significance, but it can also give beneficial advice to people’s health and life.
Numerous studies aimed towards the development of analytical methods for the caffeine
determination in different matrix (environmental, biological, plants, food, etc.) has been
published. From the optical techniques UV4 4, FT-infrared 5 and FT-Raman 6 were usually
employed for caffeine determination. The separation methods such as capillary
electrophoresis 7, gas chromatography 8 and liquid chromatography 9 were used for the
analysis of mixtures containing caffeine and other drugs or metabolites. However, these
techniques are mostly very expensive and long time is required for some procedures as
derivatization, extraction and purification, therefore, the development of reliable, low-cost,
rapid, simple and accurate method for caffeine determination in various foodstuffs,
pharmaceutical formulations and biological fluids is needed.
This fact opens the opportunities for the electrochemical methods employment, however only
a few papers dealing with an electroanalysis of caffeine on more common electrode materials
had appeared. This is because the oxidation of caffeine occurs at a very high positive
potential, and may overlap with electrochemical reactions limiting potential window from the
138
anodic side. Boron-doped diamond (BDD) is a modern electrode material which opens new
possibilities of electrochemical investigations due to its excellent features, such as the wide
potential window in aqueous solutions, low background current, long-term stability of
response, low sensitivity to dissolved oxygen and a good resistance to surface fouling due to
weak adsorption 10,11.
Based on the above mentioned facts this work demonstrates the application of bare BDD
electrode as very sensitive electrochemical sensor for the voltammetric determination of
caffeine without any chemical modifications and/or electrochemical pretreatment of electrode.
This simple and practical analytical approach is illustrated on several commercial beverages.
Experimental
Caffeine was obtained from Zentiva (Hlohovec, Slovak Republic) and used as received. All
reagents were of analytical grade purity. The stock solution of caffeine (1.0 × 10-3 mol L-1)
was prepared using double-distilled deionized water. All electrochemical experiments were
conducted in a three-electrode single compartment glass cell. This cell consisted of Ag/AgCl
(3 mol L-1 KCl) reference electrode, a platinum wire as counter electrode and BDD electrode
with inner diameter of 3 mm (Windsor Scientific Ltd, United Kingdom) served as the working
electrode. Voltammetric measurements were carried out using an AUTOLAB PGSTAT-302N
(EcoChemie, The Netherlands) potentiostat/galvanostat controlled with the NOVA 1.7
software. All pH values were measured with pH meter Model 215 (Denver Instrument, USA).
Cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) were employed without
deaeration, since dissolved oxygen did not interfere in anodic potential window of BDD
electrode. After optimization of instrumental parameters DPV voltammograms were recorded
and then calibration curve was constructed from the average of six consecutive measurements
for each addition of standard. The detection limit was calculated using the 3 criterion. In
order to fit into linear range of calibration curve, beverages were diluted by a factor 1:200
(v/v) with the supporting electrolyte after sonical elimination of gas. Coffee and tea solutions
were prepared by dissolving 1 g of coffee powder and a tea bag in 100 mL of boiling water,
then filtered and diluted with the supporting electrolyte.
Results and discussion
First, CV was applied to elucidate the electrochemical behavior of caffeine on BDD electrode
(Fig. 1).
Fig. 1. CV voltammograms of (a) 0 μmol L-1 and (b) 10 μmol L-1 caffeine in 0.4 mol L-1
HClO4 on bare BDD electrode with scan rate of 50 mV s-1.
139
It shows the anodic peak at the potential of about +1.55 V vs. Ag/AgCl and no presence of
any cathodic peak on the reverse scan, indicating that the charge transfer during caffeine
oxidation is electrochemically irreversible. Further, as it is apparent in the absence of caffeine
no oxidation peak is observed and background current is very low.
It was previously observed that low pH has a significant influence on the oxidation of
caffeine. We decided to choose and test perchloric acid in the pH range of 0.5-3 with
10 μmol L-1 caffeine concentration. Apparently the magnitude of peak current was found to be
highest in pH equal to 0.5 (results not shown). Based on this fact 0.4 mol L-1 HClO4 was
chosen and used in further experiments. The peak potential was slightly shifted towards more
negative potentials and peak current decreases as the pH increases in the range of 0.5-3.0.
Next, we performed further experiments to study the effect of the scan rate on the
voltammetric response of caffeine oxidation at bare BDD electrode and characterize the
transport in a diffusion layer. Fig. 2 shows the CV voltammograms in the presence of
10 μmol L-1 caffeine in 0.4 mol L-1 HClO4 recorded at various scan rates. The slight shift of
peak potential towards more positive potential was observed as the scan rate increased. From
the inset of Fig. 2 it can also be seen that peak current is linearly proportional (R2 = 0.998) to
the square root of the scan rate within the range of 10-300 mV s-1 indicating that the electrode
reaction is controlled by diffusion thus rate-limiting adsorption and/or specific interactions on
bare BDD electrode surface are negligible.
Fig. 2. CV voltammograms of 10 μmol L-1 caffeine in 0.4 mol L-1 HClO4 on BDD electrode
for scan rates (v) of: (a) 10, (b) 25, (c) 50, (d) 100, (e) 200 and (f) 300 mV s-1. The
dependence between peak current (μA) and square root of the scan rate appears in the inset.
Differential pulse voltammetry (DPV) was chosen as more sensitive voltammetric technique
in comparison with cyclic voltammetry to investigate the dependence between peak currents
and caffeine concentrations. The calibration curve was constructed by measuring of peak
current with optimized DPV parameters. Fig. 3 displays DPV voltammograms at various
concentrations of caffeine in 0.4 mol L-1 HClO4. An average of six consecutive measurements
was used for calibration curve construction. The dependence of peak current on caffeine
concentration shows a good linearity in the concentration range from 0.4 to 25 μmol L-1 as
depicted in the inset of Fig. 3. and is expressed by the equation: Ip ( A) = 2.4 + 3.2 c
(μmol L-1), R2 = 0.999. The detection limit was calculated according to 3 criterion and was
140
found to be 0.15 μmol L-1. The repeatability was evaluated by six successive measurements of
10 μmol L-1 caffeine solution under the same operating conditions over the short time interval
(RSD = 2.1%).
Fig. 3. DPV voltammograms of caffeine solutions with various concentrations: (a) 0 , (b) 0.4,
(c) 0.8, (d) 1, (e) 3, (f) 6, (g) 10, (h) 15, (i) 20 and (j) 25 μmol L-1 (supporting electrolyte 0.4
mol L-1 HClO4) on bare BDD electrode at optimized DPV parameters: modulation amplitude
of 50 mV, modulation time 20 ms and scan rate 50 mV s-1. The dependence between peak
current (μA) and caffeine concentrations (μmol L-1) appears in the inset.
The potential interferences influencing the caffeine determination was investigated by
addition of possible interferent to a solution containing fixed amount of 10 μmol L-1 caffeine.
The various species such as glucose, fructose, sucrose and ascorbic acid were tested under the
same experimental conditions and had no influence in 100-fold excess.
In order to estimate the accuracy of the proposed analytical technique, the standard additions
method was used for beverage sample analysis spiked with aliquots amount of caffeine
standard. The average results for six replicate measurements with standard deviations (SD)
and confidence interval for 95 % probability are summarized in Table I. To investigate matrix
effects the caffeine standard was added to the diluted coca-cola sample and the recoveries
were calculated. Their values reveal good accuracy of the presented method.
Table I.
Caffeine spiked coca-cola samples analysis on BDD electrode in DPV mode (n = 6).
Added
(μmol L-1)
Expected
(μmol L-1)
Found*
(μmol L-1)
SD
(μmol L-1)
CI for P=95 %**
(μmol L-1)
Recovery
(%)
0
50
100
150
200
297
347
397
447
247
292
338
401
457
13
17
21
23
29
(247 ± 11)
(292 ± 14)
(338 ± 17)
(401 ± 19)
(457 ± 24)
98.3
97.4
101.0
102.2
* Average for six replicate measurements (n = 6): x
** Confidence interval calculated according ( x ± tn-1,α SD/n1/2); from tables t5; 0.05 = 2.0150
The oxidation peak current of caffeine is sensitive to each standard addition, however in the
case of coca-cola sample it occurs at slightly more positive potential. This shift is probably
the consequence of the residual gas content presence in the coca-cola sample.
141
In order to evaluate the validity and practical applicability of the proposed method, three
commercially available caffeine containing beverages were directly analyzed. Real samples
analysis results of caffeine content in beverage samples are summarized in Table II. The
determined value of caffeine content in coca-cola is in good agreement with a content
declared by manufacturer.
Table II.
Real caffeine samples analysis (n = 6).
Caffeine content (mg.L-1)
Beverage samples
Coca-cola
Pepsi-cola
Energy drink
Proposed method
bare BDD (DPV)
98
117
202
SD
8
13
16
Declared by
manufacturer
100
120
195
Conclusions
Proposed analytical technique is simple and rapid in comparison with other analytical
methods used for the caffeine determination. The low detection limit (0.15 μmol L-1) was
obtained as a consequence of very high S/N ratio without any chemical modification of the
BDD surface and also no electrochemical pretreatment is involved. Method is highly selective
because species present in beverages as real samples like glucose or ascorbic acid do not
interfere even in a high excess. When tested the accuracy of the method recoveries from 97.4
to 102.2 % were achieved. Based on these facts, the presented method offers green and
sensitive possibility for quality control analysis of food products or pharmaceutical
formulations containing caffeine.
Acknowledgments
The authors thank the Grant Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic
(Grant No. 1/0182/11 and 1/0008/12) and Program for support young researchers (No. 6406).
References
1.
Spătaru N., Sarada B.V., Tryk D.A., Fujishima A.: Electroanalysis 14, 721-728 (2002).
2.
Rostagno M.A., Manchón N., D’Arrigo M., Guillamón E., Villares A., García-Lafuente
A., Ramos A., Martínez J.A.: Anal. Chim. Acta 685, 204-211 (2011).
3.
Okonny U.L.P., Wang S.X., Stubbs R.J., Guzman N.A.: Electrophoresis 26, 2652-2663
(2005).
4.
Fernandez-Maestre R., Hill H.H.: Int. J. Ion Mobil. Spec. 12, 91-102 (2009).
5.
Ito M., Suzuki T., Yada S., Kusai A., Nakagami H., Yonemochi E., Terada K.: J.
Pharm. Biomed. Anal. 47, 819-827 (2008).
6.
Koleva B.B., Kolev T.M., Tsalev D.L., Spiteller M.: J. Pharm. Biomed. Anal. 46, 267273 (2008).
7.
Zhao Y., Lunte C.E.: J. Chromatogr. B 688, 265-274 (1997).
8.
Jafari M.T., Rezaei B., Javaheri M.: Food Chem. 126, 1964-1970 (2011).
9.
Tzanavaras P.D., Themelis D.G.: Anal. Chim. Acta 581, 89-94 (2007).
10. Pecková K., Musilová J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148-172 (2009).
11. Pleskov Y.V.: Russ. J. Electrochem. 38, 1275-1291 (2002).
142
The Use of a Multi-Channel Capillary and a Capillary with Two Different Inner
Diameters for Electrophoretic Separation of Neurotransmitters
(Použití vícekanálové kapiláry a kapiláry o dvou různých vnitřních průměrech pro
elektroforetické stanovení neurotransmiterů)
Petr Tůma a, František Opekar b, and Eva Samcová a
a
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and
Molecular Biology, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic,
E-mail:[email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
Albertov 2030, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
A fused silica capillary with seven inner channels was tested for electrophoretic experiments.
An electrophoretic separation of dopamine, noradrenaline and adrenaline was performed in
100 mM acetic acid by use of contactless conductivity detection (C4D) and in 20 mM citric
acid/NaOH (pH 3.2) in combination with UV detection. Numbers of theoretical plates in
multi-channel capillary are around 160000 for C4D and around 600000 for UV detection. The
sensitivity in multi-channel capillary is 12times higher for C4D and 4times higher for UV
detection in comparison with 25 μm single-channel capillary. In another sets of experiments, a
separation of dopamine, noradrenaline and adrenaline was completed in 18 second by use of
parallel connection of 25 μm and 100 μm capillary.
Key Words: Contactless conductivity detection, Capillary electrophoresis, Multi-channel
capillary, Separation efficiency.
Úvod
V kapilární elektroforéze se separace standardně provádí v jednokanálových kapilárách o
vnitřním průměru (id) 5 až 100 m 1. Vnější průměr kapilár je v porovnání s id
několikanásobně větší (pohybuje se kolem 360 m). Pro účinnost separačního procesu v CE,
vyjádřenou počtem teoretických pater, N, platí 2 N = uiElef/2Di, kde ui a Di jsou
elektroforetická mobilita a difúzní koeficient sledovaného analytu, E intenzita elektrického
pole a lef efektivní délka kapiláry. Z tohoto vztahu jednoznačně vyplývá, že vysoké separační
účinnosti je docíleno pouze při vysokých hodnotách E. S rostoucím E ovšem roste množství
Jouleova tepla vznikajícího průchodem proudu roztokem v kapiláře, které způsobuje
nežádoucí rozmývání separovaných zón. Pro účinný odvod tepla z kapiláry je proto nutné, aby
poměr „odvod/generace“ tepla byl co největší; z tohoto hlediska je proto výhodné používání
kapilár s malým id. Na druhou stranu se snižujícím se id kapiláry klesá citlivost detekce; u
optických detektorů se snižuje délka optické dráhy, u elektrochemických klesá objem
detekční cely, podobně u MS klesá množství analytu vstupujícího do detektoru. Tento rozpor
je řešitelný použitím kapiláry s několika vnitřními kanálky (dále multi-channel kapilára).
Rozdělením jednoho velkého vnitřního průřezu na několik menších je možno dosáhnout
účinnějšího odvodu Jouleova tepla zvětšeným vnitřním povrchem. Toto řešení je výhodné i
z hlediska citlivosti bezkontaktní vodivostní detekce (C4D), protože při zachování malého id
jednotlivých kanálků, je snímán signál z celého průřezu kapiláry 3, tj. současně ze všech
kanálků. Jak bude ukázáno dále, vyšší je i citlivost UV detekce.
Rychlost elektroforetické migrace vi je přímo závislá na intenzitě použitého elektrického pole
E a mobilitě analytu ui, vi = Eui 2. Z těchto vztahů jednoznačně vyplývá, že pro dosažení
krátké doby analýzy a vysoké účinnosti separačního procesu je nutné pracovat při vysokých
hodnotách E. Separace prováděné na komerčních přístrojích CE jsou limitovány hodnotou
separačního napětí 30 kV a minimální délkou kapiláry cca 30 cm, což ve výsledku umožňuje
143
pracovat při maximálních hodnotách E kolem 1 kV/cm. Toto technické omezení je možné
obejít spojením dvou kapilár o různém vnitřním průměru id. Spojením analytické kapiláry s
malým id, která slouží jako vlastní separační kapilára, a pomocné kapiláry s velkým id, lze
docílit toho, že hodnoty E jsou v analytické části kapiláry několikanásobně větší než
v pomocné kapiláře, která pouze uzavírá elektrický obvod.
Experimentální část
Při experimentech byla používána křemenná multi-channel kapilára pokrytá ochrannou
vrstvou polyimidu o vnějším průměru (od) 360 µm se sedmi kruhovými kanálky o id 28 µm
(CACO, Slovensko), obr. 1. Pro porovnání byly elektroforetické experimenty prováděny ve
standardních jednokanálových kapilárách o id 25 a 75 µm a pro UV detekci rovněž v kapiláře
o id 25 µm s rozšířenou optickou dráhou v místě detekce na 125 µm; od všech kapilár bylo
360 m (Composite Metal Services, UK). Celková délka používaných kapilár byla 32,5 cm,
4
délka k C D 14,3 cm a délka k UV detektoru 8,3 cm. Pro sub-minutové separace byla použita
křemenná kapilára vyrobená spojením 15 cm kapiláry o id 25 μm a 17 cm kapiláry o id
100 μm; délka k UV 8,3 cm. Spojení kapilár bylo provedeno pomocí 1 cm dlouhé bužírky
používané pro izolaci proudo-vodičů. Před prvním použitím byly kapiláry aktivovány
promytím 0,1 M NaOH (10 min.), vodou (5 min.) a separačním elektrolytem (BGE, 5 min.);
mezi jednotlivými analýzami byly kapiláry promývány BGE (1 min.). Pro vybrané aplikace
byl elektroosmotický tok v kapilárách potlačen pokrytím kapiláry pomocí INST coatingsolution (Biotaq, USA). Separace byly prováděny v short-end injection módu 4.
Obr. 1. Sedmi-kanálová multi-channel kapilára o id 28 μm.
Elektroforetická měření byla provedena na přístroji HP3DCE system (Agilent Technologies,
Waldbronn, Germany) vybaveným diod-array detektorem a bezkontaktním vodivostním
detektorem (C4D)5, které jsou zabudovány do termostatované kazety s kapilárou. Pro kalibraci
C4D byly použity roztoky KCl o koncentracích 0,5 - 7 mM, s hodnotami specifické vodivosti
(κ) 7,4 – 100 mS.m-1. Při měření odezvy C4D na Δκ(KCl), byla Δκ(KCl) vyvolána zvýšením
teploty elektroforetické kazety z 25.0 ºC na 25.5 ºC 6; κ(KCl) závisí na teplotě (T) dle vztahu
κT+ΔT= κT.(1+β. ΔT) s hodnotou teplotního koeficientu β 0,024 K-1. Experimenty byly
prováděny při teplotě 25 ºC. Veškeré použité chemikálie dosahovaly analytického stupně
čistoty.
Výsledky a diskuse
Elektroforetické separace v multi-channel kapiláře s bezkontaktní vodivostní detekcí
Směs tří neurotransmiterů, dopamin, noradrenalin a adrenalin, v BGE o složení 100 mM
kyselina octová, pH 2,9, byla separována v testované multi-channel kapiláře a pro srovnání v
single-channel kapilárách o id 25 a 75 m. Použitý BGE je vhodný pro CE separace
aminokyselin a aminů v kombinaci s C4D 7;8. Pro zajištění stejné délky nadávkované zóny
144
analytu do všech testovaných kapilár bylo použito elektrokinetické dávkování, u kterého je
délka nadávkované zóny analytu nezávislá na id kapiláry. Získané elektroferogramy jsou
uvedeny na obr. 2 a vyhodnocené parametry separace jsou shrnuty do Tabulky I.
Výška píků v multi-channel kapiláře je prakticky stejná jako v 75µm kapiláře a oproti detekci
v 25 m kapiláře asi 11.8krát vyšší. Počet teoretických pater N je v multi-channel kapiláře o
38 % menší v porovnání se 75µm kapilárou. Nižší separační účinnost v multi-channel kapiláře
je zřejmě způsobena malými rozdíly v rychlosti pohybu analytů v jednotlivých kanálcích. To
se projeví větší šířkou píků (w1/2), které jsou v multi-channel kapiláře průměrně o 0,6 s širší
v porovnání s šířkou píků v 75 m kapiláře. Podíl tohoto rozdílu a migračního času udává
relativní rozdíl mezi rychlostmi pohybu analytů jednotlivými kanálky, který má průměrnou
hodnotu 0,4%. Tento poměrně malý rozdíl v rychlosti pohybu analytů jednotlivými kanálky
umožňuje požití multi-channel kapiláry pro CE separaci i směsí analytů s blízkými hodnotami
mobilit. Píky při separaci v multi-channel kapiláře mají Gaussovský tvar.
Obr. 2. CE/C4D separace modelové směsi dopaminu (1), noradrenalinu (2) a adrenalinu (3)
v multi-channel kapiláře (A) a single-channel kapilárách, id 25 µm (B) and 75 µm (C).
Experimentální podmínky: BGE, 100 mM kyselina octová; pokrytá kapilára; elektrokinetické
dávkování 1 kV po dobu 10 s; separační napětí +10 kV, proud, 8,2 µA (A), 7,9 µA (B),
1,0 µA (B); vzorek, 5 µM směs neurotransmiterů v BGE/acetonitril 1:1 v/v.
Tabulka I
Parametry separace neurotransmiterů ve spojení s C4D.
Multi-channel kapilára
75 μm id
25 μm id
Výška
N
Výška
N
Výška
N
píku (mV) (103 × m-1) píku (mV) (103 × m-1) píku (mV) (103 × m-1)
Dopamin
1,4 (0,1)
162 (9)
1.3 (0,0)
217 (3)
0,12 (0,00) 313 (16)
Noradrenalin
1,3 (0,1)
164 (11)
1,2 (0,0)
227 (8)
0,11 (0,00) 309 (4)
Adrenalin
1,4 (0,1)
156 (8)
1,3 (0,1)
223 (13)
0,12 (0,00) 290 (18)
N je udáno na jednotku efektivní délky kapiláry
145
Elektroforetické separace v multi-channel kapiláře s UV detekcí
Použitelnost UV detekce v multi-channel kapiláře byla testována na stejné směsi
neurotransmiterů jako při C4D. Separace byla provedena v BGE o složení 20 mM kyselina
citronová/NaOH, pH 3,2 s potlačeným elektroosmotickým tokem. BGE založený na kyselině
citronové je vhodnějším separačním médiem pro UV detekci než roztoky kyseliny octové,
protože neabsorbuje při 200 nm. Parametry separace v multi-channel kapiláře byly opět
srovnávány se single-channel kapilárou o id 25 m a kapilárou o stejném id, ale s optickou
drahou rozšířenou v místě detekce na 125 m. Získané elektroferogramy jsou na obr. 3 a
parametry separace v Tabulce II.
Obr. 3. CE/UV (200 nm) separace modelové směsi dopaminu (1), noradrenalinu (2) a
adrenalinu (3) v multi-channel kapiláře (A) a single-channel kapilárách, id 25 µm (B) a 25µm
kapilára s rozšířenou optickou dráhou (C). Experimentální podmínky: BGE, 20 mM kyselina
citronová/NaOH, pH 3,2; pokrytá kapilára; hydrodynamické dávkování 20 mbar po dobu
10 s; separační napětí +30 kV, proud, 37µA (A), 3,7µA(B), 3,7µA(C); vzorek, 100 µM směs
neurotransmiterů ve vodě.
V multi-channel kapiláře jsou výšky píků asi 4krát větší v porovnání s 25 m kapilárou.
Účinnost separace vyjádřená počtem teoretických pater je na úrovni cca 380000 až 560000 a
parametr rozlišení sousedních píků je 2,0 respektive 2,9, což jsou hodnoty plně srovnatelné
s hodnotami pro jednokanálovou kapiláru. Výhoda multi-channel kapiláry je zřejmá i při
srovnání s kapilárou s rozšířenou optickou drahou, která je běžně používána pro zvýšení
citlivosti UV detekce 1;9; i v tomto případě jsou výšky píků v multi-channel kapiláře 2krát
větší a hodnoty N dokonce více jak 10krát vyšší.
Tabulka II
Parametry separace neurotransmiterů ve spojení s UV při 200 nm.
Multi-channel kapilára
25 μm id
Dopamin
Noradrenalin
Adrenalin
Výška
píku (mV)
42,1 (1,0)
41,4 (0,9)
41,3 (1,0)
N
Výška
-1
(10 × m ) píku (mV)
558 (33)
10,0 (0,3)
483 (30)
10,3 (0,4)
381 (18)
10,4 (0,4)
3
146
25 μm id s optickou
dráhou 125 μm
N
Výška
N
3
-1
3
(10 × m ) píku (mV) (10 × m-1)
608 (38)
17,0 (0,2) 38,0 (0,3)
572 (47)
19,4 (0,2) 55,0 (1,0)
483 (38)
23,8 (0,3) 24,0 (1,0)
Sub-minutová elektroforetická separace neurotransmiterů v kapiláře o dvou různých id
Pro dosažení velmi vysoké intenzity separačního pole na komerčním přístroji CE byla použita
kapilára vyrobená spojením 15 cm kapiláry o id 25 μm a 17 cm kapiláry o id 100 μm. Na části
kapiláry s id 25 μm probíhá vlastní elektroforetická separace a druhá část kapiláry o id
100 μm uzavírá elektrický obvod. Tímto postupem se podařilo zvýšit E z 0,9 kV/cm při
použití kapiláry o jednotném id na 1,9 kV. Výsledkem je kompletní separace směsi dopaminu,
noradrenalinu a adrenalinu v BGE o složení 20 mM kyselina citronová/NaOH, pH 3,2 za
dobu kratší než 18 s.
Obr. 4. Separace modelové směsi neurotransmiterů (100 µM) v kapiláře vytvořené spojením
25 µm kapiláry (délka 15 cm) a 100 µm kapiláry (17 cm). BGE, 20 mM kyselina
citronová/NaOH, pH 3,2, +30 kV, délka k UV detektoru 8,3 cm.
Závěr
Tato studie jasně dokládá, že vysoko-účinnou elektroforetickou separaci je možné provádět
v několika paralelních kanálcích v rámci jedné separační kapiláry. Relativní rozdíly
v rychlostech pohybu analytu v jednotlivých kanálcích se pohybují na úrovni desetin %, což
umožňuje dosažení separační účinnosti několika set tisíc separačních pater na metr. Pro
detekci v multi-channel kapiláře lze jak použít C4D, který měří signál z celého průřezu
kapiláry, tak i standardní UV detektor. Dále se ukázalo, že pro dosažení sub-minutových
separací lze s výhodou použít spojení dvou kapilár o různém id.
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (projekty
P206/10/1231 a P206/11/0707) a UNCE 204015.
Literatura
1. Lauer H. H., Rozing, G. P.: High Performance capillary Electrophoresis, A Primer,
Agilent Technologies. Germany 2010.
2. Jorgenson J. W., Lukacs K. D.: Anal. Chem. 53, 1298 (1981).
3. Kuban P., Hauser P. C.: Electrophoresis 30, 176 (2009).
4. Geiser L., Rudaz S., Veuthey J. L.: Electrophoresis 26, 2293 (2005).
5. Gas B., Zuska J., Coufal P., van de Goor T.: Electrophoresis 23, 3520 (2002).
6. Tuma P., Samcova E., Stulik K.: Electroanalysis 23, 1870 (2011).
7. Tuma P., Malkova K., Samcova E., Stulik K.: J. Sep. Sci. 33, 2394 (2010).
8. Gong X. Y., Hauser P. C.: Electrophoresis 27, 4375 (2006).
9. Hempel G.: Electrophoresis 21, 691 (2000).
147
Voltammetric Analysis of Anthraquinone- and Nitrophenyl-Labeled Nucleotide
Triphosphates and Oligonucleotides
(Voltametrická analýza nukleosidtrifosfátů a oligonukleotidů značených antrochinonem
a nitrofenyl skupinou)
a
Pavlína Vidláková , Jana Balintová b, Radek Pohl b, Luděk Havran a, Michal Hocek b, and
Miroslav Fojta a
a
Institute of Biophysics of AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic,
E-mail: [email protected]
b
Institute of Organic Chemistry and Biochemistry v. v. i., Flemingovo nam. 2, 166 10
Prague 6, Czech Republic
Abstract
Anthraquinone and nitrophenyl group are electrochemical-active moieties that have been used
for DNA labeling. Both nitro group and antraquinone gave well developed characteristic
signals. We tested the possibility of simultaneous detection of DNAs modified with the two
types of electroactive tags. We show that using cyclic voltammetry (CV), differentiation
between the two labels, as well as between the labels and natural nucleobases, can be
improved through optimization of the CV parameters.
Key Words: Anthraquinone, Nitro group, Electrochemical analysis, DNA modification.
Úvod
Elektrochemická aktivita nukleových kyselin byla objevena v 50. letech 20. století a od té
doby je používána ke studiu struktury a interakcí přirozených i modifikovaných molekul
nukleových kyselin i syntetických oligonukleotidů. Nukleové kyseliny je možné oxidovat
nebo redukovat na různých typech elektrod 1. V posledních letech je věnována značná
pozornost značení nukleových kyselin elektroaktivními skupinami (například komplexy
přechodných kovů 2,3, amino- nebo nitroskupinami 4,5). Tyto látky podléhají redoxním
reakcím a dávají tak modifikované DNA nové elektrochemické vlastnosti. Takto značené
molekuly mohou být využity v biologických, medicínských i nanotechnologických aplikacích.
Experimentální část
Nukleosidtrifosfáty modifikované antrachinonem a nitrofenylskupinou byly připraveny
Sonogashira cross-coupling reakcí halogenovaných nukleosidtrifosfátů s N-(-2-propynyl)antrachinoncarboamidem nebo 3-nitrofenylboronovou kyselinou.
Inkorporace značených nukleosidtrifosfátů byla prováděna metodou prodlužování primeru
(PEX) 6.
Voltametrická měření byla prováděna na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The
Netherlands) spojeném s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém
zapojení (Ag/AgCl/3 M KCl jako referentní elektroda, platinový drátek jako pomocná
elektroda). Měření bylo prováděno v inertní atmosféře argonu. Jako pracovní elektroda byla
používána visící rtuťová kapková elektroda (HMDE). Doba akumulace byla 60 s. Cyklická
voltametrie (CV) na HMDE - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M
fosforečnan sodný, pH 6,9.
Výsledky a diskuse
Elektrochemické chování nukleosidtrifosfátů (obr. 1) a oligonukleotidů značených
antrachinonem a/nebo nitroskupinou bylo studováno pomocí CV na HMDE. Pro
elektrochemické chování antrachinonu je charakteristická dvouelektrodová redoxní
chinon/hydrochinon přeměna. V katodické větvi cyklického voltamogramu antrachinon
148
poskytuje pík AQred při potenciálu okolo -0,4 V, příslušející redukci antrachinonu na
antrahydrochinon. V anodické větvi cyklického voltamogramu je patrný pík AQH2ox
příslušející zpětné oxidaci antrahydrochinonu (obr. 2). Intenzita píku AQH2ox závisí na
potenciálu bodu obratu. Intenzita tohoto píku je největší při potenciálech bodu obratu -0,6 - 1,2 V, při potenciálech zápornějších než -1,4 V výška píku prudce klesá a při potenciálech
zápornějších než -1,6 V pík AQH2ox na voltamogramu nepozorujeme.
Obr. 1. Cytidintrifosfát značený nitrofenylovou skupinou dNCNO2TP (A) a cytidintrifosfát
značený propargylkarbamoylantrachinonem dCAQTP (B).
Obr. 2. CV dCAQTP na HMDE základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M
fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál 0,05 V, potenciál obratu -1,85 V (přerušovaná
čára), počáteční potenciál 0,05 V, potenciál bodu obratu -0,6 V (plná čára).
Nitroskupina během CV na HMDE poskytuje za daných podmínek při potenciálu okolo
-0,45 V katodický pík NO2red, příslušející čtyřelektronové redukci nitroskupiny na
hydroxylamin. Takto vzniklý hydroxylamin je při potenciálu kolem 0,0 V dvouelektronově
reverzibilně oxidován a poskytuje anodický pík NHOHox (obr. 3).
Zkoumali jsme možnost současného stanovení antrachinonu a nitroskupiny. Vzhledem
k blízkým hodnotám potenciálu redukce obou skupin jsou katodické píky antrachinonu a
nitroskupiny často velmi obtížně rozlišitelné. Protože je však redukce nitroskupiny
ireverzibilní a neposkytuje žádný oxidační signál v oblasti potenciálů, kde by interferoval
s oxidací antrahydrochinonu. Produkt ireverzibilní redukce nitroskupiny navíc poskytuje
oxidační signál NHOHox, jehož potenciál se od potenciálu píku AQH2ox liší o cca 400 mV a
tudíž se oba signály neovlivňují. Odlišení píku AQH2ox od anodického píku G, který poskytují
okolo -0.3 V guaninové zbytky obvykle přítomné ve značené DNA 1,6, lze dosáhnout ve dvou
149
následných potenciálových cyklech s různým negativním bodem obratu (>-1.4 pro změření
píku AQH2ox v prvním cyklu a -1.85 pro změření píku G v cyklu druhém 6).
Obr. 3. CV dNCNO2TP na HMDE základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M
fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál 0,05 V, potenciál obratu -1,85 V (přerušovaná
čára), počáteční potenciál 0,05 V, potenciál bodu obratu -1 V (plná čára).
Závěr
V této práci se zabýváme možností stanovení nukleosidtrifosfátů, oligonukleotidů a DNA
značených antrachinonem a/nebo nitroskupinou pomocí CV na HMDE. Obě značky je možné
velmi dobře elektroanalyticky detekovat jak samostatně, tak i vedle sebe. Antrachinon
poskytuje během CV dobře vyvinutý reverzibilní pík v oblasti kolem -0,4 V. Nitroskupina
poskytuje během CV ireverzibilní redukční pík v oblasti kolem -0,45 V a oxidační pík
hydroxylaminu v oblasti kolem 0,0 V. Naše výsledky ukazují, že tyto elektrochemické značky
je možné využít pro analýzu sekvence oligonukleotidů i DNA.
Poděkování
Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA ČR (P206/12/2378, P206/12/G151) a GA AV ČR
(IAA400040901).
Literatura
1. Palecek, E., Jelen, F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards
electrochemical sensors for genomics and proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang, J.,
ed.), pp 74-174, Elsevier, Amsterdam 2005.
2. Fojta, M., Havran, L., Kizek, R., Billova, S., Palecek, E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985
(2004).
3. Vrabel, M., Horakova, P., Pivonkova, H., Kalachova, L., Cernocka, H., Cahova, H., Pohl,
R., Sebest, P., Havran, L., Hocek, M., Fojta, M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009).
4. Cahova H., Havran L., Brazdilová P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.:
Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2059 (2008)
5. Horakova P., Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org.
Biomol. Chem. 9, 1366 (2011)
6. Balintova J.,Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: ChemEur. J. 17, 14063 (2011).
150
Rapid Determination of Saccharides in High Energy Drinks by Electrophoresis in a
Short Capillary
(Rychlé stanovení cukrů v energetických nápojích elektroforézou v krátké kapiláře)
Blanka Vochyánová a, František Opekar a, Petr Tůma b, and Karel Štulík a
a
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
Albertov 2030, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and
Molecular Biology, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic,
Abstract
A new laboratory system has been developed for rapid electrophoretic separations and
determinations of inorganic and organic ions. The instrument employs short quartz capillary
with a total length of 10 cm and effective lengths of 4 cm. It has been applied to separations
of neutral mono- and disaccharides, in combination with contactless conductivity detection.
The saccharides are separated in the anionic form, in solutions of alkali hydroxides, namely,
KOH, NaOH and LiOH. The separation of a model mixture of five saccharides (sucrose,
lactose, glucose, fructose and ribose) takes less than one minute, the detection limits equaling
15 and 35 mg L-1 for sucrose and lactose, respectively. The technique developed has been
used to determine sucrose, glucose and fructose in high-energy drinks.
Key Words: Capillary electrophoresis, Short capillary, Saccharides, Sucrose, Lactose,
Glucose, Fructose, Ribose, Energy drinks.
Úvod
Kvalitativní i kvantitativní zastoupení jednoduchých cukrů v nápojích a potravinách je
důležité pro kontrolu jejich energetické hodnoty, způsobu výroby, doby skladování a může
sloužit též k odhalení nezákonného falšování potravin 1. Z důvodu vysoké strukturní
podobnosti jednotlivých mono- a disacharidů je pro komplexní analýzu směsí sacharidů nutné
používat vysoko-účinnou separační techniku. Nejčastěji používaná je iontově výměnná
chromatografie s refraktometrickou nebo pulsní ampérometrickou detekcí 2,3. HPLC stanovení
je charakterizováno poměrně dlouhou dobou separace (doba separace nebývá kratší než 10
min.), náročnou úpravou vzorku a použití refraktometrické detekce vyžaduje dlouhý čas pro
ustálení základní linie 4.
Mnohem jednodušší řešení pro analýzu jednoduchých neutrálních cukrů nabízí metody
kapilární elektroforézy (CE) 5-8. Neutrální mono- a disacharidy je možno separovat v silně
alkalických separačních elektrolytech o pH větším než 12, v kterých dochází k disociaci
poloacetálové skupiny, takže cukry jsou separovány jako anionty. Mezi hlavní přednosti CE
analýzy patří snadná příprava vzorku, vysoká separační účinnost a krátká doba separace.
Dobu separace lze navíc výrazně zkrátit použitím krátké separační dráhy. Ze vztahu pro
migrační čas, tm:
L2
,
(u eff u eof ) U el
kde L je délka kapiláry, ueff efektivní elektroforetická mobilita analytu, ueof mobilita
elektroosmotického toku a Uel separační napětí, vyplývá, že zkrácením separační dráhy na
polovinu se při zachování konstantní hodnoty separačního napětí docílí čtyřnásobného
zkrácení migračního času. Navíc na krátké separační dráze je omezena nežádoucí interakce
analytu s vnitřní stěnou kapiláry, což se projeví vyšší separační účinností.
tm
151
U komerčních elektroforetických přístrojů není možno z konstrukčních důvodů používat
velmi krátké kapiláry; u často využívaných přístrojů firmy Agilent je minimální délka
kapiláry cca 30 cm 9. Pro urychlení separace lze v komerčních přístrojích dávkovat vzorek do
výstupního konce kapiláry, tzv. short end injection. Jinou možností, je využít speciálního
laboratorního zařízení vyvinutého přímo pro elektroforetické separace v krátkých
kapilárách 10. V předkládaném sdělení je jedno z takových zařízení popsáno a jeho přednosti
jsou demonstrovány na příkladu stanovení cukrů v běžně dostupných energetických nápojích.
Experimentální část
Principiálním experimentálním problémem při separacích v krátých kapilárách je jejich
omezená pohyblivost. S krátkou kapilárou nelze manipulovat stejně, jako s kapilárami
dlouhými několik desítek centimetrů, které jsou používány ve standardních elektroforetických
sestavách. Používaná elektroforetická aparatura proto byla navržena tak, aby všechny
potřebné experimentální kroky, především dávkování vzorku a promývání kapiláry, bylo
možno provést tak, aby s kapilárou nebylo nutno pohybovat.
Obr. 1. Principiální schema aparatury pro elektroforézu v krátké kapiláře. Popis viz text.
Principiální schema aparatury je na obr. 1, detaily lze nalézt v literatuře 11,12. Dávkovací konec
kapiláry (1) je v dávkovací nádobce (2) vložen do hloubky asi 1 mm do PTFE trubičky (3).
Vzorek je dávkován pomocí šesticestného dávkovacího ventilu opatřeného dávkovací
smyčkou; používána byla smyčka o objemu 15 L. Při dávkování je na definovanou dobu
aktivována piezoelektrická mikropumpa, která proudem separačního elektrolytu vypláchne
smyčku a nese vzorek kolem dávkovacího konce kapiláry; vzorek je tak dávkován po dobu,
kdy je zóna vzorku v kontaktu s dávkovacím koncem kapiláry. Tuto dobu lze řídit průtokovou
rychlostí separačního elektrolytu. Přebytek elektrolytu po dobu dávkování odtéká do odpadu.
Výstupní konec kapiláry je umístěn v koncové nádobce (4). Po ukončení separace je na
určitou dobu v nádobce vytvořen podtlak membránovou pumpou, který umožní propláchnutí
kapiláry. V dávkovací a koncové nádobce jsou umístěny elektroforetické elektrody (5). Ve
vhodné vzdálenosti od dávkovacího konce kapiláry je bezkontaktní vodivostní detektor, C4D (6).
Při všech měřeních byl používán separační elektrolyt 75 mM NaOH, křemenná kapilára o
vnitřním průměru 10 m, celkové délce 10 cm, efektivní délce 4 cm a separační napětí 5 kV.
Zásobní roztoky testovaných cukrů, sacharóza, D-laktóza, D-fruktóza, D-ribóza a D-glukóza
o koncentraci 1000 mg L-1 byly připravovány v deionizované vodě a uchovávány v chladničce.
Pro přípravy separačního elektrolytu byl používán hydroxid sodný. Reálnými vzorky byly
energetické nápoje běžně dostupné v obchodní síti (v závorce je producent nebo distributor a
údaj o celkovém obsahu cukru z etikety na obalu nápoje v g na 100 mL: Red Bull (Red Bull
GmbH, Austria, 11), KX Energy Stimulation Drink (Cott Beverages Ltd., UK, 11,1), Kamikaze
152
(Tecfood, ČR, 11,3) a Burn (Coca Cola, 13,3). Reálné vzorky byly sonikací po dobu 30 minut
zbavovány plynných složek. Pro analýzu byly ředěny deionizovanou vodou v poměru 1:50.
Stanovení bylo založeno na metodě standardního přídavku, aby byl vyloučen vliv matrice
vzorku na odezvu detektoru. Standardní přídavek byl při všech analýzách 1 g L-1.
Výsledky a diskuse
Elektroferogram modelové směsi běžných cukrů, obr. 2A, dokumentuje, že za používaných
experimentálních podmínek lze tyto cukry separovat s dobrým rozlišením za dobu kratší než
jedna minuta. Zjištěné hodnoty parametru rozlišení, R, byly: R(Lakt/Gluk) = 1,74,
R(Gluk/Frukt) = 1,1 a R(Frukt/Rib) = 1,53.
Ilustrační elektroferogramy separací cukrů v testovaných energetických nápojích s nejmenším
a největším obsahem fruktózy jsou na obr. 2B. Stanovené obsahy cukrů jsou uvedeny
v Tabulce I. Je vidět, že zjištěné hodnoty velice dobře souhlasí s hodnotami deklarovanými
výrobcem; ve většině případů je stanovená hodnota v mezích intervalu spolehlivosti rovna
hodnotě deklarované. Ve všech testovaných energetických nápojích byly nalezeny sacharóza,
glukóza i fruktóza, i když na etiketě s údaji o složení některých z nich nebyl některý
z uvedených cukrů jmenovitě uveden.
C4D odezva
C4D odezva
a
5
4
2
3
b
10 mV
4
3
5 mV
A
1
30
35
40
45
50
B
1
55
60
Čas, s
30
35
40
45
Čas, s
Obr. 2. Elektroforetická separace modelové směsi cukrů o stejné koncentraci 500 mg L-1 (A)
a elektroferogramy separace cukrů v energetických nápojích Red Bull (a) a Burn (b)
zředěných deionizovanou vodou 1:50 (B). Identifikace: 1 – sacharóza, 2 – laktóza, 3 –
glukóza, 4 – fruktóza, 5 – ribóza. Separační elektrolyt 75 mM NaOH, kapilára o vnitřním
průměru 10 m, celkové délce 10 cm a efektivní délce 4 cm, separační napětí 5 kV.
Závěr
Metodiku elektroforetického stanovení běžně se vyskytujících cukrů, viz např.7, lze
s úspěchem využít i při jejich elektroforetické separaci a stanovení v krátké kapiláře. Hlavní
předností této varianty je vysoká rychlost analýzy. Výhody elektroforézy v krátké kapiláře ve
srovnání s elektroforézou na čipu jsou zřejmé. Je využíváno běžně dostupné křemenné
kapiláry a nikoli speciálního separačního systému – čipu. Vlastnosti standardní křemenné
kapiláry jsou při elektroforetických stanoveních dobře známé a lze je podle potřeby vhodně
modifikovat. Délku i průměr separačního prostředí lze snadno volit změnou délky a vnitřního
153
průměru kapiláry, náhrada poškozené (ucpané) kapiláry je snadná. Využít lze i kapilár
z jiných materiálů, např. PEEK.
Tabulka I. Výsledky stanovení obsahu cukrů v energetických nápojích. Uvedeny jsou střední
hodnoty (mediány) obsahu jednotlivých cukrů a totální obsah cukru ze tří nezávislých
stanovení (v závorkách je RSD v %). Pro lepší názornost je přesnost stanovení totálního
obsahu cukru vyjádřena rovněž intervalem spolehlivosti počítaným pro hladinu významnosti
95 %.
Nápoj
Sacharóza Glukóza
Fruktóza
Celkový cukra
Deklarovaný cukr
-1
-1
-1
gL
gL
gL
g L-1
g L-1
KX
51,9 (10,7) 42,8 (5,6)
19,6 (7,2) 114,5 4,2 (1,7)
111
Burn
75,0 (2,8)
38,1 (5,7)
31,8 (7,4) 144,9 5,3 (1,7)
133
Red Bull
59,5 (3,1)
43,1 (8,4)
4,6 (7,7)
110
106,4 5,2 (2,2)
Kamikaze 56,8 (1,7)
51,0 (2,9)
8,9 (4,6)
113
116,1 3,1 (1,1)
a
) Celkový obsah cukru byl počítán z výsledků tří nezávislých stanovení obsahu jednotlivých
cukrů, nikoli ze středních hodnot uvedených v tabulce.
Poděkování
Práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a sportu České republiky,
projekt MSM 0021620857, a Grantové Agentury České republiky, grant č. P206/10/1231.
Literatura
1. Montero C.M., Dodero M.C.R., Sanchez D.A.G., Barroso C.G., Chromatographia 59, 15
(2004).
2. http://www.dionex.com/en-us/webdocs/61831Bro_Carbohydrates_Food_Beverage_29Aug2007_LPN1971.pdf (January 18, 2012).
3. El Rassi Z., Carbohydrate Analysis: High Performance Liquid Chromatography and
Capillary Electrophoresis, Elsevier Science, Amsterdam, 1994.
4. Soga T., Serwe M., Food Chem. 69, 339 (2000).
5. Honda S., J. Chromatogr. A 720, 337 (1996).
6. Žídková J., Chmelík J., Chem. Listy 94, 1093 (2000).
7. Tůma P., Málková K., Samcová E., Štulík K., Anal. Chim. Acta 698, 1 (2011).
8. Carvalho A.Z., da Silva J.A.F., do Lago C.L., Electrophoresis 24, 2138 (2003).
9. Lauer H.H., Rozing G.P., High Performance Capillary Electrophoresis, Agilent
Technologies, Germany, 2010.
10. Opekar F., Coufal P., Štulík K., Chem. Rev. 109, 4487 (2009).
11. Opekar F.: Chem. Listy, v tisku.
12. Vochyánová B., Opekar F., Tůma P., Štulík K.: Anal. Chim. Acta, odesláno.
154
(Strept)avidin–Biotin Interactions at Amalgam Electrodes Covered by Thiol Monolayer
(Interakce (strept)avidin–biotin na amalgamových elektrodách pokrytých
thiolovou monovrstvou)
Bogdan Yosypchuk a, Vladimír Mareček a, and Oksana Yosypchuk b
a
J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejskova 3,
182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected]
b
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2,
Czech Republic
Abstract
Carboxylic group of 11–mercaptoundecanoic acid (MUA) can be used to creat a peptide bond
with species containing amino group, e. g., peptides, and proteins. By the help of EDC–NHS
technology, streptavidin or avidin was covalently bonded with MUA–monolayer at a silver
solid amalgam electrode. Such prepared electrode was used for detecting biotin and
biotinylated albumin in the supporting electrolyte (0.15 M NaCl, 0.05 M TRIS, pH 7.0).
Electrochemical impedance spectroscopy was performed for the biosensor response
monitored by impedance spectroscopy. Binding of biotin or biotinylated albumin with
(strept)avidin entails a change in the resistance of the sensor in the concentration range of
0.5–20 µg mL–1. Electrochemical regeneration of the amalgam electrode permits simply to
renew its surface and to create the new biosensor.
Key Words: Voltammetry, Amalgam electrodes, Monolayer, Streptavidin, Avidin, Biotin.
Úvod
Avidin a streptavidin jsou dobře známé svou vysokou afinitou vůči biotinu (Kd 10–15 M) a
tato vazba patři k nejpevnějším nekovalentním vazbám. Biotin muže být snadno navázán na
různé látky (DNA 1, 2, proteiny 3, enzymy 4) bez ovlivnění jejích biologické aktivity.
Selektivní a pevná vazba (strept)avidin–biotin se široce používá v různých biosenzorech,
např., hybridizace DNA1, v diagnostických testech tělních tekutin a tkání 4. V
elektrochemických postupech se obvykle (strept)avidin naváže na pracovní elektrodu a
spojení s biotinem značenou látkou se detekuje pomoci voltametrie, amperometrie nebo
impedanční metody. Na materiálu pracovní elektrody často záleží, jakým typem vazby bude
(strept)avidin spojený s elektrodou. Na uhlíkových elektrodách se většinou používá adsorpce
(strept)avidinu přes určitou vysokomolekulární látku. U kovových elektrod se častěji aplikují
postupy s vytvořením pevných kovalentních vazeb. Amalgámové elektrody 5-8 se ukázaly být
vhodnou podložkou pro vytvoření thiolových monovrstev s vysokou povrchovou koncentrací
látky a s malým počtem defektů 9. Většina našich experimentů ze studia tiolových monovrstev
na amalgámových elektrodách byla provedena s kyselinou 11-mercaptoundekanovou (MUA).
Karboxylová skupina této látky se může použit pro vytvoření peptidové vazby s jinými
sloučeninami obsahujícími aminoskupinu, např. peptidy a proteiny. Cílem této práce bylo
kovalentně navázat streptavidin nebo avidin na monovrstvu MUA na stříbrné pevné
amalgámové elektrodě a vytvořit tak základ pro přípravu širokého spektra různých
biosenzorů.
Experimentální část
Potenciostat–galvanostat PGSTST302N s impedančním modulem FRA2 (ECO CHEMIE –
METROHM AUTOLAB, Nizozemsko) byl použit pro impedanční měření. Voltametrická
měření byla prováděna s využitím počítačového analyzátoru řízeného softwarem
MultiElchem v. 2.3 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.) a
elektrochemického stojánku (Polaro-Sensors, Praha). Pracovními elektrodami (WE) byly
155
vyleštěná stříbrná pevná amalgámová elektroda (p-AgSAE), elektroda pokrytá rtuťovým
filmem (MF-AgSAE) nebo rtuťovým meniskem (m-AgSAE) (A = 0,00358 cm2). Jako
referentní sloužila nasycená kalomelová elektroda připravená pomocí stříbrného pastového
amalgámu 6, 10 (její potenciál je stejný, jako u klasické kalomelové elektrody). Pomocnou
elektrodu tvořil Pt drátek o průměru 1,0 mm a délce 15 mm. Vzdušný kyslík byl z roztoků
odstraňován probubláváním dusíkem. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Pro
přípravu roztoků byla použita voda redestilovaná v křemenné aparatuře. Všechny použité
chemikálie byly čistoty p. a.
Výsledky a diskuse
Příprava biosenzoru na základě elektrody ze stříbrného pevného amalgámu využívajícího
interakci (strept)avidin–biotin se skládá z několika kroků. Nejdříve se na elektrodu
elektrochemicky naváže MUA, potom se pomoci EDC–NHS technologie aktivuje
karboxylová skupina deponované kyseliny 11-mercaptoundekanové a nakonec se takto
připravena elektroda inkubuje se (strept)avidinem pro vytvoření peptidové vazby. Popsána
struktura biosenzoru je založená na kovalentních vazbách a je dlouhodobě stabilní.
Elektrochemická depozice kyseliny 11–mercaptoundekanové na AgSAE
Vytvoření nebo obnovení monovrstvy MUA na různých amalgámových elektrodách je
detailně popsáno v práci9 a trvá 10 min. Nejdříve se povrch elektrody elektrochemicky
obnovuje (nebo se odstraňuje předchozí monovrstva) v roztoku [0,5 M NaOH; 50 % C2H5OH;
1 mM MUA] při potenciálu –2200 mV po dobu 180 s. Následně, při potenciálu –350 mV a po
dobu 300 s, se thiol kovalentně váže na povrch elektrody a vytváří monovrstvu. Nekovalentně
navázána MUA se odstraňuje důkladným promýváním elektrody v etanolu. Přesnost
opakovaného vytvoření monovrstvy thiolu se kontroluje podle plochy (náboje) katodického
desorpčního píku, jehož RSD byla v daném případě 1–2 %.
Aktivace karboxylové skupiny kyseliny 11–mercaptoundekanové
Pro vytvoření peptidové vazby mezi –COOH-skupinou MUA a –NH2-skupinou
(strept)avidinu se karboxylová skupina musí předem aktivovat. Tato aktivace se provádí
ponořením AgSAE+MUA do vodného roztoku [0,2 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′ethylcarbodiimid hydrochloridu (EDC); 0,05 M N-Hydroxysuccinimidu (NHS)] po dobu 15
min. Elektroda se opláchne vodou a hned se přenese do roztoku avidinu nebo streptavidinu.
Stabilita vytvořeného NHS-esteru záleží na kyselosti roztoku. Při pH 7 je poločas hydrolýzy
esteru 4–5 hod.
Navázání avidinu(streptavidinu) na AgSAE+MUA
Amino-skupiny (strept)avidinu reagují s molekulami semi-stabilního NHS-esteru s výsledným
vytvořením peptidových vazeb. AgSAE+MUA–NHS se ponoří do roztoku 1 mg mL–1 avidinu
(0,1 mg mL–1 streptavidinu) v 0,1 M fosfátovém pufru o pH 7,0 po dobu 30–60 min. Poté se
elektroda opláchne vodou a přenese se do pufru [0,15 M NaCl; 0,05 M TRIS; pH 7,0] pro
provedení EIS-měření.
(Strept)avidin–biotin interakce
Každá molekula avidinu (streptavidinu) má 4 vazebná místa pro biotin nebo biotinem značené
látky. V použitém biosenzoru je povrch elektrody účinně zablokován thiolovou monovrstvou
a proto není možné provádět voltametrická měření. Navázání biotinu na avidin mění tloušťku
a propustnost povrchové vrstvy biosenzoru, což vyvolá změnu kapacity a odporu celé
konstrukce na elektrodě. Tyto změny byly detekovány pomocí elektrochemické impedanční
spektroskopie (EIS). Po optimalizaci podmínek impedančních měření se detekce interakce
156
(strept)avidin–biotin prováděla ve frekvenčním rozsahu od 10000 do 0,1 Hz a amplitudě
0,01 V. Potenciál scanu se volil buď v rozsahu potenciálů, kde je thiolová monovrstva
stabilní, nebo tak, že se na začátku práce změřil potenciál biosenzoru v otevřeném obvodu
(Open Circuit Potential) a potom se zjištěná hodnota používala pro celou sérii měření. Odezva
připraveného biosenzoru s avidinem na přídavky biotinu je lineární v log stupnici rozsahu
0,5–5,0 µg mL–1 biotinu. Podobné výsledky byly získány i pro senzor se streptavidinem a
albuminem modifikovaným biotinem.
Obr. 1. EIS-odezva biosenzoru s avidinem na změnu koncentrace biotinu. Pracovní elektroda
MF-AgSAE (D = 0,0675 cm; A = 0,00358 cm2); základní elektrolyt (ZE): 0,15 M NaCl,
0,05 M TRIS, pH 7,0; koncentrace biotinu c = 0,58–4,03 µg mL–1; potenciál scanu
Escan = 350 mV; frekvenční rozsah a směr scanu od 10000 do 0,1 Hz; amplituda 10 mV. R –
odpor v náhradním obvodu Rs(RC) v roztocích s biotinem; R0 – stejný odpor v ZE.
Obr. 2. EIS-odezva biosenzoru se streptavidinem na změnu koncentrace biotinem
modifikovaného albuminu (BMA). Pracovní elektroda m-AgSAE (D = 0,0675 cm);
koncentrace BMA c = 1,96–20,0 µg mL–1; Escan = 62 mV (OCP); náhradní obvod
Rs(RC)(RC). Ostatní podmínky jsou stejné jako v popisu Obr. 1.
157
Závěr
Biosenzor založený na využití pevné a selektivní (strept)avidin–biotin interakce byl přípraven
poprvé na povrchu stříbrné amalgámové elektrody. Výhodou amalgámu je rychlé (3–5 min.)
vytvoření kovalentní vazby mezi kovem elektrody a atomem síry kyseliny 11–
mercaptoundekanové. (Strept)avidin se váže na monovrstvu zmíněné kyseliny peptidovou
vazbou a proto je takto připravený biosenzor velice stabilní. EIS-měřeními bylo prokázáno, že
zkoumaný biosenzor je citlivý na změnu koncentrace biotinu nebo biotinem modifikovaného
albuminu. Tato práce je začátkem výzkumu biosenzorů připravených na povrchu různých
amalgámů.
Poděkování
Tato práce vznikla s finanční podporou GA ČR (projekty čís. P206/11/1638 a P208/12/1645),
GA AV ČR (projekt čís. IAA 400400806), GA Univerzity Karlovy v Praze (projekt
282111/2001/B-Ch/PrF), Univerzity Karlovy v Praze (projekt SVV 2012-265201) a
Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy (projekt MSM 0021620857).
Literatura
1. Walter A., Wu J., Flechsig G.-U., Haake D. A., Wang J.: Anal. Chim. Acta 689 29
(2011).
2. Hong S.-R., Jeong H.-D., Hong S.: Talanta 82, 899 (2010).
3. Zhaoyin W., Lei L., Yuanyuan X., Lizhou S., Genxi L.: Biosensors and Bioelectronics
26, 4610 (2011).
4. Schetters H.: Biomolecular Engineering 16, 73 (1999).
5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009).
6. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008).
7. Yosypchuk B., Fojta M., Barek J.: Electroanalysis 22, 1967 (2010).
8. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003).
9. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011).
10. Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011).
158
Voltammetric Determination of Amino Derivatives of Naphthalene Using Boron-Doped
Diamond Film Electrode
(Voltametrické stanovení aminoderivátů naftalenu s využitím bórem dopované
diamantové filmové elektrody)
Jaroslava Zavázalová, Hana Dejmková, Jiří Barek, and Karolina Pecková
Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry,
UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43, Prague 2,
Czech Republic, E-mail: [email protected]
Abstract
Amino derivatives of naphthalene are suspected mutagens and/or carcinogens, thus they are
widely monitored in the environment as well as in biological liquids. Voltammetric behaviour
of 1-aminonaphthalene and 2-aminonaphthalene was investigated using differential pulse
voltammetry at boron-doped diamond film electrode. The passivation of the electrode surface
can be prevented by electrochemical activation at high anodic potential between individual
scans. Optimum conditions for the determinations of studied analytes were estimated based on
the influence of pH on the voltammograms in Britton-Robinson buffer.
Key Words: Boron-doped diamond film electrode, 1-aminonaphthalene, 2-aminonapthalene,
Differential pulse voltammetry.
Úvod
1-Aminonaftalen (1-AN) a 2-aminonaftalen (2-AN) patří mezi aminoderiváty polycyklických
aromatických uhlovodíků (APAH), významných polutantů životního a pracovního prostředí.
Polycyklickým aromatickým uhlovodíkům jsou přisuzovány karcinogenní, mutagenní a
teratogenní účinky. 2-AN je prokázaný karcinogen 1 a u 1-AN byly prokázány slabé
mutagenní účinky 2.
Vzhledem k tomu, že aminoskupina je elektrochemicky oxidovatelná, je možné ke stanovení
uvedených látek použít moderní voltametrické metody. Bórem dopovaný diamantový (BDD)
film je relativně nový, oblíbený elektrodový materiál, mezi jehož výhodné vlastnosti patří
široké potenciálové okno, mechanická i chemická stabilita, nízký zbytkový proud a
biokompatibilita 3, 4. Kvůli svým vhodným mechanickým a elektrochemickým vlastnostem se
používá i pro stanovení APAH 5 a nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků
(NPAH) 6. Elektrooxidace aromatických aminů na pevných elektrodách je často provázena
jejich pasivací. Proto byla provedena základní charakterizace elektrochemického chování
studovaných amino aromátů na BDD elektrodě metodou diferenční pulsní voltametrie.
Především byl sledován vliv pasivace elektrodového povrchu a vliv pH na signály analytů.
Experimentální část
Materiál
Zásobní roztoky 1-AN (98%, Aldrich) a 2-AN (95%, Sigma-Aldrich) o koncentraci
1·10–4 mol dm–3 byly připraveny rozpuštěním přesně naváženého množství dané látky
v 250 ml deionizované vody (Millipore Q-plus System, Millipore, USA) za pomoci
ultrazvuku. Brittonův-Robinsonův pufr (BR pufr) o příslušném pH byl připraven smísením
vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,2 mol dm–3 s roztokem obsahujícím
kyselinu boritou, fosforečnou a octovou (vše p.a., Lach-Ner, Neratovice, ČR), každou
o koncentraci 0,04 mol dm–3. Přesná hodnota pH byla měřena pH metrem 3510 (Jenway, UK)
s kombinovanou skleněnou elektrodou.
159
Aparatura
Voltametrická měření byla prováděna pomocí Eco-Tribo polarografu (Polaro-Sensors, Praha,
ČR) se software PolarPro (verze 5.1). Jednotlivá měření byla prováděna v tříelektrodovém
zapojení s BDD pracovní elektrodou, zkonstruovanou v naší laboratoři, s aktivní plochou
12,6 mm2 v diskovém uspořádání 6. Pracovní elektroda byla ponořena v polarografické
nádobce společně s Ag/AgCl (3 mol l–1 KCl) referentní elektrodou (ETP CZ-R00408), a
platinovou drátkovou pomocnou elektrodou (obě Elektrochemické detektory, Turnov, ČR).
Pracovní postupy
Diferenční pulsní voltametrie (DPV) byla použita s následujícími parametry: polarizační
rychlost 20 mV s–1, pulsy o šířce 100 ms a výšce +50 mV. Před prvním měřením a mezi
měřením odlišných vzorků byla elektroda opláchnuta deionizovanou vodou, ponořena do
acetonitrilu, který byl 3 min probubláván dusíkem, a znovu opláchnuta deionizovanou vodou.
Následovala elektrochemická aktivace v 1M vodném roztoku kyseliny dusičné při vloženém
potenciálu +2,4 V po dobu 1 min. Objem měřeného vzorku byl vždy 10 ml: Do 10ml odměrné
baňky byl odpipetován 1 ml zásobního roztoku studované látky a poté doplněn BR pufrem
o příslušném pH po značku. Všechny křivky byly měřeny nejméně třikrát a poté statisticky
vyhodnoceny. Veškerá měření byla prováděna za laboratorní teploty. Výška píků sledovaných
látek byla vyhodnocována od spojnice minim před a za píkem.
Výsledky a diskuse
Pasivace elektrodového povrchu BDD elektrody byla sledována v prostředí BR pufru
o pH 5,0 metodou DPV. Z měření deseti následných skenů bez jakékoliv úpravy
elektrodového povrchu mezi skeny (Obr. 1) lze usuzovat na základě poklesu výšky píku
1-AN, že dochází k pasivaci elektrodového povrchu. V předchozí práci 5 věnované
optimalizaci DPV stanovení aminobifenylů byly reprodukovatelné výšky píků získány při 15s
míchání měřeného roztoku mezi jednotlivými skeny. Tento postup však v případě 1-AN a
2-AN nevede k odstranění pasivačních produktů. Proto byl navržen program, který využívá
kombinaci míchání roztokem a vložení aktivačního potenciálu +2,4 V po dobu 15 s. Při
měření deseti opakovaných skenů je touto úpravou mezi jednotlivými skeny dosaženo
reprodukovatelných výsledků s relativní směrodatnou odchylkou 2,0 %.
350
300
I [nA]
250
200
150
100
50
200
300
400
500
600
700
800
900
E [mV]
Obr. 1. Pokles výšky píku 1-AN (c = 1·10–5 mol dm–3) při měření deseti opakovaných skenů
v prostředí BR pufru o pH 5,0. Měřeno metodou DPV na BDD elektrodě.
160
Pasivace elektrodového povrchu je při elektrochemickém stanovení organických látek na
pevných elektrodách běžným jevem, jelikož dochází velmi často k ireverzibilní adsorpci
reakčních produktů či interferentů na povrchu elektrody. Primární aromatické aminy jsou
látky elektrochemicky snadno oxidovatelné; mechanismus je založen na oxidaci aminové
skupiny navázané na aromatickém uhlovodíku, kdy prvním krokem je jednoelektronová
oxidace za tvorby kation radikálu. U studovaných aminoaromátů lze předpokládat vysoký
počet reakčních produktů a meziproduktů a složitou strukturu vznikajících polymerních filmů
vzhledem k vysokému počtu mesomerních forem radikál kationtu vzniklého prvotní
jednoelektronovou oxidací. Např. pro 4-aminobifenyl byl na platinových elektrodách popsán
vznik lineárního polymeru tvořeného bifenylovými skelety vzniklého coupling reakcí C-N
konci 4-aminobifenylu 7.
Dále byl studován vliv pH na DP voltamogramy 1-AN a 2-AN v prostředí BR pufru v rozsahu
pH 2,0 – 12,0. Vybrané voltametrické křivky pro 1-AN znázorňuje Obr. 2. 1-AN poskytuje
v oblastech pH 2,0 – 6,0 celkem čtyři píky, při pH 7,0 – 12,0 pouze jeden pík. Tuto skutečnost
zobrazuje Obr. 3, ze kterého je rovněž patrná závislost Ep na pH roztoku. 2-AN poskytuje
v oblastech pH 2,0 a 3,0 celkem čtyři píky, při pH 4,0 tři píky a při pH 5,0 – 12,0 pouze jeden
pík. Jako optimální pH pro stanovení studovaných látek bylo vybráno pH 7,0 shodně pro obě
látky vzhledem k přítomnosti jednoho symetrického píku. Tyto látky však vzhledem
k blízkým potenciálům nelze stanovit pomocí DPV ve směsi vedle sebe: V prostředí BR pufru
o pH 7 je Ep(1-AN) = 502 mV a Ep(2-AN) = 570 mV.
Potenciál signálů 1-AN a 2-AN se s rostoucí hodnotou pH měřeného prostředí zpravidla
posouvá k negativnějším potenciálům. Tento trend je obecně platný pro oxidaci
aminoskupiny, jelikož vlivem její protonizace v kyselejších prostředí klesá elektronová
hustota a je potřeba vynaložit vyšší energie (čili kladnějšího potenciálu) pro odebrání
elektronu. V několika případech byla na BDD elektrodách pozorována lepší
reprodukovatelnost signálu analytu pro zásaditá prostředí, což bylo vysvětleno vyšší
rozpustností a tím pádem snadnějším odstraněním vzniklých polymerních filmů 5, 8.
350
350
A
300
I [nA]
I [nA]
1
250
250
3
200
1
2
2
B
300
1
200
2
1
2
150
150
3
3
100
100
3
50
0
200
400
600
800
1000
1200
50
0
200
400
600
800
1000
1200
E [mV]
E [mV]
Obr. 2. DP voltamogramy 1-AN (c = 1·10–5 mol dm–3) na BDD elektrodě v prostředí BR
pufru: A – pH 2,0 (1); 4,0 (2) a 6,0 (3); B – pH 8,0 (1); 10,0 (2) a 12,0 (3).
161
E [mV]
1400
pík 4
1200
1000
800
600
pík 3
400
pík 2
200
pík 1
0
2
4
6
8
10
12
pH
Obr. 3. Závislost potenciálu píku Ep 1-AN (c = 1·10–5 mol dm–3) na pH roztoku. Měřeno
metodou DPV na BDD elektrodě v prostředí BR pufru.
Závěr
Na základě provedeného průzkumu elektrochemického chování 1-AN a 2-AN v prostředí BR
pufru na BDD elektrodě metodou DPV bylo zjištěno, že dochází k pasivaci elektrodového
povrchu a pro dosažení reprodukovatelných výsledků je nutné mezi jednotlivými skeny vložit
na pracovní elektrodu potenciál +2,4 V po dobu 15 s. Optimálním prostředím pro DPV
stanovení 1-AN a 2-AN je BR pufr o pH 7,0. Látky však nelze stanovit ve směsi vedle sebe
vzhledem k blízkým oxidačním potenciálům.
Poděkování
Tato práce byla finančně podporována MŠMT ČR (projekt MSM 0021620857), Univerzitou
Karlovou v Praze (projekt SVV 2012-265201) a GA ČR (projekt P206/12/G151). JZ děkuje
Univerzitě Karlově, Přírodovědecké fakultě (projekt STARS) za finanční podporu.
Literatura
1. http://www.iarc.fr/en/publications/list/monographs/, downloaded March 5th 2012.
2. Cheung Y., Lewis D. F. V., Ridd T. I., Gray T. J. B., Ioannides C.: Toxicology 118, 115
(1997).
3. Fujishima A., Einaga Y., Rao T. N., Tryk D. A.: Diamond Electrochemistry. Elsevier,
Amsterdam 2005.
4. Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009).
5. Barek J., Jandova K., Peckova K., Zima J.: Talanta 74, 421 (2007).
6. Cizek K., Barek J., Fischer J., Peckova K., Zima J.: Electroanalysis 19, 1295 (2007).
7. Guay J., Dao L. H.: J. Electroanal. Chem. 274, 135 (1989).
8. Mitadera M., Spataru N., Fujishima A.: J. Appl. Electrochem. 34, 249 (2004).
162
E-mail: [email protected]
tel.: 266 053 877
fax: 286 890 502
DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK
AS-DETECTOIL
Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod.
na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika,
čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. – jako
kontrolní a bezpečnostní systém.
POPIS ZAŘÍZENÍ
Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o
rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V – akumulátor, trafo) a z výstupu pro
instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a
jiného systému.
Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím
výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí.
TECHNICKÉ ÚDAJE
připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 mA; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg
163
E-mail: [email protected]
tel.: 266 053 877
tel./fax: 286 890 502
Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol
moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj
PC ECO - TRIBO voltametrický/POLAROGRAFický analyzátor
● vysoká citlivost ● snadná automatizace ● ideální pro speciaci
● stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook)
● verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP
Metody
DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie,
DP a Tast polarografie
Chronopotenciometrie s konstantním proudem
Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele
Elektrody
Miniaturní tužková rtuťová
Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná
Pevné amalgamové: stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová)
Použití
Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii)
ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v
běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace 10 -10 až 10-11
mol/l
stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp.
většiny prvků Mendělejevovy tabulky
stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl-, CN-, Br-, J-, SO42-, PO43-, S2-)
sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů,
pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů
atd.).
Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv
v běžných podmínkách, bez demontáže
Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe
vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie,
geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd.
Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven,
průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu;
zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi
80 % atd.
Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme
komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj
analytických metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu,
vhodný pro výukové účely.
164
165
166
Název:
Vydal:
Uspořádali:
Počet stran:
Náklad:
Vydání
Formát:
ISBN:
XXXII. Moderní Elektrochemické Metody
Srsenová Lenka - BEST servis Ústí nad Labem
Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav
167
65
1.
A5
978-80-905221-0-7 (Brož.)
167
168
169
© BEST servis Ústí nad Labem
170
Download

Sborník přednášek