Sbohem, paní Bradfordová …
… aneb IČ spektroskopie ve službách
kvantifikace proteinů
Mgr. Stanislav Kukla
Merck spol. s r. o.
Agenda
1
2
2
Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů
•
Bradfordové metoda
•
BCA metoda
•
UV 280
•
AAA
IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů
•
Výhody IČ spektroskopie – 5 vysoce reálných scénářů
•
Představení systému DirectDetect™
Presentation title in footer | 00 Month 0000
Současný stav kvantifikace proteinů
Bradfordové metoda
•
Založena na použití Coomassie Brilliant Blue G250
•
Barvička se váže především na bazické aminokyseliny (arginin)
•
Posun absorpčního maxima z 465 nm na 595 nm
•
Měřeno v kyvetách nebo mikrotitračních destičkách (na jedno použití)
•
Nutnost standardní série pro každé stanovení
•
BSA není vhodným standardem pro každé stanovení
•
Známou interferencí jsou detergenty
3
Presentation title in footer | 00 Month 0000
Současný stav kvantifikace proteinů
BCA metoda
•
Dvoustupňová reakce (biuret + chelatace CuI činidlem BCA)
•
Vzniklá komplexní sloučenina má absorpční maximum 562 nm
•
Redukce CuII → CuI ovlivněna sekvencí (cystein, tyrosin, tryptofan)
•
Opět se měří v kyvetách/mikrotitr. destičkách, nutnost standardní série
•
Známé interference:
Redukční činidla (DTT)
Chelatační činidla (EDTA)
Fosfolipidy, adrenalin, dopamin, chlorpromazin, penicillin a jiné
4
Presentation title in footer | 00 Month 0000
Současný stav kvantifikace proteinů
UV – 280 nm absorbance
•
Spoléhá na absorpci záření aromatických
aminokyselin v primární struktuře
•
Metoda je závislá na znalosti ε280
•
Rychlá metoda bez nutnosti kalibrace
•
Interference – látky, které absorbují v UV
(nukleové kyseliny a jiné)
•
Nelineární pro vyšší koncentrace
5
Presentation title in footer | 00 Month 0000
Současný stav kvantifikace proteinů
Analýza aminokyselin
•
Obecně uznávaná jako „zlatý standard“ v kvantifikaci proteinů
•
Vzorek je rozložen na jednotlivé AK (6M HCl,0.1% fenol;110 ºC;24hod)
•
Následuje separace (iontoměnič), derivatizace (ninhydrin) a detekce
•
Nejde o rutinní, operativní metodu (core facility)
•
Finančně a časově náročná
6
Presentation title in footer | 00 Month 0000
Současný stav kvantifikace proteinů
Historické intermezzo
7
Presentation title in footer | 00 Month 0000
NOVINKA 2012: DirectDetect™
8
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
IČ spektroskopie & kvantifikace proteinů
Přístroj měří FT-IR spektrum vzorku naneseného na měřící kartu
9
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Proč právě IČ?
• Kvantifikace proteinů je založena na analýze vibračních pásů amidových
vazeb – vlastní všem peptidům, proteinům
• Měření není závislé na primární struktuře proteinu
• Kvantifikace začíná na tripeptidech
• Lze použít BSA jako univerzální standard
10
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™ – scénář č. 1
Srovnání IČ vs. UV
11
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™ – scénář č. 2
SDS ve vzorku
12
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™ – scénář č. 3
Tween® 20 ve vzorku
13
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™ – scénář č. 4
Redukční činidla ve vzorku
14
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™ – scénář č. 5
Proteiny v buněčných lyzátech
15
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Srovnání IČ a AAA
AAA
DirectDetect
16
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Software
Součástí přístroje je notebook se SW pro analýzu a uchovávání dat
17
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Software
SW umožňuje:
• Analýzu a uchovávání dat z měření
• Vytváření vlastních kalibračních křivek
• Uživatelská prostředí (operátor vs. administrátor)
• Práci se spektry
• Export dat
18
Presentation title in footer | 00 Month 0000
2
2
3
3
DirectDetect™
Spotřební materiál – „karta“
Vzorek dávkován na membránu z hydrofilního
PTFE, ve které je kroužek z hydrofóbního
PTFE – umožňuje co nejpřesnější fokusaci
paprsku spektrofotometru na vzorek
• Dynamický rozsah měření: 0,2 – 5 mg/ml
• Objem vzorku: pouze 2 µl
48
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Kvantifikace peptidů
Weighted material
4,5
Direct Detect
water
4,0
50%MeOH
1%AcOH
Concentration [mg/mL]
3,5
3,0
35%AcCN
0.5%TFA
2,5
50%DMSO
2,0
1,5
1,0
50%DMSO
DMSO
0,5
0,0
P1
P2
P3
P4
Peptide
49
Presentation title in footer | 00 Month 0000
P5
P6
DirectDetect™
Karta
Tento typ kvantifikace proteinů umožňuje i měření dat zpětně
• DirectDetect (po 60 hod)
• Coomassie (po 30 min)
• BCA (po 30 min)
50
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Výhody systému
• Špičková FT-IR technologie
• Neruší detergenty a redukční činidla
• Není potřeba znát extinkční koeficient proteinu
• Vzorky je možné uchovat pro další reanalýzu
• Potřebuje minimum vzorku k měření
• Jde o platformu – kvantifikace dalších
biomakromolekul (lipipy, NK, cukry)
• Kompaktní přístroj (30 x 22 cm)
51
Presentation title in footer | 00 Month 0000
DirectDetect™
Nabídka
Systém zahrnuje:
-
DirectDetect spektrofotometr
-
Dell Latitude 2120 notebook
-
DirectDetect Software
-
Stojan na notebook
-
Stojánek na karty
-
50 ks karet
52
Presentation title in footer | 00 Month 0000
Děkuji za pozornost.
Mgr. Stanislav Kukla
Merck spol. s r. o.
[email protected]
+420 737 273 961
53 Presentation title in footer | 00 Month 0000
Download

Sbohem, paní Bradfordová …