Hafta VIII
Genombilimde Mikrodizin Uygulamaları ve Biyoinformatik
Analiz
MĐKRODĐZĐN
DENEYLERĐNĐN TASARIMI:
Dikkat Edilmesi Gereken
Noktalar
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
Niçin Mikrodizin Deneyi?
Deneyi?
• Genomik ölçekte bakış
– Gen ifade profilinin saptanması
– Gen ifade seviyesinin zaman, uygulama ve
örnek tipi seviyelerinde karşılaştırılması
– Fenotip-Gen ilişkisinin kurulması
– Delete veya duplike olmuş gen bölgelerinin
tespiti
– Başka genleri etkileyen genlerin tanımlanması
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
•
•
•
•
•
Hangi mikrodizin platformu kullanılmalı?
Deneyin nihai hedefi nedir?
Yapılacak en uygun kıyaslar nelerdir?
Deneyin kontrol aşamaları nelerdir?
Veri analizinde hangi istatistik yöntem
kullanılacaktır?
• Mikrodizindan alınacak sonuçlar hangi yöntemlerle
doğrulanacaktır?
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
• Hangi mikrodizin platformu kullanılmalı?
cDNA, oligo, Agilent, Affymetrix, Illumina….
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
• Deneyin nihai hedefi nedir?
– Yeni grup, sınıf tanımlamak amacı ile moleküler imza
belirlenmesi
– Bir etken maddenin etki mekanizmasının ortaya konması
– Bir süreçte etkin olan yeni genlerin tespiti
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
• Yapılacak en uygun kıyaslar nelerdir?
– Uygun kontrol grubu belirlendi mi?
– Uygulama yapılan-yapılmayan
– Tümör-Normal (Alınan tümörün aynı bireyden alınan aynı
dokunun normal hücreleri)
– Kompleks hastalıklarda grupların mümkün olduğunca
homojen tutulması
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
• Deneyin kontrol aşamaları nelerdir?
–
–
–
–
Örnek sağlam mı?
cRNA hazırlayan kit sağlam mı?
Hibridizasyon reaktif ve koşulları sağlam mı?
Deneyler teknik olarak doğru yapılıyor mu?
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
• Veri analizinde hangi istatistik yöntem
kullanılacaktır?
– Soru belirlendi mi?
– Bir istatistik uzmanına danışıldı mı?
– Veriyi analiz edebilecek bilgisayar gücü mevcut mu?
Deneysel Tasarımda Dikkate
Alınması Gerekenler
• Mikrodizindan alınacak sonuçlar hangi yöntemlerle
doğrulanacaktır?
–
–
–
–
–
–
QRT-RT PCR
Western Blot
IP
ChIP
siRNA
……
SORULAR
• Deneyi kaç mikrodizinle yapmak gerekir?
• Örnekleri biraraya getirebilir miyim,
getirmeli miyim?
• Hangi mikrodizini kullanmalıyım?
Kaç tekrar yapılmalı?
• Mümkün olduğunca çok…
Đstatistiki olarak ne kadar çok örnek
varsa
testler
o
kadar
doğru
konuşacaktır.
Kaç tekrar?
n=
4(z1−α/ 2 + z1− β )2
2
(δδ/σ
α “significance” seviyesi (Yanlış pozitifleri saptama
olasılığı)
1-β
1-β farklılıkları tespit etme gücü (Gerçek pozitifleri
saptama olasılığı)
σ log oranlarının standart sapması
δ sınıf ortalama log oranları arasındaki saptanabilir fark
z standart normal dağılım “percentile”i
n gereken tekrar sayısı
Kaç tekrar?
• En az üç tekrar gereklidir.
Biri kendinizi,
Biri patronunuzu ikna etmek için
Biri de her ihtimale karşı…☺
Tekrar sayısını belirlerken
Örneğin kalitesi
Beklenen sonuç
Deneysel tasarım
Analiz yaklaşımı hesaba katılmalıdır.
Bir örneğin kalitesi
• Örnek ne kadar küçükse gürültüye o
kadar açıktır.
• Hücre kültürü örnekleri hastadan alınan
örneklere göre daha az gürültü içerir.
• Örnekleri biraraya getirip karıştırmak
bireysel farklılıklar sorgulanmıyor ise
gürültüyü
azaltacağı
için
tercih
edilebilir.
Yanlış tekrarlar?
• Teknik tekrar (Aynı örneği tekrar
hibridize etmek)
• Karıştırılan örneklerin tekrar tekrar
hibridize edilmesi.
• Aynı örnek preparatının iki ayrı seferde
işaretlenerek hibridize edilmesi.
Örnekler karışım haline
getirilmeli mi?
• Birçok örnek zaten karıştırılmış kabul edilmeli
zira RNA birçok farklı hücreden izole
edilmiştir.
• mRNA miktarını arttırmak üzere örnekler
yalnızca gerektiği miktarda karıştırılmalıdır.
• Birbirinden bağımsız karışımlar hazırlanarak
varyasyon dikkate alınmalıdır.
• Örnekleri karışım haline getirme belli
sapmalara (bias), kontaminasyona, “outlier”
problemine neden olabilir.
Download

Hafta X - Ozdag Lab