Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ
STANDARTLARI (UMS)
Giemsa Boyama
(Klinik Örneklerin Mikroskobik Ġncelemesi)
Hazırlayan Birim
Klinik Parazitoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Parazitoloji
Bölüm
Test prosedürleri
Standart No
P-TP-06
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Giemsa boyama
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3
TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 4
1
2
3
4
Test için asgari laboratuvar koĢulları ................................ 4
Giemsa boyamanın yapılması ......................................... 7
Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması ................... 8
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 9
EKLER........................................................................... 10
Ek-1 Giemsa boyasının hazırlanması4................................ 10
Ek-2 pH düzeltme solüsyonları (%2‟lik)4............................ 11
ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ .......................................... 12
KAYNAKLAR ................................................................... 12
Sayfa 2 / 12
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Giemsa boyama
Kapsam ve Amaç
Giemsa boyama öncelikle bir eukaryot hücre boyasıdır ve klinik mikrobiyolojide
özellikle kanda bulunan enfeksiyöz ajanların ya da dokulara invazyon gösteren
enfeksiyonların incelenmesinde kullanılır. Bu UMS‟nin amacı Giemsa boyasının
özelliklerini özetlemek ve en sık kullanıldığı durumları (Plasmodium spp ve diğer
protozoon parazitler için kan yaymaları ve klamidyal inklüzyon cisimcikleri için
sürüntü preparatları) esas alan bir prosedür vermektir.
Preparatların yapılması ve sabitlenmesi amaca göre çeĢitlenebildiği için, ilgili
detaylara bu UMS‟de yer verilmemiĢtir. Bu detaylar için etken tanısı veya örnek
yönetimi grubundaki ye ilgili UMS‟ye baĢvurulması önerilir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
EDTA
Etilen diamin tetra asetik asit
Ökaryot Bir hücre çekirdeği (nükleus) ve organelleri olan hücrelerin genel adı.
Memeli hücreleri ve parazit hücreleri „ökaryot‟tur.
Genel Bilgi
Kan ve kemik iliği yaymalarının klasik boyası olan Giemsa, alkol-bazlı bir
Romanowsky boyasıdır. Vücut sıvılarından ya da dokulardan hazırlanan
yaymalarda en baĢarılı boyalardan biridir. Özellikle lökositlerin, eritrositlerin,
trombosit ve parazitlerin nükleus ve sitoplazma morfolojilerini ayırt etmek için
kullanılır. Ana kullanım alanlarından biri sıtma Ģüphesinde Plasmodium spp
aranması amacıyla kan yaymalarının boyanmasıdır. Ayrıca, yine parazitolojide
diğer kan protozoonlarının (özellikle hemoflajellatların), mikroflaryaların
tanısında, Chlamydia spp Ģüpheli örneklerde inklüzyon cisimciklerinin
aranmasında da yararlanılır. Diğer bazı bakteriyel, viral, fungal ajanların doku
invazyonlarında geliĢen patolojilerin incelenmesi dahil klinik mikrobiyolojide pek
çok durumda Giemsa boyası önemli bir tanı aracıdır (1,2).
Bir eosin ve metilen mavisi karıĢımı olan azure B içeriyor olması nedeniyle
Giemsa, özellikle kan parazitleri için en güvenilir boyadır. Eosin parazit
kromatinini kırmızı; metilen mavisi ise parazit sitoplazmasını maviye boyar.
Beyaz kan hücreleri de genel olarak sitoplazmaları mavi ve nükleusları eflatundan
siyaha değiĢen koyu renklerde ayırt edilirler. Eritrositler ise soluk kırmızı-gri
görünürler. Dolayısı ile -canlı pembe-kırmızı boyanmıĢ parazit kromatinleri
özellikle eritrositlerde küçük noktalanmalar Ģeklinde (Schüffner granülleri)
kolayca ayırt edilebildiklerinden- Plasmodium spp enfeksiyonlarında Giemsa boya
ile tanı duyarlılığı en yüksek sonuçlar elde edilir (1,3).
Hematolojide kullanılan bir boya olan Wright boyası (Wright-Giemsa) kan
parazitleri için yeterince uygun değildir. Wright rutin laboratuvarlarda yaygın,
görece kolay hazırlanabilen bir boyadır ve eğer hızlı sonuç elde etmek isteniyorsa
kullanılabilir; ancak -Schüffner granülleri bu boya ile gösterilemeyeceğinden
dolayı- daha sonra mümkün olduğunda Giemsa boyama ile doğrulama
yapılmalıdır (4).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 12
Giemsa boyama
Suyun oksijeni boyama reaksiyonunu baĢlatıcı iĢlev görmektedir. Bu nedenle
stabilitesini sağlamak için stok boya nemden tam anlamıyla korunmalıdır. Giemsa
stok solüsyonu ideal saklama koĢullarında (nemden, sudan korunarak) yıllarca
dayanır. Yine aynı nedenle boyama yapılırken stok Giemsa‟dan fosfat tamponlu
suda taze hazırlanmıĢ Giemsa boyasının kullanılması kuraldır; üzerinden bir saat
geçmiĢ ise ya da gün içinde takip eden boyamalar yapılacaksa yeni boya
hazırlanması önerilir (1,3,4).
Bir zorunluluk değilse de, tamponlu suya Triton X-100 de katılabilir. Triton X-100
bir iyonik olmayan yüzey-aktif ajandır ve Giemsa boyanma özelliklerini arttırdığı,
parazitlerin bir lamdan diğerine taĢınma olasılığını da ortadan kaldırdığı kabul
edilmektedir (5).
Ġyi bir boyama reaksiyonu belli bir pH‟da gerçekleĢir; kan yaymalarının
incelenmesinde pH 7.2 olmalıdır (özellikle Schüffner yapılarının gözlenmesini
sağlayacak kalitede bir boyama için) (3). Chlamydia spp incelemesi için Giemsa
boyamada ise nötral pH (7.0) önerilmektedir (6). Genel olarak Giemsa boyamada
pH hafif asit – hafif alkali (6.8-7.2 aralığında) olsa da ideali laboratuvarın, kendi
uygulamasında, yapacağı incelemeye göre en iyi sonucu alacak Ģekilde tamponlu
su pH‟ını test ederek bulmasıdır (1,2).
Ġyi bir boyama ve doğru bir tanımlama için preparatların hazırlanması da çok
önemlidir. Genel bir kural olarak yaymalar örnek alındıktan sonraki en kısa
sürede boyanmalıdır; çünkü gecikmiĢ boyamalarda hatalı sonuçlar alınabilir.
Gerek kan yaymalarının, gerekse diğer vücut sıvılarından veya dokulardan
preparatların tecrübeli personel tarafından hazırlanması sonuçların güvenilirliğini
yakından etkileyen bir faktördür. BaĢarılı sonuç için ayrıca yaymaların tam
kurumuĢ olması gereklidir.
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koĢulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili iĢlemler asgari BGD2 laboratuvar
Ģartlarında gerçekleĢtirilmelidir. Bütün örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. En ciddi risk kan alma iĢlemi esnasında personele kan-kaynaklı
patojenlerin (HIV, hepatit) bulaĢma riskidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
Bu prosedür uygulanırken daima eldiven giyilmelidir.
BoyanmıĢ olsun, olmasın bütün lamlar kesici-delici atık kabul edilir ve kesinlikle
kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu torbalara
atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi infeksiyöz risk oluĢtururlar.
Güvenlik uyarısı! Metanol yüksek düzeyde toksik ve parlayıcıdır. Eğer yutulacak
olursa (herhangi bir miktarı) körlüğe ve hatta ölüme neden olabilir. Kullanım
harici zamanlarda metanol ĢiĢesi kilitli bir dolapta tutulmalıdır!
Sayfa 4 / 12
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Giemsa boyama
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) tekniğin uygulanmasından önce,
amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıĢ olmalı; (ii) tekniğe tüm yönleriyle aĢina
olmalı, ve (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
Bu UMS‟nin uygulanmasından analist; tekniğin prosedüre uygun yapılmasını
sağlamaktan ve denetimi, değerlendirilmesi ve onaylanmasından (sonucun doğru
ve güvenilir olmasından) Tıbbi Mikrobiyoloji/Parazitoloji Uzmanı sorumludur.
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
İnceleme örnekleri

Parmak ucundan alınmıĢ tam kan ile hazırlanmıĢ preparatlar:
(a) ince yayma; havada iyi kurutulmuĢ ve saf metanol ile sabitlenmiĢ,
(b) kalın damla; havada iyi kurutulmuĢ, ancak sabitlenmemiĢ, veya
(c) hem ince yayma hem de kalın damla bir lamda olacak Ģekilde
hazırlanmıĢ (iyice kurutulmuĢ) ve ince yayma kısmı sabitlenmiĢ
preparat.
Kalın damla ve ince yayma hazırlanması için bkz. UMS, P-TP-07.

Venöz kan - Kan örneği EDTA (0.02g/10mL kan) içeren tüpe de
alınabilir ve preparatlar bu tüpteki kandan hazırlanmıĢ olabilir. Eğer
mikrofilarya veya tripanozomiyaz Ģüphesi varsa heparin (2mg/10mL
kan) veya sodyum sitrat (0.05g/10mL kan) içeren tüplere kan
alınmalıdır (7).
ÖNEMLĠ: Antikoagülanlı kan kullanılacaksa, kan alındıktan sonraki 1
saat içinde preparat yapılmıĢ ve sabitlenmiĢ olmalıdır.

Chlamydia trachomatis için göz ve genital (üretral, servikal) sürüntü
örneklerinden yapılmıĢ preparatlar – havada kurutulduktan sonra saf
metanol ile en az 5 dk sabitlenmiĢ, sonra yine kurutulmuĢ olmalı.

Kemik iliği, biyopsi ve diğer doku örneklerinden yapılmıĢ yaymalar
Kala-azar, ġark çıbanı ve toksoplazmoz tanısında Giemsa ile boyanır
(bkz. UMS, P-MT-04; 05 ve 08).

„Buffy-coat‟ - tam kandan hazırlanan „buffy-coat‟ yaymaları Kala azar
ve toksoplazmoz tanısı için Giemsa ile boyanır.
Reaktifler

Stok Giemsa boyası - Piyasadan hazır temin edilebileceği gibi
laboratuvarda da hazırlanabilir. Özellikle “sıtma programı” kapsamında
stok boyanın merkez (referans) laboratuvarda tecrübeli personel
tarafından hazırlanıp sahadaki laboratuvarlara dağıtılması
standardizasyon açısından idealdir (4). (Hazırlamak için bkz. Ek-1).
NOT: Ek-1‟de verilen formül, ticari formüllere göre daha tutarlı
sonuçlar verdiği sınanmıĢ bir formül olup son kullanma tarihi yoktur.

Stok tamponlar (tamponlu su hazırlamak için)

Tamponlu su (boyayı sulandırmak ve preparat yıkamak için), pH 7.2
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 12
Giemsa boyama
ÖNEMLĠ: pH kan yaymaları için 7.2, Chlamydia incelemesi için ise 7.0
olarak önerilmektedir (3,6).
Laboratuvar, kendi uygulamasında, incelemeye göre en iyi sonucu
alacak Ģekilde tamponlu su pH‟ını test ederek bulmalıdır.

%5‟lik Triton X-100 (stok); Triton tamponlu su (isteğe bağlı)

Metanol, saf (%100‟lük; aseton içermeyen) – metanol nem (su)
çekmesini önlemek için ağzı sıkı kapalı bir ĢiĢede saklanmalıdır!

Ġmmersiyon yağı
Diğer gereç, donanım

Mikroskop, binoküler (rutin ıĢık mikroskobu) – 10 düĢük, 40 yüksek
kuru, 100 immersiyon objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir.
NOT: Bazı mikroskopistler 5 oküler tercih etmektedir. Ancak 5 oküler
daha az büyütme sağlar ve inceleme duyarlılığını düĢürür; bu nedenle
10 oküler kullanılması önerilmektedir (8).

Önceden temizlenmiĢ lamlar (2575 mm) – tercihen, kenarı rodajlı

KurĢun kalem, lamın rodajlı kenarına örnek no vb. yazmak için,

3 veya 4 Ģale (Coplin jar), 50 mL (lam boyamak için)

Mezür, erlen, pipetler; vidalı kapaklı ĢiĢeler (50 mL‟den 1 L‟ye)

Cam veya plastik Pastör pipetleri, tek kullanımlık; pens

pH metre

Zaman alarmı (timer)

Filtre kağıdı, Whatman no. 1

Biyolojik atık kapları, kesici-delici atık kabı ve toksik boya atıklarını
toplamak için kap (kimyasal atık kabı)
1.4. Kalite kontrol

Boyama sonuçlarının uygunluğundan emin olmak için, eğer elde (fazla)
pozitif yayma örnekleri varsa, her Giemsa çalıĢma solüsyonu partisi
hazırlandığında bir kontrol yayması da boyanmalıdır. Boyanacak olan
vaka yaymasındaki organizmalar ve/veya lökositler de dahili kalite
kontrol olarak kabul edilebilirler.

Ġyi kalite kontrol yaymaları (ticari olarak temin edilemeyeceği için)
bilinen bir hastanın kanından aĢağıda tarif edildiği gibi hazırlanabilir ve
ileride kullanmak üzere saklanabilir (4):
(a) Yeterli parazit yoğunluğuna sahip (her iki-üç inceleme alanında en
az bir parazit olan) bir hasta seçilir ve kan örneği EDTA‟lı tüpe alınır.
(b) Bu kandan, alındıktan sonraki tercihen 1 saat içinde ve
yapılabilecek en fazla sayıda ince yayma preparat yapılır.
(c) Yaymaların -oda sıcaklığında ve bir fan (sıcak olmamalıdır!)
kullanarak- hızla kurumaları sağlanır.
(d) Saf metanolde sabitlenirler ve kurumaya bırakılırlar.
Sayfa 6 / 12
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Giemsa boyama
(e) Ġyice kurumuĢ olan lamlar kağıt havlulara sarılarak bir kutuya
yerleĢtirilir. Kutunun üzeri türün adı, hazırlama tarihi ve “Giemsa
kontrol lamları” yazarak etiketlenir.
(f) Amaç kalite kontrol lamları veya eğitim lamları yapmak olduğu için
kutu ≤-70°C‟ye kaldırılır.
(g) Kalite kontrol yapılmak istendiğinde kutudan bir yayma çıkarılır ve
üzerindeki nemin kuruması beklenir; lam “Plasmodium spp (+)” ve
tarih yazarak etiketlenir. Yayma, daha önceden sabitlenmiĢ
olduğundan, Ģimdi artık boyanmaya hazırdır.

Stok tampon çözeltiler ve tamponlu su berrak olmalı, görünür bir
kirlilik olmamalıdır. pH belirtilen sınırlar içinde olduğu sürece tamponlu
su testte kullanılabilir. Her kullanımdan önce, tamponlu suyun pH‟ı
kontrol edilmelidir. Eğer gerekiyorsa düzeltilmelidir (bkz. Ek-2).

pH‟ın belirtilen sınırlar içinde olup olmadığını değerlendirmek için ayrıca
"normal" kandan yaymalar hazırlanıp, boyanabilir ve hücreler
mikroskopta incelenerek yorum yapılabilir:
(a) Makroskobik olarak kan yayması morumsu görünür. Eğer mavi ise
tamponlu su alkaliye kaymıĢ; pembe-kırmızı ise tamponlu su asite
kaymıĢ demektir.
(b) Mikroskobik olarak, eritrositler pembemsi gri, trombositler koyu
pembe ve lökositler mor-mavi çekirdekler ile açık renk
sitoplazmaya sahip görünür. Eozinofilik granüller parlak morkırmızı ve nötrofilik granüller mordur. Enfekte olmayan eritrositler
içinde bazofilik noktalanma mavi gözlenir.
(c) Bu tarif edilen renklerde kullanılan boya serisine ve kanın
karakterine bağlı olarak küçük farklılıklar görülebilir, ancak
morfolojik özellikler ayırt edilebiliyorsa boya tatmin edicidir.

Mikroskop belirli aralıklarla (yoğun kullanılıyorsa yılda en az bir kez)
kalibre edilmelidir. Mikroskoba herhangi bir parça eklenmesi veya
değiĢtirilmesi durumunda da kalibrasyon yapılmalıdır. Kalibrasyon için
kullanılmıĢ optikler mikroskobun üzerinde olmalıdır. Tüm objektifler için
kalibrasyon faktörleri göz önündeki bir panoda asılı olmalıdır (bkz. UMS,
P-TP-01 Mikroskop Kalibrasyonu).

Tüm kalite kontrol sonuçları kaydedilmelidir.
2 Giemsa boyamanın yapılması
NOT: Prosedür sıtma Ģüphesinde ince yayma ve kalın damla
preparatlarının boyanması ön plana alınarak anlatılmıĢtır. Bununla
birlikte yeri geldikçe diğer organizmalar (Chlamydia sp vb.) için farklı
uygulama hususları da not Ģeklinde verilmektedir.

Bir boyama Ģalesine koymak üzere 40 mL Giemsa çalıĢma solüsyonu
(%2.5‟luk) hazırlanır (hazırlanıĢı için bkz. Ek-1).
ÖNEMLĠ: ÇalıĢma solüsyonu günlük hazırlanır. Eğer aynı gün çok
sayıda boyama yapılacaksa boyanın değiĢtirilmesi gerekebilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 12
Giemsa boyama
NOT: Standart bir Ģale 40 mL boya alır. Farklı büyüklükte bir Ģale
kullanılacaksa volüm, oranlar aynı kalacak Ģekilde, ayarlanmalıdır.

Ġkinci bir Ģalenin içine de 40 mL tamponlu su konur; 20 µL Triton X100 eklenir (mikroflarya incelemesinde 200 µL Triton X-100 eklenir).

Yaymalar Giemsa çalıĢma solüsyonu içeren Ģalenin içine konur ve 4560 dk tutulur.
NOT: Lamlar daha yüksek yoğunlukta (ör., %10‟luk) Giemsa çalıĢma
boyası kullanılarak daha kısa sürede (10 dk) boyanabilir. Ancak daha
fazla boya harcanmasına karĢın sonuç kalitesi yeterince iyi olmayabilir.

Ġnce yayma lamı Ģaleden çıkarılır ve tamponlu su içine batırılır; 3-4 kez
batırıp çıkarılarak yıkanır. Kalın damla preparatı ise tampon içinde 5 dk
kadar tutulmalıdır.
NOT 1: AĢırı yıkama yaymaların fazla renksizleĢmesine neden olabilir.
Süreler aĢılmamalıdır.
NOT 2: Eğer ince yayma ve kalın damla aynı lamın üzerinde ise önce
ince yayma kısmı tamponlu su içine 3-4 kez batırıp çıkarılarak yıkanır.
Sonra lamın sadece kalın damla kısmı tampon solüsyona girecek
Ģekilde Ģaleye yerleĢtirilir ve 5 dk tutulur. Bu iĢlem sırasında kalın
damlanın tamamen tampon içinde olduğundan, ancak ince yaymanın
hiçbir parçasının ise kesinlikle tampon içinde olmadığından emin
olunmalıdır.
NOT 3: Chlamydia spp‟nin bazofilik intrasitoplazmik inklüzyon
cisimciklerinin görülmesi amacıyla göz veya genital sistem sürüntü
örneklerine Giemsa boyama uygulanırken kullanılan reaktifler ve
adımlar yıkama aĢamasına kadar aynıdır. Yıkama ise %95‟lik etanolde
yapılır; preparat hızla etanol içine sokulup çıkarılarak fazla boya
uzaklaĢtırılır.

Lamlar düĢey pozisyonda dizilir ve havada kurutulur.
NOT: Eğer ince yayma ve kalın damla aynı lamın üzerinde ise
kurutulurken kalın damla kısmı aĢağıda tutulmalıdır.

Mikroskopta incelenir.
3 Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması

Preparatlar önce küçük objektif altında (10) genel boyanma özellikleri
ve yaymalarda hücrelerin dağılımını görmek için değerlendirilmelidir.
Mikrofilaryaların varlığı da bu büyütmede kolay ayırt edilir.

Daha sonra immersiyon objektifi (100) ile esas inceleme yapılmalıdır.

Ġnce yayma preparatlar en az 25-30 dk incelenmeli ve en az 300 alan
gözden geçirilmelidir. Ġncelemeye yaymanın uç bölgesinden,
eritrositlerin tek tek düĢtüğü bir alandan baĢlanır.

Kalın damla preparatlar en az 10 dk ve her biri en az 10-20 lökosit
içeren 100 alan gözden geçirilecek Ģekilde incelenmelidir.
Sayfa 8 / 12
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Giemsa boyama

Eğer Plasmodium‟lar mevcutsa sitoplazmaları mavi, nükleer materyal
kırmızı, mor-kırmızı boyanmıĢ olacaktır. Plasmodium‟ların enfekte ettiği
eritrositlerdeki Schüffner granülleri ve diğer inklüzyonlar kırmızı
boyanır.

Sıtma parazitleri için ayırt edilen nükleer ve sitoplazmik renkler
tripanozomada ve hücre içi yerleĢim göstermiĢ Leishmania‟larda da
gözlenir.

Leishmania amastigotları makrofajların içinde veya dıĢında çok küçük
(3 ila 5 µm) yuvarlak veya oval organizmalar Ģeklinde görülürler. Bir
amastigotta kırmızı-mor nükleus, oldukça küçük daha koyu kırmızı-mor
boyanmıĢ kinetoplast ve açık mavi sitoplazma ayırt edilir.
NOT: Preparatların incelenmesinde daha ayrıntılı bilgi için ayrıca Ģu
ilgili UMS‟lere bakılmalıdır:
i) Sıtmanın Mikrobiyolojik Tanısı (UMS, P-MT-06);
ii) Kala-azar‟ın Mikrobiyolojik Tanısı (UMS, P-MT-04);
iii) ġark çıbanının Mikrobiyolojik Tanısı (UMS, P-MT-05).

Mikrofilaryalar genellikle mavi-mor görünürken, kılıfları boyanmayabilir.

Göz veya ürogenital örneklerden yapılmıĢ yaymaların Giemsa
boyamasında, hücreler eğer enfekte iseler, Chlamydia spp inklüzyon
cisimcikleri bazofilik boyanmıĢ (koyu mavi-mor) olarak görülürler.
4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Kan yaymalarının kalitesi teknisyenin tecrübesi ve boyanın kalitesiyle
doğrudan iliĢkilidir. Bu nedenle hatalı yaymalardan kaçınılmalı ve
kullanılacak Giemsa boyasının taze olmasına önem verilmelidir.

ÇalıĢma solüsyonunda pH ayarlamasına gereken dikkat gösterilmez ise
sonuçların doğruluğu ve güvenilirliği etkilenebilir.

Stok Giemsa boyasına çok küçük miktarlarda bile su karıĢması boyanın
stabilitesini bozacaktır. Saklama koĢullarına özen gösterilmelidir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 9 / 12
Giemsa boyama
Ekler
Ek-1 Giemsa boyasının hazırlanması4
100x Stok Tampon 0.67 M
Na2HPO4
NaH2PO4·H2O
Deiyonize su
59.24 g
36.38 g
1000 mL
KarıĢtırılır ve 121°C‟de 15 dk otoklavlanır ya da
filtrasyon ile (filtre por çapı 0.2 µm) sterilize edilir.
Etiketlenir ve oda ısısında saklanır. Raf ömrü 1 yıldır.
Çalışma Tamponu 0.0067M, pH 7.2
Stok Tampon
Deiyonize su
10 mL
990 mL
Kullanmadan önce pH kontrol edilir. pH7.2 olmalıdır.
Etiketlenir ve oda ısısında saklanır. Raf ömrü 1 aydır.
Triton X-100, %5’lik
Deiyonize su (56°C‟ye ısıtılmıĢ)
Triton X-100
95 mL
5 mL
Deiyonize su önceden ısıtılır ve Triton X-100 yavaĢça
eklenir; yavaĢ çevrilerek karıĢtırılır.
Giemsa Stok Boya
Cam boncuklar, 3.0 mm
Metanol, saf, asetonsuz
Giemsa boya, toz (sertifiye)
Gliserol
Güvenlik
uyarısı!
Metanol
yüksek
düzeyde
toksik ve
parlayıcıdır.
Eğer
yutulacak
olursa (her
hangi bir
miktarı)
körlüğe ve
ölüme neden
olabilir.
Kullanım
harici
zamanlarda
metanol ĢiĢesi
kilitli bir
dolapta
tutulmalıdır!
30 mL
270 mL
3g
140 mL
Temiz, kuru, 500 mL‟lik bir kahverengi cam ĢiĢe alınır; içine
önce cam boncuklar konur ve listedeki diğer maddeler veriliĢ
sırasına göre ĢiĢeye eklenir. Burgu kapak sıkıca kapatılır.
ġiĢe bir çalkalayıcının üzerine bir açıyla yerleĢtirilir; orta hızda, en az 14 gün,
günde 30-60 dk olacak Ģekilde çalkalanır.
Kapak nem almayacak Ģekilde daima sıkıca kapalı tutulduğu sürece stok Giemsa
oda ısısında süresiz stabildir (ayrıca stok boya zamanla daha da geliĢir).
Kullanmadan önce ĢiĢe çalkalanır. ÇalıĢma solüsyonu hazırlamak için kullanılacak
kadar bir miktar Whatman No 1 filtre kağıdından süzülerek alınır.
Sayfa 10 / 12
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Giemsa boyama
Giemsa Çalışma Boyası (%2.5’luk)
ÇalıĢma tamponu
Giemsa stok boya
%5 Triton X-100
40 mL
1 mL
20 µL
Günlük olarak taze hazırlanır (testten hemen önce).
Eğer çok sayıda lam boyanacaksa boya gün içinde yenilenmelidir. Ġdeal olarak
hazırlanmıĢ bir çalıĢma boyası 1 saatten sonra kullanılmamalıdır.
Ek-2 pH düzeltme solüsyonları (%2‟lik)4
Tamponlu suyun pH‟ı, her Giemsa çalıĢma boyasının hazırlanmasından önce,
rutin olarak kontrol edilmelidir.
pH‟ı ayarlamak için düzeltme solüsyonları kullanılır; eğer pH<7.2 (asite kaymıĢ)
ise %2 Na2HPO4 solüsyonundan, eğer pH>7.2 (alkaliye kaymıĢ) ise %2 KH2PO4
solüsyonundan az miktarlarda eklenerek ayarlama yapılır.
Bu düzeltme solüsyonlarının hazırlanıĢı aĢağıda verilmektedir.
%2 Na2HPO4
Bir erlende 100 mL deiyonize su ile 2 g Na2HPO4 karıĢtırılır, eritilir. Solüsyon bir
burgu kapaklı ĢiĢeye aktarılır ve “%2‟lik Na2HPO4” Ģeklinde etiketlenir. Gün
ıĢığından uzak, serin bir ortamda saklanır.
Tampon suyu daha alkali yapmak için kullanılır.
%2 KH2PO4
Bir erlende 100 mL deiyonize su ile 2 g KH2PO4 karıĢtırılır, eritilir. Solüsyon bir
burgu kapaklı ĢiĢeye aktarılır ve “%2‟lik KH2PO4” Ģeklinde etiketlenir. Gün
ıĢığından uzak, serin bir ortamda saklanır.
Tampon suyu daha asit yapmak için kullanılır.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 11 / 12
Giemsa boyama
İlgili diğer UMS belgeleri
Bu prosedür belgesi (Giemsa Boyama) ayrıca aĢağıda listelenen UMS‟lerle ilgilidir.
Özellikle, preparatların incelenmesi hakkında daha ayrıntılı bilgi için bu UMS‟lere
bakılması önerilir:
UMS,
UMS,
UMS,
UMS,
UMS,
UMS,
UMS,
UMS,
P-ÖY-03
P-TP-01
P-TP-07
P-MT-06
P-MT-04
P-MT-05
P-MT-08
B-MT-16
Kan ve kemik iliği örneklerinin parazitolojik incelemesi
Mikroskop kalibrasyonu (oküler mikrometre ile)
Kalın damla ve ince yayma
Sıtmanın mikrobiyolojik tanısı
Kala-azar‟ın mikrobiyolojik tanısı
ġark çıbanının mikrobiyolojik tanısı
Toksoplazmozun mikrobiyolojik tanısı
Chlamydia trachomatis‟in mikrobiyolojik tanısı
Kaynaklar
1 Bullock-Iacullo S. Giemsa stain. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 9.8.5.1 - 9.8.5.5
2 Fritsche TR, Selvarangan R. Medical parasitology. In: McPherson RA, Pincus MR (eds). Henry’s
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22nd ed. Elsevier Inc., Philadelphia.
2011, p.1189-1238
3 WHO. Basic Malaria Microscopy Part I. Learner‟s Guide. Second edition, Switzerland. 2010.
http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547826_eng.pdf (son eriĢim tarihi:
18.12.2013)
4 CDC. Laboratory diagnosis of malaria: Staining for malaria parasites. Laboratory identification of
parasites of public health concern. DPDx.
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/PDF_Files/malaria_staining_benchaid.pdf (son eriĢim tarihi:
17.11.2013)
5 Garcia LS. Laboratory methods for diagnosis of parasitic infections: Giemsa stain (Procedures
44.20-22). In: Finegold SM, Baron EJ (eds). Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. 7th ed.,
The C. V. Mosby Company, USA. 1986 p. 812-813
6 Finegold SM, Baron EJ (eds). Formulas for commonly used stains: Giemsa stain for Chlamydiae.
Chapter 46. In: Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. 7th ed., The C.V. Mosby Company,
USA. 1986, p. 905.
7 Garcia LS. Giemsa stain. http://www.medchem.com/pages/lab_procedures/pdf/giemsa_blood_stain.pdf (son eriĢim tarihi: 17.11.2013)
8 Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD
(eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C.
2007, p. 9.3.2.1-4.
Sayfa 12 / 12
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Download

Giemsa boyama - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu