Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ
STANDARTLARI (UMS)
Metilen Mavisi Boyama
(Klinik Örneklerin Mikroskobik Ġncelemesi)
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-14
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
(Loeffler‟in) Metilen mavisi boyama
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
KISALTMALAR VE TANIMLAR .............................................. 3
GENEL BĠLGĠ ................................................................... 3
TEKNĠK BĠLGĠLER ............................................................. 4
1
2
3
4
5
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 4
Metilen mavisi boyama prosedürü ................................... 6
Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması ................... 6
Sonuçların raporlanması ................................................ 7
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 8
ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ ............................................ 8
KAYNAKLAR ..................................................................... 8
Sayfa 2 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-14 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Metilen mavisi boyama (Loeffler‟in)
Kapsam ve Amaç
Loeffler‟in metilen mavisi boyama rutin klinik mikrobiyolojide pek çok amaç için
kullanılabilen basit ancak tanıya çok yardımcı bir tekniktir. Bu UMS‟nin amacı
metilen mavisi boyamanın kullanım alanlarını özetlemek ve rutin uygulama için
bir prosedür vermektir.
Kısaltmalar ve Tanımlar
Buffy-coat
Santrifüj edilmiş antikoagülanlı kanın eritrosit tabakası ve
plazması arasında kalan ve beyaz kan hücrelerini içeren
(bulutsu) katmanı.
Kanıt hücreleri Orijinal karşılığı „clue cells‟ olup, bakteriyel vajinozda görülen ve
tipik olarak üzerine yoğun bir şekilde bakterilerin yapıştığı düz
epitel hücrelerini tanımlamak için kullanılan bir ifadedir. Sınırları
belli olmayan granüler hücreler gibi görünürler.
Kapsül şişme
reaksiyonu
Kapsüllü bir bakterinin süspansiyonuna anti-kapsül antikorlar
eklendiğinde ve ardından mikroskopta incelendiğinde kapsülün
daha belirgin, şişmiş gibi görünmesine neden olan reaksiyon
(Quellung test). Bilhassa Streptococcus pneumoniae için
uygulanan bir testtir.
LMMB
Loeffler‟in metilen mavisi boyama
Metakromatik
granüller
Bakteri hücrelerindeki bazı boyaların rengini değiştiren (ör.,
metilen mavisi ile -mavi değil- pembe boyanan) cisimciklerdir.
Corynebacterium‟larda metakromatik granüller polifosfatlardan
oluşmuştur ve enerji depoları gibi işlev görürler.
Genel Bilgi
Loeffler‟in metilen mavisi, klinik laboratuvarlarda -bakteri ya da parazit
morfolojilerinin tanımlanması, kapsül şişme testinin değerlendirilmesi, vb.- çok
çeşitli amaçlar için kullanılabilen basit bir boyadır. Corynebacterium diphtheriae
tanısında özel bir öneme sahiptir. Bu boya ile boyandığında C. diphtheriae, açık
mavi sitoplazmaya belirgin kontrast oluşturan koyu boyanmış metakromatik
granüllerin neden olduğu boncuklu ya da bantlı bir hücre görünümü ile
karakterizedir (1).
Metilen mavisi boyama, Gram boyasına yardımcı olarak da kullanılır. Özellikle
menenjit şüphesinde BOS sedimentinden Gram boya ile birlikte mutlaka metilen
mavisi boyama da yapılmalıdır. Gram boyama ile pembe-kırmızı boyanan ve
genellikle pembe bir zeminde ayırt edilmesinde güçlük olabilen Haemophilus
influenzae ve Neisseria meningitidis gibi gram negatif organizmalar, metilen
mavisi kullanılması halinde açık gri zeminde koyu mavi boyanmış hücreler
şeklinde görüleceklerinden kolayca ayırt edilebilirler (2).
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-14 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 8
(Loeffler‟in) Metilen mavisi boyama
Metilen mavisi Mycobacterium spp‟nin boyanmasında veya benzeri asit-fast
boyamalarda da zıt boya olarak kullanılır. Bir diğer kullanım alanı dışkının direkt
mikroskopisinde lökositleri göstermektir ki, lökositlerin varlığı invaziv enfeksiyon
bulgusudur. Bu boya ayrıca Gram boyama ile görülmeleri zor olabilen fuziform
bakterilerin ve spiroketlerin (ör., Vincent anjini gibi ağız enfeksiyonlarında)
morfolojisini de ortaya çıkarabilir (3).
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS‟de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Bütün kültürler enfeksiyöz kabul edilmeli ve
daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de
desteklenmelidir. Aerosol oluşturması muhtemel tüm laboratuvar çalışmaları bir
biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir (ayrıca bkz. “Ulusal Laboratuvar
Güvenliği Rehberi”).
Güvenlik uyarısı! Etanol parlayıcıdır! Alevden ve aşırı ısıdan uzak tutulmalıdır!
Boyanmış olsun veya olmasın bütün lamlar kesici-delici atık kabul edilir ve
kesinlikle kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu
torbalara atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi enfeksiyöz risk doğururlar!
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Bu UMS‟yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) testten önce, amaçlanan kullanım
ile ilgili eğitim almış olmalı; (ii) uygulamaya tüm yönleriyle aşina olmalı, ve; (iii)
daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır.
1.3. Örnek, Reaktif, Donanım
İnceleme örnekleri

Katı besiyerlerinde üreyen koloniler – özellikle C. diphtheriae ve diğer
korineformların değerlendirilmesi için. Ġdeal sonuç almak için inhibitör
içermeyen besiyerindeki genç kültürler (<24 saat) kullanılmalıdır.

Buyyon kültürleri ve kan kültürleri – hem üremenin hem de üreyen
bakterinin morfolojisinin değerlendirilmesi için.

Klinik örnek preparatları – özellikle BOS ve üretral akıntı örneklerinin
sabitlenmiş preparatları ve invaziv enfeksiyon olasılığında lökosit
varlığını değerlendirmek için dışkı örneklerinin ıslak preparatları
NOT: BOS ve üretral akıntı örnekleri için preparatların laboratuvarda
hazırlanması idealdir. Ancak örneğin laboratuvara ulaşması
gecikecekse veya örnek bir taşıma besiyerine konacağı için örneğin
yapısı değişecekse preparat örneğin alındığı birimde hazırlanmalı,
sabitlenmeli ve lamlar laboratuvara iletilmelidir.
Sayfa 4 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-14 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Metilen mavisi boyama (Loeffler‟in)
Loeffler’in metilen mavisi boya çözeltisi

Piyasadan hazır temin edilebileceği gibi laboratuvarda da hazırlanabilir.

Hazırlamak için: 0.3 g metilen mavisi, 30 mL etanol (%95‟lik) içinde
eritilir; 100 mL distile/deiyonize su eklenir. Boya bir gece bekletildikten
sonra kullanılacağı şişeye filtre edilerek (Whatman No.2 filtre kağıdı)
aktarılır. Etiketlenir ve oda ısısında saklanır. Raf ömrü 1 yıldır.
NOT: Corynebacterium ve Cryptosporidium türlerini boyamak için
önerilen formül „alkali LMMB‟ olarak da geçmektedir. Üstte verilen
formüldeki 100 mL distile su yerine 100 mL %0.01‟lik potasyum
hidroksit eklenerek hazırlanır (4,5).
Ancak bazı kaynaklarda Corynebacterium spp için bunun geçmişte
kullanılan, bugün ise gerek duyulmayan bir modifikasyon olduğu
belirtiliyor (6). Laboratuvarın bu formüllerden hangisini kullanacağına
Corynebacterium spp kontrol suşları ile yapacağı değerlendirme
sonucunda kararı vermesi önerilir.
Diğer gereç, donanım

Mikroskop, binoküler (rutin ışık mikroskobu) – 10 düşük, 40 yüksek
kuru, 100 immersiyon objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir.
NOT: Bazı mikroskopistler 5 oküler tercih etmektedir. Ancak 5 oküler
daha az büyütme sağlar ve inceleme duyarlılığını düşürür; bu nedenle
10 oküler kullanılması önerilmektedir (7).







Önceden temizlenmiş lamlar (25x75 mm) – tercih kenarı rodajlı
Mumlu kalem, lamı bölmek için
Kurşun kalem, lamın rodajlı kenarına örnek numarası vb. yazmak için
Öze, steril tek kullanımlık veya nikrom, veya steril kürdan
SF (%0.85 NaCl) veya su, steril
Ġmmersiyon yağı
Kesici-delici atık kabı, toksik boya atıklarını toplamak için kap
1.4. Kalite kontrol

Boyanın her yeni serisi kullanıma sokulmadan önce kontrol suşları /
hücreleri ile test edilmelidir.

Boya ayrıca kullanım sıklığına göre en az ayda bir veya her kullanımda
klinik örneğe paralel olarak kontrol suşları / hücreleri ile test edilmelidir.

Kalite kontrol organizmaları / hücreleri:
Escherichia coli ATCC 25922 – mavi çomaklar
Streptococcus pyogenes ATCC 19615 – mavi koklar
C. diphtheriae biyotip gravis ATCC 8028 – koyu mavi granüller
Antikoagülanlı kanın „buffy-coat‟ tabakasından bir damla – parçalı
çekirdek yapıları iyi ayırt edilen mavi boyanmış lökositler
NOT: Pozitif kontrolün ıslak preparattan yapılması şart değildir;
uygunluk, önceden hazırlanmış, sabitlenmiş, derin dondurucuda
saklanmakta olan ve lökositler, „kanıt‟ hücreleri ya da trikomonas
içeren yaymaların boyanması ile test edilebilir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-14 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 8
(Loeffler‟in) Metilen mavisi boyama
2 Metilen mavisi boyama prosedürü
2.1. Preparat hazırlanması

Klinik örneklerden veya sıvı ya da agar kültürlerden yayma preparat
hazırlanması ile ilgili ayrıntılı bilgi Gram boyama prosedüründe
verilmiştir (bkz. UMS, B-TP-03).
NOT: Gram boyalı preparatların mikroskopta okunması ve saklanması
ile ilgili hususlar LMMB ile boyalı preparatlara da uygulanabilir.

Islak preparat hazırlanır hazırlanmaz incelenmelidir (bkz. „2.3. Islak
preparatların boyanması‟).
2.2. Yayma preparatların boyanması

Boyanmaya hazır, sabitlenmiş lam(lar) bir boyama standına yerleştirilir.

LMMB çözeltisinden lamın üzerine yayma alanını kapatacak miktarda
konur.

Boya yaymanın üzerinde 1-3 dk tutulur ve sonra lam çok hafif akan
çeşme suyu ile yıkanır.

Lam üzerindeki su iyice süzdürülür ve dik konumda havada kurutulur.

Mikroskopta 40 kuru objektif ve 100 immersiyon objektifi ile incelenir.
2.3. Islak preparatların boyanması

LMMB preparatı ideal olarak SF preparatı ile yan yana hazırlanmalıdır
ÖNEMLĠ: Dışkı ve vajinal örneklerin SF ile hazırlanmış preparatlarında
varsa Trichomonas ve Giardia trophozoitleri gibi hareketli organizmaları
görmek mümkün olabilir.

Lam mumlu kalem ile ikiye bölünür.

Örnek sıvı ise (vajinal akıntı, idrar vb.) her iki bölüme birer damla
örnek konur. Örneklerden birinin üzerine bir damla LMMB ilave edilir.

Örnek katı ise (dışkı örnekleri vb.) bir bölüme bir damla SF, diğer
bölüme bir damla LMMB konur. Steril bir öze veya kürdan ile alınan
örnek parçası SF‟te ve LMMB‟de homojenize edilir.

Damlaların üzeri lamel ile kapatılır.

Mikroskopta 40 kuru objektif ile incelenir.
3 Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması

Doğru bir değerlendirme için en az 10-20 mikroskop sahasında
lökositler, eritrositler, monositler ve epitel hücrelerinin (vajinal
örneklerde „kanıt‟ hücrelerinin) varlığı ve sayıları saptanmaya çalışılır.
Sayfa 6 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-14 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Metilen mavisi boyama (Loeffler‟in)

Islak preparatlar parazit elemanlarının varlığı yönünden de
değerlendirilir; SF ile yapılan preparatta hareketli yapılar (trikomonas
vb.) görülebilir. Trichomonas vaginalis enfeksiyonunda genellikle yoğun
lökosit de gözlenir (>30 lökosit / mikroskop sahası)

Tomurcuklanmış maya hücreleri ve psödohif yapıları gözlenebilir;
vajinal akıntı ve idrarda enfeksiyon ile ilişkili iken dışkı örneklerinde bu
yapıların görülmesi normal floraya ait olabileceklerinden dolayı
enfeksiyon ile ilişkili kabul edilmez (1).

Vajinal örneklerde; tomurcuklanmış maya hücrelerinin ve/veya
psödohiflerin varlığı vajinal kandidiyaz ile ilişkilidir; „kanıt‟ hücrelerinin
varlığı bakteriyel vajinoz göstergesidir.

Üretral akıntı örneklerinden yayma preparatta -sadece erkek
hastalarda- lökositler içinde mavi boyanmış diplokokların gözlenmesi
gonokok (Neisseria gonorrhoeae) enfeksiyonu ile ilişkilidir.

BOS örneğinde benzer görünüm Neisseria meningitidis enfeksiyonu için
çok güçlü bir bulgudur.

Dışkı örneklerinin incelemesinde lökositlerin görülmesi invaziv
enfeksiyona (Shigella sp, Campylobacter sp vb.) işaret eder. Kültür için
gelmiş bir dışkı örneğinin mikroskopisinde eğer lökositler görülmüyor,
ancak eritrositler mevcut ise, örnek mutlaka Escherichia coli O157:H7
(enterohemorajik köken) için de kültüre alınmalı veya Shiga toksin
testi yapılmalıdır (1).

Normalde steril vücut bölgelerinden örneklerde metilen mavisi ile
boyanmış organizmalar görülmesi enfeksiyon bulgusudur.

Santrifüj edilmemiş idrarın LMMB mikroskopisinde (10 µL standart öze
ile alınmış damlanın lam üzerine sabitlenerek boyanması ile)
organizmaların görülmesi bakteri sayısının muhtemelen ≥105cfu/ml
olduğunu gösterir.

LMMB asla C. diphtheriae tanısı amacıyla direkt klinik örneklere
uygulanmaz. Çünkü metakromatik granüller diğer bazı bakterilerde de
bulunabilir. Bu nedenle boğaz sürüntülerinden LMMB boyamanın difteri
tanısında değeri yoktur (4,5).
4 Sonuçların raporlanması

Klinik örneklerin LMMB sonuçları ön rapor olarak klinisyene iletilmelidir.

Eğer hiçbir organizma/hücre gözlenmediyse, “herhangi bir organizma
görülmedi” veya “herhangi bir hücre görülmedi” şeklinde rapor edilir.

Varsa hücrelerin ve organizmaların sayımı yapılmalıdır. Sayım sadece,
eğer varsa, inflamasyon veya nekroz bulgusu olan alanlardan
yapılmalıdır (bkz. UMS, B-TP-03).

Dışkı örneklerinde lökositler, eritrositler; vajinal örneklerde lökositler,
Trichomonas, mantar elemanları ve „kanıt‟ hücreleri, üretral akıntı ve
BOS örneklerinde lökositler ve diplokoklar, görülüyorsa diğer
organizma formları… rapor edilmelidir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-14 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 8
(Loeffler‟in) Metilen mavisi boyama
5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Örnek pürülan olmasına rağmen LMMB‟de eğer hiç organizma
görülmemiş ise başka bir boyama yöntemi (akridin oranj vb.) önerilir.

Boyama sonuçları başka incelemelerle desteklenmelidir.
İlgili diğer UMS belgeleri
Bu prosedür belgesinde (Metilen Mavisi Boyama) geçen bazı hususlar (preparat
hazırlanması ve sonuçların raporlanması gibi) ile ilgili daha ayrıntılı veya ilave
bilgi için aşağıda verilen UMS belgesine başvurunuz:
UMS, B-TP-03
Gram boyama
Kaynaklar
1
York MK. Wet mount for detection of leukocytes and microorganisms. In: Garcia LS, Isenberg
HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington
D.C. 2007, p. 3.2.3.1 - 3.2.3.4
2
Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC, Jr. (eds). Introduction to
microbiology Part I: guidelines to practice and management: Microscopic examination. In:
Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed., J.B. Lippincott Company,
Philadelphia. 1992, p. 15-26.
3
Grasmick A. Processing and interpretation of bacterial faecal cultures. Loeffler‟s methylene blue.
In: Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. ASM Press, Washington D.C. 1992,
p.1.10.3
4
Synder JW. Corynebacterium diphtheria cultures. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical
Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p.
3.11.7.1-3.11.7.8
5
Efstratiou A, Maple PAC. Manual for the Laboratory Diagnosis of Diphtheria. Copenhagen:
Expanded Programme on Immunization in the European Region of World Health Organization,
ICP/EPI 038(C). 1994.
6
Finegold SM, Baron EJ (eds). Formulas for commonly used stains: Methylene blue stain
(Loeffler‟s). In: Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. 7th ed., The C. V. Mosby Company,
USA. 1986, p. 909.
7
Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD
(eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C.
2007, p. 9.3.2.1-4.
Sayfa 8 / 8
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-14 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Download

Metilen Mavisi Boyama - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu