Deri ve Yumuşak Doku Örneklerinin
Laboratuvarda Değerlendirilmesi
F. Ferda Tunçkanat
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
1
Örneklerin Laboratuvarda
Değerlendirilmesi
•
•
•
•
Örneklerin kabulü
Örneklerin işlenmesi
Direkt inceleme
Kültür
– Aerop
•Kültürlerin değerlendirilmesi
•Bakterilerin tanımlanması
– Anaerop
• Anaerop duyarlılık testleri uygulama
endikasyonları
2
Örneklerin Kabulü
Laboratuvara Ulaşan Örnekler
• Aspirasyon materyali
(doku sıvısı, derinden alınan püy, apse materyali)
• Drenaj materyali (apse örnekleri)
• Doku örnekleri
• Sürüntü örnekleri
Sürüntü örnekleri genellikle etken
mikroorganizmaları yansıtmaz
3
Örneklerin Kabulü
Ret Kriterleri
• Genel ret kriterleri
– Etiket bilgileri yok veya eksik
– Uygun şekilde alınmamış örnekler (anaerop kültür)
– Laboratuvara uygun koşullarda ulaştırılmamış örnekler
• Kurumuş eküvyon, formalin içinde doku örnekleri..vb
– Örnek kalitesinin yetersiz olması
• Sürüntü örneklerinin direkt incelemesinde bol miktarda skuamöz
epitel hücrelerinin görülmesi
• Anaerop örnekler için işlemler
• tiyoglikolat besiyerinde yapılır
4
Örneklerin Kabulü
Ret KriterleriKriterleri- Anaerop bakteriler
• Aspirasyon materyali
Laboratuvara iletilme süresi
• < 1 ml
• ~ 1 ml
• > 2 ml
≤ 10 dk
≤ 30 dk
≤ 2-3 st (8-24 st.e kadar)
Doku örnekleri
• Steril kapta
• Anaerop ortam, transport by.de
Anaerop eküvyon
• Tüpte, nemli anaerop atmosferde
• Anaerop transport by.de
≤ 30 dk
≤ 2-3 st
≤ 1 st
≤ 2-3 st
5
Isenberg HD, Garcia LS (eds), Clinical Microbiology Procedures
Handbook. 4.2. 2010, 3rd ed. ASM press, Washington D.C.
Örneklerin İşlenmesi
Örnekler işlem yapılıncaya kadar oda
sıcaklığında bekletilmelidir
• Fazla miktarda non-pürülan materyal
santrifüj edilir
• Pürülansı çok fazla örnekler vortekslenir
• Doku örnekleri 1 ml sıvı besiyerinde ezilir
• Eküvyon 0,5 ml sıvı besiyerinde iyice
çalkalanıp, eküvyondaki fazla sıvı akıtılır
6
Direkt İnceleme
Makroskopik
Makroskopik inceleme:
• Pürülans
• Kan ve nekrotik doku
• Kötü koku
• Sülfür granülleri
7
Direkt İnceleme
Mikroskopik
Mikroskopik inceleme amaçları
• Örnek kalitesinin değerlendirilmesi (özellikle
sürüntü örnekleri için)
• Enfeksiyon varlığı ve etken mikroorganizmalara
ilişkin bilgi sağlaması (PMNL+mikroorganizma)
• Kültür yöntemlerinin seçilmesinde / kültür
sonuçlarının yorumlanmasında yol gösterici
olması
• Gerektiği durumlarda klinisyenin yönlendirilmesi
8
Olgu 1
• Soru -Kültür için gönderilen örneğin Gram yaymasında
epitel hücresi görülmüyor , elastin fibrilleri ve gram pozitif
koklar, çok nadir lökosit izleniyor. Ne düşünelim- enfeksiyon ?
kolonizasyon ?
Enfeksiyon !!!
Elastin fibrilleri nekroz
göstergesi
9
Olgu--2
Olgu
• Soru 1-Travmaya sekonder gelişen ve hızla ilerleyen selülit
olgusundan aerop kültür için gönderilen örneğin Gram
yaymasında PMNL ve iri gram pozitif sporsuz basiller
izleniyor. Ne düşünelim ? Klinisyeni nasıl yönlendirelim ?
•C.perfringens ?
•Klinisyen acil olarak yayma
sonucundan haberdar edilmeli
•En kısa sürede anaerop kültür
için yeni örnek istenmeli
10
11
12
13
PMNL + mikst bakteri görünümü
ANAEROP ENFEKSİYON
14
14
ANAEROP ENFEKSİYON
15
Kültür
• Aerop kültür
• Anaerop kültür
– Gerektiğinde
Aerop kültür isteği yapılmamış
olsa bile örnekler
aerop olarak da ekilmelidir 16
Kültür
Aerop kültür
• Besiyerleri
– Seçici olmayan zengin besiyeri (% 5 kanlı agar)
– Seçici besiyeri (McConkey, EMB, Endo)
– Diğer (gerekirse) (Çikolata, Löwenstein-Jensen, SDA..)
•
Normal atmosfer
– % 5- 10 karbondioksit (gerektiğinde)
17
Kültür
Aerop kültür
kültür--Değerlendirme
Değerlendirmede önemli noktalar
• Örnekten üreyebilecek mikroorganizmalara ilişkin bilgi
sahibi olunması
• Gram yayma bulgularının dikkate alınması
• Mikroorganizmaların göreli olarak üreme yoğunluğu
Potansiyel patojenlerin, normal flora
üyelerinden ve/veya kolonize eden
mikroorganizmalardan ayırdedilmesi
önemli
18
Kültür
Aerop kültür
kültür--Tanımlama
• Klasik yöntemler
–
–
–
–
–
–
Koloni özellikleri
Gram boyama
Katalaz
Koagülaz
Oksidaz testi
Biyokimyasal testler ve diğerleri
• Otomatize sistemler
19
Kültür
Anerop kültür
• Anaerop besiyerleri
Besiyerleri,
* Hemin ve vitamin K ile zenginleştirilir
* Günlük hazırlanmalıdır
• Anaerop atmosfer
20
Kültür
Anerop kültür
Anaerop besiyerleri
Katı besiyerleri
Sıvı besiyerleri
Genel üretim besiyerleri (anaerop kanlı •
agar)
•
Tiyoglikolat besiyeri veya
kıymalı besiyeri
Schaedler agar,Brucella agar,
BHIA, Columbia.. (% 5 koyun kanı)
Seçici ve tanımlayıcı besiyerleri
•
Fenil etil alkol (FEA) agar
•
Bacteroides safra eskülin (BSE)agar
•
Kanamisin-vankomisin lize kanlı
(KVLK) agar
21
Soru
• Tiyoglikolat besiyerini ne şekilde değerlendirelim, ne
kadar süre ve hangi ortamda bekletelim ?
•Anaerop katı besiyerinde üreme (+) tiyoglikolat besiyerini
değerlendirmeye gerek yok.
• Katı besiyerinde üreme (tiyoglikolata dönülüp, bütün işlemler tekrarlanır (aerop
kültür (+) olsa bile)
•Katı besiyerinde üreme (-) aerop kültür (-), tiyoglikolatta
gözle görülür üreme (-anaerop pasaj
22
Kültür
Anerop kültür
Anaerop atmosfer
Anaerop atmosfer
% 80-90 N2, %5-10 H2, %5-10 CO2
• Anaerop kavanoz
– Sulu sistem- GasPak
– Kuru sistem-Aneorogen
• Anaerop kabin
23
Anaerop kavanoz sistemleri
37 oC’de en az 48 saat
Bazı türler için 2 haftaya kadar
inkübasyon
İ
24
Anaerop kabin
24 Saatte üreme kontrol edilir
25
Kültür
Anerop kültür
kültür--Değerlendirme
• Eş zamanlı yapılan aerop kültür ile karşılaştırma
• Seçici besiyerlerinin değerlendirilmesi
• Aerotolerans testi
26
Kültür
Anerop kültür
kültür--Değerlendirme
Eş zamanlı yapılan aerop kültür ile karşılaştırma
Aerop
Anaerop
27
Kültür
Anerop kültür
kültür--Değerlendirme
Seçici besiyerlerinin değerlendirilmesi
FEA agar
• Fakültatif bakterileri
baskılar
• Kolonilerin yayılmasını
önler
28
Kültür
Anerop kültür
kültür--Değerlendirme
Seçici besiyerleri
BSE agar
 >1 mm siyah
koloniler→Bacteroides
fragilis grubu
 Safraya dirençli diğer
bakteriler →Bilophila
wadsworthia, Sutterella
wadsworthensis, Alistipes
türleri, enterokoklar
29
Kültür
Anerop kültür
kültür--Değerlendirme
Seçici besiyerleri
KVLK agar
• Gram pozitif bakteriler,
enterikleri baskılayıcı etki
• Bacteroides, Prevotella,
Alistipes ve bazı Fusobacterium
türleri ürer.
Porphyromonas türleri
üreyemez (vankomisine
duyarlı)
• Pigmentli Prevotella türlerinin
pigment oluşturmasını ↑
30
31
Kültür
Anerop kültür
kültür--Değerlendirme
Aerotolerans testi
Anaerop kanlı agarda üreyen her farklı koloniden pasaj
yapılır
Anaerop ortamda 48 saat
– Anaerop kanlı agara
%5-10 CO2’li ortamda 24-48 saat
– Çikolata besiyerine
Anaerop kanlı agarda üreme var
Çikolata besiyerinde üreme yok
Anaerop bakteri
31
1
4
2
1
3
2
3
4
Çikolata besiyeri
Aerotolerans test
Anaerop kanlı agar
32
Anaerop kanlı agar
33
Aerotolerans test
Çikolata agar
33
Kültür
Anaerop kültür
kültür--Tanımlama
•
•
•
•
•
Klasik yöntemler
Yarı otomatize sistemler
Moleküler yöntemler (16SrRNA)
Gaz likit kromatografi, yağ asiti analizi
MALDI-TOF
34
Kültür
Anaerop kültür
kültür--Tanımlama
• Klasik yöntemler
–
Koloni morfolojisi
–
Gram boyama
–
Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans
–
Tanımlama disklerine duyarlılık
–
Katalaz
–
Spot indol
–
Lesitinaz, lipaz
–
Nitrat, üreaz, diğer…
35
Pophyromonas gingivalis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella intermedia
F. necrophorum
F. mortiferum
36
Bacteroides fragilis
Actinomyces israelii
Campylobacter ureolyticus
Actinomyces odontolyticus
37
Kültür
Anaerop kültür
kültür--Tanımlama
• Klasik yöntemler
–
Koloni morfolojisi
–
Gram boyama
–
Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans
–
Tanımlama disklerine duyarlılık
–
Katalaz
–
Spot indol
–
Lesitinaz, lipaz
–
Nitrat, üreaz, diğer
Metanol ile hızlı fiksasyon
38
Bacteroides fragilis
Fusobacterium nucleatum
Prevotella
F. mortiferum
39
C. tetani
Actinomyces
C.perfringens
40
Propionibacterium acnes
Kültür
Anaerop kültür-Tanımlama
• Klasik yöntemler
–
Koloni morfolojisi
–
Gram boyama
–
Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans
–
Tanımlama disklerine duyarlılık Primer plaklar/ subkültürler
–
Katalaz
–
Spot indol
–
Lesitinaz, lipaz
–
Diğer
41
Porphyromonas gingivalis
42
43
Kültür
Anaerop kültür-Tanımlama
• Klasik yöntemler
–
Koloni morfolojisi
–
Gram boyama
–
Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans
–
Tanımlama disklerine duyarlılık
–
Katalaz
–
Spot indol
–
Lesitinaz, lipaz
–
Diğer
Anaerop gram negatif basiller
44
Kanamisin (1000 μg)
Vankomisin (5 μg)
Kolistin (10 μg)
Bacteroides fragilis
45
Prevotella intermedia
46
Kültür
Anaerop kültür-Tanımlama
• Klasik yöntemler
–
Koloni morfolojisi
–
Gram boyama
–
Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans
–
Tanımlama disklerine duyarlılık
–
Katalaz
–
Spot indol
–
Lesitinaz, lipaz
–
Diğer
% 15 hidrojen peroksit
p-dimethyaminocinnamadehyde (DMACA)
Yumurta sarılı agar
47
Spot indol testi
48
Yumurta sarılı agarda lesitinaz ve lipaz aktiviteleri
Lesitinaz
Lipaz
49
Olgu--2
Olgu
• Soru 2- Bu olgunun aerop kültüründe üreme olmadı. Anaerop
kanlı agarda hemolitik koloniler üredi. Tanımlama ???
•Aerotolerans testi ?
•Kanlı agarda çift hemoliz zonu
•Hareket ø
•Spor ø
•Katalaz (-)
•Spot indol (-)
•Lesitinaz (+)
50
Kültür
Anaerop kültür-Tanımlama
• Klasik yöntemler
• Yarı otomatize sistemler
– Biyokimyasal sistemler: Bir gece inkübasyonu gerektirir
(API 20A, AN Mikroplak)
– Hızlı enzimatik sistemler: Bir gece inkübasyon gerekmez.
Birkaç saatte sonuç verirler (Rapid ID 32A, Crystal ANR ID)
• Moleküler yöntemler (16SrRNA)
• Gaz likit kromatografi, yağ asiti analizi
• MALDI-TOF
51
Anaerop duyarlılık testleri
Rutin olarak uygulanması
önerilmemekte
Uygulama endikasyonları
• Ciddi ve yaşamı tehdit eden enfeksiyonlarda
tedavinin yönlendirilmesi
• Belirli merkezlerde / bölgelerde belirli aralıklarla
duyarlılık paternlerinin saptanarak izlenmesi
• Yeni antibiyotiklere duyarlılıkların saptanması
52
Duyarlılık testlerinin uygulanmasın
ygulanmasınaa
karar verilirken dikkat edilecek noktalar
• Örnek alınırken normal flora ile kontaminasyon söz
konusu ise, duyarlılık testlerinin uygulanması tedaviyi
yanlış yönlendirir
• Patojen olma potansiyeli olan birden fazla bakteri izole
edildiğinde duyarlılık testlerinin
– Dirençli olduğu bilinen Bakterileri
kapsaması
gerekir
Bacteroides
türlerini
– Yüksek virülanslı
mutlaka
kapsamalıdır
53
Sonuç
Deri ve yumuşak doku örneklerinin mikrobiyolojik
incelemesinde ve sonuçların değerlendirilmesinde
önemli noktalar
– Örneğin nereden alındığının bilinmesi
– Doğrudan mikroskopik incelemenin yapılması
– Uygun kültür yöntemlerinin seçilmesi
– Etken olan bakteri yorumunun yapılabilmesi
54
Download

Kültür