EMBRĐYO TRANSFERĐ
Dr. Numan Akyol
Lalahan
Hayvancılık Merkez Araştırma Enstitüsü
lalahanakyol
1
lalahanakyol
2
EMBRĐYO TRANSFERĐNĐN AVANTAJLARI
Normalden 20 kat daha fazla sayıda yavru
Genetiğin %100’ünün kontrolü
Projeni test çalışmalarında etkinlik
Canlı hayvan nakil zorluğunun ortadan kalkması
Taşıyıcı annenin antikorlarından faydalanma
Verim yönünün değiştirilebilmesi
Etkin gen kaynağı muhafazası imkanı
lalahanakyol
3
EMBRĐYO TRANSFERĐNĐN AŞAMALARI
SÜPEROVULASYON
ÖSTRUS SĐNKRONĐZASYONU
UTERUS YIKAMASI
EMBRĐYO DEĞERLENDĐRME VE SINIFLANDIRMASI
EMBRĐYO DONDURULMASI VEYA TAZE TRANSFERĐ
lalahanakyol
4
Östrus Siklusunda hormon profilleri (Sığır)
östrojen
progesteron
LH
FSH
70
hormon konsantrasyonu
60
50
40
30
20
10
0
18 19 20 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0
1
2
3
siklus günleri
lalahanakyol
5
Pro-östrus
18-21.siklus günleri
Gerileyen bir CL
GnRH etkisi ile FSH
lalahanakyol
6
Östrus
12-18saat süreli
Gerilemiş bir CL
Fluktuan bir Graaf
Follikülü
Östrojenik etki
lalahanakyol
7
Met-östrus
Östrus bitiminden
sonraki 3gün
Gelişmeye aday bir
CL
Kanlı akıntı
lalahanakyol
8
Di-östrus
Siklusun en uzun
dönemi
10-14 gün
Olgun bir CL
Uterus gevşek
lalahanakyol
9
SÜPEROVULASYON
lalahanakyol
10
SÜPEROVULASYON
7.5MhZ
Fol
Fol
Fol
Fol
lalahanakyol
Fol
Linear Prob
Fol
11
SÜPEROVULASYON
Fl
Fl
Fl
Fl
Fl
Fl
Fl
Fl
Fl
Fl
lalahanakyol
Fl
5,0MhZ
Linear Prob
Fl
12
SÜPEROVULASYON
5,0MhZ
Linear Prob
lalahanakyol
13
SÜPEROVULASYON
5,0MhZ
CL
CL
Linear Prob
CL
CL
lalahanakyol
CL
14
SÜPEROVULASYON
5,0MhZ
Linear Prob
lalahanakyol
15
SÜPEROVULASYON
5,0MhZ
CL
Linear Prob
CL
CL
CL
CL
lalahanakyol
16
lalahanakyol
17
UTERUS
YIKAMASI
lalahanakyol
18
Embriyo Değerlendirilmesi ve
sınıflandırılması
SAFHA
16 HÜCRE
KALĐTE
MORULA.........................6 GÜN
MÜKEMMEL - ĐYĐ
KOMPAKT MORULA.......7
VASAT
ERKEN BLASTOSĐST.....7
ZAYIF
BLASTOSĐST..........................8
DEJENERE
GENĐŞLEMĐŞ BLASTOSĐST...8
UFO
HATCHING BLASTOSĐST
HATCHED BLASTOSĐST
lalahanakyol
19
lalahanakyol
20
Embriyo kalite sınıflandırmasında kriterler
(G.M.Lindner et al.,1983)
Mükemmel : Đdeal embriyodur, küresel, simetrik tarzda, renk ve yapısal
açıdan uniformite gösterir.
Đyi
: Önemsiz birkaç blastomer düzensizliği ve kopmaları,
düzensiz bir şekil, gözlenebilen birkaç vezikül varlığı.
Vasat
: Vezikül oluşumu ve ayrılmış birkaç blastomer gibi
gözlenen bazı problemlerin varlığı, %10-30 arasında
tespit edilen dejenerasyon ve düzensizlik.
Zayıf
: Ana embriyo kısmında gözlenen ayrılmalar, bir miktar
dejenere hücre, çok miktarda vezkül oluşumu, %30-50
arasında düzensizlik ve dejenerasyon.
lalahanakyol
21
lalahanakyol
22
lalahanakyol
23
lalahanakyol
24
lalahanakyol
25
lalahanakyol
26
lalahanakyol
27
lalahanakyol
28
lalahanakyol
29
lalahanakyol
30
lalahanakyol
31
lalahanakyol
32
lalahanakyol
33
lalahanakyol
34
lalahanakyol
35
ÜLKEMiZDE YAPILAN iLK EMBRĐYO TRANSFERĐ ÇALIŞMALARI
• 1981… TAVŞANLARDA (Kılıçoğlu ve Tekeli)
• 1983… FARELERDE (Ünal)
• 1984… KOYUNLARDA (Kılıçoğlu ve ark.)
• 1986… ĐNEKLERDE (Đleri ve Sayın)
• 1989… Đneklere dond. emb. Trans. (Sungur ve ark.)
• 1997… ANKARA KEÇĐLERĐNDE (Kılıçarslan ve Şenünver)
• 1997… KISRAKLARDA (Ekici)
• 2001… %70 GEBELĐK (Akyol ve ark.)
• 2005… Ülkemizin ilk IVF buzağısı (Akyol ve ark.)
• 2005… Ülkemizin ilk direkt transfer ve vitrifiye embriyo gebelikleri (Kızıl ve ark.)
• 2005… Ülkemizde ilk OPU çalışması (Akyol ve ark.)
lalahanakyol
36
ENSTĐTÜMÜZDE YAPILAN
EMBRĐYO TRANSFERĐ ÇALIŞMALARI
• 1989 yılında 64 baş Đsviçre Esmeri düveye dondurulmuş ithal Brangus
embriyosu nakli yapıldı ve %32.8 gebelik elde edildi (Sungur ve ark.
1989)
• 1991 yılında taze nakilden %22.2 gebelik elde edildi (Sungur ve ark.
1991)
• 1994 yılında 5 baş vericiden 24 adet embriyo alınıp, 17 embriyo
dondurulmuş ve 14 donmuş-çözünmüş embriyo naklinden %28.5 gebelik
elde edilmiştir. (Sungur, 1994)
• 2001 yılında 20 uterus yıkaması yapılmış 70 embriyo bulunmuş 10 adet
taze nakilden 7 gebelik elde edilmiştir. (Akyol ve ark. 2004)
•
lalahanakyol
37
Kısa süreli muhafaza
&
Embriyo muameleleri
lalahanakyol
38
Embriyo dondurulmasıyla ilgili gelişmeler
Yıl
1973
1979
1982
1983
1987
Araştırmacı
Wilmut & Rowson
Bilton & Moore
Renard et al.
Lehn-Jensen et al.
Massip et al.
Sığırlardaki ilk başarılı çalışma
Freezing of Embryo (DMSO)
Freezing of Embryo (Glycerol)
One Step Straw Method
Freezing of Bisected Embryo
Vitrifrication
lalahanakyol
39
Kısa süreli embriyo muhafazası
D-PBS + %10 - 20 Buzağı Serumu
* Embriyo elde edildikten sonra mümkün olduğunca çabuk
taşıyıcıya transfer edilmelidir.
* Transfer mediumu olarak kullanılabilir.
TCM199 + 10-20% FCS +
0.1mM beta-mercaptoethanol
* Đki gün embriyo kültürü yapılabilir (inkubatör şartlarında)
lalahanakyol
40
EMBRĐYO ĐLE ÇALIŞIRKEN...
a. Steril teknik ve uygulamalar
b. Kontaminasyon riski
c. Isı değişimleri
d. Ultravioleye maruz kalma
e. Medium
lalahanakyol
41
Embriyonun Transferi
* Cerrahi metot
* Cerrahi olmayan metot
Serviks kanalından
By-pass (Sugie’s method)
lalahanakyol
42
lalahanakyol
43
lalahanakyol
44
EMBRĐYO TRANSFERĐNDE
BAŞARIYI ETKĐLEYEN BAZI FAKTÖRLER
EmbrĐyo kalitesi
Transfer tekniği
Hijyenik kurallara uygunluk
CL tarafına transfer
Donor ve taşıyıcı arasındaki östrus sinkronizasyonu farkı
Taşıyıcının durumu (Đnek – Düve)
Taşıyıcının beslenme ve çevresel koşulları
lalahanakyol
45
Embriyo CL bulunan
tarafa transfer
edilmeli (ipsilateral
transfer)
Cerrahi olmayan
Cerrahi olmayan
metotda transfer
yerinin derinliğinden
ziyade uterus
endometriumuna bir
zarar verip
vermemek kanusu
daha önemli
Cerrahi
CL
lalahanakyol
46
KATETERĐN SERVĐKSTEN GĐRĐŞĐ 1
lalahanakyol
47
2
lalahanakyol
48
Memeli embriyolarının ilk başarılı dondurma çalışmaları
Tür
Araştırmacı
Yıl
Fare
Whittingham ve ark.
1972
Rat
Whittingham
1975
Tavşan
Bank ve Mourer
1974
Sığır
Wilmut ve Rowson
1973
At
Yamamoto ve ark.
1982
Koyun
Willadsen ve ark.
1974
Keçi
Bilton ve Moore
1976
Đnsan
Trounson ve ark.
1982
lalahanakyol
49
Sığır embriyo dondurulmasının tarihçesi
Author
Year
Cryoprotectant
Notes
Wilmut and Rowson
1973
DMSO
Leibo et al.
1982
Glycerol
Renard et al.
1982
Glycerol
Leibo
Glycerol
Glycerol
One step straw method
Willadsen et al.
1983
1984
1983
1985
1978
One step dilution method
using sucrose
One step dilution method
using sucrose
One step straw method
DMSO
Direct transfer
Massip and Van der Zwalmen
1984
Glycero + sucrose
Direct transfer
Massip et al.
1987
Glycero + sucrose
Direct transfer
Suzuki et al.
1990
Direct transfer
Dochi et al.
1991
Propylene
glycol(sucrose)
Ethylene glycol
Voelkel and Hu
1992
Ethylene glycol
Direct transfer
Suzuki et al.
lalahanakyol
First calves
Direct transfer
50
EMBRĐYO DONDURULMASI
Klasik embriyo dondurulması
Buz kristalleri oluşumu
Programlı soğutma için dondurma cihazı gerekli
Vitrifikasyon
Buz kristali oluşmaz
Embriyo sıvı azot içerisine direkt olarak alınır, dondurma
cihazı gerekmez
lalahanakyol
51
Dondurma Metotları
Aşamalı metot
%10 (1.36M) Gliserol (Bilton & Moore, 1979)
Direkt Transfer metodu
%10 (1.8M) Etilen glikol (Dochi et al, 1991)
lalahanakyol
52
Embriyo dondurulmasının önemli aşamaları
(Embriyo toplanması)
↓
Kriyoprotektanlarla ekilibrasyon
Soğutma & Seeding
LN2
↓
Çözündürme
Kriyoprotektanlardan arındırma
Canlılık kontrolü
↓
(Transfer)
lalahanakyol
Direkt transferde
gerekmez
53
lalahanakyol
54
S e elalahanakyol
d i n g
55
VĐTRĐFĐKASYON NEDĐR ?
Vitrifikasyon buz kristalleri oluşmadan, embriyonun
bulunduğu ortamı cam şeklinde katılaştırmak
anlamındadır.
Bu amaçla ekstrem bir viskozite (kriyoprotektan
yoğunluğu) ve soğutma süresi kullanılır.
lalahanakyol
56
Çeşitli Vitrifikasyon Solusyonları
Araştırmacı
(yıl)
Kriyoprotektan
Hayvan
(Aşama)
Rall,WF
& Fahy,GM
(1985)
DMSO %20.5 (w/v)
Asetamid %10.5 (w/v)
PG %10 (w/v)
PEG %6 (w/v)
Fare
(8-Hücre)
Scheffen,B.
et al (1986)
PG
GL
%25 (v/v)
%25 (v/v)
Fare
(KM, EB)
Massip,A.
et al (1987)
PG
GL
%25 (v/v)
%25 (v/v)
Sığır
(KM, EB)
Kasai,M.
et al(1990)
EG %40 (v/v)
Fikol %18 (w/v)
Sakkaroz 0.3 M
Fare
(M)
Yang, et al
(1992)
GL
EG
Sığır
(BL-IVF)
%25 (v/v)
%25 (v/v)
lalahanakyol
57
lalahanakyol
58
lalahanakyol
59
lalahanakyol
60
lalahanakyol
61
Embriyo Kültürü
lalahanakyol
62
Embriyo Kültürü için Kullanılan Mediumlar
Posfat Tampon Solusyonu (PBS)
• Đnkubatör dışındapH değişimlerinden korunmak için
oldukça iyi bir tampon
• Uzun süreli kültür için uygun değil
Bicarbonate buffered media
• Ham's F10
• BMOC-3
• Menezo's B2
• TCM-199
38.5 ’de %5 CO2 inkubasyon
lalahanakyol
63
Mikrodroplar içerisinde ve inkubatörde kültür için...
lalahanakyol
64
Download

EMBRĐYO TRANSFERĐ