Kültür Yapılmaksızın Tavşanlarda Paratiroid
Allotransplantasyonu
Bezmialem Vakıf Üniversitesi Genel Cerrahi AD, Endokrin Cerrahisi BD
INSERT
LOGO HERE
Tıp Fakültesi Üçüncü Sınıf Öğrencileri
Hakan Atasoy, Merve Elif Ercivan
Giriş
Serum fosfor seviyeleri: başlangıçta tüm olguların ortalama fosfor seviyeleri 6.62±0.57 mg/dL idi(0.gün). Postoperatif 10.gün
ortalama serum fosfor seviyeleri 9.38±0.63 mg/dL’ye yükseldi. Fakat allotransplantasyondan sonra progresif olarak 2.64±0.74
mg/dL (p=0.002) ve 4.46±1.06 mg/dL (p=0.007, Tablo 3) değerlerine düştü. Araştırmanın ilk ve son günlerinde ortalama serum
Kalıcı hipoparatirodizm (KH) ciddi klinik bir sorundur (1). En önemli etiyolojik faktörü ise tiroid cerrahisidir (2). KH; total
tiroidektomi yapılan hastaların %3-5’inde görülür ve bunların da %6-7’sinde total tiroidektomiyle beraber sentral ve unilateral lenf kalsiyum ve fosfor seviyeleri karşılaştırıldığında istatiksel anlamlı fark bulunamadı (p>0.05 ve p=0.176 ) (Tablo 4).
Uygulamadan sonra herhangi bir yan etki veya komplikasyon gözlenmedi. Sadece paratiroidektomiden hemen sonra bir mortalite
nodu diseksiyonu yapıldıktan sonra, %16’sında total tiroidektomiyle birlikte bilateral lenf nodu diseksiyonu yapıldıktan sonra
oluştu. Allotransplante edilen tüm paratiroid hücreleri, lenfositik infiltrayon ve nekroz da dahil olmak üzere herhangi bir red
görülür (3). KH in en önemli sonucu hipokalsemidir çünkü KH’de görülen yorgunluk, halsizlik, tremor, işgücü kaybı ve
göstermeden normal doku yapısına kavuştu.
myokardiyal disfonksiyon gibi komplikasyonlar direkt kronik hipokalsemiyle ilişkilidir (1). Şu an kalsiyum ve vitamin D3
takviyesi semptomları rahatlatmak için sadece yapılan yöntemlerdir, bununla birlikte zor ve pahalı bir tedavi yöntemi olmasının
Day 0
Postop Day 3
Postop Day 10
After Trans Day After Trans Day After Trans Day
ötesinde, bu takviyeler hipo ve hiperkalsemiyle ilişki komplikasyonlara neden olan negatif feedback mekanizmalarının yokluğuna
2
10
15
bağlı over ve under doz vitamin d3 ve kalsiyum ürünleriyle ilişkilidir (1,4,5).
Calcium (mg/dL)
Paratiroid dokusun oto ve allotransplantasyonu yeni terapatik seçenekler olarak denenmektedir (6,7). mikroencapsulasyon,
cultivation(kültüre alma) ve direkt transplantasyon en çok uygulanan parotirod allotranplantasyon teknikleridir (6). Bu
araştırmada, paratiroid hücrelerinin kültür yapılmadan kriyoprezervasyondan sonra allotrasnplantasyonunu, tavşanlarda ilk kez
uygulanan bir teknik olarak sizlere sunduk.
Phosphorus
(mg/dL)
15.82±1.02
6.58±1.06
6.66±0.7
15.10±0.34
16.54±0.68
15.98±1.25
6.62±0.57
8.66±1.33
9.38±0.63
2.64±0.74
4.96±0.59
4.46±1.06
Tablo-2 Serum fosfat ve kalsiyum değerlerindeki değişiklikler
Posttransplantation
period
p
Day 0
After Trans Day 0
0.176
0.499
Day 0
After Trans Day 2
0.011
After Trans Day 10
0.447
Day 0
After Trans Day 10
0.237
Day 0
After Trans Day 15
0.554
Day 0
After Trans Day 15
0.176
Postop Day 10
After Trans Day 2
0.108
Postop Day 10
After Trans Day 2
0.002
Postop Day 10
After Trans Day 10
0.002
Postop Day 10
After Trans Day 10
0.011
Postop Day 10
After Trans Day 15
0.004
Postop Day 10
After Trans Day 15
0.007
Pre-transplantation
Period
Pre-transplantation
period
Post-transplantation
period
p
Day 0
After Trans Day 0
0.022
Day 0
After Trans Day 2
Day 0
Tablo-3 Çalışma esnasında serum kalsiyum değerlerinin
karşılaştırılması
Tablo-4 Çalışma esnasında serum fosfat değerlerinin karşılaştırılması
Tartışma
Materyal ve Yöntemler
Metodoloji lokal etik kurulu tarafından onaylandı ve araştırma Bezmialem Vakıf Üniversitesi Deney Hayvanları Üretim ve
Araştırma Laboratuarında gerçekleştirildi. Tüm protokoller Helsinki Deklarasyonu’nun laboratuar hayvanlarının kullanım ve
bakım ilkelerine uygun olarak ilerledi. 6 beyaz dişi Yeni Zellanda tavşanı (ortalama ağırlık, 2800±410 g; ortalama yaş, 4 yıl)
yavrulama olmaksızın kullanıldı. Her bir tavşan alt ve üst kısımlar paslanmaz metalden tel örgüyle çevrili kafeslere konuldu. Kafes
tabanı her gün değiştirilmek üzere talaşla kaplandı. Tavşanlar oda sıcaklığında uygun havalandırma koşullarında tutuldu. Su ve
yiyecek için tek yöne açılan standart plastik kaplar kullanıldı. Tavşanlar küçük laboratuar hayvanları için üretilen pellet tipi yemle
beslendiler. Cerrahi girişimden önce, kalsiyum ve fosfor seviyeleri için örnek alındı (0.gün) Yemek verilmeden geçen bir geceden
sonra tavşanlar Ketamine (Ketalar®, Parke Davis Co.) 40 mg/kg body weight and Xylazine (Rompun®,
Bayer Co.) 5 mg/kg body weight ile anestezi edildi. Tavşanlar traşlandıktan sonra ortahat longitudinal insizyonuyla açılan anterior
boyun bölgesine povidone iodine (Batticon®, 10 g Povidon-iyot, Adeka Ilac) ile antisepsi sağlandı. Tiroid ve peritiroidal dokular
tamamen görünür hale getirildikten sonra paratiroidektomi mikrocerrahi yöntemle gerçekleştirildi. Erken postoperatif
komplikasyon gelişmedi fakat bir tavşan (vaka 3) postoperatif 1. Gün ex oldu. Postoperatif 3. ve 10. Günlerde serum kalsiyum ve
fosfor seviyeleri için örnek alındı. Eskite edilen dokular aşağıda anlatılar tekniğe göre kriyoprezerve edildi.
KRİYOPRESEVASYON
6 tavşandan cerrahi olarak çıkarılmış dokular iki gruba ayrıldı. Vaka 1 ve 2 birinci grup, vaka 3,4 ve 6 ikinci grup olarak
düzenlendi. Paratiroid dokuları her bir grupta toplandı ve 3 temel adımda kriyopreserve edildi. Hücre izolasyonu, viabilite
(canlılık),hücre sayımı ile birlikte son olarak sıvı nitrojen tanklarda saklandı. Dokular çıkarıldıktan hemen sonra ice chilled RPMI
1640 media ye konuldu ve hücreler izole edildi. Tüm protokoller steril koşullarda gerçekleştirildi. Tüm alet ve solüsyonlar
otoklavlama, filtreleme veya uv ile yapıldı. Tüm dokular nazikçe çelik filtrelere yerleştirildi ve rPBS+5% FCS (medium I)’e
konuldu. Tüm dokudan hücreler ayrılana kadar şırıngadan alınan bir piston yardımıyla tüm dokular ezildi. Medium 1 de yüzen
hücreler hücre süzgecinde filtre edildi. Bu işlemler sırasında bazı hücreler zarar görüp parçalanabilir ve böylece DNA içerikleri
solüsyona çıkabilir ve bu DNAlar, DNAaz eklenmesiyle önlenebilecek bir hücre agregasyonuna neden olabilir, bu nedenle önce
tüm dokular ayrılmalı ve hücre filtresinden geçirilmeli daha sonra hücre sayısının ve bu hücrelerin canlılığı tespit edilmelidir.
Hücrelerin canlılığı Vi-Cell (Beckman Coulter) ile tespit edildi ve trypan blue boyama metoduyla canlı hücreler sayıldı. Canlı
hücreler kriyoprezervasyon için şu basamaklarla hazırlandı: 500 μl FBS 20% DMSO (400 μl FBS+100 μl DMSO) solusyonu
hazırlandı ve buzda çevrelenmiş 0.25 × 106 hücre içeren 500 μl FBS solüsyonuna yavaşça döküldü. Solüsyonun sıcaklığı yavaşça
azaltıldı ve sıvı nitrojen tanklarda saklandı.
Canlı Hücreler
Yaşayanların Oranı
Toplam hücre
1. Grup
1.5 × 106
57.9%
2.5 × 106
2. Grup
3.28 × 106
54.7%
6 × 106
Tablo-1 Çıkarılan paratiroit hücreler ve yaşama oranları
TRANSPLANTASYON
Postoperatif 10. Gün, subkutan 100 mg/kg prednisolone (Prednol-L 40 mg Ampul®, Mustafa Nevzat Co.) başlama dozu olarak
vakalara uygulandı, gelecek 15 gün subkutan 10 mg/kg/gün olarak devam edildi. Hücre solüsyonları, 37 ̊C su banyosunda ısıtıldı.
2. Grup hücreleri eşit olarak ikiye ayrıldı, 1 ve 2. Vakanın sağ üst ekstremitesinin süperior bölümüne intramuskuler enjeksiyon
yapıldı. Birinci grup hücreleri eşit 3 parçaya bölündü ve vaka 4, 5 ve 6’ya aynı şekilde enjekte edildi. Post transplat 2, 10 ve 15.
Günlerde serum kalsiyum ve fosfor seviyelerinde örnekler alındı. 15. Gün tavşanlar sakrifiye edildi ve operasyon alanları olan
paratirodektomi ve transplantasyon alanı histopatolojik değerlendirme için rezeke edildi. Primer değerlendirme parametrelerini
serum kalsiyum ve fosfor seviyeleri, sekonder parametreyi ise allotransplantasyonla ilişkili komplikasyonları oluşturdu.
Allojeneik paratiroid dokularının transplantasyonu cerrahi olarak indüklenmiş hipoparatiroidizm tedavisinde kullanıldı. Fakat,
yöntemin başarısı doku reddi ve graft nonfonksiyonu gibi bazı immünolojik mekanizmalar tarafından sınırlandırılmıştı (8). Bu
nedenle; paratiroid dokularının böbrek kapsülü, cerebral ventrikül gibi immümolojik ayrıcalıklı bölgelere allotransplantasyonu,
uzun süreli ve kısa süreli immünsupresyon, organ kültürüyle immün alterasyon, preoperatif passenger lökosit deplesyonu, x-ray
irradyasyonu, mikrokapsüllerle immun koruma konuları araştırıldı (8-10).
Genel kabule göre; uzun süreli immünsupresyon infeksiyon ve malignansilere bağlı kalıcı hipoparatiroidizmin bir gerekçesi
olarak gösterilmemiştir (9,11). Bazı çalışmalarda, sistemik veya topikal kısa süreli immünsupresyon trasplante edilen graftların
survisini uzattığı gösterilmiştir (8,9). Bu yöntemlerle uzun süreli normokalsemi sürdürülmesine rağmen, uzun süreli graft
fonksiyonuna ulaşılamamıştır (9). Paratiroid hormnunun substitüsyonu ve özel doku kültüründen sonra paratiroid hücrelerinin
implantasyonu, immunsupresyonsuz kültüre ve mikroenkapsüle edilmiş paratiroid doku transplantasyonunun tek alternatifleridir
(11).
Graft reddi ve nonfonksiyonu allotransplantasyonun ana problemlerindendir (8,12). Transplantın kuvvetli human leucocyte
antigen (HLA) class 2 eksprese eden antijen sunan hücrelerden yoksunluğu, transplante edilen organ veya dokunun uzun süreli
survi ve fonksiyonunu mümkün kılar (6,13-16). Paratiroid hücrelerinin HLA class 2 antijen ekspresyonuna negatif, HLA class 1
antijenlerine ise zayıf pozitif olduğu gösterilmiştir. Paratiroid graftlarının allotrasplantasyonu kedi, köpek, rat gibi türlerin
kullanıldığı farklı deneysel çalışmalarda farklı başarı oranlarıyla gerçekleştirilmiştir (9,10,12). Yaptığımız çalışma kültür
yapılmadan paratiroid dokusun allotransplantasyonun tavşanlar için yapıldığı ilk çalışmadır.
Araştırmamızda, serum kalsiyum ve fosfor seviyeleri gibi biyokimyasal analizlerle allotransplante edilen paratiroid dokularının
fonksiyonunu değerlendirdik. İstatiksel analizler, total paratiroidektominin anlamlı derecede hipokalsemiye neden olduğunu ve
bunun allotransplantasyonla ortadan kaldırıldığını ortaya koymaktadır(p=0.001). Benzer değişiklikler serum fosfor seviyelerinde
de gözlemlenmiştir(p=0.001). Buna rağmen; serum fosfor seviyeleri 2.64±0.74 mg/dL’ye indi ve bu değer transplantasyondan
sonraki 2. Gündeki baseline değerinden daha düşüktü ve deneyin sonuna kadar baseline değerlerine ulaşılamadı. Hipokalseminin
total paratiroidektomiyle indüklenmesinden sonra, allotransplantasyon serum kalsiyum seviyelerinin transplantasyondan sonraki
2. Gündeki baseline seviyelerine dönmesine neden oldu. Allotransplante edilen graftların survilerinin uzunluğu bu çalışmanın
amacı dışında olmasına rağmen, transplantasyondan sonraki 15.gün her hangi bir takviye olmadan normokalsemiyle graftlar
fonksiyon görüyorlardı.
Biz bu çalışmada ilk olarak hassas bir canlı olan tavşanda kültür yapılmaksızın paratiroid allotransplantasyonunun mümkün
olduğunu ortaya çıkardık. Bu sonuçlar, kültüre edilmemiş paratiroid hücrelerinin transplantasyonunu insanlar için alternatif ve
güvenli bir yaklaşım olabileceğini desteklemektedir.
Kaynaklar
1. Khan MI, Waguespack SG, Hu MI. Medical management of postsurgical hypoparathyroidism.Endocr Pract. 2011;1:18–25. [PubMed]
2. Glockzin G, Hornung M, Kienle K, Thelen K, Boin M, Schreyer AG, Lighvani HR, Schlitt HJ, Aqha A. Completion thyroidectomy: effect of timing on clinical complications
and oncologic outcome in patients with differentiated thyroid cancer. World J Surg. 2012;36:1168–1173. [PubMed]
3. Giordano D, Valcavi R, Thompson GB, Pedroni C, Renna L, Gradoni P, Barbieri V. Complications of central neck dissection in patients with papillary thyroid carcinoma:
results of a study on 1087 patients and review of the literature. Thyroid. 2012;22:911–917. [PubMed]
4. Lee MK, Bae YH. Cell transplantation for endocrine disorders. Adv Drug Deliv Rev. 2000;42:103–120. [PubMed]
5. Pattou F, Combemale F, Fabre S, Carnaille B, Decoulx M, Wemeau JL, Racadot A, Proye C. Hypocalcemia following thyroid surgery: incidence and prediction of
outcome. World J Surg.1998;22:718–724. [PubMed]
6. Saxe A. Parathyroid transplantation: a review. Surgery. 1984;95:507–526. [PubMed]
7. Hasse C, Klöck G, Schlosser A, Zimmermann U, Rothmund M. Parathyroid allotransplantation without immunosuppression. Lancet. 1997;350:1296–1297. [PubMed]
8. Nawrot I, Woźniewicz B, Tołłoczko T, Sawicki A, Górski A, Chudziński W, Woitaszek M, Grzesiuk W, Slaowski D, Karwacki J, Zawitkowska T, Szmidt J. Allotransplantation
of cultured parathyroid progenitor cells without immunosuppression: clinical results. Transplantation. 2007;83:734–740.[PubMed]
9. Timm S, Otto C, Begrich D, Illert B, Hamelmann W, Ulrichs K, Thiede A, Timmermann W. Short-term immunosuppression after rat parathyroid
allotransplantation. Microsurgery. 2003;23:503–507.[PubMed]
10. Timm S, Hamelmann W, Otto C, Gassel AM, Etzel M, Ulrichs K, Thiede A, Timmermann W. Influence of donor MHC class I antigen expression on graft survival after rat
parathyroid allotransplantation. Langenbecks Arch Surg. 2001;386:430–433. [PubMed]
11. Hasse C, Bohrer T, Barth P, Stinner B, Cohen R, Cramer H, Zimmermann U, Rothmund M. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental
hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J Surg. 2000;24:1361–1366. [PubMed]
12. Friedman M. Factors influencing parathyroid allotransplantation in rats. Laryngoscope.1986;96(Suppl 39):1–16. [PubMed]
13. Bloom AD, Economou SG, Baker JW, Gebel HM. Prolonged survival of rat parathyroid allografts after preoperative treatment with cyclosporine A. Curr Surg. 1987;44:205–
207. [PubMed]
14. Schulze M, Fändrich F, Ungefroren H, Kremer B. Adult stem cells-perspectives in treatment of metabolic diseases. Acta Gastroenterol Belg. 2005;68:461–465. [PubMed]
15. Bjerneroth G, Juhlin C, Rastad J, Akerström G, Klareskog L. MHC class I and II antigen expression on parathyroid cells and prospects for their allogenic
transplantation. Transplantation. 1993;56:717–721.[PubMed]
16. Woźniewicz B, Migaj M, Giera B, Prokurat A, Tołłoczko T, Sawicki A, Nawrot I, Gorski A, Zabitkowska T, Kossakowska AE. Cell culture preparation of human parathyroid
cells for allotransplantation without immunosupression. Transplant Proc. 1996;28:3542–3544. [PubMed]
Sonuç
Ortalama kalsiyum ve fosfor seviyeleri Tablo 2’de gösterildi. Her iki elektrolit seviyelerindeki değişimler istatistiksel olarak anlamlı
bulundu (p=0.001 ikisi için de).
Serum kalsiyum seviyeleri: başlangıçta tüm olguların ortalama kalsiyum seviyeleri 15.82±1.02 mg/dL ‘di(0.gün). Postoperatif
10.gün 6.66±0.7 mg/dL’ye düştü. Fakat allaotransplantasyondan sonra progresif olarak 16.54±0.68 mg/dL (p=0.002) ve 15.98±1.25
mg/dL . (p=0.004, Tablo 3) değerlerine yükseldi.
Poster template by ResearchPosters.co.za
iletişim
Hakan Atasoy
[email protected]
Download

100cm by 100cm Poster Template