Anaerop bakterilerin “Matrix
Matrix--Assisted Laser
Desorption IonizationIonization- Time of Flight Mass
Spectrometry””(MALDI
Spectrometry
(MALDI--TOF) yöntemiyle
tanımlanmaları
Işın Akyar1, Görkem Yaman1, Serpil Ercis2, Simge Can2
1Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,
İstanbul
2Acıbadem Labmed Klinik Laboratuvarları, İstanbul
Amaç
Matriks aracılı lazer dezorpsiyon iyonizasyon uçuş
zamanı kütle spektrometresi – matrix assisted laser
desorption ionization time of flight mass
spectrometry (MALDI TOFTOF-MS) bakteri ve mayaların
hızlı tanımlanmasında yaygın bir şekilde kullanılmaya
başlanmıştır.
1960’lı yılların başlarında
1960’
gösterilmiştir.
Bu da “laser desorption (LD)
(LD) ionisation
ionisation(lazer
(lazer
salınımına bağlı iyonizasyon
iyonizasyon))” yöntemlerinin kaynağı
olmuştur.
Daha sonraki yıllarda, yöntem uçucu olmayan
biyopolimerler ve organik makromoleküllerin uçuşunu
sağlayacak şekilde geliştirilmiştir.
LD’nin gerçekten başarılı olması TOF kütle analizörleri
LD’
ile birlikte olması ile sağlanmıştır.
1987 yılında, Michael Karas and Franz Hillenkamp
matrix kullanımını devreye sokarak kütle
kısıtlamasından kurtulmuşlardır.
Bu matriksle birlikte incelenecek olan analit bir prob ya
da metal plak üzerinde karıştırıldıktan sonra lazer
ışınları atışı uygulanır.
Her bir lazer atımında hemen hemen tam olarak
iyonların patlaması sağlanır, böylelikle atımdan atıma
verimliliği arttırır.
“Matrix
atrix--assisted laser desorption/ionization
(MALDI)”
(MALDI)
” bu şekilde bulunmuştur.
bulunmuştur.
Daha sonra Koichi Tanaka’
Tanaka’nın yaptığı çalışmalarla
biyolojik makromoleküllere de MALDI uygulanabildi.
Bu da onun John Fenn ile birlikte 2002 yılında Nobel
ödülü kazanmasını sağladı.
MALDI’nin mekanizması üç basit basamaktan ibarettir:
MALDI’
1. Uygun bir solüsyon oluşturmak:
oluşturmak: Matriksin birbirinden
tümüyle ayrılmış analit moleküllerine erişebilmesi için
gereklidir.
Bu durum analitin stabil olarak ışınlanması için gerekli olan
homojen solüsyonun oluşmasını kolaylaştırmaktadır.
2. Matrix Uyarımı
Uyarımı::
Lazer ışını matriksmatriks-analit solüsyonu üzerine odaklanır.
Lazer sıklığı ile birlikte matriks hızlı titreşimli uyarılara yol
açarak katı solüsyonun parçalanmasına yol açar.
Yüzeyden fışkıran demetler içersinde matriks ve tuz
iyonlarıyla çevrelenmiş analit moleküllerini içerirler.
Matriks molekülleri demetlerden uçarak analiti serbest
olarak gaz fazında bırakırlar.
3. Anal
Analiit İy
İyoni
onizzasyonu
syonu::
Işıkla uyarılmış matriks molekülleri proton transferi yolu ile
analite doğru stabilize olurlar.
Bu işlem sırasında analite katyon tutunması da
desteklenmektedir. Tipik [M+X]+ (X= H, Na, K etc.) anali
analit iy
iyon
onları
ları
oluşmaktadır.
Bu iyonizasyon reaksiyonları yüzeyin hemen üzerinde parçalanmış
matriks--analit reaksiyon bulutunda gerçekleşmektedir.
matriks
Oluşan iyonlar incelenmesi için kütle spektrometrisine
gönderilmektedir.
Anaerop bakterilerin tanımlanmasında
MALDI TOFTOF-MS
Anaerop bakteri türlerinin tanımlanmaları
rutin laboratuvar işlemleri sırasında zor
olabilmekte ve uzun sürebilmektedir.
Bu çalışmanın amacı, anaerop bakterilerin
MALDI TOFTOF-MS yöntemiyle kısa sürede,
kolayca ve güvenilir bir şekilde
tanımlanmalarının değerlendirilmesidir.
Maldi--tof MS çalışma yöntemi:
Maldi
MALDI-TOF MS’
MALDIMS’de çalışılan izolat formik asit ekstraksiyon
yöntemi ile “polish target “ olarak adlandırılan metal bir plak
üzerine :
300 ul steril distile su içine bakteri kolonisi
Üzerine 900 ul etanol
Eklenir vortekslenir
Santrijüj edilir süpernatan atılır, işlem bir kez daha tekrarlanır.
50 ul %70 formik asit solüsyonu pellet üzerine eklenir. 50 ul
asetonitril eklenir karıştırılır. Santrifüjlendikten sonra
süpernatandan 1ul polish target üzerine konur.
Üzerine 2ul bir matriks solüsyonu eklenerek havada kurutulur.
Matriks içerisinde :alfa siyano 4 hidroksi sinnamic acid(HCCA) ve
solvent olarak da trifluoroasetik asit(TFA) ve asetonitril(ACN)
bulunmaktadır.
Daha sonra polish target cihaza yüklenir.
Cihaz içerisinde lazer ışını verilerek izolat iyonize moleküller haline
dönüşür. Uçuşan moleküller bir detektör yardımı ile toplanır.
Genellikle, tek yükü olan yalnızca tek bir iyonize tür oluşur ve
“Biotyper
Biotyper”
” ile mikroorganizma tiplendirmeleri yapılır.
İşlem ortalama 1313-15 dk içerisinde gerçekleşmekte ve otomatize
sistemlerle mikroorganizma tanımlanmasına göre çok daha kısa sürede
ve doğru bir şekilde sonuçlanır.
Kısaca:
İzolatlar metal bir plak üzerine kürdanla sürülür, matriks
solüsyonu ile birlikte havada kurutulur.
Aygıt içine yerleştirilip lazer ışınları ile vuruşlar yapıldıktan
sonra, matriks ışığı emerek ilgilenilen molekül(proteinler) haline
dönüştürür.
Genellikle, tek yükü olan yalnızca tek bir iyonize tür oluşur ve
“Biotyper
Biotyper”
” ile mikroorganizma tür tanımlamaları yapılır.
Gereç ve yöntem
Bu çalışmada Schaedler Agar’
Agar’da üremiş ve
aerotolerans ile anaerop bakteri oldukları kanıtlanmış
olan bakterilerin tanımlamalarında kütle
spektrometrisi yöntemine dayanan MALDIMALDI-TOF MS
yöntemi kullanılmıştır.
Çalışmamıza Şubat 20112011-Eylül 2011 arasında
kurumumuza başvuran 215 hastadan istenen anaerop
kültür örnekleri dahil edilmiştir.
Bu örnekler çalışılmadan önce:
Rutin kalite kontrol çalışması
Bacteroides fragilis ATCC 25285 referans suşu
Dış kalite kontrol örneği (Finegoldia
(Finegoldia magna)
magna)
çalışılmıştır.
Schaedler Agar’
Agar’da anaerop olduğunu düşünülerek aerotolerans
çalışılan ve anaerop olduğu kesinlik kazanan bakteriler VITEK 2
(Biomerieux, Fransa) otomatize sistemi ve MALDIMALDI-TOF yöntemi
ile tanımlanmıştır.
Bu örneklerde VITEKVITEK-2 ve MALDIMALDITOF yöntemleriyle 20 anaerop
bakteri saptanmıştır.
Bölüm
Sayı
Genel Cerrahi
6
Acil
4
Beyin Cerrahi
2
Örnek türü
Sayı
Püy
12
Kan
3
2
Biyolojik sıvı
2
Kardiyovasküler
Cerrahi
1
Ameliyat
materyali
1
Kulak Burun
Boğaz
1
Bronkoalveoler
lavaj
1
Onkoloji
1
Kateter ucu
1
Göz
1
Göğüs Hastalıkları 2
İç Hastalıkları
Tanımlanan Anaerop Bakteri
Sayı
Bacteroides fragilis
11
Gemella morbillorum
3
Actinomyces spp.
3
Fusobacterium necrophorum
1
Prevotella spp.
1
Peptostreptococcus anaerobius
1
Örneklerin %60’
%60’ını oluşturan püy
örneklerinde en çok üreyen anaerop bakteri
ise %58 ile Bacteroides fragilis olmuştur.
MALDI-TOF sonuçları VITEK 2 otomatize sistemi ile %
MALDI100 uyumlu sonuçlar vermiş, referans suş ve dış kalite
kontrol örneklerinde de doğru okuma sağlamıştır.
Çalışma 20 hasta örneği ve kalite kontrollerle
yapılmıştır. Daha güvenilir bir istatistik için çalışılan
örnek sayısının arttırılması gerekmektedir.
Bu nedenle bu çalışma bir ön hazırlık çalışması olarak
kabul edilmelidir.
Bacteroides fragilis
Sonuç
Anaerop bakterilerin tanımlanmasında
MALDI--TOF MS yöntemi ile VITEK 2 otomatize
MALDI
sistemi kıyaslanarak MALDIMALDI-TOF MS
yönteminin kısa sürede ve doğru sonuç veren
maliyet--etkin bir yöntem olduğu gösterilmiştir.
maliyet
Daha fazla çalışma yapılarak daha geniş bilgi
edinilmesi gerekmektedir.
Teşekkürler…
Download

(Ceza İnfaz Kurumu Katibi) Aday Tespit Lİstesi