Klinik Virolojide
Moleküler Yöntemlerin
Kullanımı
Doç Dr. Kenan Midilli
İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi
Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
Geleneksel viroloji


Altın standart: Hüce kültürü ile virusların
izolasyonu
Kısıtlılıkları:
- sonuç alma süresinin uzun olması
- Teknik güçlükler, güvenlik sorunları
- Hücre ve/ya da doku sağlamada güçlükler
- Tüm olası virusları üretebilecek tek bir
hücre serisinin olmaması
- Kontaminasyon sorunları
Viral seroloji
Hastalığın akut döneminde antikorların
henüz gelişmemesi
 Doğrulama: Akut-nekahat dönemi
karşılaştırması
 Antijen saptama: duyarlılık ve özgüllük
sorunları; farklı tiplerin saptanmasında
güçlükler

Kapsamlı bir viroloji laboratuvarının


Daha çok epidemiyolojik veri sağlayan, klinikte
hastanın bakımına doğrudan katkı sağlayacak
veri üretmeyen, genellikle belli araştırma
merkezleri ile kısıtlı bir laboratuvar olarak
kalmasına neden oldu
Antiviral tedavi seçeneklerinin yok/son derece
kısıtlı olması; çoğu viral infeksiyonun özgül
tedavisiz iyileşmesi de zorlayıcı bir talebin
gelmemesine neden oldu
1980 sonrasında….




Antiviral ilaçlarda patlama ve beraberinde gelen antiviral direnç sorunu
Yeni virusların ortaya çıkması
Transplantasyon ve bağışıklık sorunu olanlardaki viral infeksiyonların
öneminin anlaşılması
Özellikle daha hızlı ve kantitiatif sonuçlarla hasta tedavi sonuçlarında
sağlanan iyileşmeler ile birlikte:
ZAMANINDA ve HASTALARIN TANI, TEDAVİSİ ve
İZLENMESİNDE BELİRLEYİCİ ROL OYNAYAN SONUÇLARI
VEREBİLECEK BİR KLİNİK LABORATUVARA GEREKSİNİM
DOĞDU
Bu gereksinimi karşılamak için:
Daha hızlı sonuç veren hücre kültür
yöntemleri: Shell-vial, hibrid hücreler,
genetiği-değiştirilmiş hücreler…
 Hızlı antijen testleri: Lateral akış, partikül
agglutinasyon…
 Hibridizasyon yöntemleri

Nükleik asit amplifikasyon teknikleri
ve diğer moleküler yöntemler
1980’lerin sonunda çığır açıcı oldu
Üstünlükleri:
 Hızlı sonuç vermeleri
 Daha duyarlı ve özgül sonuç vermeleri
 İlk yatırım maliyetlerinin giderek düşmesi
 Kantitatif sonuç vermeleri
 İyi standardize edilmiş ticari kitlere
dönüştürülmeleri
 Teknik iyileştirmeler
 Alttiplerin ayırtedilmesine olanak vermeleri
Kısıtlılıkları:
 Teknik karmaşıklık, deneyim gerektirmeleri
 Kontaminasyon sorunları
 Genellikle tek bir etkene yönelik olarak
tasarlanmış olmaları
 Bazı klinik durumlar açısından hala yavaş
sonuç veriyor olmaları
 Biyolojik örneklerde inhibisyon sorunları
 Standardizasyon sorunları
 Maliyet yüksekliği
Bunların aşılmasında:




Real time PCR ve diğer saptama sistemlerinn
geliştirilmesi
Otomatize, standardize edilmiş ticari test kit ve
formatlarının geliştirilmesi
Revers hibiridizasyon ve array teknolijilerindeki
gelişmeler
Çoklu saptamaya olanak veren platformların
geliştirilmesi: Luminex, DNA array teknoljileri,
multipleks PCR, minyatürize sistemler
Sonuç olarak moleküler teknikler:
Viral hepatitler ve HIV
 MSS virus infeksiyonları
 Solunum yolları virusları
 CYBH’lar
 Bazı gastroenterit yapan viruslar
 Arboviruslar’ın tanısında, tedavi
seçeneklerinin belirlenmesinde, antiviral
tedavinin izlenmesinde birinci seçenek
haline geldiler.

Klinik viroloji laboratuvarı test
yelpazesini:
Bulunduğu bölge ve hastanenin hizmet verdiği
popülasyonu, verdiği hizmetleri
 Bulunduğu bölgedeki diğer kurumlara ait benzer
laboratuvarın verdikleri hizmetlerle birlikte
- test maliyetlerini,
- kendisinin
kaldırabileceği işyükü kapasitesini, insan
kaynakları ve mevcut teknik altyapısını
gözönünde bulundurarak belirlemelidir

Hangi test formatı seçiminde:




Ek yatırım maliyeti getiriyor mu
Klinik gereksinimleri karşılmak açısından uygun
zamanda sonuç veriyor mu
İyi standardize ve validasyonu yapılmış ticari kit var mı –
varsa laboratuvarın test kapsitesi açısınan maliyeti
uygun mu
İster ticari ister ev-yapımı test olsun bunun rutin
kullanıma geçirilerek sonuç vermeden önce laboratuvar
tarafından yapılması gereken kalite kontrol, validasyon
ve standardizasyon işlemlerini yapabilecek durumda mı
Hepatit, HCMV ve HIV

Klinik viroloji laboratuvarlarının en büyük
işyükünü oluşturan ve hemen hemen tüm
laboratuvarlar tarafından yapılan yaygın
testlerdir.
Hepatit, HCMV ve HIV



Kanla bulan virusların gerektirdiği ek yasal
düzenlemelere uygun kit
Ancak bu testlerin de laboratuvarda kullanılmaya
başlanmadan önce belli validasyon ve kalite
kontrol işlemlerinden geçirilerek ilgili
laborauvardaki performanslarının
değerlendirilmesi gerekir.
Dış kalite programları
Hepatit, HCMV ve HIV
Kitlerin büyük çoğu real-time PCR temelli
olup kantitatif sonuç verir
 Kantitiatif kitlerin kullanım amaçları
tedavinin izlenmesine yöneliktir; tarama ve
tanı amaçlı olarak tasarlanmamışlardır
 Ancak alt duyarlılık sınırları kalitatif sonuç
gereksinimini ortadan kaldıracak kadar
düşük düzeylerdedir ????

Hepatit, HCMV ve HIV
Direnç ve genotiplendirme testleri:
Klinik gereksinimler ve laboratuvarın teknik ve
insan donanımı gözönünde bulundurularak
yapılmalıdır.
HBV, HIV ilaç direnci ve HCV genotiplendirme için
reverse hibridizasyona dayalı ticari kitler var
DNA dizi analizine dayalı HIV ticari direnç kiti var
DNA dizi analizi ile her üçü ev-yapımı test olarak
yapılabilir  Kalite kontrolü!!!!

Hepatit, HCMV ve HIV



HCMV ilaç direnci için ticari kit yok.
Son zamanlarda HCV ile infekte kişilerde IL-28
polimorfizmlerini saptamaya yönelik testler
kullanıma sunulmaya başladı
Bu testi ve diğer bazı farmakogenetik testleri
(abakavir duyarlılığı gibi) testleri kim
yapacak???
Transplant alıcılarında görülen viral
infeksiyonlar
HCMV izlenmesi  Pre-emtif tedavi
HCMV reaktivasyonu açısından prediktif
viral yük değerleri belirlenmiş kitler tercih
edilmeli
Prediktif değerleri bilinmeyen bir kit
kullanılacaksa ilgili pediktif değerlerin
belirlenmesi gerekir.

Transplant alıcılarında görülen viral
infeksiyonlar

EBV  PTLD (posttransplant
lenfoproliferatif hastalık)
EBV yükünün izlenmesi: Haftalık
 Erken tedavi olanağı: Rituximab

Transplant alıcılarında görülen viral
infeksiyonlar
BKV: Böbrek transplant alıcılarında
nefropati – Red ile karıştırılabilir
 Serum BK virus düzeylerinin izlenmesi

MSS virus infeksiyonları
HSV-1,2, VZV
 HHV-6
 Enterovirus
 EBV
 CMV

Solunum yolları virusları
Ağır alt solunum yolları infeksiyonlarından
sorumlu virus yelpazesi genişlemekte,
özellikle bağışıklık sorunu olanlar ve uç
yaşlardakiler
 Bazı viruslar (PIV, HMpV): DFA ile
saptamada güçlük – Moleküler yöntemler
daha iyi sonuç

Solunum yolları virusları
Çoklu saptama sistemleri (20 ve üzeri
virus): Lumineks, multipleks PCR, vd.
 Maliyet ?

HPV ve diğer CYBH etkenleri
En erken ticari kitlere dönüştürülen testler:
HPV ve C. trachomatis
 HPV saptanması ve genotiplendirmesi
için değişik formatlarda testler mevcut:
Hybride-capture, multiplekx PCR, real-time
PCR, array’a dayalı
 Çoklu saptamaya yönelik paneller de
mevcut

Gastroenterit etkeni viruslar
Çoğu için hızlı antijen testleri mevcut
 Ancak özellikle noroviruslar ve diğer
etkenler (astrovirus vd.) için en uygun
yöntem moleküler testler
 Çoklu saptama panelleri de mevcut.

Yeni ve yeniden önem kazanan
viruslar; egzotik viruslar
Hastanelerdeki klinik viroloji
laboratuvarlarının görev alanında mı?
 Referans laboratuvarlarına gönderme
sorunları?
 Sonuç alma zamanı
 Endemik hale gelmiş olanlara bakılmalı
mı?













Adenovirus DNA - Qualitative RealTime PCR (For Diagnosis)
Adenovirus DNA – Quantitative RealTime PCR (For Prognosis/Monitoring
of Known Positive Patients)
BK Virus DNA - Qualitative Real-Time
PCR (For Diagnosis)
BK Virus DNA - Quantitative Real-Time
PCR (For Prognosis/Monitoring of
Known Positive Patients)
Chlamydia Trachomatis Molecular
Amplification - Transcription-Mediated
Amplification (TMA); Obtain Collection
Kits from Materials Distribution
Customer Service
Cytomegalovirus DNA - Qualitative
Real-Time PCR (For Diagnosis)
Cytomegalovirus DNA - Quantitative
Real-Time PCR (For
Prognosis/Monitoring of Known
Positive Patients)
Epstein-Barr Virus DNA - Qualitative
Real-Time PCR (For Diagnosis)
Epstein-Barr Virus DNA - Quantitative
Real-Time PCR (For
Prognosis/Monitoring of Known
Positive Patients)
Enterovirus RNA - Qualitative RealTime PCR
Hepatitis C Virus RNA - Qualitative
Real-Time PCR
Herpes Simplex Virus DNA Qualitative Real-Time PCR
Herpes Simplex Virus DNA Typing - HSV
1/2 Typing Real-Time PCR
Human Herpes Virus Type 6 DNA Qualitative Real-Time PCR (For Diagnosis)
Human Herpes Virus Type 6 DNA Quantitative Real-Time PCR (For
Prognosis/Monitoring of Known Positive
Patients)
Human Immunodeficiency Virus Type 1
RNA Qualitative Detection - TranscriptionMediated Amplification (TMA); Use for
Diagnosis
Human Immunodeficiency Virus Type 1
RNA Quantitation - Quantitative Real-Time
PCR; Use for Prognosis and Therapeutic
Monitoring
Human Metapneumovirus RNA - Qualitative
Real-Time PCR
Influenza Virus Type A RNA - Qualitative
Real-Time PCR
Influenza Virus Type A RNA Human H1 and
H3; Novel H1 Subtyping - Qualitative RealTime PCR
Influenza Virus Type B RNA - Qualitative
Real-Time PCR
Neisseria Gonorrhoeae Molecular
Amplification – Transcription-Mediated
Amplification (TMA); Obtain Collection Kits
from Materials Distribution Customer
Service

















Norovirus RNA - Qualitative Real-Time
PCR
Parainfluenza Virus Type 1 RNA Qualitative Real-Time PCR
Parainfluenza Virus Type 2 RNA Qualitative Real-Time PCR
Parainfluenza Virus Type 3 RNA Qualitative Real-Time PCR
Parechovirus RNA – Qualitative RealTime PCRli>
Parvovirus B19 DNA - Qualitative RealTime PCR
Respiratory Virus Panel for RSV A and B
RNA, Influenza Viruses A and B RNA,
Parainfluenza Viruses 1,2, and 3 RNA,
Adenovirus DNA, Metapneumovirus
RNA, and Rhinovirus RNA – Qualitative
Real-Time PCR
Respiratory Syncytial Virus RNA Qualitative Real-Time PCR
Rhinovirus RNA - Qualitative Real-Time
PCR
Varicella Zoster Virus DNA - Qualitative
Real-Time PCR
West Nile Virus RNA - Qualitative RealTime PCR
Hepatitis A, B, C and D Testing
Hepatitis B Virus DNA Quantitation –
Molecular Amplification (For Monitoring
of Known Positive Patients) (Send Out)
Hepatitis C Virus Antibody - Enzyme
Immunoassay
Hepatitis C Virus RNA – Qualitative
Real-Time PCR (For Diagnosis)
Hepatitis C Virus RNA Quantitation –
Molecular Amplification (For Monitoring
of Known Positive Patients) (Send Out)
Hepatitis C Virus Genotyping – Nucleic
Acid Sequencing (Send Out)
Retrovirology (HIV-1, HIV-2, HTLV-I/II)
Human Immunodeficiency Virus Type 1
RNA Qualitative Detection - TranscriptionMediated Amplification (TMA); Use for
Diagnosis
Human Immunodeficiency Virus Type 1
RNA Quantitation - Quantitative Real-Time
PCR; Use for Prognosis and Therapeutic
Monitoring
Human Immunodeficiency Virus Type
1 Genotyping – Nucleic Acid Sequencing
(Send Out)
Human T Cell Leukemia Virus-I/II Antibody Enzyme Immunoassay (Send Out)
Chlamydia Trachomatis and Neisseria
Gonorrhoeae Testing
Chlamydia Trachomatis Molecular
Amplification – Transcription-Mediated
Amplification (TMA); Obtain Collection Kits
from Materials Distribution Customer
Service
Neisseria Gonorrhoeae Molecular
Amplification – Transcription-Mediated
Amplification (TMA); Obtain Collection Kits
from Materials Distribution Customer
Service
Print
Klinik viroloji laboratuvarı ayrıca:




Klinisyenleri olası viral etkenler; saptama
yöntemleri ve uygun örnekler konusunda
bilgilendirmeli
Gerekiyorsa test sonuçlarını yorumlamalı
Danışmanlık hizmeti: Halka ve klinisyenlere
Klinisyenlere laboratuvarda yapılmayan testler
konusunda yardımcı olmalı
Klinik viroloji laboratuvarı
ayrıca:



Kendi varlığı ve kapasitesi
konusunda hastane çapında
farkındalık yaratmalı
Hastane infeksiyonlarının kontrolü,
hasta ve sağlık çalışanı güvenliği
konusunda sağlık çalışanlarının
eğitimine katılmalı
Hastane ya da toplumda dolaşmakta
olan salgın etkenleri ya da potansyel
salgın etkenleri konusunda uyarıcı
olmalıdır.
Download

Moleküler yöntemler