Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir.
ULUSAL MİKROBİYOLOJİ
STANDARTLARI (UMS)
Karanlık Alan Mikroskopisi
(Bakteriyel Patojenlerin Mikroskopik İncelemesi)
Hazırlayan Birim
Klinik Bakteriyoloji Tanı Standartları Çalışma Grubu
Onaylayan Birim
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu
Kategori
Bakteriyoloji
Bölüm
Test Prosedürleri
Standart No
B-TP-08
Sürüm No
1.1
Onay tarihi
01.01.2015
Geçerlilik tarihi
01.01.2018
Sürüm no Tarih
Değişiklik
Karanlık alan mikroskopisi
İÇİNDEKİLER
KAPSAM VE AMAÇ............................................................. 3
GENEL BİLGİ ................................................................... 3
TEKNİK BİLGİLER ............................................................. 4
1
2
3
4
5
Test için asgari laboratuvar koşulları ................................ 4
Karanlık alan mikroskopisi .............................................. 5
Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması ................... 6
Sonuçların raporlanması ................................................ 6
Olası sorunlar/kısıtlılıklar ................................................ 6
KAYNAKLAR ..................................................................... 7
Sayfa 2 / 7
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-08 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Karanlık alan mikroskopisi
Kapsam ve Amaç
Karanlık alan mikroskopisi sifilizin erken döneminde şankr lezyonlarında hareketli
Treponema pallidum’un varlığını göstermek için kullanılan bir yöntemdir.
Bu UMS’de de karanlık alan mikroskopisinin dayandığı prensip ile doğru kullanımı
ve yorumlanmasına dair bir rehber sunulması hedeflenmiştir
Genel Bilgi
Sıradan bir ışık mikroskobunda kullanılan kondansatör ışığı yoğunlaştırır ve
doğrudan incelenen örneğin içinden geçirir. Bu aydınlık-alan aydınlatması sağlar.
Ancak, aydınlık-alanda kendi zemini ile kontrast yapamayan ışık-duyarlı
organizmalar (spiroketler gibi), ışık mikroskobunda görülemezler. Karanlık-alan
için uyarlanmış bir mikroskop, örneğin içinden ışığın geçişini önleyen, bunun
yerine de örneğin belirli bir açıyla ışığı yansıtmasına neden olan bir kondansatöre
sahiptir. Bu ışınlar toplandığı ve bir görüntü içine odaklandığı zaman, ince bir
nesne karanlık bir arka plan üzerinde görünür hale gelmektedir (1).
Sifiliz spiroket T. pallidum’un neden olduğu bir enfeksiyondur. Laboratuvarda
kültürü yapılamadığından hastalığın tanısı büyük oranda serolojik incelemelere
dayanır. T. pallidum’un bir diğer özelliği de çok ince bir hücre yapısına sahip
olmasıdır; öyle ki, normal ışık mikroskobunda rutin boyama yöntemleri ile
görülemez. Ancak sifilizin erken döneminde, “şankr” adı verilen, çoğunlukla tek
ve genital organlarda ortaya çıkan lezyonlarından etkenin karanlık alan veya DFA
gibi diğer mikroskopik yöntemlerle gösterilmesi mümkündür (2). Bunlardan en
yaygını karanlık alan mikroskopisidir; özel ekipman gerektirmez; laboratuvarın,
karanlık alan kondansatörü olan bir ışık mikroskobuna sahip olması yeterlidir.
Özetle, karanlık alan incelemesi lezyon eksudalarında canlı, hareketli
treponemaların görülmesine imkân verir ve pozitif bulgu “kesin tanı”
koydurucudur (3,4).
Tekniğin en önemli özelliği ve aynı zamanda dezavantajı lezyondan örnek alınır
alınmaz –hareketli treponemaları görebilmek için- preparatı incelemek
zorunluluğudur. Her ne kadar karanlık alan incelemesinde başarı uygulayıcının
tecrübesi ve lezyondaki organizma sayısı ile yakından ilişkili ise de teknik genital
lezyonlara uygulandığında sonuç özgüldür. Ağız içi ve rektal bölge lezyonlarında
ise -bu bölgelerin normal florasında da spiroketler bulunabildiği için- yanlış
pozitiflik olasılığı nedeniyle karanlık alan mikroskopisi önerilmez (2). Karanlık
alan mikroskopisi Vibrio spp, Campylobacter spp gibi bakterilerin hareketlerinin
incelenmesinde de kullanışlı bir yöntemdir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 3 / 7
Karanlık alan mikroskopisi
Teknik Bilgiler
1 Test için asgari laboratuvar koşulları
1.1. Laboratuvar güvenliği
Bu UMS’de bahsi geçen organizmalar ile ilgili işlemler asgari BGD2 laboratuvar
şartlarında gerçekleştirilmelidir. Klinik örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli,
örnekleri alırken ve preparat hazırlarken daima standart önlemler uygulanmalıdır.
Güvenlik uyarısı! T. pallidum ciltteki herhangi bir açıklıktan girebilir ve
enfeksiyona neden olabilir. Bu prosedür uygulanırken daima eldiven giyilmelidir.
Boyanmış olsun veya olmasın bütün lamlar kesici-delici atık kabul edilir ve
kesinlikle kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu
torbalara atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi infeksiyöz risk doğururlar!
Eğer örneği alırken enjektör kullanılıyorsa, enjektör iğnelerinin kapakları asla
yeniden kapatılmaz! İğneler ve kullanılmış lamlar kesici-delici atık kabul edilir
ve kesinlikle kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu
torbalara atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi enfeksiyöz risk doğururlar!
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri
Sifiliz şüpheli lezyondan eksuda örneğinin alınması işlemi kesinlikle deneyimli bir
Mikrobiyoloji Uzmanı veya klinisyen tarafından gerçekleştirilmelidir.
1.3. Örnek, Donanım
İnceleme örneği

Sifiliz şüpheli lezyondan eksuda örneği – örnek alınır alınmaz preparat
hazırlanması ve incelenmesi gerekir. Bu nedenle örnek alma yöntemi
de bu UMS’de, aşağıda verilmektedir (bkz.2.2).

Primer şankr, makülopapüler lezyonlardan epidermal ve mukozal
örnekler, lenf nodu aspirasyon sıvısı – Karanlık alan mikroskopisi veya
DFA testi için kullanılabilirler.

Hastaya antibiyotik başlanmadan önce alınması önem taşır. Aktif
lezyonlar primer, sekonder ve erken konjenital sifilizde yüksek
miktarda treponema içerdiğinden uygun örneklerdir.
Diğer gereç, donanım

Karanlık alan mikroskobu - 10, 40 ve 100 objektifleri ve 10 oküler;
karanlık-alan kondansatörü (tek veya çift yansıtıcılı)





Lamlar (önceden temizlenmiş; 2575 mm) ve lameller (2222mm)
Pastör pipeti, steril (opsiyonel olarak enjektör ve iğne)
SF, steril, izotonik
Eldiven
Kesici-delici atık kabı
Sayfa 4 / 7
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-08 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Karanlık alan mikroskopisi
1.4. Kalite kontrol

Mikroskop son 12 ay içinde kalibre edilmiş olmalıdır.

Hasta örnekleri ile çalışmadan önce karanlık alanın ayarlanması ve
pratiğin geliştirilmesi amacıyla preparat hazırlanıp incelenmelidir.
Örnek preparatın hazırlanmasında aşağıda verilen yol izlenir:
(a) Temiz bir lam üzerine bir damla SF konur. Laboratuvardan bir
kişinin yanak iç yüzünden kazıntı örneği alınarak lam üzerinde
homojenize edilir,
(b) Preparat karanlık alan kondansatörü takılı mikroskopta 400 ve
1000 büyütme ile ayrı ayrı değerlendirilir.
2 Karanlık alan mikroskopisi
2.1. Örnek alınması ile ilgili önemli hususlar

Karanlık-alanda mikroskopik inceleme için lezyondan seröz sıvı örneği
alınır; örnek antibiyotik tedavisi öncesinde alınmalıdır.

Örnek, alınır alınmaz incelenmesi gerektiği için, laboratuvarda
alınmalıdır. Eğer klinik laboratuvara çok yakın ise ve 10 dk içinde
laboratuvara ulaşıp incelenebilecekse, örnek klinikte alınabilir.

Ağız lezyonlarından karanlık alan mikroskopisi için örnek alınmaz;
çünkü patojen olmayan spiroketler oral mikrobiyal floranın bir parçası
oldukları için yanlış pozitif sonuçlara neden olurlar.
NOT: Ağız ve rektal bölge lezyonlarından örnekler, eğer spesifik
antikorlar ile DFA testi yapılabiliyorsa, alınmalıdır (bkz. “5. Olası
sorunlar/kısıtlılıklar”).
2.2. Şankr örneğinin alınması ve preparatın hazırlanması

Önce lezyon yüzeyi steril gazlı bez ve SF ile temizlenir; kurutmak için
tamponlanır. Nazik bir şekilde, varsa, kabuklar vb. uzaklaştırılır.

Lezyon yüzeyi kuru gaz tampon ile biraz tahriş edilerek hafifçe kanatılır.
Steril SF ile yıkama yapılır ve silinerek, gelen kan temizlenir.

Lezyon tabanı kenarlardan parmaklar arasında tutularak nazikçe
sıkıştırılır; ülser zemininden seröz, temiz bir eksuda çıkar çıkmaz temiz
bir lam eksudaya dokundurulur.

Eğer eksuda yoksa lezyona bir damla steril SF damlatılır veya bir
şırıngaya takılı steril iğne ile lezyon tabanına girilir, aspire edilir ve
sonra iğneye bir damla da SF çekilir.
NOT: Sekonder enfeksiyon dönemi lezyonlarından örnek almak
isteniyorsa nazikçe SF ile temizlendikten sonra örnek alınmalıdır

Alınan materyal lam üzerine bırakılır. Üzerine hemen lamel ile kapatılır.

Karanlık alan mikroskobunda incelenir.
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 5 / 7
Karanlık alan mikroskopisi
2.3. Preparatların karanlık alan mikroskobunda incelenmesi

Preparat hazırlanır hazırlanmaz incelenmelidir. Önce bütün alanlar
400 büyütmede taranır; hareketli spiral organizmaların varlığı
araştırılır.

Şüpheli bir obje görülürse objektif değiştirilir ve 1000 büyütmede
(lamel üzerine immersiyon yağı konularak) daha yakından
değerlendirilir (4).

İnceleme tamamlanır tamamlanmaz lam kesici-delici atık kutusuna
atılmalıdır.
3 Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması

T. pallidum genellikle eritrosit çapından daha büyük, oldukça uzun (614 µm) organizmalardır.

Organizmalar karanlık alanda narin, tirbuşon şeklinde, sert, düzgün,
spiraller gibi görünürler; aktif hareketli iken bile sarmal görünüm
korunur.

Uzunlamasına rotasyonel hareketler, ileri-geri hareketler; bükülme,
eğilme, ya da iki yana kıvrılma hareketleri gözlenir.
4 Sonuçların raporlanması

Yalnızca genital organ lezyonuna ait örnek sonuçları rapor edilir.

Eğer karakteristik morfoloji ve hareket özelliklerine sahip organizmalar
görüldüyse “Treponema pallidum benzeri treponemalar gözlendi”
şeklinde rapor edilir.

Eğer hiçbir organizma gözlenmediyse “Treponema-benzeri herhangi bir
organizma görülmedi” şeklinde rapor edilir.
5 Olası sorunlar/kısıtlılıklar

Hareketli organizmaları görmek için örnek en kısa sürede (20 dk içinde)
incelenmelidir. Eğer bu mümkün değilse lam üzerine alınan damla
havada kurutulur ve metanol ile sabitlenir. Böylece hazırlanmış olan
lam T. pallidum DFA testi yapabilen bir laboratuvara gönderilmelidir.
Sayfa 6 / 7
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / B-TP-08 / Test Prosedürleri / Bakteriyoloji
Karanlık alan mikroskopisi
Kaynaklar
1 Black JG. Microscopy and Staining: dark-field microscopy. In: Microbiology: Principles and
Explorations. 7th ed., John Wiley & Sons, Inc, U.S. 2008, p. 60-61
2 Finegold SM, Baron EJ (eds). Spirochetes. In: Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. 7th
ed., The C.V. Mosby Company, USA. 1986, p. 469-474.
3 Pope V. Laboratory Diagnosis of Syphilis. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology
Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 11.5.1 - 4
4 York MK. Wet mount for detection of leukocytes and microorganisms: Demonstration of
Treponema pallidum in specimens using dark-field microscopy. Appendix 3.2.3–1. In: Garcia LS,
Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press,
Washington D.C. 2007, p. 3.2.3.5 - 3.2.3.6
Ulusal Mikrobiyoloji Standartları
Bakteriyoloji / Test Prosedürleri / B-TP-08 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Sayfa 7 / 7
Download

Karanlık alan mikroskopisi - Türkiye Halk Sağlığı Kurumu