TÜRKøYE CUMHURøYETø
ANKARA ÜNøVERSøTESø
SAöLIK BøLøMLERø ENSTøTÜSÜ
SøLDENAFøL DÜZEYLERøNøN, PULMONER ARTERøYAL
HøPERTANSøYON HASTA PLAZMALARINDA
KROMATOGRAFøK YÖNTEMLE BELøRLENMESø
VE “BøTKøSEL KÖKENLø” ÜRÜNLERDE øLLEGAL
VARLIöININ ARAùTIRILMASI
Emrah DURAL
DøSøPLøNLERARASI ADLø BøLøMLER ANABøLøM DALI
DOKTORA TEZø
DANIùMAN
Prof. Dr. Gülseren KARABIYIKOöLU
2014 - ANKARA
51
5. SONUÇ ve ÖNERøLER
Sildenafil klinikte temelde iki amaçla kullanılmaktadır. Bunlardan birisi erektil
fonksiyon bozuklu÷u ikincisi ise pulmoner hipertansiyon hastalı÷ının tedavisidir.
Sildenafil PDE5 enziminin potent ve seçici bir inhibitörü olup her iki hastalı÷ın
tedavisinde önemli etkileri bulunması sebebiyle kullanımı dünya genelinde oldukça
yaygındır. Kardiyovasküler ve sinir sistemi üzerindeki yan etki potansiyeli oldukça
yüksektir. Metabolizması büyük oranda CYP 3A4, düúük oranda ise CYP 2C9
tarafından gerçekleútirilir. Bu nedenle CYP 3A4 enzimi ile metabolize olan ilaç ve diyet
ürünlerinin (örne÷in; greyfurt suyu; makrolid grubu antibiyotikler, simetidin,
antifungallar) sildenafil ile birlikte kullanımı plazmada sildenafil birikimine ve ani kalp
durması dâhil olmak üzere ciddi sa÷lık sorunlarına neden olmaktadır.
Sildenafilin kandan ve “bitkisel kökenli” ifadesiyle piyasada satılmakta olan
ürünlerden izolasyonu ve analizini yapabilmek amacıyla, analiz öncesi hazırlı÷ından
analizine kadar geçen süreçte hassasiyet, tekrarlanabilirlik de÷erleri yüksek, güvenilir,
maliyeti düúük ve hızlı bir metot kurulmuú, geliútirilen özgün metot valide edilmiútir.
Sildenafilin
biyoyararlanımı
dikkate
alındı÷ında
biyolojik
örneklerde
rastlanabilecek olan sildenafil düzeyinin ppb seviyesi oldu÷u anlaúılmaktadır. Bu
nedenle biyolojik materyallerdeki sildenafil analizleri için GC - MS temelli metotların
uygun olmadı÷ı, literatürde aksini belirten yayınlar olmasına karúın, gerçekleútirilen
deneyler sonrasında ortaya çıkmıútır. Sildenafilin kimyasal yapısından dolayı yüksek
polariteye sahiptir. Tablet ya da bitkisel karıúımlardaki sildenafil oranları, µg/mL
seviyelerinde, numune zenginleútirme yöntemlerini de kullanarak, sildenafilin GC – MS
ile analiz ve kantitasyonuna imkân tanımaktadır. Bununla birlikte HPLC – UV gibi
seperasyon ve spektrofotometrik ölçüm gibi basit analiz alt yapısına sahip olan teknik,
ppb seviyesinde, hem biyolojik örnekler hem de ilaç ve ilaç benzeri ürünlerdeki
52
sildenafil miktarının tespiti için hassas, güvenilir ve pratik bir analiz olana÷ı sa÷lamıútır.
HPLC – UV cihazında kurulan ve validasyon de÷erleri incelendi÷inde güçlü bir analiz
metodu olarak de÷erlendirilebilecek olan metot ile 6 PAH hastasına ait kan örne÷i
içerisindeki sildenafil miktarı araútırılmıútır. Bu hastalarda gözlenen kan - sildenafil
düzeyi 27,05 – 2055,43 ng/mL arasında de÷iúim göstermektedir. Bu oldukça geniú bir
aralıktır. Bu de÷iúime neden olabilecek pek çok faktörün (doz, cinsiyet, yaú vb) yanında
bireysel farklılıkların öne çıkan sebep olarak düúünülür. Klinikte “bireye özgü tedavi”
artık popüler ve do÷ru bir yaklaúım úekli olarak öne çıkmaktadır. Bu nedenle aynı
miktarda ilaç kullanımına karúın bireysel farklılıkların etkisiyle tedavi sürecindeki baúarı
oranı dikkate alındı÷ında doz - tedavi düzeyi oldukça iyi ayarlanmalıdır. Bu yaklaúım
tedavi sürecinde geliúebilecek olan olası toksisite tablolarının önüne geçebilmek için en
uygun yöntemdir.
Alternatif tedavi yöntemlerinden birisi olması ve günden güne popülerli÷inin
artması sebebiyle bitkisel ilaç kullanımı her yönüyle oldukça önem taúır. Ta÷úiú
uygulamaları ile ortaya çıkabilecek olan toksisite tabloları baúta kardiyovasküler ve sinir
sistemi olmak üzere, çok ciddi sa÷lık sorunlarına yol açabilmektedir. Gerçek bitkisel
ürünlerin dahi kontrolsüz kullanımının önemli sa÷lık sorunlarına yol açtı÷ı bilinmesine
karúın, ambalajı üzerinde her bitkisel yazan ilaç benzeri ürünün bitkisel olmayabilece÷i”
algısının toplumda yaratılması son derece önemlidir. 8 ürünün içeri÷inde yapılan
sildenafil araútırmanın 4’ü pozitif sonuçlanmıútır. Daha fazla örnek üzerinde yapılacak
olan analizler halkımızın bu konudaki duyarlılı÷ını arttırabilecektir. Tehlikenin en
önemli kısmı internet ya da telefon üzerinden yapılan kontrol dıúı ürün satın alımlarıdır.
Konunun çözüme ulaútırılması ve sürecin en azından kontrol altına alınması için ciddi
tedbirlere gerek oldu÷u ve ancak uluslararası bir iúbirli÷i ile bu probleme bir çözüm yolu
geliútirilece÷i aúikârdır. øleri analiz tekniklerinden olan LC - MS/MS cihazıyla yapılacak
olan sildenafil analizleri hassasiyeti arttıracak kimliklendirmenin daha ayrıntılı
yapılmasına imkân tanıyacaktır.
53
ÖZET
Sildenafil Düzeylerinin, Pulmoner Arteriyal Hipertansiyon Hasta Plazmalarında
Kromatografik Yöntemle Belirlenmesi ve “Bitkisel Kökenli” Ürünlerde øllegal Varlı÷ının
Araútırılması
Sildenafil, fosfodiesteraz tip 5 enziminin seçici ve potent bir inhibitörü olup pulmoner
hipertansiyon hastalı÷ının (PAH) ve erektil fonksiyon bozuklu÷unun idame tedavisinde
kullanılmaktadır.
Bu çalıúmada sildenafilin insan plazması ile piyasada “Bitkisel Ürün” ifadesiyle
satılmakta olan ürünlerin içeri÷indeki varlı÷ını ve düzeyini araútırmak amacıyla yüksek
performanslı sıvı kromatografi (HPLC) ile analiz yöntemi geliútirildi. Bu amaçla özgün,
güvenilir, hassas bir metot oluúturuldu ve ilgili test uygulamaları yapılarak metot valide edildi.
Plazmadan sildenafil (1 mL) izole edilmeden önce içeri÷ine iç standart olarak verapamil
ve 200 µL hacimde 1 M’lık NaOH eklenerek ortam alkali hale dönüútürülmüútür. Ardından
ekstraksiyon iúlemi için karıúıma 3 mL etil asetat konulmuútur. Ekstraksiyon sonrası organik
çözücü, azot altında, 40 °C’de ve sabit akıúta tam kurulu÷a kadar uçurulmuú, ardından 200 µL
mobil fazda yeniden oluúturulmuútur. Kromatografik analiz inertsil C18 ters faz kolon ile 0,8
mL/dak akıú hızında, %60 asetonitril %40 amonyum asetat tamponlu mobil faz sistemi
kullanılarak, 100 µL enjeksiyon hacmi ile gerçekleútirildi. Analiz süresi 9 dakika idi.
Ekstraksiyon ürünlerinin analizleri ultraviyole dedektör (UV) ile 225 nm’de yapılmıútır.
Sildenafil ve verapamil’in retansiyon zamanları sırasıyla 6,76 ve 8,01 idi. Do÷rusallık (linearity)
plazmada 7,16 – 716 ng/mL aralı÷ında incelenmiútir. Gözlenebilme sınırı (LOD) 0,64 ng/mL,
tayin sınırı (LOQ) ise 1,93 ng/mL idi. Metodun do÷rulu÷u (accuracy), gün içinde (%RE) 6,47 ile
5,73, günler arasında ise -7,39 ile 6,45 aralı÷ındadır. Metodun kesinli÷i (precision) gün içinde
(%RSD) 1,74 – 5,68, günler arasında ise 2,58 – 6,23 aralı÷ındadır.
øncelenen 6 PAH hastasına ait sildenafil plazma da÷ılımı 27,05 – 2055,43 ng/mL’dir.
Sildenafil düzeyleri 914,25 ± 924,75 (Ort.±SD) úeklindedir. Piyasada “bitkisel” ifadesiyle
satılmakta olan 8 ürünün içeri÷inde sildenafil araútırılmıútır. 4 örnekte sildenafil belirlenmiútir.
Bu örneklerdeki sildenafil miktarları 10,55 - 621,28 ng/mL aralı÷ında bulunmuú, 176,65 ±
297,32 (Ort.±SD) olarak gözlenmiútir.
Anahtar Sözcükler: HPLC – UV, ølaç øzlemi, Sildenafil, Ta÷úiú, “Bitkisel ølaç”
54
SUMMARY
Determination of Sildenafil Levels in Pulmonary Arterial Hypertension Patients' Plasma,
by Chromatographic Method and Investigation of Illegal Assets in "Plant Origin"
Products
Sildenafil is a potent and selective inhibitor of the fosfodiesterase type 5 enzymes and is used in
the treatment of pulmonary hypertension disease (PAH) and maintenance of erectile dysfunction.
In this study, a high-performance liquid chromatography (HPLC) method was developed
in order to determination of sildenafil levels in human plasma and "herbal" products. For this
purpose an original, specific, reliable, sensitive method was established and this method were
validated.
Verapamil was used as an internal standard and plasma was made alkaline by added 200
µl NaOH, 1 M. 3 mL ethyl acetate was added in this mixture for the extraction procedure. After
the extraction, organic solvent was evaporated by nitrogen (40°C, constant flow), and then it was
reconstituted by 200 µL mobile phase. Analysis was 9 minutes. Analysis of extraction products
were made by ultraviolet detector (UV) at 225 nm. The retention time of sildenafil and
verapamil were 6.76 and 8.01, respectively. Linearity was observed the range of 7.16 - 716 ng /
mL sildenafil. Limit of Detection (LOD) and Limit of Quantification (LOQ) were measured 0.64
ng/ml and 1,93 ng/mL, respectively. Accuracy of the method were observed between 6,47 - 5,73
and 6.45 -7.39 within and without days, respectively. Accuracy of the method were observed
between 1.74 - 5.68 and 2,58 – 6,23; within and without days, respectively.
The plasma sildenafil distribution of 6 PAH patients were observed between 27,05 (min) 2055.43 (max) ng / ml. The levels of sildenafil were observed 914.25 ± 924.75 (mean ± SD). 8
products are being sold in the market were investigated. Sildenafil was determined in 4
specimens. Sildenafil levels were found between 0.55 - 621.28 ng / mL, 176,65 ± 297,32
(Ort.±SD), and observed 176.65 ± 297.32 (Mean ± SD), in these specimens.
Key Words: HPLC – UV, Drug Monitoring,, Sildenafil, Adulterating, “Herbal Medicine”
Download

Sildenafil Düzeylerinin, Pulmoner Arteriyel Hipertansiyon Hasta