Adenovirüs serotip 5 ve adenovirüs serotip
36’nın Colo-320 hücre hattında adipojenik
etkilerinin gösterilmesi
Tamer Şanlıdağ1, Sinem Akçalı1, Seda Vatansever2, Candan Çiçek3,
Murat Sayan4, Elçin Kal Çakmaklıoğulları1, Pınar Taşkıran Şen1
1. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, Manisa.
2. Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji AD, Manisa.
3. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, İzmir.
4. Kocaeli Üniversitesi Tıp FakültesiHastanesi Merkez Laboratuvarı PCR Ünitesi, Kocaeli.
Amaç
Adenovirüs serotip 5 (Ad-5) ve serotip 36’nın (Ad-36)
(ATCC VR-1610) adipojenik etkilerinin Colo-320 hücre
hattında histokimyasal, immünohistokimyasal ve
elektron mikroskobik yöntemlerle gösterilmesi
Gereç ve Yöntemler-1
Serotipler
Adenovirüs serotip 5 (Ad-5)
- Hayvan obezitesiyle ilişkili – solunum yolu izolatı
Adenovirüs serotip 36 (Ad-36)
- İnsan obezitesiyle ilişkili – Standart suş
Adenovirüs serotip 8 (Ad-8)
- Kontrol suşu – göz sürüntüsü izolatı
[ATCC VR-1610]
Gereç ve Yöntemler-2
Hücre hattı: Colo-320
•
Hızlı üreme özelliği
•
Barsak epitel hücre kökenli
•
Proliferasyonlarının dış
etkenlerden etkilenmemesi
Gereç ve Yöntemler-3
Hücre kültürü
• COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı
(HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy)
Medium:
• RPMI-1640
• %10 FCS
• 2 mM L-glutamin
• %1 penisilin-streptomisin
10 gün (2 günde bir vasat değişimi) kültür
Hücreler konfluent olduktan sonra 6 gözlü plaklara pasaj
Gereç ve Yöntemler-4
İnokülasyon
• COLO-320 Primer insan kolon karsinomu hücre hattı
(HTL95027, Interlab Cell Line Collection, Genova, Italy)
• Ad-5, Ad-36 ve Ad-8 stok (10-4 dilüsyon)
200’ er μl inokülasyon
37 0C’ de %5 CO2’li ortamda 1 saat inkübasyon
Gereç ve Yöntemler-5
İnokülasyon
Süre sonunda hücreler;
Medium:
• MEM
• %10 FCS
• 2 mM L-glutamin
• %1 penisilin-streptomisin
• %1 HEPES
• % 0.1 gentamisin
• % 0.4 Amfoterisin B
İçeren vasata alındı
Kültürün
1.
ve
2.
hf.larında
histokimyasal,
immünohistokimyasal ve elektron mikroskobik analiz için
hücreler toplandı
Gereç ve Yöntemler-6
Histokimya-Oil Red boyama
• % 4’ lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon)
•
•
•
•
Agar (%2)
Rutin parafin takip
5 µm’lik kesitler
Oil Red’le boyama
Gereç ve Yöntemler-7
İmmünohistokimya-Leptin boyama
% 4’ lük paraformaldehit 30 dk (fiksasyon)
% 3 lük hidrojen peroksit (H2O2) 5 dk
Permeabilizasyon için % 0.1 lik Triton-X 100 ile 15 dk
1 saat bloking
Anti-leptin (Invitrogen, USA) 1 gece inkübasyon
İkincil antikorlar (85-9043, Histostain Kit, Zymed)
– Biotinlayted IgG (30 dk)
– Streptavidin (30 dk)
• Diaminobenzidine (DAB) 5 dk
• Olympus BX40 ile incelendi.
•
•
•
•
•
•
Gereç ve Yöntemler-8
Elektron mikroskopi
•
•
•
•
•
•
•
% 2.5 gluteraldehit 4 saat (fiksasyon)
% 1 osmik asit 1,5 saat (fiksasyon)
Agar
Epon 812
Yarı ince: Toluidin mavisi
İnce: Uranil asetat-kurşun sitrat
DEU Tıp Fakültesi Carl-Zeiss TEM-900 Elektron
mikroskopta incelendi
(Doç. Dr. Alper Bağrıyanık, Dr. Serap Cilaker Mıcılı )
Bulgular-1
Colo 320 sitopatik etki
1. hafta
Bulgular-2
Fotoğraf 1. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı
preperatları
Oil Red
Boyama
Ad-36
Bulgular-3
Fotoğraf 2. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı
preperatları
Oil Red
Boyama
Ad-5
Bulgular-4
Fotoğraf 3. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinin Oil Red boyalı
preperatları
Oil Red
Boyama
Ad-8
Bulgular-5
Fotoğraf 4. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal
boyalı preperatları
Ad-36
1. Hafta
Leptin
Ad-36
2. Hafta
Bulgular-6
Fotoğraf 5. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal
boyalı preperatları
Ad-5
1. Hafta
Leptin
Ad-5
2. Hafta
Bulgular-7
Fotoğraf 6. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinin immünohistokimyasal
boyalı preperatları
Ad-8
1. Hafta
Leptin
Ad-8
2. Hafta
Bulgular-8
Fotoğraf 7. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM
görüntüleri (1. hf)
LV
LV
LV
LV
LV
Elektron mikroskopi
LV
LV
Bulgular-9
Fotoğraf 8. Ad-36 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM
görüntüleri (2. hf)
LV
LV
LV
Elektron mikroskopi
Bulgular-10
Fotoğraf 8. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM
görüntüleri (1. hf)
LV
LV
Elektron mikroskopi
Bulgular-11
Fotoğraf 9. Ad-5 ile infekte Colo-320 hücrelerinde lipid vakuollerinin EM
görüntüleri (2. hf)
LV
Elektron mikroskopi
Bulgular-12
Fotoğraf 10. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri (1. hf)
Elektron mikroskopi
Bulgular-13
Fotoğraf 11. Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM görüntüleri (2. hf)
Elektron mikroskopi
Bulgular-14
Fotoğraf 12. Ad-36, Ad-5 ve Ad-8 ile infekte Colo-320 hücrelerinde EM
görüntüleri
LV
LV
LV
LV
Ad-36
Ad-5
Elektron
mikroskopi
Ad-8 (K)
Sonuç
Araştırmamız sonucunda Ad-5 ve Ad-36 serotiplerinin Colo-320
hücrelerinde lipid birikimine neden olarak adipojenik etki
gösterdiği tespit edildi.
Çalışmamız, ülkemizde bu alanda yapılmış ilk araştırma
niteliğinde olup, sonuçlarımızın ülkemiz tıp literatürüne önemli
katkılar sağlayacağını beklemekteyiz.
Download

Ad-5