ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
FARKLI POLİMER MEMBRAN YÜZEYLERDE SIÇAN NEONATAL
SİYATİK SİNİR HÜCRESİ ÇOĞALMASI
Neslihan ÇELİK
KİMYA ANABİLİM DALI
ANKARA
2011
Her Hakkı Saklıdır
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
FARKLI POLİMER MEMBRAN YÜZEYLERDE SIÇAN NEONATAL SİYATİK
SİNİR HÜCRESİ ÇOĞALMASI
Neslihan ÇELİK
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN
Bu çalışmada sıçan siyatik sinirinden izole edilen neonatal sinir hücrelerinin farklı
membranlar üzerindeki davranışları izlendi. Bunun için döner kaplama yöntemi ile
hazırlanmış kollajen (Tip-I), kitosan, kitosan-kollajen, alginat, elastin, elastin-kollajen,
poli(ε-kaprolakton) (PCL), PCL-C60 (fulleren-60), PCL-TDKNT (tek duvarlı karbon
nanotüp) polimer film membranlar ve ayrıca PCL, PCL-C60, PCL-TDKNT
nanokompozitlerinin elektroeğirme yöntemi ile hazırlanmış lifli yapıdaki membranları
kullanıldı. Hazırlanan polimer yüzeylere, hücre ekimi yapılarak 1, 7, 14 ve 21.
günlerdeki hücre canlılığının belirlenmesi için MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5
difenil tetrazolyum bromür] testi ile mitokondriyel aktiviteleri ölçüldü. Ayrıca
membranların yüzeyi fotoğraflanarak, hücre membran ilişkisi, sinir hücrelerinin
çoğalması ve yayılmaları incelendi. 570 nm’de yapılan absorbans ölçümlerine göre
hücre çoğalmasının ve canlılığının en çok artış gösterdiği polimer yüzeyinin
elektroeğirme yöntemiyle hazırlanan PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT yüzeyler olduğu
tespit edildi. Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan polimerler arasında ise PCL-TDKNT
polimer yüzeyin siyatik sinir hücresi çoğalmasını daha fazla desteklediği görülmektedir.
Ocak 2011, sayfa 51
Anahtar Kelimeler: Sinir hasarı, sinir doku mühendisliği, polimerler, elektroeğirme.
i
ABSTRACT
Masters Thesis
PROLİFERATİON OF RAT NEONATAL SCİATİC NEURONS ON DİFFERENT
POLYMER MEMBRANE SURFACES
Neslihan ÇELİK
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Chemistry
Supervisor: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN
The aim of this study was to evaluate a variety of surfaces in vitro as cell subtrate for
neonatal rat sciatic neurons for a period of 3 weeks. Collagen, chitosan,
collagen/chitosan, alginate, elastin, elastin/collagen, poly(ε-caprolactone) (PCL),
PCL/fullerene (C60) and PCL/SWCNT membranes were fabricated via a computer
controlled spin-coating setup. Additionally, PCL, PCL/C60 and PCL/SWCNT
composite nanofiber based membranes were fabricated by the electrospinning
technique. Metabolic cell viability was assessed at 1,7,14 and 21. days using the
mitochondrial metabolic activity assay (MTT). All membranes seeded with cells were
routinely investigated by inverted microscope for evaluation of typical neuronal
phenotype. Absorbance measurements taken at 570 nm revealed that surfaces, prepared
by electrospinning were better substrates for cell adhesion, migration and proliferation,
related to the fibrous structure of polymer substrate. The best results, in terms of cell
viablity and proliferation was obtained with the PCL/SWCNT-ES surfaces fabricated by
electrospinning.
January 2011, 51 pages
Key Words: Nerve injury, nerve tissue engineering, polymers, electrospinning.
ii
TEŞEKKÜR
Tez çalışmamı yürütmemde bana yol gösteren danışman hocam Prof. Dr. Y. Murat
ELÇİN’e (Ankara Üniversitesi, Kimya ABD), benden yardımlarını esirgemeyen değerli
hocam Doç. Dr. A. Eser ELÇİN’e (Gazi Üniversitesi, Eğitim Fakültesi, Biyoloji
Öğretmenliği Bölümü), meslektaşım Y. Kimyager Y. Emre ASLAN’a, laboratuvarda
her türlü konuda bana yardımcı olan diğer hocalarıma, arkadaşlarıma, her zaman
yanımda olan aileme ve hayatımın anlamına sonsuz teşekkürler.
Neslihan ÇELİK
Ankara, Ocak 2011
iii
İÇİNDEKİLER
ÖZET............................................................................................................................... .i
ABSTRACT .................................................................................................................... ii
TEŞEKKÜR. ................................................................................................................. iii
SİMGELER DİZİNİ ..................................................................................................... vi
ŞEKİLLER DİZİNİ. .................................................................................................... vii
1. GİRİŞ .......................................................................................................................... 1
2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI .................................. 2
2.1 Sinir Sistemi ve Periferal Sinir Sisteminin Yapısı................................................. 2
2.2 Periferal Sinir Hasarı ............................................................................................... 3
2.3 Periferal Sinir Yenilenmesi. .................................................................................... 5
2.4 Sinir Doku Mühendisliğinde Kullanılan Biyomalzemeler. .................................. 6
2.4.1 Kollajen .................................................................................................................. 7
2.4.2 Kitosan. .................................................................................................................. 8
2.4.3 Alginat .................................................................................................................... 9
2.4.4 Elastin. .................................................................................................................... 9
2.4.5 PCL ....................................................................................................................... 10
2.4.6 Fulleren (C60) ...................................................................................................... 10
2.4.7 Tek Duvarlı Karbon Nanotüp (TDKNT) .......................................................... 10
2.5 Döner Kaplama Yöntemi. ...................................................................................... 11
2.6 Elektroeğirme Yöntemi. ........................................................................................ 12
3. MATERYAL ve YÖNTEM..................................................................................... 14
3.1 Kullanılan Kimyasallar. ........................................................................................ 14
3.2 Döner Kaplama Yöntemi ile Polimer Membranların Hazırlanması. ................ 14
3.2.1 Kollajen membran. ............................................................................................. 14
3.2.2 Kitosan membran. ............................................................................................... 15
3.2.3 Kitosan-kollajen membran ................................................................................. 15
3.2.4 Sodyum alginat membran. ................................................................................. 15
3.2.5 Elastin membran ................................................................................................. 16
3.2.6 Elastin-kollajen membran .................................................................................. 16
3.2.7 PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT membranlar................................................. 16
iv
3.3 Elektroeğirme Yöntemi ile Polimerler Membranların Hazırlanması ............... 17
3.4 Hücre Karakterizasyonu ....................................................................................... 19
3.5 MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür] Testi .......... 21
4. DENEY BULGULARI. ........................................................................................... 22
4.1 MTT Sonuçları ve Görüntüleri. ............................................................................ 22
4.1.1 Kollajen membran .............................................................................................. 22
4.1.2 Kitosan membran ................................................................................................ 23
4.1.3 Kitosan-kollajen membran ................................................................................. 25
4.1.4 Sodyum alginat membran .................................................................................. 26
4.1.5 Elastin membran ................................................................................................. 28
4.1.6 Elastin-kollajen membran .................................................................................. 29
4.1.7 PCL membran ..................................................................................................... 31
4.1.8 PCL-C60 membran ............................................................................................. 32
4.1.9 PCL-TDCNT membran ...................................................................................... 34
4.1.10 Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan PCL membran .................................. 34
4.1.11 Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan PCL-C60 membran .......................... 36
4.1.12 Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan PCL-TDKNT membran ................... 38
4.1.13 Poli-L-Lizin ........................................................................................................ 39
4.1.14 TCP ..................................................................................................................... 41
4.1.15 MTT testi sonuçlarının genel olarak incelenmesi. ......................................... 42
5. TARTIŞMA ve SONUÇ ......................................................................................... 44
KAYNAKLAR ............................................................................................................. 47
ÖZGEÇMİŞ. ................................................................................................................. 51
v
SİMGELER DİZİNİ
C60
Karbon60 (Fulleren)
DMF
Dimetilformamid
EDC
1-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)karbodiimid)
MES
2-(N-Morfolino)ethanesülfonik asit
MTT
3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür
NHS
N-Hidroksisüksinimid
PBS
Phosphate Buffered Saline (fosfat tamponlu tuzlu su)
PCL
Poli-ε-kaprolakton
TDKNT
Tek Duvarlı Karbon Nanotüp
THF
Tetrahidrofuran
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Çok kutuplu sinirin genel yapısı……………………………………………….3
Şekil 2.2 Periferal sinir hasarı sonrası dejenerasyon ve yenilenme adımları……………6
Şekil 2.3 Döner kaplama yönteminin aşamaları ............................... ………………….11
Şekil 2.4 Elektroeğirme düzeneğinin iki farklı biçimi ................................................... 13
Şekil 3.1 Lif oluşum kalitesinin pompa akış hızı ile değişimi ....................................... 18
Şekil 3.2 Lif oluşum kalitesinin şırınga ucu iç çapı ile değişimi ................................... 18
Şekil 3.3 Lif oluşum kalitesinin uygulanan gerilime göre değişimi .............................. 19
Şekil 3.4 Siyatik sinir hücre kültürünün görüntüsü........................................................ 20
Şekil 3.5 Siyatik sinir hücrelerinin H&E boyama sonrası ışık mikroskobu görüntüsü . 20
Şekil 3.6 MTT testi ile formazan kristallerinin oluşumu ............................................... 21
Şekil 4.1 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün kollajen
polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT
testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. .................................. 22
Şekil 4.2 Kollajen membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi..................................................................... 23
Şekil 4.3 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün kitosan polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. .......................................... 24
Şekil 4.4 Kitosan membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi..................................................................... 24
Şekil 4.5 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün kitosan-kollajen
polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT
testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. ................................... 25
Şekil 4.6 Kitosan-kollajen membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu
570 nm’de absorbans ölçümlerinin değişimi .................................................. 26
Şekil 4.7 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün alginat polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. .......................................... 27
Şekil 4.8 Alginat membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi..................................................................... 27
vii
Şekil 4.9 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün elastin polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. .......................................... 28
Şekil 4.10 Elastin membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi.................................................................. 29
Şekil 4.11 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün elastinkollajen polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde
yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü........... 30
Şekil 4.12 Elastin-kollajen membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu
570nm’de absorbans ölçümlerinin değişimi. ............................................... 30
Şekil 4.13 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün PCL polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. ....................................... 31
Şekil 4.14 PCL membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi.................................................................. 32
Şekil 4.15 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün PCL-C60
polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT
testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü. ................................ 33
Şekil 4.16 PCL-C60 membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi.................................................................. 33
Şekil 4.17 PCL-TDKNT membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi .................................................................. 34
Şekil 4.18 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün elektroeğirme
yöntemi ile hazırlanan PCL/EE polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14
ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin
görüntüsü ...................................................................................................... 35
Şekil 4.19 PCL/EE membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi.................................................................. 36
Şekil 4.20 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün Elektroeğirme
yöntemi ile hazırlanan PCL-C60/EE polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7,
c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan
kristallerinin görüntüsü. ............................................................................... 37
viii
Şekil 4.21 PCL-C60/EE membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi.................................................................. 37
Şekil 4.22 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün elektroeğirme
yöntemi ile hazırlanan PCL-TDKNT/EE polimer membran üzerindeki a. 1,
b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan
kristallerinin görüntüsü ................................................................................ 38
Şekil 4.23 PCL-TDKNT/EE membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu
570 nm’de absorbans ölçümlerinin değişimi................................................ 39
Şekil 4.24 Pozitif kontrol için statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre
kültürünün poli-L-lizin kaplı yüzeydeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde
yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü........... 40
Şekil 4.25 Pozitif kontrol statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi................................................................... 40
Şekil 4.26 Negatif kontrol için statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre
kültürünün doku kültürü kabında (TCP) a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde
yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü........... 41
Şekil 4.27 Negatif kontrol grubu statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi.................................................................. 42
Şekil 4.28 Tüm polimerlerin statik siyatik sinir hücresi kültürünün MTT testi sonucu
570 nm’de absorbans ölçümlerinin zamanla değişimi. ................................ 43
ix
1. GİRİŞ
İnsanın tüm zihinsel ve fiziksel aktivitelerinin yönlendiricisi olan merkezi sinir sistemi,
tüm vücuda çok geniş bir periferik sinir sistemi ağı ile bağlıdır. Erişkin sinir
hücrelerinin çoğalma ve kendilerini yenileme kapasiteleri sınırlı olduğu için meydana
gelen sinir hasarının tamiri güçtür. Buna bağlı olarak zarar görmüş bir sinirin ilgili
olduğu organlar da iş göremez hale gelir ve yeniden iyileşmesi de oldukça zorlaşır (Kim
vd. 2008).
Merkezi sinir sisteminin yapısı periferal sinir sistemine göre daha karmaşıktır ve hasarlı
sinirlerin iyileşmesi daha zordur. Sinir dokusu hasarlarında özellikle aksonal büyümenin
altında yatan mekanizmalar konusundaki bilgi eksikliğimiz, sinir onarımına gerçekçi
yaklaşımlar sunmamızı engeller. Ancak son yıllarda edinilen bilgilerin artması, sinir
yenilenmesinde yeni cerrahi tekniklerinin ve doku mühendisliği malzemelerinin
geliştirilmesine olanak sağlamıştır (Huang ve Huang 2006a).
Sinir hasarının tamirinde sinir yapısının ve rejenerasyon mekanizmasının açıklığa
kavuşması, zedelenen siniri tamir etmede bize yol gösterici olacaktır. Sinir doku
mühendisliği çalışmalarında genel uygulama sinir yapısına uygun destek malzemeler
üretmektir. Üretilen malzemeler hem şekil itibariyle hem de içerisinde bulunan
kimyasal maddelerle aksonal yenilenmeyi tetikleyici, yönlendirici ve tamamlayıcı
olmalıdır.
Bu çalışmada, şimdiye kadar periferik sinir hasarında destek olarak sıklıkla kullanılan
polimer malzemelerin, aksonal gelişmeyi desteklemesi yönünden yeni geliştirilen
polimerlerle karşılaştırılmaları esas alınmıştır. Ayrıca elektroeğirme yöntemiyle
oluşturulan nanolifli yapıdaki membran şekillerinin ne ölçüde sinir yönlenmesine ve
yenilenmesine katkısı olduğu da gözlemlenmiştir.
1
2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI
2.1 Sinir Sistemi ve Periferal Sinir Sisteminin Yapısı
Sinir sistemi, merkezi sinir sistemi ve periferik sinir sistemi olmak üzere ikiye ayrılır.
Merkezi sinir sistemi beyin ve omurilikten meydana gelmektedir. İç ve dış etkilerle
oluşan sinirsel uyarılar periferik sinir sistemi yardımı ile merkezi sinir sistemine iletilir.
Merkezi
sinir
sisteminde,
çevreden
gelen
sinyallerin
düzenlenmesinde,
tanımlanmasında, yeni sinyal üretiminde ve sinyallerin çoğaltılıp yayılmasında rol
oynayan nöronlar, astroglia, mikroglia ve oligodentrositler gibi çok fazla sayıda hücre
vardır. Periferik sinir sistemi ise motor nöronlar, duyu nöronları ve glia hücrelerinden
oluşur. Nöronların pek çok farklı tipi olmasına rağmen en yaygın olanı çok kutuplu
şekilde olandır. Genel olarak hücre gövdesi, dentrit ve aksondan oluşur (Şekil 2.1).
Periferik sinir sisteminde nöronların etrafını sararak destek görevi yapan glia
hücrelerine schwann hücreleri denir. Bu hücreler aynı zamanda miyelin kılıf oluşturarak
nöronların dış çevreden izole olması ve daha iyi iletim yapmalarını sağlarlar (Seal vd.
2001).
Schwann hücreleri, tutunma ve destek için kollajen ve laminin gibi hücre dışı matriks
(HDM) molekülleri, bunun yanında L-1 (Sinirsel aktivitelerde rol oynayan hücre
adhezyon molekülü), N-kadherin (Nöral kadherin), gamma-1-integrin (Hücre dışı
haberleşme proteini) ve N-CAM (Nöral hücre adhezyon molekülü) gibi hücre adhezyon
molekülleri ve reseptörleri üretir. Ayrıca NGF (Sinir büyüme faktörü), BDNF (Beyin
kökenli nörotrofik faktör) ve CNTF (Siliar nörotrofik faktör) gibi nörotrofik molekül
karışımını
sentezler.
Schwann
hücreleri
periferik
biçimlenmesinde kritik rol oynar (Huang ve Huang 2006b).
2
aksonların
dizilimi
ve
Şekil 2.1 Çok kutuplu sinirin genel yapısı (Seal vd. 2001)
2.2 Periferal Sinir Hasarı
Açık yaralı periferik sinir hasarlarının %5’i spor, yol kazaları gibi olayların sonucunda
uzuvların zarar görmesiyle meydana gelir. Çoğu zor doğumda da yine uzuvların
sündürme ve çekme gibi hareketler sonrası zarar görmesi ile periferik sinir hasarı ortaya
çıkar. Doğumların %0,12’sinde bu tür durumlarla karşılaşılmaktadır ve pek çok insan
hayatını bu ve benzeri olaylar yüzünden kaliteli bir şekilde sürdüremez (Huang ve
Huang 2006a).
3
Periferal sinir hasarının en çok kullanılan iki sınıflandırma sistemi Sunderland ve
Seddon’a aittir. Sunderland’ın sınıflandırması daha karmaşık olmasına rağmen
operatörler tarafından en benimsenen sınıflandırma sistemidir. Pek çok periferal sinir
hasarı, zorlama, basınç ve batma gibi olaylar sonrası oluşan kesilme ve ezilmelere
bağlıdır. Bu olaylar sonucu sinir gövdesi ya da aksonların anatomik yapısı bozulur
(Campbell 2009).
1947’de Seddon’un yaptığı sınıflandırmaya göre sinir hasarı az hasarlıdan çok hasarlıya
doğru sırasıyla Nöropraksia, Aksonotmezis ve Nörotmezis olarak 3 sınıfta incelenir.
Nöröpraksiada sinir üzerinde oluşan hafif hasarın sonucunda bu bölgedeki aksonlarda
miyelin kaybı görülür ve lokalize olmuş iletim bloğu meydana gelir. Sinir
zedelenmesinde ortaya çıkan akson hasarının hasasiyeti, motor nöronlardan duyu
nöronlara, geniş bölgelerden daha küçük bölgelere, yani yüzeyselden daha derine doğru
artar. Akson çevresinde sinir kılıfı olması sinirin daha az zarar görmesini sağlar.
İnsanlarda, kemirgenlere oranla daha fazla sinir kılıfı vardır. İkinci düzey sinir hasarı
olan Aksonotmezis ise daha şiddetli bir ezilme sonucu aksonun kendisinde meydana
gelir. Aksonun kopan ucu Wallerian dejenerasyonu geçirir. Bu kısım sinir gövdesinden
uzakta kaldığı için yenilenme oranı günde 1-2 mm gibi oldukça az bir değerdir. Sonuçta
bazı nöronlar sinir hasarı nedeniyle kaybedilebilir. Sinir gövdesine uzak olan bu
kısımda daha az sinir hücresi ölümü görülmesine rağmen yenilenme için gerekli olan
transkripsiyon moleküllerinin ekpresyonunun azaldığı görülür. Sinir hasarının üçüncü
ve son tipi ise Nörotmezis olarak adlandırılır. Burada ise endonöriyum, perinöriyum ve
epinöriyumdan oluşan bağ dokusu bileşenlerinin hasar görmesi söz konusudur. Bu
nedenle Sunderland sinir hasarını 5 sınıfta incelenmesini önermiştir. Bu hasar sinirin
tamamen kopması sonucu oluşur ve hasarlı bölge cerrahi girişim ile birleştirilerek tamir
edilir. Buradaki ana problem aksonların uyumsuz bir şekilde birleşip fonksiyonel
özelliklerini yitirmeleridir. Bu yüzden ayrılmış aksonlardaki sinir tamiri daha yavaş
ilerler. Eğer hasarlı bölgenin sinir yenilenmesi, bir yıldan uzun sürerse fonksiyonel bir
tamirden umut kesilebilir (Kern 2008).
4
2.3 Periferal Sinir Yenilenmesi
Sinirin kesilen ucundaki parçanın dejenere olması ile bunun fonksiyonunu yerine
getirecek yeni bir sinir ucu, gövde tarafından oluşturulur. Bu adımlar Şekil 2.2’de
sırasıyla gösterilmiştir. Şekil 2.2.a’da sinir fiberinin, hedef hücre ile normal bir şekilde
sinaptik iletişimini sürdürdüğü, şekil 2.2.b’de fiberin enine kesilmesi sonucu aksonun ve
miyelin kılıfın kesilen uç kısmının parçalanması ve bu parçalanan materyallerin
makrofajlar
ve
schwann
hücreleri
tarafından
fogositoz
yoluyla
ortamdan
uzaklaştırılması, bu sırada nöron gövdesindeki kromatolizis sonucu dentritlerin dallı
uzantılarının içeri doğru çekilmesi, şekil 2.2.c’de ise gövdeye yakın kısımdaki kesikten
aksonal bir filizlenme meydana gelmesi ve Büngner bandı boyunca schwann hücre
çoğalması ile bu filizlenmenin devam etmesi ve son olarak şekil 2.2.d’de ise sinir
fiberinin olgunlaşmasını tamamlayıp hedef hücre ile yeniden iletişime geçmesi
görülmektedir. Yenilenen aksonun normale göre daha küçük boğumlarının olduğu ve
yeteneklerinin etkisinin daha az sürdüğü görülür. Nöron normal iletim fenotipine döner.
Sinirin kesilmesi sırasında hedef hücrede ise fenotipik değişiklikler ve körelmeler
oluşabilir (Navarro vd. 2007).
Sinir yaralanmalarında uygulanan sinir yamalarının başarılı bir şekilde sinir hasarını
onarması o bölgede optimal koşulların oluşturulmasına bağlıdır. Hedeflenen başarı,
endonöriyum ve Schwann hücrelerinin duyarlı hale gelip Wallerian dejenerasyonu
sonrası nakledilen sinir yamasının %100 başarı göstermesidir. Ancak birçok faktör
nedeni ile başarı oranı sınırlıdır (Stang vd. 2009).
.
5
Şekil 2.2 Periferal sinir hasarı sonrası dejenerasyon ve yenilenme adımları (Navarro vd.
2007)
2.4 Sinir Doku Mühendisliğinde Kullanılan Biyomalzemeler
Doku mühendisliği uygulamalarındaki temel prensip zarar görmüş bölgedeki yapıya
uygun biyomalzemeler geliştirmektir. Sinir doku mühendisliğinde de bu prensibe
dayanarak, sinir dokusunu en iyi şekilde taklit edecek yapı oluşturulmaya
çalışılmaktadır.
Sinir doku mühendisliğinde karşılaşılan immün-ret ve doku uyumu problemlerinin
önlenmesi ile umut verici sonuçlar elde edilebilir. İlk olarak sinir doku greftleri hücredostu olacak şekilde modifiye edilmelidir. Yapay malzemeler fiziksel ve kimyasal
özellikleri bakımından kolayca şekillenebilir, iletken, gözenekli, biyouyumlu,
biyobozunur ve mekanik olarak dayanıklı malzemeler olmalıdır. Bununla birlikte
yapıya modifiye edilen substratlar ve Schwann hücreleri gibi destek hücrelerinin
6
kullanılması da sinir hasarının tamiri için önemli faktörlerdir. Bu özellikler aksonal
çoğalma ve büyüme yeteneğini önemli ölçüde değiştirir. Sinir doku mühendisliği
uygulamalarında laminin, kollajen ve fibronektin gibi HDM molekülleri; alginat, agaroz
ve kitosan gibi kolayca polipeptid iskeleleri oluşturabilen doğal polimerler
kullanılmaktadır. Ayrıca biyobozunur ve biyouyumlu olan poli-glikolik asit (PGA),
poli-laktik asit (PLA), poli(L-laktid-ko-kaprolakton) gibi poliesterler ve türevleri yapay
sinir dokusu uygulamalarında sıklıkla kullanılmaktadır (Huang ve Huang 2006b).
2.4.1 Kollajen
Hayvanlarda ve insanlardaki bağ dokunun temel proteini kollajendir. Sağlam demetler
halindeki kollajenler, kollajen lifi olarak adlandırılır. Bu kollajen lifler, dokuların şeklini
koruyan ve destek sağlayan HDM temel bileşenidir. Kollajen büyük bir gerilim
kuvvetine sahiptir. Literatürde 28 tipten daha fazla kollajen türü tanımlanmıştır.
Bunlardan tip I, II, III ve IV vücutta bulunan kollajenin %90’ını oluşturur. Tip I kollajen
periferik sinir sistemindeki en baskın kollajen olmakla birlikte Tip III kollajenle beraber
sinirleri oluşturan proteinlerin %49’unu meydana getirirler. Kollajen doğal bir malzeme
olduğu için toksik olmayan, yüksek biyoabsorblama kapasitesine sahip ve biyouyumu
mükemmel bir malzemedir (Stang vd. 2009).
Kollajen tiplerinin hepsi yapısal olarak üçlü sarmal zincirden oluşmuştur. Kollajen
fibrilleri genellikle tip I, II, III, V ve XI ağırlıklı olarak farklı dokularda farklı oranlarda
birarada bulunurlar. Tip I kollajen uzunluğu 50 nm olan 2 adet α1 zinciri, 1 adet de α2
zincirinden oluşmuştur. En çok deri, kemik, kıkırdak, dentin, kan damarı, kornea ve
tendonlarda bulunur. Tip III ise en çok deri, kan damarı ve iç organlarda görülür. Lif
uzunluğu 30 ile 130 nm arasında değişir ve yapısında 3 adet α1 zinciri vardır. En önemli
özelliği kan damarlarına esneklik kazandırması ve yara iyileşmelerine katkıda
bulunmasıdır. Tip IV kollajen bazal laminanın ve membranların temel bileşenidir.
Yapısı diğerleri gibi sade lifsi şekilde değildir. Polimer düzeni mikrolifler ve bunların
arasında bulunan ağsı yapılardan oluşmuştur (Sell vd. 2009).
7
Kollajen hücre adhezyonu göz önüne alındığında, nöral hücre benzeri PC-12
hücrelerinin yönlendirilmesinde yaygın olarak kullanılır. Ayrıca implantların yüzey
kaplamalarında kullanılarak hücrelerin yüzeye tutunmasının yanısıra implantın vücutla
uyumunu artırıcı özellik gösterir (Straley ve Heilshorn 2009).
Kollajen, sentetik bir malzeme ile karşılaştırıldığında daha geçirgen ve doğal bir
polimer olmasından kaynaklanan birçok avantaja sahiptir. 5 ve 10 mm’lik siyatik siniri
hasarında kollajen ve silikon yapay sinir tüpleri ile yapılan çalışmada, kollajenin silikon
ile karşılaştırıldığında aksonal yenilenme, Schwann hücresi ile uyumu ve dokuda
damarlaşma gibi özellikleri göz önüne alındığında daha iyi bir malzeme olduğu
görülmektedir (Kemp vd. 2009).
2.4.2 Kitosan
Kitosan, anti-tümör, antibakteriyel, biyobozunur ve biyouyum özelliklerinden dolayı
sinir yenilenmesinde kullanılabilecek materyaller arasında uygun bir adaydır. Jianchun
ve arkadaşlarının da rapor ettiği gibi kitosan membran üzerinde kültüre edilen
nöronların çok iyi geliştikleri ve periferal sinir sistemi uygulamalarında kullanılan
kitosan tüplerin sinir tamirini desteklediği görülmüştür (Kim vd. 2008).
Kitosanla hazırlanan membran ve liflerin in vitro ortamda Schwann hücreleri ile yapılan
çalışmasında, MTT sonuçlarına göre kitosanın hücre büyümesine sitotoksik etkisinin
olmadığı görülmüştür. Kitosan lifler ve polilizin kaplı coverslipler karşılaştırıldığında,
schwann hücrelerinin kitosan membranla uyumu nispeten daha yüksektir. Deneysel
sonuçlara göre schwann hücreleri kitosan malzeme üzerinde küresel ve oval olmak
üzere iki şekilde uzanırlar. Oval şekildeki hücreler şekil itibariyle de lif yapısındaki
kitosanı kuşatmaya daha eğimlidirler. Buna göre hücrelerin kitosan lif yapısı üzerindeki
göçü ve uzanımı membran yapısındakinden daha hızlıdır (Yuan vd. 2004).
8
2.4.3 Alginat
Alginat suyosunundan ekstrakte edilen β-D-mannuronik asit ve α-L-glukonik asitten
oluşan iyi düzenlenmiş ve biyobozunur özellikteki bir kopolimerdir. Alginatın in vitro
ortamda hücre yayılmasını engelleyici hiçbir etkisinin olmadığı ve ayrıca in vivo
ortamda alginatın yerleştirildiği dokuda çok az vücut reaksiyonuna sebep olduğu
görülmüştür. Alginat, schwann hücre göçünde olduğu gibi sinir hücresi yenilenmesi ve
yayılmasında da uygun ortamın oluşmasını sağlamaktadır. Hashimoto ve arkadaşları
alginat jelde periferal hücre yenilenmesinin erken ve geç dönem analizlerinde, alginatın
akson yenilenmesinde kollajen ve fibrinden daha etkili olduğunu göstermişlerdir
(Hashimoto vd. 2002).
2.4.4 Elastin
Elastin temelli materyaller doku mühendisliği uygulamalarında gittikçe daha da popüler
hale gelmektedir. Bu ilgi elastinin dikkat çekici özelliklerinden kaynaklanmaktadır.
Elastin organ ve dokulara elastiklik özelliği kazandıran HDM proteinidir. Bu yüzden
elastikiyetin çok önemli olduğu, hayat boyunca milyarlarca kez gerilme ve gevşeme
hareketi yapan damarlar, akciğerler ya da deri gibi organ ve dokularda oldukça bol
miktarda elastin lifler bulunur. Elastin ve benzeri biyomalzemeler deri nakilleri, damar
greftleri, kalp kapakçıkları ve elastik kıkırdak gibi çok çeşitli doku mühendisliği
uygulamalarında kullanılmaktadır (Dameen vd. 2007).
Yapılan birçok çalışma dokuya yabancı malzemenin yüzeyi HDM proteinleri ile
kaplandığında hücrelerin adhezyonun ve gelişiminin olumlu yönde etkilendiğini
göstermektedir. Straley ve Heilshorn’un yaptığı çalışma da HDM proteinlerinin
dizilerinindeki fonksiyonel gruplardan oluşan protein dizileri üretirken elastinin protein
dizileri kullanılmıştır. Elastin yapısının nöral hücre karakterini etkilememesi yani inert
olması ve nanoboyutta yüzey kaplama tekniğinde kullanılacak biyofonksiyonel
grupların tutturulması için uygun tekrarlanabilir protein dizileri oluşturması elastinin bu
çalışma için seçilmesini sağlamıştır (Straley ve Heilshorn 2009).
9
2.4.5 PCL
Poli-L-kaprolakton (PCL), genellikle farmasötik ürünler ve yara örtüleri yapımında
kullanılan, biyouyumlu ve biyobozunur alifatik bir poliesterdir. Su, yağ, diğer kimyasal
çözücüler ve klora karşı iyi direnç gösterir. Fizyolojik şartlarda (insan vücudu gibi) ester
bağlarının hidrolizi ile bozunur. Bu özellikleri ile nakillerde kullanılan biyomalzeme
olarakta büyük ilgi görür. Schnell ve arkadaşlarının, elektroeğirme ile yönlenmiş
nanolifli sinir kanalı şeklindeki PCL ve PCL/kollajen yapılarını, dorsal kök ganglia’dan
elde edilen sinir hücreleri ile kültüre ettikleri çalışmada her iki lifli yapının da sinir
ilerlemesini ve glia hücrelerinin göçünü desteklediği gözlenmiştir (Tabesh vd. 2009).
2.4.6 Fulleren (C60)
1985’te keşfedilen fulleren yapısı, yalnızca karbon atomlarının bir araya gelerek
oluşturduğu çokgen yapılardır. C60’da 60 adet karbon atomu altıgen beşgen gibi
geometrik şekillerde birbirine tutunarak bir futbol topu şekline benzer yapı
oluşturmaktadır (Kaladhar ve Sharma 2007).
C60 literatürde nanomalzeme ve molekül olarak tanımlanmaktadır. C60’ın yapısına
baktığımızda kristal yapıdadır. Boyutları küçük olduğundan bu nanopartiküllerin
biyolojik olarak aktif olma ve normal hücre işleyişini etkileme potansiyelleri vardır.
Uzun süreli maruz kalma durumları hakkında günümüzde rapor edilmiş bilgiler
bulunmamaktadır. Kısa süreli maruz kalma durumlarında ise memeli akciğerlerinde
küçük hava yollarını tıkayabileceği belirtilmiştir (Sayes vd. 2005).
2.4.7 Tek Duvarlı Karbon Nanotüp (TDKNT)
1991’de yapılan uzunluğu 1-3 µ ve çapı 1-3 nm olan karbon iplikler, sık kullanılan
adıyla karbon nanotüpler, sıradışı özellikleri sayesinde, karbon araştırmalarında yeni bir
çığır açmıştır. Kan ile uyumlu karbon nanotüpler, ilaç salınımı ve doku mühendisliği
uygulamalarında sınırsız fırsatlar ortaya koymuştur (Kaladhar ve Sharma 2007).
10
Bugün nanoteknolojide kullanılan ve diğer malzemelere göre daha etkili olan pek çok
materyaller gibi karbon nanotüplerde mekanik, elektronik ve diğer önemli özellikleri
bakımından umut vericidir. Mekanik ve elektronik açıdan bakılınca nanofiber kompozit
malzemede kullanılan dağınık ya da sıralı KNT yapılarının gelecek vaadettiği
düşünülmektedir. Geniş açı değeri, küçük boyut, yüksek dayanıklılık, düşük yoğunluk,
yüksek iletkenlik, yüksek elastikiyet ve esneklik özellikleri eğme, bükülme ve
sıkıştırmalara karşı dayanıklılık sağlar. Bu bakımdan KNT’ler nanokompozit malzeme
oluşturmak için ideal birer adaydır (Chronakis 2005).
2.5 Döner Kaplama Yöntemi
Döner kaplama yöntemi ile cihazın dönme hızından yararlanılarak membranın hem daha
homojen hem de daha ince olması sağlanır. Bu yöntem 4 aşamada incelenebilir (Şekil
2.3). Çökme, hızlanma, kaplama ve buharlaşma aşamaları sırasıyla gerçekleşir. Bu
aşamalarda dönme hızı giderek arttırılarak, çözeltinin bulunduğu yüzeyi ince bir film
şeklinde kaplaması sağlanır. Son aşamada ise yüzeyi kaplayan maddenin içindeki
çözücünün buharlaşması sağlanır. Oluşan membran ne kadar ince olursa buharlaşma o
kadar kolay olacaktır (Luurtsema 1997).
Şekil 2.3 Döner kaplama yönteminin aşamaları (Luurtsema 1997)
11
2.6 Elektroeğirme Yöntemi
Elektroeğirme yöntemi, ilk olarak 1897’de Rayleigh tarafından, detaylı olarak da
1914’de Zeleny tarafından elektropüskürtme çalışmaları ile ortaya çıkmış eski bir
yöntemdir. 1934’de ise Formhals tarafından tescillenmiştir. Elektroeğirme kelimesi
elektrostatik eğirmeden türemiş ve günümüzde (1994’den beri) bu şekli ile
benimsenmiş bir kelimedir. Formhals elektrostatik güç kullanılarak üretilmiş polimer
liflerin deney düzeneği ile ilgili birçok patent yayınlamıştır. Elektroeğirme yönteminde
elektrostatik çökelme ve püskürtme gibi çeşitli tekniklere benzer işlemler uygulanır.
Temel prensip çift taraflı güçlü gerilim oluşturularak yüklü polimer damlacığın yüzey
gerilimini yenmektir. Yöntem oda sıcaklığında ve atmosfer koşullarında yürütülür.
Genellikle dikey ve yatay olmak üzere iki standart elektroeğirme yöntemi
kullanılmaktadır (Şekil 2.4). Temelde sistem üç ana bileşenden oluşur. Bunlar; yüksek
voltajlı güç kaynağı, düze (küt enjektör ucu ya da pipet ucu) ve toplama plakası (metal
plaka ya da döner mil). Gelişen teknoloji ile birlikte birçok araştırma grubu karmaşık
nanolifli yapıları daha kontrollü ve
etkili bir şekilde oluşturabilen ileri sistemler
geliştirmişlerdir (Bhardwaj ve Kundu 2010).
Elektroeğirme yöntemi, genellikle birbiri ile bağlantılı gözenekli sentetik biyopolimer
malzemeler üretmek için kullanılır. Bu yöntemde rastgele yönlenmiş nanolifler, yüksek
oranda yüzey alanını oluşturarak, hücre çoğalması ve kültür ortamının geçişi için uygun
ortamı sağlarlar (Inanç vd. 2009).
12
Şekil 2.4 Elektroeğirme düzeneğinin iki farklı biçimi (Bhardwaj ve Kundu 2010)
a) Dikey elektroeğirme düzeneği
b) Yatay elektroeğirme düzeneği
13
3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.1 Kullanılan Malzemeler ve Cihazlar
Bu çalışmada polimer membranların hazırlanmasında sıçan kuyruğundan izole edilen
Tip-I kollajen, kitosan (Medium Molecular Weight/ 400.000-FLUKA, St. Louis, MO,
ABD), alginik asitin sodyum tuzu (Sigma, St.Louis, MO, ABD) ve sığır boynu bağ
dokusundan izole edilmiş elastin (Sigma, St.Louis, MO, ABD) kullanılmıştır.
Çapraz
bağlayıcı
olarak
da
EDC
(1-Etil-3-(3-Dimetilaminopropil)karbodiimid.
Hidroklorür), MES (2-(N-Morfolin)ethanesülfonik asit) ve NHS(N-Hidroksisüksinimid)
(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, ABD) kullanılmıştır. Hücre canlılığı için MTT [3-(4,5dimetildiyazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür] Testi kitleri (Sigma, St.Louis, MO,
ABD) kullanılmıştır.
Deney süresince hücreler Heraus marka (Hera Cell 240, Almanya) inkübatör içerisinde
kültüre edilmiştir. Ayrıca laminer kabin Nuaire ( NU-425-400E, ABD), petriler (Orange
Scientific, Belçika), 24 kuyucuklu plakalar (Orange Scientific, Belçika), hücre kültür
kapları (T-25 ve T-75, Corning, ABD) ve görüntüleme için Nikon ( TS-100, Japonya)
marka
mikroskop
kullanılmıştır.
Polimer
membranların
hazırlanmasında
ise
laboratuarımızda tasarlanan elektroeğirme cihazı, güç kaynağı olarak DC high voltage
power supply FC60PO2 (Glassman, ABD) ve spincoating için SSE (Almanya) marka
cihazlar kullanılmıştır. Absorbans değerleri ise Biotrak II Plate reader (Amersham,
İngiltere) ile belirlenmiştir.
3.2 Döner Kaplama Yöntemi ile Polimer Membranların Hazırlanması
3.2.1 Kollajen membran
Kollajen membranların hazırlanmasında çapraz bağlayıcı olarak EDC (1-Etil-3-(3dimetilaminopropil)karbodiimid.Hidroklorür)
kullanıldı.
Çapraz
bağlayıcının
hazırlanmasında Pietrucha ve Marzec’in (2005) kullandığı yöntemden yararlanıldı.
14
%0,8’lik kollajen çözeltisi (sıçan kuyruğundan izole edilmiş Tip-I kollajen) teflon kalıp
içerisine dökülerek döner kaplama cihazına yerleştirildi. 4 dakika 250-750 rpm arasında
döndürme yapıldı. Cihazdan çıkarılan membran 24 saatlik kurumaya bırakıldı. Sonra 25
mL 50 mM MES (2-(N-Morfolin)etansülfonik asit) içerisinde 216 mg EDC ve 160 mg
NHS (N-Hidroksisüksinimid) çözülerek pH 5.5’e ayarlandı. Hazırlanan çapraz bağlama
çözeltisi, kollajenin üzerine dökülerek membranın her tarafının çapraz bağlayıcı ile
teması sağlandı. Sonra çözelti membran üzerinden çekilip 3’er kez PBS (pH=7.4) ve
distile su ile yıkama yapıldı. Kurutulan membran UV’de steril edilip kullanıma hazır
halde saklandı.
3.2.2 Kitosan membran
Kitosan membran hazırlamak için önce %2’lik asetik asitte çözülmüş %1’lik kitosan
çözeltisi hazırlandı. Teflon plaka üzerine dökülerek bu plaka döner kaplama cihazına
yerleştirildi yine 4 dk’lık döndürme yapılarak plaka cihazdan alındı. 50ºC’de kurutulup
ardından 0,5 M NaOH ile 30 dk muamele edildi. Sonra 10 kez distile su ve 3 kezde
etanolle yıkandı. UV ile steril edilip kullanıma hazır halde saklandı (Elçin vd. 1998).
3.2.3 Kitosan-kollajen membran
Daha önce hazırlanan %0,8’lik kollajen ve %1’lik kitosan çözeltileri 1:1(w/w) oranında
karıştırılarak teflon plakaya döküldü. Döner kaplama cihazında 4 dakikalık döndürme
yapıldı ve 24 saat boyunca kurumaya bırakıldı. Ardından çapraz bağlama çözeltisi
(EDC-NHS-MES pH:5.5) ile çapraz bağlam işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra da PBS
(pH=7.4) ve distile su ile yıkama yapıldı. Kurutulduktan sonra UV ile steril edilip
kullanıma hazır hale getirildi.
3.2.4.Sodyum alginat membran
Sodyum alginatın %2’lik çözeltisi hazırlanarak teflon plakaya döküldü. Döner kaplama
cihazında 4 dakikalık döndürme yapıldı ve ardından 24 saat boyunca kurutuldu.
Kuruyan membran 0,1 M CaCI2 ile muamele edildikten sonra PBS ve distile su ile
15
yıkanarak kurutuldu. Ardından UV’de steril edilip kullanılıncaya kadar saklandı (Elçin
vd. 1998).
3.2.5 Elastin membran
Elastin membran hazırlanmasında da çapraz bağlayıcı olarak EDC çözeltisi kullanıldı
(Daamen vd. 2005). Elastinin %1’lik çözeltisi hazırlanarak Teflon plakaya döküldü ve
döner kaplama cihazında 4 dakikalık döndürme yapıldı. Cihazdan çıkarılan membran 24
saat kurutulduktan sonra çapraz bağlama çözeltisi (EDC-NHS-MES pH:5.5) membran
üzerine dökülerek elastinin çapraz bağlanma işlemi gerçekleştirildi. Membran sırası ile
PBS (pH=7.4) ve distile su ile yıkandı. UV ile steril edilip kullanıma hazır hale getirildi.
3.2.6 Elastin-kollajen membran
Elastin (%1) ve kollajen (%0,8) çözeltileri 1:1 (w/w) oranında karıştırılarak Teflon
plaka içine döküldü. Döner kaplama cihazı ile 4 dakikalık döndürme işlemi
uygulandıktan sonra membran 24 saat kurutuldu. Membran üzerine çapraz bağlama
çözeltisi (EDC-NHS-MES pH:5.5) dökülerek çapraz bağlama işlemi gerçekleştirildi.
Membran önce PBS (pH=7.4) sonra da distile su ile yıkandı. UV ile steril edilip
kullanıma hazır hale getirildi.
3.2.7 PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT membranlar
İlk olarak PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT çözeltileri hazırlandı. Bunun için izlenen
adımlar;
1. PCL çözeltisinin hazırlanışı
PCL’un, DCM:THF:DMF çözücü sistemi içerisindeki %8’lik çözeltisi hazırlandı.
2. PCL-C60(Fulleren) çözeltisinin hazırlanışı
DCM:THF:DMF çözücü sistemine C60 karıştırılarak iyice doygun hale getirildi. Sonra
PCL bu çözücü sistem ile çözerek %8’lik çözelti hazırlandı.
16
3. PCL-TDKNT çözeltisinin hazırlanışı
Bu
çözelti
de
C60’lı
çözeltinin
hazırlanmasına
benzer
şekilde
hazırlandı.
DCM:THF:DMF çözücü sistemi TDKNT ile iyice doygun hale getirilip ardından PCL
bu çözücü sistemle çözülerek %8’lik çözelti elde edilmiş oldu.
Hazırlanan 3 ayrı polimer çözeltisi 3 ayrı teflon plaka içerisine döküldü. Hazırlanan
plakalar döner kaplama cihazına yerleştirilerek 4’er dakikalık döndürme işlemi
uygulandı. Cihazdan çıkarılan plaka içerisindeki homojen membranlar, plakadan
çıkarılıp çözücüsünün uçması için 5 dakika kurumaya bırakıldı. Bu şekilde hazırlanan 3
ayrı polimer PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT distile su ile yıkanıp, UV’de steril
edilerek kullanıma hazır hale getirildi.
3.3 Elektroeğirme Yöntemi ile Polimer Membranların Hazırlanması
PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT çözeltileri döner kaplama sistemi için hazırlandığı
biçimde PCL oranı %8 olacak şekilde hazırlandı. Elektroeğirme işlemi ile kaplama
yapmadan önce deneysel olarak optimal değerler bulundu. İlk olarak PCL çözeltisi
elektroeğirme cihazına yerleştirilir ve pompa akış hızı 0,002 mL/dak olarak belirlendi
(Şekil 3.1). Çözeltinin basıldığı şırınganın ucunun iç çapı 26 G olacak şekilde
kütleştirildi (Şekil 3.2). Güç kaynağı 28 kV ayarlandı (Şekil 3.3) ve elektroeğirme
işlemine başlandı. Cihazın iç kısmındaki lif toplama alanına alüminyum plaka konuldu.
Onun üzerine de coverslip (poli-L-Lizin kaplı yuvarlak plaka) yerleştirildi. Coverslip
yüzeyi istenilen şekilde kaplandıktan sonra membranlar yüzeyden kaldırılıp UV’de
steril edilip ve kullanıma hazır halde saklandı. PCL ile yapılan bu işlem PCL-C60 ve
PCL-TDKNT kompozitleri ile de tekrarlandı.
17
L if Oluş um K alites i
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
100
200
300
400
500
P om pa Akış Hız ı (μL /da k)
L if Oluş um K alites i
Şekil 3.1 Lif oluşum kalitesinin pompa akış hızı ile değişimi (0→1 parçacıklı yapıdan
tam lif yapısına doğru oluşum)
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
20
21
22
23
24
25
26
Ş ırıng a Uc u İç Ç a pı (G )
Şekil 3.2 Lif oluşum kalitesinin şırınga ucu iç çapı ile değişimi (0→1 parçacıklı yapıdan
tam lif yapısına doğru oluşum)
18
L if Oluş um K alites i
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
5
10
15
20
25
30
Uyg ula na n G e rilim (kV)
Şekil 3.3 Lif oluşum kalitesinin uygulanan gerilime göre değişimi (0→1 parçacıklı
yapıdan tam lif yapısına doğru oluşum)
3.4 Hücre Karakterizasyonu
Laboratuvarımızda izole ettiğimiz neonatal (1 günlük) sıçan siyatik sinir hücreleri %10
fötal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, %1 ITS, %1 esansiyel olmayan amino asitler
içeren α-MEM içine alınıp kültüre edildi. Kültüre edilen hücrelerin karakterizasyonu
hematoksilin-eozin (H&E) hücre boyama yöntemi ile boyanarak belirlendi.
24
kuyucuklu plaka içerisine yerleştirilen önceden hazırlanmış polimer membranlar üzerine
hücre ekimi gerçekleştirildi. 24 kuyucuklu plaka %90 nem, %5 CO2 ve 37ºC
şartlarındaki inkübatör içinde 2-3 günde bir vasatı değiştirilerek kültüre edildi. Hücremembran yapılarının 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki takiplerine göre polimerlerle hücrelerin
etkileşimi ve hücre canlılığı faz kontrast mikroskobu ve MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür] testi sonuçlarına göre değerlendirildi.
19
10µm
Şekil 3.4 Siyatik sinir hücre kültürünün görüntüsü
10µm
Şekil 3.5 Siyatik sinir hücrelerinin H&E boyama sonrası ışık mikroskobu görüntüsü
20
3.5 MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür] Testi
MTT testi, hücrelerin hayatta kalması ve çoğalmalarını, mitokondriyel aktivitelerinin
kalorimetrik olarak ölçülmesi ile takip edilebilir hale getiren bir yöntemdir. İlk olarak
Mosmann tarafından bulunmuş, Denizot ve Lang tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem,
hücredeki solunum zinciri ve diğer elektron taşıma sistemlerinden çıkan elektronların,
ortama konulan MTT ya da diğer tetrazolyum tuzlarını indirgemesi ve suda
çözünmeyen mor rekli formazan kristalleri oluşturması esasına dayanır. Böylece
hücrelerin canlılığı ve çoğalmaları takip edilebilir (Freimoser vd. 1999).
Şekil 3.6 MTT testi ile formazan kristallerinin oluşumu
MTT testi, farklı polimer membranlar ile kültüre edilmiş siyatik sinir hücrelerinin 1, 7,
14 ve 21. günlerdeki hücre aktivitelerinin ölçülmesi için uygulandı. 24 kuyucuklu
plakalarda bulunan hücre-polimer örneklerinin üzerine herbir örnek için 150 µL MTT
çözeltisi eklenip 4 saat boyunca inkübatörde bekletildi. Daha sonra hücrelerin üzerinde
oluşan formazan kristallerinin faz kontrast mikroskobu ile görüntülerine bakıldı.
Absorbans değerlerinin ölçülebilmesi için örnekler üzerine 300 µL MTT çözücüsü
eklendi. Bu çözücü ile oluşturulan formazan kristalleri 30 dk boyunca beklenerek
çözüldü ve örnekler üzerinden çözelti alınarak UV spektrometreye yerleştirildi. 570
nm’de örnekler üzerinde oluşan formazan kristallerinin absorbans değerlerine bakıldı.
Uygulama sonunda örnek sonuçlarının ortalama değerleri alınarak günler içindeki
değişimi grafiğe geçirildi.
21
4. DENEY BULGULARI
4.1 MTT Sonuçları ve Görüntüleri
4.1.1 Kollajen membran
Kollajen membran üzerinde 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki MTT testi sonrası oluşan
formazan kristallerinin faz kontrast görüntülerine bakılarak membran yüzeyinde
formazan kristallerinin gruplar oluşturarak genellikle homojen dağılım gösterdiği
gözlemlenmiştir. Kristallerin en yoğun oluştuğu günler statik kültürün başı ve sonu olan
1. ve 21. günlerdir (Şekil 4.1).
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.1 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün kollajen
polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT
testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
22
Absorbans
Kollajen
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Kollajen
1. Gün
7. Gün
14. Gün
Zaman
21. Gün
Şekil 4.2 Kollajen membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
Kollajen membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri ilk güne göre 7. ve 14.
günlerde giderek azalmıştır. 21. günde ise azalma tersine dönmüş ve en yüksek aktivite
değerine ulaşmıştır (Şekil 4.2).
4.1.2 Kitosan membran
Kitosan membran üzerinde 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki MTT testi sonrası oluşan
formazan kristallerinin görüntülerine bakılarak membran yüzeyinde, formazan
kristallerinin nokta nokta dağınık halde bulundukları görülmektedir (Şekil 4.3).
Kitosan membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri 14. gün en yüksek
değerindedir (Şekil 4.4).
23
a
b
10 µm
10 µm
d
c
10 µm
10 µm
Şekil 4.3 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün kitosan polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
Absorbans
Kitosan
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Kitosan
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.4 Kitosan membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
24
4.1.3 Kitosan-kollajen membran
Kitosan-kollajen membran üzerinde MTT testi sonrası oluşan formazan kristallerinin 1,
7, 14 ve 21. günlerdeki görüntülerine bakılarak formazan kristallerinin bazı bölgelerde
gruplar halinde bazı bölgelerde ise dağınık olarak dağılım gösterdiği gözlemlenmiştir
(Şekil 4.5).
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.5 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün kitosan-kollajen
polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT
testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
Kitosan-kollajen membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri
çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen
değerlere göre neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri ilk gün en
yüksek olmak üzere, ilk güne göre 7. ve 14. günlerde azalmış, 21. günde ise en düşük
değerine ulaşmıştır (Şekil 4.6).
25
Kitosan-Kollajen
Absorbans
0.3
0.25
0.2
0.15
Kitosan-Kollajen
0.1
0.05
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.6 Kitosan-kollajen membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570
nm’de absorbans ölçümlerinin değişimi
4.1.4 Sodyum alginat membran
Alginat membran üzerinde 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki MTT testi sonrası oluşan
formazan kristallerinin görüntülerine bakılarak membran yüzeyinde formazan
kristallerinin deney günleri boyunca farklı dağılımlar gösterdiği söylenebilir (Şekil 4.7).
Alginat membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri ilk gün en yüksek olmak
üzere giderek azalmıştır. 21. günde ise en düşük seviyesine inmiştir (Şekil 4.8).
26
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.7 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün alginat polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
Absorbans
Alginat
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Alginat
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.8 Alginat membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
27
4.1.5 Elastin membran
Elastin membran üzerinde 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki MTT testi sonrası oluşan formazan
kristallerinin görüntülerine bakılarak membran yüzeyinde formazan kristallerinin
dağınık olarak dağılım gösterdiği gözlemlenmiştir (Şekil 4.9).
a
b
10 µm
10 µm
d
c
10 µm
10 µm
Şekil 4.9 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün Elastin polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
Elastin membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri 7. gün en yüksek olmak
üzere zamanla azalmıştır (Şekil 4.10).
28
Elastin
0.35
Absorbans
0.3
0.25
0.2
Elastin
0.15
0.1
0.05
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.10 Elastin membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
4.1.6 Elastin-kollajen membran
Elastin-kollajen membran üzerinde 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki MTT testi sonrası oluşan
formazan kristallerinin görüntülerine bakılarak membran yüzeyinde formazan
kristallerinin bazı yerlerde gruplar oluşturarak bazı yerlerde dağınık şeklinde dağılım
gösterdiği gözlemlenmiştir. Kristallerin en yoğun oluştuğu günler statik kültürün başı
olan 1. gündür. Daha sonra gittikçe danık yerleşmiş kristal yapılar oluşmuştur (Şekil
4.11).
Elastin-kollajen membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri
çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen
değerlere göre neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri ilk gün en
yüksek olmak üzere kültür süresi boyunca giderek azalmış, 21. günde ise en düşük
değerine ulaşmıştır (Şekil 4.12).
29
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.11 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün
elastin-kollajen polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21.
günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
Absorbans
Elastin-Kollajen
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
Elas tin-Kollajen
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.12 Elastin-kollajen membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570
nm’de absorbans ölçümlerinin değişimi
30
4.1.7 PCL membran
PCL membran üzerinin öbek öbek dairesel yapılardan oluştuğu, 1, 7, 14 ve 21.
günlerdeki MTT testi sonrası oluşan formazan kristallerinin de bu yapıların iç
kısımlarında ve yapıların aralarında oluştuğu gözlenmiştir (Şekil 4.13).
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.13 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün PCL polimer
membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi
sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
PCL membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri zamanla giderek daha da
azalmıştır (Şekil 4.14).
31
PCL/F
0.25
Absorbans
0.2
0.15
PCL/F
0.1
0.05
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.14 PCL membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
4.1.8 PCL-C60 membran
PCL-C60 membran üzerinin de öbek öbek dairesel yapılardan oluştuğu, 1, 7, 14 ve 21.
günlerdeki MTT testi sonrası oluşan formazan kristallerinin de yine bu yapıların iç
kısımlarında ve yapıların aralarında çok az miktarda oluştuğu gözlenmiştir (Şekil 4.15).
PCL-C60 membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek
UV spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin 7. gün mitokondriyel aktiviteleri 1. güne göre artmış
ve diğer günler giderek azalan bir grafik izlemiştir (Şekil 4.16).
32
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.15 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün PCL-C60
polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT
testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
PCL-C60/F
0.3
Absorbans
0.25
0.2
PCL-C60/F
0.15
0.1
0.05
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.16 PCL-C60 membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
33
4.1.9 PCL-TDKNT membran
PCL-TDKNT membran yapısının 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki mikroskop incelemeleri ve
fotoğraflamaları yapılmasına rağmen kayda değer hiçbir görüntü elde edilememiştir.
Bunun için yalnızca MTT Testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570 nm’de absorbans ölçümlerine bakılmıştır. Bu ölçüm değerlerine
göre neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri 7. gün en yüksek
değerde olmak üzere 7 ve 14. günler 1. güne oranla yaklaşık iki katı artmış 21. gün ise
1. günün yaklaşık yarısı kadar düşüş göstermiştir (Şekil 4.17).
Absorbans
PCL-TDKNT/F
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
PCL-TDKNT/F
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.17 PCL-TDKNT membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
4.1.10 Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan PCL membran
Elektroeğirme yöntemi kullanılarak hazırlanmış PCL membranlar üzerinde MTT testi
sonrası oluşan formazan kristallerinin 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki görüntülerine bakılarak
lifsi yapıya uygun olarak dağılım gösterdiği gözlemlenmiştir. Buradaki lifler boyunca
sık bir şekilde formazan kristalleri oluşmuştur (Şekil 4.18).
34
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.18 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün Elektroeğirme
yöntemi ile hazırlanan PCL polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c. 14 ve
d. 21. günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin
görüntüsü
PCL/EE membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV
spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre
neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri düzenli bir artış
göstermiştir. En yüksek değer ise 21. günde ölçülmüştür (Şekil 4.19).
35
PCL/EE
3
Absorbans
2.5
2
PCL/EE
1.5
1
0.5
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.19 PCL/EE membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
4.1.11 Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan PCL-C60 membran
Yine Elektroeğirme yöntemi kullanılarak hazırlanmış PCL-C60 membranlar üzerinde
MTT testi sonrası oluşan formazan kristallerinin 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki
görüntülerine bakıldığında da hücrelerin lifsi yapıya uygun olarak dağılım gösterdiği
gözlemlenmiştir. Burada da liflerin yönlenme doğrultularında, sıklıkla formazan
kristallerinin oluştuğu görülmektedir (Şekil 4.20).
PCL-C60/EE membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri
çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen
değerlere göre neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri düzenli bir
artış göstermiştir. En yüksek değer ise 21. günde ölçülmüştür (Şekil 4.21).
36
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.20 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün Elektroeğirme
yöntemi ile hazırlanan PCL-C60 polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7, c.
14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan
kristallerinin görüntüsü
PCL-C60/EE
Absorbans
2.5
2
1.5
PCL-C60/EE
1
0.5
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.21 PCL-C60/ES membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
37
4.1.12 Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanmış PCL-TDKNT membran
Elektroeğirme yöntemi kullanılarak hazırlanan 3. membran olan PCL-TDKNT üzerinde
MTT testi sonrası oluşan formazan kristallerinin 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki
görüntülerine bakıldığında ise yine hücrelerin dağılımının lifsi yapının yönlendiği
doğrultuda olduğu gözlemlenmiştir. Burada da liflerin etrafında sıklıkla formazan
kristallerinin oluştuğu görülmektedir (Şekil 4.22).
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.22 Statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre kültürünün Elektroeğirme
yöntemi ile hazırlanan PCL-TDKNT polimer membran üzerindeki a. 1, b. 7,
c. 14 ve d. 21. günlerde yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan
kristallerinin görüntüsü
PCL-TDKNT/EE membran üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri
çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri ölçülmüştür. Ölçülen
değerlere göre neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel aktiviteleri gittikçe daha
38
fazla artış göstermiştir. En yüksek değer ise bu polimer içinde 21. günde ölçülmüştür
(Şekil 4.23).
PCL-TDKNT/EE
3
Absorbans
2.5
2
PCL-TDKNT/EE
1.5
1
0.5
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.23 PCL-TDKNT/EE membran statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570
nm’de absorbans ölçümlerinin değişimi
4.1.13 Poli-L-Lizin
Yapılan deneyde hücrelerin tutunmasına ve çoğalmasına uygun ortam olan poli-l-lizin
(+) kontrol amaçlı kullanılmıştır. Poli-l-lizin kaplı plakada MTT testi sonrası oluşan
formazan kristallerinin 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki görüntülerine bakıldığında hücrelerin
yüzey üzerindeki dağılımının homojen bir şekilde olduğu gözlenmektedir (Şekil 4.24 ).
Poli-l-lizin kaplı yüzeyde neonatal siyatik sinir hücreleri ile yapılan deney serisinde
MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de
absorbans değerleri ölçülmüştür. 1, 7, 14 ve 21. günlerde ölçülen değerlere göre sinir
hücrelerinin mitokondriyal aktiviteleri giderek azalmıştır (Şekil 4.25).
39
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.24 Pozitif kontrol için statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre
kültürünün poli-L-lizin kaplı yüzeydeki a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde
yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
Poli-L-lizin
0.35
Absorbans
0.3
0.25
0.2
Poli-L-lizin
0.15
0.1
0.05
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
21. Gün
Zaman
Şekil 4.25 Pozitif kontrol statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
40
4.1.14 TCP
Yapılan deneyde hücrelerin ekildiği polistirenden üretilen 24 kuyucuklu plaka yüzeyi
(TCP) ise (-) kontrol amaçlı kullanılmıştır. TCP üzerindeki MTT testi sonrası oluşan
formazan kristallerinin 1, 7, 14 ve 21. günlerdeki görüntülerine bakıldığında hücrelerin
dağılımının seyrek ve dağınık olduğu gözlenmiştir (Şekil 4.26).
a
b
10 µm
10 µm
c
d
10 µm
10 µm
Şekil 4.26 Negatif kontrol için statik olarak yürütülen neonatal siyatik sinir hücre
kültürünün doku kültürü kabında (TCP) a. 1, b. 7, c. 14 ve d. 21. günlerde
yapılan MTT testi sonucu oluşan formazan kristallerinin görüntüsü
41
(-) Kontrol
0.3
Absorbans
0.25
0.2
(-) Kontrol
0.15
0.1
0.05
0
1. Gün
7. Gün
14. Gün
Zaman
21. Gün
Şekil 4.27 Negatif kontrol grubu statik hücre kültürünün MTT testi sonucu 570 nm’de
absorbans ölçümlerinin değişimi
Plaka yüzeyinde, neonatal siyatik sinir hücreleri ile yapılan deney serisinde MTT testi
sonucu oluşan formazan kristalleri çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de absorbans
değerleri ölçülmüştür. 1, 7, 14 ve 21. günlerde ölçülen değerlere göre sinir hücrelerinin
mitokondriyel aktiviteleri burada da zamanla azalmıştır (Şekil 4.27).
4.1.15 MTT testi sonuçlarının genel olarak incelenmesi
Deney serisindeki membranlar üzerinde MTT testi sonucu oluşan formazan kristalleri
HCI ile çözülerek UV spektrometrede 570 nm’de absorbans değerleri teker teker
ölçülmüştür. Ölçülen değerlere göre neonatal siyatik sinir hücrelerinin mitokondriyel
aktiviteleri tüm değerlerin bir arada bulunduğu bir grafiğe geçirilmiştir. Oluşturulan
grafik üzerinde membranların hücrelerle etkileşiminin karşılaştırmalı tayini için aktivite
oranları değerlendirilmiştir.
Elde edilen grafiğe göre elektroeğirme yöntemi ile hazırlanmış PCL, PCL-C60 ve PCLTDKNT memranların, daha önce sinir doku mühendisliğinde kullanılan membranlara
oranla mitokandriyel aktivitelerinin oldukça fazla olduğu görülmüştür. Ayrıca deney
süresi boyunca diğer polimerlerdeki genel eğilim aktivitenin azalması olurken,
42
elektroeğirme yöntemiyle hazırlanan üç polimer membrandaki eğilim aktivitenin
giderek artmasıdır (Şekil 4.28).
Absorbans
3
2,5
1.gün
2
7.gün
1,5
14.gün
1
21.gün
0,5
0
Zaman
Şekil 4.28 Tüm polimerlerin statik siyatik sinir hücresi kültürünün MTT testi sonucu
570 nm’de absorbans ölçümlerinin zamanla değişimi
43
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Son yıllarda giderek gelişen doku mühendisliği teknikleri, tıbbi tedaviler için önemli bir
yaklaşımdır. Bu teknikler kullanılarak geliştirilen fonksiyonel biyomalzemeler
sayesinde, hasarlı bölgelerin tedavisinde umut verici sonuçlar elde edilmeye
başlanmıştır. Bu paralellikte sinir doku mühendisliği ile sinir hücrelerinin onarımının
gerçekleştirilebileceği ortamların tasarlanması amaçlanmaktadır.
Sinir dokusunu oluşturan kanallara benzer yapıların oluşturulması için büyüme
faktörlerinin salgılanabileceği, hücre çoğalmasını, filizlenmesini ve elektriksel
aktivitelerini gerçekleştirebileceği biyobozunur ve gözenekli bir duvar yapısı
oluşturmak gerekir (Huang ve Huang 2006a).
Bir çok alanda yarar sağlayan elektroeğirme tekniği ile geniş yüzey alanına sahip 3
boyutlu nanolifler elde etmek mümkündür. Bu tekniğin biyomedikal alandaki kullanımı
genellikle malzemelerin kaplanması, elektriksel ve optiksel özelliklere sahip malzeme
üretimi ve biyosensör yapımı gibi uygulamalardır. Doku mühendisliği uygulamaların da
ise biyouyumlu, biyobozunur ve hücre tutunmasını sağlayacak iskele malzemelerin
oluşturulmasında
elektroeğirme
tekniğinden
yararlanılmaktadır.
Nanoboyutlu
malzemelerin gözenekli yapıları sayesinde proteinler malzeme içerisine kolayca
emilebilir ve hücre membran reseptörleri çok sayıda bağlanma bölgesinden iskeleye
tutunabilir. Bu sayede hücrelerin rahatça çoğalabileceği kendi özgün dokularının
mimarisine benzer yapılar oluşturulabilir (Agarwal vd. 2008).
Doku mühendisliği malzemelerinin yapısının gözenekli olması için gaz ile
köpüklendirme, dondurma-kurutma, faz ayırma ve liflerin çapraz bağlanması gibi
geleneksel yöntemlerin yanısıra elektroeğirme tekniğinden de yararlanılmaktadır.
Elektroeğirme tekniği kullanılarak üretilen PCL nanoliflerin, Schwann hücrelerinin
bölünmesi ve birbirleri ile etkileşimleri için birçok fonksiyonel yüzey alanı oluşturduğu
gösterilmiştir. Bu sebeple sinir dokusu onarımı için bu teknikle hazırlanan çapı
1µm’den küçük olan lifler diğer yöntemlerle hazırlanan malzemelere göre birçok
avantaja sahiptir (Tabesh vd. 2008).
44
Elektroeğirme yöntemi ile hazırlanmış PCL nanolifler üzerindeki sinir uzanımı
Schwann hücre göçünden daha hızlı olmaktadır. Bu da yönlenmiş nanoliflerin tekbaşına
bile sinir hücresi ilerlemesine katkı sağladığını ortaya koyar. PCL ile aksonların
biyokimyasal etkileşimine dair bir bulgu olmasa da topografik bulgular yönlenmiş
liflerin sinir yenilenmesinde ve ilerlemesinde PCL’nun muhtemelen etkili olduğunu
gösterir. Miktarı belirlenemesede PCL nanolif üzerinde gelişen sinir demetlerinin
yoğunluğu ve tutunması kollajen/PCL nanolife göre daha fazladır. Birçok çalışma
Schwann hücre kültürlerinin sentetik sinir tüpleri içerisinde ilerleyip periferal sinir
yenilenmesini arttırdığını ortaya koymuştur. Elektroeğirme tekniği ile hazırlanmış PCL
ve kollajen/PCL nanolifler de Schwann hücre göçünü ve aksonal yenilenmeyi
destekledikleri için sinir tamirine uygun birer adaydır (Schnell vd. 2007).
Malzeme seçimi, sinir doku mühendisliğinde hayati önem taşır. Uygun bir malzemenin
bozunma oranı ve mekanik özellikleri dokuda oluşacak bağışıklık tepkisini en aza
indirmelidir. Ayrıca akson yenilenmesinde yol gösterici ve destek sağlayıcı olmalıdır.
Elektroeğirme tekniği ile tüm bunları sağlayacak, sinir dokusuna benzer, yönlenmiş
nanoboyutlu malzemelerin tasarlanması mümkündür. Biyofonksiyonel nanolifli
iskeleler sayesinde sinir hücrelerinin canlı dokuya nakilleri de mümkün olabilir (Cao
vd. 2009)
Elektroeğirme tekniğinin bir diğer avantajı ise sinir tüplerinin yapımı aşamasında ısıtma
ya da kimyasal tepkimeye ihtiyaç duyulmamasıdır. Böylece diğer yöntemlerin aksine
elektroeğirme tekniği ile mikro ya da nanolifli malzemeler kimyasal tepkimelerin ve ısıl
işlemlerin kullanılmasına gerek kalmadan kararlı hale getirilebilir. Oluşturulan bu tüpler
içerisine de kollajen, fibrin ve peptid kalıntıları gibi çeşitli dolgu malzemeleri rahatlıkla
tutturularak tüplerin hücre çoğalmasını daha fazla desteklemesi sağlanabilir (Panseri vd.
2008).
Günümüzde oldukça dikkat çeken nanotüpler iletken ya da yarı iletken yapıda
tasarlanabilirler. Fizyolojik şartlara uyumlu KNT’ler elektriksel ve mekaniksel
özellikleri sayesinde doku mühendisliği uygulamalarında yeni fırsatlar ortaya
koymuştur (Kaladhar ve Sharma 2007).
45
Kalp kası ve sinir dokusu gibi dokular, hücreleri boyunca elektriksel potansiyel
oluşturma konusunda uzmanlaşmışlardır. MacDonald ve arkadaşları kollajen-TDKNT
hidrojel yapısını doğal yumuşak dokulardaki elektriksel iletkenliği örnek alarak
tasarlamışlardır. Sonuçlarına göre hücre matriksinde ve yapısındaki elektriksel
özellikler beklenenden daha yüksek çıkmıştır. Elektriği ileten protein-TDKNT
kompozitler kalp kası ve sinir dokusu gibi elektriksel iletimin önem taşıdığı dokular için
iskele olarak ya da hücrelerin tutunup elektriksel uyarı etkisi oluşturabileceği substrat
yüzeyleri geliştirmek gibi pek çok alanda kullanılabilir. Ayrıca bu kompozitler ile
biyosensör ya da iletken kablolar oluşturulabilir (MacDonald vd. 2008).
Yaptığımız çalışmada neonatal sıçan siyatik sinir hücrelerinin in vitro ortamda farklı
polimer membran yüzeyleri üzerindeki davranışları incelenerek sinir hücrelerinin
yaşayabilirliğini arttıran ortamlar geliştirmeye çalışılmıştır. Döner kaplama yöntemiyle
hazırlanmış kollajen, kitosan, kollajen/ kitosan, alginat, elastin, kollajen/elastin, PCL,
PCL-C60 ve PCL-TDKNT film yüzeylerinde 3 haftalık süreçte sinir hücresi canlılık
değerlerleri giderek azalmıştır. Buna karşın elektroeğirme yöntemi kullanılarak
hazırlanmış PCL, PCL-C60 ve PCL-TDKNT nanolifli yapıdaki membran yüzeylerinin
diğer polimer yüzeylere göre sinir hücresi çoğalmasını daha fazla desteklediği
görülmüştür. Elektroeğirme yöntemindeki üç polimer yüzey içinde de en iyi sonuç
PCL-TDKNT yüzeyde elde edilmiştir.
Elde edilen sonuçlara göre elektroeğirme yöntemi ile hazırlanan geniş yüzey alanı ve
yönlenmiş tutunma bölgeleri olan nanolifli yapıların sinir hücrelerinin çoğalması için
uygun ortamın oluşturulmasına katkı sağladığı savunulabilir. Ayrıca TDKNT ilaveli
yapının diğer yapılara göre daha iyi sonuç vermesi sinir hücrelerinin uzanım şekline
daha uygun nanotüp yapının oluşturulması ve polimere iletkenlik özelliği kazandırması
ile açıklanabilir.
Bu çalışma ile sinir doku mühendisliğine yaklaşımda iletken ve nanolifli yapıların
kullanımının sinir dokusunu daha iyi taklit edecek yapılar oluşturmak açısından uygun
bir yöntem olduğu söylenebilir. Hazırlanan bu yüzeyler in vivo denemelerle de
desteklendiğinde farklı uygulamalar açısından önemli bir adım atılmış olacaktır.
46
KAYNAKLAR
Agarwal, S., Wendorff, J.H. and Greiner, A. 2008. Use of electrospinning technique for
biomedical applications. Polymer, 49; 5603-5621
Bhardwaj, N. and Kundu, S.C. 2010. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication
technique. Biotechnology Advances, 28; 325-347
Campbell, W.W. 2009. Evaluation of peripheral nerve injury. European Journal of Pain
Supplements, 3; 37-40
Cao, H., Liu, T. and Chew, S.Y. 2009. The application of nanofibrous scaffolds in
neural tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews, 61; 1055-1064
Chronakis, I.S. 2005. Novel nanocomposites and nanoceramics based on polymer
nanofibers using electrospinning process. Journal of Materials Processing
Technology, 167; 283-293
Daamen, W.F., Veerkamp, J.H., Van Hest, J.C.M. and Van Kuppevelt, T.H. 2007.
Elastin as a biomaterial for tissue engineering. Biomaterials,28; 4378-4398
Daamen, W.F., Nillesen, S.T.M., Hafmans, T., Veerkamp, J.H., Van Luyn, M.J.A. and
Van Kuppevelt, T.H. 2005. Tissue response of defined collagen-elastin scaffolds
in young and adult rats with special attention to calcification. Biomaterials, 26;
81-92
Elçin, Y.M., Dixit, V. and Gitnick, G. 1998. Hepatocyte attachment on biodegradable
modified chitosan membranes: In vitro evaluation for the development of liver
organoids. Artificial Organs, 22(10); 837-846
47
Freimoser, F.M., Jakob, C.A., Aebi, M. and Tuor, U. 1999. The MTT [3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide] assay is a fast and
reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities. Applied
and Environmental Microbiology, 65/8; 3727-3729
Hashimoto, T., Suzuki, Y., Kitada, M., Kataoka, K., Wu, S., Suzuki, K., Endo, K.,
Nishimura, Y. and Ide, C. 2002. Peripheral nerve regeneration through alginate
gel: analysis of early outgrowth and late increase in diameter of regenerating
axons. Experimental Brain Research, 146; 356-368
Huang, Y.C. and Huang, Y.Y. 2006a. Biomaterials and strategies for nerve
regeneration. Artificial Organs, 30(7); 514-522
Huang, Y.C. and Huang, Y.Y. 2006b. Tissue engineering for nerve repair. Biomedical
Engineering-Applications, Basis & Communications, 18; 100-110
Inanç, B., Arslan, Y.E., Şeker, Ş., Elçin, A.E. and Elçin, Y.M. 2009. Periodontal
ligament cellular structures engineered with electrospun poly(DL-lactide-coglycolide) nanofibrous membrane scaffolds. Journal of Biomedical Materials
Research Part A, 90A(1); 186-195
Kaladhar, K. and Sharma, C.P. 2007. Surface passivation and controlled ligand
supplementation of cellular activation processes – strategies for bottom up
synthesis of bioactive surfaces. Trends in Biomaterials and Artificial Organs,
21(1); 29-62
Kemp, S.W., Syed, S., Walsh, S.K., Zochodne, D.W. and Midha, R. 2009. Collagen
nerve conduits promote enhanced axonal regeneration, schwann cell association
and neovascularization compare to silicone conduits. Tissue Engineeering Part
A, 15; 1975-1988
48
Kern, J.M. 2008. The microstructure of peripheral nerves. Techniques in Regional
Anesthesia and Pain Management, 12;127-133
Kim, I.Y., Seo, S.J., Moon, H.S., Yoo, M.K., Park, I.Y., Kim, B.C. and Cho, C.S. 2008.
Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnology
Advances, 26; 1-21
Luurtsema, G.A. 1997. Spin-coating for rectangular substrates.
(http://bcam.berkeley.edu/ARCHIVE/theses/gluurtsMS.pdf, 26.05.2010)
MacDonald, R.A., Voge, C.M., Kariolis, M. and Stegemann, J.P. 2008. Carbon
nanotubes increase the electrical conductivity of fibroblast-seeded collagen
hydrogels. Acta Biomaterialia, 4; 1583-1592
Navarro, X., Vivo, M. and Valore, A. 2007. Neural plasticity after peripheral nerve
injury and regeneration. Progress in Neurobiology, 82; 163-201
Panseri, S., Cunha, C., Lowery, J., Del Carro, U., Taraballi, F., Amadio, S., Vescovi, A.
and Gelain, F. 2008. Electruspun micro- and nanofiber tubes for functional
nervous regeneration in sciatic nerve transections. BMC Biotechnology, 8; 39
Pietrucha, K. and Marzec, E. 2005. Dielectric properties of the collagenglycosaminoglycans
scaffolds
in
the
temperature
range
of
thermal
decomposition. Biophysical Chemistry, 118; 51-56
Sayes, C.M., Gobin, A.M., Ausman, K.D., Mendez, J., West, J.L. and Colvin, V.L.
2005. Nano-C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation. Biomaterials, 26;
7587-7595
49
Schnell, E., Klinkhammer, K., Balzer, S., Brook, G., Klee, D., Dalton, P. and Mey, J.
2007. Guidance of glial cell migration and axonal growth on electrospun
nanofibers of poly-ε-caprolactone and a collagen/poly-ε-caprolactone blend.
Biomaterials, 28; 3012-3025
Seal, B.L., Otero, T.C. and Panitch, A. 2001. Polymeric biomaterials for tissue and
organ regeneration. Materials Science and Engineering, 34; 147-230
Sell, S.A., McClure, M.J., Garg, K., Wolfe, P.S. and Bowlin, G.L. 2009.
Electrospinning of collagen/biopolymers for regenerative medicine and
cardiovascular tissue engineering. Advanced Drug Delivery Rewiews, 61; 10071019
Stang, F., Keilhoff, G. and Fansa, H. 2009. Biocompatibility of different nerve tubes.
Materials, 2; 1480-1507
Straley, K.S. and Heilshorn, S.C. 2009. Design and adsorption of modular engineered
proteins to prepare customized, neuron-compatible coatings. Frontiers in
Neuroengineering, 2; Art. 9
Tabesh, H., Amoabediny, G., Nik, N.S., Heydari, M., Yosefifard, M., Siadat S.O.R. and
Mottagy, K. 2009. The role of biodegradable engineered scaffold seeded with
schwann cells for spinal cord regeneration. Neurochemistry International, 54(2);
73-83
Yuan, Y., Zhang, P., Yang, Y., Wang, X. and Gu, X. 2004. The interaction of schwann
cells with chitosan membranes and fibers in vitro. Biomaterials, 25; 4273-4278
50
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı:
Neslihan ÇELİK
Doğum Yeri:
Ankara
Doğum Tarihi:
28/07/1984
Medeni Hali:
Bekar
Yabancı Dili:
İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise:
Ankara Cumhuriyet Anadolu Lisesi (2002)
Lisans:
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü (2008)
Yüksek Lisans:
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı
(2011)
Çalıştığı Kurum/ Kurumlar ve Yıl
Refik Saydam Hıfzıssıhha İlaç Kozmetik Laboratuarı-Staj (2006)
Türk Standartları Enstitüsü Kimya, Sağlık, Temizlik Laboratuarı-Staj (2006)
Türk Henkel Firması-Staj (2007)
Poster Sunumu (Yeri ve Yılı)
16. Uluslararası BİOMED İstanbul (2010)
51
Download

ankara ün vers tes fen bl mler enst tüsü yüksek l sans tez farklı pol