1
DNA ` nın Yapısı
Yrd. Doç.Dr. Seda Örenay Boyacıoğlu
15 Ekim 2014 Çarşamba
Gen-Genetik Kod-Genetik bilgi
2
Kromozom
Nukleus
Kromozom
Ge
n
Gen
15 Ekim 2014 Çarşamba
Genetik materyalin dört özelliği:
3




Replikasyon-kendini eşleyebilmesi
Bilgi depolama
Bilgiyi ifade etme
Mutasyonlarla varyasyon gösterme
mRNA
Protein
rRNA
Translasyon
tRNA
Ribozom
Transkripsiyon
Replikasyon
DNA
Santral doğma
15 Ekim 2014 Çarşamba
Genetik materyal Protein mi?
Nükleik asit mi?
4
Fried Miescher (1868): Lökosit
çekirdeği-somon balığı sperm hücrelerinüklein: asidik DNA+bazik
proteinler;Fosfor ;Sülfür “Nüklein’in hücre kalıtımı ile ilgili
olabileceği fikri”

15 Ekim 2014 Çarşamba
5
Genetik Materyal: DNA’nın
keşfi- Fred Griffith (1927-8)

– İlk transformasyon deneyleri Diplococcus
(Streptococcus) pneumoniae
Isı ile öldürülmüşS hücreleri
ve canlı R hücrelerii karışımı
CanlıS hücreleri
(kontrol) virülent
Canlı R hücreleri
(kontrol) avirülent
Isı ile öldürülmüş
S hücreleri
“Transformasyon
sebebi ilke”
Kalıtımı kontrol
eden
bir molekül
mevcuttur
SONUÇLAR
Fare ölür
Fare sağlıklı
Fare sağlıklı
Mouse ölür
Kan örneklerinde
canlı S hücreleri
bulundu
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA’nın keşfi-Oswald T. Avery,
Macleod, McCarty (1944)
6

Transformasyon
sebebi ilkeGriffith’in
sonuçlarından
sorumlu olan
genetik materyal
DNA olduğu
kanıtlandı.
RNaz
ilavesi
S suşuna ait filtrat (DNA ve RNA
protein karışımı)
Sadece DNA ve
protein kalır
DNaz
ilavesi
S suşuna ait filtrat
SadeceRNA ve
protein kalır
R bakterilerine
DNA-RNA’nın
eklenmesi
DNA-RNA kalır
kalır
Besiyerine
ekim yapılır
S transformantı ürer
R hücreleri ürer
R bakterilerine
RNA’nın eklenmesi
Proteaz
ilavesi
S suşuna ait filtrat
R bakterilerine
DNA’nın eklenmesi
Besiyerine
ekim yapılır
S transformantı üremez
Sadece R ürer
Besiyerine
ekim yapılır
15 Ekim 2014 Çarşamba
S transformantı ürer
R hücresi ürer
DNA’nın keşfi-Virülent T2 fajının yaşam
döngüsü)
LİTİK DÖNGÜ
7
Bakteri hücre
duvarının
Enzimlerle
parçalanmasıyla
yeni nesil fajların
dışarı
çıkması
Fajın E. coli ye tutunması, ve
faj kromozomunu enjeksiyonu
Fajıa özgün enzimlerle
Bakteri kromozomunun
parçalanması
Faj
kromozomu
Bakteri (konak)
kromozomu
Konak E. coli hücresi
Faj
kromozomu
Bakteri kromozomu
tamamen parçalanır
Progeny faj
partiküllerinin
biraraya
getirilmesi
Faj
kafasının
oluşması
Faj
kromozomlar
ı
Faj
parçaları
Fajın yapısal içeriğinin
üretilmesi için faj
genlerinin ekspresyonu
Bakteri materyallerinin
Ve faj enzimlerinin
kullanılarak
faj kromozomunun
replikasyonu
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA’nın keşfi- Hershey-Chase
Deneyleri (1952)
8
 Yeni faj partiküllerinin sentezlenebilmesi için gerekli bilgiyi taşıyan ve
bakteri hücresine aktarılan molekül DNA
P32
S35
DNA
Protein kılıf
Faj
(metiyonin sistein)
Bacterial cell
1:
Sulfur (35S)
Radioaktif
protein
Boş
protein kılıf
Sıvıda Radyoaktivite,
(faj proteini)
DNA
Faj
DNA
Santrifüj
Pellet (bakteri
hücreleri ve içerikleri)
Radyoaktif
DNA
2:
Fosfor (32P)
Santrifüj
Pellet
Radyoaktivite
(faj DNA)
in pellet
15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asit Kimyası
9

Nükleotitler: Nükleik asitlerin yapı taşları
Fosfa
t
Pürin ya da
pirimidin
bazı
Pentoz
= Nitrojen Baz + Pentoz Şeker + Fosfat grup
Pürinler (9 üyeli çift halkalı)– Adenin &Guanin
Pirimidinler (6 üyeli tek halkalı–Timin&Sitozin&Urasil
15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asitlerin bileşenleri
(Nitrojen bazları-azotlu bazlar)
10
Adenin (A)
Pürin
Guanin (G)
Pürinler
Timin (T)
Sitozin (C) Urasil (U)
(DNA)
(DNA, RNA) (RNA)
Pirimidin
Pirimidinler
DNA
15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asitlerin bileşenleri
(Pentoz şekerler)
11



Ribonükleotitlerde 2’-OH RNA da bulunur
Deoxyribonükleotitlerde a 2’-H DNA da bulunur
Şekerler azot bazlardan ayırtedilebilmeleri için
numaralandırılmış karbon atomları içerirler
Bu karbonda
oksijen atomu
bulunmaz
Riboz
Deoksiriboz15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleik asit Kimyası
12



Nükleozitler = Baz + Şeker
NMP = nükleozit + 1 PO4
NDP = nükleozit +2 PO4
Nükleozit
Nükleotit
NTP = nükleozit + 3 PO4
Nükleik asitlerin yapı taşıdır
özel NTPs: ATP & GTP

Nükleozitlerin isimlendirilmeleri ve genel yapıl
15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleozit ve Nükleotit isimlendirilmeleri
Baz
Nükleozitler
Nükleotitler
14
Nükleik asit oluşumundaki
bağlar





Şekerin C-1’ atomu
nitrojen bazla kimyasal
bağ yapar
Şeker pürin bazının N-9
atomuna kovalent bağ
yapar
Şeker pirimidin bazının
N-1 atomuna kovalent
bağ yapar
Nukleotitler şekerin C-2’,
C-3’ ve C-5’ atomlarına
bağlanabilirler
Ancak, C-5’
konfigürasyonu biyolojik
sistemlerdeki en yaygın
olan, DNA ve RNA da
bulunan mevcut formdur.
15 Ekim 2014 Çarşamba
Nükleozit Difosfatlar ve
trifosfatlar, AMP, ADP ve ATP


Ek fosfat grupları nüklozit 5’- monofosfatlara eklenebilir ve difosfatlar
and trifosfatlar oluşur
ATP hücre aktiviteleri için en önemli enerji kaynağıdır
5’-monofosfat
Adenozin 5’-monofosfat (AMP)
5’-difosfat
Adenozin 5’-difosfat (ADP)
Adenozin 5’-trifosfat (ATP)
Polinükleotitler
16




İki mononükletit arasında bağ
yapısında, iki şekere bağlı fosfat
grubu yer alır oluşan bağ
fosfodiester
bağıdır,
çünkü
fosforik asit her iki taraftaki alkol
grubu ( iki şekerdeki OH grubu )
ile ester bağı yapar. Aynı bağ,
RNA da da bulunur.
dinukleotitler & trinükleotitler
oligonükleotitler (<20)
polinükleotitler (>20)
15 Ekim 2014 Çarşamba
Şeker-fosfat iskeleti
Fosfodiester bağları
BAZlar
5’ uç
5'
17
1'
4'
2'
DNA’nın kovalent iskeleti
3'
5'
Fosfodiester
bağları
1'
4'
2'
3'
5'
1'
4'
2'
3'
3’ uç
5'
1'
4'
2'
Fosfa
3'
t
Şeker (deoksiriboz)
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA
nükleoti
di
7. DNA Modeli: James D.
Watson & Francis H. Crick
18


DNA’nın double helix modelinin sunulması
Bilginin esas iki kaynağı:


1. Hidrolize olmuş DNA örneğinin baz kompozisyon analizi
“Chargaff Kuralı”: #A#T and #G#C. “A strange but possibly
meaningless phenomenon”.
2. X-ray kırınım çalışmaları: Rosalind Franklin & Maurice H. F.
Wilkins
15 Ekim 2014 Çarşamba
19
Chargaff Kuralları (Erwin Chargaff
1949-1953)








DNA’nın baz içeriği bir türden diğerine değişiklik göstermektedir
DNA’nın baz içeriği bir türün farklı bireylerinde ya da bireyin farklı dokularında değişiklik
göstermez
DNA’nın baz içeriği zamanla değişmez
DNA’nın baz içeriği beslenme, yaş, çevre faktörler vb. nedeniyle değişmez,
Herhangi bir türe ait DNA nın nükleotidlerine parçalandığında serbest kalan
nukleotidlerde Adenin (A) moleküllerinin sayısı timin (T) molekülleri sayısına, guanin
(G) moleküllerinin sayısı sitozin (C) moleküllerinin sayısına eşittir
 %A = %T ve %G = %C

(A/T=1 ve G/C=1)

Pürin sayısı=pirimidin sayısı

(A+G)=(T+C)
GC oranı türler arasında farklılık göstermekte ve bu oran organizmaya bağlı olarak %22%76 arasında değişmektedir.–
% G+C oranının %A+T oranına eşit olması gerekmez
İşte Watson ve Crick bu bulguları değerlendirerek böyle özelliklere sahip DNA makro
molekülünün sekonder yapısına ait bir model geliştirdiler.
15 Ekim 2014 Çarşamba
X-ışını kırınım Analizi
20


DNA
zincirleri
X-ışını
bombardımanına
tutulur
ve
molekülün atomik yapısına göre
saçtığı ışınlar belirlenir. Buna göre;
1947- William Astbury DNA’da 3.4
A aralıklarla tekrarlayan yapıların
varlığını doğrulamış ve DNA’nın bir
çeşit sarmal yapıda olduğunu ileri
sürmüştür.
1950-1953- Rosalind Franklin
3.4 A aralıklarla tekrarlayan yapıların
varlığını
doğrulamış
(William
Astbury tarafından önerilen) ve
DNA’nın bir çeşit sarmal yapıda
olduğunu daha saf örnekler
kullanara gösterebilmiştir.
1 nm=10 A0

15 Ekim 2014 Çarşamba
Watson-Crick
Modeli







İki uzun polinükleotit zinciri bir
merkez eksen etrafında kıvrılarak,
sağ-el ikili sarmal yapısını oluşturur
İki zincir birbirine antiparaleldir; iki
zincirin C-5’ ucundan C-3’ ucuna
doğru olan yönleri birbirine göre
terstir.
Her iki zincirin bazları düzlemsel
yapıda olup düzlemlere eksene diktir.
Bazlar arasındaki mesafe 3.4 A
olup birbiri üzerine istiflenmiş
durumdadırlar ve sarmal içerisinde
yer alırlar.
Karşı zincirdeki azotlu bazlar
hidrojen bağları ile birbirileri ile
eşleşirler. DNA’da sadece A=T ve
G
C eşleşmesi olabilir
(komplementerlik).
Sarmalın her bir tam dönüşü 34 A
(3.4 nm) dir. Her bir zincirde bir
dönüşte 10 baz yer alır.
Molekülün herhangi bir bölümünde,
eksen boyunca sıra ile daha geniş
olan büyük (majör) oluklar ve daha
dar olan (küçük) minör) oluklar
görülmektedir.
Sarmal 20 A (2 nm) çapındadır.
DNA sarmalı
Çap 20
Baz, şeker ve fosfat durumu, Hbağlar
Ao
5’
3’
Küçük oluk
Bir tam dönüş
34 Ao
şeker-fosfat
iskeleti
3’
5’
Büyük
oluk
Bazların yatay istiflenmesi
Baz çifti
3.4 Ao
15 Ekim 2014 Çarşamba
Merkezi eksen
DNA sarmalı
22
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA sarmalı
23
DNA’daki baz eşleşmesi
modelin genetik açıdan en
önemli
özelliğidir.
Bu
yerleşim nedeniyle eksen
boyunca büyük ve küçük
oluklar ortaya çıkar.

Sağ el sarmalının uzaydaki
konformasyonu, Watson
Crick’in verilerine en uygun
olanıdır.
15 Ekim 2014 Çarşamba
1962: Fizyoloji ve Medicine Nobel Ödülü
Watson, J.D. and F.H. Crick, “Molecular Structure of Nucleic Acids: A
Structure for Deoxynucleic Acids”. Nature 171 (1953), p. 738.
James D.
Watson
Francis H.
Crick
Maurice H. F.
Wilkins
Peki ?
Rosalind Franklin
24
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA’nın formları
25


Tek-kristal-X-ışını analizi çalışmaları ile 5 A’luk
çözünürlük 1 A’a kadar düşürülmüştür.
A-DNA right handed (11 baz/ 1 tam dönüş/çap 23 Å)—yüksek tuz kons. Yada
dehidrasyon koşullarında baskındır.

B-DNA right handed (normal, 10 baz/dönüş, çap 20 Å)

C-DNA right handed (dehydrated, 9.3 baz/dönüş,19Å)

D-DNA right handed (no guanine, 8 baz/dönüş)

E-DNA right handed (no guanine, 7.5 baz/dönüş)


Z-DNA left handed (hepsi GC, 12 baz/dönüş, 18 Å) (1979) Büyük oluk neredeyse yok
denilebilir
P-DNA DNA yapay şekilde uzatılırsa bu formu alır, fosfat grupları iç kısımda azotlu
bazlar sarmalın dış yüzünde

Fizyolojik koşullarda rasgele bir DNA dizesinde en stabil form B formudur.

A formu su dışında birçok çözeltide oluşan bir formdur.

Z formu: sola doğru dönen heliks yapısındadır. Z formu bazı genlerin ekspresyonlarının
regulasyonunda rol alabilir.
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA’nın formları
26
Sarma Dönüşbaşı
l Tipi
na baz çifti
Baz çifti
baına
dönüş
Sarmal
çapı
A
11
+34.7O
23 AO
B
10
+34.0O
19 AO
Z
12
-30.0O
18 AO
15 Ekim 2014 Çarşamba
Büyük DNA moleküller hücre
içerisinde super coiller oluşturarak
bulunurlar
Relaks, gevşek
supercoiled
Çıkarımlar..
28




Bazı virüsler haricinde DNA dünyadaki tüm
yaşayan organizmaların genetik materyalidir
Watson-Crick modeline göre; DNA right handeddouble heliks formunda bulunur
Double heliksin zincirleri komplementer nitrojen
bazları arasındaki hidrojen bağı ile birarada
tutulurlar
DNA yapısı genetik bilginin saklanmasını ve ifade
edilmesini sağlar
15 Ekim 2014 Çarşamba
DNA İZOLASYONU
Yrd.Doç.Dr. Seda Örenay
Boyacıoğlu
DNA İZOLASYONU
DNA hücrede serbest bir molekül halinde
değildir. Bazı proteinler( histonlar, histon
olmayan proteinler vb.) ve RNA ile bir
kompleks halinde bulunur. Virüsler gibi
canlılarda da bir protein kılıf içinde yer
alır.DNA izolasyonu değişik hatta aynı
organizma
gruplarında
bile
farklılık
gösterir.
DNA İZOLASYONU
DNA izolasyonun başarısı çalışılan
organizmanın
çoğaltılmasıyla
ilgilidir.Örn:
bakterilerdeki
DNA
izolasyonunda en önemli sorun yeterli
miktarlarda
DNA
elde
edilememesidir.Bu
sorun
özellikle
plasmid
izolasyonunda
öne
çıkmaktadır.
DNA İZOLASYONU
Yüksek kopya sayısına ulaşabilen
plasmidler dışında replikasyonu büyük
ölçüde genomik DNA’nın kontrolü
altında olan plasmidlerin ( Ör:
pBR322)
DNA’sının
elde
etmek
zorlaşır.Bu durumda bakteri kültürleri
kloramfenikol uygulamasına bırakılarak
bakteri
replikasyonu
engellenerek
plasmid sayısı arttırılabilir.
DNA İZOLASYONU
DNA İzolasyonu temelde 3 aşamadan
meydana gelir:
1- Hücre duvarının parçalanması
2- DNA- Protein kompleksinin
çözülmesi
3- DNA’ nın ortamdaki diğer
moleküllerden ayrılması
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI
A- FİZİKSEL OLARAK
 Mekanik işlemler
 Osmatik şok
 Dondurup çözme
 Ultrasonifikasyon v.b.
En çok kullanılan dondurup-çözme
yöntemidir.
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI
Dondurup çözme:
Hücrelerin çok düşük sıcaklık derecelerinde
(ör:-20C da) tutulup sonra yeniden
ısıtılarak çözdürülmesi ve işlemin birkaç
tekrarlanması parçalamaya yol açar.İşlemin
temel prensibi donan su moleküllerinin
hacminin genişlemesi ve hücrelerde oluşan
buz kristallerinin hücre zarına zarar
vererek parçalanmayı sağlamasıdır.
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI
2- KİMYASAL OLARAK
 Çözücülerin kullanılması:
Bu uygulamalrın prensibi,hücre zarındaki
bileşiklerin çözündüğü uygun bir çözücü
yardımıyla zar yapısının eritilmesidir.
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI
2- KİMYASAL OLARAK
Organik çözücüler( Etil asetat, toluen
v.b.) zardaki lipidleri çözerek yapıyı
bozarlar.
Bazik Çözücüler PH= 11-12,5 aralığında
uygulanır.Hücre duvarının hidrolizine yol
açarlar.
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI
2- KİMYASAL OLARAK
Deterjanlar,uygun PH’da zardaki
lipoproteinlerle etklileşime girerek etkili
olur.
.
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI
1- HÜCRE DUVARININ
PARÇALANMASI

Enzimlerin kullanılması:Bu amaçla
kullanılan litik enzimler özellikle
mikroorganizmalar için uygundur.
Lizozim; bakteri hücre duvarındaki
peptidoglikan tabakasındaki glikozidik
bağları hidroliz eder.
Tripsin, proteinaz K ve zimoliyaz
(mayalar için) bu amaçla kullanılır.
Çeşitli materyallere Uygulanacak Bazı
Parçalama Tipleri
Ozmatik Şok
Enzim Uygulaması
Deterjan Uygulaması
El Homojenizatörü
Doğrama
Ultrasonifikasyon
Bilyeli mil
Lökositler
Bakteriler, mayalar
Doku kültürü hücresi
Karaciğer v.b. Yumuşak
dokular
Kas v.b. Dokular
Hücre süspansiyonları
Hücre süspansiyonları
2-DNA-PROTEİN
KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜLMESİ
•DNA’ nın denatürasyon işlemine
dayanır. Bu amaçlada çoğunlukla
fenol ekstraksiyonu işlemi
kullanılır.Fenolle proteinler ve
DNA fragmentleri denatüre
edilerek ortamdan uzaklaştırılması
sağlanır.
2
2-DNA
DNA-PROTEİN
PROTEİN
KOMPLEKSİNİN
KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜLMESİ
ÇÖZÜLMESİ
 aqueous phase (nucleic
acids)
 phenol phase
(proteins)
2-DNA-PROTEİN
KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜLMESİ
•Amonyum sülfat ve sodyum
sülfat ile proteinler çöker.
3- DNA’NIN ORTAMDAKİ
DİĞER MOLEKÜLLERDEN
AYRILMASI
•PH= 12-12,5 aralığında plasmid
DNA ile genomik DNA’yı
birbirinden ayırırız. Bu iki yapı
farklı bazik ortamda farklı
reaksiyon verir.Bu koşullarda
genom DNA’sı denatüre olurken
plasmid DNA’sı olmaz.
3- DNA’NIN ORTAMDAKİ DİĞER
MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI
•Son aşama DNA’nın diğer
moleküllerden fiziksel ve kimyasal
etkilere maruz bırakılması ile
ayrılmasıdır.
•Kimyasal olarak etanol ve
izopropanol uygulaması ile DNA
çöktürelebilir.
•Fiziksel uygulmada ise santrifüjleme
yapılır.
3- DNA’NIN ORTAMDAKİ
DİĞER MOLEKÜLLERDEN
AYRILMASI
3- DNA’NIN ORTAMDAKİ
DİĞER MOLEKÜLLERDEN
AYRILMASI
•En çok kullanılan santrifüjleme
yöntemi Cs-Cl-etidiyum bromür (EB)
gradienti denge santrifüjlemesidir.EB,
DNA’ya bazlar arasına girerek
bağlanır ve çift sarmalın çözülmesine
neden olur.Bu da doğrusal DNA
molekülünün boyunun uzamasına ve
plasmidlerde süper sarmal dönümlerin
oluşmasına yol açar.
3- DNA’NIN ORTAMDAKİ DİĞER
MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI
Sonuçta süper sarmal dönümlerin
yoğunluğundaki büyük artışla
EB’nin girişi engellenirken,
doğrusal DNA molekülleri
doygunluğa ulaşıncaya kadar EB’yi
almaya devam eder. EB’nin
değişik oranda bağlanması sonucu
oluşan yoğunluk farklılığı iki
molekülün farklı çökelmesine
neden olur.
3- DNA’NIN ORTAMDAKİ DİĞER
MOLEKÜLLERDEN AYRILMASI
Cs-Cl Gradiyenti
Cs-Cl
Gradiyenti
İNSAN KANINDAN DNA
İZOLASYONU( Yüksek Tuz
Konsantrasyonunda)
•DNA,10 ml’lik EDTA’lı kandan izole
edilir.
•10 ml’lik kan 50ml’lik EDTA’lı tübe
alınır ve üzerine 40ml soğuk steril
distile su ilave edilerek ve 2-3 dakika
hızla çalkalanarak eritrositlerin
parçalanması sağlanır.
•2500 rpm’de oda temparatüründe
santrifüj edilir ve süpernatan kısmı
İNSAN KANINDAN DNA
İZOLASYONU( Yüksek Tuz
Konsantrasyonunda)
•Bu yıkama işlemi iki kez
tekrarlandıktan sonra (böylece
eritrositler uzaklaştırılır) pellet(
lökosit içerir) üzerine nüklei lizis
tamponu, SDS ve proteinaz K
eklenerek (Lökositlerin parçalanması
sağlanır)37 derecelik etüvde bir gece
bekletildi.
•Etüvden çıkarılan tüplere amonyum
asetat eklenerek hızla çalkalanır.
İNSAN KANINDAN DNA
İZOLASYONU( Yüksek Tuz
Konsantrasyonunda)
•Süpernatan temiz tüpe alınır ve
etanol eklenir. Tüp alt-üst edilerek
DNA görünür hale getirilir.
•Toplanan DNA % 70’lik etanolle
yıkanır ve alkol uçurulur.
•DNA TE içeren tüpe alınır ve
çözülür. Bu şekilde saklanır.
İNSAN KANINDAN DNA
İZOLASYONU( Yüksek Tuz
Konsantrasyonunda)
•İzole edilen DNA’ların 1/50
dilisyonları hazırlanarak, 260 nm
dalga boyundaki absorbans değerleri
okunur. Okunan absorbans
değerlerinden örneklerdeki DNA
konsantrasyonu hesaplanır.
Download

FFMBG103- MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK 1