İçindekiler
Beşinci Baskıya Önsöz, xv
Dördüncü Baskıya Önsöz, xvi
Üçüncü Baskıya Önsöz, xvii
İkinci Baskıya Önsöz, xviii
Birinci Baskıya Önsöz, xx
Kısım 1: Gen Klonlama ve DNA Analizinin Temel İlkeleri, 1
1 Gen Klonlama ve DNA Analizi Neden Önemlidir, 3
1.1 Genetiğin ilk gelişimi, 3
1.2Gen klonlama ve polimeraz zincir
reaksiyonunun keşfi, 4
1.3 Gen klonlama nedir? 5
1.4. PCR nedir? 6
1.5. Gen klonlama ve PCR neden çok önemlidir, 8
1.5.1. Klonlamayla gen izolasyonu, 8
1.5.2. PCR’la gen izolasyonu, 9
1.6. Bu kitap boyunca yolunuzu nasıl bulursunuz, 12
2 Gen Klonlama İçin Vektörler: Plazmitler ve Bakteriyofajlar, 14
2.1 Plazmitler, 14
2.1.1 Plazmitlerin temel özellikleri, 14
2.1.2 Büyüklük ve kopya sayısı, 16
2.1.3 Konjugasyon ve uyumluluk, 17
2.1.4 Plazmitlerin sınıflandırılması, 18
2.1.5 Bakteriler dışındaki organizmalarda plazmitler, 19
2.2 Bakteriyofajlar, 19
2.2.1 Bakteriyofajların temel özellikleri, 19
2.2.2. Lizojenik fajlar, 20
İçindekiler
λ DNA molekülünün gen düzenlenmesi, 22
λ DNA’sının doğrusal ve halkasal formları, 23
M13 – İpliksi bir faj, 25
Klonlama vektörü olarak M13’ün cazibesi, 25
2.2.3 Diğer organizmalar için klonlama vektörleri olarak virüsler, 27
3 Canlı Hücrelerden DNA’nın Saflaştırılması, 28
3.1. Total hücre DNA’sının hazırlanması, 28
3.1.1 Bir bakteri kültürünü büyütme ve harmanlama, 29
3.1.2 Bir hücre özütünün hazırlanması, 30
3.1.3 Bir hücre özütünden DNA’nın saflaştırılması, 33
Organik özütleme ve enzim sindirimiyle bulaşkanların
uzaklaştırılması, 34
Bir hücre özütünden DNA'yı saflaştırmak için
iyon-değiştirme kromatografisinin kullanımı, 35
3.1.4 DNA numunelerinin derişimi, 35
3.1.5. DNA derişiminin ölçülmesi, 37
3.1.6. Total hücre DNA’sının hazırlanması için diğer metotlar, 37
3.2. Plazmit DNA’sının hazırlanması, 39
3.2.1. Büyüklük esasına dayalı ayırma, 41
3.2.2 Konformasyona dayalı ayırma, 42
Alkalin denatürasyon, 43
Etidyum bromür- sezyum klorür yoğunluk kademeli
santrifüjleme, 43
3.2.3 Plazmit çoğaltılması, 46
3.3 Bakteriyofaj DNA’sı hazırlama, 47
3.3.1 Yüksek λ titresi elde etmek için kültürlerin büyütülmesi, 47
3.3.2 Lizojenik olmayan λ fajını hazırlama, 48
3.3.3 Enfekte bir kültürden fajın toplanması, 50
3.3.4 λ faj partiküllerinden DNA’nın izolasyonu, 51
3.3.5 M13 DNA’sının saflaştırılması birkaç probleme yol açar, 52
4 Saflaştırılmış DNA’nın Manipülasyonu, 54
4.1 DNA manipülatif enzimler serisi, 55
4.1.1 Nükleazlar, 55
4.1.2 Ligazlar, 57
4.1.3 Polimerazlar, 58
4.1.4 DNA‘yı modifiye eden enzimler, 60
4.1.5 Topoizomerler, 61
4.2 DNA’yı kesmek için enzimler – restriksiyon endonükleazlar, 61
4.2.1 Restriksiyon enzimlerinin keşfi ve işlevi, 63
vi
İçindekiler
4.2.2 Tip II restriksiyon endonükleazları DNA’nın spesifik nükleotit
dizilerini keser, 64
4.2.3 Küt uçlar ve yapışkan uçlar, 64
4.2.4 Bir DNA molekülündeki tanıma dizilerinin sıklığı, 65
4.2.5 Laboratuvarda bir restriksiyon sindiriminin gerçekleştirilmesi, 68
4.2.6 Restriksiyon endonükleaz kesim sonuçlarını
değerlendirme, 70
Jel elektroforezi ile moleküllerin ayırımı, 70
Jel boyamayla DNA moleküllerinin görüntülenmesi, 70
Otoradyografi ile DNA moleküllerini görüntüleme, 72
4.2.7 DNA moleküllerinin büyüklüklerinin hesaplanması, 74
4.2.8 Bir DNA molekülündeki farklı kesim pozisyonlarını
haritalama , 76
4.3 Ligasyon - DNA moleküllerini birbirine bağlama, 78
4.3.1 DNA ligazın etki şekli, 78
4.3.2 Bağlamanın etkisini artıran yapışkan uçlar, 78
4.3.3 Küt uçlu bir moleküle yapışkan uçlar koymak, 80
Linkerler, 80
Adaptörler, 80
Homopolimer kuyruk takmayla (Homopolymer Tailing)
yapışkan uçlar üretmek, 84
5 Canlı Hücrelere DNA’nın Girişi, 87
5.1 Transformasyon - bakteri hücreleri tarafından DNA’nın alınması, 90
5.1.1 Tüm bakteri türleri DNA alımında eşit şekilde
etkili değildir, 90
5.1.2 Kompetan E. coli hücrelerinin hazırlanması, 90
5.1.3 Transforme olan hücrelerin seçilmesi, 91
5.2 Rekombinantların Saptanması, 93
5.2.1 pBR322 ile rekombinant seçimi – bir antibiyotik direnç geninin insersiyonel inaktivasyonu, 93
5.2.2 İnsersiyonel inaktivasyon, daima antibiyotiğe dirençliliği
gerektirmez, 95
5.3 Bakteri hücrelerine faj DNA’sının sokulması, 97
5.3.1 Transfeksiyon, 98
5.3.2 λ klonlama vektörlerinin in vitro paketlenmesi, 98
5.3.3 Faj enfeksiyonu bir agar ortam üzerinde plakalar
şeklinde belirir, 99
5.4 Rekombinant fajların saptanması, 101
5.4.1 Faj vektörü tarafından taşınan lacZ´ geninin insersiyonal
inaktivasyonu, 101
5.4.2 λ cl geninin insersiyonel inaktivasyonu, 101
vii
İçindekiler
5.5 5.4.3 Spi fenotipini kullanarak seçilim, 103
5.4.4 λ genomu büyüklüğüne dayalı seçilim, 103
Bakteri olmayan hücrelerin transformasyonu, 103
5.5.1 Bireysel hücrelerin transformasyonu, 103
5.5.2 Tüm organizmanın transformasyonu, 106
6 E. coli İçin Klonlama Vektörleri, 104
6.1 E. coli plazmitlerine dayalı klonlama vektörleri, 108
6.1.1 Plazmit klonlama vektörlerinin isimlendirilmesi, 108
6.1.2 pBR322’nin kullanışlı özellikleri, 108
6.1.3 pBR322’nin pedigrisi, 109
6.1.4 Diğer tipik E. coli plazmit klonlama vektörleri, 109
pUC8- Lac seçilim plazmiti, 111
pGEM3Z- klonlanan DNA’nın in vitro transkripsiyonu, 113
6.2 M13 bakteriyofajına dayalı klonlama vektörleri, 114
6.2.1 M13mp2 klonlama vektörlerinin geliştirilmesi, 115
M13mp7- simetrik klonlama yerleri, 115
Daha kompleks M13 vektörleri, 118
6.2.2 Hibrit plazmit- M13 vektörleri, 120
6.3 λ bakteriyofajına dayalı klonlama vektörleri, 120
6.3.1 λ genomunun parçaları, canlılığını yok etmeksizin
çıkarılabilir, 122
6.3.2 Doğal seçilim, belli restriksiyon yerlerinden yoksun modifiye
λ’yı izole etmek için kullanılabilir, 123
6.3.3 İnsersiyon ve replasman (replacement) vektörler, 123
İnsersiyon vektörleri, 123
Replasman vektörleri, 124
6.3.4 λ insersiyon ya da replasman vektörleriyle klonlama
deneyleri, 126
6.3.5 Uzun DNA fragmanları bir kozmit kullanarak klonlanabilir, 127
6.4 λ ve diğer yüksek kapasiteli vektörler gen kütüphanelerinin
yapılmasına izin verirler, 129
6.5 Diğer bakteriler için vektörler, 130
viii
7 Ökaryotlar İçin Klonlama Vektörleri, 132
7.1 Maya ve diğer mantarlar için klonlama vektörleri, 132
7.1.1 2 μm plazmit için seçici belirteçler, 132
7.1.2 2μm plazmit’e dayalı vektörler-maya epizomal plazmitleri, 133
7.1.3 YEp maya kromozomal DNA’sına sokulabilir, 135
7.1.4 Maya klonlama vektörlerinin diğer tipleri, 135
7.1.5 Yapay kromozomlar mayada uzun DNA parçalarını klonlamak
için kullanılabilirler, 138
İçindekiler
YAC vektörünün yapısı ve kullanımı, 138
YAC vektörleri için uygulamalar, 140
7.1.6 Diğer mayalar ve mantarlar için vektörler, 140
7.2. Yüksek bitkiler için klonlama vektörleri, 141
7.2.1 Agrobacterium tumefaciens-doğanın en ufak genetik
mühendisi, 141
Bitki hücrelerine yeni genlerin sokulması için Ti plazmitinin
kullanılması, 142
Ti plazmitle transforme olan bitkilerin üretimi, 145
Ri plazmit, 145
Agrobacterium plazmitleriyle klonlamanın sınırlamaları, 146
7.2.2 Bitkilerde doğrudan gen transferi ile klonlama, 147
Çekirdeğe doğrudan gen transferi, 147
Genlerin kloroplast genomuna transferi, 149
7.2.3 Bitki virüslerini klonlama vektörleri olarak kullanmak için
girişimler, 150
Kaulimovirüs vektörleri, 150
Geminivirüs vektörler, 150
7.3 Hayvanlar için klonlama vektörleri, 151
7.3.1 Böcekler için klonlama vektörleri, 151
Drosophila için klonlama vektörleri olarak P elementleri, 151
Böcek virüslerine dayalı klonlama vektörleri, 153
7.3.2 Memelilerde klonlama, 153
Memeliler için klonlama vektörleri, 153
Vektörsüz gen klonlama, 155
8 Belli Bir Geni İçeren Klon Nasıl Elde Edilir, 158
8.1 Seçilim problemi, 158
8.1.1 İstenilen klonu elde etmek için iki temel strateji vardır, 158
8.2. Doğrudan Seçilim, 159
8.2.1 Belirteç kurtarma (marker rescue) doğrudan seçilimin
kapsamını genişletir, 161
8.2.2 Belirteç kurtarmanın (marker rescue) kapsamı ve
sınırlamaları , 163
8.3 Bir gen kütüphanesinden bir klonun saptanması, 163
8.3.1 Gen Kütüphaneleri, 163
8.3.2 Tüm genler aynı anda ifade olunmaz, 164
8.3.3 mRNA komplementer DNA olarak klonlanabilir, 166
8.4 Klon saptamak için metotlar, 166
8.4.1 Komplementer nükleik asit iplikleri birbirleriyle hibritlenir, 166
8.4.2 Koloni ya da plaka ile probu hibritleme, 168
8.4.3 Hibritleme probunun pratik kullanımına örnekler, 172
ix
İçindekiler
Bir cDNA kütüphanesini analiz etmek için bolluk
problama, 172
Translasyon ürünü tanımlanan genler için
oligonükleotit problar, 172
Heterolog problama ilişkili genlerin saptanmasına
izin verir, 176
8.4.4 Klonlanan genin translasyon ürününün saptanmasına dayalı
teşhis metotları, 177
İmmünolojik saptama metotları için antikorlar
gereklidir, 177
Rekombinant kolonilerde protein saptamak için saflaştırılmış
bir antikorun kullanılması, 178
Gen ifadesinin problemi, 178
9 Polimeraz Zincir Reaksiyonu, 181
9.1 Ana hatlarla polimeraz zincir reaksiyonu, 181
9.2 Daha detaylarla PCR, 184
9.2.1 Bir PCR için oligonükleotit primerleri tasarlama, 184
9.2.2 Kullanılacak doğru sıcaklığı belirleme, 186
9.2.3 PCR sonrası: PCR ürünlerini çalışma, 189
PCR ürünlerinin jel elektroforezi, 189
PCR ürünlerini klonlama, 190
9.3 Taq polimerazın hata oranına ilişkin problemler, 193
Kısım 2: Araştırmalarda Gen Klonlama ve DNA Analizi
Uygulamaları, 197
10 Genin Yerini ve Yapısını İncelemek, 199
10.1 Klonlanan bir genin yeri nasıl çalışılır, 199
10.1.1. Küçük bir DNA molekülündeki bir genin pozisyonunun
belirlenmesi, 199
10.1.2 Büyük bir DNA molekülündeki bir genin pozisyonunu
belirlemek, 202
Jel elektroforezi ile kromozomların ayrılması, 203
Ökaryotik kromozoma klonlanan bir genin pozisyonunu
in situ hibritleme ile görüntüleme, 205
10.2 DNA baz dizisi çıkarma- bir genin yapısını çözme, 207
10.2.1 Sanger-coulson metodu; zincir sonlandıran nükleotidler, 207
Primer, 207
Komplementer ipliğin sentezi, 207
Dört ayrı reaksiyon sonlanan ipliklerin dört ailesiyle
sonuçlanır, 209
Otoradyografiden DNA dizisinin okunması, 209
İçindekiler
Baz dizisi çıkarmak için tüm DNA polimerazlar
kullanılamaz, 210
10.2.2 Otomatik DNA dizileme, 211
10.2.3 PCR ürünlerini dizileme, 211
10.2.4 Maxam- Gilbert metodu-DNA’nın kimyasal sindirimi, 214
10.2.5 Uzun bir DNA dizisi oluşturmak, 216
10.2.6 DNA dizilemenin başarılması, 218
11 Gen İfadesi (ekspresyonunun) ve İşlevini İnceleme, 220
11.1 Klonlanan bir genin transkripsiyonunu inceleme, 221
11.1.1 Nükleik asit moleküllerinin elektron mikroskobisi , 222
11.1.2 Nükleaz muamelesi ile DNA-RNA hibritlerinin analizi, 223
11.1.3 Primer uzatmayla transkript analizleri, 224
11.1.4 RNA transkriptlerini incelemek için diğer teknikler, 225
Northern hibritleme, 225
Revers transkripsiyon-PCR (Rt-PCR), 226
cDNA uçlarının hızlı çoğaltımı (RACE), 227
RNA dizileme, 228
11.2 Gen ifadesinin düzenlenmesini inceleme, 230
11.2.1 Bir DNA molekülü üzerinde protein bağlanma yerlerinin
saptanması, 231
DNA-protein komplekslerinin jel gecikmesi
(retardasyonu), 231
DNaz I ile ayakizleme (footprinting), 232
Modifikasyon interferans analizleri, 233
11.2.2 Delesyon analiziyle kontrol dizilerininin saptanması, 236
Raportör genler, 236
Delesyon analizini gerçekleştirmek, 237
11.3 Klonlanan bir genin translasyon ürününü saptama ve inceleme, 239
11.3.1. HRT ve HART klonlanan genin translasyon ürününü
saptayabilir, 239
11.3.2 İn vitro mutagenez ile proteinlerin analizi, 240
In vitro mutagenez tekniklerinin farklı tipleri, 241
Klonlanan bir gende nokta mutasyonu oluşturmak için bir
oligonükleotit kullanımı, 243
Klonlanan bir gende bir nokta mutasyonu oluşturmak için
diğer metotlar, 245
İn vitro mutagenezin potansiyeli, 247
11.3.3 Protein-protein etkileşimlerinin çalışılması, 247
Faj görüntüleme, 247
Maya iki hibrit sistemi, 250
xi
İçindekiler
12 Genomları Çalışma, 252
12.1 Genomiks – bir genom nasıl dizilenir, 253
12.1.1 Genom dizilemede rastgele yaklaşım, 254
H.influenza genomunu dizileme projesi, 255
Rastgele klonlama ile ilgili problemler, 257
12.1.2 Klon kontig yaklaşımı, 257
Kromozom yürüme ile klon kontig birleştirme, 258
Klon kontig birleştirme için hızlı yöntemler, 259
Başlandırılmış dizi bölgesi içeriği analizi ile klon
kontig birleştirme, 260
12.1.3 Dizi birleştirmeye yardımcı olacak bir harita yapma, 261
Genetik haritalar, 261
Fiziksel haritalar, 262
Bir haritanın dizi birleştirmede önemi, 264
12.2 Post-genomiks – bir genom dizisini anlamaya çalışma, 264
12.2.1 Bir genom dizisindeki genleri saptama, 265
Açık okuma çerçevelerini araştırma, 265
Olası ORF’lerde gerçek genleri ayırt etme, 266
12.2.2 Bilinmeyen bir genin işlevini belirleme, 268
12.3 Transkriptom ve proteom çalışmaları, 269
12.3.1 Transkriptomu çalışma, 269
12.3.2 Proteomu çalışma, 271
Kısım 3: Gen Klonlama ve DNA Analizinin Biyoteknolojide
Uygulamaları, 275
13 Klonlanan Genlerden Protein Üretimi, 277
13.1 Yabancı genlerin E. coli’de ifade edilmesi için özel vektörler, 279
13.1.1 Promotor bir ifade vektörünün kritik bileşenidir, 282
Promotor dikkatli seçilmelidir, 282
İfade vektöründe kullanılan promotor örnekleri, 284
13.1.2 Kasetler ve gen birleşmeleri, 285
13.2 E. coli’de rekombinant protein üretimi ile ilgili genel problemler, 287
13.2.1 Yabancı gen dizisinden kaynaklanan problemler, 288
13.2.2 E. coli’nin neden olduğu sorunlar, 291
13.3 Ökaryotik hücreler tarafından rekombinant protein üretimi, 292
13.3.1 Maya ve ipliksi mantarlardan rekombinant proteinler, 292
Rekombinant protein sentezinde konak olarak Saccharomyces
cerevisiae, 292
xii
İçindekiler
Diğer maya ve mantarlar, 293
13.3.2 Rekombinant protein üretimi için hayvan hücrelerini
kullanma, 295
Memeli hücrelerinde protein üretimi, 295
Böcek hücrelerinde protein üretimi, 295
13.3.3 Canlı hayvanlar ve bitkilerden rekombinant protein üretimi
(pharming-farmasötiktarım)
Hayvanlarda farmasötiktarım, 297
Bitkilerden rekombinant proteinler, 298
Farmasötik tarım ile artan etik sorunlar, 299
14 Tıpta Gen Klonlama ve DNA Analizi, 302
14.1 Rekombinant farmasötiklerin üretimi, 302
14.1.1 Rekombinant insülin, 302
Yapay insülin genlerinin sentezi ve ifadesi, 303
14.1.2 İnsan büyüme hormonlarının E. coli’de sentezi, 305
14.1.3 Rekombinant faktör VIII, 306
14.1.4 Diğer rekombinant insan proteinlerinin sentezi, 309
14.1.5 Rekombinant aşılar, 309
Rekombinant proteinler olarak aşı üretimi, 310
Transgenik bitkilerde rekombinant aşılar, 312
Canlı rekombinant aşılar, 312
14.2 İnsan hastalıklarından sorumlu genlerin saptanması, 314
14.2.1 Genetik bir hastalık için bir gen nasıl saptanır, 315
İnsan genomunda genin yaklaşık pozisyonunu
belirleme, 315
Hastalık genleri için adayların saptanması, 318
14.3 Gen tedavisi, 319
14.3.1 Kalıtsal hastalıklar için gen tedavisi, 319
14.3.2 Gen tedavisi ve kanser, 321
14.3.3 Gen tedavisi ile ortaya çıkan etik konular, 321
15 Tarımda Gen Klonlama ve DNA Analizi, 323
15.1 Bitki genetik mühendisliğinde gen ekleme yaklaşımı, 324
15.1.1 Kendi böcek öldürücülerini yapan bitkiler, 324
Bacillus thuringiensis δ-endotoksinleri, 324
Mısıra bir δ -endotoksin genini klonlama, 325
Kloroplastlarda δ-endotoksin genlerinin klonlanması, 328
δ-endotoksin kültür bitkileri için böcek direncini
sürdürme, 329
15.1.2 Herbisite dirençli kültür bitkileri, 331
“Roundup ready” kültür bitkileri, 331
Glifosat dirençli kültür bitkilerinin yeni bir nesli, 332
15.1.3 Diğer gen ekleme projeleri, 334
xiii
İçindekiler
15.2 Gen çıkarma, 334
15.2.1 Antisens teknolojinin arkasındaki prensip, 335
15.2.2 Antisens RNA ve domateste meyve olgunlaşmasının
mühendisliği, 336
Poligalakturonaz genini inaktif hale getirmek için antisens
RNA’nın kullanımı, 337
Etilen sentezini inaktive etmek için antisens RNA’nın
kullanımı, 339
15.2.3 Bitki genetik mühendisliğinde antisens RNA kullanımının
diğer örnekleri, 340
15.3 Genetik olarak değiştirilmiş bitkilerle problemler, 341
15.3.1 Seçilebilir belirteçlerle güvenlik endişeleri, 341
15.3.2 Terminatör teknolojisi, 342
15.3.3 Çevre üzerinde zararlı etkilerin olasılığı, 344
16 Adli Tıp Biliminde ve Arkeolojide Gen Klonlama ve DNA Analizi, 346
16.1 Suç şüphelilerinin teşhisinde DNA analizi, 346
16.1.1 Hibritleme problama ile genetik parmakizleme, 347
16.1.2 Kısa ardışık tekrarların PCR’ı ile DNA profilleme, 347
16.2 DNA profilleme ile akrabalık çalışma, 350
16.2.1 Akraba bireyler benzer DNA profillerine sahiptir, 350
16.2.2 DNA profilleme ve Romanovların kalıntıları, 350
Romanov kemiklerinin STR analizi, 351
Kayıp çocuklar, 352
16.3 DNA analizi ile cinsiyet saptama, 353
16.3.1 Y kromozomuna-özgül dizilere yönlendirilen PCR’lar, 353
16.3.2 Amelojenin geninin PCR’ı, 354
16.4 Arkeogenetik-İnsan evrimi çalışmak için DNA’yı kullanma, 356
16.4.1 Modern insanların kökeni, 356
DNA analizleri çoklubölgesel hipotezine ters düştü, 357
DNA analizleri Neanderthal’lerin modern Avrupa’lıların atası
olmadığını gösterir, 358
16.4.2 DNA tarih öncesi insan göçlerini araştırmak için de
kullanılabilir, 359
Tarımın Avrupa’ya yayılması, 359
Geçmişte Avrupa’ya insan göçlerini incelemek için
mitokondri DNA’sının kullanılması, 360
xiv
Sözlük, 363
Dizin, 379
Download

İçindekiler