TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
HematoLog
2014: 4■1
Dr. Zeynep Karakaş
Dr. Ferda Özkınay
İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi,
Çocuk
Hematoloji
Bilim
Dalı,
İstanbul,
Türkiye
Ege
Üniversitesi
TıpOnkoloji
Fakültesi,
Tıbbi
Genetik
Anabilim
Dalı,
e-posta:
[email protected]
Çocuk Sağlığı
ve Hastalıkları
Anabilim Dalı, Çocuk Genetik
Hastalıkları Bilim Dalı, İzmir, Türkiye
e-posta:
[email protected]
Anahtar
Sözcükler
Alfa talasemi, Genetik, Klinik,
Sessiz alfa
talasemi taşıyıcı, Ağır alfa talasemi
Anahtar
Sözcükler
taşıyıcı, Hb H hastalığı, Hb Barts, Hidrops fetalis
Hemoglobinopati, Moleküler genetik testler, Talasemi
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
ÖZET
Hemoglobin dört globin zincirinden oluşan tetramerik bir yapı gösterir.
Fetusta en yüksek oranda bulunan hemoglobin, HbF(α2γ2) iken, erişkinde
hemoglobinin %95’i HbA (α2β2), <%3,2’si HbA2 (α2δ2), <%1’i HbF’dir (α2γ2).
Bugüne kadar moleküler düzeyde globin genlerinde yaklaşık 1000 civarında
mutant allel saptanmıştır. Hemoglobinde bulunan globin zincirlerinden birinin
az sentezlenmesi veya hiç yapılamaması yani kantitatif yetersizliği talasemi
tablosuna (α ve β talasemi) sebep olurken, globin zincirinin yapısal bozuklukları
yani kalitatif bozuklukları yapısal hemoglobin bozukluklarını oluşturur.
Bu klinik tabloları gösteren hastalardaki genotipleri ve taşıyıcılardaki
moleküler defekti göstermek, kesin tanı koymada, prognozu tahminde,
tedavi seçeneklerini uygulamada ve genetik konsültasyonda önemlidir.
Yeni gelişen DNA teknolojisi talasemiler ve yapısal hemoglobinopatilerin
moleküler tanısında, hızlı ve yüksek doğrulukta tanı testlerinin geliştirilmesini
sağlamıştır. Bu yöntemler mutasyonu doğrudan tayin eden direk yöntemler ve
indirek yöntemler olarak sınıflandrılır. Direk yöntemler arasında Allel Spesifik
Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO), Amplifikasyon Refrakter Mutasyon
Sistemi (ARMS), dizi analizi, gap-PCR yöntemleri sayılabilir. Denature edici
Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) ve Denature edici Yüksek performanslı Likid
Kromatografi (DHPLC) yöntemleri indirek yöntemlerdir. Ayrıca son yıllarda
Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA), Quantitative Multiplex PCR of Short
Fragments (QMPSF), Real-time PCR, Melting Curve Analysis (MCA) gibi
yöntemler hızla kullanıma girmektedir. Moleküler tanıda yöntem/yöntemler,
hastanın fenotipik bulgularına, hematolojik parametrelere ve toplumdaki sık
rastlanılan mutasyonlara ve laboratuvarın özel koşullarına göre seçilir.
30
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Hemoglobin molekülü, oksijenin hemoglobine reversibl bağlanmasını
sağlayan prostetik grup olan hem ve globin protein zincirlerinden oluşur.
Hemoglobinin yapısında bulunan, globin zincirlerinin sentez bozuklukları
dünyada en yaygın rastlanılan kalıtsal tek gen hastalıkları grubudur.
Epidemiyolojik çalışmalar malaryanın sık olduğu bölgelerde, bu enfeksiyona
karşı koruyucu olduğu bilinen hemoglobinopati taşıyıcılığının da sık olduğunu
göstermektedir. Dünya nüfusunun yaklaşık %5’i globin varyantlarından birini
taşımaktadır. Alfa ve beta talasemi taşıyıcılarının sıklığı %1,7’dir (1).
İnsanlarda hemoglobin dört globin zincirinden oluşan tetramerik bir yapı
gösterir. Bu tetramerik yapı içinde, insan yaşamının evrelerine göre değişkenlik
gösteren iki α veya α benzeri, iki β veya β benzeri genin ürünü olan dört
globin zinciri bulunur. Hemoglobinler, yapısındaki globin zincirlerine göre
adlandırılır. Fetusta en yüksek oranda bulunan hemoglobin, HbF (α2γ2) iken
erişkinde hemoglobinin %95’i HbA (α2β2), <%3,2’si HbA2 (α2δ2), <%1’i
HbF’dir (α2γ2). α globin zincirleri 16. kromozomun kısa kolu üzerinde
bulunan iki α geni (α1 ve α2) tarafından kodlanır; γ, δ, β, globin zincirleri ise
11. kromozomun kısa kolu üzerinde bulunan γG- γA, δ, β genleri tarafından
kodlanır. Bugüne kadar moleküler düzeyde globin genlerinde yaklaşık 1000
civarında mutant allel saptanmıştır (2). Bu moleküler değişikliklere http://
globin.cse.psu.edu/ sitesinde HbVar bilgibankası (HbVar database) yoluyla
ulaşılabilir.
Hemoglobinde bulunan globin zincirlerinden birinin az sentezlenmesi veya
hiç yapılamaması yani kantitatif yetersizliği talasemi tablosunu (α ve β
talasemi) oluştururken, globin zincirinin yapısal bozuklukları, yani kalitatif
bozuklukları yapısal hemoglobin bozukluklarını (HbS) oluşturur. Yapısal
hemoglobin bozukluklrından HbE’de zincirin yapısının bozulmasının yanısıra,
globin zincir sentezi de azaldığı için hastalık tablosu talasemilere benzer.
Hemoglobin bozuklukları oluşturdukları klinik tablolara göre dört ana grupta
incelenmektedir (3).
1- β talasemi sendromları (δβ talasemi, HbE/β talasemi de bu gruba girer)
2- α talasemi sendromu
3- Orak hücreli anemi (Hb S/S, Hb S/C, HbS/β-thal. ve daha az rastlanılan Hb
S/Dpunjab, Hb S/OArab ve Hb S/Lepore
4- Hemolitik anemi, polisitemi ve nadiren siyanozun olduğu Hb varyantları
Bu klinik tabloları gösteren hastalardaki genotipleri ve taşıyıcılardaki
moleküler defekti göstermek, kesin tanı koymada, prognozu tahminde,
tedavi seçeneklerini uygulamada ve genetik konsültasyonda önemlidir.
Ülkemizde ve Akdeniz çevresindeki ülkelerde globindeki β zincirinin az
yapıldığı veya hiç yapılamadığı β talasemi daha sık görülür.
β Talasemide Genetik
β talasemide başlıca üç klinik fenotip görülür.
• Transfüzon bağımlı talasemi major tablosu
• Nadir transfüzyon gerektiren talasemi intermedia tablosu
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
31
32
HematoLog
2014:4•1
• Talasemi taşıyıcılığı (Talasemi minor)
Bu sınıflandırma fenotipe dayalıdır. Hastalıkta genotip-fenotip ilişkisi orta
düzeyde ve modifiye edici faktörler olduğundan genotipi tam yansıtmaz
(3,4).
Son yayınlarda beta talasemi sınıflandırması aşağıdaki gibi yapılmaktadır (5):
β talasemi
Talasemi major
Talasemi intermedia
Talasemi minor
Diğer hemoglobinopatiler ile birlikte olan β talasemi
HbC/Beta-thalassemia
HbE/Beta-thalassemia
HbS/Beta-thalassemia
Herediter persistan fetal hemoglobinopati ile birlikte olan β talasemi
Otozomal dominant β talasemi
Diğer bulgularla birlikte olan β talasemi
Trikotiyodistrofi ve β talasemi
X’e bağlı trombositopeni ve β talasemi
Beta-Globin Geni ve Mutasyonlar
β ve β benzeri genler, 11. kromozom üzerinde bulunur (Şekil 1). Bu genlerin
herbiri sırasıyla embriyonal yaşamdan erişkin yaşama kadar soldan sağa
doğru eksprese olur. Embriyonal ve fetal yaşamda eksprese olan, beta gen
bölgesindeki epsilon geni erişkinde inaktiftir. Gama geni çok az eksprese
olur. Erişkinde hemoglobinin %95’i HbA (α2β2), <%3,2’si HbA2 (α2δ2),
<%1’i HbF’dir (α2γ2) (4,6,7). Bu gen bölgesinin başlangıcında, genlerin
ekspresyonunu kontrol eden elemanlar (lokus kontrol bölgesi-LCR)
bulunur. Bazı nadir beta talasemi formlarında, tüm genler sağlam olduğu
halde bu düzenleyici bölge elemanları delesyona uğrar ve tüm genlerin
ekspresyonunda belirgin bir azalma olur. Düzenleyici bölgedeki bazı cisacting mutasyonlar veya γ geni promotorunda transkripsiyon faktörlerinin
bağlanmasını aktive edici mutasyonlar γ- globin ekspresyonunu dolayısıyla
fetal hemoglobini değişik düzeylerde arttırır ve bu durum herediter persistan
Şekil 1. 11. kromozom üzerinde bulunan β ve β benzeri genler
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Beta globin geni 3 ekzon içerir ve 146 amino asitten oluşan bir protein kodlar.
Birinci ekzon 1-29 amino asitleri, ikinci ekzon 30-104, üçüncü ekzon 105146 aminoasitleri kodlar (Şekil 2).
Şekil 2. Beta globin geni
Βeta talasemi geni içinde 200’den fazla mutasyon tarif edilmiştir.
Mutasyonların çoğu nokta mutasyonları olup nadiren delesyonlar ve
insersiyonlar da görülebilir (10). Mutasyonların dağılımı toplumdan topluma
değişiklik gösterir. Bazı mutasyonlarda protein hiç sentezlenemez ve “β0”
talasemi adını alır. Bazı mutasyonlarda ise protein sentezi vardır fakat
yetersizdir. Protein sentezi az miktarda olduğunda “β+” talasemiden söz
edilir. β0 talasemilerde genellikle klinik tablo daha ağırdır. Türk toplumunda
en sık olarak IVS-1-110 mutasyonuna rastlanır. Bu mutasyon β+ talasemi
olmasına rağmen ağır klinik tablo yapar. Birinci intronda bulunan IVS-1110 mutasyonu intron içinde bir ekzon yapışma bölgesi oluşturarak, RNA
oluşması sırasında, birinci ekzonun ikinci ekzona yapışacağı yerde buraya
yapışmasına neden olur ve sentezi azaltır. Toplumumuzda β talasemi
geninde bulunan en sık 7 mutasyon tüm olgulardaki mutasyonların %7580’ini oluşturur (Tablo 1) (11).
Tablo 1. Türk toplumunda en sık rastlanılan 7 mutasyon (11)
Mutasyon Tipi Sayı %
IVS-I-110 312 39,3
IVS-I-6 (T-C) 80 10,1
FSC-8 (-AA) 43 5,5
IVS-I-1 (G-A) 40 5,0
IVS-II-745 (C-G) 40 5,0
IVS-II-1 (G-A) 37 4,7
Cd 39 (C-T) 30 3,8
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
fetal hemoglobinemi (HPFH) adını alır. Deltabeta talasemide en azından bir
γ- globin genini sağlam bırakan δ, β genlerinin delesyonu söz konusudur.
Bu durumda orta düzeyde δβ talasemi tablosu ve HbF’de artma vardır (8,9).
33
34
HematoLog
2014:4•1
BETA TALASEMİDE KLİNİK TABLOYU ETKİLEYEN
GENETİK FAKTÖRLER
Beta talasemili hastalarda klinik bulgular değişkenlik gösterir. Klinik tabloyu
etkileyen genetik faktörler 3 ana grupta incelenmekedir (12):
1. Primer modifiye edici faktörler
2. Sekonder modifiye edici faktörler
3. Tersiyer modifiye edici faktörler.
Primer Modifiye Edici Faktörler: Bu gruba β talasemi gen bölgesinde
bulunan genlerdeki mutasyonlar girer. β genindeki bazı mutasyonlarda
globin zinciri sentezi tamamen durmaktadır. β0 talasemi olarak adlandırılan
bu tip talasemilerde klinik tablo, hemoglobin sentezinin kısmen yapılabildiği
β+ veya β++ talasemilere göre daha ağırdır. β0 mutasyonlar genellikle 1.
ve 2. ekzonda ya da ekzon-intron sınırına yakın bölgelerde bulunan nokta
mutasyonları veya küçük delesyonlar ve insersiyonlardır. Cd 6-A and cd 8-AA
gibi birkaç β0 talasemi mutasyonu, γ- globin geninin promotor bölgesindeki
aktive edici bir mutasyonla bağlantı gösterdiği için, yüksek HbF üretimi
nedeniyle hafif klinik tablo gösterir (13). β talasemide büyük delesyonlar
nadirdir. Büyük delesyonlar kapsadığı gen bölgesine göre değişik bulgular
gösterir. Örneğin -125 den +78 e kadar olan bazların delesyona uğradığı
mutasyon 5’ bölgesindeki CACCC, CCAAT ve TATA elementleri de içerir. Bu
bölgede bulunan ve genlerin ekspresyonu arasındaki dengeyi sağlayan lokus
kontrol bölgesi (LCR=Lokus control region) de yok olduğu için β geni ile
cis durumda bulunan δ ve γ genlerinin ekspresyonu artmıştır ve bu nedenle
HbA2 düzeyleri belirgin şekilde yüksek olarak bulunur. On birinci kromozom
üzerindeki tüm β ve β benzeri genlerin ve LCR bölgesinin delesyona uğradığı
(εγδβ)0 talasemide ise hematolojik parametreler talasemi taşıyıcılığını
gösterirken HbA2 düzeyleri normal olarak bulunur (14). Son yıllarda yapılan
çalışmalarda β geninde yeni delesyon mutasyonları tarif edilmektedir (15,16).
Genin 5’ bölgesinde promotor bölgede ilk ekzonun önündeki 50 nükleotidi
içeren bölgede oluşan veya 3’ UTR’de bulunan bazı mutasyonlar “gizli
mutasyon”lardır. Taşıyıcılarda bulgu vermezler. Homozigot olarak
bulunduklarında taşıyanlarda beta talasemi taşıyıcılığı tablosu görüldüğü için
veya ağır bir başka mutasyon ile birleşik heterozigot durumda bulunduklarında
talasemi intermedia tablosu gösterdiklerinde yapılan analizlerde saptanır
(12,13). Bu mutasyonlardan bazıları: 92 C→T, –101 C→T, 5′ UTR +10 –T, 5′
UTR +33 C→G, IVS2 844 C→G, CAP +1 A→C, 3′ UTR +6 C→G’dir.
Hafif mutasyonlar, gizli mutasyonlar gibi genellikle genin 5’ promotor
bölgesinde, 3’UTR bölgesinde ve PoliA bölgesinde bulunur. Hafif mutasyon
taşıyıcılarında hematolojik parametreler taşıyıcılığı gösterir. Bu mutasyonlar
homozigot durumda genellikle talasemi intermedia tablosu yaparlar. Ağır
mutasyonlarla birleşik heterozigotluk durumunda klinik tablo talasemi
intermedia tablosundan, talasemi major tablosuna kadar değişkenlik gösterir
(13). Bu mutasyonlardan bazıları:
–90 C→T, –88 C→A,–88 C→T, –87 C→A, –87 C→G, –87 C→T,–86 C→G, –31
A→G, –30 T→A, –30 T→C, –29 A→G, –28 A→G (zencilerde hafif Çinlilerde ağır),
5′ UTR +22 G→A, CD 19 A→G Malay, CD 24 T→A, CD 26 G→A (Hb E), CD 27
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Bazı β talasemi mutasyonları tek allelde bulunduklarında da hafiften ağıra
değişen talasemi tablosuna neden olurlar. Bu tip otozomal dominant kalıtılan
30 kadar mutasyon tarif edilmiştir. Mutasyonlar genellikle 3. ekzondadır.
Taşıyıcılığın nadir olduğu toplumlarda görülür. Sıklıkla de-novodur.
Eritrositlerde alfa ve anormal β çökmesi (inkülizyonlar) vardır (17).
Sekonder Modifiye Edici Faktörler: Diğer globin zicirlerini kodlayan
genlerdeki defektler bu gruba girer. Talasemide eritrosit yıkımına neden
olan en önemli patolojik olay eritositlerin içinde α globin zincirlerinin
yığılmasıdır. Bu nedenle α gen delesyonlarında α globin sentezi azalacağı
için klinik tablo hafifler. α gen delesyonunun bulunduğu, α-/αα, - - /αα,
α- /α-, α- /- - genotipleri β talasemi ile bulunduklarında klinik tabloyu
hafifletir. Triplikasyon veya quadriplikasyonları (ααα, αααα) klinik tabloyu
ağırlaştırır. HbF’nin yüksekliği klinik tabloyu hafifleten bir diğer nedendir. β
ve δ genlerinin total delesyonunda HbF yüksekliği vardır ve klinik tablo daha
iyidir. β talasemi gen bölgesinde bulunan Gγ genindeki -158 C>T (Xmn1-Gγ)
polimorfizmi hematopoetik stresde HbF sentezini arttırır. Ayrıca 6q, Xp, 8q
de γ sentezi ilgili lokusların HbF düzeyini etkileyerek fenotipi değiştirdikleri
ortaya konmuştur (12,17,18).
Tersiyer
Modifiye
Edici
Faktörler:
Osteoporoz
talaseminin
komplikasyonlarındandır. Kemik metabolizmasında görev alan VDR, ESR,
Kollagen genlerindeki varyasyonlar osteoporozun gelişmesini etkiler
(19,20,21). Artmış demir yükü talasemide patolojik bulguların ve organ
yetmezliklerinin gelişmesinde en önemli faktördür. Demir metabolizmasında
rol oynayan, HFE geni, C282Y ve H63D genlerindeki polimorfizmlerin fenotipi
etkilediği gösterilmiştir (22-24). Bilirubin metabolizması genlerindeki
polimorfizmler (Örnek: UGT1 geni (TA)7 polimorfizmi) ve immun sistem
genlerindeki (HLA, TNF, ICAM gibi) polimorfizmlerin de talasemili hastalarda
morbidite ve mortaliteyi etkilediği gösterilmiştir (25,26).
ALFA TALASEMİDE GENETİK
Alfa talasemi, globinin α zincirlerini kodlayan genlerdeki delesyonlar veya
diğer tipteki mutasyonlar sonucu zincirin yetersiz sentezi sonucu meydana
gelir. α globin zincirleri her iki 16. kromozom üzerinde bulunan 2’şer genden
(α1 ve α2), toplam 4 gen tarafından kodlanır ve normal genotip, αα/ αα
olarak yazılır (Şekil 3). Bu genlerdeki moleküler defektler sonucu α Talasemi
taşıyıcılığı, HbH hastalığı (β4) ve Hb Bart’s (γ4) hidrops fetalis tabloları gelişir.
Bu klinik tabloların prevalansı Güney Asya, Uzak Doğu, Ortadoğu, Sahra altı
Afrika ve Hindistan’da yüksektir (27).
Alfa talasemi de taşıyıcılar ve hastalar moleküler defektin durumuna göre
düşük Hb, MCV, MCH gösterirler eritrosit sayısı yüksektir. HbA2 normal veya
hafifçe azalmış olabilir.
Elektroforez ile tanı konulmaz, moleküler genetik analiz tanıda önemlidir.
Demir eksikliği anemisi ile karışabilir. Demir tedavisi hastalara zararlı olabilir
(1). Alfa talasemide Mendel kalıtımı biraz daha karmaşıktır, birden fazla
taşıyıcı türü vardır, genotiplere göre fenotipler Tablo 2’de gösterilmiştir.
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
G→T Knossos, IVS1 6 T→C, 3′ UTR 47 C→G, PolyA AATAAA→AACAAA, PolyA
AATAAA→AATUAA, PolyA AATAAA→AATAGA, PolyA AATAAA→AATAAC’dir.
35
36
HematoLog
2014:4•1
Şekil 3. Alfa talasemide genotiplere göre fenotipler
Tablo 2. Alfa talasemide genotiplere göre fenotipler
Genlerde delesyon olabildiği gibi, geni inaktive eden bir nokta mutasyonu
da olabilir. Ebeveynlerden biri α- /αα , diğeri - - /αα ise ve her iki ebeveyn
de talasemi kromozomlarını çocuğa verirse, çocuk - - /α - olacaktır.
Bunun sonucunda β4 teramerleri tayin edilebilir düzeylerde olacak ve HbH
hastalığı ortaya çıkacaktır. Bu kişilerde ortadan ağır düzeylere (Hb: 2,6-13,3
g/dl) kadar değişen anemi vardır letal değildir. HbH düzeyleri (%0,8-40)
değişiktir (27,28). HbH hastalığında klinik tablo moleküler defekte bağlıdır.
Non-delesyonel tipte defekt olanlarda, delesyonlu hastalara göre daha
ağır klinik tablo görülür (29,30). Genlerin hiçbirisinin çalışmadığı durumda
Bart’s Hidrops fetalis sendromu görülür. Bu olgularda hemoglobinin çoğunu
fizyolojik olarak non-fonksiyonel γ4 ve β4 homotetramerleri oluşturur.
Ayrıca bu fetuslarda fonksiyon gören, oksijen taşıyan tek hemoglobin olarak,
değişen düzeylerde Hb Portland (ζ2γ2) vardır. Bu hemoglobin sayesinde fetal
yaşamlarını sürdürürler. Düzenleyici bölge - MCS (multispecies conserved
sequences) mutasyonları da genler sağlam olduğu halde zincir sentezini
bozarak α talasemiye neden olabilir (27).
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Orak hücreli anemide globin zincirinde kalitatif (yapısal) bozukluk vardır.
Globinde 6. pozisyondaki hidrofilik amino asit glutamik asit, hidrofobik amino
asit olan valine değişmiştir (CTC>CAC). Ortaya çıkan hemoglobin, HbS adını
alır ve elektroforezde farklı hareket eder. Taşıyıcıda, HbA2 ve F normaldir.
Homozigot olanlarda, ateş, enfeksiyon, dehidratasyon ve oksijensiz ortamda
eritrositlerde oraklaşma meydana gelir ve bu durum kanın normal akışını
engeller (Oraklaşma Krizi). Klinik tablo talasemilerden farklıdır. Hastalarda
vazooklüziv krizler, hemolitik krizler, dalakta sekestrasyon krizleri,
aplastik krizler görülür. HbS homozigot veya diğer hemoglobinopatiler
ile bileşik heterozigotluk (HbS/HbC, HbS/β talasemi) durumunda olabilir.
Homozigotlarda genellikle hastalık tablosu daha ağırdır. Son yıllarda HbS
hastalarında klinik tabloyu modifiye eden genetik faktörlerden sıkça söz
edilmektedir (31). Bunlarda en önemlisi HbF üretimini etkileyen genetik
faktörler ve eşlik eden α talasemi tablosudur (32). HbF yüksekliğinin ağrılı
krizleri, bacak ülserlerini azalttığı ve yaşamı uzattığı ile ilgili kuvvetli bulgular
olduğu bildirilmektedir. HbS allelinin, γ genini sağlam bırakıp diğer β
genlerini delesyona uğratan β talasemi alleli ile bileşik heterozigot durumda
olması çok hafif klinik bulgulara sebep olmaktadır. Çünkü bu durumda HbF
fazla üretilmektedir. HbF’in fazla üretimine yol açan, HPFH yapan, γ gen
mutasyonları veya γ genini aktive eden ilişkili genlerdeki mutasyonlar klinik
tabloyu hafifletmektedir (31). Son yıllarda tüm genomu araştıran çalışmalar
11. kromozomda ve genomun başka bölgelerinde β genleri fonksiyonlarını
etkileyen ve HbF düzeylerinde değişikliğe neden olan çok sayıda gen
göstermektedir (33-35).
HbS hastalığında klinik tabloyu modifiye eden bir başka genetik faktör α
talasemi varlığıdır. Hastalarda aynı zamanda α talasemi var ise HbS’nin
hücre içi kosantrasyonu düşmekte ve hücre hasarı azalmakta ve hemoliz
düzelmektedir (36). Buna bağlı olarak bacak ülserleri, inme, priapizm gibi
bazı semptomların azaldığının gösterildiği bildirilmektedir (31). Homozigot
Hb S-α talasemi birlikteliğinde, hastalarda hematolojik bulgular örneğin
anemi düzelir, ancak ağrılı krizlere etkisi çok önemli değildir.
S/β talasemide β globin geninde, bir allelde β talasemi diğer allelde orak hüre
anemisi mutasyonu olanlarda orak hücre semptomları genellikle ön planda
olabilir. Βu mutasyonunun tipine ve diğer modifiye edici genetik faktörlere
göre klinik tablo hafiften ağıra değişir.
DİĞER BAZI YAPISAL HEMOGLOBİNOPATİLER
VE GENETİK
HbC
Beta globin geninde kodon 6’da glutamik asit lizine değişir. Homozigotlarda
erişkinde ortaya çıkan hafif anemi vardır. HbC/β talasemi bileşik
heterozigotluğunda klinik tablo değişkendir. β0 alleli taşıyanlarda ve HbA2
düşük olanlarda klinik tablonun daha ciddi olduğu bildirilmektedir (39).
HbS/HbC: Orak hücre anemisi tablosuna yakın tablo verir. Daha hafiftir fakat
taşıyıcılıktan daha ağırdır.
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
HBS HASTALIĞI ve GENETİK
37
38
HematoLog
2014:4•1
HbD Punjab (Hb Los Angeles)
HbD de β globin geninde kodon 121 GAA ->CAA değişimi vardır. Hindistan
ve Pakistan’da en sık mutasyondur. Glutamik asit, glutamine değişir.
Homozigotlarda çok hafif bulgular olabilir. β talasemi alleleri ile bileşik
heterozigotluk durumunda genellikle hafif anemi vardır (37). HbS ile birlikte
ise orak homozigot HbS hastalığı benzeri ağır tablo görülebilir (38).
HbE
Beta globin kodon 26’da glutamik asit lizine (GAG->AAG) değişir.
Mutasyon kodon 25-27’de alternatif yapışma bölgesi oluşturarak zincirin
ekspresyonunu etkilediğinden talasemi tablosu verir. Uzakdoğu Asya’da
sıktır. Homozigotlarda hafif talasemi tablosu görülür iken β talasemi alleleri
ile orta veya ağır derecede talasemi tablosu görülür (40). HbS ile bileşik
heterozigotluğu (HbS/HbE), orak hücreli anemi tablosuna daha yakın
semptomlar görülür. Tablo S/β tablosuna benzer (41).
HEMOGLOBİNOPATİLERDE MOLEKÜLER TANI
YÖNTEMLERİ
Hemoglobinopatilerde, hastalarda ve taşıyıcılarda mutasyonların tayini için
moleküler analiz teknikleri uygulanmadan önce hematolojik parametreler ve
hemoglobin elektroforezi sonuçları değerlendirilmelidir. Bu çalışmalar DNA
analizinde hedef gen veya gen bölgesini belirlemede ve seçilecek moleküler
analiz yöntemini belirlemede en önemli adımdır. Hasta veya taşıyıcılardaki
hematolojik parametrelerin ve elektroforez sonuçlarının durumuna göre
moleküler tanıda uygulanacak yöntemlerin seçimi yapılır. Bu yöntemlerin
çoğu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)’nunun kullanıldığı tekniklerdir (26).
Hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısını yapan laboratuvarlar,
ülkelerinin koşullarını, ülkelerinde sık görülen hemoglobin bozukluklarının
genetik özelliklerini, kendi laboratuvarlarındaki özel koşulları ve yöntemi
uygulamadaki deneyimlerini göz önünde bulundurarak tanıda yol haritalarını
belirlemelidir. Teknolojideki gelişmeler, yeni, hızlı ve yüksek doğrulukta
moleküler genetik analiz yöntemlerinin keşfine ve hemoglobin bozukluklarının
tanısında da yeni uygulamalara yol açmaktadır (42,43). Hemoglobinopatilerin
moleküler genetik tanısında kullanılan yöntemler geleneksel olarak iki gruba
ayrılmaktadır (27):
1. Direkt mutasyon tayini yapan yöntemler: Doğrudan özgün mutasyonun
olup olmadığını gösterirler. Nokta mutasyonları için Allel Spesifik
Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO), Amplifikasyon Refrakter Mutasyon
Sistemi (ARMS), dizi analizi gibi yöntemler, delesyonlar için de gap-PCR
yöntemi bu gruba giren örneklerdir.
2. İndirekt yöntemler: Belirli bir gen veya gen bölgesini, dizi değişikliği
olup olmadığının anlaşılması için, tarayan yöntemlerdir. Denature edici
Gradient Jel Elektroforezi (DGGE) ve Denature edici Yüksek Performanslı
Likid Kromatografi (DHPLC) yöntemleri bu gruba girer. Bu yöntemlerle
mutasyonun yerinin saptanmasından sonra dizi analizi ile özgün değişikliğin
ortaya konulması gerekir.
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Bu yöntemlerin dışında son yıllarda Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA),
Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF), Real-time PCR,
Melting Curve Analysis (MCA) gibi yöntemler hızla kullanıma girmektedir
(27).
Hemoglobin bozukluklarında tanıda en sık kullanılan yöntemler ve ana
prensipleri aşağıda kısaca özetlenmiştir:
Allel Spesifik Olgonükleotid Hibridizasyon (ASO)
Bu yöntem hedef dizi ile, birisi mutasyonlu diğeri de normal dizi için
hazırlanmış olan iki oligonükleotid probunun hibridizasyonuna dayanır.
Tanıda ilk kullanılan yöntemlerdendir (44). Yöntemde, belli mutasyonların
sık olarak gözlendiği toplumlarda “dot blot” veya “reverse dot blot” şeklinde
uygulama ile homozigot, heterozigot ve normal genotipe sahip olanlar
kolayca saptanabilir. Ticari olarak üretilen, “reverse dot blot” yönteminin
kullanıldığı kitler ile toplumlarda sık rastlanılan mutasyonların multipleks
PCR ile çoğaltılan DNA’da kolayca tanımlanmasını mümkün hale gelmiştir
(45). Bu yöntemde normal ve mutasyonlu problar membrana emdirilmiştir.
Genomik DNA ile hibridizasyon sonucunda normal ve mutant paralel bantlar
değerlendirilerek tanı konur. Ülkemizde rastlanılan alfa globin ve beta
globin mutasyonlarının büyük kısmını (%90-95 oranında) kapsayan ticari
kitler bulunmaktadır (Viennalab StripAssay) (Şekil 4). Bu klasik metodun
prensiplerine dayanan micro-array teknolojisinin kullanıldığı tanı yöntemleri
de uygulanmaktadır (46).
Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi (ARMS)
Bu yöntemde tanı konulması istenen DNA dizisi ile tam uyum gösteren primer
ile yapılan PCR reaksiyonunda başarılı olur iken, 3’ ucunda dizi ile uyum
göstermeyen primer ile PCR reaksiyonunun başarılı olmamasına dayanır.
ARMS yöntemi için çok sayıda farklı primerler düzenlenmiştir. Bu yöntem en
çok kullanılan yöntemlerden birisidir (47). Bilinen mutasyonların tanısında
hızlı ve pratik bir test olmasına karşın her primer için ayrı standardizasyon
gerektirir ve test koşulları iyi standardize edilemediği zaman yalancı pozitif
ve yalancı negatif sonuçlar gözlenebilir.
Gap-PCR
Delesyon tipinde mutasyonları tayin etmede ideal yöntemlerdendir. Tam
olarak sınırları bilinen delesyon şeklindeki mutasyonların saptanmasında
kullanılır. Delesyonun olduğu DNA bölgesinde 5’ ve 3’ bölgelerinde bir kısım
dizi uyan primerlerle bölge çoğaltılır. Çoğalan delesyonlu DNA bölgesindeki
diziler normal ile kıyaslandığında daha küçüktür (3,42). Beta talasemiye
neden olabilen nadir görülen β geni delesyonları, alfa talasemiye neden olan
α genlerindeki delesyonlar, δ-β talasemiler, Hb Lepore tanısında kullanımı
kolay ve ucuz bir yöntemdir (48). Allel drop-out oluşmasına yatkın bir
yöntemdir (42).
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
Otomatize ve hızlı uygulanabilen dizi analizi yöntemleri nokta mutasyonlarının
daha sık olarak görüldüğü küçük genler (β globin geni gibi) için rutin
uygulanabilecek teknikler arasında sayılmakta ise de, delesyonların olduğu
gen ve gen bölgeleri için uygun değidir. Bu bölgeler için Southern-blot, gapPCR gibi yöntemler halen geçerlidir.
39
40
HematoLog
2014:4•1
Şekil 4. Beta talaseminin moleküler tanısında kullanılan Strip Assay. Test ile
saptanabilen mutasyonlu ve normal allelleri gösteren bantlar
DNA Dizi Analizi
Moleküler tanı koymada en güvenilir yöntemlerdendir. Daha çok nokta
mutasyonlarının sık görüldüğü ve mutasyon dağılımı geniş olan toplumlarda
β globin geni analizi için bazı laboratuvarlarda ilk yöntem olarak
kullanılmaktadır. Ayrıca birçok laboratuvarda, diğer ucuz ve pratik tanı
yöntemleri ile gösterilemeyen mutasyonları saptamak için uygulanmaktadır.
Örneklerin hazırlanması ve sonuçların okunması özel beceri gerektirir.
Dizi analizinde heterozigotların saptanmasında dikkatli bir gözle analiz
yapılmalıdır. Delesyonların, özellikle büyük delesyonların bulunduğu, α
talasemi gibi, hemoglobin bozuklukları için uygun değildir.
Denature Edici Yüksek Performanslı Likid Kromatografi (DHPLC)
Yöntemleri ve Gradient Jel Elektroforezi (DGGE)
PCR ürününde bilinmeyen mutasyonların olduğu bölgeleri saptamada
kullanılan yöntemlerdir. Her iki yöntem de jel üzerinde mutant ve normal
allelin farklı hareket etmesi prensibine dayanır. Elde edilen sonuçlara göre
mutasyonun saptanmasında başlıca dizi analizi olmak üzere bir diğer
yönteme gereksinim vardır. DHPLC metodu hem bilinen hem de bilinmeyen
β geni mutasyonlarını saptamada güvenilir ve yüksek duyarlılıkta, nispeten
ucuz bir tekniktir (3,42).
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
Kısa ekzonik dizilerin multipleks PCR ile çoğaltılmasına dayanan yarı
kantitatif bir yöntemdir. Özellikle gen içindeki delesyon ve duplikasyonların
saptanmasını sağlar (49).
Real-Time PCR
Günümüzde PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlayan cihazların
gelişimi ve flöresan ışıma tekniklerinin kullanılması ile gen kopya ürünlerinin
düzeylerini sayısal değerde ölçmek ve devam eden PCR reaksiyonuna gerçek
zamanlı (real time olarak) müdahale etmek mümkün olmuştur. Bu teknoloji
“flöresan kantitatif RT-PCR”, “kantitatif kinetik PCR” gibi çeşitli adlarla da
isimlendirilmektedir. Hedef DNA dizisini hem çoğaltan hem de kantifiye eden
bir laboratuvar yöntemidir. Hemoglobinopatilerin tanısında pratik ve güvenli
bir teknik olarak rutin uygulamaya hızla girmektedir (50,51). Normal alleli
ve mutasyonlu alleli gösterecek problar farklı erime dereceleri gösterecek
şekilde düzenlenir. Tek nükleotid mutasyonlarında elde edilen normal ve
mutant alleli gösteren eğriler arasında genellikle 5-10 derecelik bir farklılık
olur. Böylece mutant ve normal alleller kolaylıkla ayırt edilebilir (Şekil 5).
Şekil 5. Beta talasemide IVS 1-110 mutasyonu için yapılan RT-PCR sonucu: Normal
allel 620 de, mutant allel 560 de pik göstermektedir
Preimplantasyon genetik tanıda tek hücrede RT-PCR kullanılarak talasemi
mutasyonlarının başarıyla saptanabildiği ve güvenle kullanılabileceğini
gösteren çalışmalar vardır (52,53).
Multiple Ligation Probe Analysis (MLPA)
Delesyon tipinde mutasyonları saptamada Southern blot, FISH ve gap-PCR
gibi zaman alıcı ve zor tekniklerin yerini almaktadır. Son yıllarda hızla rutin
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments (QMPSF)
41
42
HematoLog
2014:4•1
kullanıma girmiş olan ucuz ve pratik bir yöntemdir. Hedef bölgedeki kopya
sayısı değişikliklerini saptama esasına dayanır. Hedef bölgeye çok sayıda
probun hibridize edildikten sonra, bu hibridize edilen probların universal
-tag PCR probları kullanılarak kantitatfif PCR ile çoğaltılmasına ve elde edilen
fragmentlerin özel bilgisayar programları kullnılarak analiz edilmesine
dayanır (54). α ve β gen bölgelerini kapsayan MLPA ticari kitleri üretilmiştir
(MRC-Holland and ServiceXS).
Yeni Nesil Dizi Analizi
Son yıllarda çok sayıda geni bir arada, tüm ekzonları veya tüm genomu
dizileyebilen cihazlar geliştirilmiştir. Yakın gelecekte tüm globin genlerini,
modifiye edici genleri bir arada dizileyerek daha ayrıntılı genomik bilgiye
ulaşmak, fenotip için daha doğru öngörüde bulunmak mümkün hale gelecektir.
Sonuç olarak, hemoglobinopatilerin moleküler genetik tanısıda kullanılan bir
çok yöntem geliştirilmiş ve geliştirilmektedir. Bazen tanıda yukarıda sayılan
yöntemlerden birden fazlasının kullanılması gerekebilir. Tanıda kullanılacak
yöntemin/yöntemlerin saptanmasında analiz yapılacak hasta veya taşıyıcılarda
fenotipik bulguların ve hematolojik parametreler ile hemoglobin elektroforezi
sonuçlarının iyi değerledirilmesinin yanısıra toplumda sık rastlanılan
mutasyonların ve her laboratuvarın özel koşullarının da dikkate alınması gerekir.
Kaynaklar
1. Muncie HL Jr, Campbell J. Alpha and beta thalassemia. Am Fam Physician.
2009;80:339-344.
2. J. M. Old. Screening and genetic diagnosis of haemoglobin disorders. Scand J Clin
Lab Invest. 2007;67:71-86.
3. Clark BE, Thein SL. Molecular diagnosis of haemoglobin disorders. Clin Lab Haem.
2004;26:159-176.
4. Weatherall DJ. The Thalassemias. In: Williams Hematology, edited by Ernest Beutler,
et al. 5th ed. New York: McGraw-Hill, 1995.
5. Galanello R, Origa R. Beta-thalassemia. Orphanet J Rare Dis. 2010;5:11.
6. Birgens H, Ljung R. The thalassemia syndromes. Scan J Clin Lab Invest. 2007;67:1126.
7. Mosca A, Paleari R, Leone D, Ivaldi G. The relevance of hemoglobin F measurement
in the diagnosis of thalassemias and related hemoglobinopathies. Clin Biochem.
2009;42:1797-801.
8. Forget BG. Molecular basis of hereditary persistence of fetalhemoglobin. Ann N Y
Acad Sci. 1998;850:38-44.
9. Thein SL, Wood WG. The molecular basis of β thalassemia,δβ thalassemia and
hereditary persistence of fetal hemoglobin. In: Steinberg MH, Forget BG, Higgs
DR, Weatherall DJ, eds. Disordersof hemoglobin, 2nd edn. Cambridge: Cambridge
University Press,2009: 323–56.
10.Weatherall DJ, Clegg JB. The thalassaemia syndromes.Blackwell Scientific
Publications, Oxford, 2001.
11.Tadmouri GO, Tüzmen S, Özçelik H, et al. Molecular and population genetic
analyses of beta-thalassemia in Turkey. Am J Hematol. 1998;57:215-220.
12.Weatherall DJ. Phenotype-genotype relationships in monogenic disease: lessons
from the thalassaemias. Nat Rev Genet. 2001;2:245-255.
13.Cao A, Galanello R. Beta-thalassemia. Genet Med. 2010;12:61-76.
HEMOGLOBİNOPATİLERDE GENETİK PATOLOJİ
ve MOLEKÜLER TANI YÖNTEMLERİ
15.Gallienne AE, Dréau HM, McCarthy J, et al. Multiplex ligation-dependent probe
amplification identification of 17 different beta-globin gene deletions (including
four novel mutations) in the UK population. Hemoglobin. 2009;33:406-416.
16.Lee ST, Yoo EH, Kim JY, Kim JW, Ki CS. Multiplex ligation-dependent probe
amplification screening of isolated increased HbF levels revealed three cases of
novel rearrangements/deletions in the beta-globin gene cluster. Br J Haematol.
2010;148:154-160.
17.Thein SL. The molecular basis of β-thalassemia Cold Spring Harb Perspect Med.
2013;1:3.
18.Rund D, Fucharoen S. Genetic modifiers in hemoglobinopathies.Curr Mol Med.
2008;8:600-608.
19.Ferrara M, Matarese SM, Francese M, et al. Effect of VDR polymorphisms on growth
and bone mineral density in homozygous beta thalassaemia. Br J Haematol.
2002;117:436-440.
20.Origa R, Fiumana E, Gamberini MR, et al. Osteoporosis in beta-thalassemia: Clinical
and genetic aspects. Ann N Y Acad Sci. 2005;1054:451-456.
21.Wonke B, Jensen C, Hanslip JJ, et al. Genetic and acquired predisposing factors
and treatment of osteoporosis in thalassaemia major. J Pediatr Endocrinol Metab.
1998;11(Suppl 3):795-801.
22.Martins R, Picanço I, Fonseca A, et al. The role of HFE mutations on iron metabolism
in beta-thalassemia carriers. J Hum Genet. 2004;49:651-655.
23.Andreani M, Radio FC, Testi M, et al. Association of hepcidin promoter c.-582 A>G
variant and iron overload in thalassemia major. Haematologica. 2009;94:1293-1296.
24.Sampietro M, Lupica L, Perrero L, et al. The expression of uridine diphosphate
glucuronosyltransferase gene is a major determinant of bilirubin level in
heterozygous beta-thalassaemia and in glucose-6-phosphate dehydrogenase
deficiency. Br J Haematol. 1997;99:437-439.
25.Giovannoni L.TNFA locus is associated with beta degrees 39 thalassemia in Corsica
and Sardinia. Eur Cytokine Netw. 2008;19:196-203.
26.Old JM. Screening and genetic diagnosis of haemoglobinopathies. Scand J Clin Lab
Invest. 2007;67:71-86.
27.Harteveld CL, Higgs DR. Alpha-thalassaemia. Orphanet J Rare Dis. 2010;5:13.
28.Ribeiro DM, Sonati MF. Regulation of human alpha-globin gene expression and
alpha-thalassemia. Genet Mol Res. 2008;7:1045-1053.
29.Fucharoen S, Thonglairuam V, Winichagoon P. Hematologic changes in alphathalassemia. Am J Clin Pathol. 1988;90:193-196.
30.Durmaz AA, Akın H, Ekmekçi AY, et al. Severe alpha thalassemia case compound
heterozygous for Hb Adana in alpha1 gene and 20.5 kb double gene deletion. J
Pediatr Hematol Oncol. 2009;31:592-594.
31.Steinberg MH, Sebastiani P. Genetic modifiers of sickle cell disease.Am J Hematol.
2012;87:795-803.
32.Driss A, Asare KO, Hibbert JM, Gee BE, Adamkiewicz TV, Stiles JK. Sickle cell
disease in the post genomicera: A monogenic disease with a polygenic phenotype.
Genomics Insights. 2009;2009:23-48.
33.Solovieff N, Milton JN, Hartley SW, et al. Fetal hemoglobin in sickle cell
anemia:Genome-wide association studies suggest a regulatory region in the 5’olfactory
receptor gene cluster. Blood. 2010;115:1815-1822.
TÜRK HEMATOLOJİ DERNEĞİ
14.Thein SL.Genetic modifiers of the beta-haemoglobinopathies. Br J Haematol.
2008;141:357-366.
43
44
HematoLog
2014:4•1
34.Farrell JJ, Sherva RM, Chen ZY, et al. A 3-bp deletion in the HBS1L-MYBintergenic region
on chromosome 6q23 is associated with HbF expression.Blood. 2011;117:4935-4945.
35.Makani J, Menzel S, Nkya S, et al. Genetics of fetal hemoglobin in Tanzanian and British
patients with sickle cell anemia. Blood. 2011;117:1390-1392.
36.Steinberg MH, Embury SH. Alpha-thalassemia in blacks: Genetic and clinical aspects
and interactions with the sickle hemoglobin gene. Blood. 1986;68:985-990.
37.Rahimi Z, Akramipour R, Korani S, Nagel RL. Hb D-Punjab [beta 121 (GH4) Glu-->Gln]/
beta0-thalassemia [IVSII.1(G-->A)] in two cases from an Iranian family: first report. Am
J Hematol. 2006;81:302-303.
38.Kelleher JF Jr, Park JOK. Life-threatening complications in a child with hemoglobin SDLos Angeles disease. Hemoglobin. 1984;8:203-213.
39.Weatherall DJ, Clegg JB. The band db thalassemia in association with structural
hemoglobin variants. In: The Thalassemia Syndromes, eds DJ Weatherall & JB Clegg.
Blackwell Science Ltd, Oxford. 2001;p. 415-419.
40.Fucharoen S, Weatherall DJ. The hemoglobin E thalassemias. Cold Spring Harb Perspect
Med. 2012;2:8.
41.Vichinsky E. Hemoglobin E syndromes. Hematology Am Soc Hematol Educ Program.
2007:79-83.
42.Harteveld CL, Kleanthous M, Traeger-Synodinos J. Prenatal diagnosis of hemoglobin
disorders: present and future strategies. Biochem. 2009;42:1767-1779.
43.Kutlar F. Diagnostic approach to hemoglobinopathies. Hemoglobin. 2007;31:243-250
44.Saiki RK, Walsh PS, Levenson CH, Erlich HA. Genetic analysis of amplified DNA with
immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc Natl Acad Sci USA.
1989;86:6230-6234.
45.Gold B. Origin and utility of the reverse dot-blot. Expert Rev Mol Diagn. 2003;3:143152.
46.Cremonesi L, Ferrari M, Giordano PC, et al. An overview of current microarray-based
human globin gene mutation detection methods. Hemoglobin. 2007;31:289-311.
47.Old JM, Varawalla NY, Weatherall DJ. Rapid detection and prenatal diagnosis of
b-thalassaemia: studies in Indian and Cypriot populations in the UK. Lancet 1990;336;
834-837.
48.Tan AS, Quah TC, Low PS, Chong SS. A rapid and reliable 7-deletion multiplex
polymerase chain reaction for alpha-thalassemia. Blood. 2001;98;250-251.
49.Rose C, Rossignol J, Lambilliotte A, Depret S, Le Metayer N, Pissard S. A novel
(epsilongammadeltabeta)(o)-thalassemia deletion associated with an alpha globin
gene triplication leading to a severe transfusion dependent fetal thalassemic syndrome.
Haematologica. 2009;94:593-594.
50.Liu JZ, Yan M, Wang LR,et al. Molecular prenatal diagnosis of alpha-thalassemia
using real-time and multiplex polymerase chain reaction methods. Hemoglobin.
2008;32:553-560.
51.Maciag M, Płochocka D, Adamowicz-Salach A, et al. Diversity of thalassemia variants in
Poland - screening by real-time PCR. Acta Haematol. 2008;120:153-157.
52.Traeger-Synodinos J, Vrettou C, Kanavakis E. Rapid detection of fetal Mendelian
disorders: thalassemia and sickle cell syndromes. Methods Mol Biol. 2008;444:133145.
53.Durmaz B, Özkınay F, Onay H, et al. Genotyping of β-globin gene mutations in single
lymphocytes: a preliminary study for preimplantation genetic diagnosis of monogenic
disorders.Hemoglobin. 2012;36:230-243.
54.Harteveld CL, Voskamp A, Phylipsen M, et al. Nine unknown rearrangements in 16p13.3
and 11p15.4 causing alpha- and beta-thalassaemia characterised by high resolution
multiplex ligation-dependent probe amplification. J Med Genet. 2005;42:922-931.
Download

HematoLog - Türk Hematoloji Derneği