Zirve Üniversitesi Tıp Fakültesi I. Dönem 3. Ders Kurulu Tıbbi Biyokimya Laboratuvar Uygulaması Deney 2 DİKKAT:
Ø Bu deney esnasında laboratuvar önlüğünüzü ve koruyucu gözlüğünüzü mutlaka takınız Ø Hidrojen peroksit (H2O2) ve HCl çözeltisi ile çalışırken dikkatli olunuz. Bu çözeltilerin deriyle ve gözle temas etmemesine dikkat ediniz. Aksi durumda temas olan bölgeyi bol suyla yıkayınız. Ø Bunzen beki kullanırken dikkatli olunuz. Test tüpünü tahta maşa ile alevin üzerinde 45 derece eğimle tutunuz ve kesinlikle çıplak elle tutmayınız. Deneyin İsmi: Enzim Aktivite Analizi Deneyin Amacı: Katalaz enzimin aktivitesinin analizi ve aktivitenin birtakım etkenlere bağlı olarak nasıl değiştiğinin incelenmesi Deneyin Açıklaması: Bu deneyde karaciğer dokusundaki katalaz enziminin aktivitesi gözlemlenecektir. Katalaz enzimi vücut için zararlı bir madde olan hidrojen peroksit molekülünü (H2O2) hidroliz ederek su ve oksijene çevirir. H2O2, vücudun normal metabolizması esnasında oluşan bir yan ürün olmakla beraber etkisiz hale getirilmediği takdirde, dada güçlü oksidan moleküller dönüştürülerek dokularda oksidatif hasara yol açar. Katalaz enzimi sayesinde bu zararlı etki önlenmiş olur. Katalaz, hemen hemen bütün canlılarda bulunur. Bu deneyde katalaz enzimi aktivitesi sonucu oluşan oksijen çıkışı gözlemlenecek ve değişik faktörlerin (sıcaklık, pH gibi) enzim aktivitesini nasıl etkilediğini incelenecektir. Deney için gerekli malzemeler ve kimyasallar: -­‐% 5’lik Hidrojen peroksit (H2O2) çözeltisi -­‐Katalaz enzim kaynağı (Karaciğer dokusu) -­‐Tris tampon çözeltisi (50 mM ve pH 7.5) -­‐0.1 M HCl çözeltisi -­‐Cam deney tüpleri -­‐Bunsen beki ve tahta maşa -­‐Buz -­‐Vorteks karıştırıcı Deneyin prensibi ve yapılışı: katalaz H2O2 H2O + ½ O2 Substrat: H2O2 (Hidrojen peroksit), Enzim: katalaz (karaciğer dokusundan) Ürünler: H2O ve O2 (A) Karaciğerdeki katalaz enziminin aktivitesinin normal gözlemlenmesi: 1) Cam test tüp içerisine küçük bir parça karaciğer koyunuz. şartlarda 2) Daha sonra üzerine pipet yardımıyla 2 mL Tris tampon çözeltisi (50 mM ve pH 7.5) ilave ediniz ve vorteks yardımıyla orta hızda karıştırınız (yaklaşık 5 saniye) Dikkat: Çok hızlı ve uzun süre karıştırmanız enzim denatürasyonuna sebebiyet verebilir. 3) Üzerine pipet ile 0.3 mL hidrojen peroksit çözeltisi ekleyiniz ve el yordamıyla test tübünü hafifçe çalkalayınız. 4) Gaz çıkışını gözlemleyiniz. (B) Protein Denatürasyonunun Enzim Aktivitesine Etkisi: 1) Cam test tüp içerisine küçük bir parça karaciğer koyunuz. 2) Daha sonra üzerine pipet ile 2 mL Tris tampon çözeltisi (50 mM ve pH 7.5) ilave ediniz ve vorteks yardımıyla orta hızda karıştırınız (yaklaşık 5 saniye) Dikkat: Çok hızlı ve uzun süre karıştırmanız enzim denatürasyonuna sebebiyet verebilir. 3) Test tüpünü tahta maşa yardımıyla tutarak bunzen brülör üzerinde bir müddet ısıtınız (Çiğ karaciğer parçalarının rengi pişmiş karaciğer rengi kıvamına gelinceye kadar) Dikkat: Test tüpünü alev üzerinde çok uzun tuttuğunuz takdirde tüp içerisindeki çözelti kaynamaya başlayarak dışarıya sıçrayabilir. Test tüpünü sürekli olarak 3 saniyeden fazla alev üzerinde tutmayın. Eğer karaciğer pişmiş rengini henüz almamışsa, tüpün soğumasını bekleyip tekrar 3 saniye alev üzerinde bekletin. 4) Test tüpünü oda sıcaklığında bir müddet soğuttuktan (1-­‐2 dakika) sonra üzerine pipet ile 0.3 mL hidrojen peroksit çözeltisi ekleyiniz ve hafifçe test tüpünü sallayınız 5) Gaz çıkışını gözlemleyebildiniz mi? Önceki deneyle karşılaştırınız. (C) pH’ın Enzim Aktivitesine Etkisi: 1) Cam test tüp içerisine küçük bir parça karaciğer koyunuz. 2) Daha sonra üzerine pipet yardımıyla 2 mL Tris tampon çözeltisi (50 mM ve pH 7.5) ilave ediniz ve vorteks yardımıyla orta hızda karıştırınız (yaklaşık 5 saniye) Dikkat: Çok hızlı ve uzun süre karıştırmanız enzim denatürasyonuna sebebiyet verebilir. 3) Üzerine 1 mL 0.1 M HCl çözeltisi ekleyiniz ve vorteks yardımıyla orta hızda karıştırınız (yaklaşık 5 saniye) 4) Oluşan karışımın üzerine pipet ile 0.3 mL hidrojen peroksit çözeltisi ekleyiniz ve el yordamıyla hafifçe çalkalayınız. 5) Gaz çıkışını gözlemleyebildiniz mi? Önceki deneylerle karşılaştırınız. (D) Sıcaklığın Enzim Aktivitesine Etkisi: 1) Cam test tüp içerisine küçük bir parça karaciğer koyunuz. 2) Daha sonra üzerine pipet yardımıyla 2 mL Tris tampon çözeltisi (50 mM ve pH 7.5) ilave ediniz ve vorteks yardımıyla orta hızda karıştırdıktan sonra (yaklaşık 5 saniye) buzun üzerine koyarak 5 dakika bekletiniz. 3) Test tüpünü buzun üzerinden alır almaz üzerine pipet ile buzda önceden soğutulmuş 0.3 mL hidrojen peroksit çözeltisi ekleyiniz ve hafifçe test tüpünü sallayınız. 4) Gaz çıkışını gözlemleyiniz ve (A) deneyindeki (oda sıcaklığında) gaz çıkış miktarı ile karşılaştırınız. (E) Enzim ve Substrat Konsantrasyonunun Aktiviteye Etkisi: (A) bölümündeki deneyi enzim (karaciğer miktarı) ve substrat (hidrojen peroksit) miktarını değiştirerek (artırarak veya azaltarak) tekrar ediniz. Gözlemlerinizi not ediniz. (Not: Bu kısım grup halinde her bir grup üyesi farklı enzim ve substrat miktarları kullanılarak yapılabilir). Yapılan Gözlemler: Yukarıda yaptığınız deneylere göre, (A) deneyindeki gaz çıkışı miktarını normal düzey kabul ederek diğer deneyleri (A) deneyi ile karşılaştırınız ve sebeplerini yazınız (gaz çıkışı olmadıysa niçin olmadı, gaz çıkış miktarı farklı ise niçin arttı veya azaldı?). Deney Gözlem ve sebepleri: B) C) D) E) Deney Sonrası Soruları? 1) Bu deneyde katalaz enziminin aktivitesini ne şekilde gözlemlediniz? 2) Katalaz enziminin aktivitesi sıcaklığın düşmesiyle nasıl etkilenmiştir? Niçin? 3) Katalaz enziminin ısıtılması aktiviteyi nasıl etkilemiştir? Neden? 4) Enzim çözeltisine HCl eklenmesi aktiviteyi 2 tür nedenle etkilemiş olabilir? Bu iki nedeni ve hangisinin sizce baskın olduğunu açıklayınız. 5) Enzim miktarının (karaciğer miktarı) artırılması ürün oluşumuna ne yönde bir etki yapmıştır? 6) Substrat konsantrasyonunun artırılması enzim aktivitesine ne yönde bir etki yapmıştır? 
Download

Zirve Üniversitesi Tıp Fakültesi I. Dönem 3. Ders Kurulu Tıbbi