ÖZEL EGE LİSESİ
KATALAZA ÖZGÜ MOLEKÜLER DAMGALI
KİTOSAN BONCUKLARININ HAZIRLANMASI
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Pelin USLU
Çağıl BENĠBOL
DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Mesut ESEN
2014
İZMİR
1
İÇERİK LİSTESİ
PROJENĠN ADI……………………………………………………………………………….……….. 3
PROJENĠN AMACI………………………………………………………………………….……….... 3
1.GĠRĠġ………………………………………………………………………………………....…….... 4
1.1 Moleküler Damgalı Polimerler…………………………….……………………........................ 4
Niçin Kitosan? …………………………….……………………..................................................... 6
1.2 Katalaz ve Biyolojik Önemi…………………………..……..................................................... 7
1.3 Kitosan ve kullanım alanları ……………………………….................................................... 8
2.YÖNTEM…………………………………………………………………………….......................10
2.1 Materyal………………………………………………………….…………………………..........10
2.2 Kitosan Boncukların Hazırlanması……………………………………………….……….........10
2.3 Katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarının hazırlanması ……………………13
2.4 Protein Tayini……………………………………………….……………………………….........14
2.5 KATALAZ (CAT) Enziminin Native-PAGE Elektroforezde Tanımlanması …..…................15
2.6 PEROKSĠDAZ (POX) Enziminin Native-PAGE’te Tanımlanması…………………...…...…16
3-SONUÇLAR ve TARTIġMA…………………………………………………………….………....18
3-1 Katalazaözgümolekülerdamgalıkitosan boncuklarının hazırlanması vekatalaz
damgalamaetkiliğinin belirlenmesi ………………………………….……………………..……….19
3.2 Katalazaözgü moleküler damgalıkitosan boncuklarının CAT’ a spesifikliğinin belirlenmesi
……………………………………………………………..………………………….………..…...… 21
DEĞERLENDĠRME………………………………….…………………………………...…….….... 22
TEġEKKÜR………………………………………………………………………………………....... 22
KAYNAKÇA……………………………………………………………………………………...…… 23
2
PROJE ADI: KATALAZA ÖZGÜ MOLEKÜLER DAMGALI KĠTOSAN
BONCUKLARININ HAZIRLANMASI
PROJENĠN AMACI:
DeğiĢen ortamlara bitkilerin alıĢması hücrenin farklı bölmelerinde yer alan birden
fazla metabolik yol arasındaki hassas düzenlemeler ile gerçekleĢir. Ancak, bu metabolik
denge, su kıtlığı ve tuzluluk stresi sırasında bozulabilmektedir. Bunun sonucunda reaktif
oksijen türü (ROS) olarak adlandırılan, DNA ve hücre zarındaki lipitleri oksitleyerek zarar
oluĢturan toksik moleküller [süperoksit anyonu (O2.-), hidrojen peroksit (H2O2), ve hidroksil
radikali (HO)] oluĢur. Bitkiler oluĢan bu ROS‘larıdetoksifiye etmek için KATALAZ gibi
antioksidan enzimler üretirler.Son yıllarda bu enzimlerin hücredeki miktarlarının artıĢı,
bitkinin çevresel streslere dayanıklılık iĢaretlerinden biri olarak gösterilmektedir. Bu nedenle
kuraklık ve tuzluluk streslerinin etkilerine karĢı bitkilerin verdiği biyokimyasal yanıtların
araĢtırıldığı çalıĢmalarda bu enzimlerin aktivite ölçümlerine büyük önem verilmektedir.
Ancak günümüzde CAT gibi antioksidan enzim aktivite yöntemlerinde kullanılan kimyasal
malzemeler hem toksik, hem kanserojen hem de maliyetlidir. Bu amaçla, yapay
makromoleküler reseptörlerin oluĢturulması için geliĢtirilen tekniklerden biri olan
“Moleküler Damgalı Polimerler”(MIP) uygun, kolay ve daha pratik bir yol olarak
gözükmektedir. Moleküler kalıbı oluĢturulması istenen hedef molekül, fonksiyonel
monomerler ve çapraz bağlayıcılarla polimerizasyona girerek moleküler damgalı polimeri
oluĢturur. Ġlaçlar, karbohidratlar, pestisitler, amino asitler, peptidler ve proteinler hedef(kalıp)
molekül olabilir. Bu çalıĢmada bir biyopolimer olan kitosan boncukları destek materyal olarak
kullanılarak katalaz damgalı moleküler polimerlerin hazırlanması ve CAT enzimini tanıma
etkinliğinin araĢtırılması hedeflenmiĢtir.
3
1- GĠRĠġ
1.1 Moleküler Damgalı Polimerler
Moleküler tanıma kimya, fizyoloji ve farmakoloji ile ilgili bir çok olayın
mekanizmasının aydınlatılması yaĢamın oluĢması ve devamındaki bir çok olayın temeli
olduğu için önemlidir. Moleküler tanıma ile ilgili biyolojik fonksiyonların aydınlatılmasında
moleküler tanıma kapasitesine sahip sentetik moleküllerin bulunması ve hazırlanması ile
oluĢturulan bifonksiyonel yapay sistemler kullanılabilir. Bu biyomimetrik sistemler
biyoteknoloji, tıp ve biyoanalitik alanlarında rahatlıkla kullanılabilir. Sentetik sistem
alternatiflerinden birisi de ―Moleküler Damgalı Polimerler‖dir (MIP). Moleküler damgalı
polimerlerin oluĢumu 3 adımda özetlenebilir (ġekil 1). a) Hedef(kalıp) molekül ile polimerize
olabilecek fonksiyonel gruplara sahip monomerler arasında kovalent/kovalent olmayan
etkileĢimlere dayalı kompleks oluĢumu, bu adımda kalıp molekül etrafını monomerler sararak
pre-kompleks oluĢturulur. b) Ortamda bulunan polimerizasyon ajanları (porojen, çapraz
bağlayıcı, insiyatör) ile kalıp-monomer etkileĢimi artarak kalıp molekülün polimer içerisinde
bağlanma bölgeleri(kalıp moleküle spesifik boĢluklar) oluĢur. c) Kalıp molekül uygun (Liu et
al., 2013). MIP‘lerboyut, Ģekil ve kimyasal fonksiyonları açısından hedef molekülü
tamamlayabildiğinden, bu moleküle karĢı mükemmel bir tanıma yeteneğine sahiptir.
Günümüzde, MIP‘ler, katı-faz ekstraksiyonu (Lenain et al., 2012; Hu et al., 2012) kimyasal
sensörler (Xia et al., 2013; Li et al., 2012) ve sentetik antikorlar gibi birçok alanda
kullanılmaktadırlar.MIP‘ler, tanıma amaçlı kullanıldığı gibi istenmeyen maddelerin
karıĢımdan
uzaklaĢtırılmasını
da
sağlarlar
ġekil 1: Moleküler Damgalı Polimerin Hazırlanması
4
(Zhong
et
al.,
2012).
Moleküler
damgalı
polimerlerin
oluĢturulmasında,yığın
(bulk),
süspansiyon,
presipitasyon ve yüzey moleküler damgalama gibi 4 farklı teknik kullanılmaktadır (ġekil 2).
1- Yığın (Bulk) Polimerizasyonu: MIP sentezinde ilk kullanılan yöntemdir (Mosbach
ve arkadaĢları, 1996). Bu yöntem, monomerlerin yüksek sıcaklıkta doğrudan doğruya ya da
insiyatör varlığında polimerizasyonuna dayanır. Termal, mekanik ve kimyasal Ģartlardan
kolay etkilenmezler. Labaratuvarlardaki temel malzemelerle hazırlanabilirler.
2- Süspansiyon Polimerizasyonu: Su ve organik fazlı sistemdir. Monomerler su
fazında damlacıklar halinde dağılmıĢ Ģekilde bulunur. Su fazında damlacıkların birleĢmesini
önleyen stabilizatörler vardır. ĠĢlem süresi yığın polimerizasyonuna göre daha kısadır.
3- Yüzey Moleküler Damgalama: Bu teknikte katı polimerler suda çözünen kalıp
molekülü içeren emülsiyonun polimerizasyonuyla hazırlanır. Fonksiyonel monomer ile kalıp
molekül arasında kompleks oluĢur. Kalıp molekül ortamdan uzaklaĢtırıldığında bu ara
yüzeyde spesik bölge meydana gelir. Moleküler olarak baskılı polimerler (MIP) bir hedef
molekülün etrafında üç boyutlu polimerik bir matriks oluĢturularak hazırlanır. Matriks
kaldırıldıktan sonra tamamlayıcı boĢluklar Ģekil alır ve fonksiyonel gruplar kalır. (Adler et al.,
2000)
ġekil 2: Moleküler damgalı polimerlerin oluĢturulmasındaki teknikler
Belirgin yeteneklere sahip olmalarına ve çeĢitli uygulamalarda kullanılmalarına
rağmen MIP‘lerle ilgili hala bazı sorunlar vardır: MIP‘lerin hedef molekülden
uzaklaĢtırılması, yavaĢ kütle transferi, düĢük bağlama kapasitesi gibi. MIP‘lerle ilgili bu
problemlerin üstesinden gelmek için kullanılan en etkili yöntemlerden biri “YÜZEY
DAMGALAMA TEKNĠĞĠ”dir (Liu et al., 2013). Bu teknikle, yüzeye damgalanmıĢ
polimerler, hızlı kütle transferi ve hızlı bağlanma kinetiği gösterirler. ÇeĢitli araĢtırmalarda
5
hızlı ve etkili yüzey moleküler damgalamanın elde edildiği birçok örnek rapor edilmiĢtir.
Örneğin Lu ve ark. (2009) tarafından çevresel bir kirletici olan bisphenol A‘nın seçici
ekstraksiyonu için Fe3O4 MIP nanopartikülleri hazırlanmıĢtır. Gai ve ark. (2010; 2011)
iselizozim ve sığır serum albüminin tanımlanması için magnetik yüzeye damgalanmıĢ
nanopartiküller geliĢtirmiĢlerdir.
Niçin Kitosan?
Bu çalıĢmada ise katalaza özgü moleküler damgalı polimerler hazırlamak için destek
materyal olarak ―KĠTOSAN BONCUKLAR”üretilmiĢtir. Son yıllarda kitosan ve
türevleri,doğada bol miktarda bulunması ve yüksek soğurma kapasitesine sahip olmasından
dolayı uranyum gibi radyoaktif metal iyonlarını ve diğer çevresel kirleticileri içeren çeĢitli
metal iyonlarının uzaklaĢtırılmasında etkili bir biyolojik sorbent olarak dikkat çekmektedir.
(Muzzarelli, 2011; Varma et al.,2004). Kitosanınradyolize direnci ve bunun nükleer alanda
uygulanabilirliği de daha 1972‘ de araĢtırılmıĢtır (Muzzarelli&Tubertini, 1972). Kitosanın
amin ve hidroksil fonksiyonel gruplarının kimyasal reaktifliği ve kompleks doğası metal
iyonlarının uzaklaĢtırılması için uygun bir sorbenttir (Bhatnagar&Silllanpaa, 2009). Ancak
kitosanın asidik solusyonlarda kullanımı, seyreltilmiĢ organik ve mineral asitlerdeki (H2SO4
hariç) çözünürlüğünden dolayı sınırlıdır (Pilllai et al.,2009). Kitosanın çapraz bağlanması
seyreltik asitlerde bunun çözünebilirliğini azaltır. Ancak çapraz bağlanma, kitosanın
soğurmadan sorumlu kompleks gruplarının miktarını azaltır ve bunun için kitosanın alınma
kapasitesini olumsuz olarak etkiler. Ancak böyle bir çapraz bağlanma her zaman duyarlılıkta
artıĢa neden olmaz halbu ki metal iyon damgalama metodu boyunca çapraz bağlanmıĢ
kitosanların hazırlanması ilgili hedef iyonlara karĢı duyarlılıkta artıĢa sebep olur (Chen et al.,
2009; Dhakal et al., 2008). Yapılan kaynak taraması sonucunda kitosanın ve kobalt damgalı
kitosanın kullanımı üzerine araĢtırmaların yapıldığı belirlenmiĢtir. Ancak çalıĢmamızın ana
materyalini
oluĢturan
tanımlanmasında
katalaz
moleküler
gibi
biyolojik
damgalı
kitosan
literatürde hiçbir çalıĢma bulunmamaktadır.
6
aktiviteye
sahip
boncuklarının
biyomoleküllerin
kullanımı
üzerine
1.2 Katalaz ve Biyolojik Önemi
Son yıllarda birçok çalıĢmada yüzey damgalama ve diğer teknikler özellikle hayvan ya
da insanlara ait özel bileĢiklerin içindeki bir hedef molekülü tanımak ve bu bileĢikteki
istenmeyen ya da gereksiz maddeleri ayırmak için kullanılmasına rağmen bitkilerde yapılan
çalıĢmalar oldukça sınırlı sayıdadır (Xia et al., 2006). Bu amaçla araĢtırmamızda ilk defa
kitosanla kaplı moleküler damgalı polimer boncuklarının,bitki KATALAZ (CAT) enziminin
tanımlanmasındaki rolleri araĢtırılmıĢtır. Katalaz enzimi, strese maruz kalan bitki hücrelerinin
plazma membranı, mitokondri ve peroksizomlarında oluĢan H2O2 ‗in süpürülmesinden
sorumlu olan en önemli antioksidan enzimlerden biridir (Mittler, 2006).
DeğiĢen ortamlara bitkilerin alıĢması hücresel dengenin yeniden kurgulanmasını
gerektirir. Bu ise, hücrenin farklı bölmelerinde yer alan birden fazla metabolik yol arasındaki
hassas düzenlemeler ile gerçekleĢir. Ancak, bu metabolik denge, su kıtlığı ve tuzluluk stresi
sırasında bozulabilmektedir (Mittler, 2006). Farklı metabolik yolların uyum içinde çalıĢmaları
bozulunca, hücrede yüksek enerji düzeyindeki elektronlar moleküler oksijene (O2) iletilirler
(Takahashi ve Asada 1988; Mittler 2002). Bunun sonucunda tekli oksijen (1O2), süperoksit
anyonu (O2.-), hidrojen peroksit (H2O2), ve hidroksil radikali (HO.-) gibi reaktif oksijen türleri
(ROS) oluĢur. Bunlar, proteinler, DNA ve lipitleri oksitleyerek zarar oluĢturan toksik
moleküllerdir (Apel ve Hirt 2004). Optimum büyüme koĢullarında, ROS‘lar kloroplast,
mitokondri ve peroksizomlar gibi organellerde düĢük düzeylerde üretilirler. Ancak, stres
sırasında, ROS‘ların üretiminde bir artıĢ görülür. Bitkilerde stres sırasında ROS birikimi;
ROS üretimi ve ROS süpürülmesi arasındaki dengeye bağlıdır (Miller 2009). ROS‘ların
üretimi ve süpürülmesi ise, stresin Ģiddetine ve dokunun enerji dengesizliğine süratle alıĢma
yeteneğinin yanında, büyüme koĢullarındaki (ıĢık Ģiddeti, sıcaklık vb.) değiĢikliklere de
bağlıdır.
Bitkiler oluĢan ROS‘larıdetoksifiye etmek için çeĢitli enzimatik ve enzimatik olmayan
antioksidanlar üretirler. Askorbik asit (AsA) ve glutatyon (GSH) gibi enzimatik olmayan
antioksidanlar ve süperoksitdismutaz (SOD), katalaz (CAT), peroksidaz (POX) gibi ROS
süpürücü
enzimler,
gerek
normal
metabolizma
gerekse
stres
sırasında
ROS
detoksifikasyonunda rol alırlar (Takahashi ve Asada 1988; Mittler ve ark. 2004; Dietz ve ark.
2006; Türkan ve Demiral 2009). Bu enzimlerden SOD, stres sırasında oksijenin elektron
alarak indirgenmesi sonucu oluĢan süperoksit anyon radikalini (O2.-) parçalayarak hidrojen
peroksiti (H2O2) oluĢturur. Bu molekül, POX ve/veya CAT enzimleriyle suya ve oksijene
dönüĢtürülmektedir.
7
CAT enzimi, strese maruz kalan bitki hücrelerinin plazma membranı, mitokondri ve
peroksizomlarında oluĢan H2O2 ‗in süpürülmesinden sorumlu olan en önemli antioksidan
enzimlerden biridir. Katalaz enzimi sadece bitkilerde değil mantarda ve hayvanlarda da
bulunur. Hatta baĢta karaciğer olmak üzere hayvanların tüm organlarında bulunur. Ayrıca bu
enzimi, hemen hemen tüm oksijenli solunum yapan bakteriler de kullanır.
Doğal bitki örtüsünün korunması ve stres koĢullarında kültür bitkilerinin
performanslarının kararlı hale getirilmesi açısından büyük önem taĢıyan kuraklık ve tuzluluk
streslerinin etkilerine karĢı bitkilerin verdiği fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler yanıtların
araĢtırıldığı çalıĢmalarda KATALAZ enzim aktivite ölçümüne büyük önem verilmektedir.
Hatta son zamanlarda, bu enzimin hücre içindeki miktarındaki artıĢ, bitkinin strese
dayanıklılıkiĢaretlerinden biri olarak gösterilmektedir.
Bitki homojenatındaki toplam katalaz enzim aktivitesinin tanımlanması için
spektrofotometrik bir metot (Bergmeyer et al. 1970) kullanılırken, bu enzimin izozimlerinin
belirlenmesi
için
de
elektroforetik
yöntemlerden
(Woodbury
et
al.,
1971)
yararlanılmaktadır.Ancak, bu yöntemlerde kullanılan kimyasal malzemeler hem toksiktir hem
de kanserojendir. Diğer yandan hem maliyetli hem de zaman alıcıdır. Dolayısıyla
MOLEKÜLER
DAMGALAMA
TEKNĠĞĠ,
MIP‘lerin
maliyetinindüĢük
olması,
polimerizasyonun ılımlı koĢullarda gerçekleĢmesi (atmosferik basınç, normal sıcaklıklar) ve
kullanılan malzemelerin kanserojen özelliğinin olmamasından dolayı katalaz enzimin
tanımlanması için alternatif bir yöntem olabilir. Dolayısıyla bu çalıĢma, katalaza özgü
moleküler damgalı kitosan boncuklarının hazırlanması alanındaki ilk çalıĢmadır.
1.3 Kitosan ve kullanım alanları
Kitosan, doğada en çok bulunan biyopolimerlerden biri olan ve eklembacaklıların dıĢ
iskeletini oluĢturan ve mantarların hücre çeperini oluĢturan karbonhidrat olan kitinin
deasetilasyonu ile oluĢur.
8
Kitosan boncuklar farklı teknikler kullanılarak hazırlanır;
•
Deproteinizasyon
•
Demineralizasyon
•
Dekolonizasyon
•
Deasetilasyon
Kitin deasetilasyonu: Yapılan araĢtırmalarda deasetilasyon için en uygun maddenin
NaOH olduğu rapor edilmiĢtir. NaOH, kitinin deasetillenmesine ve biyopolimerin hidrolize
olması sonucu molekül ağırlığının azalmasına neden olmaktadır. Deasetilasyonda,NaOH
kullanılabileceği gibi tripolifosfat(TPP) de kullanılabilir. NaOH kullanılırsa bazik, TPP
kullanılırsa ortam asidik olur. Bu ortamlar saf su ile nötr hale getirilebilir (Jonathan et al.,
1999).
Deasetilasyon Derecesi: Kitin ve kitosan arasındaki temel farklılık, yapılarındaki asetil
içeriğinden kaynaklanmaktadır. Deasetilasyon derecesi, kitinin yapısında bulunan aminoasetil
gruplarından asetil grubunun uzaklaĢtırılma derecesidir. Böylece geride sadece amin grubu
kalır. Kitosan kitine göre çok daha kolay çözünür, çünkü yapısı denatüre olmaya çok
uygundur (Jonathan et al., 1999).
http://www.altakitin.com/images/Chitosan1.gif
Moleküler damgalamada kitosan, kitine göre daha çok tercih edilir. Çünkü kitosan, ,
(i) canlılara karĢı toksik özelliği yoktur (ii) biyolojik olarak parçalanabilir (iii)
biyouyumluluğu, kimyasal ve fiziksel özellikleri bakımından diğer biyopolimerlere göre üstün
özellikleri vardır. Tüm bu özelliklerden dolayı araĢtırmamızda kitosan tercih edilmiĢtir.
Kitosanın moleküler damgalama dıĢındaki diğer uygulama alanları ise, eczacılık, medikal,
atık su arıtma, ilaç yapımı, biyoteknoloji, kozmetik, gıda, tekstil ve ziraattir.
9
2- YÖNTEM
ġekil 3: ÇalıĢmada izlenecek süreçlerin Ģematik gösterimi
2.1 Materyal
Kitosan, NaOH, KH₂PO₄, Sodyum asetat, asetik asit çalıĢmada kullanılan analitik
saflıktaki kimyasallardır.
2.2 Kitosan Boncukların Hazırlanması
%3 lük kitosan, %2 lik asetik asitte çözülür. 2 M‘lık 250 ml‘lik NaOH solüsyonu
içerisine kitosan solüsyonu damlatılarak boncuklar oluĢturuldu.OluĢan kitosan boncuklar 24
saat için NaOH solüsyonunda karıĢtırıldı (ġekil 4, 5)ve kullanıncaya kadar saf suda
buzdolabında saklandı.
10
ġekil 4:Kitosan boncuklarının oluĢturulması
ġekil 5:Kitosan boncuklar
11
Elde edilenkitosan boncuklardan 10 g tartılarak 0,06 M NaOH içerisine 0.1 ml 0.043
mol/L epikloridrin (ECH) eklenmiĢ çözeltiye konulur. Boncuklar 60°C‘de 5-6 saat bu çözelti
içerisine çapraz bağlanma iĢlemi için bırakıldı (ġekil 6). Çapraz bağlanmıĢ olan
kitosanboncuklar nötr olana kadar saf su ile yıkandı. Yıkama suyunun pH‘ı,pH indikatör
kağıtları ile ölçüldü. Çapraz bağlanmıĢ kitosanboncuklar kullanıma kadar üzerini örtecek
kadar saf su içerisinde buzdolabında saklandı.
ġekil 6: Çapraz bağlanmıĢ kitosanlarıneldesi
Polimerizasyon
ve
damgalı
polimerden,katalazın
uzaklaĢtırılması
aĢamasında
kullanılmak üzere tamponlar hazırlandı. Bunlar; 7 pH‘lı olan fosfat (KH₂PO₄) tamponu ve
5,06 (yaklaĢık 5) olan sodyum (Na) Asetat tamponuydu.
0,01 M 250 ml fosfat tamponu hazırlanırken 0,34 gram KH₂PO₄ hassas tartıda beher
içinde tartıldı. Üzerine 250 ml‘den az (yaklaĢık 240 ml) saf su eklendi. pH metrenin
elektrotları saf su ile yıkandı. BaĢlangıç pH‘ı not edildi (4.71 pH). 2 MolarlıkNaOH
damlatarak pH‘ı 7‘ye getirildi. Sonra balon jojeye kondu. Balon jojenin250 ml çizgisine kadar
saf su eklendi. Ağzı kapatılarak karıĢtırıldı. Koyu renk cam ĢiĢeye konularak dolaba kaldırıldı.
0,01 Molarlık 250 ml Na Asetat tamponu hazırlanırken (ġekil 7) 0,20 gram Na Asetat
hassas tartıda beher içinde tartıldı. Üzerine 250 ml‘den az (yaklaĢık 240 ml) saf su eklendi.
pH metrenin elektrotları saf su ile yıkandı. BaĢlangıç pH‘ı not edildi (pH: 7,34) . Asetik Asit
damlatarak pH‘ı 5,06‘ya indirildi. Sonra balon jojeye kondu. Balon jojenin 250 ml çizgisine
kadar saf su eklendi. Ağzı kapatılarak karıĢtırıldı. Koyu renk cam ĢiĢeye konularak dolaba
kaldırıldı.
12
ġekil 7: 0,01 M, pH: 5.06 Na-Asetat tamponu
2.3 Katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarının hazırlanması
ECH ile çapraz bağlanan 5 g kitosan boncuğu tartılarak iki boyunlu balona konuldu.
Üzerinemonomer olarak 150 mg akrilamid, çapraz bağlayıcı olarak 40 mg MBA
(metilendiakrilamid), polimerizasyon baĢlatıcı olarak 10 mg APS (amonyum persülfat) içeren
30 ml fosfat tamponu eklendi. Boncuklar dengeye gelmesi için bir müddet karıĢtırıldı. Daha
sonra 1 mg katalaz enzimi (Stok: 10mg/ml) eklendi ve 20 dkkarıĢtırıldı. Dahasonra 5 ml
fosfattamponuiçindeçözünmüĢ%0,16'lık,
reaksiyonhızlandırıcı,
NaHSO3eklendi.
PolimerizasyoniĢlemiyaklaĢık 300 rpm‘de 2 saatdevametti.
2 saatin sonunda çözelti ortam sıvısı CAT enzim tayini için ayrıldı. Bu sıvıda ortamda
bağlanmadan kalan CAT enzim miktarı bize ortama konulan enzimin ne kadarının
damgalandığı hakkında bilgi verecektir. Damgalanan katalaz enziminin moleküler kitosan
polimerden uzaklaĢtırılması için boncuklar hazırlanan pH 5 sodyum asetat tamponu içerisine
konularak rotator (açısal karıĢtırıcıda) 4 saat karıĢtırıldı (ġekil8). Yıkama suyu CAT analizi
için ayrıldı.
13
ġekil8:Damgalanan katalaz enziminin, moleküler kitosan polimerden uzaklaĢtırılması için
boncukların pH‘ı 5 olan sodyum asetat tamponu içerisine konularak karıĢtırıldığı rotator
Katalazaözgümoleküler damgalı kitosan boncuklarının tanıma etkinliğini saptamak
amacıyla bir baĢka enzim olan peroksidaz ile birlikte çalıĢıldı.Katalaza özgü moleküler
damgalı kitosan boncuklardan katalaz uzaklaĢtırılarak elde edilen katalaza özgü oyuklar
içeren boncuklar bu aĢamada kullanıldı. Bu boncuklar fosfat tamponu içerisine konuldu ve
içerisindekatalaz ve peroksidazı birlikte içeren enzim çözelti eklenerek diğer iĢlem adımları
aynen
tekrarlandı
(Balonda
karıĢtırma
ve
yıkama).
Yıkama
suyunda
hem
katalazhemdeperoksidaz tayinleri ayrı ayrı yapıldı.
2.4 Protein Tayini
Bradford Protein Metodu:
Bradford çözeltisi:
40 mg CBB (G250), 50ml etanolde çözüldü. %85 fosforik asitte çözüldü ve
karıĢtırıldı. 800 ml ye saf suyla tamamlandı. Filtre kağıdı ile süzüldü. Saf su ile 1L ye
tamamlandı.
1 ml için: 50 µl örnek ve 950 µl Bradford çözeltisi 10 dak. oda sıcaklığında bekletildi
(ġekil 9) ve spektrofotometride 595 nm‘de okundu.
ġekil 9:CAT tayini öncesi protein miktarı belirlenecek olan örnekler [(Bradford
çözeltisi+ örnekler (POLM VE YS, açıklamalar için Ģekil 3 bkz)]
14
2.5 KATALAZ (CAT) Enziminin Native-PAGE Elektroforezde (Denatüre Edici
Olmayan) Tanımlanması:
Polimerizasyon sonrası yıkama suyunda damgalanmadan kalan katalaz miktarını tespit
etmek amacıyla katalaz enzimine karakteristik Native-PAGE uygulaması yapıldı. Bunun için
hazırlanan jel prosedürü aĢağıda verilmiĢtir.
Elektroforez öncesi hazırlanan solüsyonlar:
Monomer Solusyonu: 60 g akrilamidve 1.6 g bisakrilamid200 ml dIH2O‘da
çözündü.
4x Running jel buffer (Ayırmajelçözeltisi) (1.5 M Tris-HCl pH 8.8):36.3 g
Tris,150 ml dIH2O (deiyonizesu) da çözünür.200 ml ye tamamlandı.
4x Stackingjel buffer (AlıĢtırmajelçözeltisi) (0.5 M Tris - HCl pH 6.8): 3 g Tris, 40
ml dIH2O da çözdürüldü. pH 6.8‘eHClileayarlandı. 50 ml‘ye dIH2O iletamamlandı.
10% Ammonium persulfate (APS): 0.1 g APS, 1 ml dIH2O‘da çözdürüldü.
Tank Buffer (0.025 M Tris, 0.192 M Glisin, pH 8.3): 30.28 g Tris ve144.13 g
glycine, 10 L ‗e dIH2O‘ da çözüldü.
%7.5 AyırmaJeliiçin (10 ml için): %4 AlıĢtırmaJeli:
Monomer solusyonu: 2.5 ml
2.66 ml
Ayırmajelçözeltisi: 2.5 ml
5 ml
dIH2O: 4.95 ml
12.2 ml
%10 APS: 50µl
100 µl
TEMED: 3.33 µl
10 µl
Elektroforezeönce ayırma jeli (Katalaz için %7.5luk ayırma jeli) döküldü. Üzerine
polimerizasyonun daha çabuk olması için 2 ml n- butanol konulup ayırma jelinin donması
beklendi. Daha sonra alıĢtırma jelini döktük ve örneklerimizi pipetleyip yürümesini
sağlayacağımız kuyuları oluĢturan tarakları taktık.
AlıĢtırma jeli de donduktan sonra tarakları çıkarıp oluĢan boĢluklara,(örnekleri
pipetlemeden) elektrik akımının geçmesini sağlayacak olan Tank buffer‘dan pipetledik. Daha
sonra her kuyuya eĢit miktarda protein koyacak Ģekilde örneklerimizden pipetledik.
(Pipetlenen örnekler ve eĢit protein miktarlarına karĢılık gelen hacimler sonuçlar kısmında
verilmiĢtir.) Örnek pipetleme iĢlemi bittikten sonra elektroforezi güç kaynağına bağladık
(kırmızı uç + ya siyah uç –‗ye gelecek Ģekilde). Güç kaynağı 40 mA‘e ayarlandı ve jeller2
15
saat boyunca yürütüldü. Yürütme iĢlemi tamamlandıktan sonra güç kaynağı kapatılıp jeller
çıkartıldı. Son olarak jeller, katalaza özel bir boya solüsyonuna alındılar.
CATboyaması:
Solusyon 1: %0,01 H2O2 ve 0,25 gr Aminotriazol 300 ml dIH2O‘da çözdürüldü.
Jelbusolusyonuniçindekaranlıkta 10-15 dak.bekletildi.
Solusyon 2: 1 g FeCl3 ve 1 g K3Fe CN6 100 ml dIH2O‘ da çözüldü.Sol.1 den
çıkarılanjeller, karanlıkta10 dakbekletilip dIH2O ileyıkandı.
Boyasonrasındajelüzerinde
enzimininvarolduğunoktalarparlakbeyazolarkgözlendi.
CAT
2.6 PEROKSĠDAZ (POX) Enziminin Native-PAGE’te Tanımlanması:
Hazırlanan katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarının katalaza spesifik
olup olmadığını tespit etmek amacıyla peroksidaz enzimi ile birlikte katalaz da katalaz
uzaklaĢtırılan damgalı boncuklara uygulandı. Yıkama suyunda ortamdaki peroksidazı tespit
etmek amacıyla peroksidaza spesifik nativepage çalıĢması yapıldı. Prosedür aĢağıda
verilmiĢtir.
%10AyırmaJeliiçin (10 ml için):
%4 AlıĢtırmaJeli:
Monomer solusyonu: 3.33 ml
2.66 ml
Ayırmajel tampon: 2.5 ml
5 ml
dIH2O: 4.11 ml
12.2 ml
%10 APS: 50µl
100 µl
TEMED: 3.33 µl
10 µl
Yürütme iĢlemi tamamlandıktan jel, peroksidaza özel bir boya solüsyonuna alındılar.
POX boyaması [DAB (diaminobenzidine) boyama]:
200 mM, pH 5 Sodyum asetat tamponu hazırlandı.0,0334 gr DAB, hazırlanan
tamponun 100 ml‘sinde çözüldü. %3 ‗lik H2O2 stok solüsyonu hazırlanıp bundan 75 µl alınıp
boya solüsyonunun içine eklendi. Jeller boya içine konulup bantlar görünür hale gelinceye
kadar beklendi.
16
ġekil10:ElektroforezçalıĢmalarındangörüntüler
17
3- SONUÇLAR ve TARTIġMA
ġekil 11: ÇalıĢmadaizlenensüreçlerinsonundaeldeedilensonuçlarınĢematikgösterimi
18
3-1 Katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarının hazırlanması ve
katalaz damgalama etkiliğinin belirlenmesi
Katalaz damgalı kitosan boncuklara bağlanmadan çözelti ortamında kalan ve daha
sonra bağlanan katalazınsodyum asetat tamponuyla yıkmayla uzaklaĢtırılması sonucunda elde
edilen yıkama sularında CAT enzimi miktarının tanımlanması amacıyla önce protein tayini
yapılıp daha sonra Native- PAGE te, CAT enzimi tanımlanmıĢtır.
Bunun için öncelikle protein tayini yapılmıĢtır.
Örnekler:
1- Katalaz (CAT) Standardı(Std)
2- Polimerizasyon sonrası örnek (POLM):Katalaza özgü moleküler damgalı kitosan
boncuklarını içeren örnek(ġekil 11-4)
3-Yıkama
suyu
(YS):
Katalazdamgalananmolekülerkitosanboncuklardan,
asetattamponuilekatalazınuzaklaĢtırıldığıyıkamasuyu(ġekil 11-6)
Protein Sonuçları:
1- Standart (Std): 10mg/ml
2- Polimerizasyon sonrası örnek (POLM): 0,037 mg/ml
3- Yıkama suyu(YS):0,055 mg/ml
b
0,06
Protein Miktarı (mg/ml)
0,05
a
0,04
0,03
0,02
0,01
0
POLM
YS
Örnek grupları
ġekil 12: Polimerizasyon sonrasındaki örnek (POLM) ve yıkama suyundaki (YS)
protein miktarları
Katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarını içeren örnekteki protein
miktarının (POLM), standart (Std) ve yıkama suyundaki (YS) protein miktarından daha az
olduğu bulunmuĢtur (ġekil 12). Bu sonuç,katalaz enziminin kitosan boncuklarda
damgalandığının kanıtlarından biridir.
19
POLM‘ye göre, YS‘deprotein miktarının daha fazla (ġekil 12) olmasının nedeni,
katalazın
damgalandıkları
moleküler
kitosan
boncuklardan
asetat
tamponu
ile
uzaklaĢtırılmasından kaynaklanmaktadır. Bu hipotezi desteklemek için her iki örnekteki CAT
enzim aktiviteleri Native-PAGE ‗te tanımlanmıĢtır.
Natıve-PAGE (denatüre edici olmayan) elektroforezde, CAT enziminin tanımlanması
için yukarıdaifade edilen 3 örnek, eĢit miktarda protein içerecek Ģekilde jele yüklendi
(Tablo 1).
Tablo 1: Jele 0.25, 0.50 ve 0.75 mg/ml protein yüklemek için örneklerden alınacak
miktarlar
Örnekler
0.25 mg/ml
0.50 mg/ml
0.75 mg/ml
Std
2.2 µl
4.4 µl
6.6 µl
POLM
6.76 µl
13.52 µl
20.28 µl
YS
4.63 µl
9.26 µl
13.89 µl
ġekil 13:0.25, 0.50 ve 0.75 mg/ml içeren CAT standardındaki (STD), kitosan
boncuklarıyla polimerizasyon sonrasındaki(POLM= katalaza özgü moleküler damgalı kitosan
boncuklarını içeren örnek) ve yıkama suyundaki (YS= katalazın damgalandıkları moleküler
kitosan boncuklardan asetat tamponu ile uzaklaĢtırıldığı yıkama suyunda) Katalaz (CAT)
enziminin tanımlanması
Protein sonuçlarını destekler nitelikte, NATIVE-PAGE‘tepolimerizasyon sonrası
örnekte (POLM= katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarını içeren örnek), CAT
enzimi tanımlanmazken, yıkama suyunda (YS) CAT aktivitesi belirgin olarak tanımlanmıĢtır
(ġekil
13).
Bu
sonuçiar,POLM‘deCAT‘ınkitosan
20
boncuklarında
damgalandığını
kanıtlamaktadır. Ayrıca YS‘de gözlenen bant, moleküler kitosan boncuklara damgalanmıĢ
ancak daha sonra asetat tamponu ile bu boncuklardan uzaklaĢtırılan CAT enziminin
aktivitesidir.
3.2 Katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarının CAT’ a
spesifikliğinin belirlenmesi:
Katalaza
özgü
hazırlanan
moleküler
damgalı
kitosan
boncuklarınınCAT‘aspesifikliğinin belirlenmesi amacıyla CAT ile birlikte peroksidaz (POX)
enzimlerini içeren çözelti,katalazın uzaklaĢtırıldığı moleküler damgalı kitosan boncuklarının
olduğu ortama eklendi.ĠĢlem sonrasında, 10 ve 15 µg protein içindeki CAT ve POX enzim
aktiviteleri karĢılaĢtırıldığında, CAT enzim aktivitesinin POX enzimindekinden düĢük olduğu
gözlenmiĢtir (ġekil 14). Katalazın moleküler damgalı polimerde kendisine özgü oyuklara
girmesi, jelde CAT enziminin daha az yoğunlukta görünmesine neden olmuĢtur. Diğer yandan
katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklarda POX enzimini tanıyacak spesifik
bölgelerin olmamasından dolayı bu yapılara enzimin giremediğini POX enziminin
aktivitesinin bu nedenle daha yoğun olduğu ve bu enzimin 4 farklı izoziminin olduğu
gösterilmiĢtir (ġekil 14).
ġekil 14: 10 µg ve 15 µg protein içeren polimerizasyon sonrası örnekteki(POLM)
Katalaz (CAT) ve Peroksidaz (POX) enziminin NATIVE-PAGE ‗te tanımlanması [POLM:
Polimerizasyon sonrası örnek]
21
DEĞERLENDĠRME
Bu çalıĢmada katalaza özgü moleküler damgalı kitosan boncuklar hazırlandı ve
hazırlanan bu boncukların katalaza özgü olup olmadığı bir baĢka enzim varlığında test edildi.
Moleküler damgalı polimer hazırlama tekniklerinden biri olan ―Destek Materyal Yüzeyine
Damgalama
Tekniği‖
ile
protein
ve
enzim
gibi
büyük
moleküller
kolaylıkla
çalıĢılabilmektedir. Bu çalıĢmada kitosan doğal bir biyopolimer olması ve toksik /kanserojen
olmamasından dolayı destek materyal olarak seçildi. Katalaz enziminin biyolojik önemi ve
zahmetli tayin yöntemleri olmasından dolayı moleküler damgalı kitosan boncuklarının bu
amaçla kullanımı iyi bir alternatif olarak görülmektedir. Çapraz bağlanmıĢ kitosan
boncuklarının destek materyali olarak kullanılmasıyla hazırlanan katalaza özgü moleküler
damgalı kitosan boncuklarının CAT tayini amacıyla kullanılıp kullanılmayacağı test edildi ve
elde edilen jel görüntüleriyle,kitosan boncuk yüzeyinde katalaza özgü oyukların oluĢarak
katalazın bu bölgelere bağlandığı desteklenmiĢtir. OluĢan oyukların katalaza özgü olup
olmadığını test etmek için uygulanan enzim karıĢımından yüksek oranda katalazın
bağlanmasıda damgalama prosedürünün baĢarı ile gerçekleĢtirildiğini göstermektedir.
Bu çalıĢmanın sonucundamoleküler damgalı kitosan boncukları,katalaz gibibitki
enzimlerinin hem karıĢımlardan ayrılması hem debirbiri yanında tanımlanmasında
kullanılabilecek alternatif sentetik materyaller olarak görülmektedir.Ayrıca bu çalıĢmayla
katalaz gibi biyolojik aktiviteye sahip biyomoleküllerin tanımlanmasında moleküler
damgalı kitosan boncuklarının kullanımı ilk kez ortaya konmuĢtur.
TEġEKKÜR
Proje çalıĢmalarında bizi destekleyen okul müdürümüz Aylin MUSLUOĞLU’na, müdür
yardımcımız F. Necla ATIL’a, danıĢman öğretmenimiz Mesut ESEN’e, laboratuvar, malzeme
ve alan bilgisi bakımından yardımcı olmaya çalıĢan Ege Üniversitesi Biyokimya bölümünden
Doç.Dr. Burcu OKUTUCUveEsenTURANCI’yaveyinelaboratuvar, malzeme ve alan bilgisi
bakımından her zaman yardımcı olan Genel Biyoloji Ana Bilim Dalından Doç. Dr. A. Hediye
SEKMEN ESEN’earaĢtırmalarımıza yapmıĢ oldukları katkılarından dolayı çok teĢekkür
ederiz.
22
KAYNAKLAR
Adler, M., F.,Grieser, J.B. Li, D. Prieve, (2000), Colloids and Surfaces A:
Physicochemical and Engineering Aspects 169 259.
Apel, K.,Hirt, H., (2004), Reactiveoxygenspecies: metabolism, oxidativestress,
andsignaltransduction., AnnualReview of PlantBiology, vol. 55, pp. 373-99.
Bergmeyer,
N.,
(1970),
Methoden
der
enzymatischenAnalyse,
vol.
1,
AkademieVerlag, Berlin, pp. 636–647
Bhatnagar,
A.,&Sillanpää,
M.,
(2009),
Applications
of
chitinandchitosan-
derivativesforthedetoxification of waterandwastewater—A shortreview. Advances in Colloid
and Interface Science, 152(1–2), 26–38.
Chen, A.-H.,Yang, C.-Y., Chen, C.-Y., Chen, C.-Y., &Chen, C.-W., (2009),
Thechemicallycrosslinked metal-complexedchitosansforcomparativeadsorptions of Cu(II),
Zn(II), Ni(II) and Pb(II) ions in aqueousmedium. Journal of HazardousMaterials, 163(2–3),
1068–1075.
Dhakal, R. P.,Oshima, T., & Baba, Y., (2008), Planarity-recognitionenhancement of
N-(2-pyridylmethyl)chitosanbyimprintingplanar metal ions. ReactiveandFunctional Polymers,
68(11), 1549–1556.
Dietz, K.,Jacob, S., Oelze, M., Laxa, M., Tognetti, V., de Miranda, S.M. , Baier, M.
,Finkemeier, I., (2006), Thefunction of peroxiredoxins in plantorganelleredoxmetabolism.,
Journal of ExperimentalBotany, vol. 57, pp. 1697-709,
Gai, Q.Q., Qu, F., Liu, Z.J., Dai, R.J., Zhang, Y.K., (2010), J. Chromatogr.A 1217
5035.
Gai, Q.Q., Qu, F., Zhang, T., Zhang, Y.K., (2011), J. Chromatogr.A 1218 3489.
Hu, Y.L., Song, C.Y., Li, G.K.,( 2012), Chromatogr. A 1263 21.
Jonathan Z. K, Samuel M. Hudson, Katherine A. M. Creber, Crosslinking of Chitosan
Fibers with Dialdehydes: Proposal of a New Reaction Mechanis, Journal of Polymer Science:
Part B: Polymer Physics, Vol. 37, 1079–1094 (1999)
Lenain, P., Mavungu J.D.D., Dubruel, P., Robbens, J., Saeger, S.D., (2012),
Anal.Chem. 8410-411.
Li, J.P., Li, S.H., Wei, X.P., Tao, H.L., Pan, H.C., (2012), Anal. Chem. 84 9951.
Liu, Y, He, Y, Jin, Y, Huang, Y, Liu, G, Zhao, R, 2013, Preparation of
monodispersedmacroporous core–shell molecularlyimprinted particles and their application in
the determination of2,4-dichlorophenoxyacetic acid, Journal of Chromatography A.
Lu, C.H., Wang, Y., Li, Y., Yang, H.H., Che,n X., Wang, X.R., (2009), J. Mater.
23
Chem. 19 1077
Mittler, R., (2002), Oxidativestress, antioxidantsandstresstolerance, Trends in
PlantScience, vol. 7, pp. 405-410.
Mittler, R., (2006), Abioticstress, thefieldenvironmentandstresscombination., Trends
in PlantScience, vol. 11,pp. 15-9.
Mittler, R., (2006), Abioticstress, thefieldenvironmentandstresscombination., Trends
in PlantScience, vol. 11,pp. 15-9.
Mittler,
R.,Vanderauwera,
S.
,
Gollery,
M.,Van,
Breusegem,
F.,
(2004)
Reactiveoxygen gene network of plants., Trends in PlantScience, vol. 9, pp. 490-8.
Mosbach, K., Ramson, O., (1996), The emerging technique of molecular imprinting
and its future impact on biotechnology, Biotechnol., 14: 163–17.
Muzzarelli, R. A. A., (2011), Potential of chitin/chitosan-bearing materials for
uranium recovery: An interdisciplinary review. Carbohydrate Polymers, 84(1), 54–63.
Muzzarelli, R.,&Tubertini, O., (1972), Radiationresistance of chitinandchitosanapplied
in thechromatography of radioactivesolutions. Journal of Radioanalyticaland Nuclear
Chemistry, 12(1), 431–440
Pillai, C. K. S., Paul, W., &Sharma, C. P., (2009), Chitinandchitosanpolymers:
Chemistry, solubility and fiber formation. Progress in Polymer Science, 34(7), 641–678.
Takahashi, M., Asada K., (1988), Superoxideproduction in aproticinterior of
chloroplastthylakoids, Archives of BiochemistryandBiophysics, vol. 267, pp. 714-722.
Varma, A. J., Deshpande, S. V., & Kennedy, J. F., (2004), Metal complexation by
chitosan and its derivatives: A review. Carbohydrate Polymers, 55(1), 77–93.
Woodbury, W, Spencer, AK, Stahman MA, (1971), An improved procedure using
ferricyanide for detecting catalase isozymes. Anal Biochem44:301-305
Xia, Y, Guo, T., Song, M., Zhang,B., (2006), Selective separation of quercetin by
molecular imprinting using chitosan beads as functional matrix. Reactive Functional Polymers
66:1734-1740
Xia,Z.W., Lin, Z.A., Xiao, Y., Wang, L., Zheng, J.N., Yang, H.H., Chen, G.N.,
(2013), Biosens.Bioelectron. 47 120.
Zhong, Q.S., Hu, Y.F., Hu, Y.L., Li, G.K., (2012), J. Chromatogr. A 1241 13.
24
Download

özel ege lisesi katalaza özgü moleküler damgalı kitosan