Türkiye Parazitoloji Dergisi 26 (3): 239-244 2002
İnsan ve Köpeklerden Alınan Klinik Örneklere
Leishmaniasis Tanısı İçin Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PZR) Uygulanması
Seray ÖZENSOY TÖZ, Yusuf ÖZBEL, Mediha Gül ATAY, Hatice ERTABAKLAR,
Nermin ŞAKRU, Ayşegül TAYLAN ÖZKAN, Murat HÖKELEK
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı Bornova, İzmir; Hıfzısıhha Merkezi Başkanlığı Salgın Hastalıklar
Dairesi Başkanlığı Ankara; Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Samsun
ÖZET: Birçok bölgemizde Kala-Azar’ın, Güneydoğu Anadolu Bölgesi dışında ise Şark Çıbanının sporadik olarak görülmesi
leishmaniasisin akla gelmesini ve ayırıcı tanısını zorlaştırmaktadır. Kala-Azar’ın rezervuarı olan köpeklerde enfeksiyon daha yüksek bir
insidansla seyretmekte ancak veteriner hekimlik alanında da benzer sorunlar yaşanmaktadır. Çalışmamızda insan ve köpeklerde
serolojik tanının yanısıra direkt mikroskobik tanı ile PZR’ın karşılaştırılması amaçlanmıştır. Kala-Azar şüphesi olan 6 hastadan alınan
kemik iliği örnekleri, şark çıbanı şüphesi olan 2 hastadan alınan yara kabuğu ve lezyon aspirasyon örnekleri çalışmaya dahil edilmiştir.
Ayrıca serolojik olarak pozitif olduğu saptanan 7, eşik değerin altında pozitif olan (<1/128) 1 köpekten alınan lenf aspirasyon örnekleri
ve nekropsi yapılan 2 köpeğin dalak ve karaciğer örnekleri çalışılmıştır. Altı şüpheli Kala-Azar hastasından bir tanesi tüm testlerle pozitif,
üçü ise PZR ve serolojik testlerle pozitif bulunmuş ancak direkt kemik iliği bakılarında amastigota rastlanılamamıştır. İki hasta ise tüm
testlerle negatif bulunmuştur. Şark çıbanı şüphesi olan her iki hasta da hem yayma preparatta hem de PZR ile pozitif saptanmıştır. On
köpekten elde edilen 12 örnekten 9 tanesi her üç yöntemle de pozitif saptanmıştır. İki örnekte PZR ve serolojik testler pozitifken lenf nodu
aspirasyonundan yapılan yayma direkt bakıda negatif bulunmuştur. Diğer bir örnekte serolojik testte eşik değerinin altında, direkt bakı
negatif iken PZR pozitif bulunmuştur. Çalışmada, PZR yönteminin insan ve köpeklerde leishmaniasis tanısında kullanılmasının uygun
olduğu saptanmıştır. Ancak, alınan örneklerin yeterli olmaması durumunda sadece yayma preparatta değil PZR’da da sorun yaratabileceği
düşünülerek diğer yöntemlerle birlikte uygulanmasının tanıda hassasiyeti arttıracağı sonucuna varılmıştır.
Anahtar kelimeler: Leishmaniasis, tanı, PZR, Türkiye
Application of Polymerase Chain Reaction (PCR) for Diagnosis of Leishmaniasis in Clinical
Samples Obtained from Human and Dogs
SUMMARY: Suspection and diagnosis of leishmaniasis are not easy because of existance as sporadic cases of Kala-Azar in many
of the regions and cutaneous leishmaniasis except southeastern region of Turkey. The infection is observed in a higher incidence in
reservuar dog population of Kala-Azar and similar problems are seen in veterinary medicine. The aim of our study was to compare
the correlation of the results of PCR with serological and microscopical diagnosis. Bone marrow aspiration samples from six
suspected Kala-Azar cases, dermal scraping and lesion aspiration samples from two suspected cutaneous leishmaniasis cases were
included. In addition, lymph node aspiration samples of seven seropositive and one borderline (<1/128) and liver and spleen
samples of two necropsied dogs were studied. One out of six suspected Kala-Azar cases was found to be positive and two were
found to be negative by all methods. Other three cases were found to be positive by PCR and serology while amastigotes could not
seen by microscopy. Two suspected cutaneous leishmaniasis cases were found to be positive by all methods. Twelve samples were
taken out of ten dogs and nine of them were found to be positive by all methods. Amastigotes could not seen while PCR and
serology were found to be positive in two cases. Serological titer was found to be positive below than cut off titer and amastigotes
could not be seen while PCR was found to be positive in another case. PCR was found to be suitable in diagnosis of leishmaniasis in
human and dogs, but it could be also negative in case of unproper sampling. We concluded that PCR application together with other
diagnostic methods will increase the sensitivity of diagnosis.
Key words: Leishmaniasis, diagnosis, PCR, Turkey
GİRİŞ
Geliş tarihi / Submission date :
Kabul tarihi / Accepted date:
Yazışma / Corresponding author: Doç. Dr. Seray Özensoy
Tel: (+90).(232) 339 82 90 Fax: (+90).(232) 388 13 47
E-mail: [email protected]
Bu çalışma kısmi olarak E.Ü. Araştırma Fon Saymanlığı
2000/TIP/016 nolu proje kapsamında desteklenmiştir.
Leishmaniasis ülkemizde insanlarda visseral (Kala-Azar) ve
deri leishmaniasisi (Şark Çıbanı) şeklinde karşımıza çıkmakta,
Kala-Azar’ın doğadaki rezervuarlığını ise diğer Akdeniz
ülkelerinde olduğu gibi köpekler yapmaktadır (20, 32).
Ülkemizde başta Ege ve Akdeniz bölgesi olmak üzere hemen
hemen her bölgemizde sporadik veya endemik olarak görülen
Özensoy Töz S. ve ark.
Kala-Azar’ın etkeninin Leishmania infantum, hiperendemik
olarak Şanlıurfa ilinde, endemik olarak civar illerde ve
Adana’da, sporadik olarak diğer bölgelerimizde görülebilen
deri leishmaniasisi etkeninin ise Leishmania tropica olduğu
bildirilmiştir (7, 18).
Türkiye’de Kala-Azar daha çok çocuklarda nadiren erişkinlerde görülmekte ve (17) hastalığın sporadik olgular halinde
ortaya çıkması nedeniyle tanıda güçlükler yaşanmaktadır.
Klinik bulguların birçok hastalığı taklit etmesi nedeniyle KalaAzar öncelikli olarak düşünülmemektedir (8, 21, 30). Ayırıcı
tanı amaçlı kemik iliği aspirasyonu uygulanması durumunda,
örnekte amastigot formu sayısının az olması, deneyim
gerektirmesi nedeniyle gözden kaçabildiği belirtilmektedir
(22). Kala-Azar’ın düşünülmesi durumunda tanıda yardımcı
olmak amacıyla dünyanın birçok bölgesinde olduğu gibi
ülkemizde de yüksek duyarlılık ve özgüllükte olan serolojik
testler uygulanmaktadır. Uzun zamandır uygulanan İndirekt
Fluoresan Antikor (IFA) testine ek olarak ELISA, rK39
antijeninin kullanıldığı dipstick testi ve Direkt Aglütinasyon
Testi (DAT) de antileishmanial antikorların saptanması için
rutinde ve sero-epidemiyolojik çalışmalarda yaygın olarak
kullanılmaktadır (1, 2, 3, 16, 20, 25).
Deri leishmaniasisinin daha önceleri Şanlıurfa ve Adana illeri
ile civarında kısıtlı bir bölgede görülmesine karşın son yıllarda
çalışma amaçlı toplu göç hareketleri ve seyahatlerin sıklaşması
nedenleriyle diğer illerimizde de yeni odaklar oluşabilmekte ve
bu bölgelerde direkt tanıda sorunlar yaşanabilmektedir (4, 7).
Sporadik Kala-Azar olgularının saptandığı, özellikle kırsal
kesimlerde yapılan çalışmalarda köpeklerde enfeksiyon oranının çok daha yüksek olduğu (3, 19, 20) ve köpek leishmaniasis
olguları (CanL) ile hastalığın görülme oranları arasında doğrudan bir ilişki olmadığı belirtilmektedir (6, 9). Köpeklerdeki
bulguların veteriner hekimler tarafından iyi bilinmemesi,
enfeksiyonu taşıyan köpeklerin 1/3’ünün klinik bulgu
göstermemesi (5) ve ülkemizde tanı testlerinin her bölgede
uygulanamaması gibi nedenlerle bu konuda da tanıda
güçlükler yaşanmaktadır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) birçok hastalıkta olduğu
gibi leishmaniasisin tanısında da çok yaygın olarak
uygulanmakta (10, 12, 13, 14, 19, 21, 27, 29), klinik
örneklerde az miktarda bulunan paraziti saptayabilmesi, direkt
tanıda yardımcı olabilecek deneyimli personele gereksinim
göstermemesi, tedavi sonrası izlemin yapılabilmesi gibi
avantajları bulunmaktadır. PZR’da parazit genomuna veya
kinetoplast DNA’sına ait primerler kullanılarak (11, 22, 24,
29) tanı konulması yanısıra türe özgü primerler kullanılarak
parazitin tür ayrımı da aynı anda yapılabilmektedir (10, 27).
Buradan yola çıkarak çalışmamızda, ülkemizde PZR yönteminin leishmaniasis tanısında rutine konulabilmesi amacıyla
bütün Leishmania türlerinin kinetoplastik DNA’sında bulunan
bir bölgeden türetilen, 10 parazite kadar saptayabilen ve tanıda
yaygın olarak kullanılan 13A ve 13B (24, 26) primer çifti ile
insan ve köpeklerden elde edilen klinik örneklerde PZR
yöntemi uygulanmıştır.
240
GEREÇ VE YÖNTEM
Örnekler: Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazitoloji Ana
Bilim Dalına başvuran ya da preparatı gönderilen (a) Kala-Azar
şüpheli 3 hastanın kemik iliği aspirasyon yayma preparatları (b)
deri leishmaniasisi şüpheli 2 hastanın yara kabuğu ve aspirasyon
yayma preparat örnekleri (c) Aydın ili Kuşadası ilçesinde ve
Denizli ilinin çeşitli köylerinde gerçekleştirilen epidemiyolojik
araştırmalar sırasında saptanan 14 seropozitif köpekten alınan
popliteal lenf bezi aspirasyon örneklerinden lam üzerine yayma
preparat örnekleri ve (d) nekropsi yapılan köpeklerden alınan
dalak ve karaciğerlerinden lam üzerine bastırarak yapılan yayma
preparat örnekleri çalışma kapsamına alınmıştır. Tüm örnekler
metanol ile tesbit edilerek çalışılana dek -20 oC’de saklanmıştır.
Örneklere DNA izolasyonu sonrası PZR uygulanmıştır.
Kala-Azar şüpheli hastalar ve köpek serumlarına IFA testi,
Ege Üniv. Tıp Fak. Parazitoloji AD’nda uygulanmıştır (3).
Preparatlar Giemsa ile boyandıktan sonra mikroskopta X1000
büyütmede iki farklı kişi tarafından değerlendirilmiştir.
DNA izolasyonu: Preparatlar ve 100 µl’lik aspirasyon sıvıları
TEN (28) solüsyonu ile 400 µl’ye tamamlanarak 1,5 ml.lik
eppendorf tüpüne aktarılmıştır. Üzerine 4 µl Proteinaz K (stok
sol: 20 mg/ml) ve 27 l SDS (stok: %15) eklenmiş ve 37 oC’lik
su banyosunda bir gece bekletilmiştir. Önce eşit miktarda (400
µl) Trisle doyurulmuş fenol eklenip (Sigma P-4557) 5 dk.
karıştırılmış ve 12.000 rpm’de 5 dk. santrifüj yapılmıştır, üst
kısım yeni bir tüpe alınarak alt kısım atılmıştır. Daha sonra eşit
oranda karıştırılmış fenol-kloroform karışımı ile ve son olarak
da kloroform ile aynı karıştırma ve santrifüj işlemleri tekrarlanmıştır. Kloroform aşaması tamamlandığında üst kısım yeni bir
tüpe aktarılmış ve 1/10’u kadar (yaklaşık 40 l) 3M sodyum
asetat (NaAc), 2 katı (800µl) absolü etanol konulmuş ve DNA’
nın presipite olması sağlanmıştır. Bir gece –10 oC’de saklandıktan sonra 12.000 rpm’de 10 dk santrifüj edilmiştir. Bu işlem
sonunda pelletin dibe yapışması sağlanmış ve üst kısım atılmıştır. Pellet üzerine 3 kez 1 ml %70 etanol eklenip tüpler hafifçe
çalkalanarak DNA yıkanmış ve pellet kurutulmuştur. Üzerine
25 l TE solüsyonu (28) eklenerek DNA örneği elde edilmiştir.
DNA Amplifikasyon Reaksiyonu (PZR): Reaksiyon karışımı
(100 l); 1XPZR tampon, 4 mM MgCl2, her
deoxyribonucleotide’den 0.2 mM, her primer’den 0,5 M ve her
reaksiyon için 2,5 U Taq polimeraz enziminden oluşmaktadır.
Primer olarak 13A (5’ GTG GGG GAG GGG CGT TCT 3’) ve
13B (5’ ATT TTA CAC CAA CCC CCA GTT 3’) kullanılmıştır. Termocycler 94 oC 10 dk (1 kez); 94oC’de 1 dk; 60 oC’de
1dk; 70 oC’de 1 dk; (30 kez) ve 70 oC’de 7 dk (bir kez) olacak
şekilde programlanmıştır (24). Agaroz Jel Elektroforezi %1.7’
lik jel ile TAE (27) solüsyonu kullanılarak gerçekleştirilmiş ve
pozitif kontrol olarak kültürde üretilen promastigotlardan elde
edilen DNA örneği, negatif kontrol olarak ise (kontaminasyon
kontrolu için) distile su kullanılmıştır. Marker olarak 50 ile
1031 bp arasında bant veren GeneRulerTM 50bp DNA Ladder
(Fermentas SM0371) kullanılmıştır.
Leishmaniasis tanısında PZR
BULGULAR
IV. Olgu: Çorum ili Uğurludağ ilçesi Küçükerikli köyünde
yaşayan hasta, aynı bölgede yapılan epidemiyolojik araştırmalar sırasında seropozitif olarak saptanmış ve kemik iliği
aspirasyonu örneğinden yapılan DNA izolasyonu sonrası
uygulanan PZR’nunda pozitif olarak saptanmıştır.
Kala-Azar:
I. Olgu: Çorum ili İskilip ilçesi Ahlatçık köyünde yaşayan
hastaya yapılan ilk kemik iliği aspirasyon örneği EDTA’lı tüpte
gönderilmiştir. Hazırlanan yayma preparat hemoliz nedeniyle
değerlendirilememiş ve NNN besiyerine ekim yapılmıştır. Bu
besiyeri tüpünden 2 gün sonra alınan 400 l kemik iliği içeren
besiyeri ortamından DNA izolasyonu yapılmıştır. Tedavi
sonrasında klinik iyileşme sağlanamaması üzerine yeniden
kemik iliği aspirasyonu uygulanmış ve yapılan yayma
preparattaki örnek kullanılarak DNA izolasyonu yapılmıştır.
Her iki örnekte de PZR pozitif olarak saptanmıştır.
Deri Leishmaniasisi (KL):
I. Olgu: Samsun merkezde yaşayan hasta ile yapılan
görüşmede bir yıl önce Batman iline ziyarette bulunduğu
öğrenilmiş ancak hangi ayda gittiği belirlenememiştir. Omuz
bölgesinde bulunan lezyonun çapının 1 cm. olduğu ve kabuk
bulunduğu görülmüştür. Hastanın yara kabuğu ve lezyon
aspirasyon materyali ayrı ayrı değerlendirilmiş ve sadece yara
kabuğu örneği PZR ile pozitif olarak saptanmıştır.
II. Olgu: Çorum ili Sungurlu ilçesi Üçoluk köyünde yaşayan
hastadan alınan kemik iliği aspirasyon örneğinden yapılan DNA
izolasyonu sonrası uygulanan PZR pozitif olarak saptanmıştır.
2. Olgu: Uşak ilinde yaşayan hastanın 2002 yılının Şubat
ayında Urfa’yı ziyaret ettiği öğrenilmiştir. Fakültemizin
Dermatoloji kliniğine başvuran hasta şüphe üzerine şark çıbanı
açısından değerlendirilmek üzere laboratuvarımıza gönderilmiş
ve 1 cm. çapında ülsere olmamış lezyonun sağlam deri ile
III. Olgu: Aydın ili Kuşadası ilçesinde yaşayan hasta bir yıl
önce Kala-Azar tanısı alarak tedavi edilmiş ancak gerileyen
bulguların yeniden belirginleşmesi üzerine yapılan kemik iliği
Tablo 1. Kala-Azar ve Şark Çıbanı şüpheli hastalardan alınan klinik örneklerden PZR ile elde edilen sonuçlar
Olgu
IFAT
1/
Yayma
Neg
Neg
Neg
POZ
256
Neg
K.İ.
POZ
512
POZ
VL
K.İ.
POZ
512
Neg
VL
K.İ.
POZ
128
Neg
Uşak
VL
K.İ.
Neg
Neg
Neg
15
Samsun
KL
Yara kabuğu
POZ
-
POZ
35
Uşak
KL
Lezyon aspirasyon örneği
POZ
-
POZ
Yaş
Bölge
Tip
Materyal
1
17
Muş
VL
K.İ.
2
2
Çorum
VL
K.İ.
3
2,5
Çorum
VL
4
5
Çorum
5
2
Kuşadası
6
1,5
7
8
PZR
VL: Visseral leishmaniasis; KL: Deri leishmaniasisi; K.İ: Kemik iliği aspirasyon materyali
Tablo 2. Seropozitif olarak saptanan köpeklerden alınan örneklerden PZR ile elde edilen sonuçlar
Örnek
No
1
2
3
4
5
Bölge
Köpek No
Materyal
Yayma
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
IFAT
1/
KOEV-239
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
6
KOEV-240
POZ
POZ
512
7
8
9
10
11
12
KOEV-247
KUŞ-301
ASA-001
ASA-003
ASA-006
DER-025
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
POZ
Neg
Neg
Neg
1024
4096
1024
512
64
256
KUŞ-208
KUŞ-172
Kuşadası
Denizli
Karaciğer
Dalak
Karaciğer
Dalak
PZR
Lenf Asp. Örneği
Lenf Asp. Örneği
aspirasyon örneğinden elde edilen yayma preparattan ve
EDTA’lı tüpe alınan kemik iliği örneğinden yapılan DNA
izolasyonu sonrası uygulanan PZR pozitif olarak saptanmıştır.
1024
1024
1024
birleştiği bölgeden insülin enjektörü ile yapılan aspirasyonla
alınan örnekten yapılan DNA izolasyonu sonrası uygulanan
PZR, pozitif olarak saptanmıştır.
241
Özensoy Töz S. ve ark.
Hastalar ile ilgili sonuçlar Tablo 1’de verilmiştir.
CanL:
Seropozitif köpeklerden elde edilen örneklerden yapılan DNA
izolasyonu sonrası uygulanan PZR işleminden alınan sonuçlar
Tablo 2’de verilmiştir.
Çalışılan bütün örneklerin PZR son ürünleri hepsi birlikte bir
jelde yürütülmüş ve elde edilen görüntü Şekil 1’de sunulmuştur.
arttırabilmektedir (22). Bizim çalışmamızda da 3 Kala-Azar
hastasında Giemsa ile boyama sonrası yapılan mikroskobik
incelemede parazite rastlanamadığı halde PZR ile pozitif
saptanmıştır.
Hastaların tedavi sonrası takibi de önem taşımakta, tam tedavi
sağlanamadığında tedavinin devamı veya başka bir ilacın
uygulanması önerilmektedir. Serolojik antikor yanıtı tedaviden
sonra da uzun süre devam etmekte ve yavaş bir düşüş
Şekil 1. Çalışılan bütün örneklerin PZR son ürünlerinin hepsi birlikte bir jelde yürütüldükten sonra elde edilen görüntü (M: Marker)
TARTIŞMA
Ülkemizde leishmaniasisin visseral ve deri formunun endemik
ve sporadik olarak görülmesi, visseral forma rezervuarlık
yapan köpeklerde enfeksiyonun insanlara göre çok daha
yüksek oranda saptanması, bu hastalığın ve hem insanlarda
hem de köpeklerdeki ayırıcı tanısının önemini arttırmaktadır.
Leishmaniasisin bazı bölgelerimizde sporadik olarak
görülmesi, visseral ve deri formunun diğer bir çok hastalıkla
aynı bulguları vermesi nedeniyle ayırıcı tanıda öncelikle
düşünülmemektedir. Endemik bölgelerde yapılan çalışmalar
bu konuya ışık tutması, o bölgelerdeki hekim ve veteriner
hekimleri bilgilendirmesi açısından önem taşımaktadır.
Ayırıcı tanıda visseral leishmaniasis düşünülen hastalarda
invaziv olmayan ve yüksek derecede hassasiyet ve özgüllük
gösteren serolojik testler tanıda büyük oranda yardımcı
olmaktadırlar. Antikor saptanan olgularda, hala altın standart
olarak kabul edilen, kemik iliği aspirasyon yaymasında
parazitlerin gösterilmesi ile kesin tanı konmaktadır. Fakat
kemik iliği aspirasyonu işlemi sırasında zaman zaman kanama
olabilmekte, yetersiz materyal alınabilmekte ve örnekte
amastigota rastlanmayabilmektedir. Alınan örnekte çok az
sayıdaki parazitin dahi DNA’sını saptayabilen PZR yöntemi
kemik iliği aspirasyonu ile tanının hassasiyet ve duyarlılığını
242
göstermektedir. Serolojik olarak takip edilen hastaların eski
serumlarının saklanması ve takip serumları ile birlikte
çalışılarak bu düşüşün gösterilmesi gerekmektedir. Ülkemizde
bir çok laboratuvarda hastaların serumları düzenli bir şekilde
saklanmamakta ve eski serumlarla birlikte çalışılmamaktadır.
Tedavi takibinde kemik iliği aspirasyonu uygulanmasında ise
parazit tedavi nedeniyle tam kaybolmasa bile azalmakta ve
direkt mikroskobide saptanmasında zorluk yaşanmaktadır.
Piarroux ve ark. (22) Kala-Azar tanısında hiç bir yöntemin
%100 hassasiyet göstermediğini, en hassas yöntemin PZR
olduğunu bildirmişlerdir. Serolojik yöntemlerin de yüksek
derecede hassasiyet gösterdiğini, ancak relapsları tanımada
başarısız bulunduğunu belirtmişlerdir. Bizim çalışmamızda da
iki Kala-Azar hastasının tedavi sonrası kemik iliği
örneklerinin direkt mikroskobide amastigota rastlanmamasına
karşın hem serolojik olarak hem de PZR ile pozitif saptanmış
ve tedavinin tekrarlanması sağlanmıştır. Ayrıca kemik iliği
örneğinin inoküle edildiği besiyeri ortamından da parazit
DNA’sının saptanabilmesi kullanılabilecek örnek çeşitliliğini
arttırması açısından yönteme üstünlük sağlamaktadır.
Serolojik tanının değerli olmadığı bildirilen (1) L. tropica’nın
etkeni olduğu deri leishmaniasisinde tanı, klasik olarak
lezyonun sağlam deri ile birleştiği bölgeye lansetin batırılması
sonrası çıkan seröz sıvının lam üzerine yayılması ve Giemsa
Leishmaniasis tanısında PZR
ile boyanarak amastigotların görülmesiyle direkt olarak
yapılmaktadır (31). Örneğin doğru olarak alınması durumunda
hassasiyeti ve duyarlılığı çok yüksek olan bu yöntemle (23)
ülkemizde şark çıbanı görülen bölgelerde tanı konulmaktadır.
Çalışmamızda PZR yöntemi kullanılarak lezyon aspirasyon
örneği veya yara kabuğu ile pozitif sonuçların alındığının
gösterilmesi değer taşımakta, ancak her laboratuvarda
uygulanabilme zorluğu ise bir dezavantaj olarak karşımıza
çıkmaktadır.
Teşekkür
Ülkemizde de diğer Akdeniz ülkelerinde olduğu gibi KalaAzar’ın en önemli rezervuarın köpekler olduğu ve endemik
olan bölgelerde enfeksiyon oranının yüksek olduğu
bilinmektedir. Hastalık daha çok vektör Phlebotomus’un
yaşamasına uygun köylerde ortaya çıkmakta ve köpekler de
evin dışında vektörle karşılaşabileceği açık ortamlarda
yaşamaktadır. Bu nedenle serolojik testlerle eşik değerin
altında da düşük titrasyonlarda asemptomatik olgulara
rastlanmaktadır (6). Seronegatif olgularda da lenf aspirasyon
örneklerinde parazit saptanabildiği için serolojik tanıyı
destekleyecek hassas yöntemlere gereksinim duyulmaktadır
(24). Çalışmamızda bu sonuçlara benzer şekilde eşik değerin
altında olan iki olgu PZR ile pozitif saptanmış ve bunların
birinde de direkt bakıda parazite rastlanmıştır.
1.
Reale ve ark. (24) çalışmamızda kullandığımız 13A ve 13B
primerleri ile köpek lenf nodu aspirasyon örneklerinde PZR
uygulamışlar ve direkt bakıyı altın standart olarak aldıklarında
%100 hassasiyet ve özgüllük saptamışlardır. Aynı çalışmada
IFA testi ile yüksek oranda yanlış negatif sonuç aldıklarını
bildirmişlerdir.
Mathis ve Deplazes’de (15) insan ve köpeklerden alınan klinik
örneklerde ssrRNA gen sekansı ile PZR uygulamışlar ve
kültür sonuçları ile karşılaştırmışlardır. Yalnızca bir örnekte
PZR ile yanlış negatif sonuç almışlar ve bunu örneğin uygun
alınamamasına bağlamışlardır. Benzer şekilde bizim
çalışmamızda da serolojik testler ve direkt bakı ile
karşılaştırdığımızda PZR ile daha hassas sonuçlar almamıza
karşın örnek alımı işleminin PZR’da da çok önemli olduğu
çalışmamız sırasında görülmüştür.
Çalışmamızda ve diğer çalışmalarda görüldüğü gibi parazitin
direkt olarak görülmesi altın standart olma özelliğini hala
korumaktadır. Buna karşın örnek alınımındaki hatalar
yüzünden hassasiyeti düşük olabilmektedir. PZR yöntemi ile
tanıda hassasiyet artırılabilmektedir. Serolojik yöntemler de
yüksek hassasiyet ve özgüllük göstermektedirler. Ancak eşik
değerin altındaki olgularda da direkt bakıda parazit
görülebilmekte ya da PZR ile parazit DNA’sı saptanabilmektedir. Buna karşın nadir de olsa uygun örnek alınamamasına
ve örnekteki PZR inhibitörlerine bağlı olarak PZR ile
yanlış negatif sonuçlar alınabilmektedir (15, 24) Bu nedenlerle
PZR’nin diğer yöntemlere alternatif olması yerine, diğer
yöntemlerle birlikte uygulanmasının leishmaniasis tanı ve
takibinde daha yararlı olacağını düşünmekte ve önermekteyiz.
Çalışmada kullanılan primer çiftini temin eden Chicago Finch
Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümünden Prof. Dr. K. –P. Chang’a;
Kuşadası Veteriner Kliniğinden Vet. Hek. Nevzat Yıldızlı’ya, Denizli İl
Sağlık Müdürlüğü Bulaşıcı Hastalıklar Şube Müdürü Dr. İsmail
Sancak’a ve jel fotoğraflarının çekilmesinde yardımcı olan Yrd. Doç.
Dr. Cumhur Gündüz’e teşekkür ederiz.
KAYNAKLAR
Edrissian H, Darabian P, Zovein Z, Seyedi-Rashti MA,
Nadim A, 1981. Application of the indirect fluorescent antibody
test in the serodiagnosis of cutaneous and visceral leishmaniasis
in Iran. Ann Trop Med Parasitol, 75(1): 19-24.
2.
El-Safi SH, Evans DA, 1989. A comparison of the DAT and
ELISA in the serodiagnosis of leishmaniasis in the Sudan. Trans
R Soc Trop Med Hyg, 83:334-337.
3.
Ertabaklar H, Özensoy Töz S, Şakru N, Keleş E, Özbel Y,
2001. Muğla İli Göktepe Köyünde Çocuklarda ve Köpeklerde
visseral leishmaniasisin araştırılması. T Parazitol Derg, 25(2):
128-131.
4.
Ertuğ S, Aydın N, Gültekin B, Doyuran SE, 2002. Aydın
bölgesindeki deri leishmaniasisi olgularının
incelenmesi. T Parazitol Derg, 26(2):140-142.
5.
retrospektif
Ferrer LM, 1999. Clinical spects of canine leishmaniasis. In:
Canine leishmaniasis : an update. Proceedings of the International
Canine Leishmaniasis Forum, Barcelona, Spain, p.6-10.
6.
Gradoni L, 1995. Canine reservoir of zoonotic visceral
leishmaniasis in the Mediterranean area. Epidemiol Control Inf
Circ WHO Mediterr Zoon Control Cent, 37:12-13
7.
Gürel MS, Ulukanlıgil M, Özbilge H, 2002. Cutaneous
leishmaniasis in Sanliurfa: epidemiologic and clinical features of
the last four years (1997–2000). Int J Dermatol, 41:1-7.
8.
Güven K, Ünal A, Kandemir O, Aygen B, Doğanay M, 1994.
Kala-Azar: Üç Olgu Raporu. Mikrobiyol Bült 28(4): 378-384.
9.
Harith AE, Slappendel RJ, Reiter I, van Knapen F, de Korte
P, Huigen E, Kolk AHJ, 1989. Application of a direct
agglutination test for detection of specific anti-Leishmania
antibodies in the canine reservoir. J Clin Microbiol, 27:2252-2257.
10. Ibrahim ME, Smyth AJ, Ali MH, Barker DC, Kharazmi A,
1994. The polymerase chain reaction can reveal the occurence of
naturally mixed infections with Leishmania parasites. Acta Trop,
57: 327-332.
11. Katakura K, Kawazu SI, Naya T, Nagakura K, Ito M,
Aikawa M, Qu JQ, Guan LR, Zuo XP, Chai JJ, Chang KP,
Matsumoto Y, 1998. Diagnosis of Kala-Azar by Nested PCR
based on amplification of the Leishmania mini exon gene. J Clin
Microbiol, 36(8): 2173-2177.
12. Lachaud L, Chabbert E, Dubessay P, Reynes J, Lamothe J,
Bastien P, 2001. Comparison of various sample preparation
methods for PCR diagnosis of visceral leishmaniasis using
peripheral blood. J Clin Microbiol, 39(2): 613-617.
243
Özensoy Töz S. ve ark.
13. Lachaud L, Dereure J, Chabbert E, Reynes J, Mauboussin
JM, Oziol E, Dedet JP, Bastein P, 2000. Optimized PCR using
patient blood samples for diagnosis and follow-up of visceral
leishmaniasis, with special reference to AIDS patients. J Clin
Microbiol, 38(1): 236-240.
23. Ramirez JS, Agudelo S, Muskus C, Alzate JF, Berberich C,
Barker D, Velez ID, 2000. Diagnosis of cutaneous
leishmaniasis in Colombia: the sampling site within lesions
influences the sensitivity of parasitologic diagnosis. J Clin
Microbiol, 38(10): 3768-3773.
14. Le Fichoux Y, Quaranta JF, Aufeuvre JP, Lelievre A, Marty
24. Reale S, Maxia L, Vitale F, Glorioso NS, Caracappa S, Vesco
P, Suffia I, Rousseau D, Kubar J, 1999. Occurence of
Leishmania infantum parasitemia in asymptomatic blood donors
living in an area of endemicity in southern France. J Clin
Microbiol, 37(6): 1953-1957.
G, 1999. Detection of Leishmania infantum in dogs by PCR with
15. Mathis A, Deplazes P, 1995. PCR and in vitro cultivation for
detection of Leishmania spp. in diagnostic samples from human
and dogs. J Clin Microbiol, 33(5): 1145-1149.
lymph node aspirates and blood. J Clin Microbiol, 37(9): 29312935.
25. Reithinger R, Quinnell RJ, Alexander B, Davies CR, 2002.
Rapid detection of Leishmania infantum infection in dogs:
comparative study using an immunochromatograpic dipstick
test, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, and PCR. J Clin
16. Mohammed AR, Wright EP, Rahmen AM, et al., 1986.
Serodiagnosis of Sudanese VL and MCL: comparison of ELISAIFA and IHA. Trans R Soc Trop Med Hyg, 80:271-274.
26. Rodgers MR, Popper SJ, Wirth DF, 1990. Amplification of
17. Ok ÜZ, Balcıoğlu İC, Taylan Özkan A, Özensoy S, Özbel Y,
kinetoplast DNA as a tool in the detection and diagnosis of
2002. Leishmaniasis in Turkey. Acta Trop, (baskıda).
18.
Özbel Y, Turgay N, Ozensoy S, Ozbilgin A, Alkan MZ, Ozcel
27. Salotra P, Sreenivas G, Pogue GP, Lee N, Nakhasi H,
Ramesh V, Negi S, 2001. Development of a species-specific
20. Özensoy S, Özbel Y, Turgay N, Alkan MZ, Gül K, GilmanSachs A, Chang K-P, Reed SG, Ozcel MA. 1998.
Serodiagnosis and epidemiology of visceral leishmaniasis in
Turkey. Am J Trop Med Hyg, 59(3): 363-369.
Pearson RD, Queiroz de Sousa A, 1995. Leishmania species:
Visceral (Kala-Azar) Cutaneous and Mucosal Leishmaniasis.
Principles and Practice of Infectious Diseases, Eds. Mandell GL,
Bennett JE, Dolin R. 4th Edi. Churchill Livingstone, p.2428-2442.
22. Piarroux R, Gambarelli F, Dumon H, Fontes M, Dunan S,
Mary C, Toga B, Quilici M, 1994. Comparison of PCR with
direct examination of bone marrow aspiration, myeloculture, and
serology for diagnosis of visceral leishmaniasis in immunocompromised patients. J Clin Microbiol, 32(3): 746-749.
244
Leishmania. Exp Parasitol, 71:267-275.
MA, Jaffe CL, Schnur L, Oskam L, Abranches P. 1995.
Epidemiology, diagnosis and control of leishmaniasis in the
Mediterranean region. Ann Trop Med Parasitol, 89(Suppl.1):89-93.
19. Özbel Y, Oskam L, Özensoy S, Turgay N, Alkan MZ, Jaffe
CL, Özcel MA, 1999. A survey on canine leishmaniasis in
western Turkey by parasite, DNA and antibody detection assays.
Acta Trop, 72(1):1-6.
21.
Microbiol, 40(7): 2352-2356.
PCR assay for detection of Leishmania donovani in clinical
samples from patients with Kala-Azar and post Kala-Azar
Dermal Leishmaniasis. J Clin Microbiol, 39(3): 849-854.
28. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 1989. Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, Edi. Nolan C. 2nd Edi. CSH
Press, p.B20.
29. Smyth AJ, Ghosh A, Hassan MQ, Basu D, de Bruijn MHL,
Adhya S, Mallik KK, Barker D, 1992. Rapid and sensitive
detection of Leishmania kinetoplast DNA from spleen and blood
samples of Kala-Azar patients. Parasitol, 105:183-192.
30. Tokel NK, Sarıbaş S, Aksüyek Ç, 1992. Kala-Azarlı Yedi
Çocuğun Tedavisi. Ankem Derg, 6(1): 71-74.
31. World Health Organization 1990 Control of Leishmaniasis.
Technical report series no. 793. World Health Organization,
Geneva, Switzerland.
32. Yaşarol Ş, 1955. A case report of canine visceral leishmaniasis
in Istanbul. Tur J Microbiol, 8:1-9.
Download

şanlıurfa bölgesindeki sıtmalı hastaların plasmodium