Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi
Cilt: 9, No: 1, 2014 (1-5)
Electronic Journal of Food Technologies
Vol: 9, No: 1, 2014 (1-5)
TEKNOLOJİK
ARAŞTIRMALAR
www.teknolojikarastirmalar.com
e-ISSN:1306-7648
Kısa Makale
(Short Paper)
Bacillus Amyloliquefaciens Kullanılarak α-Amilaz Üretimine Substrat
Partikül Boyutunun Etkisi
Ali YARAŞ1, Veyis SELEN2, Dursun ÖZER2
1
Bartın Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Bölümü, Bartın/TÜRKİYE
2
Fırat Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Elazığ/TÜRKİYE
[email protected]
Özet
Günümüzde çeşitli endüstrilerde yaygın olarak kullanılan enzimlerin üretim maliyetlerini azaltmak için ortam
optimizasyonu çalışmaları ile mikroorganizmaların enzim üretim kapasitelerinin artırılması amaçlanmaktadır. Bu
çalışmada katı substrat olarak kullanılan soya küspesinin farklı partikül boyutlarının α-amilaz üretimi üzerine
etkisi incelenmiştir. Maksimum enzim aktivitesi (1572 U/ml) -50+100 mesh boyutundaki fraksiyona sahip soya
küspesi (20 g/L) içeren fermantasyon ortamında 37 oC, 150 rpm ve başlangıç pH’ı 7.0 olan ortam şartlarında elde
edilmiştir.
Anahtar Kelimeler: α-Amilaz, Bacillus Amyloliquefaciens, soya küspesi, fermantasyon
Effect of Substrate Particle Size Using Bacillus Amyloliquefaciens
on α-Amylase Production
Abstract
Nowadays, in order to reduce the production cost of enzymes that widely used in various industries, the
increasing of the enzyme production capacity of microorganisms is intended by media optimization. In this study,
the effect of different particle sizes of used soybean meal as solid substrate on α-amylase production was studied.
The maximum enzyme activity (1572 U/ml) was obtained in the fermentation medium containing soybean meal
(20 g/L and -50 +100 mesh particle size) at 37 °C 150 rpm and initial pH=7 conditions.
Keywords: α-Amylase, Bacillus amyloliquefaciens, soybean meal, fermentation
Bu makaleye atıf yapmak için
Yaraş, A.,Selen, V., Özer, D., “B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-Amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi” Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi
2014,9(1) 1-5
How to cite this article
Yaraş, A.,Selen, V., Özer, D., “B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-Amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi” Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi
2014,9(1) 1-5
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5
B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-Amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi
1. GİRİŞ
α-Amilaz (1-4 α-D-glukanohidrolaz, E.C.3.2.1.1) nişasta ve glikojen gibi polisakkaritlerin α-1-4glikozitik bağlarını gelişi güzel parçalayarak maltoz ya da daha büyük oligosakkaritlere dönüştürebilen
hücre dışı enzimlerdir [1]. α-Amilaz hayvanlar ve bitkiler tarafından sentezlenmesine rağmen, kontrollü
koşullarda kısa sürede ürün elde edilmesinden dolayı asıl kaynağı Bacillus türü mikroorganizmalar
oluşturmaktadır [2].
Günümüzde α-amilaz enzimi, başta nişasta sıvılaştırma olmak üzere tekstil, deterjan ve kağıt gibi
endüstrilerde yaygın olarak kullanılmaktadır. α-Amilazın ekonomik olarak üretilmesi fermantasyon
ortam maliyetinin azaltılması ile sağlanabilir. Bu amaçla pahalı olan sentetik ortam bileşenleri yerine
daha ekonomik ve ucuz olan endüstriyel ve tarımsal yan ürün ve atıklar kullanılabilir [3]. Son yıllarda
kassava bagası, şeker kamışı küspesi, kahve kabuğu ve atıkları, elma posası, arpa atıkları, soya fasulyesi
atıkları, meyve suyu endüstrisi atıkları gibi katı substratlar mikrobiyal kaynaklı enzim üretimi için
fermantasyon proseslerinde kullanılmaktadır [3;4;5]. Ayrıca fermantasyon sonrasında ortamda kalan
protein içeriği ve besin değeri yüksek katı ürün hayvan yemi olarak da değerlendirilebilir [6]. Bu
çalışmada Bacillus amyloliquefaciens ile soya küspesinin partikül boyutunun α-amilaz üretimine etkisi
zamana bağlı olarak incelenmiştir.
2. MATERYAL METOT
2.1 Doğal Substrat ve Kimyasallar
Bu çalışmada, Ordu Yağ Sanayi A.Ş. Fabrikası’ndan temin edilen soya küspesi doğal substrat olarak
kullanılmıştır. Soya küspesi öğütüldükten sonra ASTM standart eleklerde elenerek -16+30 mesh, -30+50
mesh, -50+100 mesh ve 100+200 mesh boyutlarında farklı fraksiyonlar elde edilmiş ve bu fraksiyonlar 70
ºC’de 24 saat süreyle etüvde kurutulmuş ve kapalı kaplarda muhafaza edilerek deneylerde kullanılmıştır.
Deneylerde kullanılan soya küspesinin bileşimi Tablo 1.’de sunulmuştur. Ayrıca deneylerde kullanılan
diğer bütün kimyasallar analitik saflıkta olup Merck ve Sigma firmalarından temin edilmiştir.
Tablo 1. Soya küspesi bileşimi
Bileşen
(%)
Nem
15.0
Protein
44.0
Yağ
0.9
Kül
6.0
Selüloz
7.0
Diğer
27.1
Metabolik Enerji 2400 kcal/kg
2.2 Mikroorganizma
Bacillus amyloliquefaciens NRRL B–645 türü bakteri NRRL (National Center for Agricultural Utilization
Research, USA) kültür koleksiyonundan temin edilmiştir.
2.3 Mikroorganizma Büyüme Ortamı
Mikroorganizmanın gelişimi ve saklanması için kullanılan besi ortamları Tablo 2.’de verilmiştir [7,8].
Stok kültürler 4 oC’de kültür saklama besi ortamının bulunduğu eğik deney tüplerinde muhafaza edilmiş
ve her 1 aylık periyotlar ile stok kültürler yenilenmiştir. Enzim üretiminde kullanılacak mikroorganizma
2
Yaraş, A., Selen, V., Özer, D.
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5
Tablo 2’de verilen bakteri gelişim besi ortamından 50 ml alınarak erlende geliştirilmiştir.
Mikroorganizma gelişim ve α-amilaz üretim besiyerlerinin başlangıç pH’sı, 1 N HCl ve 1 N NaOH
kullanılarak 7.0’e ayarlanmıştır. Otoklavda (Prior Clave 129) sterilizasyonu yapılan (121 oC, 1.2 bar, 15
dakika) besi ortamına steril şartlarda mikroorganizma ön ekimi yapılmış ve besi ortamı orbital
çalkalayıcıda (37 oC’de ve 150 rpm) 18 saat süreyle inkübe edilmiştir. Daha sonra mikroorganizmanın %1
(v/v) oranında ön gelişim ortamından alınarak 20 g/L konsantrasyonunda farklı tanecik boyutuna (16+100 mesh, -30+50 mesh, -50+100 mesh ve -100+200 mesh) sahip soya küspesi içeren fermantasyon
ortamına ekimi gerçekleştirilmiş ve α-amilaz üretimi incelenmiştir. Deneylerde hem maliyet hem de
içerdiği minerallerin olumlu etkisinden dolayı musluk suyu kullanılmıştır [4].
Tablo 2. Bacillus amyloliquefaciens için saklama ve gelişim besi yeri bileşimleri.
Kültür Saklama Besiyeri Bakteri Gelişim Besiyeri
(g/L) [8]
(g/L) [7]
Glikoz
4.0
18.0
Pepton
1.0
Yeast ekstrakt
0.5
1.0
MgSO4.7H2O
0.5
NaCl
2.0
CaCl2.2H2O
0.1
KH2PO4
1.0
Et peptonu
8.0
Kazein peptonu
2.0
Agar
18.0
MnSO4.7H2O
0.01
FeSO4. 7H2O
0.01
(NH4)2SO4
5.0
Bileşen
2.4. Enzim Aktivitesinin Ölçülmesi
Fermantasyon süresince, farklı zamanlarda alınan örnekler 5000 rpm’de 15 dakika santrifüjlenerek
(Hettich Eba 21) fermantasyon sıvısında aktivite tayini yapılmıştır. Aktivite ölçümlerinde %3’ lük 2.3 ml
çözünür nişasta, 1 ml 0.1 M CaCl2, 250 ml 0.1 M potasyum fosfat tamponu (0.025 M NaCl içeren,
pH=6.2), 200 ml distile sudan oluşan karışım substrat çözeltisi olarak kullanılmıştır. Aktivite ölçümlerinde
bir kontrol ve üç numune tüpü olmak üzere toplam dört tüp kullanılmıştır. Tüplere 4.5 ml substrat
çözeltileri eklendikten sonra 37 oC’de su banyosunda 5 dakika süreyle tutulmuştur. Daha sonra numune
tüplerine 0.5 ml enzim ilave edilmiş ve 37 oC’de 30 dakika süreyle inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi
sonrasında kontrol tüpüne ve örnek tüplerine reaksiyonu durdurmak amacıyla 1 M 0.9 ml HCl çözeltisi
eklenmiştir. Kontrol tüpüne 0.5 ml enzim çözeltisi konduktan sonra renk oluşumunu gözlemek amacıyla
0.1 ml iyot ayıracı (% 0.3 I, % 3 KI) ilave edilmiştir. 4 ml distile su ile hacim tamamlandıktan sonra
vorteks’de karıştırılarak absorbansların okunmasına geçilmiştir. α-Amilaz aktivitesi iyodun nişasta ile
verdiği renk esasına göre spektrofotometre (620 nm) (Chebios Optimum-One UV&VIS) kullanılarak
belirlenmiştir. 1 birim enzim aktivitesi (U/ml), 37 oC’de iyot çözeltisi ile nişastanın verdiği renkteki 0.0284
OD (optical density)’lik azalma olarak tanımlanmıştır [9].
3
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5
B.Amyloliquefaciens Kullanılarak α-Amilaz Üretimine Substrat Partikül Boyutunun Etkisi
3. SONUÇLAR
Soya küspesi partikül boyutunun α-amilaz üretimine etkisini incelemek amacıyla yapılan deneylerden
elde edilen sonuçlar Şekil 1.’de verilmiştir. Şekil 1.’den de görüldüğü gibi katı substrat olarak kullanılan
soya küspesinin partikül boyutunun α-amilaz üretimi üzerine ve ortam pH’sına belirgin bir etkisinin
olmadığı görülmektedir. Maksimum enzim aktivitesi -50+100 mesh partikül boyutuna sahip soya küspesi
içeren fermantasyon ortamında 1572 U/ml olarak elde edilmiş ve mikroorganizmanın tüm partikül
boyutlarında katı halde bulunan substratı kullanabildiği gözlenmiştir.
1800
Enzim Aktivitesi (U/ml)
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
9
pH
8
7
6
0
12
24
36
48
60
72
İnkübasyon Zamanı (Saat)
Şekil 1. Soya küspesi partikül boyutunun α-amilaz üretimine etkisi (○ -16+30 mesh, ● -30+50 mesh,
□ -50+100 mesh, ■ -100+200 mesh, fermantasyon sıcaklığı: 37 °C, başlangıç pH:7.0)
4
Yaraş, A., Selen, V., Özer, D.
Teknolojik Araştırmalar: GTED 2014 (9) 1-5
4.KAYNAKLAR
1. Kandra, L., 2003. α-Amylases of medical and industrial importance, Journal of Molecular Structure
(Theochem), 666-667: 487-498.
2. Fogarty, W.M. Microbial Enzyme and Biotechnology, Applied Science, 2-72, 1983.
3. Haq, I., Ashraf, H., Iqbal, J. and Qadeer, M.A., 2003. Production of alpha amylase by Bacillus
licheniformis using economical medium, Bioresource Technology, 87: 57-61.
4. Tanyıldızı, M.S., Özer, D., Elibol, M., 2007. Production of bacterial α-amylase by B.
amyloliquefaciens under solid substrate fermentation, Biochemical Engineering Journal, 37: 294-297.
5. Pandey, A., Soccol, C.R., Nigam, P., Soccol, V.T., Vandenberghe, L.P.S., 2000. Biotechnological
potential of agro-industrial residues. II: cassava bagasse, Bioresource Technology, 74: 81-87.
6. Berovic, M. and Ostroversnik, H., 1997. Production of Aspergillus niger pectolytic by solid state
bioprocessing of apple pomace, Journal of Biotechnology, 53: 47-53.
7. Syu, M.J. ve Chen, Y.H., 1997. A study on the α-amylase fermentation performed by Bacillus
amyloliqyefaciens, Chemical Engineering Journal, 65: 237-247.
8. Yıldız, S., 1993. Değişik bakteri ve substratlar kullanılarak amilaz üretiminin incelenmesi, Yüksek
Lisans Tezi, Fırat Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü.
9. Pfueller S.L., and Eliot W.H., 1969.The extraceluler α-Amylase of Bacillus stearotermophillus’, J.
Biological Chemistry, 244, 48-54.
5
Download

İndir - Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi