T. C.
İSTANBUL BİLİM ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
C6 GLİOMA HÜCRELERİNDE MORİNDA CİTRİFOLİA VE
PAKLİTAKSELİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Biyolog Elçin ÖZEN
YÜKSEK LİSANS TEZİ
İSTANBUL, 2009
T. C.
İSTANBUL BİLİM ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
C6 GLİOMA HÜCRELERİNDE MORİNDA CİTRİFOLİA VE
PAKLİTAKSELİN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
Biyolog Elçin ÖZEN
Tez Danışmanı
Prof. Dr. Tuncay ALTUĞ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
İSTANBUL, 2009
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
1. ÖZET ................................................................................................................................... 1
2. SUMMARY ........................................................................................................................ 2
3. GİRİŞ VE AMAÇ ............................................................................................................... 3
4. GENEL BİLGİLER ............................................................................................................. 4
4.1. GLİOBLASTOMA MULTİFORME (GBM) .................................................................. 4
4.2. C6 GLİOMA HÜCRE SOYLARI.................................................................................... 5
4.3. MORİNDA CİTRİFOLİA (NONİ) .................................................................................. 6
4.4. PAKLİTAKSEL ............................................................................................................... 7
4.5. HÜCRE SİKLUSU ........................................................................................................... 8
4.6. KANSER .......................................................................................................................... 10
4.7. β-KATENİN MOLEKÜLÜ.............................................................................................. 11
4.8. WNT SİNYAL İLETİ MEKANİZMASI ......................................................................... 12
5. MATERYAL VE YÖNTEM .............................................................................................. 14
5.1. KULLANILAN KİMYASALLAR .................................................................................. 14
5.2. KULLANILAN YÖNTEMLER....................................................................................... 15
5.2.1. Hücre kültürü .......................................................................................................... 15
5.2.2. Hücre Proliferasyonunun Belirlenmesi .................................................................. 15
5.2.2.1. β-katenin İmmünositokimyası ............................................................................ 15
5.2.2.2. Bromodeoksiuridin (BrdU) İmmünositokimyası ................................................ 16
6. BULGULAR ....................................................................................................................... 17
6.1. MORİNDA CİTRİFOLİA VE PAKLİTAKSELİN C6 GLİOMA HÜCRELERİNDE
PROLİFERASYON
ÜZERİNE
ETKİLERİNİN
BROMODEOKSİÜRİDİN
İLE
GÖSTERİLMESİ .................................................................................................................... 17
6.2. MORİNDA CİTRİFOLİA VE PAKLİTAKSELİN C6 GLİOMA HÜCRELERİNDE
β KATENİN EKSPRESYONU ÜZERİNE ETKİLERİ.......................................................... 19
7. TARTIŞMA ......................................................................................................................... 22
8. SONUÇ................................................................................................................................ 24
9. TEŞEKKÜR ........................................................................................................................ 25
10. KAYNAKLAR .................................................................................................................. 26
SİMGE VE KISALTMALAR
AEC
: Aminoetilkarbezol
APC
: Adenomatöz polipozis koli
β TrCP
: β Transdusin tekrarları içeren protein
BrdU
: Bromodeoksiuridin
CTNNB1
: Katenin β1 geni
Cdk
: Siklin bağımlı kinaz
Cyc
: Siklin
CKI
: Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri
Dsh
: Dishevelled
DMEM
: Dulbecco’nun modifiye eagle medyumu
FCS
: Fetal sığır serumu
Fzd
: Frizzled
GBM
: Glioblastoma multiforme
GSK 3 β
: Glikojen sentetaz kinaz 3 β
TNFα
: Tümör nekroz faktör α
TCF/LEF
: T hücre transkripsiyon faktörü/Lenfoid çoğaltıcı faktör
WHO
: Dünya Sağlık Örgütü
Araştırma Projesi No
: TBG/0282007
1. ÖZET
Bu çalışmada in vitro C6 glioma hücre modelinde Morinda citrifolia (noni) ekstresi
ve
paklitakselin
farklı
konsantrasyonlarının
β-katenin
sinyal
yolu
ile
hücre
proliferasyonunda meydana getirdiği değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi.
Hücre proliferasyonunun değerlendirilmesinde hücre siklusunda S fazına özgü bir
işaretleyici olan bromodeoksiuridin (BrdU) uygulandı. Noni ile inkübasyon sonrasında
BrdU inkorporasyonunda kontrol gruba kıyasla azalma izlenirken, sadece paklitaksel
uygulanan ve noniyle paklitakselin birlikte uygulandığı gruplarda S fazında hiç hücre
gözlenmedi. Glioma hücrelerinde, plazma membranlarının intraselüler sınırları boyunca
β-katenin ekspresyonu izlendi. Noni ekstresi ile inkübasyon sonrasında plazma membranı
seviyesinde normal seviyelerde ekspresyon izlendi. Paklitaksel inkübasyonu sonrasında
nükleusta belirgin β-katenin ekspresyonu izlendi. Noni ve paklitakselin birlikte
uygulandığı gruplarda ise
β-katenin ekspresyon ve lokalizasyonunda bir değişiklik
olmadığı görüldü.
Çalışmamız sonucunda plazma membranında bulunan β-katenin ekspresyonunun
noni ekstresi uygulamasıyla değişmediği, düşük dozda paklitaksel uygulamasında
nükleustaki β-katenin ekspresyonunun arttığı izlendi.
1
2. SUMMARY
In this study, in in vitro C6 glioma cell model, different concentration of Morinda
citrifolia (noni) extract and paclitaxel dependent β-catenin signaling pathway and changes
in the cell proliferation are examined immunocytochemically.
To ases cell proliferation, S-phase spesific marker bromodeoxyuridin (BrdU)
immunocytochemistry was performed. While a decrease in BrdU incorporation was
observed after noni extract incubation, there was no S-phase cell after paclitaxel and
combined noni extract and paclitaxel applications. In glioma cells, β-catenin expression
was observed across the intracelluler margin of plasma membrane. After incubation with
noni extract, no change in β-catenin expression of existing β-catenin was noticed. A
significant increase was observed in nucleus β-catenin expression after paclitaxel
incubation. Also after incubation with combined noni extract and paclitaxel no change in
existing β-catenin expression was noticed.
As a result of our study, it was determined that, the expression of plasma membrane
localized cell adhesion molecule β-catenin was not change by effect of noni extract, and
β-catenin expression was decreased by effect of low dose paclitaxel in nucleus.
2
3. GİRİŞ VE AMAÇ
Morinda citrifolia, deniz seviyesindeki açık sahil kesimlerinde ve deniz
seviyesinden 400 metre yüksekliğe kadar ormanlık alanlarda bulunan yeşil renkli bir
ağaçtır (1). Noni olarak da bilinen Morinda citrifolia birçok hastalığın tedavisinde ve ideal
sağlık koşullarının oluşturulmasında kullanılmaktadır.
Paklitaksel porsuk ağacının (Taksus brevifolia) kabuğundan izole edilen, 853,9
dalton ağırlığında doğal bir alkoloidtir. Genellikle akciğer, göğüs, baş-boyun bölgesi
tümörlerinin tedavisinde kullanılan kemoterapi ilacıdır.
Gliomalar
ise
malign
beyin
tümörlerinin
büyük
bölümünü
oluştururlar.
Glioblastoma multiforme neoplastik hücrelerin merkezi sinir sistemine infiltrasyonu
sonucu nörolojik fonksiyon kaybına ve bunun sonucunda da ölüme yol açar (2).
Çalışmamızda noni ekstresi ve paklitakselin glioma hücreleri üzerindeki etkilerini
izleyebilmek için sıçan C6 glioma hücre soyu kullanıldı. Çalışmamızın amacı noni ekstresi
ve paklitaksel uygulaması sonrası glioma hücrelerinde β-katenin sinyal yolu ve hücre
proliferasyonunda meydana gelen değişiklikleri izlemektir.
3
4. GENEL BİLGİLER
4.1. GLİOBLASTOMA MULTİFORME (GBM)
Santral sinir sistemi tümörlerinin en büyük grubunu glial hücrelerden gelişen ve
glioma olarak bilinen tümörler oluşturur.
Beyin tümörlerinin bugünkü sınıflamasının temelini Wirchow atmıştır. 1860’da
beynin hücrelerarası matriksi olan nörogliayı tanımlamıştır. Yine Wirchow tümörlerin
mikroskopik ve makroskopik özellikleri arasında bağlantı kurmuş ve glioma tarifini de ilk
kez yapmıştır. 1993 yılında Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tümörlerin sınıflandırılmasını
yayınlamış ve evre I-IV arasında tümörler benignden maligne doğru sınıflanmıştır (3).
2000 yılında bu sınıflandırma histopatolojik özellikler ve yaşam süresi verilerine
dayandırılarak WHO tarafından güncellenmiştir (3).
Santral sinir sistemi tümörleri içinde, çocuk yaş grubunda primer tümörlerin
yaklaşık %40-45’ini, erişkin yaş grubunda ise %50-60’ını astrosit kökenli tümörler
oluşturur. WHO’a göre astrositik tümörler 2 gruba ayrılır.
1) Diffüz infiltran astrositer tümörler
2) Daha iyi sınırlı astrositomların özel varyantları
Diffüz tipteki astrositomlar artan anaplazi oranına göre sınıflandırılırlar. WHO
evreleme sistemine göre 4 gruba ayrılırlar. Evre IV olarak bilinen GBM erişkin yaş
grubunda en sık rastlanan primer beyin tümörüdür. GBM primer olarak gelişebildiği gibi
daha düşük evre glial tümörlerden de progresyon ile gelişebilmektedir.
Erkeklerde kadınlara göre, beyaz ırkta siyah ırka göre daha sık görülmektedir.
Genetik yatkınlık ya da çevresel bir faktör olmadan ortaya çıkar. 10. ve 17.
kromozomlardaki tümör supresyon genlerin kaybının GBM’nin ortaya çıkışında etkili
olduğu düşünülmektedir. GBM genelde serebral hemisferin derin beyaz maddesinde ortaya
çıkar.
4
4.2. C6 GLİOMA HÜCRE SOYLARI
Gliomalar erişkinde oldukça sık görülen, malign beyin tümörlerinin büyük
bölümünü oluştururlar. Hayvan beyin tümörlerinin, insan beyin tümör modelleri ile olan
benzerlikleri, klinikte parametrelerin tanımlanması ve doğru tedavinin uygulanması
açısından oldukça yol göstericidir. Primer beyin tümörlerinin %60 kadarını gliomalar
oluştururlar. GBM neoplastik hücrelerin merkezi sinir sistemine infiltrasyonu sonucu
nörolojik fonksiyon kaybına ve sonunda da ölüme yol açan bir kanserdir (2). Yetişkin
erkeklerde, kadınlara oranla daha sık görülmekle beraber, 15 yaşın altındaki çocuk
tümörlerinin %40-45’ini oluşturmaktadır. Malign beyin tümörlerinin oluşumunun ve
gelişmesinin anlaşılmasında, buna dayalı tedavilerin saptanmasında, in vivo ve in vitro
çalışmalarda hayvan tümör modelleri vazgeçilmez kaynaklardır (2). C6 glioma hücreleri
yüksek mitotik aktivite, nükleer pleomorfizm, tümör nekroz odakları, tümör içi kanama
gibi çeşitli malign gliobastoma karakteristik özelliklerine sahip hücreler olarak GBM’nin
in vivo özelliklerinin araştırılmasında günümüze kadar başarı ile kullanılmıştır. Wistar
Furth soyu sıçanların
N-N’nitrozometülüre uygulanmasıyla oluşturulan C6 glioma tümör
hattı ilaç etkileşimi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır (2).
5
4.3. MORİNDA CİTRİFOLİA (NONİ)
Morinda citrifolia (noni) 2000 yıldan beri Polinezyalılar tarafından halk yapımı
ilaçlarda kullanılmaktadır (1). Noni; Morinda citrifolia bitkisi için kullanılan yaygın
isimdir. Dünyanın her yerinde, farklı kültürler içinde İndian mulberry (yerli dut), Ba Ji
Tian, nono (veya nonu), cheese fruit, nhau gibi değişik isimler almıştır (4). Noni bitkisi,
deniz seviyesindeki açık sahil kesimlerinde ve deniz seviyesinden 400 metre yüksekliğe
kadar ormanlık alanlarda bulunan, yeşil renkli bir ağaçtır. Bu ağaç genellikle, lav akıntıları
boyunca yetişir. Düz gövdesi; geniş, parlak ve elips şeklindeki yaprakları; beyaz çiçekleri
ve sarı meyvesi ile tanımlanmaktadır. Meyvesi 12 cm ve üstüne kadar gelişebilir.
Olgunlaşmış noni meyvesi, kötü bir tat ve kokuya sahiptir (5).
Şekil 1. Morinda citrifolia (Noni) meyvesi
6
Noni; farklı hastalıkların tedavisinde
ve genel sağlık koşullarını sağlamada
kullanılan bir bitkidir. Kanser, enfeksiyon, arterit, diyabet, astım, hipertansiyon ve ağrılar
için tedavi edici etkisinin yanı sıra antibakteriyal, antiviral, antifungal, antitümör,
antihelmintik, analjezik, antiinflamatuar ile bağışıklığı güçlendirici geniş kapsamlı
terapötik etkileri olduğu bildirilmektedir (1).
Noni bitkisinin meyvesi, kökleri ve yapraklarından elde edilen ekstreler; skopoletin,
oktoanoik asit, potasyum, C vitamini, terpeneoid, alkoloid, antrakuinon, beta sterol,
karoten, A vitamini, flavon glukosid, linoleik asit, alizarin, aminoasit, akubin,
L-asperulosid, kaproik asit, kaprilik asit, ürsolik asit, rutin ve putativ prokseronin
bakımından zengindir (6-17). Noni meyvesindeki akubin, L-asperulosid ve alizarin, Noni
köklerindeki bazı antrakinonlar bileşimlerin antibakteriyal etkileri vardır. Nonideki bu
antibakteriyal elementler, deri enfeksiyonlarının, soğuk algınlığının, yüksek ateşin ve bazı
bakterilerin sebep olduğu sağlık sorunlarının giderilmesinde etkilidir (18). Noninin
karsinojenezin başlangıç evresinde önleyici etkisi vardır. Noninin bağışıklık sistemini
uyararak bazı malignant tümörler dahil koruyucu ve tümör proliferasyonunu önleyici etkisi
olduğu ileri sürülmektedir (19).
Noni meyvesinin alkol ekstraktı, endojen tümör
destekleyici Tümör Nekroz Faktör-α (TNF-α) üretimini inhibe eder. Böylece TNF-α’nın
tümör geliştirici etkisi de inhibe edilir (20). Noni meyve suyu (noni ppt.) ise tümör
gelişimini inhibe edici polisakkaritçe zengin bir madde içerir (19). Ayrıca, noninin
köklerinin ekstraktının analjezik ve hipotansif etkileri vardır (21).
4.4. PAKLİTAKSEL
Paklitaksel porsuk ağacının (Taksus brevifolia) kabuğundan izole edilen, 853,9
dalton ağırlığında doğal bir alkoloidtir (22). Tübülin heterodimerlerine bağlanıp, tübülin
sentezini stimüle eder, sonuçta mikrotübül yapımı azalır. Paklitaksel, mitoz için gerekli
olan, daha önce sentezi tamamlanmış mikrotübüllere bağlanır ve depolimerizasyona karşı
kararlılığın sağlanmasında rol oynar (22). Tübülin ve mikrotübül oranı bozulur. Bu
durumda hücre siklusu bloke olur, hücreler G2/M fazında birikirler. Böylelikle mitozdan
çıkan hücreler apoptoza girerler, paklitaksel apoptozu teşvik eder.
7
Paklitakselin etki mekanizmasına dayanarak antitümöral bir ajan olduğu
söylenebilir. Genellikle klinikte halen akciğer, göğüs, baş-boyun bölgesi tümörlerinin
tedavisinde kemoterapi ilacı olarak kullanılmaktadır (23).
Şekil 2. Paklitakselin molekül yapısı (24)
4.5. HÜCRE SİKLUSU
Vücudumuzdaki hücrelerin sahip oldukları bir yaşam döngüleri vardır. Her hücre
temel hücre hipotezinde olduğu gibi, başka bir hücreden köken alır ve belli dönemlerde
kendisi gibi başka hücreler üretir. Hücre, yaşam döngüsünü tamamladıktan sonra
canlılığını kaybeder. Bu yaşam döngüsünün süresi, hücreden hücreye değişir. Hücrelerin
yaşam döngülerindeki süre farklılıkları özellikle, G0 döneminin uzunluğuyla ilişkilidir.
Yaşam döngüsünde yer alan dönemler (Şekil 3) (25) ve başlıca özellikleri şunlardır:
G0 dönemi: Normal hücre işlevlerinin devam ettiği dönemdir. Süresi hücreden
hücreye farklılık gösterir. Bu dönemde hücre temel işlevlerini yerine getirir.
G1 dönemi: Hücre büyümesinin ön planda olduğu dönemdir. Artan protein sentezi
sayesinde hücre organellerinin sayısı iki katına çıkar. Bu dönem, hücre döngüsünde 8 saat
ya da daha uzun bir süre alır.
8
S dönemi: 6–8 saat süren bu dönemde, temelde DNA’nın kendi kopyasının
oluşturması (replikasyon) gerçekleşir.
G2 dönemi: 2-5 saat süren bu dönemde protein sentezi ön plandadır.
Mitoz dönemi: Mitoz iğsi, ipliksi anlamına gelen bir sözcüktür. Döneme bu ismin
verilmesinin nedeni, çekirdekte izlenen iğsi, ipliksi görünümdür. Mitoz, vücut hücrelerinde
izlenen bir bölünme şeklidir. Mitoz dönemi 1-3 saat süren ve birbiri peşi sıra devam eden
profaz, metafaz, anafaz ve telofaz dönemlerinden oluşur. Bu süreç hücrenin bu zamana
kadar kabaca iki katına çıkardığı organeller ve genetik malzemenin, eşit olarak ikiye
bölünmesiyle sonlanır. Mitozu oluşturan dört dönem sonunda genetik malzeme ikiye
ayrılırken, son iki dönem olan anafaz ve telofazda sitoplazma ve içerdiği organeller eşit
olarak bölünür.
Hücre siklusunda bir faz tamamlanmadan sonraki faza geçilirse genetik materyal
tam ve doğru kopyalanmadığı için hücrede hasar meydana gelebilir. Hücre siklusunda G1-S
geçişinde, G2-M geçişinde ve metafaz-anafaz geçişinde kontrol noktaları vardır.
Şekil 3. Hücre siklusu (25)
Hücre siklusu siklinler (cyc), siklin bağımlı kinazlar (cdk) ve siklin bağımlı kinaz
inhibitörleri (CKI) tarafından kontrol edilir. Bu proteinlerin düzeyleri hücre siklusunun
farklı fazlarında farklılık gösterir. Cdk’lar G1-S-G2 ve mitoza geçişi kontrol eder (26-28).
Memeli hücrelerinde hücre siklusunun düzenlenmesinde işlevleri bilinen 11 tane cdk ve
16 cyc görev almaktadır (26-30) .
9
Cyc D, E, G1/S fazlarının sınırında geçici olarak sentezlenir, hücre S fazına
geçtiğinde ise yıkılır. Cyc A ve B, S/G2/M fazlarının geçişlerinde sentezlenir, siklin A1
mayoz ve embriyogenesis de, siklin A2 çoğalan vücut hücrelerinde bulunur. Cyc B1’in ve
cyc B2’nin fonksiyonlarını kontrol ettiği düşünülmektedir.
Cdk’lar protein fosforilasyonu yapan enzimlerdir. Cdk’lar, cyce bağlandığında
aktifleşerek aktif Cyc-Cdk komplekslerini oluştururlar. Cyc’ler bu komplekslerin
düzenleyici, Cdk’lar ise katalitik komponentleridir (31).
CKI’lar, Cdk aktivitesini kontrol ederler. Bu proteinler Cyc-Cdk kompleksi
oluşumunu ve DNA replikasyonunu inhibe ederler. CKI’lar hücre siklusunu frenledikleri
için tümör baskılayıcı genlere adaydır.
4.6. KANSER
Organizma, organ ya da doku gelişimi, hücrelerin büyüme ve çoğalmalarını içerdiği
gibi hücre ölümlerini de sağlar. Hücre büyümesi, farklılaşması ve çoğalmasında görevli
olan proto-onkogenlerde meydana gelen mutasyonlar tümör gelişimine, tümör baskılayıcı
genlerde meydana gelen mutasyonlar ise hücre siklusunun inhibisyonunu engelleyerek
anormal hücre büyümesine neden olur.
Apoptozis (programlanmış hücre ölümü); dengelenmiş hücre proliferasyonu ve
dokulardaki hücre sayısının sabit tutulmasından sorumludur. Apoptozis normal hücre
ölümünün yanı sıra mutant hücre çoğalmasını önleyen önemli bir yoldur. Hücre siklusu ve
apoptoziste çok sayıda protein ikili rol oynar. Çevresel faktörlerle meydana gelen DNA
hasarı hücre siklus kontrol mekanizmalarının bozulmasına neden olur. Pek çok kanser
tipinde hücre siklus kontrol noktalarında mutasyonlar belirlenmiştir (26). Büyümenin
durdurulması, DNA onarımı ve apoptozisin engellenmesi kanser gelişiminde kritik öneme
sahiptir (32). Tümör baskılayıcı genlerde mutasyonlar hasarlı hücrelerin hücre sikluslarının
ilerlemesine ve tümör gelişimine neden olur.
Günümüzde birçok maddenin kanser hücreleri üzerine etkileri gerek kimyasal
maddelerle indüklenmiş hayvan modellerinde gerekse kanserli hücreler kullanılan in vitro
modellerde
araştırılmaktadır. Doku kültürlerinde bu amaçla insanlardan veya
hayvanlardan elde edilip hücre hattı haline getirilmiş materyaller kullanılmaktadır.
10
4.7. β-KATENİN MOLEKÜLÜ
β-katenin 781 aminoasitten oluşan, 92kDa’luk bir proteindir. Temel yapısı 100
aminoasitlik bir karboksi-terminal uç, 130 aminoasitlik bir amino uç, 42 aminoasitten
oluşan tekrar bögesi içerir. Tekrar bölgesinin süper helikal tarzda bükülmesi, β-kateninin
kaderin molekülü, adenomatöz polipozis koli (APC), aksin ve T hücre transkripsiyon
faktörü/Lenfoid çoğaltıcı faktörü (TCF/LEF) ailesine bağlanmasını düzenler (33).
β-katenin, sitoplazmada ve plazma hücre membranında yer alır ve hücreler arası adezyonu
düzenleyen kaderin-katenin kompleksinin üyesi olarak görev yapar. Ayrıca β-kateninin
WNT sinyal ileti yolunda da önemli görevleri vardır.
Şekil 4. β-katenin molekülünün yapısı ve β-katenine bağlanan moleküller (34)
11
4.8. WNT SİNYAL İLETİ MEKANİZMASI
Wnt/β-katenin
yolağı omurgalı ve omurgasızlarda embriyonal gelişimde
düzenleyici görevindedir. Wnt ailesi sisteince zengin 19 adet proteinden meydana gelir;
bunlar, Frizzled (Fzd) ailesinin transmembran reseptörlerine bağlanarak, Wnt sinyal
yolunu aktive ederler. Wnt proteinleri, hücresel düzeyde yaşamsal fonksiyonların
düzenlenmesinde rol alır (35). Kanonikal olarak bilinen Wnt 1 sınıfı proteinlerin görevli
olduğu sinyal oluşturma yolunun aktivasyonu, β-kateninin stabilizasyonuna ve
translokasyonuna yol açar. Β-katenin çok fonksiyonlu bir proteindir; zonula aderens
bağlantı kompleksindeki fonkiyonu ile yara iyileşmesinde etkilidir ve bu sinyal yolunda
oluşacak hasarlar kanser gelişimine yol açabilir.
Wnt ligandları Fzd reseptörlerinin ekstraselüler kısımlarına bağlanırlar. Bu
bağlanma Wnt/β-katenin sinyal yolunu aktive eder. Wnt/β-katenin sinyal yolu aktive
olduğunda; Wnt’nin Fzd reseptörüne bağlanması, sitoplazmada Dishevelled (DSH)
proteininin aktif hale geçmesine ve aksin ile bağlanarak Glikojen Sentetaz Kinaz-3β’nin
(GSK-3 β) inhibe olmasına neden olur. Böylece β-katenin fosforilasyonu gerçekleşemez,
β-katenin sitoplazmada birikir. β-kateninin bir kısmı sitoplazmadan nükleusa taşınır.
Burada TCF/LEF transkripsiyonel faktörüne bağlanıp hedef genlerin ( hücre siklusunu
düzenleyen: cyc D1, c-myc; Ekstraselüler matriks bağlantılarının düzenlenmesinde görev
alan: fibronektin, WISP 1; transkripsiyon faktörleri:TCF1, c-jun, fra-1, PPAr delta)
eksprese edilmesini aktive eder.
Wnt/β-katenin sinyal yolu sadece Fzd reseptörleri ve koreseptörleri LRP5 ve LRP6
Wnt ligantları ile kompleks oluşturduğu zaman aktive olur. Wnt sinyal yolu aktif değilse
DSH de aktif değildir. Kazein Kinaz1’in β-katenini serin 45 bölgesinden işaretlemesinin
ardından GSK-3β; threonin 41, serin 35 ve serin 33’ü ardı ardına fosforile eder. Fosforilize
β-katenin β TrCP (β transdusin tekrarları içeren protein) tarafından bağlanır. β TrCP,
β-kateninin proteozom tarafından tanınmasını ve yıkılmasını sağlar. Β-kateninin yıkımı 76
aminoasitten oluşan ubikitin adı verilen bir polipeptidin β-katenine bağlanarak
işaretlemesinin ardından proteozom tarafından gerçekleştirilir (36). Wnt sinyal yolunda
bulunan β-katenin, APC, aksin ve TCF-1 gibi çeşitli proteinler, onkogen veya tümör
baskılayıcı olarak önemli görevlere sahiptir.
12
Şekil 5. Wnt sinyal ileti mekanizması. β-katenin, sinyal yokluğunda yıkılmaktadır.
β-katenin, sinyal varlığında nükleusta birikmektedir (37).
İnsanda pek çok kanser türünde β-kateninin hücrede birikmesine neden olan
mutasyonun rol aldığı bildirilmiştir. β-katenini kodlayan CTNNB-1 geninin ekson 3
bölgesi insan tümörlerinde mutasyonların gelişim noktası olarak tanımlanmıştır. Bu
bölgede oluşan bir mutasyon β-katenindeki ser/thr residülerinin GSK-3β tarafından
fosforile edilmesine engel olarak, β-kateninin hücrede birikmesine yol açar.
13
5. MATERYAL VE YÖNTEM
5.1. KULLANILAN KİMYASALLAR
1) Morinda Citrifolia (noni)
2) Paklitaksel (Taxol)
3) NaCl, Atabay AT091-950
4) Na2HPO4, Riedel-de Häen 81890
5) Na2H2PO4, Riedel-de Häen 8210A
6) HCl, Merck K23226314 632
7) DMEM, Sigma D5546
8) Nutrient mixture F-12, Sigma N6658
9) L-Glutamin, Biological Industries 03-020-IC
10) Penisilin, Streptomisin, Biological Industries 03-031-1C
11) Fetal Sığır Serumu, Seromed S0115
12) Anti-β-katenin antikoru, Cell Signaling Technology, 9562
13) Anti-BrdU antikoru, Neomarkers MS-1058
14) Histostain Plus Kit, Zymed 85-8943
15) Aminoetilkarbazol (AEC), Lab Vision TA-060-HA
16) Metanol, Riedel-DC-Haen 24229
17) Tripsin EDTA, Biological Industries 243338
18) DMSO, Sigma D 2650
19) Borik Asit, Sigma B0252
20) Sodyum Tetra Borat, Sigma B0127
14
5.2. KULLANILAN YÖNTEMLER
5.2.1. Hücre Kültürü
Bu çalışmada İstanbul Bilim Üniversitesi Bilimsel Araştırma laboratuarında uzun
zamandır dondurularak saklanıp, zaman zaman pasajları yapılan sıçan C6 glioma hücre
soyu kullanıldı. C6 glioma hücreleri için besiyeri ortamı; inaktive edilmiş %10 fetal sığır
serumu (FCS) ve antibiyotikler (0,2 mM glutamin, 100 ünite/ml penisilin G, 100 µg/ml
streptomisin) içeren Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle medyumu (DMEM) ile
besleyici karışım Ham’s F12 medyumudur. C6 glioma hücreleri bu besiyeri (DMEM-F12)
içerisinde
37ºC’ de %5 CO2 ve %95 hava içeren inkübatörde büyütüldü. Noninin
etkilerini belirlemek için oluşturulan deney grubunda medyum içerisine 1 mg/ml, 3 mg/ml
ve 10 mg/ml konsantrasyonlarında noni eklendi. Paklitakselin etkilerini belirlemek için
oluşturulan deney grubuna 1 µg/ml, 3µg/ml ve 10 µg/ml konsantrasyonlarında paklitaksel
eklendi. Paklitaksel ve noninin etkilerinin birlikte inceleneceği deney grubuna ise 1 mg/ml
noni ve 1 µg/ml paklitaksel, 3 mg/ml noni ve 3µg/ml paklitaksel, 10 mg/ml noni ve 10
µg/ml paklitaksel birlikte uygulandı. Tüm çalışma gruplarında 24 saatlik inkübasyon
sonrasında deney sonlandırıldı.
5.2.2. Hücre Proliferasyonunun Belirlenmesi
5.2.2.1. β-katenin İmmünositokimyası
β-kateninin immünositokimyasal incelemesi için lameller üzerine ekilmiş olan
hücreler -20ºC de metanol ile fikse edildi. Spesifik olmayan boyanmaları engellemek için
non-immün serumla (Histostain Plus Kit, Zymed) 20 dakika bloking işlemi uygulandı.
Bloking işleminin ardından anti-β-katenin primer antikoru ile 3.5µl/ml dilüsyonda oda
ısısında 1 saat inkübe edildi. Sonrasında biotinle işaretli sekonder antikor 20 dakika
uygulandı. PBS ile yıkamanın ardından streptavidin ile 20 dakika inkübasyon
gerçekleştirildi. Yıkamaları takiben AEC kromojeni uygulandı. Kromojen uygulaması
sonucu ortaya çıkan spesifik kırmızı renk reaksiyonu Olympus BX 50 ışık mikroskobunda
değerlendirildi.
15
5.2.2.2. Bromodeoksiuridin (BrdU) İmmünositokimyası
Hücreler lameller üzerinde ekildikten 2 gün sonra PBS ile yıkandı. Ardından 5
dakika -20ºC’de metanol ile fikse edildi. Proliferasyon indeksi belirlenmesi için S fazına
özgü BrdU işaretlemesi kullanıldı. Anti-BrdU monoklonal antikoru ile boyama yapılacak
hücreler fiksasyondan önce 5-bromo-2-deoksiuridin (1mM) ile 1 saat 37ºC’de inkübe
edildi. PBS yıkamaları sonrasında hücrelerin DNA’sı 2N HCl ile 37ºC’de 30 dakika
denature edildi. Borat tampon ile nötralize edildikten sonra PBS yıkamaları yapıldı.
Sonrasında bloking işlemi yapıldı (Histostain Plus Kit, Zymed). Anti-BrdU Mouse
monoklonal antikoru ile 1 saat oda ısısında inkübasyona bırakıldı. Streptavidin ve biotinHRP bağlı sekonder antikorlarla 20’şer dakika inkübe edildi (Histostain Plus Kit, Zymed).
AEC kromojeni uygulaması sonucu oluşan kırmızı renk reaksiyonu Olympus BX 50 ışık
mikroskobunda değerlendirildi.
16
6. BULGULAR
6.1. MORİNDA CİTRİFOLİA VE PAKLİTAKSELİN C6 GLİOMA
HÜCRELERİNDE
PROLİFERASYON
ÜZERİNE
ETKİLERİNİN
BROMODEOKSİÜRİDİN İLE GÖSTERİLMESİ
Morinda citrifolia ekstresi ve paklitakselin glioma C6 hücrelerinde proliferasyon
üzerine etkileri hücre siklusunda S fazındaki hücrelerin işaretlenmesi temeline dayanan
BrdU immünositokimyası ile gösterildi.
Resim 1A, B: Kontrol grubu C6 glioma hücrelerinde BrdU işaretli S fazındaki
hücreler (A). Noni ekstresi uygulanan C6 glioma hücrelerinde işaretli S faz hücreleri ve
BrdU inkorporasyonunda azalma görülmekte (B). X600
17
Resim 1C, D: Noni ekstresi ve paklitaksel birlikte uygulanan C6 glioma
hücrelerinde (C) ve sadece paklitaksel uygulanan C6 glioma hücrelerinde (D) BrdU
inkorporasyonu izlenmedi. X600
Kontrol grubu hücrelerde saptanan BrdU işaretli S faz hücreleri oranı ile
karşılaştırıldığında 24 saatlik noni ekstresi inkübasyonu sonrasında BrdU işaretli hücre
oranında azalma saptandı. Sadece paklitaksel ve noni ektresi ile birlikte paklitaksel
uygulanan deney grupları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında deney gruplarında S fazında
hiç hücre gözlenmedi (Resim 1 A,B,C,D).
18
6.2. MORİNDA CİTRİFOLİA VE PAKLİTAKSELİN C6 GLİOMA
HÜCRELERİNDE
β-KATENİN
EKSPRESYONU
ÜZERİNE
ETKİLERİ
Resim 2A, B, C, D: Kontrol grubunda (A), 1mg/ml noni ekstresi uygulanan grupta
(B), 3mg/ml noni ekstresi uygulanan grupta (C), 10mg/ml noni ekstresi uygulanan grupta
β-katenin ekspresyonu. X600
β-katenin ekspresyonu glioma hücrelerinde plazma membranının intraselüler
sınırları boyunca izlendi. Noni ekstresi inkübasyonu sonrasında, hücrelerde β-katenin
ekspresyonunda ve lokalizasyonunda bir değişiklik gözlenmedi. Ekspresyon kontrol grubu
hücrelerdeki gibi plazma membranı seviyesinde izlendi (Resim 2A,B,C,D).
19
Resim 3A, B, C, D: Kontrol grubunda (A), 1µg/ml paklitaksel uygulanan grupta
(B), 3µg/ml paklitaksel uygulanan grupta (C), 10µg/ml paklitaksel uygulanan grupta (D)
β-katenin ekspresyonu. X600
Paklitaksel inkübasyonu sonrasında, 1µg ve 3µg uygulanan deney grubunda nükleus
seviyesinde β-katenin ekspresyonu izlendi. (Resim 3B, 3C), 10µg uygulanan deney
grubunda sadece sitoplazmada ve periferde β-katenin gözlendi (Resim 3D).
20
Resim 4A, B, C, D: Kontrol grubunda (A), 1µg/ml paklitaksel ve 1mg/ml noni
ekstresi uygulanan grupta (B), 3µg/ml paklitaksel ve 3mg/ml noni ekstresi uygulanan
grupta (C), 10µg/ml paklitaksel ve 10mg/ml noni ekstresi uygulanan grupta (D) β-katenin
ekspresyonu. X600
Yalnızca paklitaksel uygulanan grupla karşılaştırıldığında, paklitaksel ve noni
ekstresinin kombine uygulandığı deney grubunda β-katenin ekspresyon düzeylerinde ve
lokalizasyonunda bir değişiklik meydana gelmedi (Resim 4A,B,C,D).
21
7. TARTIŞMA
Noni olarak da bilinen Morinda citrifolia birçok hastalığın tedavisinde ve ideal
sağlık koşullarının oluşturulmasında kullanılan deniz seviyesinden yüksekteki ormanlık
alanlarda bulunan bir ağaçtır. Paklitaksel ise genellikle akciğer, göğüs, baş-boyun bölgesi
tümörlerinin kemoterapisinde kullanılan Porsuk ağacının kabuğundan elde edilmiş olan
doğal bir alkoloidtir. Çalışmada in vitro C6 glioma hücre modelinde Morinda citrifolia
(noni) ekstresi ve paklitakselin farklı konsantrasyonlarının β-katenin sinyal yolu ile hücre
proliferasyonunda meydana getirdiği değişiklikler immünositokimyasal olarak incelendi.
Çalışmamızın sonucunda plazma membranında bulunan adezyon molekülü β-katenin
ekspresyonunun noni ekstresi uygulamasıyla değişmediği, düşük dozda paklitaksel
uygulamasında nükleustaki β-katenin ekspresyonunun
arttığı izlendi. Bu sonuç
paklitakselin düşük dozlarında β-kateninin transkripsiyon faktörü olarak etkili olduğunu,
paklitakselin yüksek dozlarının ise Wnt sinyal yolu üzerinde etkili olmadığını düşündürür.
Ishikawa hücreleriyle yapılan bir çalışmada Tian Long adlı tıbbi bitkinin suda
çözünen ekstresinin BrdU yöntemiyle proliferasyon üzerine olan etkileri gözlenmiştir.
Bulunan sonuçların Tian Long ekstresinin uygulamasının endometrial karsinomda
antitümör aktivitenin hangi mekanizma ile etkili olduğunun belirlenmesinin ardından daha
ümit verici olacağı ileri sürülmektedir (38).
SW480 kolon kanseri hücre soylarında yapılan bir çalışmada Eleutherine palmifolia
ekstresinin uygulanmasının ardında TCF/β-katenin transkripsiyonun inhibisyonunun doza
bağımlı olduğu görülmüştür (39).
Litchi meyvesinin perikarpının ekstresinin insan meme kanseri hücre soylarına
uygulanmasıyla yapılan çalışmada litchi ekstresinin zamana ve doza bağlı olarak hücre
büyümesi ve BrdU inkorporasyonu üzerine inhibisyon etkisi yaptığı izlenmiştir (40).
Waldschager ve arkadaşları keten tohumundan izole edilen değişik molekülleri bir
trofoblast tümörü olan Jeg3’de kullanarak BrdU yöntemiyle inhibitör etkisini
göstermişlerdir (41).
Knöpfl- Sidler ve arkadaşları HELA-S3, MOLT-4, MFM-223, COR-L51, KPL-1 ve
UM-CUB1 tümör hücrelerinde çeşitli Viscum album (ökseotu) fraksiyonlarını kullanarak,
başta BrdU yöntemi olmak üzere farklı yöntemlerle tümör hücreleri üzerinde büyümeyi
durdurucu etkisi olduğunu göstermişlerdir (42).
22
Santa Maria Margalef ve arkadaşları Psegeum africanumun insan prostat kanseri
hücrelerindeki etkilerini araştırmışlar ve çalışma sonucunda Psegeum africanum’un
epidermal büyüme faktörlerinin mitojenik etkisini inhibe ettiğini ve hücre siklusunda
G1’den S fazına geçişi bloke ettiğini gözlemişlerdir (43).
Biz de çalışmamızda kontrol grubu hücrelerde saptanan BrdU işaretli S faz hücreleri
oranı ile karşılaştırıldığında 24 saatlik noni ekstresi inkübasyonu sonrasında BrdU işaretli
hücre oranında azalma gözledik. Sadece paklitaksel ve noni ektresi ile birlikte paklitaksel
uygulanan deney grupları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında deney gruplarında S fazında
hiç hücre gözlenmedi.
Azoksimetanla uyarılmış kolon kanseri oluşturulmuş erkek F344 soyu sıçanlarla
yapılan bir çalışmada PCNA işaretleme yöntemi kullanarak Terminalia catappa (hint
bademi) bitkisinin etkileri incelenmiştir. Hint bademi bitkisinin kısa dönemde kolon
karsinogenezis belirteçleri üzerinde etkili olduğu görülmüştür (44).
Misikangas ve arkadaşları barsak kanseri oluşturulmuş farelerle yaptıkları çalışmada
3 Nordic berry (Kuzey Avrupa yaban çileği) türünün β-katenin sinyal ileti yolu ve bazı
moleküler mekanizmalar üzerindeki etkilerini izlemişler ve yabani ağaç çileğinin bir
türüyle beslenen barsak kanserli farelerin hücrelerinde nükleer β-katenin seviyelerinde artış
gözlemişlerdir (45).
Bizde çalışmamızda noninin ve paklitaselin etkilerini incelediğimizde, hücrelerde
β-katenin ekspresyonunda ve lokalizasyonunda bir değişiklik olmadığını, düşük dozda
paklitaksel uygulamasında plazma membranında lokalize β-kateninin nükleusa transfer
olduğunu gözledik. Noni ekstresi ve paklitakselin kombine uygulanmasında ise
paklitaselin, antitümöral ajan etkisinde olmadığını ve β-katenin ekspresyon ve
lokalizasyonunda bir değişiklik oluşmadığını gözledik.
23
8. SONUÇ
Noni ekstresi tek başına verildiğinde BrdU ile işaretlenmiş S fazındaki hücrelerin
azaldığını görmemiz; noni ekstresinin proliferasyonu azalttığını, paklitaksel ile kombine
edildiğinde, tek paklitaksel uygulaması yapıldığındaki sonuçlarla yakın sonuçlar elde
edildiğini gördük. Paklitaksel tek uygulandığında S fazındaki hücreleri tamamen ortadan
kaldırması nedeniyle kombine kullanımda noni ekstresinin katkısının olup olmadığını
yorumlayamıyoruz. Bu konuda paklitakselin daha düşük dozlarıyla noni ekstresi kombine
uygulanırsa hücre proliferasyon inhibisyonunda
noninin paklitaksele katkısı olup
olmadığını yorumlayabiliriz.
Paklitaksel uyguladığımız hücrelerde inhibisyon beklenen bir sonuçtu. Noninin
uygulandığı
gruplarda
metabolizmasında
etkisi
kontrole
göre
olmadığını
bir
fark
bulmamamız
göstermektedir.
Buna
onun
β-katenin
karşılık
β-katenin
metabolizmasını doza bağlı olarak inhibe eden paklitakselle kombine uygulanan noni
ekstresinin paklitakselin inhibisyon etkisi üzerinde olumsuz rol oynadığı izlenmiştir.
Dolayısıyla başka çalışmalar da bunu teyid ederse ikisinin birlikte antitümöral etki için
kullanılmaması gerektiği anlaşılmaktadır.
24
9. TEŞEKKÜR
Yüksek Lisans çalışmamda bana yardımcı olan ve desteğini hiç esirgemeyen değerli
danışman hocam Prof. Dr. Tuncay ALTUĞ’a teşekkür ederim. Çalışmam sırasında
bilgilerini ve tecrübelerini benimle paylaşan değerli hocam Doç. Dr. Meral KOYUTÜRK’e
teşekkür ederim. Çalışmamızda kullandığımız malzemelerin temininde yardımcı olan
Dr. Elif İlkay TAŞKIN’a ve Msc. Bio. Ayşegül
Deneylerim
sırasında
Msc.
Melike
Bio.
laboratuarda
ERSÖZ’e,
yardımlarını
Enstitü
KAPUCU’ya teşekkür ederim.
esirgemeyen
Sekreterimiz
sevgili
sevgili
arkadaşım
arkadaşım
İlknur
KARAOSMANOĞLU’na destekleri için teşekkür ederim.
Sevgili aileme ve tüm dostlarıma bana destek oldukları ve varlıklarını her zaman
yanımda hissettirdikleri için teşekkür ederim.
25
10. KAYNAKLAR
1. Whistler WA. Traditional and herbal medicine in the cook islands. Ethnopharm J.
1985; 13: 239-280.
2. Grobben B, De Deyn PP, Slegers H. Rat C6 glioma as experimental model system for
the study of glioblastoma growth and invasion. Cell Tissue Res. 2002; 310(3):257-270.
3. Kliehues P, Burger PC, Scheithauer BW. WHO International Histological Classification
of Tumors: In Histological typing of tumours of the central Nervous System.
Springer-Verlag 1993.
4. Whistler W. Tongan herbal medicine. Isle Botanica, Honolulu, Hawaii, 1992; 89-90.
5. Wang MY, Brett JW, Jarakae CJ, Diane N, Su C, Afa KP, Gary . Morinda citrifolia
(noni): A literature review and recent advances in noni research. Acta Pharmacol Sin.
2002;23 (12):1127-1141.
6. Levand O, Larson HO. Some chemical constituents of Morinda citrifolia. Planta Med.
1979; 36: 186-187.
7. Farine JP, Legal L, Moreteau B, Le Quere JL. Volatile components of ripe fruits of
Morinda citrifolia and their effects on Drosophila. Phytochemistry 1996; 41: 433-438.
8. Higa I, Fuyama Y. Genetics of food preference in Drosophila sechellia. Responses to
food attractants. Genetica 1993; 88: 129-136.
9. Peerzada N, Renaud S, Ryan P. Vitamin C and elemental compos ition of some
bushfruits. J Plant Nutr. 1990; 13: 787-793.
10. Budavari S, O’Neil MJ, Smith A, Heckelman PE. In: The Merck Index. An
encyclopedia of chemicals, drugs , and biologicals. Merck & Co Inc, Rathway, 1989.
11. Moorthy NK, Reddy GS. Preliminary phytochemical and pharmacological study of
Morinda citrifolia, Linn. Antiseptic 1970; 67: 167-171.
12. Daulatabad CD, Mulla GM, Mirajikar AM. Riconoleic acid in Morinda citrifolia seed
oil. Oil Technologists’ Association of India 1989; 21: 26-27.
13. Balakrishna S, Seshadri TR, Venkataramani B. Special chemical component of
commercial woods and related plant materials: Part X-Heartwood of Morinda citrifolia
Linn. J Sci Industrial Res 1961; 20B: 331-333.
14. Legal L, David JR, Jallon JM. Molecular basis of Morinda citrifolia (L.): toxicity on
Drosophila. J Chem Ecolog 1994; 20: 1931-1943.
26
15. Singh J, Tiwari RD. Flavone glycosides from the flowers of Morinda citrifolia. J
Indian Chem Soc 1976; 53: 424.
16. Simonsen JL. Note on the constituents of Morinda citrifolia. J Chem Soc
1920; 117: 561-564.
17. Heinicke R. The pharmacologically active ingredient of Noni. Bulletin of the National
Tropical Botanical Garden, 1985.
18. Atkinson N. Antibacterial substances from flowering plants. Antibacterial activity of
dried Australian plants by a rapid direct plate test. Australian J Exper Biol 1956; 34: 17-26.
19. Hirazumi A, Furusawa E, Chou SC, Hokama Y. Immunomodulation contributes to the
anticancer activity of Morinda citrifolia (noni) fruit juice. Proc West Pharmacol Soc
1996; 39: 7-9.
20. Hokama Y. The effect of Noni fruit extract (Morinda citrifolia, Indian mulberry) on
thymocytes of BALB/c mouse. FASEB J 1993; 7: A866.
21. Youngken HW, Jenkins H J, Butler CL. Studies on Morinda citrifolia L.
J Am Pharm Assoc 1960; 49: 271-273.
22. Schiff, P. B., Fant, J. ve Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by
taxol, Nature,1979; 277, 665-667.
23. Rowinsky, E. K. The development and clinical utility of the taxane class of antimicro
tubule chemotherapy agents, Annu Rev of Medicine.,1997;48: 353-374.
24. en.wikipedia.org/wiki/Portal:Organic_chemistry
25. Andrew CG Porter. Preventing DNA over-replication: a Cdk perspective. Cell Div
2008; 3: 1747-1028.
26. Vermeulen K, VanBockstaele DR, Berneman Z N. The cell cycle : a review of
regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Prolif 2003; 36: 131-149.
27. Vermeulen K, Berneman ZN, vanBockstaele DR. Cell cycle and apoptosis. Cell Prolif
2003; 36: 165-175.
28. Foster I. Cancer: A cell cycle defect. Radiography 2008; 14: 144-149.
29. Kearns WG, Liu JM. Cell cycle checkpoint genes and aneuploidy:A short review. Curr.
Genomics 2001; 2:171-180.
30. Giacinti C, Giordano A. RB and cell cycle progression. Oncogene 2006; 25: 52205227.
27
31. Flatt PM, Pietenpol JA. Mechanisms of cell-cycle checkpoints: at the cross roads of
carcinogenesis and drug discovery. Drug Metab Rev 2000; 32: 283-305.
32. Bellamy COC. p53 and apoptosis. Br Med Bull 1996; 53(3): 522-538.
33. Luu HH, Zhang R, Haydon RC, Rayburn E, Kang Q, Si W, et al. Wnt/B-catenin
signaling pathway as novel cancer drug targets. Curr Cancer Drug Targets
2004; 4: 653–671.
34. Nusse R and K Willert. (1998). Beta-catenin: a key mediator of Wnt signaling. Curr.
Opinion in Genetics & Dev.1998; 8:95-102.
35. Hagen T, Sethi JK, Foxwell N, Vidal-Puig A. Signalling activity of beta-catenin
targeted to different subcellular compartments. Biochem J. 2004; 379: 471–477.
36. Amit, S., Hatzubai, A., Birman, Y., Andersen, J. S., Ben-Shushan, E., Mann, M., BenNeriah, Y., and Alkalay, I. Axin-mediated CKI phosphorylation of beta-catenin at Ser 45: a
molecular switch for the Wnt pathway. Genes Dev.2002;16:1066–1076.
37. www.cellsignal.com/.../Wnt_beta_Catenin.html
38. Li ZL, Morishima S, Tang JT, Otsuki Y. Apoptotic effects of Tian- Long compound
on endometrial adenocarsinoma cells in vitro. Med Mol Morphol J. 2009 ;42(1):32-39.
39. Li X, Ohtsuki T, Koyano T, Kowithayakorn T, İshibasi M. New Wnt/beta-catenin
signaling inhibitors isolated from Eleutherine palmifolia. Chem Aian J, 2009;4(4):540-7
40. Wang X, Yuan S, Wang J, Lin P, Liu G, Lu Y, Zhang J, Wang W, Wei Y. Anticancer
activity of litchi fruit pericarp extract against human breast cancer in vitro and in vivo.
Toxicol Appl Pharmacol. 2006; 215(2):168-178
41. Waldschlager J, Bergemann C, Ruth W, Effmert U, Jesche U, Richter DU, Kragl U,
Piechulla B, Briese V. Flax-seed extracts with phtoestrogenic effects on a hormone
receptor-positive tumor cell line. Anticanser Res. 2005;25 (3A):1817-22
42. Knöpfl-Sidler F, Viviani A, Rist L, Hensel A, Human cancer cells exhibit in vitro
individual receptiveness towards different mistletoe extracts. Pharmazie. 2005; 60
(6): 448-454.
43. Santa Maria Margalef A, Paciucci Barzanti R, Reventos Puigjaner J, Morote Robles J,
Thomson Okatsu TM. Antimitogenic effect of Pygeum africanum extracts on human
prostatic cancer cell lines and explants from being prostatic hyperplasia. Arch Esp Urol.
2003; 56(4):369-78
28
44. Morioka T, Suzui M, Nabandith V, Inamine V, Aniya Y, Nakayama T, Ichiba T,
Yoshimi N. Eur J Cancer Prev. 2005; 14(2):101-105
45. Misikangas M, Pajari AM, Päivärinta E, Oikarinen SI, Rajakangas J, Marttinen M,
Tanayama H, Törrönen R, Mutanen M. Three Nordic berries inhibit intestinal
tumorigenesis in multiple intestinal neoplasia/+ mice by modulating beta-catenin signaling
in the tumor and transcription in the mucosa. J Nutr. 2007;137(10):2285-2290
29
Download

c6 glioma hücrelerinde morinda citrifolia ve paklitakselin etkilerinin