Olgu Sunumu/Case Report
Mikrobiyol Bul 2014; 48(4): 683-688
Türkiye’de İlk
İ Kez Saptanan
Hepatit B Virus Genotip E Enfeksiyonu*
Hepatitis B Virus Genotype E Infection in Turkey:
The Detection of the First Case
Murat SAYAN1, Tamer ŞANLIDAĞ2, Sinem AKÇALI2, Ayşe ARIKAN3
1
1
2
2
3
3
Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Merkez Laboratuvarı, Kocaeli.
Kocaeli University Medical School Hospital, Central Laboratory, Kocaeli, Turkey.
Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Manisa.
Celal Bayar University Faculty of Medicine, Department of Medical Microbiology, Manisa, Turkey.
Yakın Doğu Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Merkez Laboratuvarı, Lefkoşa, KKTC.
Near East University Medical School Hospital, Central Laboratory, Nicosia, TRNC.
* XVI. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi (13-17 Mart 2013, Antalya)’nde sunulmuştur.
Geliş Tarihi (Received): 05.05.2014 • Kabul Ediliş Tarihi (Accepted): 14.07.2014
ÖZET
Hepatit B virusu (HBV) enfeksiyonları, tüm dünyada önemli bir halk sağlığı sorunudur. HBV, nükleik
asit dizi heterojenitesine göre tanımlanan 10 genotip (A-J) içermekte ve bu genotiplerin dünya üzerindeki
dağılımı coğrafi bölgelere göre farklılıklar göstermektedir. Ülkemizin değişik bölgelerinde yapılan çalışmalarda, genotip D’nin baskın olduğu gösterilmiş, ancak diğer HBV genotiplerinin de varlığı bildirilmiştir.
HBV genotip E hakkındaki epidemiyolojik ve klinik bilgiler sınırlı olsa da, Batı ve Ortadoğu Afrika’da yaygın
olarak bulunduğu bilinmektedir. Bu raporda, ülkemizde ilk kez tanımlanan bir HBV genotip E enfeksiyonu
olgusunun sunulması amaçlanmıştır. Beş yıldır Manisa’da ikamet eden ve iş hayatına sahip 22 yaşında
Nijerya uyruklu bir erkek olgu, rutin sağlık tarama testleri için Celal Bayar Üniversitesi Hastanesine başvurmuştur. Yapılan tetkikler arasında HBsAg testinin pozitif olarak saptanması üzerine hastadan yeni kan
örneği alınarak HBV belirteçleri ayrıntılı olarak araştırılmıştır. Hastanın laboratuvar bulguları; HBsAg 21
IU/ml, anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc (+), anti-HCV (-), anti-HIV (-), ALT: 44 U/L, AST: 45
U/L olarak belirlenmiş; gerçek zamanlı PCR yöntemiyle (Artus HBV QS RGQ Qiagen, Almanya) HBV-DNA
düzeyi 700 IU/ml olarak saptanmıştır. Hastanın serum örneğinden izole edilen HBV-DNA’sı PCR ile çoğaltılmış ve HBV polimeraz gen bölgesi direkt dizileme yöntemiyle dizilenmiştir. Virusun genotipi, UPGMA
yöntemi ile yapılan filogenetik analiz ve hastada olası çoklu HBV genotip enfeksiyonunun belirlenmesi
amacıyla uygulanan Inno-LiPA HBV genotiplendirme (Innogenetics, Belçika) yöntemi ile genotip E olarak
belirlenmiştir. HBV izolatının polimeraz geni parsiyel dizileri, global sürveyansa katkı sağlaması amacıyla
uluslararası DNA veri bankasına (Gen Bank) yüklenmiştir. Ülkemizde ilk kez bildirilen bu olgu, Türkiye’de
İletişim (Correspondence):: Prof. Dr. Tamer Şanlıdağ, Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim
Dalı,
l 45030
030 Manisa,
i
Türkiye.
ü ki
Tell ((Phone):
h
): +90
90 236 233 1920/423,
1920/ 23 E-posta (E-mail):
(
il): [email protected]
lid @ h
Türkiye’de İlk Kez Saptanan Hepatit B Virus Genotip E Enfeksiyonu
yaygın olan HBV genotip D dışında diğer genotiplerin de olabileceğini vurgulamaktadır. Olgumuz, ülkemize gelmeden önce de inaktif HBsAg taşıyıcısı olduğundan importe olgu özelliği taşımaktadır. Sonuç
olarak, farklı HBV genotiplerinin tanımlanması ve epidemiyolojik ve moleküler özelliklerinin belirlenmesi,
ulusal ve global HBV sürveyansı açısından önemli olabileceği gibi, genotip tayininin yapılması, klinik
yaklaşımların da daha bilinçli olmasına olanak sağlayabilir.
Anahtar sözcükler:: Hepatit B virusu; genotip E; Manisa.
ABSTRACT
Hepatitis B virus (HBV) infection is a global major health problem. Currently, 10 genotypes (A-J)
of hepatitis B virus (HBV) are identified based on the nucleic acid sequence heterogeneity, and these
genotypes have been shown to have distinct geographic distribution. Reports of the previous studies
indicated that the genotype D is the predominant type among hepatitis B patients in different regions
of Turkey. However, recent studies indicated that other HBV genotypes are also seen with an increasing
rate. Although epidemiological and clinical information on genotype E infection is currently limited, it is
known that genotype E infection is common in West and Central Africa. In this report, the first case of
HBV genotype E infection in Turkey was presented. A 22-year-old Nigerian male employee who resided
in Manisa for five years was admitted to Celal Bayar University Hospital Manisa, Turkey, for his routine
check-up. Since HBsAg was found positive, other HBV markers were tested with a repeated serum sample. Laboratory findings were as follows; HBsAg (+), anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc (+),
anti-HCV (-), anti-HIV (-), ALT: 44 U/L and AST: 45 U/L. HBV-DNA level was detected as 700 IU/ml by
real-time PCR (Artus HBV QS RGQ Qiagen, Germany). HBV-DNA isolated from the serum sample of the
patient was amplified by PCR and polymerase gene segment of HBV was directly sequenced. UPGMA
method was used for phylogenetic analysis and Inno-LIPA HBV genotyping method (Innogenetics,
Belgium) was performed to determine multiple HBV genotype infection. On the basis of those methods
the genotype of the virus was identified as genotype E. The partial sequences of the HBV polymerase
gene were loaded to the international DNA data bank (GenBank) for contribution to the global HBV
surveillance. This report emphasized that besides genotype D the other HBV genotypes could be found
in Turkey. Since the patient was an inactive HBsAg carrier before his residence in Turkey, this case was
regarded as an imported HBV genotype E case. In conclusion, detection of different HBV genotypes,
their epidemiology and molecular characteristics are important for both national and global HBV surveillance and better clinical approach.
Key words:: Hepatitis B virus; genotype E; Turkey.
GİRİŞ
Hepatit B virusu (HBV), nükleik asit dizi heterojenitesine göre kesinleşmiş 8 farklı
genotipte (A-H) sınıflandırılmaktadır1. Farklı genotiplerin varlığında, hastalığın klinik
seyrinde ve tedavi yanıtında farklılıklar izlenebilmektedir. Bu nedenle HBV enfeksiyonlarında genotipin bilinmesi, hastalığın seyrinin öngörülmesi ve uygun tedavi seçeneğinin
belirlenmesi açısından önemli olabilir2,3.
HBV genotiplerinin dağılımı coğrafik farklılıklar göstermektedir. Kuzey Avrupa, ABD
ve Orta Afrika’da genotip A; Asya’da genotip B ve C; Güney Avrupa, Ortadoğu ve
Hindistan’da genotip D; Afrika’da genotip E; Orta ve Güney Amerika’da özellikle Pasifik
okyanusundaki adalarda (Polinezya) genotip F ve ABD ve Fransa’da genotip G sık görül-
684
MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ
Sayan M, Şanlıdağ T, Akçalı S, Arıkan A.
mektedir. Genotip H ise, ilk olarak ABD ve Nikaragua’da tanımlanmış daha sonra Orta
Amerika, Meksika ve Japonya’dan bildirilmiştir2,4-6. HBV yüzey antijeni (HBsAg) prevalansına göre orta düzeyde endemik (%2-7) bölge karakteri gösteren ülkemizde, genotip
dağılımı incelendiğinde, HBV genotip D’nin predominant olduğu görülmektedir7. Öte
yandan, Kocaeli’nde genotip A, Adana’da genotip G ve Konya’da genotip H ile enfekte kronik hepatit B olguları bildirilmiştir7-9. Bu raporda, Türkiye’de tanımlanan ilk HBV
genotip E enfeksiyonu olgusunun sunulması amaçlanmıştır.
OLGU SUNUMU
Ülkemizde ikamet eden ve çalışan Nijerya uyruklu 22 yaşındaki erkek hasta, rutin
tarama testlerini (HBsAg, anti-HCV, anti-HIV) yaptırmak üzere Celal Bayar Üniversitesi
Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarına başvurdu. Yaptırdığı tetkikler arasında HBsAg (19
IU/ml) pozitifliğinin saptanması üzerine aynı kişiden yeni kan örneği istendi ve HBsAg
testi tekrarlanarak diğer tüm hepatit belirteçleri kemilüminesans yöntemiyle araştırıldı.
Laboratuvar testlerinde; HBsAg 21 IU/ml, anti-HBs (-), HBeAg (-), anti-HBe (+), anti-HBc
(+), anti-HCV (-), anti-HIV (-) ve karaciğer enzimleri ALT/AST: 44/45 IU/ml olarak tespit
edildi. Serum HBV-DNA düzeyi, gerçek zamanlı PCR yöntemiyle (Artus HBV QS RGQ
Qiagen, Almanya) 700 IU/ml olarak saptandı.
HBV Dizi Analizi
HBV poll geninin (ters transkriptaz; rt bölgesi, 80-250. aminoasitler arası) dizi analizi
için serum örneğinden HBV-DNA izole edildi (Anatolia Geneworks, Bosphore® Viral
DNA Extraction Spin Kit ve Magnesia® 16 Magnetic Bead Extraction System, Istanbul,
Türkiye). HBV poll geni amplifikasyonu (742 bp) için ileri (F:5’-tcgtggtggacttctctcaatt-3’)
ve geri (R:5’-cgttgacagactttccaatcaat-3’) primerler kullanıldı. PCR koşulları; 95°C’de 10
dk ön denatürasyon, ardından 35 döngü 95°C’de 45 sn 60°C’de 45 sn ve 72°C’de 45
sn olarak uygulandı7. Tüm PCR ürünleri High Pure PCR Product Purification Kit (Roche
Diagnostics, Almanya) ile saflaştırıldı. Dizileme protokolünde Phire Hot Start DNA polimeraz (Finnzymes Oy, Finlandiya) enzimi kullanıldı ve yöntem, The BigDye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc. NJ, ABD), 36 cm kapiller
ve POP-7 TM polimer (Applied Biosystems Inc., CA, ABD) kullanılarak üretici firmanın
önerileri doğrultusunda (http://www.appliedbiosystems.com) ABI PRISM 3130 (Applied
Biosystems Inc., CA, ABD) platformunda gerçekleştirildi.
Filogenetik Analiz
HBV genotipi, Neighbore-Joining metodu kullanılarak filogenetik olarak analiz edildi.
Bu amaçla oluşturulan filogenetik ağaç Şekil 1’de gösterildi. Hastadan izole edilen HBV
suşu, genotip E olarak tanımlandı. Filogenetik ağaç yapımına poll geni dizisi kullanıldı ve
Bootstrap değeri 100 olarak alındı. Kullanılan referans diziler GenBank’tan (www.nvbi.
nih.gov) sağlandı. Hastadan izole edilen genotip E izolatının poll geni dizisi (parsiyel)
GenBank’a yüklendi ve bir erişim numarası sağlandı (KC495968.1).
MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ
685
Türkiye’de İlk Kez Saptanan Hepatit B Virus Genotip E Enfeksiyonu
Şekil 1. HBV pol geni dizisinin filogenetik analizi [Filogenetik ağaç, HBV ters transkriptaz kangalı (~490
bp alignment) dizilenerek ve Neighbor-Joining metodu kullanılarak oluşturulmuştur. Bootstrap değeri 100
olarak seçilmiştir. Filogenetik ağacın oluşturulmasında CLC Sequence Wiever 6.7.1 (CLC bio A/S, Danimarka)
programı kullanılmıştır. HBV Genotip A: EU185788, B:AB602818, C: AY066028, D: AY796031, E:HM363609,
F: DQ823094, G: GU563556, H: AB516395 referans dizileri GenBank’tan sağlanmıştır].
Şekil 2. Inno-Lipa yöntemiyle genotip E olarak belirlenen HBV Manisa suşu (Inno-Lipa HBV Genotyping Strip,
Innogenetics, Belçika).
686
MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ
Sayan M, Şanlıdağ T, Akçalı S, Arıkan A.
LiPA (Line Probe Assay) Yöntemi
HBV-DNA, üretici firmanın önerileri doğrultusunda hasta örneğinden yeniden izole
edildi ve Inno-LiPA HBV genotipleme kiti (Innogenetics, Belçika) kullanılarak HBV suşu
(TS/2012/Manisa) genotip E olarak tanımlandı (Şekil 2).
TARTIŞMA
Bu çalışmada, Türkiye’de kronik hepatit B’li bir hastada ilk kez genotip E enfeksiyonu
bildirilmektedir. HBV genotip E, sadece Batı Afrika’da endemik bir genotiptir. HBV’nin
diğer genotiplerinin aksine alt genotipleri bulunmamaktadır13,14. Ülkemizde yapılan
çalışmalara göre HBV genotip D predominant, genotip A, G ve H olgular şeklinde bildirilmiştir7,12. HBV genotiplerinin birbirlerinden farklı özelliklere sahip olmaları kliniği
ve antiviral tedaviyi etkileyebilmektedir10,11. Bu açıdan HBV genotip tayininin yapılması
klinik açıdan önemli olabilir.
HBV genotiplendirmesinde altın standart yöntem, popülasyon temelli DNA dizileme
tekniği ile elde edilen nükleotid dizilerinin filogenetik analizidir. Ancak hem belirlenen
genotipin farklı bir analiz tekniği ile doğrulanması hem de hastada çoklu HBV genotip
enfeksiyonunun belirlenmesi amacıyla Inno-LiPA HBV genotiplendirme tekniği kullanılmıştır. Çalışmamızda, hastada çoklu HBV enfeksiyonu saptanmamış ve HBV suşu her iki
yöntemle de genotip E olarak belirlenmiştir. Öte yandan DNA dizileme ile elde edilen
nükleotid dizilerinin uluslararası dizi veri havuzu olan GenBank’a yüklenmesi ve böylece
global sürveyansa katkı yapılması mümkün olabilmektedir15.
Olgumuz, ülkemizde 5 yıldan bu yana ikamet etmektedir. Olgu, ülkemize gelmeden
önce de inaktif HBsAg taşıyıcısı olduğunu ifade ettiğinden, importe olgu özelliği taşımaktadır. Olgunun ülkemizde ikamet ediyor ve çalışıyor olması genotip E’nin yayılması
açısından önemli olabilir. Ülkemizde önümüzdeki dönemde yabancı uyruklu kişilerin ve/
veya mültecilerin sayılarının artmasına bağlı olarak farklı HBV genotip enfeksiyonlarını
tanımlamak mümkün olacaktır. Bu nedenle filogenetik analiz ile genotip D dışındaki HBV
genotiplerinin tanımlanması, dolaşımları ve bulaşı hakkında sağlıklı bir epidemiyolojik
veri sağlayacaktır.
KAYNAKLAR
1.
Onganer PU, Oguzoglu N, Ozer A. Mutation and genotype analysis of hepatitis B virus on acute and chronic
infected selected patients in Turkey. J Cell Mol Biol 2006; 5(1): 33-42.
2.
Chihara N, Arase Y, Suzuki F, et al. Prolonged hepatitis after acute infection with genotype H hepatitis B
virus. Intern Med 2007; 46(22): 1847-51.
3.
Kramvis A, Kew MC. Relationship of genotypes of hepatitis B virus to mutations, disease progression and
response to antiviral therapy. J Viral Hepat 2005; 12(5): 456-64.
4.
Kumagai I, Abe K, Oikawa T, et al. A male patient with severe acute hepatitis who was domestically infected
with a genotype H hepatitis B virus in Iwate, Japan. J Gastroenterol 2007; 42(2): 168-75.
5.
Alvarado-Esquivel C, Sablon E, Conde-González CJ, Juárez-Figueroa L, Ruiz-Maya L, Aguilar-Benavides S.
Molecular analysis of hepatitis B virus isolates in Mexico: predominant circulation of hepatitis B virus genotype H. World J Gastroenterol 2006; 12(40): 6540-5.
MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ
687
Türkiye’de İlk Kez Saptanan Hepatit B Virus Genotip E Enfeksiyonu
6.
Sánchez LV, Tanaka Y, Maldonado M, Mizokami M, Panduro A. Difference of hepatitis B virus genotype
distribution in two groups of mexican patients with different risk factors. High prevalence of genotype H
and G. Intervirology 2007; 50(1): 9-15.
7.
Sayan M, Şentürk Ö, Akhan S, Hülagü S, Çekmen MB. Monitoring of hepatitis B virus surface antigen escape
mutations and concomitantly nucleos(t)ide analogues resistance mutations in Turkish patients with chronic
hepatitis B infection. Int J Infect Dis 2010; 14(Suppl 3): e136-41.
8.
Ural O, Sayan M, Akhan S, Sümer Ş, Şimşek F. Türkiye’de ilk kez saptanan Hepatit B virus genotip H enfeksiyonu olgusu. Mikrobiyol Bul 2013; 47(3): 550-5.
9.
Sayan M, Dogan C. Hepatitis B virus genotype G infection in a Turkish patient undergoing hemodialysis
therapy. Hepat Mon 2012; 12(2): 118-21.
10. Chen X, Lİ M, Zhang X. HBV genotype B/C and response to lamivudine therapy: a systematic review. Biomed Res Int 2013; 2013: 672614.
11. Emekdaş G, Tezcan S, Aslan G ve ark. Mersin ilinde kronik hepatit B hastalarında hepatit B virusu genotiplerinin belirlenmesi. Mikrobiyol Bul 2012; 46(3): 432-45.
12. Özdemir D, Balık İ. Ülkemizde hepatit B virusu (HBV) genotip dağılımı. Viral Hepatit Derg 2002; 8(1-2):
451-4.
13. Lin CL, Kao JH. The clinical implications of hepatitis B virus genotype: Recent advances. J Gastroenterol
Hepatol 2011; 26(Suppl 1): 123-30.
14. Kurbanov F, Tanaka Y, Mizokami M. Geographical and genetic diversity of human hepatitis B virus. Hepatol
Res 2010; 40(1): 14-30.
15. Sayan M. Molecular diagnosis of entecavir resistance. Hepat Mon 2010; 10(1): 42-7.
688
MİKROBİYOLOJİ BÜLTENİ
Download

683-688 Murat Sayan.indd