Aysel KÜÇÜK TUNCA
Validasyon
Bir yöntemin validasyonu, bir veya bir seri
analitin,
belirli
bir
matriks
içindeki
konsantrasyonunun tayini için kullanılan belirli bir
yöntemin, amaçlanan uygulama bakımından
güvenirliğini göstermek için yapılması gereken
bütün işlemleri kapsamaktadır.
Güvenilirliği bilinmeyen bir analitik sonucun
hiçbir değeri yoktur.
2
Konsantrasyon ölçümlerinde kullanılan bir
analitik
yöntemin
yeterli
duyarlılıkta
ölçtüğünün ve uygun kesinliğe sahip olarak
doğruluğunun deneysel olarak gösterilmesi
gerekmektedir. Analitik yöntemlerle belirli bir
matriks içindeki bir analit, yeterli duyarlılık,
özgünlük, doğrusallık, geri kazanım, doğruluk
ve kesinlik (gün-içi ve günler-arası)
bakımlarından tam olarak valide edilmiş,
uygun bir yöntem kullanılarak tayin
edilmelidir. Bilindiği gibi, valide edilmiş bir
yöntemin hedefi ise; bu yöntemle yapılmış
sonuçlara güvenirlilik sağlamaktır.
3
Validasyon parametreleri nelerdir?
Validasyon yaparken, analitik bir yöntemin kabul edilebilirliğini
sağlayan ve validasyon parametreleri denilen aşağıdaki belirli
kabul kriterlerine titizlikle uyulmalıdır:
1. Analitin belirli bir matriks içinde, saklama şartlarındaki
kararlılığı (stability)
2. Doğrusallık (linearity)
3. Kesinlik (precision)
4. Doğruluk (accuracy)
5. Tekrarüretilebilirlik, Tekrarlanabilirlik (Reproducibility,
repeatability)
6. Duyarlılık/hassasiyet (sensitivity)
7. Özgünlük/belirleyicilik, seçicilik (specificity, selectivity)
8. Tutarlılık, sağlamlık (ruggedness, robustness)
9. Tespit ve tayin sınırları (Limits of detection-limits of
4
quantitation)
Stability
Kararlılık: Belirli bir matriks içindeki bir analitin, amaçlanan
saklama ısısında, dondurma veya çözme dönemlerinin
etkisinde, oda ısısında veya diğer çevresel faktörlerin
etkisindeki stabilitesidir. Stok solüsyonların ve numunenin
kararlılığının da belirlenmesi gerekir. Bir çözücü içindeki
analitin kararlılığı, saklama koşulları, maddenin kimyasal
özellikleri, matriks ve kap sistemine bağlıdır. Kararlılık
deneylerindeki koşullar, gerçek numune hazırlama ve analizi
sırasında karşılaşılması muhtemel durumları yansıtmalıdır.
İstenilen saklama süresinin tamamlanmasından sonra,
kararlılık, cihaz tepkisinin taze hazırlanmış solüsyonların tepkisi
ile karşılaştırılarak test edilmelidir.
5
Stabilite nasıl belirlenir?
1. Donma ve Erime Stabilitesi: Analit stabilitesi üç donma ve erime
turlarından sonra belirlenmelidir. Analit ayarlanmış depolama sıcaklığında
stabil değilse, stabilite örneği üç donma ve erime turu boyunca -70 derecede
dondurulmalıdır.
2. Kısa Dönem Stabilitesi: 2 ile 24 saat arasında oda sıcaklığındaki analitin
stabilitesidir.
3. Uzun Dönem Stabilitesi: Uzun donem bir stabilite değerlendirmesinde
depolama zamanı, son örneğin analiz tarihi ile ilk örneğin toplanma tarihi
arasındaki zamanı aşmalıdır.
4. Stok Çözeltinin Stabilitesi: Stok çözelti ve internal standardın stabilitesi
en az 6 saatlik oda sıcaklığında değerlendirilmelidir. Stok çözeltiler, uygun
periyotlarda dondurulur ya da buzdolabında tutulursa, stabilite
belgelenmelidir.
5. Hazırlama Sonrası Stabilite: Otosampler içindeki bekleme zamanını
içeren işlenmiş örneklerin stabilitesi belirlenmelidir.
6
Linearity
Doğrusallık: Deneyimizde, aradığımız
madde örnek içindeki miktarıyla doğru
orantılı sonuçlar vermelidir. Buna
doğrusallık denir. Her deney belli bir
ölçüm aralığında doğrusaldır ve bu
nedenle doğrusallığın bilinmesi, ölçüm
aralığı konusunda bizi uyaracağından
son derece önemlidir. Ölçüm aralığı ise
belirlenen deney hataları içinde kalan
ve tam olarak doğru sonuçları aldığımız
aralıktır.
7
Başka bir değişle; analitik bir işlemin doğrusallığı, belirli
sınırlar
içinde,
numunedeki
analit
miktarı
(konsantrasyon) ile deneysel cevap arasında doğrusal
sonuçların alınma özelliğidir. Uygun konsantrasyon aralığı
seçilerek, cihaz cevabının (y), analitin konsantrasyonuna
karşı (x) grafiğe geçirilmesiyle doğrusal bir ilişki elde
edilir. Böylece hazırlanan standart kalibrasyon eğrisi
üzerinde, gösterilen doğrusal ilişkiyi bulmanın en yaygın
yolu olan en küçük kareler yöntemi kullanılır. y=mx+b
(regresyon denklemi) ile verilen bir doğru denkleminden
m ile doğrunun eğimi, b ile de kesim noktası bulunabilir.
En küçük kareler yöntemiyle elde edilen regresyon
katsayısı, r2  0,95 olmalıdır. Standart eğri ise, 5-8
standart nokta içermeli ve tekrarlanabilir olmalıdır.
8
Standart eğriden sapmalar olabilir, sapmaların bazıları pozitif
bazıları ise negatiftir. İşaretine bakılmaksızın sapmaların
büyüklüğünü en aza indirgemek için bütün sapmaların
karesini alırız ki böylelikle sadece + sayılarla ilgileniriz.
Sapmaların karelerini en aza indirgemeyi araştırdığımız bu
metot, en küçük kareler metodudur (regresyon metodu) ve
iki değişken arasındaki ilişkinin derecesini ortaya koyan
yöntemlerin bir grubudur. En iyi doğruyu bulmak için (veriler
boyunca), kalıntıların karelerinin toplamını minimize eder. Tek
değişkenli kalibrasyonlar x-y arasındaki ilişkiye dayanır. İşte bu
şekilde x-y arasındaki bu matematiksel ilişki, aynı zamanda
lineer regresyon analizi olarak da adlandırılır. Çok değişkenli
kalibrasyonlarda ise karışımların analizi kullanılır.
9
Doğrusallık nasıl belirlenir?
Derişime karşı cihaz cevabı grafiğinin çizilmesi (en
az 5 derişim seviyesine ihtiyaç vardır),
Uygun istatistiksel yöntemler (en küçük kareler)
ile doğru denkleminin (y = mx + b) çıkarılması,
Denklemin regresyon katsayısı (r), kayması (b) ve
eğiminin (m) hesaplanması.
10
Ratios of peaks area (PR/LD)
4,5
4
3,5
y = 0,8569x - 0,0354
R2 = 0,9995
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
1
2
3
4
5
6
concentration
11
Accuracy
Doğruluk: Ölçmede hatalar ve belirsizlikler kaçınılmazdır. Bu
hataları en aza indirmek ve onların büyüklüklerini kabul
edilebilir doğrulukla hesaplamak gerekir.
Sonuçların gerçek değere veya kabul edilen değere yakınlığını
gösteren analitiksel bir işlemdir. Yani, gerçek değerden
sapma, doğruluğun ölçümü olarak verilir.
Doğruluk, yöntemde elde edilmiş olan ortalama test
sonuçlarının gerçek analit değerine yakınlığı olarak da tarif
edilebilir.
Doğruluk çalışması geri kazanım yapılarak veya sertifikalı
referans madde kullanılarak yapılabilir. Doğruluk, gerçek
değerle ölçülen değer arasındaki yakınlığı ifade ederken,
gerçek değerle ölçülen değer arasındaki fark ise hatadır
12
(bias/inaccuracy).
Doğruluk; Mutlak hata veya bağıl hata terimleriyle
açıklanır yani doğruluğun ölçüsü, hatanın büyüklüğü
ile verilir.
Ortalamanın gerçek (ya da doğru kabul edilen)
değerden farkı yada ölçülen değer ile gerçek değer
arasındaki fark, mutlak hatadır. (Xi ölçülen değer, Xt
kabul edilebilir gerçek değer)
E  Xi  Xt
Az sayıda tekrar analiziyle elde edilen bir veri takımının
ortalamasının mutlak hatası aşağıdaki denklemle
verilir:
E  X  X
t
13
Numune ortalaması olan X , sınırlı bir veri takımının
aritmetik ortalamasıdır (Xort). Ortalama değerin üstün olan
yanı ise, analizde bulunan bütün değerleri temsil etmesidir.
Tekrarlanan ölçümlerin toplamının gruptaki ölçüm sayısına
bölünmesiyle elde edilen büyüklüktür:
n
x 

i 1
xi
n
Ortanca ise büyüklük sırasına konmuş bir veri takımındaki
ortaya düşen değerdir. Sonuçların sayısı çift ise, ortadaki iki
değerin ortalaması ortalama olarak alınır. İdeal durumlarda
ortalama ve ortancanın değerleri aynı olur.
14
Bağıl hata, ölçülen büyüklüğün gerçek değerden farkının gerçek
değere oranıdır. Mutlak veya bağıl hataların önüne yazılan işaret
eğer pozitifse, onun gerçek değerinden büyük olduğunu, işaret
negatifse de bunun tersi olduğunu gösterir. Genellikle doğruluk,
aşağıdaki denklemde olduğu gibi, bağıl hata ile gösterilir:
B. Hata 
Xi  Xt
.% 100
Xt
Başka bir değişle; bağıl hata, mutlak hatanın büyüklüğünün ilgili
ölçümün büyüklüğü ile karşılaştırılmasıdır. Buradaki Xi, ölçüm
sonucu elde edilen büyüklük ve Xt kabul edilebilen doğru (gerçek)
değerdir. Verilerin ortalaması için ise bağıl hata şöyle verilir:
B. Hata 
X  Xt
Xt
.% 100
Örnek:
12,35 ml’lik (belirsizlik 0,02 ml) bir büret okumasının bağıl hatası:
Bağıl hata = (Olması gereken miktar-Bulunan miktar)/Olması
gereken miktar
Bağıl hata = Xi – Xt/ Xt
ya da,
Bağıl hata = Mutlak hata / Ölçümün büyüklüğü
= 0,02 ml / 12,35 ml = 0,002 olur.
Yüzde bağıl hata ise:
% Bağıl Hata (Bias) = 100 x Bağıl hata olarak verilir.
Yukarıdaki örnekte % bağıl hata, % 0,2’dir.
Sabit bir mutlak hata, ölçüm büyüklüğü arttıkça, daha küçük bağıl
hata sonucunu doğurur. Bir büret okumasındaki belirsizlik 0,02 ml
olarak sabitse, bağıl hata 10 ml’lik hacim okuması için % 0,2 ve 20
ml’lik hacim için % 0,1’dir.
Örnek
500 mg’lık çökeltinin 200 ml yıkama sıvısı ile yıkanması sonucu,
0,50 mg çökeltinin kaybolduğunu varsayalım. Çözünürlük kaybından
ileri gelen bağıl hata;
-(0,50/500)x%100= -% 0,1’dir.
50 mg’lık çökelti için aynı miktardaki kayıp ise; %1,0’lık bir bağıl
hataya sebep olur.
-(0,50/50)x%100= -% 1,0’dir.
Not: Önüne yazılan işaret eğer pozitifse, onun gerçek değerinden
büyük olduğunu, işaret negatifse de bunun tersi olduğunu gösterir.
17
Doğruluk nasıl belirlenir?
Analitik yöntem, belirlenmiş çalışma aralığında kurulmadır.
En az 3 derişim seviyesinde ve en az üçer kez analizi yapılarak deneyler
gerçekleştirilmelidir.
Sonuç raporları: % Geri Kazanım= (ölçülen değer/ kabul edilen (bilinen)
değer)x100 veya % Bağıl Hata= (ölçülen değer-kabul edilen (bilinen) değer)/
(kabul edilen (bilinen) değer)x100 içermelidir.
Doğruluk belirlemede farklı yaklaşımlar vardır. Bunlar:
Bilinen derişimlere sahip bir seri örneğin analizi ve sonucun gerçek değerle
karşılaştırılması ile ya da sonuçların daha önce bilinen doğru bir yöntemle
alınmış sonuçlarla karşılaştırılması ile,
Hedef derişim üzerinde 3 düzeyde 3 deney yapılarak ekleme yapılmış
numune üzerinde çalışılarak,
Ekleme yapılmış numune hazırlanamıyorsa, standart ekleme teknikleri
kullanarak gösterilebilir.
18
Precision
Kesinlik: Aynı şartlarda ve aynı yöntemle elde edilen
sonuçların, birbirini takip eden ölçümleri arasındaki
yakınlığın derecesini, diğer bir değişle; ölçümlerin
tekrarlanabilirliğini göstermek için kullanılır. Bir analitik
yöntemin kesinliği, homojen ve orijinal bir numune
kullanılarak, ölçümlerin tekrarlanması suretiyle kolaylıkla
bulunabilir. Tekrarlanabilirlik analizleri ise, aynı yöntem, aynı
analizci, aynı alet ve aynı laboratuar ile kısa sürede
sağlanabilir. Bir analitik yöntemin kesinliği, prosedür
homojen numuneye tekrar tekrar uygulandığında,
ölçümlerin birbirine yakınlığı ile de tanımlanabilir.
Kesinlik; tekrarlanabilirlik (repeatability), ara kesinlik
(intermediate precision) ve kopyalanabilirlik yada yeniden
üretilebilirlik (reproducibility) olarak incelenmektedir.
19
Repeatability
Tekraredilebilirlik: Yöntem geçerliliği denetiminin en önemli
ayaklarından bir tanesi de hiç şüphesiz tekraredilebilirlik
çalışmasıdır. Burada aynı laboratuarda, aynı kişi, aynı örneği
kullanarak istatistiksel sonuç yaratacak kadar, yani 10-15 kez
deneyi tekrarlamalıdır. Elde edilen sonuçlar belli bir matematiksel
anlam içermeli, sonuçlar mantık yoluyla değil, doğrudan
matematik kurallar açısından değerlendirilmelidir.
Tekraredilebilirlik (ya da tekrarlanabilirlik, r), aynı laboratuarda,
aynı metotla, aynı cihazla, aynı numune üzerinde, aynı analizci
tarafından alınan deney sonuçlarından (olabildiğince homojen
şartlarda yapılan analizler için) herhangi ikisi arasındaki farkın %95
ihtimalle en fazla r kadar olacağını ifade eder. Yani aynı metotla
aynı maddeden alınan analiz sonuçlarından herhangi ikisi arasında,
%95 ihtimalle en az veya en çok ne kadar fark olacağını gösterir.
20
Analiz sonuçlarının birbirine çok yakın olması, doğru
sonuçlar elde edildiği anlamına gelmez. Sonuçlar birbirine
çok yakın olmalarına rağmen, doğru (gerçek) değerden uzak
da olabilirler.
Tekrarlama, sonuçların kalitesini arttırır ve onların
güvenirliğinin bir ölçüsünü verir. Tekrar numuneleri, aynı
zamanda ve aynı yolla analitik işlemin uygulandığı yaklaşık
olarak aynı büyüklükteki madde kısımları olmalıdır.
Reproducibility
Tekrarüretilebilirlik: Tekraredilebilirlik çalışmasını izleyen diğer
çalışma da, tekrarüretilebilirliktir. Burada ise aynı çalışma değişik
koşullarda tekrarlanır. Elbette işin içine değişik koşullar girince,
çalışmanın yapılabildiği alan önemli ölçüde genişler. Genel bir
uygulama olarak, aynı laboratuarda farklı kişiler tarafından deney
tekrarlanabilir. Hatta varsa, değişik aygıtlar da işin içine sokulabilir.
Daha sonra bir başka laboratuarda (yani dışarıda) tüm çalışma
baştan sona yapılabilir.
Dışarıda yapılan deneyler, istatistik sonuç yaratacak düzeyde
(10’dan fazla olabilir) tekrarlanır. Tüm sonuçlar toplanır ve
istatistiksel olarak değerlendirilir. Bu uygulama, farklı
laboratuarlarda, farklı cihazlarla, farklı analistler tarafından uzun
bir zaman periyodunda yapılır.
22
Analitik bir işlemin veya ölçümün kesinliği, yaygın olarak üç
farklı terimle ifade edilmektedir;
Mutlak Standart Sapma (SD): ortalamadan sapmanın
ölçüsüdür.
Bağıl Standart Sapma (RSD): standart sapmayı veri takımının
ortalamasına
bölerek
hesaplarız.
Verilerin
kalitesinin
değerlendirilmesi için mutlak standart sapmadan daha açık bilgi
verir.
Varyans /Varyasyon Katsayısı (CV): standart sapmanın karesi
veya yüzde bağıl standart sapma (%RSD) olarak ifade edilir.
Bazen bir veri takımının tekrar sonuçlarının kesinliğini ifade
etmede başka bir terim daha kullanılır. Bu da yayılım veya
aralık’tır. Yayılım (w), bir takımdaki en büyük ve en küçük değer
arasındaki farktır.
23
Bu terimlerin hepsi, ortalamadan sapmanın bir
fonksiyonudur ve:
•Kısa bir zaman aralığında ve aynı şartlarda yapılan
işlemlerin doğruluğunu,
•Değişik gün, operatör ve cihazda yapılan deneyin
sonuçlarının kesinliğini,
•Laboratuarlar arası yapılan deneylerin kesinliğini
göstermektedir.
Kesinlik tayinlerinde, bir matriks içinde, uygun bir
konsantrasyon aralığında hazırlanan standartlar, bir gün
içinde veya farklı günlerde birkaç deney yapılarak analiz edilir
ve her gün için ayrı bir regresyon denklemi çıkartılır. Kesinlik,
her bir konsantrasyon (üç konsantrasyon önerilir) için en az
altı kez tekrarlanmalıdır. Gün-içi kesinlik (intra-day) için;
uygun konsantrasyon aralığında hazırlanan standartlar, bir
gün içinde belli aralıklarla tekrarlanarak tayin edilir. Günlerarası kesinlik (inter-day) için de; uygun konsantrasyon
aralığında hazırlanan standartlar, farklı günlerde tek bir defa
analizi ile tekrarlanarak tayin edilir.
Gün-içi ve günler-arası kesinlik tayininde; tüm deneydeki her
bir konsantrasyon için, SD ve RSD (CV)  %15 olmalıdır.
25
Sistemin kesinliği ise, aynı standart çözeltiden aynı konsantrasyonda alınan
örnekler ile arka arkaya ölçüm yapılarak bulunur. Okunan cevaplar için X,
SD ve RSD (CV) değerleri hesaplanır. Numune Standart Sapması olan SD,
verilerin ortalama değer etrafında hangi yakınlıkta kümelendiğini
göstermektedir:
N

SD 
i 1
X i
 X
2
N 1
Bağıl Standart Sapma olan RSD ise:
RSD 
SD
X
10
z
z=2 olduğunda, RSD % olarak verilir ve bu da Varyasyon Katsayısı, CV olarak
adlandırılır:
CV 
SD
X
%100
CV = % RSD
Varyans ise standart sapmanın karesidir.
Yayılım
w  X
eb
 X
ek
SD 
2
Varyans
 X  X 
N
i 1
2
i
N 1
26
İstatistiksel hesaplamalarda devamlı karıştırılabilen iki kavram vardır. Bu
iki kavram arasındaki en önemli fark; doğruluğun referans noktasının
teorik değer, kesinliğin referans noktasının ise ortalama değer olmasıdır.
Kısacası; doğruluğun derecesi, bir ölçümün ne kadar doğru ve güvenilir
olduğunu, kesinlik derecesi ise onun ne ölçüde tekrarlanabilir olduğunu
gösterir.
27
Kesinlik & Doğruluk
Kesinlik;
Ölçüm
sonuçlarının
birbirlerine
yakınlığını
(yani
tekrarlanabilirliği) gösterir. Standart
sapma, varyans veya varyasyon
katsayısı ile ifade edilir.
Kesinlik
Kötü
Doğruluk;
Ölçülen
değerin
doğru ya da doğru kabul edilen
değere
yakınlığını
gösterir.
Mutlak hata ya da bağıl hata ile
ifade edilir.
Doğruluk
iyi
Kesinlik
iyi
Kesinlik
iyi
Doğruluk
kötü
28
DOĞRULUK VE TEKRARLANABİLİRLİK
Doğruluk kötü,
Tekrarlanabilirlik kötü
Doğruluk iyi,
Tekrarlanabilirlik kötü
Doğruluk kötü,
Tekrarlanabilirlik iyi
Doğruluk iyi,
Tekrarlanabilirlik iyi
29
Sensitivity
Duyarlılık: Bir cihazın veya bir yöntemin duyarlılığı (analitik
hassasiyeti), bir analit konsantrasyonundaki küçük farkları
ayırt edebilme kabiliyetinin bir ölçüsü yada analitik bir
yöntemin düşük konsantrasyonları saptayabilme yeteneği de
denilen standart kalibrasyon eğrisinin eğimidir. Hassasiyet,
analitin bir birim artışının, sinyal büyüklüğüne etkisini
gösteren bir kriterdir ya da analit derişimindeki birim değişime
karşı gelen sinyal şiddeti değişimidir.
Hassasiyet = ölçüm sinyali/konsantrasyon
30
 Miktar tayin limiti (Limit of Quantitation, LOQ)
 Teşhis limiti (Limit of Detection, LOD)
TAYİN LİMİTİ (Limit of quantification-LOQ)
Belirleme düzeyi de denilen LOQ değeri, bir deneyde
bulunabilecek en düşük miktarı anlatır. Bunun için deney belli
sayıda tekrarlanır. Belirleme düzeyi, ortalama değere standart
sapma değeri eklenerek de bulunur. Bu konuda değişik
uygulamalar vardır:
Örneğin; deneyi şahit (kör) örnek üzerinden tekrarlayarak,
ortalama değer üzerine, şahit deney standart sapmasının üç katı
eklenebilir.
31
Tayin limiti (sınırı), kabul edilebilir kesinlik ve doğruluk
seviyesinde
belirlenebilen
en
düşük
analit
konsantrasyonudur.
LOQ = ortalama + 10s
LOQ = 10.SD/m
formülü ile de hesaplanabilir. Bazı kaynaklarda 10 katı
yerine 5 veya 6 katı olarak da geçmektedir.
32
Bir analitik yöntemde, miktar tayin limiti LOQ,
numune içindeki analitin uygun kesinlik ve doğruluk ile
miktar tayini yapılabilecek en düşük miktarı
olduğundan; kalibrasyon eğrisi üzerinde, kabul edilebilir
doğruluk (% 20), kesinlik (RSD% 20) ve değişkenlik ile
ölçülebilen en küçük konsantrasyon yani ölçüm
aralığının alt sınırı, tayin limiti olarak tespit
edilmektedir. Bunun için standartlardan en az 5 örnek
kullanılarak tayin yapılmaktadır. Kabul edilebilir kesinlik
ve gerçeklikle ölçülen en düşük analit konsantrasyonu
olan LOQ, çoğunlukla LOD’nin 2,5-3 katı olarak da
hesaplanır.
33
TESPİT LİMİTİ (Limit of detection-LOD)
Kullanılan metodun laboratuar koşullarında tespit edebildiği
minimum konsantrasyondur. Ya da minimum tespit limitine
(sınırına), aranan maddenin tespit edilebildiği ancak hesaplamanın
yapılamadığı miktarıdır da denilebilir. Belirleme düzeyinin yani
LOQ’in hesaplanabilecek en küçük miktarı da tespit limitini (LOD)
verecektir.
 Tespitin zorlaştığı sınır belirlenir.
 Bu noktada 10 bağımsız analiz yapılır.
 Ölçümlerin ortalaması alınır.
 Ölçümlerin standart sapması hesaplanır (s).
LOD = ortalama + 3s
LOD = 3.SD/m
34
Tespit (teşhis) limiti (Limit of Detection, LOD) aynı zamanda,
kör (blank) numuneden %95 olasılıkla ayırt edilebilecek en
küçük konsantrasyondur. Yada belirli bir analitik işlemin tespit
limitine yani LOD’sine, numune içindeki analitin teşhis
edilebildiği miktarıdır da denilebilir. Burada bileşiğin teşhisi
yapılabilir, ancak bu miktar kantitatif analiz için yeterli değildir.
LOD için tipik olarak kabul edilebilen değer; gürültü
seviyesinin 3 katıdır. S/G oranı, analit ile ilgili bilgiyi taşıyan
sinyal S ve cihazdan gelen elektronik gürültü G’yi mukayese
eder. LOD, S/G oranı, 3’e yaklaşana kadar seri olarak
seyreltilmiş numuneler test edilerek de belirlenebilir.
35
LOQ = S/G x10
LOD = S/G x3
Gürültü= max.pik – min.pik
36
Working Range/Linearity
Çalışma aralığı ve linearite: Kantitatif metotlarda çalışma
aralığının belirlenmesi gerekmektedir. Analiz sonucunda
elde edilen değerler bu aralıkta yer almalıdır. Bu aralık,
değerlerin doğru, kesin ve doğrusal olduğu derişim
seviyelerinde, örnek içerisinde analit derişiminin daha üstü
ve daha altı arasındaki aralıktır.
Bu aralığın en düşük noktası LOD ve/veya LOQ değeridir.
Her bir konsantrasyon düzeyine karşılık gelen cihaz yanıtı
grafiğe geçirilir. Lineer regresyon analizi yapılır. Regresyon
katsayısı hesaplanır. Artıklar (her bir x değeri için, gerçek y
değeri ile tahmin edilen y değeri arasındaki fark) hesaplanır
ve grafiğe geçirilir.
37
Grafik eğrisi etrafındaki rastgele dağılım lineariteye işaret
eder. Eğrinin bir tarafına olan sistematik eğilim ise
lineerliğin sağlanamadığını gösterir. Regresyon katsayısı 1’e
yakın olmalıdır (en azından 0,990).
Regresyonda yansıtılmayan, dışlanan değerleri atmadan
önce, o değere yakın konsantrasyonlarda daha ileri
incelemeler veya testler yapılmalıdır.
38
Specificity / selectivity
Özgünlük/Belirleyicilik: Analitik bir yöntemin sadece
amaçlanan bileşen veya bileşenleri tayin edebilme
yeteneğidir.
Sadece tek bir analite cevap verecek bir yöntem için
belirleyicilik (specificity),
Birden fazla analite cevap verecek bir yöntem için ise
seçicilik (selectivity) olarak tanımlanır.
Yani seçicilik, yöntemin aranan bir analiti, örnek
matriksindeki diğer maddelerden ayırabilme özelliğidir.
39
Selectivity
Seçicilik: Bir analitik yöntemin, numunede başka
bileşenlerin olması halinde, analiti kalitatif ve
kantitatif olarak tayin edebilme yeteneğidir.
Numuneye çeşitli başka bileşikler katılarak ve
zenginleştirme
yapılarak
yanıta
bakılabilir.
İnterferansların (girişim yapanların) etkisi incelenir.
Yöntemin birden fazla analit için planlanması halinde,
işlem her bir analit için tekrar yapılmalıdır.
40
Belirleyicilik nasıl belirlenir?
Örneğin Kromatogafik Yöntemler için; Rezolüsyonu (ayrılma)
gösterme,
Safsızlıklar ve bozulma ürünleri mevcut ise, safsızlıkları ve
bozulma ürünlerini ekleme,
Rezolüsyonu gösterme ve interferansları (girişim yapanları)
çıkarma,
Safsızlıklar ve bozulma ürünleri yoksa, belirlenmiş örnekler ile,
analiz için belirlenmiş ve belirlenmemiş örnekleri karşılaştırma ve
safsızlık testi için safsızlık profillerini karşılaştırma.
41
42
Ruggedness / robustness
Tutarlılık: Yöntemin farklı deney şartlarında (farklı alet, farklı
analizci ve farklı laboratuar gibi) tekrarlanması ile kabul edilebilir
sonuç elde edilebilmesidir.
Sağlamlık: Yöntemin deney koşullarındaki küçük sapmalara karşı
hassasiyet derecesini gösterir. Metot oluşturulurken yapılan ve
metodun performansını belirlemek için yapılan çalışmalardır.
Metot performansına etki edecek parametreler belirlenir. Bu
parametrelerdeki değişikliklilerin doğruluk ve kesinliği nasıl
etkilediğine bakılır. Sağlamlık testlerinden elde edilen bilgi,
yöntemin uygulanabilir olduğu koşulların tanımlanmasını sağlar.
43
Recovery
Geri kazanım: Yöntem geçerliliğinde son adım, geri kazanımdır.
Laboratuarda hazırlanan, içerdiği maddeler nedeniyle analizi
etkilemeyecek bir örneğe katılan analizi yapılacak maddenin analiz
sonunda tam olarak elde edilebilmesidir. Burada da yine 10-15
tekrar yapılır. Bir analitiksel yöntemin ekstraksiyon verimiyle
yakından ilgilidir. Bir analitik yöntemde, geri kazanım ve
ekstraksiyon verimliliği, numune işlemlerindeki kayıpları
vermektedir. Bir matriks içindeki bir analitin geri kazanımı, saf
standardın gerçek konstrasyonu ile matrikse eklenmiş ve ekstrakte
edilmiş olan analit miktarının ölçüm sonucunun karşılaştırılmasıdır.
Kısacası, geri kazanım ekstraksiyon verimliliğidir.
Analitikse l İyileşme 
Bulunan Miktar
İlave Edilen Miktar
% 100
44
Geri kazanım çalışması iki şekilde yapılabilmektedir:
1- Aranan maddenin numuneye bilinen miktarda
eklenmesi ile (zenginleştirme),
2- Sertifikalı referans madde kullanılarak.
Geri kazanım (%) = (C1-C2)/C3X100
C1= Zenginleştirilmiş örneğin sonucu
C2= Örnek
C3= Zenginleştirme miktarı
45
Kullandığımız Gaz kromatografisi (GC) veya yüksek basınçlı sıvı
kromatografisi (HPLC) gibi yöntemler ise, analitin her bir
standart
konsantrasyonunda,
ekstrakte
edilmemiş
numunelerle ekstrakte edilen numunelerin pik yükseklikleri
veya alanları mukayese edilerek, mutlak iyileşme (recovery)
bulunur. Bu iyileşmenin tercihen %75 civarında olması kabul
edilebilir, fakat %60 veya daha düşükse, ekstraksiyon işlemi
tekrarlanmalıdır.
Doğal olarak geri kazanımın yüzde yüz olması gerekmektedir.
Ama böylesi bir çalışmayı yaptığınızda şaşırtıcı sonuçlarla
karşılaşabilirsiniz. Kim yerde yüzde yüz on, kim yerde yüzde
seksen gibi rakamlar deneyimizin güvenirliliği konusunda bize
bilgi verirler.
46
Bir analitik yöntemde:
Analitik teşhisin doğru yapıldığından,
analitik yöntemin analitin taşıdığı safsızlıkları tam
olarak belirlendiğinden,
ortaya konulan analitik yöntemin numune içinde
bulunan analitin durumunu ve miktarını belirleyici
olduğundan
tam olarak emin olunmalıdır.
47
İstatistiki Özet
Aritmetik Ortalama:
Standart sapma:
Veri dağılımını ölçmek için kullanılır.
x 
i 1
SD 
n 1
xi
n
n
x
2
i
 nx
2
i 1

n 1
s
RSD   
x
Varyans:
2
N
SD
Yayılım (Aralık): Bir veri takımındaki en
büyük ve en küçük değer arasındaki
farktır.
i 1
n
2
  xi  x 


n
Bağıl standart sapma:
Varyasyon katsayısı: %100 ile çarpılan
RSD’ye denir.
Standart hata: Gaus dağılımı normal
simetrik
bir
dağılım
göstermezse,
ortalamanın standart hatası (ortalamanın
standart sapması) bulunur.
n
x 1  x 2  .........  x n
2

 X
i
 X

i 1
N 1
 s 
CV    x % 100  % RSD
x
std .hata 
s
n
w  X
eb
 X
ek
48
Örnek: Bir kimyacı bir kan numunesinin alkol derişimi için alttaki
verileri elde etmiştir. Etanol %’si, % 95 güvenle ne olmalıdır?
X1: 0,084 X2: 0,089 X3:0,079
X ort  0 , 084
( 0 , 084  0 , 084 )  ( 0 , 089  0 , 084 )  ( 0 , 079  0 , 084 )
2
s
2
( 3  1)
2
 0 , 0050
X  0 ,084  0 ,0050
Örnek: Bir kağıt fabrikası yakınındaki havada SO2 derişimleri için
tekrarlı veriler elde edilmiştir: 1,96 1,91 1,88
1,94 ppm
(mg/lt)
a- ortalama,
b- RSD (bağıl standart sapma),
c- (CV) varyasyon katsayısı değerlerini hesaplayınız.
49
Örnek
Bir kan numunesinin kurşun içeriğini tayin etmek için yapılan tekrar analizlerinde
aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir. Bu veri takımının ortalamasını, standart sapmasını,
varyansını, bağıl standart sapmasını, varyasyon katsayısını ve yayılımını hesaplayınız.
Numune
Xi2
Xi
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1
2
3
4
5
0,752
0,756
0,752
0,751
0,760
ƩXi = 3,771
n
x 
xi


3 , 771
n
i 1
( X i )
0,565504
0,571536
0,565504
0,564001
0,577600
ƩXi2 = 2,844145
 0 , 754 ppmPb
5
2

( 3 , 771 )
n
2
 2 ,8440882
5
n
2


x

x
 i
s
i 1
n 1

2 ,844145  2 ,8440882
5 1
 0 , 0038  0 , 004 ppmPb
s  ( 0 , 0038 )  1, 4 x10
2
2
RSD 
0 , 0038
5
 0 , 005
0 , 754
CV 
0 , 0038
 % 100  % 0 ,50
0 , 754
w  0 , 760  0 , 751  0 , 009 ppmPb
Download

Bağıl hata