Inovatívne prístupy v diagnostike rastlinných
vírusov a ich prínos pre poľnohospodársku prax.
Innovative techniques in the diagnostic of plant
viruses and their contribution to agriculture
practices
Otakar Kúdela, Miroslav Glasa
Oddelenie rastlinnej virológie, Virologický ústav SAV, Dúbravská cesta 9, 845 15
Bratislava
Slovenská rastlinolekárska spoločnosť
9-10.október 2013, Nitra
Inovatívne postupy v diagnostike rastlinných
vírusov a ich prínos pre poľnohospodársku prax.
Citlivá a špecifická diagnostika využívajúca v
súčasnosti zavádzané nové postupy, ktoré
vylepšujú jej parametre a umožňujú získať ďalšie
dôležité informácie o genomickej štruktúre a
spektre infekčných vírusov a ich interakcii s
hostiteľom predstavuje základný nástroj pre
identifikáciu ochorení poľnohospodárskych
plodín a aplikáciu účinných fytosanitárnych
opatrení.
Vírus šarky slivky
Plum pox virus - PPV
- celosvetovo rozšírený vírus kôstkovín
- vysoká genetická variabilita
- patrí medzi najúplnejšie preskúmané rastlinné vírusy
(Sharco projekt 7RP)
- obmedzené možnosti kontroly jeho šírenia
(eliminácia vektorov, konštruovaná rezistenciaGMR, rezistentné odrody – napr. Jojo,
hypersenzitívne podpníky, eradikácia infikovaných
drevín)
Vírus šarky slivky (Plum pox virus, PPV)
rod Potyvirus, čeľaď Potyviridae
P1
HC
P3
CI
NIa
NIb
CP
- vláknité virióny s rozmermi asi 15 x 750 nm
- genóm vírusu tvorí jednovláknová RNA pozitívnej
polarity, kóduje 1 polyproteín
Genetická diverzita Plum pox virus
Pred rokom 2000
D
Súčasnosť
M
EA
C
Fylogenetická analýza na základe kompletných sekvencií
genómu.
Rekombinácia predstavuje dôležitý faktor v evolučnej histórii
Plum pox virus
100
100
An
T
M
100
100
Rec
D
EA
100
W
W*
100
100
C
CR
0.02
PPV-Rec (recombinant)
- identifikovaný nedávno (~ 2000) využitím vylepšených detekčných techník,
vznikol homologickou rekombináciou medzi PPV-M a PPV-D
- v prevažnej miere zistený na slivkovinách, v poľných podmienkach sa takmer
vôbec nevyskytuje na broskyniach (hostiteľská špecificita?)
- vyše 97% sekvenčná homológia (nt) a identický bod rekombinácie v NIb géne
u izolátov rôzneho geografického pôvodu
- silné prepojenie na sady tolerantných odrôd sliviek (Čačanská), možné
ohnisko rozšírenia v minulosti (80. roky minulého storočia)
D
Rec
M
PPV-Rec na St.
Julien
Typická mobilita obalového proteínu
(CP) v SDS-PAGE
PPV-D
PPV-M
PPV-Rec
- PPV-D je dominantným kmeňom v SR (slivkoviny, marhule,
divorastúce Prunus)
- PPV-Rec je široko rozšírený, často asociovaný s výsadbami
tolerantných sliviek
- PPV-M je exkluzívne prítomný na broskyniach
Biologická variabilita PPV
izolát BOR-3 (PPV-Rec)
- ten istý PPV izolát môže exprimovať odlišne intenzívne príznaky v
závislosti na hostiteľovi Prunus
Č. najbolea
Č. lepotica
- prejav príznakov závisí aj na odrode v rámci jedného druhu Prunus
(PPV-D infikované slivky, sad Krajné, SR)
Príklad biologickej variability v rámci PPV-Rec kmeňa (symptomatológia na
broskyni GF305)
BOR-3
Horomerice
Aj malá odlišnosť v štruktúre genómu (napr. zmena aminokyseliny,
aminokyselinového motívu, delécia...) môže spôsobiť zmenu fenotypových
vlastností izolátu, agresivity alebo jeho virulencie.
Hostiteľská tolerancia (alebo rezistencia) je preto často relatívna a môže ju
prekonať virulentnejší izolát alebo variant.
• v SR sa dokázala prítomnosť 3 hlavných kmeňov (M, D a Rec), často
na rovnakých lokalitách
• možnosť zmesnej infekcie aj v jednom strome (väčšinou však jedna
populácia vytlačí druhú)
• neexistuje priamy vzťah medzi zatriedením PPV do kmeňov a
biologickými/epidemiologickými vlastnosťami (nie agresívnejší a slabší
kmeň, iba agresívnejšie a slabšie izoláty - vysoká vnútrokmeňová
variabilita)
• s výnimkou PPV-EA a PPV-T neexistuje striktná geografická štruktúra
PPV
Vírus žltej mozaiky cukety
Zucchiny yellov mosaic virus - ZYMV
- potyvírus, +ssRNA
- na území SR sme ho zistili po prvý krát v r. 2001
- v porovnaní so ZYMV izolátmi z iných
geografických oblastí (napr. Ázia), ZYMV izoláty zo
strednej Európy sú typické významne nižšou
diverzitou
AY016556-67, AY016570, AY016573-74, AY016576-99, AY016600-02, AY016604-15,
AY016617-23, AY016625-35, AY016637-39, AY016641-45, AY016648 (Martinique),
AY016537 and AY016540 (Guadeloupe), AY016521 (Spain), AY016510 (Nepal),
AY016512-14 (France)
96
3
D13914 (USA)
AY611021 (China)
AJ316229 (China)
L31350 (USA)
AY016508 (Italy)
Geografická oblasť
Počet
sekvencií
Genetická
odlišnosť
Stredná Európa (Rakúsko,
Česká rep., Maďarsko,
Slovensko, Slovinsko)
22
0.3%
Japonsko
3
2.7 %
Západná Európa (Nemecko,
Taliansko)
2
2.9%
Taiwan
7
3.7%
Kórea
5
4.9%
Čína(city of Hangzou)
8
17.1%
Svet
69
10.6%
AJ420020 (Italy)
AY016507 (Italy)
66
AY016519, AY016520 (France)
Iran5
2
Iran2
AY016522 (France)
D00692 (USA)
AY016511 (USA)
Iran12
91 Iran6
Iran7
AY611026 (China)
AF127929 (Taiwan)
98
AJ316227-28 (China)
AB004641 (Japan)
AY016515 (France)
AY016523 (France)
62
Iran 1,3,10
AY016527-30 (Dominican Republic)
AY016525 (Turkey)
AY016516-18 (Sudan)
AY016526 (Turkey)
Iran9
Iran8
Iran4
DQ124246 (Czech Republic)
Iran11
1
AY016524 (Pakistan)
AY188994 (Israel)
AJ420019 (Germany)
AY016548-51 (Costa Rica)
AY016531-34, AY016541-42, AY016544-47 (Guadeloupe)
AY016543 (Guadeloupe)
AY016535-36 (Guadeloupe)
AY01638-39 (Guadeloupe)
DQ124240-43, DQ278177, DQ124239, EF070211-12 (Slovakia), DQ124244-45 (Czech Republic),
96
AJ420012-17 (Austria), AJ420018 (Slovenia), AJ459954-AJ459956, AJ251527 (Hungary)
AJ307036 (China)
AF062518 (South Korea)
AY278999-00 (South Korea)
AY611022 (China)
AY611024 (China)
AY016509 (China)
AY611023 (China)
100
DQ925449-50 (Vietnam)
96
78
AJ889243 (China)
DQ925451 (Vietnam)
AY611025 (China)
AJ515908 (China)
98
AJ515907-09, AJ515911 (China)
AF014811 (Singapore)
DQ925447 (Vietnam)
93
AY016553 (Reunion)
98
AY016552 (Reunion)
99
AY016555 (Mayotte)
AY016554 (Mauritius)
L29569 (Reunion)
0.05
Potvrdili sme ,že jedna aminokyselinová
zámena v P3 proteíne ZYMV
(Arg917Lys/Asn/Trp) odlišuje agresívne a
mierne izoláty a súvisí so schopnosťou
izolátu prekonať toleranciu u tekvíc
SE04T
SE04T-S
SE04T-S
SE04T
SE04T-S
SE04T
SE04T
SE04T-S
MKGSLVTQDELDLALKQLLEMTQWFKNHMHLTGEEALKMFRNKRSSKAMI
.............................R.........FRNK.......
NPSLLCDNQLDKNGNFVWGERGYHSKRLFKNFFEEVIPSEGYTKYVVRNF
..................................................
PNGTRKLAIGSLIVPLNLDRARIALLGENIEKKPLTSACVSQQNGNYIHS
..................................................
CCCVTMDDGTPMYSELKSPTKRHLVIGASGDPKYIDLPTSEAERMYIAKE
..................PTK.............................
Vírus zvinutky viniča 1
Grapevine leafroll-associated virus-1 - GLRaV
- vírus sa vyskytuje vo všetkých pestovateľských
oblastiach
- prenáša sa červcami z čeľade Cocciidae a
infikovaným množiteľským materiálom
- infekcia spôsobuje poškodenia krov a znižuje
výnosy a kvalitu plodov
- podľa Nariadenia vlády SR č.49/2007 sa nesmie
vyskytovať v množiteľskom materiáli
- analýza získaných parciálnych CP sekvencií
ukázala, že GLRaV-1 izoláty cirkulujúce na
Slovensku môžeme zatriediť do dvoch geneticky
odlišných kmeňov.
Fylogenetická analýza slovenských
izolátov GLRaV-1 pomocou
neighbour-joining metódy
Vírus škvrnitosti viniča
Grapevine fleck virus - GFkV
• vyskytuje sa celosvetovo v pestovateľských
oblastiach
• zatiaľ je len málo údajov o štruktúre genómu
• prenosný je infikovaným množiteľským materiálom
• infekcia spôsobuje poruchy zrastu podpníka a štepu
A
GFkV6445F
GFkV6964R
B
Novovyvinutá RT-PCR detekcia GFkV
Group I
GFkV izoláty na Slovensku sa
zatrieďujú do 2 geneticky
odlišných klastrov.
Izoláty z Group II neboli doteraz
vo svete identifikované.
Prípadná epidemiologická
rozdielnosť izolátov GroupI a II
nie je doteraz objasnená.
Group II
Vírus čiarkovitej mozaiky pšenice
Wheat streak mosaic virus - WSMV
-
-
vyskytuje sa vo všetkých pestovateľských oblastiach obilnín
vírus patrí do čeľade Potyviridae (rod Tritimovirus), genóm je molekula
ssRNA
na území SR sme ho identifikovali v r. 2007 (imunochemické a
molekulárne techniky)
v niektorých rokoch a pestovateľských oblastiach spôsobil vážne
ekonomické straty
prenáša sa hlavne prostredníctvom roztoča Aceria tosichella
analýzou génu pre kapsidový proteín sa zistilo, že izoláty z územia SR
ako i ďalšie izoláty z regiónu strednej Európy sú odlíšne od doposiaľ
charakaterizovaných WSMV izolátov
v rámci medzinárodnej spolupráce sme vyvinuli diagnostickú techniku,
umožňujúcu špecifickú detekciu vírusového druhu ako aj určenie
geografického pôvodu
vírus (+ vektor) sme identifikovali tiež v burinách určitých druhov a v
rastlinách zo samovýsevu
Vírus čiarkovitej mozaiky pšenice
Aktuálny problém pestovateľov obilnín
Pšenica zo samovýsevu – významný zdroj infekcie
Roztoč Aceria tosichella - prenášač vírusu
Buriny – významný zdroj infekcie
vírus čiarkovitej mozaiky pšenice, WSMV
Foto: J. Kakuta
Foto: J. Kakuta
Špecifická detekcia
WSMV-E izolátov
pomocou RT-PCR a
RFLP
Use of the membranes to simplify
and lower the cost of the molecular
detection
• FTA (Whatman) cards are suitable for sampling,
storage, transport and molecular detection of
RNA viruses
• efficiency of RT-PCR from RNA extracted using
the FTA technology was comparable with those
using classical RNA isolation methods
• FTA method is safe, simple, time saving and
reproducible
• RNAs can be stored at room temperature (up
to 1 month)
Závery
-
poľnohospodárske plodiny, pestované na území SR, sú
vystavené trvalému infekčnému tlaku spektra vírusových
druhov
-
aplikáciou pokročilých technológií sme v rámci
identifikovaných druhov a izolátov zistili rôznu mieru
štrukturálnej diverzity, čo umožnilo komplexnejšiu analýzu
biologických prejavov ich interakcie s hostiteľmi a rozšírilo
naše poznatky o evolučných procesoch v širšom geografickom
kontexte
- získané molekulárne údaje umožnili vyvinúť efektívne
diagnostické postupy, využiteľné v rámci fytosanitárnych
opatrení a kontrole ochorení
Výskum bol podporovaný projektami
HUSK 0901/1.2.1/0126 (COSHARKA)
VEGA2/0060/13
APVV-51-0042
Ďakujeme
za pozornosť
Download

prezentácia - Slovenská rastlinolekárska spoločnosť