II
BIOFYZIKA BUNKY
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
86
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
6 BIOFYZIKA MEMBRÁN [1, 12, 13, 25, 27 – 29, 37 – 62, 73, 74]
6.1 Princípy výstavby membrán [1, 37, 39, 40 – 44]
Plazmatická membrána, obklopujúca každú bunku, ur uje jej ve kos a zabezpe uje zachovanie
podstatných rozdielov medzi obsahom bunky a okolitým prostredím. Membrána predstavuje mimoriadne
výberový filter a zodpovedá za aktívny transport, s jej pomocou sa reguluje vstup potrebných látok
dovnútra a výstup produktov odpadu von z bunky. Membrána prijíma vonkajšie signály, o dovo uje
bunke rýchle reagova na zmeny prebiehajúce v okolitom prostredí.
Všetky biologické membrány (v ítane plazmatickej membrány a membrán subbune ných štruktúr
eukaryotických buniek) majú všeobecné štruktúrne osobitosti: predstavujú súbor lipidických a bielkovinových molekúl, udržiavaných spolu pomocou nekovalentných väzieb. V aka tomu sa udržuje
štruktúrna celistvos membrán. Pritom však membrány sú dynamické „tekuté“ štruktúry a vä šina ich
zložiek je schopná premiest ova sa v rovine membrány.
Lipidická dvojvrstva o hrúbke približne 5 nm je základnou štruktúrou membrány, ktorá vytvára relatívne nepriepustnú bariéru pre vä šinu vo vode rozpustných molekúl. Bielkoviny sú akoby „rozpustené“
v lipidickej dvojvrstve. Sú to základné štruktúry pre vykonávanie rôznych funkcií membrán. Jedny
zabezpe ujú transport molekúl do vnútra alebo von z bunky, iné sú enzýmami a katalyzujú reakcie
viazané s membránou. V membránových systémoch, obsahujúcich vysokousporiadané súbory enzýmov
a bielkovín, prebiehajú dva najdôležitejšie procesy transformácie energie v biosystémoch. Je to fotosyntéza (t. j. premena svetla na energiu chemických väzieb vo vnútorných membránach chloroplastov)
a oxida ná fosforylácia (po as ktorej v dôsledku oxidácie organických substrátov sa vytvára na vnútorných membránach mitochondrií adenozíntrifosfát – ATP, základná energetická molekula v bunke).
alšia trieda bielkovín zabezpe uje štruktúrnu väzbu plazmatickej membrány s cytoskeletom na
jednej strane a na druhej strane s mimobunkovým matrixom, alebo so susednou bunkou. Zvláštnu skupinu bielkovín predstavujú membránové receptory pre zachytenie a transformáciu chemických signálov
z okolitého prostredia. Membrány sú asymetrické, obe ich vrstvy sa v dvojvrstve odlišujú lipidickým
a bielkovinovým zložením, o vyjadruje funk né rozdiely ich povrchov a dovo uje realizova usmernený – vektorový priebeh procesov.
6.1.1 Vlastnosti štruktúry biomembrán
Membrány sa odlišujú tak z h adiska funkcie, ako aj štruktúry. Všetky však majú nasledujúce
základné vlastnosti:
• Membrány sú ploché štruktúry o hrúbke nieko kých molekúl, ktoré vytvárajú spojitú bariéru medzi
jednotlivými as ami bunky a bunky ako celku od okolitého prostredia. Hrúbka membrány dosahuje
obvykle 6 – 10 nm.
• Membrány sú zložené z lipidov a bielkovín. Váhový pomer bielkovín a lipidov pre vä šinu biomembrán leží v rozmedzí od 1 : 4 po 4 : 1. V membránach sú prítomné aj sacharidové zložky, viazané
s lipidmi a bielkovinami.
• Lipidy membrán sú reprezentované pomerne neve kými molekulami, nesúcimi hydrofilné a hydrofóbne skupiny. Vo vodnom prostredí tieto lipidy spontánne vytvárajú uzavreté bimolekulárne vrstvy.
Takéto lipidické dvojité vrstvy sú bariérou pre polárne látky.
• Jednotlivé funkcie membrán sa sprostredkúvajú špecifickými bielkovinami. Bielkoviny uskuto ujú
úlohu púmp, kanálov, receptorov, enzýmov a transforma ných energetických prvkov. Bielkoviny membrán sú zabudované do lipidickej dvojvrstvy, o vytvára výhodné prostredie pre prejavy ich aktivity.
• Membrány sú nekovalentné nadmolekulárne štruktúry, zložky membrán (bielkoviny, lipidy) sa držia
spolu v aka vzniku mnohých nekovalentných interakcií, kooperatívnych z h adiska vlastností.
87
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
• Membrány sú asymetrické, ich vonkajší a vnútorný povrch sa odlišujú navzájom.
• Membrány sú tekuté štruktúry. Ak molekuly lipidov a bielkovín v membráne nie sú udržiavané
v ur itom mieste silami špecifickej interakcie, potom môžu ahko difundova v ploche membrány.
Membrány je možné považova za dvojrozmerné roztoky definovaným spôsobom orientovaných
bielkovín a lipidov.
6.1.2 Organizácia lipidov a topografia bielkovín v membráne [1, 37]
6.1.2.1 Modely organizácie membrán
Pre vysvetlenie molekulovej organizácie membrán boli predložené rôzne hypotézy. Jednou z prvých
bola hypotéza unitárnej (jedinej) membrány, potom hypotéza opakujúcich sa štruktúrnych jednotiek
a tre ou hypotéza mozaikovej štruktúry. Pod a prvej hypotézy fosfolipidická vrstva je štruktúrnou bázou
celej membrány a bielkoviny sú uložené len na oboch povrchoch dvojvrstvy. Druhá hypotéza predpokladala, že membrány sa skladajú z rovnakých opakujúcich sa bielkovinovo-lipidických jednotiek, pri om
existencia dvojvrstvy samotnej sa odmietala. Tretia hypotéza predpokladá, že v membráne existuje aj
dvojvrstva, ale aj asti bez nej, v ktorých sa nachádzajú komplexy z bielkovín a lipidov.
Prvá hypotéza predpokladala, že biomembrány majú celkom rovnaké vlastnosti, ako fosfolipidické
dvojvrstvy. Toto bolo možné potvrdi , ale nebolo možné vysvetli , pre o obsah lipidov v membráne
sa mení od 27 % po 50 % (pod a hypotézy mal by obsah bielkovín a lipidov v membráne rovnaký).
Okrem toho sa predpokladalo, že lipidy sú viazané s bielkovinami iba elektrostaticky a preto sa musia
v roztokoch solí rozpada na jednotlivé bielkoviny a lipidy, o neprebieha.
Druhá hypotéza predpokladala hydrofóbne interakcie medzi bielkovinou a lipidom a odmietala
existenciu vo nej lipidickej dvojvrstvy v membráne, o protire í experimentálnym faktom.
Tretia hypotéza predpokladá, že membrány sú dvojrozmerné roztoky globulárnych bielkovín a
lipidov, orientovaných ur itým spôsobom. Základné tvrdenia tohto modelu sú nasledovné:
− Vä šia as membránových fosfolipidov a glykolipidov je uložená v podobe dvojvrstvy. Lipidická
dvojvrstva hrá dvojakú úlohu – je sú asne rozpúš adlom pre integrálne bielkoviny membrány a aj
bariérou priepustnosti.
− Neve ká as membránových lipidov je špecificky viazaná s ur itými membránovými bielkovinami a
pravdepodobne je nevyhnutná pre ich funkciu.
− Membránové bielkoviny vo ne difundujú v lipidickom matrixe v laterálnom smere, ale nemôžu sa
premiest ova v prie nom smere, t. j. od jedného povrchu k druhému.
Základné zložky biomembrán sa nezú ast ujú iba na tepelnom pohybe, ale môžu uskuto ni aj
usmernené pohyby, v dôsledku ktorých sa v membráne vytvára nerovnomerné rozdelenie komponent.
Na základe takéhoto prerozdelenia sa môžu vytvori nasledovné štruktúry:
• lipid-lipidické klastre, v dôsledku ktorých v membráne môže vzniknú prerozdelenie fáz,
• bielkovinovo-bielkovinové klastre,
• bielkovinovo-lipidické domény, odlišujúce sa zložením bielkovín a lipidov od druhých oblastí membrány,
• domény z vnútromembránových komponent, vytvorené v dôsledku ich väzby s vysokomolekulárnymi zložkami, uloženými na povrchu membrán,
• reorganizované bielkovinové oblasti v membráne v dôsledku funkcie cytoskeletu.
6.1.2.2 Asymetria membrán
Membrány sú asymetrické tak v štruktúrnom ako aj vo funk nom zmysle. Vonkajší a vnútorný povrch
všetkých známych biologických membrán sa odlišuje zložením a enzymatickou aktivitou. Príkladom
môže slúži pumpa, regulujúca koncentrácie Na+ a K+ v bunkách. Tento transportný systém je prítomný
v plazmatických membránach skoro všetkých buniek vyšších organizmov. Pumpa je orientovaná v plazmatickej membráne tak, aby vylu ovala Na+ z bunky a nasávala K+ do bunky. Pre prácu pumpy je
potrebné tiež ATP, ktoré sa musí nachádza na vnútornej strane membrány. Špecifický inhibítor pumpy
uabain je efektívny iba vtedy, ak ú inkuje z vonkajšej strany membrány.
88
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
Presne ur ená orientácia membránových bielkovín je vyvolaná tým, že tieto bielkoviny sa syntetizujú a vnášajú do membrány asymetrickým spôsobom. Táto absolútna asymetria sa zachováva v aka
neprítomnosti transmembránových prechodov bielkovín po as celej ich existencie v membráne.
Lipidy sa tiež rozde ujú asymetricky, o je vyvolané mechanizmom ich biosyntézy, ale táto asymetria prakticky vo všetkých prípadoch okrem glykolipidov, ktoré sú uložené len na vonkajšej strane
membrány, nie je absolútna. Asymetria lipidov významne odlišuje od seba vnútornú a vonkajšiu as
dvojvrstvy. Napr. v erytrocytoch loveka vä šina lipidických molekúl, obsahujúca na konci cholín (fosfatidylcholín, sfingomyelín) je vo vonkajšej strane membrány a skupina lipidov, obsahujúca aminoskupinu
(fosfatidyletanolamín a fosfatidylserín) je na vnútornej strane membrány. Chvosty karboxylových kyselín
v prvej skupine sú viac nasýtené, ako v druhej. Na základe toho asymetria v rozdelení polárnych hláv sa
sprevádza asymetriou rozdelenia uh ovodíkových chvostov. To môže vies k tomu, že tekutos vnútornej asti je o osi vä šia, ako vo vonkajšej. Pretože záporne nabitý fosfatidylserín je len na vnútornej
strane dvojvrstvy, budú sa tieto vrstvy odlišova podstatne aj nábojom. Niektoré enzýmy (napr. proteínkinázy C) využívajú tento fenomén. Význam asymetrie lipidov nie je však ešte jasný.
6.1.2.3 Membránové lipidy [1]
V bunkovej membráne sú prítomné lipidy troch typov: fosfolipidy, cholesterol a glykolipidy. Na
jednom mikrometre štvorcovom lipidickej dvojvrstvy sa nachádza asi 5 × 106 molekúl lipidov, to znamená, že v plazmatickej membráne neve kej živo íšnej bunky je približne 109 molekúl lipidov.
Z fosfolipidov sa v živo íšnych bunkách vyskytujú predovšetkým fosfatidylcholín, fosfatidylserín,
fosfatidyletanolamín a sfingomyelín. Z nich iba fosfatidylserín má záporný náboj, ostatné tri lipidy sa
pri fyziologických hodnotách pH chovajú ako elektricky neutrálne. Iné fosfolipidy (ako napr. fosfatidylinozitol) sú prítomné v malých množstvách, ale sú ve mi významné z funk ného h adiska. Výskyt
pomerne širokého spektra druhov fosfolipidov je vyvolaný predovšetkým tým, že niektoré membránové
bielkoviny zdá sa môžu pracova normálne iba v prítomnosti ur itých špecifických typov lipidov.
Cholesterol hrá mimoriadne dôležitú úlohu pri regulácii tekutosti membrány. Plazmatické membrány
eukaryotov obsahujú pomerne ve ké množstvo cholesterolu – približne jednu molekulu na každú molekulu fosfolipidu. Cholesterolové molekuly sa orientujú v dvojvrstve tak, aby ich hydroxylové skupiny
sa pripájali k polárnym hlavám fosfolipidických molekúl. Pritom ich tuhé ploché steroidné cyklické
štruktúry imobilizujú tie asti karboxylových re azcov, ktoré bezprostredne ležia pri polárnych hlavách.
Ostatné asti uh ovodíkových re azcov nestrácajú svoju pohyblivos . Cholesterol okrem vplyvu na
tekutos pri vysokých koncentráciách (bežných u eukaryotov) zabra uje zliepaniu a kryštalizácii
uh ovodíkových re azcov – teda inhibuje možné fázové prechody.
Cholesterol okrem toho zmenšuje priepustnos biomembrány pre malé, vo vode rozpustné molekuly
a zvä šuje pružnos a mechanickú pevnos dvojvrstvy. V aka nemu membrány môžu meni svoj tvar
ako odpove na priloženú silu. Je to spôsobené tým, že na rozdiel od fosfolipidov cholesterol sa môže
rýchle prerozde ova medzi vrstvami, nako ko malá polárna hlava cholesterolu (hydroxylová skupina)
relatívne ahko prechádza cez stred dvojvrstvy, energetická bariéra pre flip-flop cholesterolu je ve mi
nízka a teda prerozdelenie prebieha ve mi rýchlo.
Glykolipidy (komplexy oligosacharidov s lipidmi) sú najasymetrickejšie uložené lipidické molekuly
v membráne. Nachádzajú sa iba vo vonkajšej strane dvojvrstvy a ich sacharidové skupiny sú orientované
k povrchu bunky. Táto asymetrická distribúcia sa vytvára pri pripojení sacharidových zvyškov k molekulám lipidov v Golgiho aparáte. Glykolipidy sa rozlišujú pod a po tu sacharidových zvyškov v ich
polárnych hlavách. Najdôležitejšími typmi sú:
1. Neutrálne glykolipidy (ktorých polárne hlavy obsahujú od 1 do 15 a viac nenabitých neutrálnych
sacharidov). Predstavite om tejto skupiny je galaktocerebrozid, ktorý predstavuje hlavný lipid myelínu,
mnohovrstvovej membránovej obálky, chrániacej nervové axóny. V membránach iných buniek je
tohto typu lipidu málo.
2. Gangliozidy (obsahujú jeden alebo viac zvyškov N-acetylneuramínovej kyseliny, ktoré nesú záporný
náboj). Ve mi ve a týchto lipidov sa nachádza v plazmatickej membráne nervových buniek. Je ich
asi 40 typov. O ich funkciách sa vie málo. Predpokladá sa, že predstavujú receptory pre ur ité
mediátory, uskuto ujúce výmenu informácie medzi bunkami.
89
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
6.1.2.4 Membránové bielkoviny – spôsoby asociácie s dvojvrstvou
Hoci základné štruktúrne osobitosti biomembrán sa ur ujú vlastnos ami lipidickej dvojvrstvy, vä šina
špecifických funkcií sa uskuto uje bielkovinami. Preto typy bielkovín a ich množstvo v membráne sú
ve mi variabilné. V obvyklej plazmatickej membráne množstvo bielkovín je rovné približne polovici
jej hmotnosti. Pretože však rozmer lipidickej molekuly je ve mi malý v porovnaní s rozmermi molekuly
bielkoviny, je možné predpoklada , že v membráne bude vždy ove a viac lipidických molekúl, ako
bielkovín (napr. pri 5 % obsahu bielkovín na jednu molekulu bielkoviny prislúcha približne 50 molekúl
lipidov).
Existuje pä spôsobov asociácie membránových bielkovín s lipidickou dvojvrstvou (pozri obr. 11.):
1. transmembránové bielkoviny prechádzajú cez dvojvrstvu v podobe jednotlivej α závitnice alebo
nieko kých α závitníc,
2. niektoré z transmembránových bielkovín majú kovalentne pripojený re azec karboxylovej kyseliny,
ponorený do cytoplazmatickej asti dvojvrstvy,
3. vnútrobunkové membránové bielkoviny sú pripojené k dvojvrstve iba s pomocou re azca karboxylovej kyseliny alebo lipidu, ktoré sú ponorené opä do cytoplazmatickej asti dvojvrstvy,
4. niektoré povrchové bielkoviny sú pripojené k dvojvrstve v dôsledku kovalentných väzieb (cez špecifický oligiosacharid) s fosfatidylinozitolom – minoritným fosfolipidom, ktorý sa nachádza na vonkajšej strane lipidickej dvojvrstvy,
5. niektoré bielkoviny sú pripojené k vnútornej alebo vonkajšej vrstve membrány v dôsledku nekovalentných interakcií s inými membránovými bielkovinami (takýto typ pripojených bielkovín vôbec
neinteraguje s hydrofóbnou vnútornou as ou dvojvrstvy).
Obr. 11 Ilustrácia spôsobov asociácie membránových bielkovín s lipidickou dvojvrstvou
Tie bielkoviny, ktoré sa uvo ujú z membrány ahko, bez deštrukcie lipidickej dvojvrstvy, sa
nazývajú periférne bielkoviny (je to posledná skupina z predchádzajúcej klasifikácie). Tie bielkoviny,
ktoré môžu by uvo nené iba po deštrukcii dvojvrstvy, sa nazývajú integrálne membránové bielkoviny
(prvé štyri skupiny z predchádzajúcej klasifikácie).
Tá as polypeptidického re azca transmembránových bielkovín, ktorá je ponorená do hydrofóbneho
okolia lipidickej dvojvrstvy, je zložená ako pravidlo z aminokyselinových zvyškov s nepolárnymi
bo nými skupinami. Pretože peptidické skupiny sú polárne a molekuly vody sú nedostupné, budú sa
všetky peptidické skupiny snaži vytvára vodíkové väzby medzi sebou. Po et vodíkových väzieb
medzi peptidickými skupinami je maximálny, ak as polypeptidického re azca, prechádzajúca cez
dvojvrstvu, je α závitnica. Práve týmto spôsobom vä šina polypeptidických re azcov prechádza cez
membránu. V tých prípadoch, kedy cez dvojvrstvu prechádza nieko ko astí polypeptidického re azca,
peptidické skupiny môžu by principiálne nasýtené vodíkovými väzbami, ak sú tieto asti organizované
v podobe β štruktúr. Polypeptidický re azec bielkovín, prechádzajúci cez membránu nieko ko krát, však
90
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
naj astejšie vytvára sériu α závitníc a nie β štruktúr. Prísna podmienka maximalizácie po tu vodíkových
väzieb v neprítomnosti molekúl vody ozna uje tiež skuto nos , že polypeptidický re azec, prechádzajúci cez membránu, pravdepodobne nemení svoj pôvodný smer až dovtedy, kým úplne neprejde cez
membránu, lebo prítomnos zlomu v re azci by viedla k zmenšeniu po tu regulárnych vodíkových
väzieb. Je zrejmé, že z tohto dôvodu nebola doteraz nájdená membránová bielkovina, ktorá by bola
ponorená do lipidickej dvojvrstvy iasto ne.
Transmembránové bielkoviny majú vždy unikátnu orientáciu v lipidickej dvojvrstve. To vyjadruje
asymetrický charakter ich biosyntézy a zabudovania do membránovej vrstvy endoplazmatického retikula
a taktiež rôzne funkcie cytoplazmatických a mimobunkových domén.
Vä šina transmembránových bielkovín je glykozylovaná. Ako aj v prípade glykolipidov sú oligosacharidové re azce prítomné vždy na vonkajšej strane membrány, pretože sacharidové zvyšky sa
pripájajú v cisternách endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu. Druhá asymetria je obsiahnutá
v bielkovinových skupinách (S-H), ktoré zostávajú redukované v cytoplazmatických doménach, ale
asto sa využívajú pre vytváranie vnútro- alebo medzi-re azcových disulfidických väzieb (S-S) v mimobunkových doménach.
6.1.2.5 Membránové bielkoviny – klasifikácia v závislosti od funkcie
•
•
•
•
•
Klasifikácia bielkovín pod a ich funkcie v membránach vedie k nasledujúcim skupinám:
Katalyzátory metabolizmu – sú bielkoviny, ktoré majú enzymatickú aktivitu a katalyzujú chemické
premeny substrátov. Sem patria enzýmy (oxydoreduktázy, transferázy, hydrolázy, izomerázy, ligázy
a lyázy) a iné bielkoviny, predovšetkým prenáša e elektrónov (cytochrómy, bielkoviny s nehémovým
železom a pod.)
Transportné bielkoviny – sú také, ktoré uskuto ujú transport látok, molekúl, iónov, a tento transport
nie je sprevádzaný chemickými premenami substrátov. Sem patria nielen membránové bielkoviny,
ale aj hemoglobín (ktorý je schopný viaza a uvo ova kyslík) a bielkoviny, ktoré prenášajú fosfolipidy od jednej membrány k druhej. Membránové bielkoviny, ktorých funkcia spo íva v transmembránovom prenose molekúl alebo iónov, sa delia na prenáša e a kanálotvorné bielkoviny. Prenáša e
sa pri prenose látok premiest ujú v membráne spolu s prenášanou látkou. Kanálotvorné bielkoviny
sú také molekulárne štruktúry, ktoré môžu vytvára bu iónové kanály (pre prenos presne ur ených
molekúl), alebo vrátka (ktoré predpokladajú existenciu štruktúr, riadiacich priepustnos kanálu) alebo
pumpy (ktoré sú schopné transportova látky, alebo ióny proti gradientu koncentrácie, alebo potenciálu, pri om nevyhnutnú energiu získavajú z hydrolýzy ATP, preto sa nazývajú ATP-ázy). Podrobne
pozri kapitolu 2.1.
Dynamické štruktúry – zabezpe ujúce pohyblivos vnútrobunkových astí a buniek ako celku. Sú to
predovšetkým typy mikrofilamentov a mikrotubulov, obsahujúce kontraktilné bielkoviny, schopné
uskuto ova aj zmeny v štruktúre membrán. Predstavujú systém cytoskeletu.
Receptorové štruktúry – ktoré zabezpe ujú príjem a odovzdanie informácie. Vyskytujú sa bu ako
chemoreceptory (receptory hormónov a mediátorov, receptory chuti a vône), alebo ako alšie bielkoviny, nevyhnutné pre prenos informácie. Patrí sem aj rodopsín, ktorý sa vyskytuje v membránach
sietnice oka a pracuje ako receptor informácie, prijímanej v podobe svetelných kvánt. Pre rozlíšenie
cudzorodých látok sa vyvinuli špeciálne imunitné receptory. Dôležité sú aj mechanorecep né štruktúry,
ktoré snímajú informáciu z posunu a deformácie svojich sub astí.
Bielkoviny, potrebné pre udržanie tvaru a povrchu membránových štruktúr – také ako kolagén a jemu
podobné typy bielkovín, vytvárajúce mimobunkový matrix a bazálne membrány.
6.1.2.6 Špecifické bielkovinovo-lipidické domény a regulárne štruktúry v membráne
Pri tvorbe ur itého priestorového rozdelenia bielkovín a lipidov v membráne spoluú inkuje nieko ko
fenoménov.
Jedným z fenoménov je skuto nos , že membránu je možné považova za dvojrozmernú kvapalinu.
Táto dovo uje bielkovinám otá a sa okolo vlastnej osi a laterálne sa premiest ova v rovine vrstvy
membrány. Druhým z týchto fenoménov je existencia lipid-lipidických, bielkovinovo-lipidických a
bielkovinovo-bielkovinových interakcií v membráne. Tretím fenoménom je interakcia membránových
91
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
bielkovín s makromolekulárnymi štruktúrami, nachádzajúcimi sa vo vnútre (bielkovina spektrín alebo
cytoskeletálna sústava) alebo zvonku bunky (mimobunkový matrix alebo glykokalyx). Obmedzenie
laterálnej pohyblivosti bielkovín plazmatickej membrány je možné uskuto ni bu ich asociáciou do
ve kých komplexov (ako napr. u molekúl bakteriorodopsínu v Halobaktériách), pripojením vo vnútre
alebo mimo bunky ku komplexom makromolekúl, alebo zabezpe ením ich interakcie s bielkovinami
na povrchu inej bunky. Všetky takéto obmedzenia vedú k vytvoreniu osobitých doménových štruktúr,
ktoré obsahujú špecifické zloženie komplexov lipid-bielkovina, alebo regulárnych štruktúr, kedy obmedzenie pohyblivosti je vyvolané interakciou pravidelne rozložených ve kých bielkovinových komplexov.
asto takéto pravidelne umiestnené komplexy sú zložené z ve kého po tu rôznych polypeptidov,
a tieto spravidla multienzýmové štruktúry katalyzujú ve mi zložité reakcie v dôsledku kooperatívnej
innosti podjednotiek. Takými sú napríklad „bielkovina tretieho pásu“ (názov má pod a toho, že pri
elektroforéze sa nachádza v takejto polohe vo i polohám iných bielkovín – ide o transmembránový
globulárny dimér a možno aj tetramér, s desiatimi špirálami v membráne na jednu jednotku komplexu),
bakteriorodopsín (sedem α závitníc v pravidelnej štruktúre, podobnej kryštálu, regulárne umiestnených
v membráne), alebo bakteriálne fotosyntetické reak né centrum (štyri rôzne polypeptidy, dva z ktorých
sú transmembránové, jeden je vo vnútri a jeden (cytochróm) vonku z bunky).
Obr. 12 Glykoproteín R v plazmatickej membráne bunky ako toxínová pumpa
6.1.3 Membránové sacharidy
Membránové sacharidy sú umiestené na vonkajšej strane membrán (pozri obr. 12). Na sacharidy je
viazaná vä šina bielkovín plazmatickej membrány, ktorá prechádza na povrch bunky, zatia o z desiatich lipidov vo vonkajšej vrstve dvojvrstvy je so sacharidmi viazaná menej než jedna molekula lipidu.
Tým nemenej (pretože lipidických molekúl je v membráne 50-krát viac ako bielkovinových molekúl)
po et lipidických molekúl, viazaných so sacharidmi je vä ší ako po et so sacharidmi viazaných bielkovinových molekúl. Pri tom však glykoproteín môže ma ve ký po et bo ných oligosacharidových
92
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
re azcov, zatia o molekula glykolipidu iba jeden re azec. V prospech bielkovín hovorí aj existencia
proteoglykánov, ktoré vytvárajú mimobunkový matrix.
Existujú dve možnosti pripojenia oligosacharidu k membránovým glykoproteínom:
1. bu sú tieto pripojené N-väzbou k zvyškom asparagínu v polypeptidickom re azci,
2. alebo O-väzbou k zvyškom serínu alebo treonínu.
Termín bunková obálka alebo glykokalyx sa asto používa pre ozna enie sacharidmi obohatenej
periférnej zóny na povrchu vä šiny eukaryotických buniek. Je to však skôr sémantický pojem, pretože
nie je možné dobre ur i , ktoré zo sacharidov patria ešte k membráne a ktoré ku mimobunkovému
matrixu. O úlohe sacharidov na povrchu sme už iasto ne diskutovali v asti (4.3.2.2.).
6.2 Transportné javy v membráne [1, 37, 39, 46, 48, 50, 54]
Biologické membrány predstavujú významné výberové bariéry priepustnosti. Tok molekúl a iónov
medzi bunkou a okolitým prostredím je prísne regulovaný špecifickými transportnými systémami.
Transportné procesy zabezpe ujú nieko ko dôležitých funkcií:
• regulujú objem bunky a udržujú oscilujúce vnútrobunkové hodnoty pH a iónové zloženie v úzkych
hraniciach, o vytvára výhodné podmienky pre zabezpe enie aktivity enzýmov,
• zabezpe ujú extrakciu a koncentrovanie substrátov energetickej a látkovej výmeny (palivo a stavebné
bloky) z okolitého prostredia a sú asné vylú enie toxických látok z bunky,
• vytvárajú iónové gradienty, o je nevyhnutné pre udržanie membránového potenciálu a tým excitability nervov a svalov.
Všetky tieto úlohy membrány plnia dvomi cestami:
1. Lipidická dvojvrstva v aka svojim hydrofilným vlastnostiam je prakticky nepriepustná pre vä šinu
polárnych molekúl a tým zabra uje úniku vo vode rozpustného obsahu buniek.
2. V dôsledku nevyhnutnosti regulova vnútrobunkové koncentrácie iónov (t. j. vymie a ióny s okolitým prostredím) sa museli vytvori špeciálne štruktúry a prenosové cesty pre malé molekuly alebo
pre makromolekuly a ve ké astice. Tieto štruktúry a cesty nie sú rovnaké pre oba tieto prípady.
6.2.1 Prenos malých molekúl cez membránu
V princípe ubovo ná molekula za dostato ne dlhý as prejde v dôsledku difúzie po gradiente koncentrácií cez lipidickú dvojvrstvu, ktorú sme zbavili bielkovín. Ale rýchlosti, s ktorými rôzne molekuly
difundujú cez takúto dvojvrstvu, budú silne závisie od rozmeru molekúl a rozpustnosti v tukoch. ím
menšia je molekula, ím viac je hydrofóbna, alebo nepolárna, tým rýchlejšie bude difundova cez dvojvrstvu. Malé nepolárne molekuly, také ako O2, sa ahko rozpúš ajú v dvojvrstve a budú ou rýchlo
prechádza . Aj malé nenabité polárne molekuly budú difundova dostato ne rýchlo (napr. CO2 (44Da),
etanol (46Da), mo ovina (60Da)). Glycerol (92Da) bude difundova pomalšie a glukóza (180Da) prakticky ve mi ažko prejde cez dvojvrstvu. Voda (18Da) difunduje cez dvojvrstvu ve mi rýchlo, hoci je
relatívne nerozpustná v tukoch, ale je malá a nenabitá. Oproti tomu všetky nabité molekuly (ióny) nebudú
cez dvojvrstvu prechádza v dôsledku toho, že vlastnia náboj a majú vysoký stupe hydratácie.
6.2.1.1 Základné štruktúrne jednotky iónového transportu
Základnými štruktúrnymi jednotkami transportu nabitých iónov a malých molekúl cez membrány
sú membránové transportné bielkoviny. Nachádzajú sa vo všetkých typoch biologických membrán
(BM) a môžu sa ve mi silne odlišova navzájom. Každá konkrétna bielkovina je ur ená pre prenos
ur itej triedy molekúl (napr. anorganických iónov, sacharidov alebo aminokyselín) a asto len pre
ur itý typ molekúl z tejto triedy. Všetky tieto bielkoviny zabezpe ujú prenos špecifických látok cez
membránu bez ich bezprostredného kontaktu s hydrofóbnou vnútornou as ou lipidickej dvojvrstvy
tým, že v nej vytvárajú priechodné kanály.
Existujú dva druhy takýchto bielkovín:
1. Bielkoviny-prenáša e, ktoré viažu molekulu prenášanej látky, ím dochádza k ich konforma nej
zmene a výsledkom tejto zmeny je prenos molekuly cez membránu.
93
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
2. Bielkoviny-kanály (alebo bielkoviny-tvoriace kanály), ktoré vytvárajú vodou naplnené póry, prenikajúce dvojvrstvou. ke sú tieto póry otvorené, molekuly špecifických látok prechádzajú cez ne do
vnútra bunky.
Všetky bielkoviny-kanály a mnohé bielkoviny-prenáša e dovo ujú rozpusteným látkam prenika
cez membránu len pasívnym transportom alebo u ah enou difúziou. Ak molekula transportovanej látky
nemá náboj, potom smer pasívneho transportu sa ur uje iba rozdielom koncentrácie tejto látky na oboch
stranách membrány (gradientom koncentrácie). Ak však je molekula nabitá, potom na jej transport
vplýva tak gradient koncentrácie, ako aj rozdiel elektrických potenciálov na oboch stranách membrány
(membránový potenciál). Spolu koncentra ný a elektrický gradient vytvárajú elektrochemický gradient.
V ubovo nej plazmatickej membráne sa vyskytuje gradient elektrického po a. Pri tom je vnútorná
strana membrány nabitá obvykle záporne vo i vonkajšej (ktorej potenciál pod a konvencie je rovný
0 mV). Takýto gradient u ah uje preniknutie do bunky kladne nabitých iónov, ale zabra uje prechodu
do vnútra iónom nabitým záporne.
Transport cez bielkoviny kanály je vždy pasívny. Pre bielkoviny-prenáša e platí iné pravidlo.
Predošleme, že bunkám sú treba aj štruktúry, ktoré budú aktívne prenáša látky proti ich elektrochemickému gradientu. Takýto proces, nazývaný aktívnym transportom, sa uskuto uje bielkovinami-prenáša mi, resp. iónovými pumpami. V tomto prípade sú však tieto viazané so zdrojom energie, napr. takým,
akým je hydrolýza ATP (v prípade iónovej pumpy), alebo gradient iónov (v prípade prenáša a). Teda
transport, uskuto ovaný bielkovinami-prenáša mi, môže by tak pasívny (ak tieto nie sú pripojené
k zdroju energie), ako aj aktívny.
6.2.1.2 Prietokové iónové kanály
Bielkovinové kanály tvoria v membránach póry, zaplnené vodou. V baktériách sú tieto póry ve ké
a relatívne nešpecifické, v plazmatických membránach živo íšnych a rastlinných buniek sú tieto póry
rozmerovo malé a vysoko špecifické, slúžia pre špecifický transport iónov a nazývajú sa iónové
kanály. Zabezpe ujú prenos približne 106 iónov za sekundu, o je zhruba 100 krát rýchlejšie ako
rýchlos prenosu v ubovo nej známej bielkovine-prenáša i. Iónové kanály prenášajú vždy pasívne
špecifické ióny typu Na+, K+, Ca2+ alebo Cl−.
Bielkovinové kanály plazmatickej membrány majú iónovú selektivitu t. j. dovo ujú difundova cez
seba iba iónom ur itého typu. Zdá sa, že sú dostato ne úzke, aby špecifický ión bol v tesnom kontakte
so stenami a aby prechádzali iba tie ióny, ktoré majú špecifický rozmer a náboj. Pri tom ión stráca
vä šinu asociovaných molekúl vody. Iónové kanály sú teda selektívnym filtrom. alšou osobitos ou
týchto kanálov, na rozdiel od jednoduchých pórov, je skuto nos , že nie sú odkryté bez obmedzenia.
Kanály majú vrátka, ktoré sa odkrývajú na ur itú dobu (neplatí pre ligand závislé iónové kanály). Vo
vä šine prípadov sa kanály otvárajú ako odpove na špecifické vybudenie membrány. Najznámejšími
typmi takýchto kanálov sú:
1. potenciál-závislé vrátkovacie kanály (voltage-gated channels), (reagujúce na zmenu membránového
potenciálu)
2. mechanicky otvárané kanály (stretch-activated channels), (reagujúce na mechanickú stimuláciu
membrány)
3. ligand-závislé iónové kanály (ligand-gated channels), (reagujúce na naviazanie molekulárnych signálov). Molekulárnymi ligandami môžu by :
• mimobunkové signály, nazývané neurotransmitery alebo neuromediátory (tieto kanály sa potom
nazývajú neuromodulátor-závislé kanály)
• vnútrobunkové signály také ako rôzne ióny (druhý posol-závislé kanály), nukleotidy (nukleotid-závislé kanály), alebo GTP-viažuce regula né bielkoviny (G-bielkovinou regulované kanály).
V sú asnej dobe je známzch viac ako 50 druhov iónových kanálov. Najviac rozšírené sú kanály pre
K+, ktoré boli nájdené v plazmatických membránach skoro všetkých živých buniek. Pretože sa zdá, že
pre ich otváranie nie je treba špecifické membránové vybudenie, nazývajú ich draslíkovými prietokovými kanálmi. Tieto sú zodpovedné za vytváranie membránového potenciálu – rozdielu elektrického
napätia, pozorovaného na dvoch stranách všetkých typov membrán.
94
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
6.2.1.3 Membránový potenciál
Membránový potenciál závisí od rozdelenia iónov po oboch stranách membrány. Ako uvidíme alej,
pumpy aktívneho transportu ((Na+ + K+)ATP-ázy) vytvárajú osmotickú rovnováhu v bunke tým, že
udržujú nízku vnútrobunkovú koncentráciu Na+. (Typické hodnoty koncentrácií iónov [mM] sú:
– v mimobunkovom prostredí 5 KCl, 140 NaCl, 10−4 CaCl2, 1 MgCl2, – vo vnútrobunkovom prostredí
130 KCl, 5 NaCl, 2,5 CaCl2 u loveka a 1,8 CaCl2 u obojživelníkov, 1 MgCl2). Bunky vyžadujú prebytok
iných katiónov, aby kompenzovali náboj fixovaných bunkových aniónov (takých ako HCO−3, PO3−,
vnútrobunkových bielkovín, nukleových kyselín, metabolitov s fosfátovými alebo karboxylovými skupinami a pod.) nachádzajúcich sa v bunke. Túto úlohu sp ajú ióny draslíka v aka K+ prietokovým kanálom,
ktoré dovo ujú vo ný priechod týchto iónov cez membránu a ich nasávanie do vnútra bunky v dôsledku
záporného náboja spomínaných aniónov (aj keby nepracovali žiadne pumpy typu (Na+ + K+)ATP-ázy).
V dôsledku toho sa nastaví rovnováha, pri ktorej elektrická sila, v ahujúca ióny K+ do vnútra bunky,
bude vyvážená snahou K+ unika z bunky v dôsledku gradientu koncentrácie tohto iónu vo vnútre
bunky. Membránový potenciál je vyjadrením tejto elektrickej energie a jeho ve kos môže by ur ená
kvantitatívne pomocou rovnice Nernsta, ktorá vyjadruje podmienky rovnováhy. Rovnica hovorí, že:
V = RT/ZF{ln C0/Ci} = Vi – V0
kde V je napätie vytvorené rovnovážnym stavom daného typu iónov na membráne (vyjadrujúce rozdiel
potenciálov na vnútornej (Vi) a vonkajšej (V0) strane membrány vo voltoch [V]), C0 a Ci sú vonkajšia
a vnútorná koncentrácia daného typu iónov príslušne, R je univerzálna termodynamická konštanta
(8,3 J·mol−1 ·K), T je absolútna teplota [K], F je Faradayova konštanta (2,3·104·4,18 J·V−1 ·mol−1),
Z je náboj iónu. Toto pokojové napätie na membráne nervových buniek kolíše od −70 mV do −100 mV
pre K+ a od +50 mV do +65 mV pre Na+.
Na základe tejto rovnice je možné ukáza , že pre to, aby sa vytvorilo na membráne napätie, je posta ujúce prenies cez membránu celkom malý po et iónov (vi 6.7.2.1.). Teda membránové napätie
vzniká v dôsledku takého premiestnenia nábojov, ktoré necháva koncentráciu iónov na oboch stranách
membrány prakticky nedotknutú. Prebieha iba neve ké prerozdelenie po tu kladne a záporne nabitých
iónov medzi stranami membrány a navyše toto prerozdelenie prebieha ve mi rýchle (za nieko ko ms).
(Na predstavu, v sférickej bunke o rozmere 10 µm už výtok jednej stotisícovej asti iónov K+ bude meni
potenciál membrány o 100 mV).
V rôznych typoch buniek membránový potenciál sa mení od −20 mV do −100 mV. Hoci gradient
K+ vždy vnáša najvä ší príspevok do tohto potenciálu, výrazný vplyv majú aj gradienty iných iónov.
ím je membrána priestupnejšia pre daný typ iónu, tým vä šmi membránový potenciál závisí od rovnovážnych podmienok pre daný ión. Teda prakticky pri ubovo nej zmene priepustnosti membrány pre
ióny prebieha zmena membránového potenciálu. Tento k ú ový princíp spája elektrickú excitabilitu
buniek s aktivitou iónových kanálov.
6.2.1.4 Potenciálovo-závislé vrátkovacie iónové kanály (Na+ kanál)
Takéto typy kanálov sa nachádzajú v plazmatických membránach elektricky vzrušivých buniek
(predovšetkým nervových a svalových) a sú zodpovedné za generovanie (vznik, vytvorenie) ak ného
potenciálu – t. j. rýchlych prúdových samošíriacich sa elektrických vybudení membrány. Ak né potenciály sú dvoch typov: sodíkovo-draslíkové (popísané v kapitole 6.2.1.2 a 6.2.1.3, resp. 6.7.) a kalciové
(popísané v kapitole 6.2.l.6.). V tejto kapitole si podrobnejšie všimneme vznik ak ného potenciálu na
báze Na+ kanálu.
Tento proces za ína pri depolarizácii membrány – t. j. posune membránového potenciálu k menej
záporným hodnotám. Podnet, ktorý vyvoláva iasto nú depolarizáciu, otvára okamžite potenciál-závislé
vrátkovacie Na+ kanály, o dovo uje neve kému po tu iónov Na+ vojs do bunky. Prítok kladných
nábojov následne depolarizuje membránu ešte viac, o vedie k otváraniu alších Na+ kanálov, ktoré
prepúš ajú alšie ióny Na+ a tým alej depolarizujú membránu. Proces trvá dovtedy, kým sa potenciál
lokálnej asti membrány nezmení od pokojovej hodnoty −70 mV do rovnovážneho potenciálu Na+,
ktorý sa rovná +50 mV. Pri tejto hodnote by bunka prišla do nového stavu rovnováhy, v ktorom všetky
Na+ kanály by boli permanentne otvorené, ak by konformácia otvoreného kanálu bola stabilná. Bunky
95
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
sú však chránené pred takýmto nepretržitým elektrickým „k om“, pretože Na+ kanály sa nachádzajú
pod kontrolou automatického inaktiva ného mechanizmu. Po otvorení sa tieto kanály rýchle zatvárajú,
neh adiac na depolarizáciu membrány. V takomto inaktivovanom stave sa nemôžu otvori dovtedy, kým
neprebehne nieko ko milisekúnd od zníženia membránového potenciálu na pôvodné záporné hodnoty.
Opísaný proces sa uskuto uje iba na neve kej asti plazmatickej membrány. Samosatvoriaca depolarizácia jednej asti membrány sta í na depolarizáciu susedných oblastí membrány, ktoré sa zapájajú
pri tom do prenosu ak ného potenciálu. Takým spôsobom sa ak ný potenciál šíri zo za iato ného úseku
depolarizácie na celú membránu. Podrobnejšie si tento proces všimneme v kapitole o procese prenosu
informácie po neuróne (6.7.2.2.).
Nukleotidová postupnos DNA, ur ujúca tvorbu Na+ kanálu bola ur ená v roku 1984. Kóduje jeden
dlhý polypeptidický re azec (1 800 aminokyselinových zvyškov), obsahujúci štyri homologické transmembránové domény (každá z nich obsahuje predpokladane šes α závitníc, prechádzajúcich cez
membránu). Tieto závitnice interagujú navzájom a vytvárajú steny póru, naplneného vodou. Jeden
z predpokladaných transmembránových segmentov obsahuje kladne nabité aminokyselinové zvyšky,
oddelené medzi sebou pravidelnými medzerami. Takéto zvyšky spolo ne plnia funkciu senzora potenciálu, zabezpe ujúc otváranie kanálu ako odpove na dostato nú depolarizáciu membrány.
Na+ kanál sa môže nachádza v jednom z najmenej troch stavov (konformácií). Vnútorné sily, ktoré
sú v tomto prípade predstavované interakciami nábojov, sa vyskytujú na rôznych stranách kanálu, stabilizujú každý stav a ochra ujú kanál od vplyvu neve kých porúch. Interakcie s inými molekulami môžu
vies k prechodu z jedného stavu do druhého. Stav s minimálnou energiou je ur ený membránovým
potenciálom, pretože rôzne konformácie majú rôzne rozloženie nábojov. V stave pokoju (ke je membrána silne polarizovaná) je kanál zavretý, ale nie je inaktivovaný. Je to najstabilnejší stav s najnižšou
vo nou energiou. Pri depolarizácii membrány bude stavom s nižšou energiou otvorená konformácia
a teda kanál sa otvorí. Vo ná energia inaktivovaného stavu je však ešte nižšia a po niektorej náhodnej
dobe trvania otvoreného stavu sa kanál zavrie, prejde do inaktivovaného stavu. Teda otvorená konformácia zodpovedá metastabilnému stavu a netrvá dlho. Po repolarizácii membrány sa kanál vráti do
stavu s najmenšou vo nou energiou pre polarizovanú membránu.
Proces potenciálovo závislého otvárania a zatvárania je možné pochopi na základe jednoduchých
fyzikálnych princípov. Vo vnútre pokojovej (nevybudenej) nervovej a svalovej bunky je elektrický
potenciál o 50 až 100 mV nižší, ako vonku. Takýto rozdiel potenciálov na oboch stranách membrány
sa môže zda neve kým, ale pri zvážení faktu, že hrúbka membrány je iba 5 nm, gradient potenciálu
bude rovný približne 100 000 V/cm. Teda membránové bielkoviny sa nachádzajú vo ve mi silnom
elektrickom poli. Prirodzene, že membránové bielkoviny, tak ako všetky ostatné bielkoviny, obsahujú
na svojom povrchu ur ité množstvo nabitých skupín. Elektrické pole zvä šuje sily, pôsobiace na štruktúru molekuly. V mnohých membránových bielkovinách zmeny elektrického po a na membráne nevyvolávajú pozorovate ný vplyv. Iónové kanály však získali v procese evolúcie jemnú vyváženú citlivos
na elektrické pole: môžu sa nachádza v nieko kých alternatívnych konformáciách, stabilita ktorých
závisí od veli iny elektrického po a. Malé poruchy (vybudenia) nevplývajú na konformácie kanálov,
ale pri dostato ne silných vplyvoch, napríklad náhodných tepelných pohyboch obklopujúcich molekúl,
môže prebehnú prechod k inej konformácii.
Jednotlivé Na+ kanály sa otvárajú pod a princípu „všetko alebo ni “. V otvorenom stave sa ich vodivos nemení a doby otvárania a zatvárania sú náhodné. Preto sumárny tok, te úci cez ve kú populáciu Na+ kanálov membrány celej bunky dáva predstavu nie o stupni otvorenia individuálneho kanálu,
ale iba o priemernej pravdepodobnosti, že takýto kanál je otvorený. Ak ný potenciál sa chová taktiež
pod a princípu „všetko alebo ni “, o je ve mi dôležité pri prenose správy bez skomolenia.
V plazmatickej membráne buniek kostrových svalov sa nachádza iba nieko ko stoviek Na+ kanálov
na jeden mikrometer štvorcový, t.j. jeden kanál na 10 000 molekúl fosfolipidu. Hoci ich hustota je tak
malá, sú tieto membrány elektricky vzrušivé, pretože každý kanál má ve mi vysokú vodivos , prechádza
ním viac ako 8 000 iónov za jednu milisekundu.
6.2.1.5 Mediátorovo-závislý katiónový kanál (acetylcholínový receptor)
Mediátorovo závislé (alebo modulátor, resp. transmiter-závislé) iónové kanály sú prispôsobené pre
transformáciu mimobunkových chemických signálov na elektrické signály. Sú uložené v špecializovaných
96
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
prepojeniach (chemických synapsiách) na rozhraní medzi nervovými bunkami a bunkami ter íkmi. Tieto
kanály sú schopné sa otvára na ur itú dobu ako odpove na pripojenie neuromediátora, uvo ovaného
synaptickou membránou nervu. Pri tom sa mení priepustnos postsynaptickej membrány ter íkovej
bunky. Na rozdiel od potenciálovo závislých kanálov sú mediátorovo závislé kanály relatívne necitlivé
k membránovému potenciálu a preto nie sú schopné vytvára proces samozosil ovacieho sa vybudenia.
Namiesto toho menia priepustnos membrány a tým vplývajú na membránový potenciál. Ve kos tejto
zmeny závisí od toho, ko ko mediátora sa uvo nilo v synapsii a po as akej doby je tam prítomný. Okrem
charakteristickej iónovej selektivity každý mediátorovo závislý kanál má ve mi špecifické väzobné
miesto pre svoj mediátor. Príkladom takéhoto kanálu je acetylcholínový receptor.
Acetylcholínový receptor je glykoprotein, ktorý je zložený z piatich transmembránových polypeptidov. Dva z nich sú jedného typu (α, α), tri alšie sú rôzne (β, γ, δ,). Kódujú sa štyrmi génmi. Dve
identické podjednotky majú v asti, tr iacej do mimobunkového priestoru, väzobné miesta pre naviazanie
acetylcholínu. Pri naviazaní dvoch molekúl mediátora s pentamérovým komplexom prebieha indukovaná konforma ná zmena, vedúca k otvoreniu kanála. Kanál sa otvára približne na jednu milisekundu
a potom sa zatvára. Tak ako v prípade Na+ kanálu je otvorený kanál krátkožijúcou konformáciou, ktorá
rýchlo prechádza do uzavretého stavu s menšou vo nou energiou. Molekuly acetylcholínu po zatvorení
kanálu disociuujú z komplexu s receptorom a hydrolyzujú sa špecifickým enzýmom (acetylcholinesterázou). Po uvo není mediátora sa receptor vráti k po iato nému pokojovému stavu.
Model kanálu predpokladá, že klastre záporne nabitých aminokyselinových zvyškov vystielajú otvor
kanálu. Záporne nabité ióny preto nemôžu prechádza cez kanál, zatia o kladne nabité ióny s rozmerom do 0,65 nm to môžu urobi . Cez kanál prechádzajú prednostne ióny Na+, K+, a tiež ur ité množstvo
iónov Ca2+. Prísne obmedzenia na typ katiónu neexistujú, preto tok každého z nich cez kanál sa ur uje
predovšetkým ich koncentráciami a elektrochemickými hybnými silami. Pretože gradient napätia
v prípade pokojového potenciálu vyrovnáva gradient koncentrácie K+ cez membránu, potom aj hybná
sila pre ióny K+ je blízka nule. Naopak pre ióny Na+ aj gradient napätia aj gradient koncentrácie pôsobia
v jednom smere a napomáhajú pohybu týchto iónov do bunky. To isté platí pre Ca2+, ale jeho mimobunková koncentrácia je omnoho menšia ako u Na+, a teda príspevok Ca2+ k celkovému toku iónov je
nepatrný. Preto otváranie acetylcholínových receptorových kanálov vedie k ve kému prítoku iónov
Na+ (maximálna rýchlos 30 000 iónov na jeden kanál za jednu milisekundu). Tento tok vyvoláva
depolarizáciu membrány, o slúži ako signál pre svalovú kontrakciu. Po et týchto kanálov v priestore
nervovosvalového spojenia je ve mi ve ký (až 20 000 receptorov na mikrometer štvorcový), v iných
miestach tej istej membrány je nepatrný.
6.2.1.6 Súbory iónových kanálov ako báza nervovo-svalového spojenia
Mimoriadnu úlohu iónových kanálov s „vrátkami“ je možné ilustrova na príklade stimulácie kontrakcie svalovej bunky prichádzajúcim nervovým impulzom. Táto na prvý poh ad jednoduchá akcia
spo íva v postupnom otváraní a zatváraní najmenej štyroch rôznych súborov kanálov s vrátkami a celý
tento proces prebieha v dobe kratšej ako jedna sekunda.
Prvou etapou tohto procesu (alebo jeho za iatkom) je okamžik, kedy nervový impulz dosahuje
nervové zakon enie a depolarizuje jeho plazmatickú membránu. Depolarizácia odkrýva na ur itú dobu
potenciál závislé vrátkovacie Ca2+ kanály v tejto membráne. Pretože koncentrácia vo ného Ca2+ mimo
bunky viac ako 1 000 krát prevyšuje koncentráciu vo ného Ca2+ v bunke, ióny vápnika te ú do vnútra
nervového zakon enia. Zvä šenie koncentrácie Ca2+ v cytozole nervového zakon enia stimuluje lokálne
uvo ovanie acetylcholínu do synaptickej štrbiny.
V druhej etape sa uvo nený acetylcholín viaže s acetylcholínovými receptormi na plazmatickej
membráne postsynaptickej svalovej bunky. To vyvoláva do asné otváranie katiónových kanálov receptorov. V dôsledku toho prítok Na+ vedie k lokálnej depolarizácii membrány svalovej bunky.
V tretej etape depolarizácia plazmatickej membrány svalovej bunky otvára vrátka potenciál závislých
Na+ kanálov tejto membrány, ím umož uje nasávanie ešte vä šieho množstva Na+ iónov. V dôsledku
toho prebieha zosilnenie depolarizácie membrány. To následne vedie k otvoreniu alších potenciál
závislých Na+ kanálov a nakoniec vzniká vlna depolarizácie (alebo ak ný potenciál), ktorá sa šíri
dovtedy, kým nezachváti celú svalovú membránu.
97
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
Štvrtá etapa spo íva v tom, že celková depolarizácia plazmatickej membrány svalovej bunky vedie
k do asnému otvoreniu Ca2+ kanálov v membránach sarkoplazmatického retikula a uvo neniu Ca2+ do
cytozolu. V dôsledku toho prebieha zvýšenie vnútrobunkovej koncentrácie Ca2+, ktoré vyvolá kontrakciu myofibríl v svalovej bunke (podrobnejšie v kapitole o kontraktilných štruktúrach 7.2.4.). Nie je
zatia známe, ako zmeny napätia na svalovej plazmatickej membráne vytvárajú signál pre otváranie
potenciál závislých Ca2+ kanálov v membráne sarkoplazmatického retikula. Iná možnos riešenia tejto
situácie spo íva v tom, že depolarizácia plazmatickej membrány svalu vyvolá aktiváciu mediátorových
ciest pre odovzdanie signálu na uvo nenie Ca2+ pomocou inozitolfosfolipidu (pozri 5.2.2.3.).
6.2.1.7 Membránové transportné bielkoviny a ionofóry ako prenáša e v pasívnom transporte
Proces, pomocou ktorého bielkoviny-prenáša e špecificky viažu a transportujú rozpustené molekuly
cez lipidickú dvojvrstvu, pripomína enzymatickú reakciu a transportné bielkoviny predstavujú osobitý
druh enzýmov, viazaných s membránou. V bielkovinách prenáša och všetkých typov sa vyskytujú
aktívne miesta pre prenášané molekuly (substráty). Ke je bielkovina nasýtená (ke všetky miesta
väzby sú obsadené), potom je rýchlos prenosu maximálna.
Táto rýchlos , ozna ovaná ako Vmax je charakteristikou danej bielkoviny prenáša a. Okrem toho
každá bielkovina-prenáša má charakteristickú väzbovú konštantu KM, rovnú koncentrácii transportovanej látky, pri ktorej rýchlos transportu tvorí polovicu jej maximálnej hodnoty. Väzba rozpustenej
látky môže by špecificky blokovaná jednak konkuren nými inhibítormi (konkurujúcimi s prenášanou
látkou o to isté miesto väzby) a jednak nekonkuren nými inhibítormi (viažucimi sa na iné lokality
molekuly mimo väzobných miest pre prenášanú látku, ale špecificky vplývajúcimi na štruktúru prenáša a).
V tomto prípade je analógia s reakciou enzým – substrát neúplná, pretože transportované látky obvykle
nie sú modifikované kovalentne bielkovinami prenáša mi.
Jednoduchý prenos látky z jednej strany membrány na druhú sa nazýva uniport. Niektoré prenáša e
pracujú ako kotransportné systémy, v ktorých prenos jednej rozpustenej látky závisí od sú asného alebo
následne idúceho prenosu inej látky bu v tom istom smere, ako sa prenáša prvá látka (symport), alebo
v protismere (antiport).
Molekulárny mechanizmus práce bielkovín prenáša ov nie je dosia známy. Predpokladá sa, že
tieto molekuly prenášajú rozpustené látky cez membránu, striedajúc pritom vratne rôzne konforma né
stavy, ktoré im dovo ujú postupne exponova miesta väzby pre rozpustené látky raz z jednej, druhý
krát z druhej strany. Vie sa, že prenáša e sú transmembránové bielkoviny, ktorých re azec prechádza
cez dvojvrstvu nieko kokrát. Je ve mi málo pravdepodobné, že takéto bielkoviny neprestajne preskakujú
v membráne z jednej vrstvy na druhú, alebo prechádzajú spôsobom „vpred a nazad“ cez lipidickú
vrstvu, ako sa to kedysi predpokladalo. Existujúce modely vychádzajú z toho, že štruktúra prenáša a,
ktorý realizuje iba pasívny transport, by mala by ve mi podobná štruktúre prenáša a, ktorý po pripojení zdroja energie vykonáva funkciu pumpy (pozri nasledujúcu kapitolu 6.2.1.8.).
Príkladom bielkoviny typu prenáša a je (Na+ + H+) prenáša -výmenník. Tento typ hrá k ú ovú úlohu
pri udržaní vnútrobunkovej hodnoty pH (alebo pHi, obvykle asi 7.1 až 7.2). Tento prenáša zabezpeuje spriahnutie výtoku iónov H+ s prítokom iónov Na+ a tým odstra uje prebytok iónov H+, vytvárajúci
sa v dôsledku bunkových procesov oxydácie. Práca tohto výmenníka sa reguluje hodnotou pH. Ak hodnota pH (pHi) je vyššia ako 7.7, výmenník je neaktívny, ak pHi klesá, aktivita výmenníka sa zvä šuje.
Takáto regulácia je daná väzbou H+ s regula nou lokalitou výmenníka, nachádzajúcou sa na cytoplazmatickej strane. Pri udržaní hladiny pHi hrá dôležitú úlohu aj (Cl− + HCO−3) výmenník, ktorý je totožný
s bielkovinou tretieho pásu z membrán erytrocytov. Práca tohto výmenníka sa reguluje opä hodnotou
pHi, ale opa ným spôsobom. Aktivita tohto výmenníka rastie pri zvýšení pHi a zvä šuje rýchlos
vylu ovania HCO−3 z bunky výmenou za Cl−, takým spôsobom sa znižuje hladina pHi.
Iným druhom podobných látok sú ionofóry. Sú to neve ké hydrofóbne molekuly, ktoré sa rozpúš ajú
v lipidických dvojvrstvách a zvyšujú ich priepustnos pre ióny. Existujú dva druhy ionofórov: pohyblivé prenáša e iónov a kanálotvorné ionofóry. Oba druhy pracujú tým spôsobom, že tienia náboj transportovaného iónu tak, aby tento mohol prejs cez hydrofóbnu vnútornú oblas lipidickej dvojvrstvy.
Pretože ionofóry nie sú spojené so žiadnymi zdrojmi energie, dovo ujú iónom pohybova sa iba po ich
elektrochemických gradientoch.
98
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
Príkladom pohyblivého prenáša a iónov je valinomycín. Je to polymér, ktorý prenáša K+. Má
prstencovú štruktúru. Vonkajšia hydrofóbna as sa skladá z bo ných re azcov valínu a kontaktuje
s uh ovodíkovou centrálnou as ou lipidickej dvojvrstvy. Vo vnútornej polárnej oblasti sa môže
umiestni jeden ión K+. Valinomycín prenáša K+ po jeho elektrochemickom gradiente. Zachytí ión na
jednej strane membrány, difunduje na druhú stranu a uvo ní ho na druhej strane.
Príkladom kanálotvorného ionofóru je gramicidín A. Je to lineárny polypeptid, ktorý má 15 aminokyselinových zvyškov, všetky majú hydrofóbne bo né re azce. Dve molekuly gramicidínu sa spájajú
v dvojvrstve a vytvárajú transmembránový kanál, dovo ujúci monovalentným katiónom (naj ahšie H+,
menej K+ a ažko Na+) prechádza po ich elektrochemickom gradiente. Podobné diméry sú nestabilné,
neustále sa vytvárajú a disociuujú, takže doba, po as ktorej je kanál otvorený, je priemerne jedna
sekunda. V prípade ve kého elektrochemického gradientu gramicidín A môže prepusti až 20 000
katiónov na jeden otvorený kanál za jednu milisekundu, t. j. asi 1 000 krát viac ako prenesie za ten istý
as jedna molekula pohyblivého prenáša a. Gramicidín je antibiotikum, jeho pôsobenie je založené na
tom, že tento kanál ovplyv uje normálne gradienty koncentrácií H+, Na+, a K+.
6.2.1.8 Transmembránové bielkoviny ako pumpy v aktívnom transporte
Proces, ktorý poznáme pod názvom aktívny transport a ktorý dovo uje bunke prenáša rozpustené
látky proti ich elektrochemickému gradientu, sa vždy uskuto uje transmembránovými bielkovinami-prenáša mi. Pri aktívnom transporte „pumpovacia“ aktivita prenáša ov je vždy usmernená, pretože je
úzko spojená so zdrojom metabolickej energie, takým ako hydrolýza ATP alebo gradient iónov.
Základnou transmembránovou bielkovinou-prenáša om tohto typu je (Na+ + K+) pumpa plazmatickej membrány. Táto pumpa pracuje na princípe antiportu, aktívne pumpuje Na+ z bunky a K+ dovnútra
bunky proti ich strmým elektrochemickým gradientom. Na prácu tejto pumpy sa minie skoro 1/3 celej
energie, potrebnej pre existenciu bunky (v nervových bunkách až 2/3 tejto energie).
(Na+ + K+) pumpa predstavuje v sebe dva navzájom spojené prvky a dva spriahnuté procesy. Prvkami
sú enzým ATP-áza a prenáša (Na+ + K+). Spriahnutými procesmi sú transport iónov a hydrolýza ATP.
Preto pumpu nazývame tiež (Na+ + K+)-ATP-áza. Je to tetramér α2β2 s hmotnos ou 270 kDa. Ve ká
podjednotka (95 kDa) obsahuje miesta väzby pre hydrolýzu ATP a pre naviazanie Na+ na strane cytoplazmy, a miesta väzby pre naviazanie K+ a kardiotonického steroidného inhibítora (napr. uabain) na
vonkajšej strane membrány. Menšiu β jednotku tvorí malý glykoproteín.
Pri analýze innosti pumpy sa zistilo:
• transport iónov Na+ a K+ a hydrolýza ATP sú úzko spojené navzájom a ani jeden z procesov sa
neuskuto uje oddelene od druhého,
• transport iónov a hydrolýza ATP prebieha len vtedy, ke Na+ a ATP sú vo vnútre bunky a K+ zvonku,
• uabain inhibuje ATP-ázu len na vonkajšej strane membrány, kde konkuruje s K+ o miesto väzby,
• pri hydrolýze každej molekuly ATP (maximálny po et obratov ATP-ázy je asi 100 s−1) sa vylú ia
3 ióny Na+ z bunky a 2 ióny K+ prejdú do bunky.
Model innosti ATPázy je nasledovný:
Väzba Na+ a následná fosforylácia ATP-ázy zo strany cytoplazmy indukuje v bielkovine konforma né
zmeny, v dôsledku ktorých sa Na+ prenáša cez membránu a uvo uje do mimobunkového priestoru.
Následne väzba K+ na vonkajšom povrchu a s tým spojená defosforylácia transformujú bielkovinu do
pôvodnej po iato nej konformácie, pritom K+ prechádza cez membránu a uvo uje sa do cytoplazmy.
Tento zjednodušený opis nevysvet uje po ty prenášaných iónov. Reálne existujú zrejme tri väzobné
miesta pre Na+ a dve pre K+.
Práca pumpy generuje elektrický tok cez membránu, ktorý vytvára elektrický potenciál so zápornou
hodnotou na vnútornej asti membrány vo i vonkajšej asti (pumpa je „elektrogénna“). Tento efekt
pumpy však prispieva iba 10 % k tvorbe hodnoty membránového potenciálu. Zvyšok (90 %) potenciálu
sa generuje pumpou nepriamo a to v dôsledku vzniku a udržiavania rozdielnej koncentrácie K+ na oboch
stranách membrány. Zvýšenie koncentrácie K+ vnútri bunky je nevyhnutné na vyrovnanie ve kého
sumárneho záporného náboja, vyvolaného fixovanými bunkovými aniónmi (množstvom záporne nabitých organických molekúl, nachádzajúcich sa vo vnútre bunky a neschopných uniknú cez plazmatickú
membránu).
99
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
(Na+ + K+)-ATP-áza hrá bezprostrednú úlohu v regulácii bunkového objemu. Kontroluje koncentráciu roztokov vo vnútri bunky a následne aj osmotické sily, vedúce k napú aniu alebo zmenšovaniu
bunky. Roztoky vnútri bunky udržujú ve ký osmotický gradient, nasávajúci vodu do vnútra bunky.
V živých bunkách sa tento efekt neutralizuje vysokými koncentráciami anorganických iónov (najmä
Na+ a Cl−), ktoré sa nachádzajú v mimobunkovom priestore. (Na+ + K+)-ATP-áza udržuje osmotickú
rovnováhu, pretože pumpuje ióny Na+ (ktoré môžu pomaly vteka do bunky po stup ovitom gradiente)
von z bunky. Ióny Cl− sa udržujú mimo bunky v aka membránovému potenciálu.
(Na+ + K+)ATPáza nie je jediným typom membránovo viazanej pumpy. Aj niektoré Ca2+pumpy sú
tiež membránovo viazané ATP-ázy, príkladom môže by (Ca2+)-ATP-áza sarkoplazmatického retikula
svalov. Tento typ pumpy presúva Ca2+ z cytozolu do sarkoplazmatického retikula a tým vytvára podmienky pre návrat svalu po kontrakcii do pokojového stavu. (Ca2+)-ATP-áza má zloženie homologické
s ve kou katalytickou jednotkou (Na+ + K+)-ATP-ázy, o hovorí o evolu nej príbuznosti týchto dvoch
druhov púmp.
ATP-ázy môžu pracova aj v opa nom smere, kedy namiesto hydrolýzy ATP (zabezpe ujúcej
transport iónov), katalyzujú syntézu ATP (z ADP a fosfátu), uskuto ovanú v dôsledku prítomnosti
gradientu protónov na membránach, v ktorých sú zabudované. Gradient H+ vzniká po as jednotlivých
etáp transportu elektrónov v priebehu oxida nej fosforylácie alebo fotosyntézy a tiež pomocou fotoaktivujúcej sa protónovej pumpy (bakteriorodopsínu v halobaktériách). Takéto enzýmy, v norme syntetizujúce ATP, sú nazývané syntetázy. Aj tieto, tak ako transportné ATP-ázy, sú schopné bu hydrolyzova
ATP a nasáva H+ do vnútra bunky, alebo syntetizova ATP pri prechode toku iónov H+ cez molekulu
enzýmu v opa nom smere (pozri 6.2.1.9, resp. 6.6.2.5).
Aktívny transport sa môže uskuto ova aj s pomocou iónových gradientov tým spôsobom, že systém
bude pracova ako párový transportér, v ktorom jedna zo zložiek v dôsledku svojho elektrochemického
gradientu zabezpe uje aktívny transport zložky druhého typu. Príkladom je ión Na+, ktorý týmto spôsobom presúva do bunky aminokyseliny alebo sacharidy. V takýchto systémoch sa rozpustené molekuly
a ióny Na+ viažu špecificky s rôznymi lokalitami na bielkovine-prenáša i. Na+ sa snaží vojs do bunky
po svojom elektrochemickom gradiente, a tým akoby „v ahuje“ molekuly sacharidu alebo aminokyseliny do bunky spolu so sebou. ím vyšší je gradient Na+, tým je rýchlejšie nasávanie rozpustených
molekúl spätne sa Na+ z bunky pumpuje ATP-ázou.
Základom medzibunkového transportu rozpustených malých molekúl je asymetrické rozdelenie
bielkovín-prenáša ov v bunkách (napr. epitelu). Tým sa dosiahne prechodový transport pohlcovaných
rozpustených látok cez bunku. Príkladom je spojenie Na+ závislého symportu glukózy cez apikálny
(nasávajúci) membránový povrch epitelovej bunky (zo strany reva) s Na+ nezávislými transportnými
bielkovinami (prenáša mi) glukózy na bazálnej a laterálnej membráne epitelovej bunky (zo strany krvnej
cievy). Gradient Na+ udržujú (Na+ + K+)-ATP-ázy na plazmatickej membráne. Plochu plazmatickej
membrány možno v tomto prípade mimoriadne (až 25-krát) zvä ši využitím existencie mikrovláskov
na apikálnom povrchu (smerom do reva), o samozrejme zvyšuje aj transportné možnosti bunky.
6.2.1.9 Protónová pumpa aktivovaná svetlom (bakteriorodopsín)
Na to, aby bolo možné pochopi prácu membránových transportných bielkovín, je nevyhnutná presná
informácia o ich trojrozmernej štruktúre pri zabudovaní do dvojvrstvy. Prvou transportnou bielkovinou,
pre ktorú boli takéto detaily ur ené, bol bakteriorodopsín – bielkovina, pracujúca ako fotoaktivovaná
protónová (H+) pumpa v plazmatickej membráne niektorých baktérií. Ako sme už spomínali, takýto
typ pumpy pracuje v „purpurovej“ membráne baktérií Halobaktérium halobium. Každá molekula pumpy
má jednu prostetickú skupinu alebo chromofór (retinal – príbuzný vitamínu A). Retinal pohlcuje svetlo
a je kovalentne spojený s bo ným re azcom lyzínu v bielkovine. Chromofór, aktivovaný jedným kvantom svetla, sa vybudí a vyvoláva konforma né zmeny v bielkovine, v dôsledku oho sa dva protóny
prenášajú z vnútorného povrchu bunky na vonkajší povrch. V bunke sa tým postupne vytvára gradient
protónov a gradient elektrického potenciálu. Ich vznik umož uje syntézu ATP so spoluú as ou alšej
bielkoviny bunkovej plazmatickej membrány.
Molekuly bakteriorodopsínu vytvárajú v membráne plochú kryštalickú mriežku, podobnú dvojrozmernému kryštálu. Každá molekula je zložená zo siedmich α závitníc (každá z nich obsahuje 25 aminokyselinových zvyškov) ktoré sú kompaktne uložené ved a seba. Takéto závitnice pretínajú štruktúru
100
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
dvojvrstvy približne kolmo k jej povrchu. Je celkom možné, že protóny prechádzajú cez membránu
s ú as ou chromofóru po spriahnutom systéme bo ných re azcov α závitníc, detaily tohto procesu nie
sú zatia dostupné. Bakteriorodopsín patrí ku skupine membránových bielkovín, ktoré majú rovnakú
štruktúru, ale rôzne vlastnosti. Jeho príbuzný rodopsín (receptor svetla v ty inkách sietnice oka) funguje
ako prenáša signálu na rozdiel od bakteriorodopsínu, ktorý plní funkcie pumpy.
Baktérie majú ešte jeden spôsob aktívneho transportu, a to vektorový alebo usmernený prenos skupín.
Pri takomto spôsobe sa molekuly, vstupujúce do bunky pomocou pasívneho transportu, chemicky
modifikujú tak, aby už nemohli bunku opusti . Napr. sacharidy po prenose cez plazmatickú membránu
sa fosforylujú, ím sa stávajú nabité a nemôžu vratne prechádza membránou z bunky von. Tým, že sa
fosforylujú, zostáva koncentrácia ich nefosforylovaných analógov v bunke nízka a to umož uje neustále
tieto sacharidy pasívnym transportom prenáša do vnútra bunky pomocou ich elektrochemického gradientu (hoci ich koncentrácia v bunke v skuto nosti neustále stúpa – preto aktívny transport). Pretože
sa fosfátové skupiny prenášajú na molekuly transportovaných látok až po ich prenose membránou,
nazývajú tento typ aktívneho transportu usmerneným prenosom skupín.
6.2.2 Prenos makromolekúl a astíc cez membránu (exocytóza a endocytóza)
Vä šina buniek vylu uje a pohlcuje makromolekuly v procesoch exocytózy a endocytózy. Pri exocytóze sa obsah transportných alebo vylu ovacích mechúrikov uvo uje do mimobunkového priestoru
vtedy, ke sa mechúriky zlievajú s plazmatickou membránou. Pri endocytóze proces prebieha v opa nej
postupnosti: lokálne asti plazmatickej membrány sa vtlá ajú do bunky a spájajú tak, že vytvárajú
endocytózový mechúrik. Vä šina astíc, pohltených pri endocytóze, sa prenáša do lyzozóm, kde sú
podrobené degradácii. Ako exocytóza, tak aj endocytóza môžu by bu konštitutívne (nepretržite
prebiehajúce v bunke; nie sú vyvolané žiadnou prí inou; mechúriky sa v tomto prípade nazývajú transportné), alebo indukované (regulované) ako odpove na vonkajšie signály (prenášané molekuly sú
v tomto prípade udržiavané v špeciálnych vylu ovacích alebo sekre ných mechúrikoch).
Vä šina buniek nepretržite uskuto uje endocytózu fragmentov svojej plazmatickej membrány
a potom tieto fragmenty vracia naspä na bunkový povrch v cykle endocytóza-exocytóza. Tento cyklus
je sprostredkovaný v princípe as ami membrány, pomenovanými jamkami a z nich vznikajúcimi
mechúrikmi, pri vytváraní ktorých spolupracuje špeciálny bielkovinový komplex – klatrín. Mnohé
povrchové receptory, viažuce špecificky mimobunkové makromolekuly, sa rozmiest ujú v klatrínom
„olemovaných“ jamkách a následne sa stávajú as ou obsahu opä klatrínom „olemovaných“ mechúrikov. Tento proces sa nazýva receptorovo-sprostredkovanou endocytózou. Klatrínom olemované
endocytózové mechúriky v bunke rýchle strácajú svoj klatrinový obal a zlievajú sa s endozómami,
v ktorých prebieha oddelenie receptorov a ligandov. Vä šina ligandov sa oddelí od receptorov vo vnútri
endozómy a prenesie sa nakoniec do lyzozóm. Vä šina receptorov sa vracia spolu s transportnými mechúrikmi naspä na bunkový povrch pre opätovné použitie. Sú známe ale aj komplexy receptor-ligand,
ktoré unikajú inou cestou z endozómových kompartmentov. Niekedy sa komplex receptor-ligand prenáša
cez celú bunku a ligand sa uvo ní až na druhom povrchu bunky pomocou exocytózy. Tento proces sa
nazýva transcytóza. Zatia nebol pochopený ani jeden z týchto mechanizmov.
Niektoré závery je možné urobi z analýzy zlievania obálok vírusov, ktoré majú membránu, s bunkami pri infekcii. Bunkové membrány sa nikdy nezlievajú samovo ne. Pre to, aby sa membrány zlievali
treba, aby molekuly vody boli vytesnené interagujúcimi lipidickými dvojvrstvami, ktoré sa musia
zblíži do vzdialenosti 1,5 nm medzi sebou. Tento proces je energeticky ve mi nevýhodný. Preto je
pravdepodobné, že zlievanie všetkých membrán v bunkách sa katalyzuje špeciálnymi bielkovinami
zlievania. Takéto bielkoviny neboli zatia identifikované v bunkách, ale zistilo sa, že tento druh bielkovín hrá k ú ovú úlohu pri prenikaní membránou obalených vírusov (napr. vírus chrípky) do bunky.
Pre konkrétny typ bielkoviny zlievania (fuzogénu) vírusu chrípky (jedná sa o membránový glykoproteín
s názvom hemaglutinín) bola ur ená trojrozmerná štruktúra a zistilo sa, že pri nízkom pH sa v takejto
bielkovine indukujú ve ké konforma né zmeny, vedúce na jej povrchu k exponovaniu predtým schovanej
hydrofóbnej oblasti. Tým sa umož uje jej interakcia s lipidickou dvojvrstvou ter íkovej membrány.
Zdá sa, že klaster takýchto hydrofóbnych oblastí, uložených navzájom ved a seba v molekule bielkoviny
zlievania, vedie dve blízke lipidické dvojvrstvy k tesnému kontaktu a destabilizuje ich tak, že sa
dvojvrstvy zlievajú.
101
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
6.2.2.1 Špeciálne štruktúry endocytózy a exocytózy
„Olemované jamky“ (coated vesicles) sú špecializované oblasti plazmatickej membrány (pozri obr. 13a).
Na báze takýchto štruktúr sa vytvára „olemovaný mechúrik“. V týchto špecializovaných astiach
membrány sa nachádza nieko ko prevládajúcich bielkovín. Jednou z nich, doteraz najlepšie charakterizovaných, je klatrín (clathrin). Je to bielkovinový komplex, skladajúci sa z troch dlhých a troch
krátkych polypeptidických re azcov, tvoriacich spolu trojvalentný bielkovinový komplex (triskelion).
Tieto komplexy vytvárajú na cytoplazmatickom povrchu membrány sie ovité štruktúry z šes uholníkov
a pä uholníkov, podobné košíku (pozri obr. 13b1, 13b2). Dlhšie re azce triskelionu sú uložené tak, aby
sa vzájomne prekrývali s re azcami alších triskelionov, a krátke re azce smerujú od dlhších „dolu“
(smerom ku membráne) ako nôžky stoli ky. To, že sa ohybné re azce prekrývajú, pridáva takejto
štruktúre jednak mechanickú odolnos a jednak pohyblivos .
Obr. 13 Ilustrácia olemovaných jamiek a klatrínovej obálky
Ostatné prevládajúce bielkoviny, ktoré sú kompaktnejšie viazané s membránou olemovaných jamiek,
sú nevyhnutné pre väzbu klatrínovej obálky na membránu a pre vychytávanie rôznych receptorov plazmatickej membrány. Predpokladá sa, že vtlá anie (v ahovanie) olemovanej jamky smerom do bunky
a vznik mechúrika sa uskuto uje v dôsledku síl, vznikajúcich pri väzbe klatrínu na tie povrchové
bielkoviny, ktoré sa nachádzajú na cytoplazmatickej strane plazmatickej membrány. Po vytvorení
olemovaného mechúrika sa klatrín spolu s pripojenými bielkovinami odde uje od membrány mechúrika
a vracia sa do plazmatickej membrány na vytváranie alších olemovaných jamiek. (Pomocou štúdia
plazmatickej membrány fibroblastov, rastúcich v kultúre, sa zistilo, že za jednu minútu sa z membrány
jednej bunky odlepuje približne 2 500 olemovaných mechúrikov. Doba života olemovanej jamky je
približne jedna minúta, na konci tejto doby sa vytvára olemovaný mechúrik, ktorého doba života je
ešte menšia, pretože ve mi rýchle stráca klatrínový obal a zlieva sa s endozómom.)
Existujú najmenej dva typy olemovaných jamiek a mechúrikov:
1. typ s klatrínovou obálkou, ktorý môže vytvára ve mi zložité štruktúry a rozpoznáva špecifické
makromolekuly pre zabezpe enie ich transportu do vnútra bunky,
2. typ bez klatrínovej obálky, ktorý takýto špecifický transport urobi nemôže.
Nie je však jasné, ako sa iniciuje vznik takýchto jamiek, vznik mechúrikov a oddelenie klatrínu.
Transport špecifických makromolekúl z mimobunkového priestoru, uskuto nený pomocou receptorov
na povrchu olemovanej jamky, sa (ako sme už uviedli) nazýva receptorovo-sprostredkovanou endocytózou. Takýto typ endocytózy zabezpe uje mechanizmus selektívneho koncentrovania špecifických
ligandov, až tisíc krát ú innejší, ako normálny proces endocytózy. Príkladom môže by použitie lipoproteínov pri prenose cholesterolu (5.2.3). Doteraz je známych viac ako 25 rôznych receptorov pre rôzne
molekuly, zú ast ujúce sa endocytózy. Všetky používajú tú istú cestu do vnútra bunky – cez olemované
jamky. Jamky teda v tomto prípade pracujú ako molekulárne filtre, ktoré výberovo zhromaž ujú na
svojom povrchu ur ité bielkoviny a vylu ujú prítomnos iných. Ukazuje sa, že v lokalite olemovanej
102
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
jamky sa môže zhromaždi až 1 000 receptorov rôznych typov. Akéko vek komplexy receptorov s ligandmi, využívané v procese endocytózy v olemovaných klatrínových mechúrikoch, zrejme postupujú
do jednej a tej istej endozómy. Následný osud takýchto molekúl je však ur ený typom receptora.
Endocytózový cyklus má zrejme vz ah k pohyblivosti buniek a k fenoménu vytvárania klastrov
špecifických bielkovín na membráne (patching – pláta ) ako aj k presúvaniu týchto klastrov po povrchu
bunky na jedno miesto, kde vytvárajú tzv. „ iapku“ (cap). Jedna z možností vytvorenia takýchto útvarov
spo íva v tom, že v bunkách, ktoré sa pohybujú po substráte (napr. fibroblast) vzniká usmernený membránový tok v dôsledku asymetrie cyklického procesu endocytóza-exocytóza. Tento membránový tok
prenáša ve ké klastre spojených molekúl bielkovín na zadnú as bunky, zatia o vo né (nezošité)
bielkoviny pomerne rýchle difundujú po membráne a ich distribúcia zostáva náhodnou. Alternatívna
hypotéza spo íva v tom, že klastre membránových bielkovín interagujú s pohyblivým systémom vnútrobunkových filamentov a tubulov a tento premiest uje klastre k zadnému koncu bunky. Ani jedna z týchto
hypotéz nie je ešte dokázaná.
S otázkou vytvárania klastrovej iapo ky na membráne (capping, patching) súvisí aj pohltenie
astíc, ktoré na svojom povrchu nesú špecifické receptory. Takéto pohltenie sa uskuto uje v procese
fagocytózy, o je špeciálna forma endocytózy. Pri fagocytóze sa pohlcujú ve ké astice, mikroorganizmy
alebo celé asti buniek pomocou ve kých endocytózových mechúrikov, nazývaných fagozómy. Zatia
o olemované mechúriky majú pomerne malý rozmer (asi 150 nm v priemere), fagozómy majú priemer
ur ený rozmermi pohlcovanej astice (spravidla vä ší ako 250 nm). asto môžu by temer takej ve kosti, ako samotné fagocytujúce bunky. V cicavcoch existujú dve triedy leukocytov, sprostredkujúce
fagocytózu: makrofágy a neutrofily (o ich aktivite môže sved i fakt, že makrofágy denne pohltia
v loveku 1011 starých erytrocytov).
Fagozómy sa zlievajú s lyzozómami a vytvárajú fago-lyzozómy. V tých prebieha degradácia pohlteného materiálu. Nespracované produkty zostávajú vo fagolyzozómach a vytvárajú tzv. zvyškové
teliesko. asti pohltených zložiek vlastnej plazmatickej membrány sa tak ako pri endocytóze vrátia
spä do plazmatickej membrány. Na to, aby fagocytóza prebehla, sa musia najskôr pohlcované astice
spoji s povrchom fagocytu. Všetky pripojené astice sa však nepohltia. Existuje súbor špecializovaných
povrchových receptorov, funk ne viazaný s fagocytózou. Na rozdiel od pinocytózy (konštitutívneho
procesu endocytózy s pomocou malých mechúrikov, ktorá prebieha nepretržite) je fagocytóza indukovaný
proces. V jeho priebehu aktivované receptory odovzdávajú signál do vnútra buniek pre iniciáciu odpovede a lokálnou reakciou asti plazmatickej membrány a ležiacich pod ou cytoplazmatických štruktúr
na takýto signál je fagocytóza.
Ak sa makrofág spája s ter íkovými bunkami, pokrytými rovnomerne protilátkami, pohlcuje takéto
bunky. Ak však sú molekuly protilátok sústredené v dôsledku klastrovania (capping) na jednom póle
bunky, potom plazmatická membrána makrofága sa zbližuje s povrchom ter íkovej bunky iba v asti,
ktorá je pokrytá klastrom. Spojenie ter íkovej bunky s makrofágom iba indukuje postupne sa šíriaci
proces spojenia membrán (nasúvanie membrány makrofága na ter íkovú membránu) ale uskuto nenie
tohto procesu vyžaduje nepretržitý kontakt receptorov s protilátkami. Iba pri tejto podmienke pohlcovaná
bunka bude úplne obklopená fagozómou. Znamená to, že fagocytóza prebieha spôsobom, pripomínajúcim
„zazipsovanie“ membrány pomocou mechanizmu, pôsobiaceho ako zips. Žiaden z týchto mechanizmov
nie je dnes ešte známy.
Zliepanie dvojvrstviev a zjednocovanie dvojvrstiev sú postupné etapy zlievania membrán. Sú to
fundamentálne bunkovo-membránové procesy, prebiehajúce nielen pri exocytóze alebo endocytóze,
ale aj pri delení alebo zlievaní buniek.
6.3 Funkcia vnútorných membrán eukaryotickej bunky [1]
6.3.1 Priestorové rozdelenie eukaryotickej bunky (kompartmentalizácia)
Eukaryotické bunky obsahujú vnútrobunkové membrány, ktoré uzavierajú skoro polovicu celkového
objemu bunky do jednotlivých vnútrobunkových špecializovaných priestorov – kompartmentov.
Základné typy membránových organel vo všetkých eukaryotických bunkách sú: endoplazmatické
retikulum, Golgiho aparát, jadro, mitochondrie, lyzozómy, endozómy a peroxizómy; rastlinné bunky
obsahujú tiež chloroplasty. Každá organela obsahuje vo svojej výbave rôzne bielkoviny, ur ujúce jej
103
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
unikátne funkcie. Centrálnu úlohu v kompartmentalizácii eukaryotickej bunky hrajú bielkoviny. Bunka
cicavca obsahuje približne 1010 molekúl bielkovín zhruba asi 10 000 rôznych typov. Syntéza skoro
všetkých bielkovín za ína v cytozole (spolo nom priestore bunky), obklopujúcom všetky organely.
Každá nanovo syntetizovaná bielkovina organel prechádza od ribozómu do organely osobitou dráhou,
ur enou bu signálovým peptidom alebo signálovou as ou. Triedenie bielkovín za ína z primárnej
agregácie, pri ktorej bielkovina bu zostáva v cytozole, alebo sa prenáša do druhého kompartmentu.
Bielkoviny, vstupujúce do endoplazmatického retikula (ER) sa alej triedia pod a toho, ako sa prenášajú
do Golgiho aparátu (GA) a potom z tohto aparátu do lyzozóm, do sekre ných mechúrikov alebo k plazmatickej membráne (PM). Bielkoviny, ur ené pre druhé kompartmenty, zdá sa, sú umiest ované do
transportných mechúrikov, ktoré sa odliepajú od jednoho kompartmentu a zliepajú s druhým.
Cytozol, tvoriaci obvykle asi polovicu objemu eukaryotickej bunky, predstavuje celý vnútrobunkový
priestor bez organel. V cytozole prebieha vä šina reakcií sekundárnej výmeny a syntézy bielkovín. Ak
novosyntetizované bielkoviny nemajú ozna enie pre transport do organel (definovanú signálnu sekvenciu), zostávajú v cytozole. Niektoré z týchto bielkovín sa deštruujú ve mi skoro po syntéze. Jediná
„destabilizujúca“ aminokyselina na ich N-konci napomáha pripojeniu mnohých molekúl ubiquitínu
(termostabilná bielkovina – pridanie re azca týchto molekúl k bielkovine znamená okamžitú degradáciu
bielkoviny, pridanie jednej takejto molekuly je vratnou modifikáciou s regula nou úlohou) k špecifickým zvyškom lyzínu ter íkovej molekuly. Takúto bielkovinu molekuly ubiquitínu po pripojení deštruujú
s pomocou ATP-závislej proteázy. Defektné kopie vä šiny cytozolových bielkovín sa likvidujú prostredníctvom tohto ubiquitín-závislého mechanizmu.
Mnohé bielkoviny sa podria ujú v cytozole kovalentným modifikáciám. Niektoré z týchto modifikácií sú stále a iné (napr. fosforylácia) sú vratné a hrajú dôležitú úlohu v regulácii aktivity týchto bielkovín. K ur itým bielkovinám sa kovalentne pripájajú karboxylové kyseliny. Potom bielkovina, ktorá bola
bez takýchto modifikácií rozpustná, nadobúda schopnos viaza sa s cytoplazmatickým povrchom
bunkovej membrány.
Jadro je uzavreté do obálky, zloženej z dvoch koncentrických membrán. Vonkajšia jadrová membrána prechádza do membrány ER a priestor medzi vonkajšou a vnútornou jadrovými membránami
prechádza do dutiny ER. Molekuly RNA a ribozómy sa vytvárajú v jadre a prenášajú sa do cytozolu,
zatia o všetky bielkoviny, ktoré sú zložkami jadra, sa syntetizujú v cytozole a prenášajú do jadra.
Výmena materiálu medzi jadrom a cytoplazmou prebieha cez póry jadra, zabezpe ujúce priame spojenie
cez vnútornú a vonkajšiu jadrovú membránu.
Bielkoviny, obsahujúce signály jadrového importu, sa aktívne prenášajú do jadra cez spomínané
póry. Tieto bielkoviny sa rozpoznávajú pod a krátkych kladne nabitých signálnych peptidov. Pretože
sa signálny peptid neodstra uje po prenose, jadrové bielkoviny sú prenášané z jadra a do jadra pod a
potreby (napríklad vtedy, ke sú nevyhnutné pri rekonštrukcii jadra po mitóze). Molekuly mRNA
a možno aj podjednotky ribozómu sa aktívne prenášajú cez póry z jadra do cytoplazmy.
Vä šina bielkovín preniká do mitochondrií a chloroplastov z cytozolu podobným spôsobom. Tento
mechanizmus bol najlepšie preštudovaný pre mitochondrie, zvláš u kvasiniek. Bielkovina sa prenáša
do matrixu mitochondrií cez zóny zliepania vonkajšej a vnútornej membrány. Pre takýto prenos je
potrebná hydrolýza ATP a taktiež elektrochemický gradient na vnútornej membráne. Transportovaná
bielkovina sa rozvinie, ke prechádza mitochondriálnou membránou. Do mitochondrií a chloroplastov
sa prenášajú opä iba tie bielkoviny, ktoré obsahujú špecifický signálny peptid. Tento signálny peptid
je obvykle uložený na N-konci molekuly bielkoviny a odstra uje sa po jej prenose do vnútra organely.
V druhej etape transportu sa bielkovina môže prenáša do vnútornej membrány. Pre to musí ma ešte
dlhší hydrofóbny signálny peptid. Tento peptid sa odkrýva po odstránení prvého signálu. V prípade
chloroplastov je pre prenos bielkovín zo stromy (vnútorného matrixu chloroplastu) do tylakoidu (vnútornou membránou obklopený kompartment chloroplastu, na membráne ktorého sa nachádza fotosyntetický systém, transportný re azec elektrónu a ATP-syntetáza) potrebný taktiež druhý signálny peptid.
Peroxizómy sa špecializujú na uskuto nenie oxida ných reakcií s použitím molekulárneho kyslíka.
Vyrábajú peroxid vodíka (ktorý potrebujú pre oxidáciu) a deštruujú jeho prebytok s pomocou katalázy.
Predpokladá sa, že peroxizómy (tak ako mitochondrie a chloroplasty) sú samoreplikujúcimi sa organelami
(rastú a delia sa samé), ale neobsahujú ani svoje DNA, ani ribozómy. Predpokladá sa, že v ich konštrukcii sa nachádza unikátny membránový receptor, ktorý dovo uje vnáša do organely všetky bielkoviny
(v ítane samotného receptora) pomocou výberového transportu z cytozolu.
104
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
Endoplazmatické retikulum (ER) je továre na výrobu bielkovinových a lipidických zložiek mnohých
organel. Jeho obrovská membrána obsahuje ve a enzýmov biosyntézy. Medzi nimi sú aj tie, ktoré zodpovedajú za syntézu skoro všetkých bunkových lipidov a za prispôsobenie N-viazaného oligosacharidu
k množstvu bielkovín. Novosyntetizované bielkoviny, ktoré sú ur ené tak pre sekréciu, ako aj pre
samotné ER, GA, lyzozómy a plazmatické membrány, musia najskôr prejs z cytozolu do ER. Do ER
sa prenášajú len tie bielkoviny, ktoré majú špecifické hydrofilné signálne peptidy. Signálny peptid sa
rozpoznáva signál-rozpoznávajúcou asticou (SRP-signal recognition particle), ktorá viaže nový re azec bielkoviny a ribozóm a usmer uje takto ozna ené bielkoviny na receptorovú bielkovinu na povrchu
membrány ER. Toto spájanie s membránou spúš a ATP-závislý prenos, pri ktorom slu ka polypeptidického re azca sa prepcháva cez membránu ER.
Rozpustné bielkoviny, ur ené pre dutinu ER, vylu ovanie alebo pre prenos do iných organel, prenikajú ako celok do dutiny ER. Transmembránové bielkoviny, ur ené pre membrány ER, alebo pre
membrány iných bunkových organel, sa prenášajú cez membránu ER, ale neuvo ujú do dutiny. Namiesto
toho zostávajú zakotvené v dvojvrstve pomocou jednej alebo nieko kých α závitnicových astí polypeptidického re azca, prestupujúcich membránu. Tieto hydrofóbne asti bielkoviny môžu predstavova
signálne peptidy, ur ujúce po iatok alebo koniec prenosu. Ak polypeptid obsahuje ve a takýchto striedajúcich sa štart- a stop- peptidov, môže prechádza dvojvrstvou z jednej strany na druhú mnohokrát.
Asymetria procesov zabudovania bielkovín do membrán ER a ich glykozylácia v týchto membránach zabezpe uje polaritu rozloženia membránových bielkovín vo všetkých alších organelách.
Bielkoviny prechádzajú do Golgiho aparátu (GA) z ER a usmer ujú sa potom k plazmatickej membráne, lyzozómom a vylu ovacím (sekre nym) mechúrikom. Golgiho aparát predstavuje polarizovanú
štruktúru, skladajúcu sa z jednej alebo viacerých stopiek (na seba uložených vrstiev) plochých cisterien,
obklopených množstvom malých bubliniek. Tieto cisterny sú spojené najmenej do troch rôznych kompartmentov (cis-, medzi ahlý a trans- kompartment GA – niekedy aj trans-sie GA). Bielkoviny z dutiny
a membrány ER sa prenášajú na cis-stranu stopky Golgiho pomocou transportných mechúrikov. Bielkoviny, ur ené pre sekre né mechúriky, plazmatickú membránu a lyzozómy, sa pohybujú postupne od
jednej cisterny k druhej. Nakoniec prichádzajú do trans-siete Golgiho, odkia každá bielkovina, umiestnená do špeciálnych mechúrikov, sa prenáša na ur ené miesto.
Na rozdiel od ER obsahuje GA mnoho nukleotid-sacharidov. Rôzne glykozyltransferázy ich používajú ako substráty v reakciách glykozylácie bielkovín a lipidov, prechádzajúcich cez GA. Napr. od
N-viazaných oligosacharidov sa odštiepujú zvyšky manózy a pripájajú sa doplnkové sacharidy, také
ako zvyšky N-acetylglukozamínu, galaktózy a kyseliny sialovej. Okrem toho v GA prebieha O-glykozylovanie a premena proteoglykánových kôrových bielkovín na proteoglykány. Sulfatizácia sacharidu
v proteoglykánoch a na niektorých zvyškoch tyrozínu v bielkovinách tiež prebieha v GA.
Lyzozómy sa špecializujú na vnútrobunkové štiepenie látok (degradáciu). Obsahujú unikátne membránové bielkoviny a ve ké množstvo rôznych hydrolytických enzýmov, ktoré najlepšie u inkujú pri
kyslých hodnotách pH (pH ≈ 5), charakteristických pre prostredie lyzozómov. Kyslé pH v lyzozómoch
sa udržiava pomocou ATP závislej protónovej pumpy v ich membránach. Novosyntetizované bielkoviny
lyzozómov sa prenášajú do dutiny ER, potom sa transportujú cez GA a z trans-siete Golgiho s pomocou
transportných mechúrikov sa prenášajú do medziorganelového (medzistavového) kompartmentu (endolyzozómov, predstavujúcich kombináciu endozómov a lyzozómov).
Lyzozómové hydrolázy obsahujú N-viazané oligosacharidy, ktoré sú modifikované fosforyláciou
ich zvyškov manózy v cis-kompartmente Golgiho. Tieto manózo-6-fosfátové skupiny (M6F) sa rozpoznávajú v trans-sieti Golgiho receptorom M6F, ktorý odoberá hydrolázy a pomáha ich uloži do
mechúrikov, pokrytých klatrínom a odliepajúcich sa od membrán tejto siete. Transportné mechúriky,
obsahujúce receptor M6F pôsobia ako lnky, prevážajúce receptor od trans-siete Golgiho k endozómom
a spä . Nízka hladina pH v endolyzozómoch vyvoláva disociáciu komplexu lyzozómovej hydrolázy
a receptora, ím sa transport hydroláz stáva jednosmerným.
Bielkoviny sa môžu vylu ova z bunky v procese exocytózy bu konštitutívnou alebo regulovanou
cestou. Pri regulovanom mechanizme sa molekuly uchovávajú v sekre ných mechúrikoch, ktoré sa
nezlievajú s plazmatickou membránou a neuvo ujú svoj obsah, pokia nebude získaný mimobunkový
signál. Ukladanie bielkovín do týchto mechúrikov v trans-sieti Golgiho je sprevádzané ich výberovou
kondenzáciou. Regulovaná sekrécia prebieha iba v špecializovaných sekre ných bunkách, zatia o
105
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
konštitutívny sekre ný mechanizmus existuje vo všetkých bunkách. Základným typom konštitutívnej
sekrécie je vezikulárny transport od trans-siete Golgiho k plazmatickej membráne.
Pre nepolarizované bunky je dokázané, že tie bielkoviny, ktoré nie sú ur ené špeciálne pre transport
do niektorej organely a nemajú signály triedenia, udržujúce ich v ur itej organele, sú automaticky prenášané s pomocou konštitutívneho mechanizmu k trans-sieti Golgiho a odtia k plazmatickej membráne.
V polarizovaných bunkách transportné siete od trans-siete Golgiho k plazmatickej membráne musia
pracova výberovo, aby zabezpe ili apikálnej a bazolaterálnej doméne membrány dodávku rôznych
súborov membránových bielkovín, vylu ovaných (sekre ných) bielkovín a lipidov.
ER a každý kompartment GA obsahujú unikátne súbory bielkovín. Zdá sa, že tieto bielkoviny sú
udržované v organelách v aka špeciálnym signálom, ktoré nesú na sebe. Pritom vä šia as látok sa
prenáša automaticky od ER k GA, cez stopku Golgiho a od trans-siete Golgiho k povrchu bunky. Je
možné predpoklada , že transport pri takom nevýberovom spôsobe prebieha pomocou neklatrínových
olemovaných mechúrikov, ktoré nie sú špecializované v závislosti od ich obsahu. V tom istom ase
transport, riadený signálmi (zabezpe ujúci triedenie) je sprostredkovaný olemovanými mechúrikmi,
pokrytými klatrínom. Aby bolo možné overi tieto hypotézy, je nevyhnutné rozšifrova molekulárne
mechanizmy, zú ast ujúce sa v odliepaní transportných mechúrikov, usmer ovaní ich k ter íkom
a zlievaní s membránami. V genetických experimentoch na kvasinkách bolo identifikovaných viac ako
25 génov, produkty ktorých sú zodpovedné za jednotlivé štádiá transportu. Okrem toho, pre cicavcov
sú vypracované bezbune né systémy, v ktorých prebieha výberové odliepanie a zlievanie mechúrikov.
Pravdepodobne práve spojenie genetického a biochemického prístupu dovolí v budúcnosti izolova
v istom stave mnohé bielkoviny, zú ast ujúce sa v týchto procesoch.
6.3.2 Osobité vlastnosti membrán organel a plazmatickej membrány
Z opisu kompartmentalizácie jednozna ne vyplýva nezamenite nos úlohy membrán pri vzniku
a existencii oddelených funk ne rozdielnych priestorov v bunke. Okrem toho možno krátko charakterizova niektoré špeciálne vlastnosti takýchto vnútorných membrán, ale aj plazmatickej membrány, ktoré
s kompartmentalizáciou súvisia:
• Bunky nemôžu vytvára svoje membránové organely „de novo“ (celkom znovu). Pre tvorbu membránových organel nie je posta ujúca iba informácia DNA, ur ujúca bielkoviny organel. Pri ich
tvorbe je nevyhnutná taktiež „epigenetická“ informácia o tvare hoci aspo jednej charakteristickej
bielkoviny v membráne organely. Táto informácia sa odovzdáva rodi ovskou bunkou potomstvu so
samotnou organelou. Tento typ informácie je nevyhnutný pre udržanie kompartmentalizácie bunky,
zatia o informácia DNA je nevyhnutná pre rozmnožovanie nukleotidových a aminokyselinových
postupností.
• Dvojitá jadrová membrána obsahuje jadrové póry. Tieto sú vytvárané špeciálnymi pórovými
komplexmi, predstavujúcimi súbor ve kých bielkovinových granúl, zoskupených do oktagonálnej
štruktúry. V strede komplexu je kanál o priemere 9 nm a d žke 15 nm. Cez tento pór prechádzajú do
jadra vo ne malé molekuly (5 kDa a menšie). Ukázalo sa však, že na oboch koncoch týchto pórov sú
uložené receptory, ktoré po rozpoznaní ve kých, v jadre potrebných a signálom ozna ených astíc,
(typu DNA, RNA a polymeráz o molekulárnych hmotnostiach až 1 200 kDa), zrejme rozširujú tieto
póry takým spôsobom, aby aj tak ve ké astice prenikli celé do jadra. spätne póry po rozpoznaní
špecifických signálových sekvencií prepúš ajú do cytoplazmy napr. mRNA (teda opä astice vä šie,
ako rozmer póry). Zatia nie je známe, ako tento systém pracuje.
• Mitochondriálne bielkoviny prenikajú do matrixu mitochondrie v zónach zliepania, spájajúcich obe
mitochondriálne membrány. Ke tieto bielkoviny prenikajú do mitochondriálneho matrixu, musia
sa rozvinú (z globuly do lineárneho re azca). Pre transport bielkovín do medzimembránového
priestoru mitochondrií sú nevyhnutné dva signály (platí to aj pri prechode bielkovín do tylakoidov
chloroplastov, ktoré majú taktiež dvojitú membránu).
• Membrány mitochondrií chloroplastov a peroxyzómov sa netvoria nanovo, ale vznikajú rastom a
delením (podobne ako celé tieto organely).
• Vä šina buniek v tkanivách je polarizovaná a ich plazmatická membrána je zložená z dvoch (alebo
aj viacerých) fyzikálne spojitých, ale obsahom a zložením rôznych astí. Ako obvykle apikálna as
106
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
je nasmerovaná do dutiny orgánu a nesie asto na svojom povrchu špeciálne štruktúry typu riasiniek,
alebo lemovania mikrovláskov. Bazolaterálna as pokrýva zvyšok bunky. Uvedené asti sú na hranici dotyku spojené kruhom tesných kontaktov, ktoré nedovo ujú bielkovinám a lipidom difundova
z jednej asti membrány do druhej. Lipidické aj bielkovinové zloženie oboch astí je odlišné.
6.4 Membránové receptory a medzibunková signalizácia [1, 25, 51]
Bunky mnohobunkových organizmov nevyhnutne vyžadujú výmenu informácie medzi sebou
navzájom a to tak pre reguláciu svojho vývoja a organizácie v tkanive, ako aj pre kontrolu procesov
rastu, delenia a koordinácie funkcií. Spolupráca živých buniek sa deje tromi spôsobmi:
1. bunky vylu ujú chemické látky, ktoré slúžia ako signály pre iné bunky, vzdialené od nich v ur itej
vzdialenosti,
2. nesú na svojom povrchu signálne molekuly, viazané s plazmatickou membránou, ktoré vyvolávajú
pri bezprostrednom kontakte vplyv na iné bunky (táto as sa týka adhézie buniek a bude diskutovaná v 6.3.4.),
3. vytvárajú štrbinové kontakty, priamo spájajúce cytoplazmu dvoch ved a seba ležiacich a interagujúcich buniek, o dáva možnos výmeny malých molekúl medzi bunkami (táto as sa týka cytoskeletu
a bude diskutovaná v 6.3.4).
V tejto asti chceme hovori o prvom spôsobe, týkajúcom sa príjmu mimobunkových signálnych
molekúl bunkou. Takéto molekuly môžeme rozdeli pod a stup a ich pôsobenia „do dia ky“(na ur itú
vzdialenos ) na tri základné triedy:
lokálne chemické mediátory, ktoré sa rýchle pohlcujú alebo deštruujú a preto vplývajú bezprostredne iba
na susedné bunky,
hormóny, ktoré sú prenášané k svojim ter íkom, rozptýleným asto po celom organizme, pomocou
toku krvi,
neuromediátory, pôsobiace iba na postsynaptickú bunku.
Každý typ buniek organizmu má jemu vlastný súbor bielkovinových receptorov, dovo ujúcich
naprogramovaným a charakteristickým spôsobom reagova na príslušný súbor molekúl-signálov.
Všimneme si mechanizmus odovzdania takéhoto signálu pomocou (alebo so spoluú as ou)
receptorových bielkovín bunkového povrchu.
Všetky vo vode rozpustné signálne molekuly (ale aj neuromediátory, peptidické hormony, faktory
rastu a niektoré v tukoch rozpustné signálne molekuly) sa pripájajú k špecifickým bielkovinovým receptorom na povrchu buniek ter íkov. Povrchové receptory viažu signálnu molekulu (ligand) s vysokou
afinitou a táto mimobunková udalos vytvára vnútrobunkový signál, meniaci chovanie bunky. Zdalo
by sa, že takéto receptory iba jednoducho prenášajú signál cez membránu. To nie je pravda. Úlohou
vonkajšieho ligandu je vyvola konforma né zmeny bielkoviny receptora, ktorý sa nachádza na povrchu
bunky. Receptor potom priamo alebo prenesene mení vonkajší signál na signál, pôsobiaci vo vnútre
bunky.
Vä šinu bielkovinových receptorov bunkového povrchu je možné zaradi do jednej z troch nasledujúcich tried v závislosti od mechanizmu, použitého pre odovzdanie signálu:
1. Kanálotvorné receptory sú mediátormi regulované iónové kanály, zú ast ujúce sa predovšetkým na
rýchlom synaptickom prenose signálu medzi elektricky vzrušivými bunkami. Pre riadenie takýchto
kanálov sa používa neve ký po et neuromediátorov, ktoré na krátky as otvárajú alebo zatvárajú
kanál, vytvorený receptormi, meniac tým iónovú priepustnos plazmatickej membrány a tým aj
vzrušivos postsynaptickej bunky. Štúdium postupností DNA, kódujúcich tieto receptory dokázalo,
že všetky sú lenmi jednej skupiny homologických bielkovín, ktoré úplne prechádzajú (prestupujú)
cez membránu.
2. Katalytické receptory pri aktivácii ligandom za ínajú pracova ako enzýmy. Vä šina známych
katalytických receptorov sú transmembránové bielkoviny s cytoplazmatickou doménou, ktorá má
tyrozín-špecifickú proteinkinázovú aktivitu.
3. Receptory, spriahnuté s G-bielkovinami, ktoré sprostredkovane aktivujú alebo inhibujú definované
enzýmy alebo iónové kanály, viazané s plazmatickou membránou. Interakcia medzi receptorom
a enzýmom, alebo iónovým kanálom sa uskuto uje sprostredkovane cez tretiu bielkovinu, ktorú
107
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
nazývajú GTP-viažucou regula nou bielkovinou (alebo G-bielkovinou). Receptory, viazané s G-bielkovinou, obvykle spúš ajú celý re azec udalostí, ktoré menia koncentráciu jednej alebo viacerých
malých vnútrobunkových signálnych molekúl, asto nazývaných vnútrobunkovými sprostredkovate mi
(druhými poslami) alebo vnútrobunkovými mediátormi. Tieto molekuly následne pôsobia tým spôsobom, že menia chovanie alších bielkovín-ter íkov v bunke. Dvomi najdôležitejšími poslami sú
cAMP (ktorý je syntetizovaný z ATP pomocou enzýmu adenylátcyklázy, viazanej v membráne) a
ión Ca2+. Nimi sprostredkované signály sa generujú rozdielnymi cestami a používajú sa vo všetkých
živo íšnych bunkách.
6.4.1 Membránové receptory, spriahnuté s G-bielkovinami
Receptory tohto typu sú ve kou triedou homologických štruktúr, vytvorených z jedného polypeptidického re azca, ktorý prechádza cez lipidickú dvojvrstvu sedem krát za sebou. Do tejto triedy receptorov patria β-adrenergické receptory pre adrenalín, muskarínové receptory pre acetylcholín, nieko ko
receptorov pre neuropeptidy a dokonca rodopsín.
G-bielkoviny majú vzájomne podobnú subjednotkovú štruktúru a aminokyselinovú postupnos .
Napr. GS-bielkovina, ktorá aktivuje adenylátcyklázu (a tým spúš a syntézu cAMP) je heterodimér,
ktorý pri aktivácii disociuje na podjednotky. Skladá sa z troch polypeptidov: α-re azca (GSα), ktorý
viaže a hydrolyzuje GTP a aktivuje adenylátcyklázu, a pevného komplexu β-re azca a γ-re azca (Gβγ),
ktorý zakotvuje GS na vnútornej strane cytoplazmatickej membrány.
Existujú dva hlavné mechanizmy (dráhy), s pomocou ktorých receptory bunkového povrchu,
spriahnuté s G-bielkovinami, spúš ajú vytváranie vnútrobunkových poslov (pozri obr. 14). V oboch
variantoch väzba mimobunkového ligandu mení konformáciu cytoplazmatickej domény receptora takým
spôsobom, že táto doména sa viaže s G-bielkovinou, ktorá potom aktivuje alebo inhibuje príslušný
enzým plazmatickej membrány. V niektorých prípadoch G-bielkovina interaguje nie s enzýmom, ale
s iónovým kanálom.
Obr. 14 Dve dráhy vytvárania vnútrobunkových poslov pomocou G bielkovín
V cAMP dráhe enzým (adenylátcykláza), aktivovaný GS-bielkovinou, syntetizuje molekulu cAMP.
V Ca2+ dráhe s pomocou enzýmu (fosfolipázy C) sa vytvára sprostredkovate (InsP3 – pozri kapitolu
5.2.2.3.), ktorý uvo uje z vnútrobunkových cisterien ióny Ca2+. Tak molekuly cAMP, ako aj ióny
Ca2+ sa viažu v bunke s inými špecifickými bielkovinami (bu s cAMP-závislou proteinkinázou alebo
kalmodulínom príslušne) a menia ich aktivitu.
Dôvody takéhoto zložitého mnohostup ového prenosu signálu so spoluú as ou G-bielkovín (len
u eukaryotických buniek, v baktériách niet medzistup a GS medzi receptorom a adenylátcyklázou) sú dva:
108
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
• nevyhnutnos zosilnenia signálu,
• potreba doplnkových stup ov kontroly.
GS dovo uje vytvori dva typy zosilnenia. V jednoduchšom prípade jednotlivý aktivovaný bielkovinový receptor môže v princípe absolvova zrážky s mnohými molekulami GS-bielkovín a tým ich
aktivova . Aktivované GS bielkoviny následne vyvolajú aktiváciu mnohých molekúl adenylátcyklázy.
Druhý spôsob spo íva v tom, že zatia o komplex receptor-ligand sa rozpadá ve mi rýchle (približne
za jednu sekundu), GS zostáva aktívne viac ako 10 – 15 s, pokia neprebehne hydrolýza naviazaného
GTP na GDP. V dôsledku toho GS bude udržova adenylátcyklázu ove a dlhšie v aktívnom stave.
Výsledkom oboch typov zosilnenia bude vytvorenie ove a vä šieho po tu molekúl cAMP, ako v prípade
jednotlivej reakcie: jeden receptor – jedna GS-bielkovina.
GS nielen zosil uje signál, ale môže regulova celý proces aktivácie. Efektívnos interakcie medzi
receptormi a enzýmom môže by zmenená kovalentnou modifikáciou G-bielkoviny, alebo zmenami
koncentrácie receptora alebo G-bielkoviny v plazmatickej membráne. Typickým príkladom je ú inok
cholerového toxínu, ktorý predstavuje enzým, katalyzujúci prenos ADP-ribózy z vnútrobunkového
NAD na α subjednotku GS bielkoviny. Táto pri tom stráca schopnos hydrolyzova naviazanú molekulu
GTP. Adenylátcykláza, aktivovaná takto zmenenou α subjednotkou GS-bielkoviny môže by v aktívnom
stave nekone ne dlho, o má za následok dlhotrvajúce zvýšenie hladiny cAMP v bunkách revného
epitelu a následne masívny výtok vody a sodíka zo všetkých buniek do dutiny reva, o vedie k ažkým
hna kovým stavom – charakteristickému príznaku cholery.
Jedna a tá istá signálna molekula môže bu zvyšova , alebo znižova vnútrobunkovú koncentráciu
cAMP v závislosti od typu receptora, s ktorým sa viaže. Napr. β adrenergické receptory pre adrenalín
aktivujú adenylátcyklázu, α adrenergické receptory inhibujú adenylátcyklázu. Výsledný efekt sa ur uje
G-bielkovinami, uskuto ujúcimi spriahnutie receptora s adenylátcyklázou. β receptory pôsobia cez GS,
α receptory (inhibítory) pôsobia cez Gi, inhibujúcu G bielkovinu, ktorá obsahuje ten istý βγ komplex,
ale inú α podjednotku (Giα).
Signálne systémy, as ou ktorých sú G-bielkoviny, sú obdivuhodne rozli né. Tak ako GS a Gi
umož ovali spriahnutie receptora s adenylátcyklázou, GP bielkoviny umož ujú spriahnu iný receptor
s fosfolipázou C, ktorá cez (IsnP3) uvo uje Ca2+ (pozri 5.2.2.3.). V oku stavovcov alšia G-bielkovina
(transducín) umož uje spriahnu proces pohltenia fotónu v molekule rodopsínu s aktiváciou enzýmu
fosfodiesterázy, hydrolyzujúceho cGMP. Zníženie koncentrácie tohto vnútrobunkového sprostredkovate a vedie k elektrickým zmenám vo fotoreceptorovej bunke. Všetky tieto G-bielkoviny môžu sprostredkovane, tým alebo druhým spôsobom, meni stav iónových kanálov na membráne, ale niektoré
G-bielkoviny môžu s ním interagova priamo. Napr. pripojenie acetylcholínu k receptorom na bunkách
srdcového svalu aktivuje Gi podobnú bielkovinu, ktorá priamo aktivuje draslíkový kanál v plazmatickej
membráne (tieto receptory, citlivé ku alkaloidu muskarínu sa nazývajú muskarínové receptory acetylcholínu, na rozdiel od nikotínových receptorov acetylcholínu, ktoré sú kanálotvornými receptormi
kostrových svalov).
6.4.2 Membránové katalytické receptory
Niektoré membránové receptory pôsobia po kratšej dráhe, ako receptory s G-bielkovinami. Sú to
katalytické bielkoviny – receptory. Najlepšie preštudované sú tyrozín-špecifické proteínkinázy, katalytická doména ktorých sa nachádza na vnútornej strane plazmatickej membrány. Tieto receptory prechádzajú cez membránu len jedenkrát, pri naviazaní ligandu sa aktivujú a prenášajú terminálnu fosfátovú
skupinu od ATP na hydroxylovú skupinu tyrozínového zvyšku v ur itých bielkovinách ter íkovej bunky.
Bielkovina-receptor s tyrozínkinázovou aktivitou fosoryluje aj sama seba, ak je aktivovaná. K takejto
triede proteínkináz patria receptory inzulínu, mnohých rastových faktorov, v ítane trombocytárneho
rastového faktoru (PDGF – platelet-derived growth factor) a rastového faktoru epidermy (EGP – epidermal growth factor). ktorý stimuluje delenie epidermálnych a mnohých druhých buniek. Vä šina
druhých proteinkináz fosforyluje serínové alebo zriedkavejšie treonínové zvyšky v bielkovinách.
Nie je jasné, akým spôsobom väzba ligandu s mimobunkovou doménou receptora aktivuje katalytickú doménu na druhej strane plazmatickej membrány. Je ažké si predstavi , že by sa konforma né
zmeny mohli prenies z jednej strany lipidickej dvojvrstvy na druhú stranu jedinou závitnicou.
109
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
Predpokladá sa (na základe znalostí o receptore EGP) že v dôsledku interakcie dvoch susedných
cytoplazmatických domén (po naviazaní ligandu) môže takýto dimér získa katalytickú aktivitu. Nie je
ešte jasná ani úloha fosforylácie tyrozínu v prenose signálu.
Po naviazaní ligandu mnohé katalytické receptory prechádzajú do vnútra bunky pomocou endocytózy
v olemovaných mechúrikoch, obsahujúcich komplex receptor-ligand. V niektorých prípadoch je taká
endocytóza ur ená samofosforyláciou receptora. Tento proces môže hra vážnu úlohu pri rozštiepení
signálnych molekúl a regulácii hustoty receptorov na povrchu ter íkovej bunky. Okrem toho prenos
domény s tyrozínkinázovou aktivitou do nových astí bunky, ktorý sa pri tom uskuto uje, môže by
podstatný pre signálny proces, hoci to ešte nie je dokázané.
Ve mi dôležitým faktom je to, že produkty niektorých onkogénov sú anomálnymi katalytickými
receptormi s neregulovanou kináznou aktivitou. V sú asnosti je známych viac ako 70 proteínkináz,
pri om tie z nich, ktoré fosforylujú ter íkové bielkoviny na zvyškoch tyrozínu, serínu alebo treonínu, sú
aj produktami približne polovice všetkých doteraz objavených onkogénov. Ukázalo sa že napr. onkogén neu, aktívny v niektorých chemicky indukovaných nádoroch nervového systému u krýs, kóduje
anomálny receptor, ktorý sa líši od normálneho iba jediným aminokyselinovým zvyškom v jedinom
transmembránovom segmente bielkoviny. Takáto zmena je dostato ná na to, aby vyvolala u tyrozínovej
kinázy neustálu aktivitu a toto pod iarkuje vážnu úlohu tyrozínových kináz v kontrole bunkovej proliferácie.
6.4.3 Membránové kanálotvorné receptory
Uvedený typ receptorov vystupuje predovšetkým v synapsiách nervových a nervovosvalových
spojení. Chemický prenos v synapsiách je založený na tých istých princípoch, ako v prípade chemickej
signalizácie s pomocou vo vode rozpustných látok (typu hormónov). V jednom aj druhom prípade bunka
uvo uje sprostredkujúcu látku, ktorá ú inkuje na inú bunku alebo skupinu buniek tým, že sa viaže
s membránovými bielkovinami-receptormi. V prípade synapsií je chemickým sprostredkovate om
neuromediátor, ktorý pôsobí vo ve mi malej vzdialenosti, pretože šírka synaptickej štrbiny predstavuje
zlomky mikrometra.
Receptory plazmatickej membrány postsynaptickej bunky sú dvoch typov:
1. Receptory viazané s kanálmi, ktoré predstavujú vlastne ligand-závislé kanály. Konformácia takýchto
receptorov sa transformuje okamžite po naviazaní neuromediátora takým spôsobom, že v membráne
sa vytvára otvorený kanál pre ur ité ióny a tým sa priepustnos membrány mení. Receptory tohto
typu slúžia bázou pre najobvyklejší a najpreštudovanejší spôsob prenosu signálov v chemických
synapsiách, pri ktorom sa prenos uskuto uje ve mi rýchlo.
2. Receptory neviazané s kanálmi, ktoré spúš ajú tie isté procesy, ako pri ú inku vo vode rozpustných
hormónov a lokálnych chemických mediátorov všade v organizme. V takých receptoroch miesta
väzby neuromediátora sú funk ne spriahnuté s enzýmom, ktorý v prítomnosti neuromediátora obvykle
katalyzuje vytváranie vnútrobunkového posla, napr. cAMP. Tento následne vyvoláva zmeny v postsynaptickej bunke, v ítane modifikácie iónových kanálov v bunkovej membráne. Na rozdiel od
receptorov, viazaných s kanálmi, tieto receptory ako pravidlo sprostredkujú relatívne spomalené, ale
ove a dlhšie trvajúce ú inky neuromediátorov. Predpokladá sa, že aktivácia takých receptorov
vyvoláva v neurónoch zmeny, ktoré sa udržiavajú dlhší as a sú základom procesov u enia a pamäti
(pozri 6.7.5.).
6.4.4 Význam membránových receptorov pre adaptáciu ter íkových buniek
(flagelárny motor baktérií) [1, 66]
Bunky môžu regulova svoju citlivos k ve kosti podnetu pomocou do asnej a vratnej adaptácie
k vysokým koncentráciám signálneho ligandu a tým odpoveda na zmenu koncentrácie ligandu, a nie
na jej absolútnu hodnotu. Adaptácia sa dosahuje rôznymi cestami:
• pripojenie ligandu môže vyvola prechod receptorov do vnútra bunky, kde tieto zostanú na ur itý
as v „ukrytom“ stave, alebo sa deštruujú v lyzozómoch,
• aktivované receptory sa môžu vratne inaktivova pomocou fosforylácie alebo metylácie,
110
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
• nereceptorové bielkoviny signálnej dráhy (typu G bielkovín) môžu by taktiež vratne inaktivované
pomocou zatia neznámych mechanizmov.
Príkladom adaptácie, najlepšie ilustrujúcim uvedené princípy je bakteriálna chemotaxia, pri ktorej
vratná metylácia k ú ovej membránovej bielkoviny v re azci prenosu signálu dovo uje bunkám premiest ova sa v optimálnom smere
Pohyblivé baktérie plávu v smere vyšších koncentrácií potravinových substrátov (atraktantov – napr.
sacharidov a aminokyselín) a „unikajú“ od vysokých koncentrácií nebezpe ných látok (repelentov –
napr. jedov). Tento typ chovania – chemotaxia, sa zabezpe uje jedným a tým istým systémom, ktorý
raz pracuje v jednom smere a druhýkrát naopak.
Baktérie sa pohybujú pomocou bi íkov. Sú to špirálovité rúrkovité štruktúry (20 nm v priemere),
zložené z rovnakých podjednotiek bielkoviny flagelínu. Základ a každého bi íka je pripevnená pomocou
krátkeho pružného k bu k malej bielkovinovej valcovitej štruktúre, ponorenej do bakteriálnej membrány.
Táto valcovitá štruktúra je as ou mikroskopického bi íkového (flagelárneho) motora, ktorý vyvoláva
rýchle otá anie špirálovitého bi íka na princípe otá ania rotora, pripevneného k základni bi íka, vo i
statoru, vytvorenému transmembránovými bielkovinami, pri om ako pohonná sila sa využíva energia
transmembránového protónového gradientu. Všetky medzimolekulové pohyby (okrem prestavby kvartérnej štruktúry bielkovín pri zmene smeru otá ania) a mechanochemické premeny energie prebiehajú
v bazálnej asti bi íka, a jej vonkajšia as hrá z h adiska takýchto pohybov pasívnu úlohu, ktorú je
možné porovna s úlohou lodnej skrutky. V tom spo íva jeden z hlavných rozdielov tohto systému od
podobného systému eukaryotických buniek (systému riasiniek, ktorý uskuto uje zložité aktívne pohyby
v dôsledku premiest ovania svojich molekulových štruktúr vo i sebe navzájom – na základe princípu
svalovej kontrakcie).
Premena otá ania bi íka na postupný pohyb bunky je dôsledkom špirálového tvaru jeho vonkajšej
asti. Pretože špirála bi íka je zakrútená ur itým smerom, smer rotácie špirály nie je bez významu
a ur uje typ pohybu bunky. Ak bi íky rotujú proti pohybu hodinových ru i iek (tzv. CCW pohyb),
potom sa všetky grupujú do spolo ného zväzku a baktéria sa rovnomerne pohybuje v jednom smere
(pláva). Ak sa bi íky otá ajú vo smere pohybu hodinových ru i iek (CW pohyb), potom spolo ný zväzok bi íkov sa rozpadá, každý bi ík rotuje samostatne a baktéria sa akoby trasie – motá sa na jednom
mieste. Ak niet vonkajších podnetov, tieto dva stavy sa u baktérie striedajú pravidelne každých pár
sekúnd.
Atraktanty a repelenty menia obvyklý pohyb baktérií. Pripájajú sa k špecifickým bielkovinovým
receptorom a vplývajú na frekvenciu výskytu týchto dvoch stavov, zvä šujúc alebo zmenšujúc interval
medzi dvomi postupnými zmenami smeru, v ktorom sa otá ajú bi íky. Ak baktérie plávajú v smere
vä šej koncentrácie atraktantu, motajú sa kratšiu dobu, ako ke plávajú na opa nú stranu. To znamená,
že výskyt priameho pohybu bude dlhší pri pohybe smerom k vyšším koncentráciám atraktantu a baktérie sa budú blíži k zdroju atraktantu. Naopak, ak bude vzrasta koncentrácia repelentu, baktérie sa
budú mota astejšie a tým vz a ova od zdroja repelentu. Teda stratégia chovania baktérií v gradiente
koncentrácií atraktantov a repelentov sa ur uje zmenou pravdepodobnosti vzniku intervalov „trasenia sa
na jednom mieste“ v závislosti od toho, i receptorový aparát bunky hodnotí vybratý smer ako výhodný
alebo nie.
V prirodzených podmienkach baktérie (vzh adom na svoju ve kos ) nevnímajú gradienty rôznych
látok priestorovo, ale kineticky, t.j. na základe zmeny koncentrácie látok po as rovnomerného pohybu
baktérie niektorým smerom. Zvä šenie koncentrácie atraktantu v ur itom ase sa prejaví zmenšením
doby stavu, ktorý núti baktériu unika z tohto miesta, zmenšenie koncentrácie atraktantu sa prejaví
pred žením doby tohto stavu. Po krátkej dobe baktéria prejde do „normálneho“ stavu (adaptovaného
na stav zvýšenej alebo zníženej koncentrácie) a zmení svoje chovanie až vtedy, kedy sa opä vyskytne
asová zmena koncentrácie. Adaptácia tak dovo uje baktériám reagova nie na stálu absolútnu veli inu
koncentrácie, ale na jej zmenu a pokra ova v pohybe, ak sa tento uskuto uje pre baktériu výhodným
smerom.
Ukázalo sa, že reakcie chemotaxie na celý rad látok sú závislé od neve kej skupiny ve mi blízkych
transmembránových bielkovín – receptorov, zodpovedných za odovzdanie signálu cez plazmatickú
membránu. Tieto receptory sa metylujú v období adaptácie a preto ich nazývajú metyl-akceptorovými
bielkovinami chemotaxie. V plazmatickej membráne sa vyskytujú štyri druhy receptorov tohto druhu
111
Vydané len pre vnútornú potrebu FMFI UK ako elektronický u ebný textPJK
a každý z nich podmie uje odpove na špecifickú skupinu chemických látok. Dva z týchto receptorov
sprostredkujú reakciu na serín a aspartát príslušne, priamo viažu tieto aminokyseliny a menia takúto
udalos väzby aminokyseliny na vnútrobunkový signál. Dva alšie sa aktivujú sprostredkovane cez
špeciálne periplazmatické substrát-viažuce bielkoviny, ktoré viažu sacharidy a dipeptidy a následne
vytvárajú komplexy s príslušným receptorom z tejto dvojice, o opä vyvolá vznik vnútrobunkového
signálu. Adaptácia pri chemotaxii baktérií zabezpe uje kovalentné spojenie metylovej skupiny s bielkovinovými receptormi chemotaxie. Celý proces má dve etapy:
1. rýchlo sa rozvíja vybudenie, pretože aktivovaný receptor vytvára vnútrobunkový signál, ktorý zabezpe uje, aby motor bi íka pokra oval v rotácii CCW, v dôsledku oho sa bunka pohybuje lineárne
v jednom smere bez motkania sa na jednom mieste,
2. prebieha pomalá adaptácia, vyvolaná tým, že aktivovaný receptor sa stáva dostupným pre metylovanie
cytoplazmatickými enzýmami a za nieko ko minút sa jeho aktivácia kon í.
Aktivácia receptora chemotaxie atraktantmi a repelentmi musí vytvára vnútrobunkový signál,
vplývajúci na smer otá ania bi íka. Genetické pokusy ukázali, že pri prenose tohto signálu ú inkujú
štyri cytoplazmatické bielkoviny – CheA, CheW, CheY a CheZ (bez nich niet chemotaxie, preto ich
ozna ujú „che“). Posledné dve pôsobia na konci efektorovej dráhy a kontrolujú smer otá ania bi íka,
pri om CheY dáva pokyn (signál) otá a sa v smere (CW) a CheZ pokyn otá a sa proti smeru (CCW)
hodinových ru i iek, pritom sú priamo naviazané na bielkovinové zložky motora (nazývali sa aj MotA
a MotB, pretože bez ich naviazania sa motor nepohyboval, a preto mali predponu „mot“ od slova
„motion“). Che A a asi aj CheW odovzdávajú signál od receptora chemotaxie ku bielkovinovému
CheY a CheZ pomocou mechanizmu, obsahujúceho fosforyláciu a defosforyláciu bielkovín.
112
Download

Biofyzika membran 1