1
Prof. Ing. Ľudovít DROBNICA, DrSc.
2
DROBNICOV MEMORIÁL
VI. ročník
21. -23. September 2011
PIEŠŤANY
3
ISBN 978-80-970164-3-2
Vychádza v redakčnej úprave:Michaela Pavlovičová,
Albert Breier,
Zdenka Sulová
Vydal: Petrus, Polárna 6, Bratislava,
pre: © Institute of Molecular Physiology and Genetics,
Slovak Academy of Sciences, Bratislava, 2011
4
5
Spomienka
na prof. Ing. Ľudovíta Drobnicu, DrSc.
Narodil sa 30. septembra 1930 v Trnave. Po skončení vysokoškolského
štúdia v Brne v roku 1953 nastúpil na Katedru technickej
mikrobiológie a biochémie Chemickej fakulty Slovenskej vysokej
školy technickej v Bratislave. Tu prešiel všetkými učiteľskými
stupňami. Na fakulte patril medzi prvých vedeckých ašpirantov.
Hodnosť kandidáta vied získal uţ v roku 1958. Docentom bol v odbore
Biochémia a fyziológia mikroorganizmov od roku 1964. Vedeckú
hodnosť doktora vied získal na Ústave organické chemie a biochemie v
Prahe pre odbor Biochémia v roku 1973. Bohuţiaľ, profesorom sa z
politických dôvodov nestal ani do svojej predčasnej smrti v roku 1980
(napriek tomu, ţe vychoval viac neţ 100 diplomantov a viac neţ 20
ašpirantov). Bol ním menovaný po zmenách v roku 1989 in memoriam.
Prof. Drobnica v rámci svojej nesmierne bohatej výskumnej činnosti
zaloţil, rozvinul a vybudoval na Slovensku vedeckú školu, týkajúcu sa problematiky mechanizmu
účinku prírodných a syntetických látok a vzťahov medzi ich štruktúrou, účinnosť určujúcimi
fyzikálnochemickými vlastnosťami a biologickými aktivitami, a to s ohľadom na farmaceutickomedicínske, poľnohospodársko-potravinárske i chemicko-ekologické aspekty pouţitia (aplikácie v
praxi). Ťaţisko jeho záujmu sa v tomto smere sústredilo na izotiokyanáty a ich prírodné prekurzory,
predovšetkým glukozinoláty. Pod jeho vedením na stovkách prírodných i novosyntetizovaných
derivátoch boli študované chemické, biochemické i fyziologické parametre interakcií s enzýmami a
inými izolovanými biokomponentami, subcelulárnymi partikulami, bunkovými i nadcelulárnymi
modelmi a to tak z oblasti mikrobiálnej, rastlinnej, resp. ţivočíšnej ríše. Príslušné zistenia boli
predmetom vyše 100 publikácií, 52 patentov, viac ako 200 vystúpení na vedeckých konferenciách, z
nich viaceré prof. Drobnica ako medzinárodné organizoval u nás doma v Smoleniciach.
Systematický výskum izotiokyanátov vyústil vydaním monografie The Chemistry of –NCS group
vo vydavateľstve John Willey a zavedením p-brómfenylizotiokynátu do výroby a vyuţívania v praxi
ako veterinárneho liečiva. Bohuţiaľ z dôvodu predčasnej smrti sa mu uţ nepodarilo dokončiť a
vydať monografiu The biology of –NCS group.
Okrem izotiokyanátovej problematiky prof. Drobnica so svojimi kolegami a ašpirantami venoval
pozornosť výskumu rôznych xenobiotík, regulácii energetickouhlíkového metabolizmu, dimorfizmu
kvasiniek, nadprodukcii primárnych metabolitov, imobilizovaným biosystémom, preţívaniu
mikroorganizmov v nepriaznivých (stresových) podmienkach, atď.
Výsledkom týchto výskumných aktivít bola minimálne ďalšia stovka vedeckých prác v
renomovaných časopisoch a mnohé ďalšie publikačné produkty. Spomínané témy sa stali základom
celoţivotného výskumu jeho ţiakov, z ktorých mnohí sú významnými predstaviteľmi
biochemických, mikrobiologických, fyziologických a biotechnologických vied nielen na Slovensku,
ale aj vo svete.
Prof. Drobnica okrem pedagogickej a vedeckej práce pracoval aktívne v domácich a zahraničných
vedeckých spoločnostiach, v odborných komisiách pre obhajoby dizertačných prác, vo vedeckých a
edičných radách ústavov a vydavateľstiev, úzko spolupracoval s praxou. Popri tom bol v mladosti
výkonným športovcom, perfektne hral šach, aktívne spieval, výborne hral na klavíri, bol veľmi
spoločenský.
6
Jeho veľkosť spočívala predovšetkým v excelentnej schopnosti rozvoja teoretických predstáv
experimentálnymi cestami. Bol veľmi náročný na rozsah, hĺbku, kvantitu i kvalitu experimentálnej
práce. Vyznačoval sa obrovskou neúnavnosťou a nadšením v laboratórnej činnosti, kritičnosťou k
nameraným údajom a veľkou opatrnosťou pri formulovaní záverov. Významnou pre jeho prácu bola
vysoká kooperativita. Spolupracoval s obrovským mnoţstvom partnerov na svojom pracovisku, v
rámci Bratislavy, Slovenska a na medzinárodnej úrovni. Perfektne vedel organizovať a vykonávať
kolektívnu prácu. Okrem interdisciplinárneho prístupu k riešeniu vedeckovýskumných činností sa
vyznačoval tieţ schopnosťou prepájať vedu s praxou. Bol napríklad iniciátorom zaloţenia
Výskumného ústavu liečiv v Modre s prepojením na Slovakofarmu Hlohovec, zriadenia Enzýmovej
poloprevádzky v Dolnej Krupej cez Výskumný ústav liehovarov a konzervární s nasmerovaním na
biotechnologickú prax, atď.
Prof. Drobnica bol výnimočný tieţ ako pedagóg. Vďaka svojej charizmatickej osobnosti vedel
zaujať kaţdého poslucháča. Nikdy neľutoval čas strávený so študentami a ašpirantami. Majstrovsky
vedel zapáliť záujem o vedu a nasmerovať dané schopnosti. Kaţdého vedel povzbudiť, poradiť mu,
pomôcť. Absolventi sa k nemu vracali dlho po skončení štúdia. Dodnes naňho spomínajú ako na
nezabudnuteľný vzor pracovitosti a ľudskosti. Jeho vedecká škola má punc vysokej kvality. Veľmi
dôleţitou črtou jeho osobnosti bola nekonformnosť, nebojácnosť a schopnosť byť sebou samým.
Tieto vlastnosti mu v časoch totality spôsobili nemálo ťaţkostí i problémov a v konečnom dôsledku
i predčasnú smrť. Aţ do nej však bol verný zásadám nezmieriteľnosti s pokrytectvom,
povýšenectvom, aroganciou moci, obmedzovaním slobody a demokracie, pätolízačstvom. Typický
pre neho bol pritom altruizmus, ţičlivosť, optimizmus, pozitívne myslenie.
V každom prípade však zmyslom i odkazom jeho života bola práca pre vedu a výchovu. Bola mu
zdrojom potešenia pre seba a užitočnosti pre ostatných.
7
ORGANIZAČNÝ VÝBOR:
doc. Ing. Albert BREIER, DrSc.
PhDr. Zuzana KLIMEŠOVÁ
RNDr. Michaela PAVLOVIČOVá, PhD..
Ing. Andrej RUSNÁK, PhD.
Ing. Zdena SULOVÁ, CSc.
doc. Ing. Ernest ŠTURDÍK, CSc.
PREDSEDA KOMISIE:
prof. RNDr. Ľudovít VAREČKA, DrSc
ČLENOVIA KOMISIE:
RNDr. Imrich BARÁK, DrSc.
RNDR. Miroslav BARANČIK, DrSc
doc. Ing. Albert BREIER, DrSc.
MVDr. Juraj KOPÁČEK DrSc
doc. MVDr. Juraj KOPPEL, DrSc.
doc. Ing. Oľga KRIŢANOVÁ, DrSc.
doc. RNDr. Peter RAČAY, CSc.
Ing. Zdena SULOVÁ, CSc.
doc. Ing. Ernest ŠTURDÍK, CSc.
.
8
Obsah
Program: ............................................................................................................................................... 10
Zborník abstraktov ............................................................................................................................... 14
Sekcia II.: Biochémia a biofyzika biologických membrán .................................................................. 16
Sekcia I.: Xenobiotiká a vzťahy medzi štruktúrou a účinkom látok .................................................... 20
Sekcia III.: Molekulárna, celulárna biológia a mikrobiológia ............................................................. 30
Sekcia IV.: Enzymológia a proteomika ............................................................................................... 52
Posterová sekcia ................................................................................................................................... 60
Zoznam účastníkov .............................................................................................................................. 70
Sponzori Drobnicovho memoriálu ....................................................................................................... 72
9
Program:
1. Deň: 21. 9. 2011 (streda)
12:00-13:00 Registrácia účastníkov
13:00-14:00 Obed
14:00-14:15 Otvorenie
14:15-15:00Ľudovít Varečka. Chémia ţivota (Úvodná prednáška)
Súťaž mladých vedeckých pracovníkov
Sekcia II.
predseda:
15:00-15:15
15:15-15:30
15:30-15:45
Biochémia a biofyzika biologických membrán
Ľudovit Varečka, Peter Račay
Martina Garaiová. Kontrola hladiny skvalénu v kvasinkách S. cerevisiae.
Zuzana Tomášková. Regulácia vodivosti chloridových kanálov z mitochondriálnych
membrán.
Peter Kohút. Úloha proteínov aus1 a pdr11 v príjme externých sterolov u kvasiniek.
15:45 -16:05 PRESTÁVKA
Sekcia I.
predseda:
16:05-16:20
16:20-16:35
16:35-16:50
16:50-17:05
17:05-17:20
17:20-17:35
17:35-17:50
17:50-18:05
Xenobiochémia a vzťahy medzi štruktúrou a účinkom látok
Ernest Šturdik, Albert Breier
Róbert Ševčík. Počítačová mikrotomografia v biológii.
Daniel Gogola. Kontrastné látky a ich interakcia s prostredím pri vytváraní kontrastu
v MRI.
Lucia Mikušová. Zdraviu prospešné účinky cereálneho β-glukánového nápoja a tanca
ako súčasť redukčného programu.
Ľubomír Mikuš. Extrakt z ginko biloba ako zdroj zdraviu prospešných látok v
pekárskom výrobku.
Ivana Miláčková. Antioxidačný účinok SMe1EC2, nízkobázického derivátu stobadínu, v
chemickom modeli a na bunkovej úrovni.
Jana Plšíková. Takrínové deriváty ako potencionálne protinádorové liečivá
Martina Danihelová. Protinádorová aktivita lipofilných derivátov rutínu.
Lenka Duchoňová. Netradičné farebné pšenice, ich nutričná ariabilita a vyuţitie
v potravinárstve.
19:00-20:00 VEČERA
20:00-??:?? Neformálna diskusia
2. Deň: 22. 9. 2011(štvrtok)
08:45-9:20
RAŇAJKY
Sekcia III. Molekulárna, celulárna biológia a mikrobiológia
predseda: Peter Račay, Zdena Sulová
09:30-09:45 Katarína Kliková. Štúdium vplyvu hsp70 na preţívanie a chemosenzitivitu
leukemických buniek
10
10:30-10:45
Lucia Messingerová. Lenalidomid v liečbe myelodysplastického syndrómu.
Andrea Štefániková. Vzájomná inhibícia signálnych dráh PI3K/Akt a MEK/ERK
spôsobuje smrť buniek HL-60.
Jozef Hatok. Štúdium vplyvu multidrug rezistencie a apoptózy na rozvoj vybraných
nádorových chorôb.
Jaromír Mikeš. Úloha GDF-15 vo fotodynamickej terapii s hypericínom.
10:45-11:15
PRESTÁVKA
Sekcia III.
predseda:
11:15-11:30
Molekulárna, celulárna biológia a mikrobiológia (pokračovanie)
Juraj Koppel, Miroslav Barančík
Lucia Lichvárová. Časovo závislé zmeny expresie cav1.2 vápnikového kanála počas
diferenciácie pc12 buniek.
Karel Frimmel. Môţe krátkodobé podávanie omega-3 mastných kyselín redukovať
poškodenie aorty vyvolané zápalovým procesom.
Matej Kučera. Vplyv kotvených molekulových foriem cholínesteráz na vybrané
fyziologické parametre v srdci.
Mária Kovalská Hyperhomocysteinémia a ischemicko/reperfúzne poškodenie
mozgu potkana
Stanislav Babic. Vplyv blokády glutamátovej signalizácie na proliferáciu buniek v
hipokampe a v srdci počas stresu.
09:45-10:00
10:00-10:15
10:15-10:30
11:30-11:45
11:45-12:00
12:00-12:15
12:15-12:30
13:00-13:45
OBED
Sekcia III.
predseda:
14:00-14:15
Molekulárna, celulárna biológia a mikrobiológia (pokračovanie)
Juraj Kopáček, Olga Kriţanová
Martina Némethová. Mutačná analýza génov NF1 a SPRED1 u slovenských
pacientov
Lea Dugovičová. Kmeňové bunky a ich identifikácia pomocou prietokovej
cytometrie.
Peter Radvák. Modulácia expresie karbonickej anhydrázy IX pomocou RNA
interferencie a jej vplyv na nádorové bunky
Zuzana Kažmérová. Patologicky modifikovaný tau proteín spôsobuje neurozápal v
alzheimerovej chorobe
Michal Prčina. Analýza interakčných partnerov priónového proteínu a ich funkčný
význam.
14:15-14:30
14:30-14:45
14:45-15:00
15:00-15:15
15:15 -15: 35 PRESTÁVKA
Sekcia III.
predseda:
15:35-15:50
15:50-16:05
16:05-16:20
16:20-16:35
Molekulárna, celulárna biológia a mikrobiológia (pokračovanie)
Ľudovít Varečka, Imrich Barák
Matej Stano. phiSITE a phiGENOME – bioinformatická platforma pre genomiku
bakteriofágov.
Karol Blesák. Unikátne sekvenčno-štruktúrne črty extrémofilných amylolytických
enzýmov z rodiny GH57.
Anna Vandžurová . Genetická ekológia restrikčno-modifikačných systémov
u enterokokov.
Ľuboš Nižnanský. Úloha glutamát dekarboxylázy počas vývoja a stresu u vláknitej
huby Trichoderma atroviride F-534.
11
16:35-16:50
Ján Madacki. Funkčná charakterizácia predpokladanej epoxidhydrolázy EphD z
Mycobacterium tuberculosis.
16:50-17:05
Soňa Bernátova. Firma ProScienceTech (Prednáška sponzora)
POSTEROVA sekcia (17:30-18:30)
predseda:
Ernest Šturdik, Miroslav Barančik
1.
Ivana Centárová. Charakterizácia kvasinkových mitochondriálnych prenášačov.(Sekcia II)
2.
Katarína Turáková a kol. Vtok Ca2+ do myšacích tymocytov. .(Sekcia II)
3.
Lucia Mikešová. Nekaspázové dráhy apoptózy a ich podiel na bunkovej smrti nádorov
vystavených fotodynamickej terapii s hypericínom. (Sekcia III)
4.
Csaba Bognár. DHPLC skríning kauzatívnych mutácií vybraných oblastí génov LRRK2 a
parkin u pacientov s Parkinsonovou chorobou. (Sekcia III)
5.
Lenka Fráterová. Extracelulárne chitinázy a glukanázy v procese somatickej embryogenézy
niektorých ihličnanov. (Sekcia III)
6.
Renáta Kozáková. Chemická analýza odrôd pšenice letnej (triticum aestivum l.) s dôrazom na
ich zdraviu prospešnosť. (Sekcia III)
7.
Jana Mlynárová. Aplikácia prietokovej cytometrie pri separácii cd133+ kmeňových buniek
z kostnej drene. (Sekcia III)
8.
Michal Šarkan. Štúdium funkcie predpokladaného ABC transportéra
MSMEG_3119/MSMEG_3118/MSMEG_3117 v mykobaktériách. (Sekcia III)
9.
Zuzana Zemková.. Heterotransglykozylačné aktivity proteínov v semenách kapucínky
(Tropaeolum majus). (Sekcia IV)
19:00-??:??
GRILOVANIE, Neformálne diskusie
3. Deň: 23. 9. 2011 (piatok)
8:45-9:30
RAŇAJKY
Sekcia IV.
predseda:
09:30-09:45
10:30-10:45
Enzymológia a proteomika
Juraj Koppel, Imrich Barák
Ľuboš Ambro. Mutáciami indukovaná separácia dvoch kooperujúcich aktivít ľudskej
Lon proteázy.
Marek Bučko. Vývoj univerzálnej techniky na imobilizáciu biokatalyzátorov
Dominika Dingová Optimalizácia podmienok Ellmanovej metódy
Jaroslav Filip. Konstrukce elektrod biopalivového článku pomocí kombinace
nanočástic.
Katarína Mrvová. Vývoj detekčnej metódy na štúdium inter-individuálnej variability
butyrylcholínesterázy.
Jozef Parnica. Iónové kvapaliny ako proteín stabilizujúce systémy.
10:45-11:15
PRESTÁVKA
09:45-10:00
10:00-10:15
10:00-10:15
10:15-10:30
11:15-12:30 Zasadania komisie
12:30-13:30
OBED
13:45-14:15 Vyhlásenie výsledkov súťaţe mladých vedeckých pracovníkov
14:15-14:30Ukončenie 6. Ročníka Drobnicovho memoriálu
12
13
Zborník abstraktov
14
CHÉMIA ŢIVOTA
Martin Šimkovič, Ľudovít Varečka
Oddelenie biochémie a mikrobiológie Fakulty chemickej a potravinárskej technológie STU,
Radlinského 9, 812 37 – Bratislava
Kľúčový problém prebiotickej syntézy biomolekúl, ako aj autotrofného spôsobu ţivota, predstavuje
redukcia CO2 a vznik zlúčenín s väčším počtom uhlíkov. V ţivých organizmoch dnes existuje
niekoľko dráh, činnosťou ktorých dochádza ku zabudovaniu CO2 do organických molekúl, ale len
dve reakcie, pri ktorej sa CO2 redukuje priamo. Prvá z nich vedie ku asimilácii CO2 niektorými
baktériami a vzniká pri nej octan (Woodova-Ljungdahlova reakcia). Pozoruhodné je, ţe intermediát
tejto reakcie je CO. Táto okolnosť je veľmi zaujímavá, vzhľadom na existenciu karboxydotrofných
(tj. ţijúcich na CO) baktérií, ktoré boli objavené nedávno. Pravdepodobne ide o veľmi starobylú
reakciu. Druhá reakcia je biosyntéza pyrohroznanu z octanu. Iné reakcie asimilácie CO2, ktoré sú
známe z biochémie autotrofných organizmov, sú zaloţené na karboxylačných reakciách, ktorých
produkty podliehajú následným oxidoredukčným premenám.
Priama redukcia CO2 je známa z disimilácie (tj. energetického vyuţitia) CO2 metanogénnymi
baktériami a vedie ku vzniku metánu. Táto reakcia je veľmi pravdepodobne zdrojom zemného plynu.
Priama redukcia CO2 sa uskutočňuje vodíkom priamo, alebo prostredníctvom iných redukovaných
zlúčenín (feredoxín, redukované redukčné ekvivalenty, napr. NADPH+H+, a pod.). V poslednom
čase sa ukazuje, ţe molekula H2 je častejším redukčným činidlom ako by sa javilo na prvý pohľad,
dokonca aj pri symbióze baktérií a niţších ţivočíchov. Redukcia molekulou H2 je katalyzovaná
zvláštnymi enzýmami – hydrogenázami. Tieto enzýmy sú kľúčové pri pokusoch produkovať
molekuly H2 ako nádejné palivo budúcnosti pomocou metabolizmu anaeróbnych mikroorganizmov.
Netreba zabúdať ani na to, ţe oxidovaná forma vodíka, tj. H+, sa vyskytuje ako univerzálny faktor
konzervovania energie (pochádzajúcej z oxidačno-redukčných reakcií) prostredníctvom
elektrochemického potenciálu protónov.
Primárnou reakciou asimilácie dusíka je tzv. fixácia dusíka, pri ktorej molekula N2 je redukovaná aţ
na amoniak. Amoniak môţe byť zabudovávaný do organických molekúl niekoľkými univerzálnymi
reakciami. Reakcia fixácie N2 je katalyzovaná nitrogenázou a je tieţ veľmi starobylá. Ukázalo sa, ţe
nitrogenázová reakcia má niekoľko alternatívnych podôb. Za určitých podmienok je nitrogenáza
schopná redukovať aj H+ a produkovať H2. Nedávno sa ukázalo, ţe nitrogenáza sa môţe zúčastňovať
aj metabolizmu uhlíka. Ukázalo sa, ţe môţe redukovať reťaziť CO za vzniku etylénu, etánu aţ
butylénu a butánu, čo sú minoritné zloţky zemného plynu. To ukazuje na flexibilitu starobylých
mechanizmov, ktorá môţe vysvetliť aj mnohé aspekty explozívneho rozvoja metabolizmu do
rozmerov, aké poznáme dnes. Teda, CO je jedným z dôleţitých intermediátov metabolizmu.
Aj keď dnes poznáme metabolizmus vyšších organizmov prakticky vyčerpávajúco, ukazuje sa, ţe
štúdium niţších foriem ţivota a najmä ich biochemických aspektov prináša stále nové poznatky,
ktoré odhaľujú nielen zaujímavé reakčné mechanizmy, ale umoţňujú pochopiť aj širšie, napr.
ekologické alebo energetické aspekty fungovania ţivých organizmov.
Táto práca bola podporovaná grantmi APVV 0642-07 a LPP 0092-06.
15
Sekcia II.: Biochémia a biofyzika biologických membrán
16
KONTROLA HLADINY SKVALÉNU V KVASINKÁCH S. CEREVISIAE
Martina Garaiová, Veronika Nahálková, Peter Kohút, Ivan Hapala
Ústav biochémie a genetiky živočíchov SAV, 90028 Ivanka pri Dunaji
Úvod: Skvalén je lineárny izopreoid vyskytujúci sa v bunkách eukarytov ako biologicky prekurzor
biosyntézy steroidov vrátane cholesterolu. Vďaka výrazným antioxidačným a chemoprotektívnym účinkom
nachádza uplatnenie v kozmetickom, farmaceutickom a potravinárskom priemysle. Medzi zdroje pre
priemyselnú produkciu skvalénu patrí pečeň ţralokov resp. rastlinné oleje, vhodný alternatívny zdroj tejto
významnej molekuly by mohli predstavovať mikroorganizmy vrátane kvasiniek. V práci sa zameriavame sa
skúmanie faktorov kontrolujúcich hladinu skvalénu v kvasinke Saccharomyces cerevisiae.
Materiál a metódy: Pouţité kmene: štandardný kmeň (BY4742), 350 (KLN1 [pNS1]ERG1), 353 (KLN1
[pAB1]erg1 L37P),358 (KLN1 [pCN1]erg1 Q443STOP), QM (DGA1::KanMX; LRO1::KanMX;
ARE1::KanMX; ARE2::KanMX)
Striktne anaeróbne podmienky sme dosiahli úpravou médií podľa metódy vyuţívanej pre metanogénne
baktérie. Nesaponifikovateľné lipidy boli stanovené pomocou HPLC na reverznej fáze (RP-HPLC) s vyuţitím
Corona CAD detektora. Viabilitu kvasiniek sme testovali pomocou kvapkového testu.
Výsledky a diskusia: V štandardných podmienkach je skvalén v bunkách kvasiniek S. cerevisiae okamţite
spotrebovávaný na syntézu ergosterolu. Častým prístupom na zvýšenie jeho obsahu je zvýšenie syntézy
v mevalonátovej dráhe. V práci sme sledovali alternatívne faktory ovplyvňujúce hladinu skvalénu v bunkách:
inhibícia postskvalénovej časti biosyntézy ergosterolu (anaerobióza, hem-deficiencia, zníţenie aktivity
skvalén epoxidázy špecifickým inhibítorom terbinafínom mutačný zásah ERG1 génu) a ovplyvnenie
skladovacej kapacity buniek v lipidových časticiach. Najväčší nárast obsahu skvalénu sme pozorovali pri
zníţení aktivity skvalén epoxidázy u terbinafín-hypersenzitívnych mutantov v géne ERG1 kódujúcom skvalén
epoxidázu (Obr.1) resp. pri blokovaní aktivity skvalén epoxidázy subinhibičnými koncentráciami terbinafínu
(obr. 2). Akumulácia skvalénu bola pritom významne ovplyvnená u mutantov s narušenou biogenézou
lipidových partikúl (obr. 2) ako „skladovacích“ organel pre neutrálne lipidy. Absencia týchto organel
v bunkách kvasiniek sa odrazila ako na akumulácii skvalénu, tak aj na celkovej viabilite buniek.
700
600
100
358
kmene
Obr.1 Vplyv
zníţenej
aktivity
epoxidázy
skvalénu
na
produkciu skvalénu
Obr.2
5
7,
5
b
b
+T
er
M
Q
+T
er
M
2,
5
Q
b
+T
er
M
M
Q
353
BY
350
47
4
0
Q
2+
BY
100
2+
Te
rb
5
2+
Te
rb
7,
5
0
47
4
200
Skvalen
200
47
4
300
Ergosterol
300
BY
Skvalén
400
2
Ergosterol
2,
5
400
500
47
4
500
Te
rb
lipidy (ug/109 buniek)
600
BY
lipidy (ug/109 buniek)
700
kmene
Vplyv
terbinafínu
na
akumuláciu skvalénu v divom
type (BY4742) a kmeni bez
lipidových partikúl (QM)
Zablokovanie metabolizmu skvalénu v neprítomnosti O2 resp. hem deficienciou viedlo k výrazne niţšej
akumulácii skvalénu
Záver: Naše výsledky potvrdili, ţe obsah skvalénu v bunkách kvasiniek je kontrolovaný na viacerých
úrovniach. Z hľadiska zvýšenia jeho akumulácie sa ako veľmi sľubný prístup ukazuje zníţenie aktivity
skvalén epoxidázy pomocou špecifických mutácií v ERG1 géne.
Práca bola podporená grantmi VVCE-0064-07, APVV-0681-07 a VEGA-2-0058-11
17
REGULÁCIA VODIVOSTI CHLORIDOVÝCH KANÁLOV Z MITOCHONDRIÁLNYCH
MEMBRÁN
Anton Mišák, Marián Grman, Lubica Máleková, Zuzana Tomášková, Karol Ondriaš
Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava
Úvod: Srdcové arytmie môţu spôsobiť náhle srdcové príhody, často fatálne. Napriek dlhoročnej
práci, mechanizmus zodpovedný za vznik srdcových arytmií stále nie je úplne objasnený. Ukazuje
sa, ţe jednou z príčin môţu byť aj poruchy v bioenergetike mitochondrií: tieto majú významnú úlohu
pri regulácii vzrušivosti kardiomyocytov, a to predovšetkým pri vzniku arytmií v dôsledku
oxidačného stresu, ktorý vzniká napríklad pri ischémii/reperfúzii [1]. Iónové kanály z vnútornej
mitochondriálnej membrány priepustné pre anióny a označované ako IMAC (inner membrane anion
channel), ovplyvňujú mitochondriálny membránový potenciál ΔΨm. V kardiomyocytoch, ktoré boli
vystavené oxidačnému stresu, bolo pozorované zníţenie aţ kolaps ΔΨm [2]. Pokles ΔΨm je
sprevádzaný zníţenou produkciou ATP, na ktorú reagujú draslíkové kanály nachádzajúce sa na
sarkoleme a regulujúce priebeh a dĺţku akčného potenciálu na tejto membráne[3]. Úloha IMAC
kanálov v procese regulácie ΔΨm bola podloţená faktom, ţe látky, ktoré blokovali tok Cl - iónov z
mitochondrií (DIDS, 4-chloro-diazepam) dokázali zvrátiť kolaps ΔΨm [2]. Molekulárna identita
IMAC kanála je zatiaľ neznáma, avšak predpokladá sa, ţe je totoţný s mitochondriálnym „centum
pS“ kanálom, ktorý bol zmeraný metódou napäťového zámku [4]. Proti tejto hypotéze stoja
existujúce rozdiely pozorované medzi IMAC kanálom a „centum pS“ kanálom [5]. Naším cieľom je
purifikácia mitochondriálnych membrán, meranie Cl- prúdov cez tieto membrány, charakterizácia
vodivosti Cl- kanálov a jej regulácie pomocou pH.
Materiál a metódy: Mitochondrie izolované zo srdca potkana sme purifikovali na gradiente hustoty
a overili sme si čistotu mitochondriálnej frakcie pomocou vybraných protilátok a elektrónovej
mikroskopie. Z mitochondrií sme pripravili submitochondriálne vezikuly (SMP), ktoré sme
zabudovali do umelej lipidovej dvojvrstvy a merali sme elektrický prúd cez jeden kanál. Pouţili sme
gradient KCl (250/50mM). Pridávaním HCl alebo zásobného roztoku Tris sme menili pH
v roztokoch obmývajúcich kanál. Z nameraných prúdovo-napäťových charakteristík sme určili
hodnotu vodivosti kanála.
Výsledky a diskusia: Vo vyčistenej mitochondriálnej frakcii sme pozorovali zanedbateľnú
kontamináciu sarkoplazmatickým retikulom (SR) a lyzozómami. Chloridové kanály získané z tejto
frakcie mali v našich podmienkach vodivosť 129±3 pS (pH=7,4; N=62). Pokles pH na hodnotu 6,5
spôsobil nárast vodivosti na 120% aţ 220%, podľa strany membrány. Naopak, nárast pH na 8,5
spôsobil, ţe vodivosť klesla na 76%. Tento účinok bol pozorovaný pri zmene pH na oboch stranách
membrány. Podobné vlastnosti boli pozorované aj na Cl- kanáloch zo SR. Z našich predchádzajúcich
štúdii však vieme, ţe medzi nami meranými kanálmi a SR kanálmi existujú rozdiely (efekt ATP,
selektivita), takţe nepredpokladáme, ţe skúmané Cl- kanály pochádzajú z kontaminácie
mitochondriálnej frakcie membránami SR.
Záver: Tieto výsledky sú pre nás prvým krokom pre podrobnú charakterizáciu Cl- kanálov
z mitochondrií a naším ďalším cieľom bude zistiť, do akej miery sa pozorované kanály zhodujú
s IMAC a „centum pS“ kanálmi.
1. Brown, D.A. and B. O’Rourke, Cardiovasc Res (2010) 88, 241-249
2. Aon, M.A., et al., J Biol Chem (2003) 278, 44735-44744
3. O'Rourke, B., B.M. Ramza, and E. Marban, Science (1994) 265, 962-966
4. Sorgato, M.C., B.U. Keller, and W. Stuhmer, Nature (1987) 330, 498-500
5. Peixoto, P.M., Ryu, S.Y. a Kinnally K.W. FEBS Lett. (2010) 584, 2142-2152
Práca bola podporená projektom VEGA 2/0150/10
18
ÚLOHA PROTEÍNOV AUS1 A PDR11 V PRÍJME EXTERNÝCH STEROLOV U KVASINIEK
Peter Kohút1, Daniel Wüstner2, Lucia Hronská1, Ivan Hapala1, Martin Valachovič1,3
1
Ústav biochémie a genetiky živočíchov SAV, 90028 Ivanka pri Dunaji, 2Department of Biochemistry and
Molecular Biology, University of Southern Denmark, DK-5230 Odense M, Denmark, 3Department of Medical
Biochemistry, Medical University of Vienna, Max F. Perutz Laboratories, A-1030 Vienna, Austria
Úvod: U kvasiniek Saccharomyces cerevisiae je príjem externých sterolov viacstupňový proces prebiehajúci
len počas anaerobiózy alebo hem deficiencie. Zahŕňa prestup bunkovou stenou, vstup do plazmatickej
membrány a integráciu do vnútrobunkových membrán. V našej práci sme pomocou fluorescenčného analógu
ergosterolu – dehydroergosterolu (DHE) sledovali prvé dve fázy tohto procesu pomocou troch nezávislých
experimentálnych prístupov: fluorescenčnej spektroskopie, fluorescenčnej mikroskopie a kvantifikácie obsahu
sterolov pomocou kvapalinovej chromatografie (HPLC).
Materiál a metódy: V práci sme vyuţívali štandardné biochemické postupy ako napríklad izoláciu
a kvantifikáciu lipidov pomocou TLC a HPLC, prípravu protoplastov, izoláciu membránových frakcií,
fluorescenčnú mikroskopiu (v spolupráci s Dr. Wüstnerom) a tieţ nami vyvinutú metódu fluorescenčného
stanovenie obsahu dehydroergosterolu v bunkách.
Výsledky a diskusia: Vyuţitím špecifických vlastností DHE sme ukázali, ţe vstup sterolov do plazmatickej
membrány nieje spontánny, ale vyţaduje prítomnosť dvoch ABC (ATP-Binding Cassette) proteínov – Aus1
a Pdr11. Pomocou fluorescenčnej mikroskopie sa nám podarilo priamo vizualizovať DHE v plazmatickej
membráne buniek obsahujúcich tieto dva proteíny(Obr1., hem1+DHE). HPLC analýza sterolov síce odhalila
prítomnosť určitého mnoţstva DHE aj u buniek bez Aus1 a Pdr11 proteínov (Obr. 2 vľavo, hem1 aus1 pdr11),
fluorescenčná spektroskopia však ukázala, ţe tento DHE nie je inkorporovaný do membrán (Obr. 2 vpravo).
Po enzymatickom odstránení bunkovej steny sa mnoţstvo takto asociovaného DHE signifikantne zníţilo čo
ukazuje, ţe bunková stena zohráva aktívnu úlohu v príjme externých sterolov u kvasiniek.
Fluorescenčná mikroskopia buniek kultivovaných v prítomnosti dehydroergosterolu.
Obr 1.
200.00
1000
hem1 DHE membránová frakcia
180.00
Cholesterol
Ergosterol
Intenzita fluorescencie (AU)
ug of sterol/10e9cells
160.00
140.00
120.00
100.00
80.00
60.00
40.00
hem1 aus1 pdr11 DHE membránová frakcia
800
700
600
500
400
300
200
100
20.00
0
0.00
hem1
Obr2.
900
DHE
hem1 aus1 pdr11
340
350
360
370
380
390
400
410
420
430
440
450
460
Emisná vlnová dĺžka (nm)
Analýza obsahu sterolov pomocou HPLC (vľavo) a fluorescenčná anlýza obsahu DHE
v membránach(vpravo) u buniek kultivovaných v prítomnosti DHE.
Závery:
 Proteíny Aus1 a Pdr11 sú u kvasiniek S. cerevisiae počas anaerobiózy nevyhnutné pre vstup externých
sterolov do plazmatickej membrány.
 Bunková stena anaeróbnych a hem deficitných kvasiniek sa aktívne podieľa na príjme sterolov
a vykazuje špecifickú schopnosť vychytávať ergosterol a štruktúrne príbuzné steroly.
Táto práca bola podporená grantmi APVT-51-029504, VVCE-0064-07 a Transmed I v rámci OP VaV
financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
19
Sekcia I.: Xenobiotiká a vzťahy medzi štruktúrou a účinkom látok
20
POČÍTAČOVÁ MIKROTOMOGRAFIA V BIOLÓGII
Robert Ševčík1, Miroslav Hain1
1
Ústav merania SAV Bratislava
Úvod: Röntgenová počítačová mikrotomografia je okrem iného vynikajúcim nástrojom na
vizualizáciu a štúdium vnútorných štruktúr organizmov v biológii a paleontológii.
Metódy a materiály: Na nedeštruktívnu vizualizáciu vnútorných štruktúr organizmov bola
aplikovaná moderná metóda RTG mikrotomografie s vyuţitím prístroja Nanotom 180 firmy GEPhoenix. Nanotom obsahuje výkonnú RTG trubicu 180 kV/15W so submikrometrovou fokusáciou a
scintilačný detektor s rozlíšením 2300x2300 pixelov. V 2D projekcii umoţňuje dosiahnuť rozlíšenie
na úrovni 200-300 nm/pixel a v 3D po rekonštrukcii obrazu rozlíšenie 500 nm/voxel. RTG trubica
Nanotomu je transmisného typu a je moţné zvoliť terčík z dvoch materiálov – wolfrám a molybdén.
Prezentované merania boli uskutočnené s wolfrámovým terčíkom pri optimalizovaných
podmienkach pre biologické vzorky. Po rekonštrukcii 3D obrazu bol na ďalšie grafické spracovanie
3D obrazu pouţitý program VG Studio Max 2.1.
Ako vzorky boli pouţité hmyz, jaštery a skameneliny.
Výsledky a diskusia: Počítačová mikrotomografia znamená zásadný posun v štúdiu vnútorných
štruktúr organizmov a ich zobrazovaní. Je to predovšetkým preto, ţe je to neinvazívna
(nedeštruktívna) metóda, takţe nedochádza k ţiadnemu zásahu do celistvosti skúmaného objektu či k
jeho moţnému poškodeniu. Táto metóda dokáţe v krátkom čase vytvoriť presný trojrozmerný model
(3D) a zobraziť dané štruktúry z rôznych strán a v rôznych rezoch.
Na obrázkoch sú zobrazené rôzne moţnosti vizualizácie biologických objektov – zobrazenie
povrchu, transparentnosť, rez a segmentácia.
Obr. 1: Mucha v netransparentnom, transparentnom móde s viditeľnými orgánmi a v reze.
Obr. 2: Segmentácia lebky slepúcha.
Moţné sú aj ďalšie reţimy zobrazenia, pouţitia farieb atď.
Záver: Počítačová mikrotomografia poskytuje v biológii široké moţnosti nedeštruktívneho
zobrazenia kostier, vnútorných orgánov ako aj malých biologických objektov a ich následné
počítačové 3D spracovanie.
Poďakovanie: Táto publikácia bola vytvorená realizáciou projektu „Vytvorenie CE na výskum a vývoj konštrukčných
kompozitných materiálov pre strojárske, stavebné a medicínske aplikácie“, na základe podpory operačného programu
Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
21
KONTRASTNÉ LÁTKY A ICH INTERAKCIA S PROSTREDÍM
pri vytváraní kontrastu v MRI
Daniel Gogola1, Oliver Štrbák1, Ladislav Bačiak2, Ivan Frollo1
1
Ústav merania SAV Bratislava, 2Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU
Úvod: MRI tak ako aj ostatné zobrazovacie techniky sa stretáva s problémom odlíšenia tkanivových štruktúr
ktorých intenzity signálov sa navzájom prekrývajú a to napriek tomu ţe MRI je v súčasnej dobe povaţované
za zobrazovaciu techniku s najlepšou rozlišovacou schopnosťou mäkkých tkanív.
Najčastejšie pouţívané kontrastné látky vyuţívajú častice gadolínia alebo rozličné oxidy ţeleza ako Fe 2O3,
Fe3O4 ktoré sú rozptýlené v nosnej kvapaline. Cieľom tejto štúdie je sledovanie vplyvu záujmových molekúl
(NaCl, glukóza) na relaxačné časy kontrastnej látky Resovist.
Materiál a metódy: Resovist je klinicky pouţívaná kontrastná látka v ktorej účinnou látkou je
superparamagnetický oxid ţeleza obalený vrstvou karboxydextránu. Resovist umoţňuje včasné zobrazovanie
T2, T2* váţených obrázkov. Táto kontrastná látka je vysoko efektívna a dobre tolerovaná, ktorá nezaťaţuje
kardiovaskulárny systém. Koncetrácia kontrastnej látky v in VITRO experimentoch zodpovedala koncentrácii
kontrastnej látky pri in VIVO zobrazovaní.
Obrázky boli získavané na MR tomografe Varian 4.7 T, sekvenciou "Spin-echo Multi-slices Imaging
sequence" (SEMS), s opakovacím časom TR=2 s a dvanástimi rôznymi echočasmi. Namerané dáta boli
porovnané s dátami s klinického tomografu ESAOTE Opera 0.178 T. Sledovali sme päť vzoriek (plus jedna
referenčná) s rovnakou koncentráciou Resovistu a rôznou koncentráciou záujmových molekúl (NaCl a
glukóza): 1. voda, 2. voda + Resovist, 3. voda + Resovist + cNaCl = 9 g/l, 4. voda + Resovist + cNaCl = 90 g/l ,
5. voda + Resovist + cGlu = 1 g/l, 6. voda + Resovist + cGlu = 10 g/l
Výsledky a diskusia: Na obrázku 1 sú zobrazené dáta, získané sekvenciou SEMS na tomografe 4.7 T pre
dvanásť rôznych echo časov. Z obrázku je zrejmé, ţe rôzne molekuly v rôznych koncentráciách ovplyvňujú
relaxačné časy kontrastnej látky. Zmeny T2 časov sú uvedené tab.1.
Tab.1
Číslo
[s.d.]+/T2[s]
vzorky
[s]
1
0.3205
0.009
2
0.0286 0.00009
3
0.0348 0.00024
4
0.0463 0.00017
5
0.0287 0.00007
6
0.0297 0.00013
Obr.1 Snímky namerané MR tomografom
4.7 T, TR = 2 s
Obr.2 Snímky namerané klinickým MR tomografom 0.178 T
Pre porovnanie vplyvu záujmových molekúl na relaxačné vlastnosti kontrastnej látky boli vzorky zobrazené v
klinickom tomografe ESAOTE Opera 0.178 T (obr.2). Z obrázkov je vidieť zmenu kontrastu pre vzorky číslo
1, 3, 4 pri sekvencii SE.
Záver:Pokles signálov v jednotlivých vzorkách so vzrastajúcim echo časom bol očakávaný, na rozdiel od
zmeny relaxačných T2 časov pre jednotlivé molekuly a ich koncentrácie. Táto zmena, spolu s odchýlkami
nameranými na klinickom tomografe sú predmetom ďalšej štúdie.
22
ZDRAVIU PROSPEŠNÉ ÚČINKY CEREÁLNEHO β-GLUKÁNOVÉHO NÁPOJA A
TANCA AKO SÚČASŤ REDUKČNÉHO PROGRAMU
Lucia Mikušová1, Andrea Holubková1, Lenka Duchoňová1, Ernest Šturdík1, Igo Kajaba2,
Martina Valachovičová2
1
Oddelenie výživy a hodnotenia potravín, Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, FCHPT STU
Bratislava, 2Slovenská zdravotnícka univerzita, Bratislava
Úvod: Mnohé cereálie, najmä jačmeň a ovos, sú bohatým zdrojom β-glukánov so zaujímavými
fyziologickými účinkami. Zatiaľ čo β-glukány húb sú známe najmä svojím imunomodulačným
potenciálom, cereálne β-glukány môţu zniţovať hladinu glukózy, inzulínu a celkového cholesterolu
resp. ovplyvňovať hormóny regulujúce pocit sýtosti. Konkrétne vlastnosti však závisia od prírodného
zdroja a štruktúry sledovaného β-glukánu. Cieľom tejto práce bolo sledovať zdraviu prospešné
účinky dvojmesačnej konzumácie β-glukánového nápoja (Actiglucane) na vybranej vzorke zdravých
ţien so zvýšeným percentom telesného tuku (˃29%) ako súčasť programu na zníţenie hmotnosti.
Program redukcie hmotnosti - nutrične vyváţená strava a konzumácia Actiglucane (skupina "nápoj")
boli doplnené aj o pohybový tanečný reţim aeróbneho charakteru 3 krát týţdenne po 75 minút
(kombinovaná skupina "tanec a nápoj").
Materiál a metódy: Súbor tvorili zdravé probandky (n=45 vo veku 19-34 rokov), ktoré boli
rozdelené do 4 skupín ("nápoj", "tanec a nápoj", "tanec“ a “kontrola"). Actiglucane po komplexnej
analýze (IČ spektroskopia, mol. hmotnosť, viskozita; obsah základných nutrientov, antioxidačná
aktivita, postprandiálna sýtiaca schopnosť a glykemická odpoveď) bol zaradený do jedálnička
probandiek 2 krát denne, ako náhrada desiaty a olovrantu v rámci nutrične vyváţenej stravy (skupina
"nápoj" a "tanec a nápoj"). Denná dávka 2 x 45g koncentrátu nápoja predstavovala 3g βglukánu/deň. Skupina "tanec" resp. "tanec a nápoj" navštevovala 3x týţdenne riadené tanečné hodiny
aeróbneho charakteru. Na sledovanie antropometrických parametrov bol pouţitý prístroj In Body 230
(Biospace, USA). Biochemické analýzy boli vykonané na automatickom analyzátore Vitros 250
(Johnson & Johnson, USA). Všetky probandky podstúpili na začiatku a konci štúdie Eurofit testy a
tanečnú hodinu za pouţitia sporttesteru Polar RS 400 (China).
Výsledky a diskusia: Adaptácia na nutrične vyváţenú stravu (prípravná časť štúdie, 8 týţdňov)
nepreukázala štatisticky významné zmeny. Implementácia nízkoenergetického (111 kcal/deň)
Actiglucane nápoja s dobrou sýtiacou schopnosťou do nutrične vyváţenej stravy probandiek
spôsobila zníţenie príjmu tukov ("nápoj": zníţenie o 53%, p<0,016; "tanec a nápoj": 37%, p<0,017)
ako aj pokles celkového energetického príjmu ("nápoj": pokles o 17%, p<0,034; "tanec a nápoj":
12%, p<0,049). Vplyvom tanca došlo v kombinovanej skupine aj k vzostupu výdaja energie, čo sa
odzrkadlilo v zlepšení antropometrických parametrov. Kombinovaná skupina zníţila v priebehu
štúdie svoju hmotnosť o 2,6±0,5 kg, pričom skupina bez zaradenej pohybovej aktivity schudla
o 2,0±0,5 kg. K zmenám došlo aj na úrovni BMI, % telesného tuku a WHR indexu. Významný
pokles bol zistený aj v hladine viscerálneho tuku. Na biochemickej úrovni došlo k štatisticky
významnému poklesu celkového a LDL cholesterolu ako aj aterogénneho indexu. Hladina glukózy a
inzulínu nebola štatisticky významne odlišná na hladine pravdepodobnosti 95%, čo je ale v súlade
s inými prácami u probandov s normálnou glukózovou toleranciou.
Záver: Vďaka prezentovaným zdraviu prospešným účinkom by β-glukánový nápoj mohol byť
v klinickej praxi pouţívaný ako podporný prostriedok pri redukcii hmotnosti, resp. pri predchádzaní
obezity a v prevencii kardiovaskulárnych ochorení. Avšak je potrebné výsledky podporiť
dlhodobejšími štúdiami s väčším počtom probandov vo viacerých vekových kategóriách ako aj u
muţov.
Práca bola podporená agentúrou APVV v rámci projektu číslo 0310-06 a VMSP-II-0024-09. Autori
by radi poďakovali firme Essentia, s.r.o. za prípravu Actiglucane nápoja a firme Bel/Novamann za
umoţnenie analýz nutričných komponentov
23
EXTRAKT Z GINKO BILOBA AKO ZDROJ ZDRAVIU PROSPEŠNÝCH LÁTOK V
PEKÁRSKOM VÝROBKU
Ľubomír Mikuš1, Mária Kováčová1, Ladislav Dodok1, Zuzana Vantová2
Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia, 1Oddelenie výživy a hodnotenia potravín; 2Oddelenie
biochémie a mikrobiológie, FCHPT STU Bratislava
Úvod: Podľa Cieza et al. (2003) extrakt z ginko biloba (EGb 761®) ukázal pozitívny účinok pri prevencii
duševných chorôb, hlavne u pacientov s poruchami mozgu vaskulárneho pôvodu a u pacientov s
Alzheimerovou chorobou. Zlepšuje cirkuláciu krvi, spevňuje steny kapilár, chráni nervové bunky a zlepšuje
koncentráciu a pamäť. EGb 761® obsahuje štandardne 24% flavonoidov a 6 % terpenoidov. Cieľom práce
bolo pripraviť extrakt z ginko biloba s podobnými vlastnosťami a inkorporovať ho do pekárskeho výrobku.
Materiál a metódy: Na oboch pripravených extraktoch z ginko biloba (vodný, etanolový) boli vykonané
nasledovné analýzy. Obsah celkových fenolových látok bol stanovený spektrofotometrickou metódou
pomocou Folin-Ciocalteuovho činidla pri vlnovej dĺţke λ=725 nm (štandard kyselina galová) podľa Velioglu
(1998). Flavonoidy boli stanovené spektrofotometrickou metódou podľa Rakatoarisona et al. (1997), pomocou
AlCl3 pri vlnovej dĺţke λ=394 nm (štandard kvercetín). Antioxidačná aktivita bola stanovená
spektrofotometrickou metódou podľa Chu & Chen (2006), pomocou DPPH• pri vlnovej dĺţke λ=517 nm.
Cytotoxicita bola stanovená MTT testom, čo je kolorimetrická metóda zaloţená na schopnosti ţivých buniek
redukovať rozpustnú MTT soľ ţltej farby na formazánové kryštály modrej farby podľa Carmichael et al.
(1987).
Výsledky a diskusia: Pred testovaním extraktov z ginko biloba a po inkorporácii tohto extraktu do pekárskeho
výrobku bolo vykonané senzorické hodnotenie. Analýzy extraktov z ginko biloba sú uvedené v tabuľke č.1.
Tab. 1. Obsah celkových fenolových látok, flavonoidov a antioxidačná aktivita vyjadrená pomocou hodnoty
IC50 extraktov z ginko biloba
Celkové fenolové látky
( g /100 g)
ginko biloba (listy)
ginko biloba (extrakt)
Flavonoidy (g /100g)
ginko biloba (listy)
ginko biloba (extrakt)
vodná
extrakcia
0,971
4,5
etanolová
extrakcia
1,837
8,0
0,965
4,5
1,666
7,2
Hodnoty IC50 (µg /ml)
2097,1
689,4
kvercetín
25,3
kyselina galová
14,9
Etanolový a vodný extrakt ani pri koncentrácii 200 μg/ml nespôsobili 50 %-nú inhibíciu bunkovej viability.
Cytostatický/cytotoxický efekt látky nebol na študovanej nádorovej línii potvrdený. Po vykonaní senzorického
hodnotenia ako aj obsahu zloţiek extraktov (celkové fenolové látky, flavonoidy, antioxidačná aktivita) sme sa
rozhodli pre inkorporáciu etanolového extraktu z ginko biloba do pekárskeho výrobku v mnoţstve podľa
ODD (odporúčaná denná dávka) v minimálnom a maximálnom mnoţstve (pre EGb 761® 120 – 240 mg/ deň).
Záver:Hodnotitelia určili maximálne mnoţstvo extraktu z ginko biloba v pekárskom výrobku za senzoricky
nevhodnú (horká chuť, nepríjemná aróma). Naopak, minimálne mnoţstvo extraktu z ginko biloba bolo
hodnotené veľmi pozitívne. Vyskúšanie iných dávok extraktu ginko biloba, vykonanie analýz hotových
výrobkov ako aj sledovanie biologického účinku konzumácie týchto výrobkov na ľudský organizmus je
cieľom ďalšieho výskumu.
Táto práca vznikla s podporou agentúry APVV v rámci projektu VMSP-II-0024-09 a agentúry ministerstva
školstva, vedy, výskumu a športu Slovenskej Republiky pre štrukturálne fondy EÚ ako časť projektu:
,,Hodnotenie prírodných látok a ich výber pre prevenciu a liečbu civilizačných ochorení“ (ITMS
26240220040).
24
ANTIOXIDAČNÝ ÚČINOK SMe1EC2, NÍZKOBÁZICKÉHO DERIVÁTU STOBADÍNU,
V CHEMICKOM MODELI A NA BUNKOVEJ ÚROVNI
Ivana Miláčková1, Gregorz Bartosz2, Mária Jusková1, Milan Štefek1
1
Ústav experimentálnej farmakológie a toxikológie, SAV, Bratislava, Slovenská republika,
2
Department of Molecular Biophysics, University of Lodz, Lodz, Poland,
Úvod: Látka SMe1EC2 (Obr. 1a) bola zosyntetizovaná na Ústave experimentálnej farmakológie a toxikológie
Slovenskej akadémie vied v Bratislave ako analóg hexahydropyridoindolu stobadínu (Obr. 1b), ktorého
antioxidačná aktivita bola potvrdená viacerými štúdiami in vitro aj in vivo. Zámena metyl skupiny metoxy
skupinou v polohe 8 bola predpokladom zvýšenia antiradikálovej aktivity a zámena metyl skupiny acylovou
skupinou v polohe 2 bola predpokladom zníţenia bazicity, a tým zvýšenia biodostupnosti oproti stobadínu.
Cieľ: Overiť antioxidačnú aktivitu látky SMe1EC2 v podmienkach chemického modelu a na bunkovej úrovni
izolovaných erytrocytov a makrofágov, a tieţ porovnať jej biodostupnosť so stobadínom.
Materiál a metódy: V DPPH teste bol pouţitý 50 µM etanolický roztok stabilného voľného radikálu DPPH
(1,1´-difenyl-2-pikrylhydrazyl), do ktorého boli pridávané vodné roztoky skúmaných látok v konečnej
koncentrácii 50 µM pri laboratórnej teplote. Ako parameter antiradikálovej aktivity sa určil pokles
charakteristickej absorbancie pri 518 nm v priebehu prvej minúty reakcie. V systéme izolovaných erytrocytov
in vitro sa oxidačné poškodenie iniciovalo peroxylovými radikálmi indukovanými rozkladom hydrofilného
2,2´-azobis(2-amidinopropán)hydrochloridu (AAPH) a lipofilného t-butylhydroperoxidu (t-BuOOH) pri
teplote 37˚C. U študovaných látok sa ako kritérium antiradikálovej aktivity stanovila dĺţka počiatočnej
indukčnej periódy, ktorá predchádzala hemolýze. Ako ďalší bunkový model boli pouţité makrofágy RAW
264,7 myší, ktoré boli kultivované v médiu DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium) obsahujúce 10%
teplom inaktivované fetálne hovädzie sérum a gentamycín. Produkcia reaktívnych foriem dusíka (RNS) bola
indukovaná inkubáciou buniek v prítomnosti lipopolysacharidu (100 ng/ml; 16 hod) a produkcia reaktívnych
foriem kyslíka (ROS) bola indukovaná inkubáciou v roztokoch lipopolysacharidu (100 ng/ml; 16 hod)
a forbol myristát acetátu (100 nM; 30 min). Produkcia RNS a ROS bola stanovená fluorescenčnými metódami
s pouţitím molekulových prób DAF-FM DA (4-amino-5-metylamino-2´,7´-difluoresceín diacetátu) a H2R123
(dihydrorodamínu 123).
Výsledky: V DPPH teste látka SMe1EC2 vykazovala pribliţne trikrát vyššiu antiradikálovú aktivitu ako
stobadín. U erytrocytov vystavených extracelulárnemu pôsobeniu radikálov generovaných rozkladom
hydrofilného AAPH alebo intracelulárne, pôsobením lipofilného t-BuOOH, sme zaznamenali progresívnu
hemolýzu, ktorá bola charakterizovaná počiatočnou indukčnou periódou. Pôsobením hydrofilných
peroxylových radikálov generovaných extracelulárne, stobadín účinnejšie zabraňoval hemolýze. Naopak, ak
bola hemolýza iniciovaná lipofilnými peroxylovými radikálmi generovanými intracelulárne účinnejšiu
ochranu poskytla látka SMe1EC2 s vyššou biologicku dostupnosťou. V bunkovom modeli makrofágov
RAW 264,7 stobadín aj SMe1EC2 inhibovali intracelulárnu produkciu RNS a ROS, pričom SMe1EC2 sa
ukázal ako signifikantne silnejší inhibítor.
Záver: V celulárnych systémoch teda relatívna antioxidačná aktivita hodnotených látok závisí od vzájomnej
lokalizácie antioxidantu a atakujúcich radikálov. Výsledky predurčujú SMe1EC2 pre ďalší predklinický
výskum.
Obr. 1a
H2
C CH3
O
O
Obr. 1b
CH 3
N
N
CH3O
H 3C
N
H
N
H
25
TAKRÍNOVÉ DERIVÁTY AKO POTENCIONÁLNE PROTINÁDOROVÉ LIEČIVÁ
Jana Plšíková1, Ján Kovaľ2, Rastislav Jendţelovský2, Jana Janočková1, Slávka Hamuľaková3,
Peter Fedoročko2, Ján Imrich3, Mária Koţurková1
1
Katedra biochémie PF UPJŠ v Košiciach, 2Ústav biologických a ekologických vied PF UPJŠ v
Košiciach, 3Katedra organickej chémie PF UPJŠ v Košiciach
Úvod: Nukleové kyseliny sú hlavným cieľom pôsobenia rôznych protinádorových liečiv. Zmena
štruktúry DNA ovplyvňuje jej syntézu a funkciu, čo obvykle vedie k narušeniu bunkovej proliferácie
a môţe nakoniec vyvolať aj bunkovú smrť. Tieto účinky sú v súčasnosti vyuţívané na rozvoj nových
biologicky aktívnych liekov s potencionálnou aplikáciou ako antiproliferačné terapeutiká. Sú to
ligandy formujúce ternárny komplex s DNA cez interkaláciu, viazanie do ţliabkov, kovalentnú
väzbu a tieţ cez komplex s topoizomerázou. Tento enzým je schopný odvíjať DNA v jadre bunky a
keďţe odvíjanie DNA je prvým krokom pri replikácii bunky, ligandy schopné vyvolať štrukturálne
zmeny DNA by mohli byť pouţité ako chemoterapeutiká.
V práci sme preto sledovali vplyv novosyntetizovaných takrínových derivátov na DNA, spôsob ich
viazania sa, inhibičný účinok na topoizomerázu I a tieţ ich protinádorový účinok.
Materiál a metódy: Pri štúdiu boli pouţité novosyntetizované takrínové deriváty N-(1,2,3,4tetrahydroakridín-9-yl)-N`-[2-(1,2,3,4-tetrahydroakridín-9-yl-amino)alkyl] tiomočoviny (alkyl = etyl,
butyl, hexyl), syntetizované na Katedre organickej chémie PF UPJŠ v Košiciach. Ich schopnosť
viazať sa do DNA bola určená pomocou spektroskopických metód a to UV–vis spektroskopiou
a cirkulárnym dichroizmom. Látky boli rozpustené v DMSO a merané v 0,01M Tris (pH 7,4, 24 °C).
Inhibičný účinok na topoizomerázu I bol stanovený pomocou agarózovej gélovej elektroforézy.
Protinádorový účinok bol sledovaný na modeli leukemickej bunkovej línie HL-60. Bunky boli
kultivované v kompletnom médiu RPMI 1640 doplnenom o 10 % fetálne teľacie sérum a antibiotiká
(penicilín 100 U/ml, streptomycín 100 µg/ml, amfotericín 25 µg/ml) v inkubátore s 5 % CO2 pri 37
°C. Viabilita a zmeny v membránovom mitochondriálnom potenciáli boli sledované pomocou
prietokovej cytometrie s vyuţitím fluorescenčných farbív TMRE, FDA a propídium iodidu pri 24
a 48 hod. inkubácii buniek s príslušnými derivátmi.
Výsledky a diskusia: Experimentálne výsledky zo spektroskopických a elektroforetických metód
poukazujú na schopnosť nových derivátov viazať sa do malého ţliabku DNA s väzobnými
konštantami 3,4x104 - 1,6x105 (etyl, butyl, hexyl), taktieţ inhibovať topoizomerázu I uţ pri
koncentrácii 5 µM (hexylový derivát) a 8µM. Biologická účinnosť sledovaných látok bola stanovená
analýzou zmien mitochondriálneho membránového potenciálu, indukciou bunkovej smrti, analýzou
bunkového cyklu a fragmentáciou chromozomálnej DNA v bunkách ľudskej promyelocytovej
leukémie HL-60. Najsilnejší cytotoxický efekt sme zaznamenali po aplikácii hexylového derivátu.
Uţ pri 5 a 15 μM koncentráciách sme pozorovali signifikantný nárast počtu buniek
s depolarizovaným mitochondriálnym potenciálom, významnú indukciu nekrózy a akumuláciu
buniek v G1 fáze bunkového cyklu, zatiaľ čo u samotného takrínu nedochádzalo k ţiadnym zmenám
pri tom istom koncentračnom rozmedzí. Fragmentáciu chromozomálnej DNA sme pozorovali uţ pri
koncentrácii 10 μM po 18 hod. inkubácii buniek s príslušnými derivátmi.
Záver: Vzhľadom na dosiahnuté výsledky môţme konštatovať, ţe novosyntetizované takrínové
deriváty interagujú s DNA a inhibujú topoizomerázu I. V in vitro podmienkach dochádza
k fragmentácii DNA, depolarizácii mitochondriálneho potenciálu a indukcii bunkovej smrti.
Najväčšiu väzobnú afinitu k DNA mal hexylový derivát, ktorý taktieţ vykazoval aj najvyšší
protinádrový účinok.
Štúdia bola uskutočnená za podpory grantov VVCE-0001-07, VEGA 1/0672/11, APVV 0040-10,
SEPO II (ITMS 26220120039) a VVGS 32/10-11.
26
PROTINÁDOROVÁ AKTIVITA LIPOFILNÝCH DERIVÁTOV RUTÍNU
Martina Danihelová, Petra Píšová, Jana Viskupičová, Soňa Jantová, Ernest Šturdík
Ústav biochémie, výţivy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU
Bratislava
Úvod: Incidencia zhubných nádorov ako aj mortalita za posledné roky u slovenského obyvateľstva
zaznamenáva rastúci trend. Práve preto je dôleţité zaoberať sa štúdiom nových potenciálnych
protinádorových látok, ktoré by selektívne zabraňovali rastu rakovinových buniek, pričom normálne
bunky by zostávali nezmenené. Tako perspektívnu skupinu prírodných, nízkotoxických zlúčenín
predstavujú flavonoidy. Experimenty a štúdie preukázali, ţe disponujú viacerými zdraviu
prospešnými vlastnosťami. V poslednej dobe vzrastá záujem o štúdium ich protinádorových efektov.
Viaceré zlúčeniny flavonoidov sa uţ v súčasnosti vyuţívajú vo farmácii, kozmetike a potravinárstve.
Avšak ich vyuţívanie je v mnohých prípadoch limitované nízkou rozpustnosťou a stabilitou
v lipofilnom prostredí. Derivatizáciou pôvodného skeletu flavonoidov lipofilnými molekulami
moţno pripraviť zlúčeniny nielen s vyššou rozpustnosťou a stabilitou v hydrofóbnom prostredí, ale
častokrát aj so zlepšenými biologickými vlastnosťami. Naším zámerom bolo testovanie
protinádorových efektov derivátov rutínu s mastnými kyselinami, a to konkrétne ich antioxidačných
vlastností, schopnosti inhibovať urokinázu a proliferáciu nádorových buniek hrubého čreva CaCo-2.
Materiál a metódy: V práci bolo testovaných 9 derivátov rutínu (s kyselinou kapronovou,
kaprylovou, kaprinovou, laurovou, myristovou, stearovou, olejovou, linolovou a linolénovou), ktoré
boli pripravené enzymatickou esterifikáciou vyuţitím lipázy z Candida antarctica.
Cytotoxitu látok na nádorovú líniu buniek rakoviny hrubého čreva CaCo-2 sme determinovali
pomocou MTT testu.
U pripravených derivátov sme stanovovali tieţ antioxidačnú aktivitu metódou viazania radikálu
DPPH a sledovaním ochrany β-karoténu pred oxidáciou v hydrolyzáte slnečnicového oleja. Bol
determinovaný aj inhibičný účinok pripravených flavonoidov na patofyziologický enzým urokinázu
a to spektrofotometrickou mikroplatničkovou metódou s vyuţitím chromogénneho substrátu.
Výsledky a diskusia: Cytotoxicita bola zisťovaná na rakovinovú bunkovú líniu CaCo-2. Sledovaný
účinok bol najvýraznejší pri koncentrácii látok 500 - 1000 µM, pričom so stúpajúcou koncentráciou
vzrastal ich antiproliferatívny účinok. Najúčinnejšie spomedzi testovaných látok boli rutín a jeho
deriváty s kyselinou kapronovou a kaprylovou, kedy sme dosiahli 100%-ný inhibičný účinok uţ pri
koncentrácii 500 µM a čase pôsobenia 72 h.
Inhibičný účinok na patofyziologický enzým urokinázu, ktorého zvýšená hladina v organizme
uľahčuje inváziu nádorových buniek a tvorbu metastáz, sme vyjadrili v hodnotách IC50. Rutín
prejavil svoju 50%-nú účinnosť pri koncentrácii 6 µM. Testované deriváty rutínu boli menej účinné,
pričom ich IC50 sa pohybovali v rozmedzí 14 aţ 50 µM.
Pre zistenie antioxidačnej aktivity v hydrofilnom prostredí bola zvolená metóda viazania radikálu
DPPH. Rutín v koncentrácii 2 mM preukázal schopnosť viazať 75,8% tohto radikálu, pričom aktivita
jeho derivátov s mastnými kyselinami vykazovala porovnateľné hodnoty. Sledovaním ochrany βkaroténu v hydrolyzáte slnečnicového oleja sme určovali antioxidačnú účinnosť látok v lipofilnom
prostredí. Rutín dokázal ochrániť 61,1% β-karoténu pred oxidáciou. Účinok jeho derivátov bol
porovnateľný.
Záver: Získané výsledky sú podkladom pre testovanie mechanizmov protinádorového pôsobenia
lipofilných derivátov flavonoidov a poukazujú na moţnosť ich vyuţitia ako potenciálnych
protinádorových látok, ktoré svojou zvýšenou lipofilitou môţu lepšie prestupovať bunkovými
membránami.
Táto práca vznikla za podpory Agentúry Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu SR pre štrukturálne fondy EÚ,
operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja realizovaním projektu
„Hodnotenie prírodných látok a ich výber pre prevenciu a liečbu civilizačných ochorení“ (ITMS 26240220040)
a Agentúry na podporu výskumu a vývoja realizovaním projektu APVV-0339-10.
27
NETRADIČNÉ FAREBNÉ PŠENICE, ICH NUTRIČNÁ VARIABILITA
A VYUŢITIE V POTRAVINÁRSTVE
Lenka Duchoňová, Mária Vargovičová, Renáta Kozáková, Ernest Šturdík
Ústav biochémie, výţivy a ochrany zdravia, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie
STU Bratislava
Úvod: O existencii zaujímavých genotypov pšenice s purpurovou, modrou, ţltou a bielou farbou zrna sa
píše v mnohých vedeckých príspevkoch. Nové kultivary vznikli kríţením druhu Triticum aestivum L. s
inými, ktoré majú zvýraznené vlastnosti ako napríklad odolnosť voči škodcom a chorobám, lepší výnos
zrna, vyšší obsah bielkovín, vitamínov a lepku, či vhodnosť zŕn na mletie. Výskumy zaoberajúce sa
sledovaním zloţenia zrna netradične sfarbených genotypov pšenice potvrdili zvýšenú prítomnosť
biologicky aktívnych látok patriacich do skupiny fenolických zlúčenín. Zaradenie obilných potravín s
vyšším obsahom antioxidantov do jedálnička by za predpokladu dlhodobej a pravidelnej konzumácie
mohlo mať priaznivý vplyv na ľudské zdravie. Naším záujmom bolo získať vlastné poznatky o zastúpení
funkčných zloţiek farebných pšeníc s predpokladom, ţe celé zrná sú bohaté na radu komponentov, ako
sú vláknina, škrob, bielkoviny, minerálne látky, flavonoidy a fenolové zlúčeniny, ktoré sú spojené so
zniţovaním rizika mnohých chorôb.
Materiál a metódy: V práci boli pouţité farebné genotypy pšeníc poskytnuté zo Zemědelského
výskumného ústavu Kroměříţ (CZ) a z firmy ISTROPOL Solary, a.s. Horné Mýto (SK).
Stanovenie jednotlivých zloţiek v zrne farebnej pšenice bolo merané podľa normy ISO 712 (vlhkosť),
STN 560116 (popol, bielkoviny), STN 461011-37 (celkový škrob), analytická súprava z firmy
Megazyme (β-D-glukány), spektrofotometricky podľa Singleton et al.(fenoly), spektrofotometricky
podľa Lamaison et al. (flavonoidy), metóda DPPH (antioxidačná aktivita).
Senzorické hodnotenie upečených chlebov bolo posudzované 5-timi hodnotiteľmi pomocou 5-bodovej
hedonickej stupnice.
Výsledky a diskusia: Mnoţstvo bielkovín sa pohybovalo od 9,02 do 14%. Najvyššiu hodnotu mala
odroda BONA DEA (14%) ale aj modrá odroda UC 66049 (13,02%); najmenej bolo v červenom zrne
FEDERER (9,02%) a v ţltej odrode CITRUS (9,90%). Všeobecne moţno povedať, ţe najvyšší obsah
bielkovín obsahujú purpurové odrody pšeníc. Na základe enzymatického stanovenia β-glukánov sa v
našich vzorkách zistilo, ţe priemerný obsah tejto zloţky v analyzovanom súbore pšeníc sa pohybuje v
rozmedzí od 0,25% (BONA VITA) do 0,67% (ABISSINSKAJA a LUTEUS). Hodnoty hrubej vlákniny
sa pohybovali v rozpätí 2,40 aţ 3,20%, pričom najviac vlákniny obsahovala vzorka BONA DEA (3,20%)
a najmenej LUTEUS (2,40%).
Antioxidačná aktivita extraktov z obilnín je pripisovaná hlavne prítomným polyfenolickým zlúčeninám,
ktorých koncentrácia a štrukturálne zastúpenie je v jednotlivých obilninách rozdielne. Najviac fenolových
látok (134 mg GAE/l) a flavonoidov (2,80 mg RE/l ) obsahovala vzorka RU440-6, najmenej vzorka IS
CORVINUS (87 mg GAE/l). Najvyššiu antioxidačnú aktivitu sme zaznamenali v modrej odrode pšenice
48M (0,269 mmol TE/l), najniţšia bola stanovená v purpurovej vzorke ANK 28A (0,083 mmol TE/l).
Cieľom finálnej časti práce bolo zistiť vhodnosť vybraných vzoriek pre chlebopekárske vyuţitie a
pozorovať medziodrodové rozdiely vo vzťahu ku kvalite chleba. Farebná rôznorodosť zrna (modrá pri
RU440-6 a červená pri KONINI) bola viditeľná aj pri finálnych výrobkoch. Celkovo najpríjemnejšiu
chuť, pruţnosť a farbu striedky mal bochník chleba pripravený z odrody KONINI bez pridania βglukánov.
Záver: Získané výsledky sú podkladom pre výber najvhodnejších genotypov pšeníc významných
z hľadiska ľudskej výţivy a zavedenie pouţívania farebných múk v slovenskom pekárenskom priemysle.
Táto práca vznikla za podpory Agentúry Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu SR pre štrukturálne
fondy EÚ, operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja
realizovaním projektu „Hodnotenie prírodných látok a ich výber pre prevenciu a liečbu civilizačných
ochorení“ (ITMS 26240220040) a APVV VMSP-II-0024-09
28
29
Sekcia III.: Molekulárna, celulárna biológia a mikrobiológia
30
Štúdium vplyvu Hsp70 na preţívanie a chemosenzitivitu leukemických buniek.
Katarína Kliková1, Andrea Štefaniková1, Jana Jurečeková1, Jozef Hatok1, Peter Račay1
1
Ústav lekárskej biochémie, JLF UK, Martin
Úvod: Akútna myeloblastová leukémia (AML) patrí do heterogénnej skupiny zhubných nádorových
ochorení, ktoré sú charakteristické poruchami v procesoch diferenciácie a apoptózy, čím dochádza
ku nekontrolovateľnej proliferácii hematopoetických buniek a myeloidných prekurzorov. Jedným
z faktorov, ktorý ovplyvňuje preţívanie malígnych buniek je zvýšená expresia antiapoptických
bielkovín, kam patrí aj bielkovina bunkového stresu - Hsp70. Tomuto proteínu sa pripisujú
cytoprotektívne účinky, je významným negatívnym regulátorom vnútornej mitochondriálnej dráhy,
pretoţe v malígnych bunkách môţe blokovať apoptózu na rôznych úrovniach. Nadexpresia tohto
proteínu participuje na onkogenéze, je zodpovedný za zníţenú citlivosť malígnych buniek na
cytostatiká, za zvýšenú proliferáciu a tvorbu metastáz, čím limituje účinnosť liečby. Pri liečbe
akútnych myeloblastových leukémií existuje niekoľko stratégií, napr. vyuţitie tepelného šoku buď
samostatne, alebo v kombinácii s podávanými cytostatikami, príp. neutralizácia Hsp proteínov
prostredníctvom inhibítorov (napr. inhibítor Hsp70 pifitrín µ).
Cieľom predloţenej práce bolo štúdium vplyvu Hsp70 na preţívane a citlivosť leukemických buniek
HL60 na cytostatiká.
Materiál a metódy: V experimentoch sme pouţívali leukemickú bunkovú líniu HL-60 (AML-M3).
Bunky s optimálnou hustotou 0,5x106 b/ml (37°C, 5% CO2) boli kultivované v kultivačnom médiu
IMDM s obsahom 20% FBS, 1% PNC/STR a 1% GENT. Neopracované bunky a bunky vystavené
tepelnému šoku (42°C, 2 hod.) boli kultivované s rôznymi koncentráciami vybraných cytostatík.
Pifitrín µ (PFTμ, Sigma-Aldrich) pôsobil na bunky samostatne, ale aj v kombinácii s cytostatikami.
Preţívanie a citlivosť leukemických buniek na cytostatiká sme sledovali pomocou MTT testu.
Expresiu bielkoviny Hsp70 po tepelnom šoku (42°C, 2 hod.) sme stanovili metódou Westernblotovej analýzy pouţitím špecifických protilátok proti Hsp70 (1:200, C92F3A-5: sc-66048, Santa
Cruz) a proti β-aktínu (1:2000, C-4: sc-47778, Santa Cruz).
Výsledky a diskusia: Vystavenie buniek tepelnému šoku (42°C, 2 hod.) viedlo ku zvýšenej hladine
Hsp70 uţ po 24 hod. Tepelný šok však neviedol k významným zmenám tak v preţívaní, ako aj
citlivosti buniek na podávané cytostatiká. Podobne tepelný šok neovplyvnil citlivosť HL60 buniek
voči látkam indukujúcim mitochondriálnu apoptózu, ABT-737 a butyrát sodný. PFTµ, inhibítor
HSP70, nebol schopný indukovať inhibíciu bunkového rastu ani smrť buniek. Jeho kombinácia s
cytostatikami neviedla k významnej zmene citlivosti buniek na podávané cytostatiká.
Záver: Hoci antiapoptotický účinok Hsp70 je v literatúre jasne dokumentovaný, naše výsledky
ukázali, ţe tak zvýšenie expresie HSP70 po tepelnom šoku, ako aj inhibícia Hsp70 pifitrínom µ
neviedlo k významným zmenám v preţívaní a citlivosti buniek HL60 na cytostatiká. Naše výsledky
naznačujú, ţe antiapototický vplyv Hsp70 závisí od typu buniek.
Táto práca bola podporená projektom: „Identifikácia nových markerov v diagnostickom paneli
neurologických ochorení“ spolufinancovaného zo zdrojov EÚ a Európskeho fondu regionálneho
rozvoja.
31
LENALIDOMID V LIEČBE MYELODYSPLASTICKÉHO SYNDRÓMU
L. Messingerová1, A. Jonášová 2 , L. Gibalová1, M. Barančík3, M. Šereš1, Z. Sulová1, A. Breier1
1
Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky SAV, Bratislava, 2 Hematologická ambulancia, I. Interná
klinika, Všeobecná fakultná nemocnica Univerzita Karlova, Praha, 3 Ústav pre výskum srdca SAV,
Bratislava
Úvod: Myelodysplastický syndróm (MDS) je klonálna porucha charakterizovaná inefektívnou
hematopoézou, ktorá môţe viesť na jednej strane k fatálnym cytopéniám a na druhej strane k rozvoju
akútnej myeloidnej leukémie. MDS je v súčasnej dobe povaţovaný za hematologickú malignitu
vychádzajúcu z pluripotentnej kmeňovej bunky. Heterogenita MDS spôsobuje, ţe priebeh tohto
ochorenia sa u jednotlivých pacientov značne odlišuje. Z tohto dôvodu je ochorenie členené podľa
staršej FAB (Francúzsko-Americko-Britská klasifikácia) a podľa novšej WHO (World Health
Organization) klasifikácie do jednotlivých podskupín. V našom laboratóriu sa zaoberáme
podskupinou pacientov s deléciou dlhého ramienka chromozómu 5 (5q- syndrómom). Tento
syndróm bol prvý krát popísaný v roku 1974 Van den Bergom, patrí medzi najčastejšie
chromozomálne abnormality a pacienti s týmto syndrómom majú dobrú prognózu. Medzi novšie
prístupy v liečbe tohto ochorenia patrí aj lenalidomid, ktorý patrí medzi IMIDs (imunomodulačné
liečivo) s antineoplastickými a antiangiogénnymi účinkami. Má podobné biologické účinky ako
talidomid ale menej neţiadúcich účinkov. Imunomodulačné účinky tohto lieku sú aţ 1000x silnejšie
ako účinky talidomidu. Činnosť protinádorovej chemoterapie je však často výrazným spôsobom
obmedzená vznikom rezistencie. Môţe sa jednať o primárnu necitlivosť nádorových buniek
k cytostatiku, avšak častejší je typ rezistencie, ktorý vzniká aţ v priebehu cytostatickej liečby, kedy
sa pôvodne citlivá nádorová populácia stáva rezistentnou a účinnosť cytostatickej liečby sa zniţuje.
Multidrug rezistencia (MDR) je spôsobená zvýšenou expresiou minimálne dvoch génov a to MDR 1,
ktorý kóduje transmembránový proteín P-glykoproteín (P-gp) a MRP1, ktorý kóduje “multidrug
associated protein” (MRP). Enzýmy, ktoré majú významnú rolu v proliferácii a angiogénnych
procesoch, sú matrixové metaloproteinázy (MMP). Zmeny v hladinách a aktivitách týchto enzýmov
korelujú so zmenou citlivosti nádorových buniek na chemoterapiu a so vznikom multidrug
rezistencie. MOLM bunková línia reprezuntuje model akútnej myeloidnej leukémie odvodenej od
myelodysplasplastického syndrómu. Pouţili sme túto bunkovú líniu na porovnanie efektu
lenalidomidu a beţne pouţívaných cytostatík vinkristínu a mitoxantrónu.
Materiál a metódy: Cieľom našej štúdie bolo sledovať efekt terapie lenalidomidom u pacientov s
MDS na expresiu P-pg, MRP a sledovanie hladín a aktivít LDH (laktát dehydrogenáza) a MMP.
Vzorky periférnej krvi a kostnej drene od pacientov s MDS 5q- liečených lenalidomidom boli
spracované separáciou leukocytov na Ficolle a expresie P-gp a MRP boli stanovené pomocou RTPCR. Aktivita MMP bola stanovovaná vo vzorkách plazmy pomocou zymografie. Hladiny MMP
proteínov boli sledované pomocou Western blotu. Aktivita LDH bola stanovená ako NADH oxidácia
spektrofotometricky podľa štandardného protokolu.
Výsledky a záver: Zistili sme, ţe liečba MDS pacientov lenalidomidom neindukovala zvýšenú
expresiu P-gp a MRP mRNA. Na druhej strane liečba lenalidomidom vyvolala signifikantnú
redukciu MMP aktivít v plazme. Predlţovanie terapie s lenalidomidom vyvolalo signifikantnejšiu
redukciu MMP a LDH aktivít rovnako ako redukciu hladín proteínov MMP v plazme pacientov.
Doterajšie výsledky naznačujú, ţe liečba lenalidomidom u pacientov s myelodysplastickým
syndrómom 5q- nespôsobuje zmeny v expresii P-gp a MRP. Taktieţ sa zdá, ţe zmeny v hladinách a
aktivitách MMP sa môţu podieľať na efektívnosti liečby lenalidomidom pri pacientoch s MDS.
Táto práca bola podporená : Celgene, APVV-0084-07, VEGA (2/0123/10 and 2/0155/09).
32
VZÁJOMNÁ INHIBÍCIA SIGNÁLNYCH DRÁH PI3K/AKT A MEK/ERK SPÔSOBUJE
SMRŤ BUNIEK HL-60
Andrea Štefaniková, Jana Jurečeková, Katarína Kliková, Jozef Hatok, Peter Račay
Ústav lekárskej biochémie JLF UK v Martine
Úvod: Jednou zo základných čŕt nádorových buniek je ich schopnosť rásť a preţívať spôsobom,
ktorý porušuje normálnu homeostázu bunkového prostredia. Akútna myeloidná leukémia (AML) je
ochorenie, ktoré pramení z kombinácie mutácií a abnormalít, ktoré vedú k porušenej aktivácii
viacerých signálnych dráh. Signálne dráhy, ktorých signalizácia ovplyvňuje proliferáciu, rast a
odolnosť voči apoptóze označujeme ako signálne dráhy preţívania. Raf/MEK/ERK a PI3K/Akt
signálne dráhy sú hlavnými signálnymi dráhami zodpovednými za reguláciu bunkovej proliferácie a
preţívania. Obe dráhy sú pri AML konštitutívne aktivované. Zvýšená aktivácia týchto dráh je tieţ
spájaná s rezistenciou leukemických buniek na chemoterapiu.
Materiál a metódy: Pouţité boli bunky bunkovej línie HL-60, kultivované v kultivačnom médiu
IMDM s 20% FBS pri 37°C a 5% CO2 atmosfére. Kultivačné médium bolo menené kaţdý 3. deň a
bunky boli kultivované pri optimálnej hustote 0,5x106 buniek na ml. Pre potreby experimentu bola
časť buniek HL-60 kultivovaná 72 hod. na 96 jamkovej platni so stúpajúcou koncentráciou inhibítora
PD98059 a/alebo Akti-1/2. Pouţité inhibítory: PD98059 (inhibícia MEK, Sigma-Aldrich), Akti-1/2
(inhibícia Akt, Sigma-Aldrich). Preţívanie buniek bolo hodnotené spektrofotometricky meraním
absorbanie formazanu, ktorý vzniká oxidáciou MTT pridaného do jamiek k bunkám. Percento
preţívajúcich buniek je vypočítané pre kaţdú pouţitú koncentráciu inhibítora.
Výsledky a diskusia: Naše experimenty ukázali, ţe bunky HL-60 sú citlivé na obidva pouţité
inhibítory (Akti-1/2 a PD98059). Inhibícia zameraná na jednu z kináz Akt alebo MEK však nebola
tak účinná ako inhibícia obidvoch kináz súčasne. Samostatná inhibícia viedla skôr k zastaveniu
proliferácie ako k indukcii bunkovej smrti. Súčasná inhibícia obidvoch dráh spôsobila bunkovú smrť
uţ pri najniţších pouţitých koncentráciách. Rovnako aj pouţitie inhibítora antiapoptotických
bielkovín Bcl-2 rodiny, ABT-737, zosilňovalo efekt obidvoch pouţitých inhibítorov PD98059 a
Akti-1/2.
Záver: Inhibítory PD98059 a Akti-1/2, pouţité samostatne, neindukovali vo výraznej miere bunkovú
smrť buniek HL-60. Ich kombinácia však viedla k signifikantnej indukcii bunkovej smrti. Pouţitie
inhibítora antiapoptotických bielkovín Bcl-2 rodiny, ABT-737, zosilňovalo efekt inhibítora PD98059
aj Akti-1/2. Presný mechanizmus pôsobenia týchto inhibítorov je však nutné ďalej preskúmať.
Táto práca bola podporená projektom: „Podpora rozvoja ľudských zdrojov s vyuţitím
najmodernejších postupov a foriem vzdelávania na JLF UK v Martine“ spolufinancovaného zo
zdrojov EÚ a Európskeho sociálneho fondu a projektom „Centrum excelentnosti pre výskum v
personalizovanej terapii (CEVYPET)“.
33
ŠTÚDIUM VPLYVU MULTIDRUG REZISTENCIE A APOPTÓZY NA ROZVOJ
VYBRANÝCH NÁDOROVÝCH CHORÔB
Jozef Hatok1, Jana Jurečeková1, Andrea Štefaniková1, Lenka Bartošová2, Daniela Kotuličová2,
Anton Dzian3, Edward Huľo3, Peter Račay1
1
Ústav lekárskej biochémie JLF UK, 2Klinika hematológie a transfúziológie JLF UK a UNM,
3
Chirurgická klinika JLF UK a UNM - Martin
Úvod: Účinnosť chemoterapie pri hematologických malignitách a solídnych tumoroch je výrazne
ovplyvnená rôznymi faktormi, ktoré zohrávajú významnú úlohu v liečebnej stratégii
a spolurozhodujú o výsledku liečby. Medzi najvýznamnejšie limitujúce faktory patrí predovšetkým
nízka citlivosť malígnych buniek na chemoterapiu, čo je podmienené profilom expresie určitých
génov. Na jednej strane hovoríme o ATP transportných bielkovinách (ABC), najznámejšie z nich: Pglykoproteín (MDR-1), multidrug rezistentný proteín (MRP) a „breast cancer“ rezistentný proteín
(BCRP). Na druhej strane je pre úspešnosť terapie dôleţitá aj samotná apoptóza. Úroveň expresie
ochranných antiapoptotických (napr. bielkovín Bcl2 rodiny) a efektorových tumor-supresorových a
proapoptotických bielkovín (napr. p53 a Bax) predstavuje jeden zo základných molekulových
faktorov podmieňujúcich citlivosť malígnych buniek na cytostatiká. Cieľom našich experimentov
bolo na základe in vitro metyl tetrazoliového (MTT) testu určiť profil chemorezistencie, a tým
pomôcť pri výbere najúčinnejšieho cytostatika. Ďalej sme sledovali expresie mRNA ABC a
apoptotických bielkovín pri rozdielnych typoch buniek.
Materiál a metódy: Do tohto súboru bolo zaradených 60 vzoriek od pacientov s hematologickou
malignitou (AML, ALL a CML) vo veku od 22 do 83 rokov, u ktorých sa testovala chemorezistencia
MTT testom. Expresiu mRNA študovaných bielkovín sme zisťovali na 26 vzorkách od pacientov s
akútnou leukémiou (AL) a 42 vzorkách od pacientov so solídnymi tumormi (ST). Navyše sme
vyšetrovali aj skupinu darcov (n=16; 30 rokov), ako aj detských leukemických pacientov (n=22; 12
rokov). Ako metódy sme pouţili spomínaný MTT test, reverzno-transkripčnú PCR techniku,
imunochemické farbenie značených mononukleárnych buniek „Dynabeadsami“ a štatistickú analýzu
pomocou programu MedCalc 8.1., resp. Origin – verzia 7.0.
Výsledky a diskusia: Zistili sme, ţe rezistencia voči prednizolónu, dexametazónu, etopozidu
a vinkristínu bola signifikantne zvýšená u pacientov s AML v porovnaní s ALL pacientmi. Normálne
bunky ovplyvňovali štatisticky významne výsledok chemorezistencie (p< 0,01). Pomocou RT-PCR
sme v 55,3% zistili u AL vzoriek (n= 26) zvýšenú expresiu všetkých ATP transportérov. V skupine
leukemických vzoriek sme navyše stanovili štatisticky významné rozdiely expresie mRNA
apoptotických bielkovín oproti leukocytom od zdravých darcov (p< 0,001 aţ 0,0001). Medzi
hladinami mRNA ST vzoriek sme nezistili ţiadne významnosti. Zaujímavosťou bolo určenie
korelácie medzi p53 a Bax, kde sme dokázali signifikantne pozitívnu koreláciu pri obidvoch
skupinách pacientov (p< 0,0001; resp. p= 0,0014). Pri stanovení pomeru Bcl-2/Bax mRNA sme
zistili najvyššiu hodnotu u ST, oproti AL a normálnymi leukocytmi. Navyše sme zistili vplyv p53
a Bax mRNA na výsledok testovania chemorezistencie u väčšiny sledovaných cytostatík.
Záver: Zohľadnenie výsledkov prediktívnych in vitro testov chemorezistencie a sledovanie hladín
ABC by mohlo viesť k zlepšeniu terapie pacienta. Zvýšené hladiny mRNA apoptotických bielkovín
v onkologických vzorkách poukazujú na moţné zmeny v integrite genómovej DNA. Dokázali sme,
ţe Bax gén je regulovaný prostredníctvom p53 bielkoviny. K iniciácii apoptózy prostredníctvom
aktivácie Bax však nedochádza aj kvôli vysokým hladinám Bcl-2 a Bcl-XL. Antiapoptotické
bielkoviny tak zohrávajú dôleţitú úlohu pri zabránení rozvoja apoptózy a tým k preţívaniu
malígnych buniek.
Táto práca bola podporená projektom "Identifikácia nových markerov v diagnostickom paneli
neurologických ochorení" spolufinancovaným zo zdrojov ES a Európskeho fondu regionálneho
rozvoja.
34
ÚLOHA GDF-15 VO FOTODYNAMICKEJ TERAPII S HYPERICÍNOM
Jaromír Mikeš, Rastislav Jendţelovský, Ján Kovaľ, Lucia Mikešová, Zuzana Papčová, Barbora
Valeková, Otto Dóč, Peter Fedoročko
Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta, Univerzita P.J. Šafárika
v Košiciach, Moyzesova 11, 040 01 Košice
Úvod: Proteín GDF-15, známy aj ako MIC-1, NAG-1, PDF a pod., je radený do skupiny cytokínov
z rodiny TGF-β. Zvýšené hladiny boli za fyziologických podmienok pozorované napríklad
v placente, prostate alebo v koţi. Avšak dokázané sú aj jeho asociácie s nádorovými ochoreniami
a obzvlášť so zvýšenou metastatickou schopnosťou prostatických, kolorektálnych a prsníkových
nádorov. Naopak akumulácia GDF-15 v nádorových bunkách sa dáva do súvisu s COX-2 nezávislým
chemopreventívnym účinkom nesteroidných antiglogistík (tzv. NSAIDs) alebo protinádorovými
účinkami niektorých prírodných látok ako napr. genisteínu, vitamínu D alebo retinolu. Niektorí
autori dokonca poukázali na pozitívnu koreláciu medzi hladinou GDF-15 a programovanou
bunkovou smrťou. Avšak presná funkcia tohto proteínu a jeho úloha v karcinogenéze je stále nejasná
a niekedy dokonca rozporuplná.
Aj keď súčasťou fotodynamickej terapie (PDT) je podávanie chemickej látky označovanej ako
fotosenzibilizátor, principiálne sa líši od klasickej chemoterapie, pretoţe jeho nedielnou súčasťou je
aj aktivácia svetlom. Výsledný efekt na úrovni nádorovej bunky alebo tkaniva je preto závislý od
mnoţstva faktorov. Naše predchádzajúce experimenty poukázali na moţnosť zvýšenia efektivity
PDT s hypericínom pomocou pred-inkubácie buniek s NSAIDs a to aj nezávisle od inhibície COX-2.
Preto snaha vysvetliť molekulárne mechanizmy tejto kombinovanej terapie nás viedli k štúdiu
hladiny GDF-15. Uţ úvodné štúdie dokázali, ţe samotná PDT s hypericínom vyvoláva silnú
akumuláciu tohto proteínu v rôznych nádorových bunkových líniách, čím nastolili otázku jeho
funkcie v mechanizme účinku PDT.
Materiál a metódy: Hladina sekretovaného proteínu bola stanovená pomocou ELISA testu.
Intracelulárnu akumuláciu sme stanovili pomocou Western blottingu a zmeny v hladine mRNA
pomocou RT-PCR metódy. Úlohu samotného proteínu sme analyzovali po RNA silencingu
a následnom stanovení zmien v incidencii bunkovej smrti prietokovou cytometriou simultánnym
stanovením externalizácie fosfatidylserínu, aktivácie kaspázy 3 a depolarizácie mitochondriálneho
potenciálu ako aj stanovením viability a metabolickej aktivity buniek.
Výsledky a diskusia: Pomocou Western blottingu sme dokázali, ţe PDT vyvoláva v priebehu
prvých 24-roch hodín nahromadenie proteínu GDF-15 vo viacerých bunkových líniách. Táto
akumulácia koreluje aj so štiepením proteínu PARP, ako typického znaku programovanej bunkovej
smrti a nahromadením ATF-3, jedného z transkripčných faktorov génu gdf-15. Tento nárast
intracelulárnej hladiny je sprevádzaný naopak poklesom jeho sekretovanej formy v okolitom médiu
a počiatočným nárastom hladiny mRNA, ktorá však neskôr klesá pod hladinu neovplyvnenej
kontroly. RNA silencing nevyvolal významnejšie zmeny v citlivosti nádorových buniek na PDT.
Záver: Z výsledkov doterajších experimentov moţno predpokladať, ţe v prípade fotodynamickej
terapie s hypericínom je akumulácia cytokínu GDF-15 v bunke dôsledkom poškodenej sekrečného
mechanizmu nádorovej bunky ako aj dôsledkom počiatočného zvýšenia hladiny mRNA gdf-15.
Korelácia medzi jeho akumuláciou a typickými prejavmi programovanej bunkovej smrti, ako aj
skutočnosť, ţe RNA silencing nevyvolal významnejšie zmeny v citlivosti buniek na PDT, naznačujú,
ţe akumulácia GDF-15 v bunkách je len dôsledkom poškodenia buniek vyvolaného účinkom PDT
a následnou iniciáciou programovanej bunkovej smrti. Avšak GDF-15 je cytokín a jeho funkcia je
striedavo spájaná s pro-apoptotickým ako aj anti-apoptotickým účinkom, preto v ďalších
experimentoch sa budeme zaoberať úlohou aj jeho sekretovanej formy.
Poďakovanie: Práca bola finančne podporená grantovými projektmi: APVV-0040-10, APVV-0321-07, LPP-0062-09,
VVCE-0001-07, VEGA 1/0475/10, VEGA 1/0626/11 a SEPO II (ITMS 26220120039).
35
ČASOVO ZÁVISLÉ ZMENY EXPRESIE CAV1.2 VÁPNIKOVÉHO KANÁLA POČAS
DIFERENCIÁCIE PC12 BUNIEK
Lichvárová, L., Lacinová Ľ.
Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky, Slovenskej akadémie vied, Bratislava
Úvod: Na štúdium napäťovo závislých vápnikových kanálov a chemických procesov spojených so
syntézou, akumuláciou a uvoľnovaním neurotransmiterov, neurochemické štúdie a výskum
selektívnej expresie génov pre iónové kanály je dlhé roky pouţívaná línia PC12 buniek
z neuroendokrinného nádora nadobličky [1]. V týchto bunkách boli nájdené viaceré podtypy L-typu
vápnikových kanálov a neuronálnych vápnikových kanálov [2,3]. My sme sledovali zmeny expresie
Cav1.2 vápnikového kanála, ktorý patrí medzi kanály L-typu, počas neuronálnej diferenciácie PC12
buniek. Diferenciáciu sme vyvolali pôsobením neuronálneho rastového faktora NGF ako
transkripčného faktora, ktorý spúšťa Ras/MAP kinázovú dráhu a zosilňuje expresiu na úrovni
transkripcie. Vyhodnotili sme morfologické zmeny buniek a zmeny expresie Cav1.2 kanála na úrovni
mRNA a na úrovni funkčného proteínu.
Materiál a metódy: Experimentálnym objektom bola bunková línia PC12 buniek zakúpená z DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH). Diferenciáciu buniek sme
dosiahli pridaním 50 ng/ml NGF (Rat recombinant NGF, Sigma). Bunky sme kultivovali v DME
médiu 1-18 dní. Ako kontrola nám slúţili bunky, ktoré rástli bez prítomnosti NGF. Expresia génu
CACNA1C a housekeepera GAPDH bola stanovená metódou RT-PCR. Na elektrofyziologické
experimenty sme pouţili metódu patch clamp v konfigurácii „z celej bunky“.
Výsledky a diskusia: V našej práci sme sledovali zmeny vlastností PC12 buniek počas diferenciácie
na bunky podobné neurónom, vyvolanej pôsobením NGF. NGF zastavil delenie buniek a podnietil
ich diferenciáciu na bunky podobné neurónom. Morfologické zmeny v tvare buniek boli viditeľné uţ
na štvrtý deň kultivácie s NGF. Neuronálna diferenciácia bola spojená so signifikantným nárastom
veľkosti buniek, ktorý sme merali prostredníctvom kapacity bunky. Kapacita bunky je priamo
úmerná ploche membrány. Súčasne sa zvyšoval prepis génu CACNA1C, ktorý kóduje hlavnú
podjednotku Cav1.2 vápnikového kanála, meraný PCR metódou. Expresiu funkčného proteínu, sme
určovali meraním vápnikového prúdu. Celkový vápnikový prúd v PC12 bunkách tečie cez viacero
typov vápnikových kanálov. Podiel prúdu cez L-typ vápnikových kanálov sme určili jeho
zablokovaním 10 µM nimodopínom. Veľkosť nimodipín-senzitívneho prúdu sa zvyšovala s dĺţkou
pôsobenia NGF aţ napokon saturovala. Časový priebeh všetkých troch procesov, teda zmeny
veľkosti buniek, rastu transkripcie CACNA1C génu a rastu amplitúdy prúdu cez L-typ vápnikových
kanálov bol rovnaký. Nárast začal na štvrtý deň a saturoval na deviaty a desiaty deň.
Záver: Opísaním časovej závislosti pôsobenia NGF na morfológiu PC12 buniek, zmeny v expresii
CACNA1C génu a expresie funkčných vápnikových kanálov L-typu sme definovali experimentálny
model pre štúdium vplyvu Cav1.2 na neurogenézu.
[1] Greene, L. A., Tischler, A. S. (1976) Proc. Natl. Acad. Science USA, 73, p. 2424.
[2] Klugbauer, N., Marais, E., Hofmann, F. (2003) J. Bioenerg. Biomembr. 35, p 639.
[3] Castillo, C. et al. (2001) Brain Res. 24, 911 (2), p. 181
Táto práca bola podporená Agentúrou pre vedu a výskum kontraktom APVV-0212-10.
36
MÔŢE KRÁTKODOBÉ PODÁVANIE OMEGA-3 MASTNÝCH KYSELÍN REDUKOVAŤ
POŠKODENIE AORTY VYVOLANÉ ZÁPALOVÝM PROCESOM?
Karel Frimmel1, Ruţena Sotníková2, Jana Navarová2, Iveta Bernátová3, Jana Vlkovičová1,
Miroslav Ovečka4, Peter Weismann5, Ľudmila Okruhlicová1
1
Ústav pre výskum srdca, 2Ústav experimentálnej farmakológie a toxikológie, 3Ústav normálnej a
patologickej fyziológie, 4Botanický ústav, SAV, 5Lekárska fakulta UK, Bratislava
Úvod: Zápalový proces je súčasťou aterosklerózy vo všetkých fázach jej vývinu. Mnohé štúdie
dokazujú, ţe dlhodobé uţívanie omega-3 mastných kyselín (MK), známych svojimi
širokospektrálnymi kardioprotektívnymi účinkami, môţe zníţiť závaţnosť ochorenia. Cieľom našej
práce bolo sledovať, či krátkodobá diéta obohatená o MK môţe redukovať niektoré predpokladané
účinky experimentálneho zápalu.
Materiál a metódy: Zápal sme vyvolali jednorazovou dávkou lipopolysacharidu (LPS, 1 mg/kg,
i.p.). MK sme podávali denne v dávke 30 mg/kg po dobu 10 dní. Dospelé potkany línie Wistar sme
rozdelili na 4 skupiny: kontrola (C), C+MK, LPS, LPS+MK. V aorte sme sledovali relaxáciu závislú
od endotelu a aktivitu celkovej NO syntázy (NOS). Konfokálnou mikroskopiou, morfometrickou
analýzou obrazu a Western blot analýzou sme v stene aorty detekovali distribúciu a expresiu
konexínu-40 (Cx40), proteínu medzibunkových komunikačných spojení, ktoré modulujú vaskulárny
tonus. Na subcelulárnu analýzu endotelových buniek sme pouţili transmisnú elektrónovú
mikroskopiu. V plazme sme stanovovali aktivitu N-acetyl-b-D-glukozaminidázy (NAGA) a hladiny
C-reaktívneho proteínu (CRP) a malonaldehydu (MDA) ako biomarkerov poškodenia buniek, zápalu
a oxidačného stresu.
Výsledky a diskusia: Zistili sme, ţe 10-dňový zápal signifikantne stimuloval aktivitu NAGA
(p<0,05) a zvyšoval hladiny MDA a CRP (p<0,001) v plazme v porovnaní s kontrolnou skupinou.
Aplikácia LPS vyvolala poruchy v relaxácii aorty závislej od endotelu a zvýšila aktivitu celkovej
NOS v tkanive aorty o 54% v porovnaní s kontrolou. Zápal zvýšil expresiu Cx40 v endoteli aorty o
13%, kým v tunica medii aorty nebol vplyv LPS na Cx40 expresiu signifikantný.
Elektrónmikroskopickou analýzou sme pozorovali zvýšenú adhéziu leukocytov na endotel a lokálne
subcelulárne poškodenie endotelu, ktoré môţe prispievať k poruchám homeostázy tkaniva.
Krátkodobá diéta obohatená o MK podávaná počas zápalu redukovala hladiny MDA o 31% a CRP o
52%, kým na aktivitu NAGA nemala signifikantný účinok. MK nemali výrazný protektívny účinok
na poškodenú relaxáciu aorty závislej od endotelu. Napriek známemu protektívnemu účinku MK na
aktivitu NOS, nezaznamenali sme po diéte s MK počas zápalu redukciu aktivity enzýmu, ale naopak,
dvojnásobné zvýšenie oproti skupine LPS. Po aplikácii MK sme nepozorovali výraznu redukciu
lokálnych zápalom vyvolaných subcelulárnych zmien v integrite štruktúry endotelovej monovrstvy.
Na druhej strane, MK zmiernili účinky LPS na expresiu Cx40 v endoteli a tunica medii aorty o 45%.
Záver: Výsledky naznačujú, ţe krátkodobá diéta obohatená o omega-3 mastné kyseliny čiastočne
redukovala zápalovým procesom vyvolané poškodenie aorty. Výsledky zdôrazňujú terapeutický
potenciál konexínových kanálov pri ochorení vaskulárneho systému.
Podporené projektom VEGA 2/0108/10.
37
VPLYV KOTVENÝCH MOLEKULOVÝCH FORIEM CHOLÍNESTERÁZ NA VYBRANÉ
FYZIOLOGICKÉ PARAMETRE V SRDCI
Matej Kučera, Marek Máťúš, Anna Hrabovská
Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta Univerzity Komenského, Bratislava.
Úvod: Acetylcholínesteráza (AChE) a butyrylcholínesteráza (BChE) sa v ţivočíchoch nachádzaju
v rôznych molekulových formách. Kotvené heterooligomérne formy cholínesteráz tvoria funkčné
jednotky na cholinergných synapsách stavovcov. Doteraz sú známe dve kotvy cholínesteráz: kolagén
Q (ColQ), ktorý ukotvuje tri tetraméry na bazálnu laminu a na prolín bohatá membránová kotva
(z angličtiny Proline-Rich-Membrane Anchor; PRiMA) ktorá je transmembránový proteín,
ktorý ukotvuje jeden tetramér. Srdcové tkanivo obsahuje obidve cholínesterázy, pričom aktivita
BChE je vyššia ako aktivita AChE. Rovnako sú v srdci prítomné kotviace proteíny PRiMA a ColQ,
zatiaľ čo hladina mRNA ColQ je spomedzi všetkých orgánov najvyššia práve v tomto tkanive. Do
dnešného dňa nebola popísaná úloha rozličných molekulových foriem cholínesteráz vo fyziológii
srdca. Cieľom tohto projektu bolo štúdium účasti molekulových foriem cholínesteráz kotvených
ColQ a PRiMA vo funkcii srdca.
Materiál a metódy: V tomto projekte sme pouţili mutantné myši - ColQ (ColQ -/-) a PRiMA
(PRiMA -/-) deficientné kmene, ktorým chýbal príslušný kotviaci proteín. Wildtype myši slúţili ako
kontrola. Zvieratá sme uviedli do anestézy tribromoetanolom a po stabilizácii sme stanovovali
štandardné trojzvodové EKG. Ďalej sme implantovali tenký polyetylénový katéter do pravej Arteria
carotis, za účelom zmerania hemodynamických parametrov (ako je srdcová frekvencia a systolický
a diastolický tlak krvi).
Výsledky a diskusia: Oba mutantné kmene myší mali skrátené trvanie srdcového cyklu oproti
wildtype zvieratám a tým pádom aj vyššiu srdcovú frekvenciu. PQ interval a QRS komplex
nevykazovali ţiadne rozdiely medzi jednotlivými genotypmi, ale QT interval bol skrátený u ColQ -/aj PRiMA -/- myší v porovnaní s kontrolami. V priebehu všetkých experimentov sme nezaznamenali
u ani jedného kmeňa ţiadne spontánne dysrytmie. Čo sa hemodynamických parametrov týka,
chýbanie ColQ a PRiMA kotviacich proteínov viedlo k vyššiemu systolickému a diastolickému tlaku
krvi. Podobne aj srdcová frekvencia meraná v pravej Arteria carotis bola vyššia u ColQ -/- a PRiMA
-/- myší ako u wildtype zvierat. Zvýšený systolický aj diastolický tlak by mohol byť dôsledkom
vyššej srdcovej frekvencie. Nevieme však s určitosťou zatiaľ povedať, aký mechanizmus vyvolal
u mutantných zvierat spomínané zmeny a povaţujeme za nevyhnutné vykonať ďalšie experimenty.
Záver: Chýbanie molekulových foriem cholínesteráz kotvených ColQ a PRiMA viedlo k zvýšenému
systolickému a diastolickému tlaku krvi, zvýšenej srdcovej frekvencii, k skráteniu srdcového cyklu
a k rýchlejšej repolarizácii komôr. Mechanizmus týchto zmien je do dnešného dňa neznámy.
Práca bola bola podporená grantami UK/306/2011, SK-FR-0031-09 a SK-CZ-0028-09.
38
HYPERHOMOCYSTEINÉMIA A ISCHEMICKO/REPERFÚZNE POŠKODENIE MOZGU
POTKANA
Mária Kovalská1, Marian Adamkov2, Ján Lehotský1
1
Ústav lekárskej biochémie, UK, JLF, Martin, 2 Ústav histológie a embryológie, UK, JLF,Martin
Úvod: Zvýšená hladina homocysteínu (Hcy) v plazme je nezávislý rizikový faktor vzniku
aterosklerotických vaskulárnych ochorení (mozgová príhoda; [1]; infarkt myokardu). Tieţ bolo
dokázané, ţe vzrastajúca hladina Hcy je rizikovým faktorom pre sekundárne vaskulárne príhody
u pacientov po mozgovej príhode (napr. vzniká nový aterotrombus; [2]). Bolo však diskutabilné, či je
moţné umelo vyvolanou hyperhomocysteinémiou (hHcy) ovplyvniť priebeh ischemicko/reperfúzneho
(IR) poškodenia u laboratórnych zvierat? Mnohé experimentálne štúdie dokazujú, ţe pri krátkodobej
ischémii sú procesy vedúce ku smrti bunky iniciované ischémiou, ale sami o sebe prebiehajú počas
reperfúzie a končia oneskorenou smrťou neurónov (24-48 h; [3]). Z biochemického hľadiska vyvoláva
IR poškodenie mozgu zmeny mnohých bunkových dráh a bunkových dejov, ktoré často súvisia, resp.
vyúsťujú aţ do odumretia neurónov. Doteraz sa však nepodarilo dostatočne objasniť ako signálna
MAPK dráha a pERK a p38 proteíny, ako súčasť tejto signalizačnej cesty, môţe viesť k preţívaniu
neurónov po inzulte [4,5]. V súčasnosti sa skúmajú rôzne metodické postupy, ako vyvolať fenomén
tolerancie voči poškodeniu a to aj na klinickej úrovni, či uţ vyuţitím farmák resp. biologických
manévrov ako je IPC (ischemický preconditioning; [6]). Na druhej strane, hHcy je jedným
z predpokladaných faktorov, ktorý môţe priebeh IR poškodenia nepriaznivo ovplyvniť.
Materiál a metódy: Ako biologický materiál boli pouţité samce potkanov kmeňa Wistar. Zvieratá boli
rozdelené do troch skupín. Všetkým zvieratám bola pod celkovou anestéziou navodená globálna
mozgová ischémia (4-VO). Prvá skupina zvierat bola ošetrená 5 min subletálnou ischémiou (IPC) a po
dvoch dňoch im bola aplikovaná 15 min letálna ischémia. Druhej skupine zvierat bol po dobu 2 týţdňov
subkutálne podávaný Hcy. Po uplynutí tejto doby bola potkanom aplikovaná 15 min letálna ischémia
s následnou reperfúziou 1h, 3h a 24 hodín. Posledná skupina slúţila ako kontrola.
Výsledky a diskusia: Pri IPC sme zaznamenali signifikantný nárast hladiny pERK proteínov s rastúcim
intervalom reperfúzie. Po 24h reperfúzii sme zaznamenali nárast hladiny proteínov ako po 24h reperfúzii
u zvierat s Hcy. Rovnako sme v tejto skupine sledovali pokles hladiny p38 proteínov 24h po inzulte
v porovnaní s Hcy skupinou s rovnakou dobou reperfúzie. Fluorescenčná imunoanalýza korelovala s WB
analýzou. Z našich doterajších výsledkov vyplýva, ţe zvýšená hladina pERK proteínov a zníţená hladina
p38 proteínov MAPK dráhy v cytoplazme pravdepodobne vedie k preţívaniu vulnerabilných neurónov
po ischemickom inzulte, čo bolo v koreklácii so svetovým výskumom [4,5].
Záver: Naše výsledky dokazujú, ţe IPC a hHcy vplývajú na zmeny pERK a p38 proteínov v mozgu.
Ďalší výstup tejto štúdie poukazuje na široký záber pôsobenia adaptačného mechanizmu MAPK signálnej
transdukčnej dráhy v tkanive po IR inzulte. Dosiahnuté výsledky tejto práce rozširujú poznatky o
mechanizmoch regulácie post-translačných zmien v intracelulárnych dráhach MAPK/ERK a MAPK/p38
aj v odpovedi na IPC a hHcy.
Práca bola financovaná z projektu MZ UK 5515/0, UK/10/2010 a projektom “Identifikácia nových markerov v
diagnostickom paneli neurologických ochorení” spolufinancovaných zo zdrojov EÚ a Európskeho fondu regionálneho
rozvoja.
Literatúra
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Narang,AP; Verma,I;Kaur,S;Narang,A;Gupta,S;Avasthi,G.(2009):IndianJPhysiolPharmacol., 53/1: 34-8
Mizrahi,EH;Noy,S;Sela,BA;Fleissig,Y;Arad,M;Adunsky,A.(2003): IMAJ, 5/ 11:791-794
Lehotsky,J;Kaplan,P.(2003):Biologia,58:1007-1013
Veeranna,G.J;Shetty,K.T;Takahashi,M;Grant,P;Pant,H.C.(2000):Molecular Brain Research,76:229–236
Lee,CH;Yoo,KY;Park,OK;Choi,JH;Kang,IJ;Bae,E;Kim,SK;Hwang.IK;Won,MH.(2010):Mol.Cells,29: 373-378
Lehotsky,J;Racay,P;Pavlikova,M;Tatarková,Z;Urban,P;Chomova,M;Kovalska,M;Kaplan,P.(2009): Gen. Physiol.
Biophys., 28: 104–113
39
VPLYV BLOKÁDY GLUTAMÁTOVEJ SIGNALIZÁCIE NA PROLIFERÁCIU BUNIEK
V HIPOKAMPE A V SRDCI POČAS STRESU
Stanislav Babic, Mária Ondrejčáková, Daniela Jeţová
Laboratórium farmakologickej neuroendokrinológie, Ústav experimentálnej endokrinológie SAV,
Bratislava
Úvod: Glutamát je hlavný excitačný neurotransmiter v mozgu stavovcov. Glutamátová signalizácia
hrá dôleţitú úlohu v procesoch mozgovej plasticity ako je pamäť a učenie, ako aj v procesoch
neurogenézy v dospelosti. Nadmerné mnoţstvo glutamátu však prostredníctvom aktivácie NMDA
receptorov spôsobuje zvýšený tok vápnika do buniek a spôsobuje ich poškodenie aţ smrť.
K neprimerane zvýšenej glutamátovej signalizácii dochádza aj počas rôznych stresových podnetov.
Cieľom našich experimentov bolo zistiť, či blokáda nadmerne vylučovaného glutamátu ovplyvní
parametre mozgovej plasticity a proliferáciu buniek v srdci.
Materiál a metódy: Dospelé samce potkanov kmeňa Wistar sme počas 8 dní vystavovali
obmedzeniu pohybu - hipokinéze na 2 h denne. Polhodinu pred stresovým podnetom sme zvieratám
podávali antagonistu glutamátových NMDA receptorov memantín alebo vehikulum. Na 7. deň
experimentu sme zvieratám podali 5-bróm-2-deoxyuridín (BrdU), marker proliferácie buniek.
Výsledky a diskusia: Zistili sme, ţe nami pouţitý model opakovaného mierneho stresu zniţuje
inkorporáciu BrdU do DNA v hipokampe a navyše zniţuje počet BrdU pozitívnych buniek v gyrus
dentatus hipokampu, čo je jedna z neurogénnych zón v mozgu cicavcov. Získali sme dôkazy o tom,
ţe vystavenie stresovému podnetu zniţuje inkorporáciu BrdU do DNA aj v srdci. To poukazuje na
zníţenú proliferáciu buniek v týchto štruktúrach. Prekvapujúco, podávanie antagonistu
glutamátových NMDA receptorov memantínu nezmiernilo negatívne účinky stresu. Práve naopak,
v stresových podmienkach podávanie memantínu ešte viac zníţilo proliferáciu buniek v hipokampe
a v srdci.
Závery: Naše výsledky ukazujú, ţe blokáda glutamátergickej neurotransmisie pomocou antagonistu
NMDA glutamátových receptorov memantínu nezabránila negatívnym účinkom stresu na
proliferáciu buniek v hipokampe a srdci. Podávanie memantínu tieto negatívne účinky stresu
dokonca ešte potencovalo. Priniesli sme prvé údaje o zmenách proliferácie buniek v srdci, a to jej
zníţenie pod vplyvom chronického stresu.
Podporené grantom Vega 2/0118/11
40
MUTAČNÁ ANALÝZA GÉNOV NF1 A SPRED1 U SLOVENSKÝCH PACIENTOV
Nemethová M.1, Rybárová A.2, Olčák T.3, Ilenčíková D.4, Kádaši L.1,3, Zaťková A.1,3
1
ÚMFG SAV, Laboratórium genetiky, Vlárska 5, 833 34 Bratislava, 2 2. detská klinika LF UK a
DFNsP v Bratislave, Limbová 1, 833 40 Bratislava, 3 PriF UK, Katedra molekulárnej biológie,
Mlynská dolina, 842 15 Bratislava, 4Laboratorium klinickej a molekulárnej genetiky, 2. detská
klinika LF UK a DFNsP v Bratislave, Limbová 1, 833 40 Bratislava
Úvod: Neurofibromatóza typu 1 (NF1) je autozomalne dominantné ochorenie s incidenciou 1:3500.
Penetrancia ochorenia je 100% uţ do 8 roku ţivota. Hlavnými znakmi ochorenia su café au lait
škvrny, Lishove noduly, freckling, neurofibrómy rôzneho typu, dysplázia dlhých kostí, očný glióm
a prvostupňový príbuzný s NF1. Ochorenie je spôsobené mutáciami v NF1 géne (17q11.2), ktorý
pozostáva zo 60 exónov, z ktorých 3 podliehajú alternatívnemu zostrihu. Proteín neurofibromín má
tumor supresorovú funkciu a je negatívnym regulátorom proto onkogénu Ras a celej MAPK
signálnej dráhy. Legius syndróm, nazývaný aj Neurofibromatóze typu 1 – podobný syndróm, je
ochorenie, ktorého klinické príznaky sú podobné ako pri NF1. Toto ochorenie je spôsobené
mutáciami v ďalšom negatívnom regulátore MAPK signálnej dráhy - SPRED1 (Sprouty-related
EVH1 domain – containing protein 1). SPRED1 gén sa nachádza na chromozóme 15q13.2
a pozostáva z 8 exónov.
Materiál a metódy: Leukocyty sme separovali a následne krátkodobo kultivovali z periférnej krvi
pacientov. Z nich sme pomocou Trizolu (Invitrogen) izolovali celkovú RNA a pomocou Superscript
RT (Invitrogen) pripravili cDNA, ktorú sme pouţili na PCR amplifikáciu celej kódujúcej časti NF1
génu v 5 prekrývajúcich sa fragmentoch. Tieto sme postupne sekvenovali pomocou 19 špecifických
primerov a sekvenačného kitu Big Die® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems) sme v sekvenátore ABI 3130xl (Applied Biosystems). Identifikované mutácie sme
overovali na genomickej DNA pomocou PCR amplifikácie a sekvenovaním príslušného exónu. Ak
sa u pacienta sekvenovaním neodhalila ţiadna mutácia, vzorku sme analyzovali pomocou MLPA.
Sekvenačnú analýzu SPRED1 génu sme následne uskutočnili u tých pacientov, u ktorých sa nenašla
ţiadna patogénna zmena NF1 génu. SPRED1 sme analyzovali na základe PCR amplifikácie z cDNA
v dvoch fragmentoch a PCR amplifikácie v 8 exónoch na úrovni genomickej DNA.
Výsledky a diskusia: Uskutočnili sme kompletnú analýzu vzoriek 77 pacientov. Sekvenovaním
a pomocou MLPA sme identifikovali a overili 47 mutácií, 27 z nich je nových a 17 rekurentných.
V našom súbore pacientov boli najčastejšie frameshift mutácie 22/47 (47%), splicingové mutácie
7/47 (15%), missence mutácie 6/47 (13%), nonsence mutácie 5/47 (10,5%), delécie celého génu typu
I 4/47 (8,5%), zozsiahle vnútrogénové delécie 2/47(4%) a jedna in frame delécia (2%). 6 mutácií sa
overuje. 10 ďalších pacientov je v štádiu analýzy. I na základe splnenia základných diagnostických
kritérií sme u 24 pacientov, ktorí boli podrobení kompletnej analýze sekvenovaním a MLPA nenašli
ţiadnu mutáciu. U 18 z nich bola uţ uskutočnená aj analýza SPRED1, ani v tomto géne sme však
nenašli ţiadnu typickú patogénnu zmenu.
Závery: V našej práci sme do praxe úspešne zaviedli molekulárnu diagnostiku neurofibromatózy
typu 1. Jedinou moţnosťou liečby pri lahších formách NF1 je často len chirurgický zákrok, ale
v mnohých prípadoch má ochorenie ťaţký priebeh, ktorý si vyţaduje aj pouţitie chemoterapie.
Včasné správne diagnostikovanie ochorenia moţe napomocť pri navrhnutí správnej liečby.
V prípade, ak sa mutácia v NF1 géne nepotvrdí môţeme uvaţovať o príbuzných ochoreniach, ktoré
majú podobné klinické prejavy. V našom prípade overujeme, či to nie je práve Legius syndróm.
41
KMEŇOVÉ BUNKY A ICH IDENTIFIKÁCIA POMOCOU PRIETOKOVEJ
CYTOMETRIE.
Lea Dugovičová, Peter Musil, Jana Mlynárová, Ján Kyselovič
Univerzita Komenského, Farmaceutická fakulta, Katedra farmakológie a toxikológie, Odbojárov 10,
832 32 Bratislava
Úvod: V súčasnej dobe medicínsky výskum sústreďuje obrovský záujem na svoju perspektívnu
oblasť – regeneratívnu medicínu. Jej ťaţisko spočíva v liečbe a náhrade poškodených orgánov,
oprave a návrate funkčnosti buniek a tkanív a ich celkovej obnove. Najväčší potenciál v rámci
tkanivového inţinierstva a regenerácie tkanív majú kmeňové bunky. Charakterizované sú vysokou
kapacitou sebaobnovy a schopnosťou diferencovať sa do mnohých špecializovaných bunkových
línií. Pluripotentné embryonálne kmeňové bunky by sa mohli úspešne pouţiť na terapiu doposiaľ
neliečiteľných chronických a degeneratívnych ochorení. Ich aplikácia je však limitovaná niekoľkými
etickými a vedeckými problémami. Výhodnou alternatívou sa zdá byt pouţitie multipotentných
dospelých kmeňových buniek, ktoré sa vyskytujú takmer v kaţdom tkanive organizmu. Z nich
najlepšie preskúmanými sú hematopoietické a mezenchymálne kmeňové bunky.
Pri práci s kmeňovými bunkami v rámci jednotlivých liečebných metód je dôleţitým faktorom
identifikácia presného zloţenia pouţívaných bunkových vzoriek určených na izoláciu alebo
terapeutickú aplikáciu buniek. Prietoková cytometria je metóda zaloţená na identifikácii skupiny
povrchových markerov buniek. Pouţívajú sa pri nej dve rôzne techniky označovania buniek : 1.
pozitívna selekcia buniek vyuţívajúca povrchové markery buniek napr. Stro-1, CD133, CD44, SH3,
SH4 a 2. negatívna selekcia, pri ktorej sa pomocou špeciálnych koktailov protilátok označia všetky
ostatné bunky okrem tých skúmaných. (Alhadlaq a Mao, 2004) Okrem kvalitatívneho zloţenia
identifikovanej vzorky poskytuje aj kvantitatívnu informáciu týkajúcu sa percenta buniek
exprimujúcich povrchové markery v kultúre a ich intenzitu značenia s protilátkami.
V našej práci sme sa snaţili aplikovať prietokovú cytometriu ako identifikačnú metódu v praxi
a zároveň podať aktuálny prehľad v oblasti kmeňových buniek a ich klinického vyuţitia.
Materiál a metódy: Analýza vzoriek pomocou prietokovej cytometrie bola realizovaná na prístroji
MACSQuant® Analyzer ( Miltenyi Biotec), zaloţenom na simultánnom meranií fluorescenčných
signálov pochádzajúcich z excitovaných protilátok naviazaných na prítomné kmeňové bunky v
jednotlivých vzorkách. Postupovali sme podľa protokolu Miltenyi: MACS ®Control: MC
CD34/CD133 Stem Cell Cocktail human. Vyuţili sme pritom techniku pozitívnej selekcie buniek.
Pouţité značenie sa vykonalo na potvrdenie prítomnosti antigénov CD34, CD45 a CD133,
špecifických pre pouţité vzorky kmeňových buniek.
Výsledky a diskusia: Metódou prietokovej cytometrie boli jednotlivo analyzované vzorky
mezenchymálnych kmeňových buniek izolovaných z tukového tkaniva a vzorky hematopoietických
kmeňových buniek izolovaných z kostnej drene. Všetky vzorky boli podrobené testu na viabilitu
pomocou propídium jodidu.
V oboch typoch vzoriek sme následne identifikovali prítomnosť CD 133+ buniek a stanovili
početnosť buniek na 1 ml roztoku.
Záver: Pouţitie prietokovej cytometrie sa ukázalo byt nevyhnutnou metódou pre prácu s kmeňovými
bunkami, nakoľko pomocou nej môţme poukázať na detailné zloţenie vzoriek pochádzajúcich z
prípravku s potencionálnym terapeutickým uplatnením. Jeho pouţitie v klinickej praxi je
podmienené veľmi presným stanovením zloţenia, aby sa následne mohol odhaliť mechanizmus
účinku kmeňových buniek v patologickom tkanive pacientov.
42
MODULÁCIA EXPRESIE KARBONICKEJ ANHYDRÁZY IX POMOCOU RNA
INTERFERENCIE A JEJ VPLYV NA NÁDOROVÉ BUNKY
Peter Radvák
Virologický ústav SAV, Bratislava
Úvod: S rastom solídneho nádorového tkaniva je spájaný aj zníţený podiel kyslíka v pericelulárnom
priestore, tzv. hypoxia. Popri aktivácii širokého spektra génov v reakcii na hypoxiu patrí karbonická
anhydráza IX (CA IX) k dôleţitým hypoxiou indukovateľným proteínom. Expresia CA IX je
zároveň detegovaná u viacerých typov nádorov. Proteín CA IX zohráva dôleţitú úlohu v regulácii
intracelulárneho pH, iónového transportu a predpokladá sa aj zapojenie do procesov modulácie
bunkovej adhézie a participácie v signálnych dráhach. Preto môţeme predpokladať, ţe potlačením
expresie CA IX by mohlo dôjsť k ovplyvneniu expresie proteínov zúčastnených na spomenutých
procesoch. Rozhodli sme sa preto u nádorových buniek potlačiť expresiu proteínu CA IX pomocou
RNA interferencie a sledovať vplyv na proteíny, ktoré sa zúčastňujú adaptácie nádorových buniek na
hypoxické prostredie.
Materiál a metódy: RNA interferencia génu CA9 v nádorových bunkách HT-1080 bola
sprostredkovaná indukovateľným lentivírusovým systémom, stabilne integrovaným v genóme
bunkovej línie. Indukcia expresie CA9 bola dosiahnutá kultiváciou buniek v hypoxických
podmienkach (Ruskinn Technologies). Detekcia zníţenej hladiny expresie CA IX bola overená na
úrovni proteínu (Western blot). Vplyv potlačenia expresie CA IX na sledované gény/proteíny bol
detegovaný prostredníctvom Real Time PCR a Western blotu.
Výsledky a diskusia: Pre overenie supresie proteínu CA IX lentivírusovým systémom sme testovali
bunky HT-1080-siCAIX (siRNA sekvencia proti génu CA9). Bunky HT-1080-scramble (siRNA
sekvencia typu non-sense) nám pri testoch slúţil ako kontrola. Prostredníctvom RNAi sme dokázali
u bunky siCAIX potlačiť expresiu proteínu CA IX. Pomocou Western blotu sme zistili, ţe v
dôsledku supresie proteínu CA IX bola zníţená hladina hypoxiou indukovaného transkripčného
faktora (HIF-1α) a fosforylovanej formy Akt kinázy (p-Akt) v porovnaní s kontrolnými bunkami.
Viaceré štúdie dokázali vplyv aktivovanej fosfatidylinozitol-3 kinázovej (PI3K) signálnej dráhy na
zvýšenie hladiny HIF-1α v prepojení s p-Akt kinázou. Ku skupine génov, ktoré sú regulované HIF-1
transkripčným faktorom patria aj gény ako vaskulárny endotelový rastový faktor (VEGF)
a glukozový transportér (GLUT-1). Pri analyzovaní hladiny mRNA pre gény VEGF a GLUT-1
vyplynulo, ţe hladina mRNA v bunkách s potlačenou CA IX bola pre obe gény zníţená. Keďţe sa
nám vplyv inhibovanej CA IX na HIF-1α prejavil na úrovni proteínov, zaujímalo nás akým
spôsobom k tejto inhibícií dochádza. Prostredníctvom Real Time PCR sme detegovali, ţe hladina
mRNA kódujúca HIF-1α sa výrazne nemení. Preto je moţné predpokladať, ţe k deregulácii expresie
HIF-1α dochádza na úrovni translácie mRNA alebo degradácie proteazómovým komplexom.
Následne sme prostredníctvom inhibítora proteazómového komplexu (MG132) zistili, ţe pokles
hladiny proteínu HIF-1α je pravdepodobne spôsobený niţšou efektivitou translácie v bunkách
s siRNA proti CA IX. V ďalšom postupe je preto potrebné sa zamerať na proces translácie a s ním
spojené regulačné mechanizmy.
Záver: Na základe našich výsledkov konštatujeme, ţe potlačenie expresie proteínu CA IX
ovplyvňuje transkripčný faktor HIF-1α a ním regulované gény VEGF, GLUT-1. K zníţeniu hladiny
HIF-1α nedochádza na úrovni transkripcie alebo stability proteínu v cytoplazme.
Podporené grantom VEGA 2/0194/09
43
PATOLOGICKY MODIFIKOVANÝ TAU PROTEÍN SPÔSOBUJE NEUROZÁPAL
V ALZHEIMEROVEJ CHOROBE
Zuzana Káţmérová, Norbert Ţilka, Andrej Kovač, Michal Novak
Neuroimunologický ústav Slovenskej akadémie vied, Dúbravská cesta 9, 845 10 Bratislava
Úvod: Tau proteín, ktorý patrí do skupiny prirodzene neusporiadaných proteínov zohráva kľúčovú
úlohu v patogenéze Alzheimerovej choroby (AD) (Skrabana a kol., 2006). V prevaţnej miere je
charakterizovaný ako intracelulárny cytoplazmatický proteín, avšak za patologických podmienok je
schopný sa akumulovať v extracelulárnom prostredí a tým prispievať k neurodegeneračným
zmenám. Expresia patologicky modifikovaného tau proteínu (tau 151-391) v mozgu transgénnych
zvierat vedie k tvorbe neurofibrilárnych klbiek a k aktivácii gliových buniek (Zilka a kol., 2009).
Na základe tohto zistenia a skutočnosti, ţe Alzheimerova choroba je špecifická nielen prítomnosťou
neurofibrilárnych klbiek a amyloidných plakov, ale aj silným neurozápalom, sme si stanovili
hypotézu, v ktorej sme chceli dokázať, ţe extracelulárny tau proteín zohráva významnú úlohu
v neurodegenerácii a indukuje imunitnú odpoveď gliových buniek. V našej štúdii sme zistili, ţe
patologicky modifikovaný proteín tau je schopný indukovať morfologické a funkčné zmeny
mikrogliových buniek a stimulovať ich zápalový fenotyp. Mechanizmus účinku je viazaný na MAP
kinázovú dráhu, ktorá zohráva kľúčovú úlohu v produkcii prozápalových cytokínov. (Kovac a kol.,
2011).
Materiál a metódy: Mixované gliové kultúry boli pripravené z jednodňových SD potkanov
a kultivované 3 týţdne v médiu (DMEM, 10%FCS, L-glutamine). Primárne mikroglie boli
pripravené miernou trypsinizáciou z mixovaných gliových kultúr. Mixované gliové kultúry boli
inkubované 24 hodín so skráteným tau proteínom (0,6 - 5µM), médium bolo následne odobraté
a pouţité na ELISU. Prozápalové cytokíny (IL1-β, TNF-α, IL-6), protizápalový cytokín TIMP1
a chemokín MCP-1 boli detekované komerčnou ELISOU. Proteomická analýza internalizácie
patologicky modifikovaného tau s microgliami bola stanovená western blotovou analýzou, kde
komerčné protilátky DC25 HRP a DC190 HRP boli pouţité na detekciu patologicky
modifikovaného tau z bunkových lyzátov microglií. Mikroglie boli pred tým inkubované 2 a 10
hodín s 1µM tau proteínom. NO v mixovaných gliových kultúrach bolo merané v médiu Griessovou
reakciou. MAP kinázy, transkripčné faktory a zápalové gény boli detekované kvantitatívnou realtime PCR analýzou.
Výsledky: V našej štúdii sme zistili, ţe patologicky modifikovaný tau proteín je schopný indukovať
zápal, ktorý je charakterizovaný morfologickou zmenou primárnych mikroglií a produkciou
prozápalových cytokínov IL1-β, TNF-α, IL-6; chemokínu MCP-1 a zároveň protizápalového
cytokínu TIMP1. Okrem toho sme zistili, ţe produkcia zápalových cytokínov je regulovaná MAP
kinázovou aktivitou, konkrétne kinázami JNK, ERK1, p38β a transkripčnými faktormi AP-1(c-jun,
c-fos) a NFkB. Westen blotovou analýzou sa nám podarilo zaznamenať internalizáciu patologicky
modifikovaného tau proteínu s primárnymi mikrogliami pouţitím špecifických tau rozpoznávajúcich
protilátok DC 25HRP a DC 190HRP.
Záver: Naše výsledky po prvý krát jasne preukázali, ţe patologicky modifikovaný tau proteín
zohráva kľúčovú úlohu v regulácii zápalovej odpovede v Alzheimerovej chorobe.
Tento výskum bol podporený nasledujúcimi grantami: VEGA 2/0144/08, VEGA 2/0067/10, VEGA 2/0193/11, LPP0039-09, APVV 0631-07 and structural fund 26240220046, VEGA 2/0151/10.
Zilka, N., Z. Stozicka, A. Kovac, E. Pilipcinec, O. Bugos, and M. Novak. 2009. Human misfolded truncated tau protein
promotes activation of microglia and leukocyte infiltration in the transgenic rat model of tauopathy. J. Neuroimmunol.
209(1-2):16-25.
Kovac, A., N. Zilka, Z. Kazmerova, M. Cente, M. Zilkova and M. Novak. 2011. Misfolded truncated protein tau
induces innate immune response via mitogen-activated protein kinase pathway. J. Immunol. 187(5):2732-9.
Skrabana, R., J. Sevcik and M. Novak. 2006. Intrinsically disordered proteins in the neurodegenerative processes:
formation of tau protein paired helical filaments and their analysis. Cell Mol Neurobiol. 26(7-8):1085-97
44
ANALÝZA INTERAKČNÝCH PARTNEROV PRIÓNOVÉHO PROTEÍNU A ICH
FUNKČNÝ VÝZNAM
Michal Prčina, Eva Kontseková, Peter Baráth, Branislav Kováčech, Michal Novák
Neuroimunologický ústav SAV, Bratislava
Úvod: Priónové ochorenia patria do skupiny konformačných neurodegeneratívnych ochorení. Ich
príčinou je autokatalytická konformačná zmena monomérneho priónového proteínu, ktorý je
v bunkách normálne prítomný (PrPC), na nerozpustný multimér (PrPSc), odolný voči proteolytickej
degradácii. Mechanizmus tejto konverzie, a dokonca aj fyziologická funkcia PrPC zostávajú
neznáme. V našej práci sme pripravili bunkový model vhodný pre skúmanie fyziologickej funkcie
PrPC a biochemických aspektov priónových ochorení. Identifikovali sme niekoľko proteínov
interagujúcich s PrPC, ktoré môţu uţšie súvisieť s jeho fyziologickou funkciou.
Materiál a metódy: Bunky derivované z PrP0/0 myši boli imortalizované pomocou 3metylcholantrénu a vzniknutá línia PrP0/0/1 bola transfekovaná vektorom nesúcim gén pre priónový
proteín. Stabilná expresia a správna lokalizácia PrPC vo výslednej bunkovej línii huPrP1 bola
potvrdená western blotom a imunoflurescenčným farbením.
Lyzáty z bunkových línií a mozgu BSE pozitívneho a BSE negatívneho hovädzieho dobytka boli
inkubované s anti-priónovou mAb PrP1 kovalentne naviazanou na CNBr sefarózu. Naviazané
proteíny boli eluované kyslým pufrom, vyzráţané a rozpustené vo vhodnom pufri. Pripravené vzorky
boli separované pomocou jedno- alebo dvojrozmernej elektroforézy. Všetky proteínové pruhy alebo
škvrny, ktorými sa analyzovaná vzorka líšila od kontrolnej, boli vyrezané, proteíny v nich
redukované, alkylované a poštiepené trypsínom. Vzniknuté peptidy boli rozdelené pomocou nanoHPLC a identifikované pomocou tandemovej hmotnostnej spektrometrie.
Výsledky a diskusia: Pripravili sme stabilnú bunkovú líniu huPrP1 exprimujúcu ľudský priónový
proteín na PrP0/0 pozadí. Exprimovaný PrPC bol správne lokalizovaný v plazmatickej membráne
a úroveň expresie bola porovnateľná s fyziologickou expresiou v bunkách GT1-7. Línia huPrP1 sa
vyznačuje rýchlym rastom, vďaka čomu je môţné v krátkom čase získať veľké mnoţstvo materiálu
pre proteomické experimenty.
V pripravenom bunkovom modeli a vo vzorke mozgu hovädzieho dobytka sme identifikovali
niekoľko proteínov potenciálne interagujúcich s PrPC. Tieto proteíny sa dajú rozdeliť do skupín
podľa ich fyziologických funkcií, s endocytózou súvisia α- a β-adaptín, Alix a Hsc70, v bunkovej
signalizácii sú zapojené synapsín 1b a CRMP2 a medzi šaperóny patria Hsc70, Grp78, mortalín
a malektín. Väčšina týchto proteínov bola identifikovaná v mozgu BSE negatívneho hovädzieho
dobytka, avšak nenašla sa sa v BSE pozitívnej vzorke. To naznačuje, ţe mnohé fyziologické procesy
s účasťou PrPC sú pri prionózach zmenené alebo úplne vyradené.
Záver: Pripravili sme bunkové línie PrP0/0/1 a huPrP1, ktoré spolu predstavujú sľubný model pre
skúmanie bunkovej biológie PrPC. Tieţ sme identifikovali skupinu proteínov potenciálne
interagujúcich s PrPC. Cieľom ďalších experimentov je analýza špecifickosti a fyziológie interakcií
kandidátových proteínov s PrPC, je totiţ pravdepodobné, ţe niektoré z týchto proteínov budú
zohrávať dôleţitú úlohu v bunkovej biológii PrPC.
Podporené z operačného programu Výskum a vývoj pre projekt
spolufinancovaného zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.
45
ITMS
26240220008,
phiSITE a phiGENOME – BIOINFORMATICKÁ PLATFORMA PRE GENOMIKU
BAKTERIOFÁGOV
Matej Stano, Ľuboš Kľučár
Ústav molekulárnej biológie SAV Bratislava
Úvod: Bakteriofágy (fágy), ako modelové objekty, stáli pri zrode molekulárnej biológie a významne
prispeli k porozumeniu vlastností ţivej hmoty na jej elementárnej úrovni. Fágy boli prvé biologické
entity so stanovenými kompletnými genómovými sekvenciami a zohrali aj kľúčovú rolu na poli
štúdia regulácie expresie génov. Dnes sú známe genómy stoviek fágov a regulačné mechanizmy
detailne preštudované v desiatkach z nich. Napriek tomu tieto cenné informácie neboli dostupné v
ţiadnej špecializovanej biologickej databáze. Zhromaţďovanie, organizácia a uchovávanie
biologických dát je jedným z poslaní bioinformatiky. Biologické databázy by zároveň mali tieto dáta
adekvátnym spôsobom sprístupňovať koncovým pouţívateľom. V prípade databáz genómových
sekvencií sú to prehliadače a nástroje na vizualizáciu genómov, ktoré v prístupnej forme
sprostredkúvajú informácie o organizácií funkčných elementov v genómoch.
Materiál a metódy: Databáza phiSITE je zaloţená na databázovom systéme MySQL. Pri tvorbe
webového rozhrania databázy bola pouţitá kombinácia programovacích jazykov PHP a XHTML. Pri
vývoji prehliadača genómov phiGENOME bola uplatnená technológia Adobe Flash v synergii so
sériou ďalších webových technológií (XHTML, SVG, XML, JavaScript).
Výsledky a diskusia: Navrhli a vybudovali sme biologickú databázu phiSITE, databázu génových
regulácií v bakteriofágoch. phiSITE uchováva sekvencie genómov bakteriofágov a informácie o ich
génoch, cis-regulačných elementoch a ich vzájomných regulačných interakciách. Databáza aktuálne
obsahuje informácie o 542 fágoch, z toho má 539 známu kompletnú genómovú sekvenciu
a anotované gény. Unikátnu zloţku databázy tvorí 732 záznamov pre transkripčné cis-regulačné
elementy, t.j. promótory, operátory a terminátory, ktoré pochádzajú z 32 fágov. Navyše pre 9
bakteriofágov boli zostavené modely kompletných regulačných sietí. phiSITE je verejná databáza,
dostupná cez webový portál: http://www.phisite.org. Stránky webového portálu sú rozdelené do
niekoľkých sekcií, cez ktoré môţe pouţívateľ vyhľadávať, vizualizovať a analyzovať dáta uloţene v
databáze. K dispozícii sú aj programy slúţiace na predikciu cis-regulačných elementov. Paletu
informácií dopĺňajú početné hypertextové odkazy na externé databázy.
Kľúčovým komponentom pouţívateľského rozhrania databázy phiSITE je interaktívny prehliadač
fágových genómov phiGENOME (http://www.phisite.org/phigenome). Ten poskytuje názorné a
dynamické grafické zobrazenie genómov fágov uloţených v databáze phiSITE, s dôrazom na ich cisregulačné elementy. Okrem samotných vizualizačných funkcií, poskytuje pouţívateľovi aj esenciálne
informácie asociované so zobrazeným genómom, a hypertextové odkazy na ďalšie zdroje informácií.
phiGENOME pozostáva z troch vzájomne prepojených komponentov. Genome map viewer,
zaloţený na technológii Adobe Flash, ponúka grafickú reprezentáciu genómu v dynamickej forme a s
intuitívnym ovládaním. Slúţi predovšetkým na globálne prehliadanie organizácie genómu. Za
účelom detailného prehliadania na sekvenčnej úrovni bol zostrojený sequence browser, druhý
komponent phiGENOME, ktorý je zaloţený na precízne formátovaných HTML značkách. Tretí
komponent, regulation illustrator, vychádza z technológie SVG a slúţi na grafické znázornenie
regulačných vzťahov medzi cis-regulačnými elementmi a génmi/proteínmi.
Záver: Databáza phiSITE, spolu s prehliadačom genómov phiGENOME, sú dnes jedinečnými
zdrojmi informácií o regulačných elementoch, génoch a genómoch bakteriofágov, ktoré sú voľne
dostupné všetkým potenciálnym pouţívateľom.
Práca bola podporená: APVV- 51-02504 a VEGA 2/0100/09.
46
UNIKÁTNE SEKVENČNO-ŠTRUKTÚRNE ČRTY EXTRÉMOFILNÝCH
AMYLOLYTICKÝCH ENZÝMOV Z RODINY GH57
Karol Blesák, Štefan Janeček
Laboratórium evolúcie proteínov, Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava
Úvod: Rodina 57 glykozidových hydroláz (GH57)1 je v systéme CAZy klasifikácie enzýmov
aktívnych voči sacharidom2 známa ako tzv. druhá α-amylázová rodina. Patria do nej amylolytické
enzýmy (α-amyláza, amylopululanáza, glukán-vetviaci enzým a 4-α-glukanotransferáza), ale aj αgalaktozidáza. Rodina GH57 obsahuje ~600 sekvenovaných enzýmov a proteínov2 z domén Archaea
(1/4) a Bacteria (3/4), pochádzajúcich prevaţne z extrémofilov. Doteraz bolo biochemicky
charakterizovaných len menej ako 20 GH57 enzýmov1,2. Členovia tejto rodiny vyuţívajú retenčný
reakčný mechanizmus a majú typickú štruktúru katalytickej domény, ktorá je tvorená tzv.
nekompletným TIM-barelom3. Pred niekoľkými rokmi boli popísané základné konzervované
sekvenčné regióny, ktoré zahŕňajú predovšetkým katalytický nukleofil a donor protónu, ale aj
niekoľko ďalších, funkčne dôleţitých zvyškov4.
Materiál a metódy: V práci boli porovnávané aminokyselinové sekvencie proteínov z rodiny GH57
získané nástrojom BLAST5 s vyuţitím sekvencií 15 charakterizovaných enzýmov. Výsledky boli
doplnené o dostupné sekvencie z databázy CAZy2. Tieto sekvencie hypotetických GH57 proteínov
boli na základe bioinformatických analýz v niekoľkých postupných kolách rozdelené do skupín, pre
ktoré boli charakteristické veľmi podobné sekvenčno-štruktúrne motívy a pravdepodobne aj
enzýmové špecificity.
Výsledky a diskusia: Z takmer 10 tisíc získaných sekvencií (väčšina však bola zachytená viackrát)
bol po vytriedení pripravený súbor viac neţ 1000 unikátnych sekvencií, ktoré vykazovali podobnosť
so známymi členmi rodiny GH57. Z nich bolo na detailnú sekvenčnú analýzu vybraných takmer
päťsto proteínov, ktoré boli následne rozdelené do skupín podľa príslušných špecificít: α-amylázy,
amylopululanázy, glukán-vetviace enzýmy, 4-α-glukanotransferázy a α-galaktozidázy. Pre jednotlivé
enzýmové špecificity boli na základe konzervovaných sekvenčných regiónov pripravené ich
sekvenčné logá, ktoré môţu byť vyuţité ako ich tzv. sekvenčné odtlačky prstov. Bolo navrhnuté aj
typické doménové usporiadanie GH57 špecificít spolu s modelmi ich terciárnej štruktúry (u
chýbajúcich experimentálnych štruktúr), ako aj popísaním evolučných vzťahov medzi nimi. Detailne
boli analyzované sekvencie, štruktúry a evolučné vzťahy aj v skupine hypotetických proteínov, ktoré
boli mimoriadne podobné s GH57 α-amylázami, ale obsahovali mutáciu v jednom alebo oboch
katalytických zvyškoch6.
Záver: Cieľom predloţenej in silico štúdie bolo poukázať na moţnosť predpovedať enzýmovú
špecificitu (funkciu) necharakterizovaných proteínov z rodiny GH57 na základe unikátnych čŕt v ich
aminokyselinových sekvenciách.
Práca bola podporená grantmi APVV LPP-0417-09 a VEGA 2/0148/11.
1.Janecek S. 2010. In: CAZypedia, URL: http://www.cazypedia.org/.
2.Cantarel B.L., Coutinho P.M., et al. 2009. Nucleic Acids Res. 37: D233-8.
3.Imamura H., Fushinobu S., et al. 2003. J. Biol. Chem. 278: 19378-86.
4.Zona R., Chang-Pi-Hin F., et al. 2004. Eur. J. Biochem. 271: 2863-72.
5.Altschul S.F., Gish W., et al. 1990. J. Mol. Biol. 215: 403-10.
6.Janecek S. & Blesak K. 2011. Protein J. 30: 429-35.
47
GENETICKÁ EKOLÓGIA RESTRIKČNO-MODIFIKAČNÝCH SYSTÉMOV
U ENTEROKOKOV
Anna Vandţurová1, Peter Javorský1, Peter Pristaš1,2
1
Ústav fyziológie hospodárskych zvierat SAV, Košice, 2 Univerzita Mateja Bela, Katedra biológie a
ekológie, Banská Bystrica
Úvod: Restrikčno-modifikačné systémy (R-M systémy) sú zloţené z génov kódujúcich restrikčnú
endonukleázu (RE) a DNA metyltransferázu. Prevládajúcim názorom je, ţe ich hlavná funkcia spočíva
v ochrane bakteriálnych buniek pred inváziou cudzorodej DNA. Viaceré experimenty však podporujú
hypotézu, ţe R-M systémy sa správajú ako „sebecké gény“ - paraziti na úrovni genómu, pretoţe ak ich
raz bunka získa, stávajú sa esenciálnymi pre jej ţivot. Správajú sa podobne ako iné mobilné génové
elementy, sú schopné pohybovať sa medzi genómami a nie sú závislé od hostiteľa [1].
Cieľom práce bolo štúdium kolonizácie populácií enterokokov z tráviaceho traktu teplokrvných
ţivočíchov R-M systémami, charakterizácia vybraných R-M systémov a RE a analýza ich biologických
funkcií.
Materiál a metódy: V práci boli pouţité izoláty enterokokov z tráviaceho traktu a faeces rôznych
ţivočíchov získané kultiváciou na selektívnej agarovej pôde (Bile Aesculin Azide Agar, Merck) pre
enterokoky. Kultivácia prebiehala v aeróbnych podmienkach pri 37 °C a získané izoláty sa ďalej
typizovali pomocou MALDI-TOF analýzy. Na prítomnosť R-M aktivít bolo rýchlou skríningovou
metódou podľa Javorského a Vanáta [2] analyzovaných 102 izolátov z 11 zvierat. U vybraných izolátov
z kamzíka vrchovského (Rupicapra rupicapra tatrica) sa testoval výskyt antibiotickej rezistencie na
vybrané antibiotiká (ampicilín 50 mg.ml-1, erytromycín 10 mg.ml-1 a tetracyklín 10 mg.ml-1).
Výsledky: Analýza restrikčných aktivít v hrubých bunkových extraktoch ukázala, ţe R-M systémy sa
vyskytujú pribliţne len v 30% študovaných enterokokových populácií. Študované populácie sú
väčšinou kolonizované len jedným, unikátnym typom R-M systému. Výnimkou bola populácia
enterokokov u svine domácej, kde sa súčasne vyskytovali viaceré R-M systémy. Nami izolované RE sú
prvými RE detegovanými u Enterococcus spp. a sú izoschizomérmi komerčne dostupných RE BstNI,
SduI, BsmAI, HaeIII a HhaI. Výsledky MALDI TOF analýzy naznačujú moţnú mobilitu R-M systémov
u enterokokov. U izolátov z kamzíka vrchovského (R. rupicapra tatrica) sa zistilo, ţe výskyt
antibiotickej rezistencie nie je ovplyvnený prítomnosťou R-M systémov, naopak populácie
kolonizované R-M systémami boli - v zjavnom rozpore s proklamovanou úlohou R-M systémov kolonizované aj mobilnými génovými elementmi zodpovednými za šírenie rezistencie.
Záver: Táto práca je jednou z prvých štúdií zameraných na výskyt a kolonizáciu populácii enterokokov
R-M systémami. Naše zistenia potvrdzujú hypotézu o sebeckosti génov kodujúcich R-M systémy.
Táto práca vznikla za podpory grantu VEGA 2/0066/11.
Literatúra:
1. Kobayashi I.: Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their
impact on genome evolution. Nucleic Acids Res (2001), 29: 3742-3756.
2. Javorský P., Vanát I.: Deoxyribonuclease activity in Streptococcus bovis. Lett Appl Microbiol (1992),
14: 108-111.
48
Úloha glutamát dekarboxylázy počas vývoja a stresu u vláknitej huby Trichoderma atroviride
F-534
Ľuboš Niţnanský, Svetlana Kryštofová, Ľudovít Varečka
Oddelenie biochémie a mikrobiológie FCHPT STU
Úvod: Enzým glutamát dekarboxyláza (GAD) konvertuje glutamát na kyselinu 4-aminobutánovú
(GABA). Tento enzým uţ bol ocharakterizovaný u vláknitých húb ako Trichoderma atroviride
(Strigáčová, 2001), Aspergillus oryzae (WEIGUO, 2010), avšak jeho jasná funkcia ostáva
neobjasnená. Predmetom štúdie je popísať funkciu GAD u vláknitých húb. Doposiaľ známe výsledky
naznačujú, ţe endogénna hladina GABA by mohla byť spojená s klíčením/alebo konidiáciou. Naše
výsledky poukazujú na toto spojenie GAD s polarizáciou klíčenia. Navyše analýzou promotorovej
oblasti sa ponúka úloha tohto enzýmu pri strese zastúpeným prítomnosťou acetátu v médiu.
Materiál a metódy: mutantné kmene Δgad 10 a Δgad 21 boli pripravené elektroporáciou a
následnou homológnou rekombináciou dizrupčnej kazety. Delécia génu bola potvrdená
Southernovou analýzou. Izolovaná genómová DNA bola poštiepená restrikčnou endonukleázou
Hind III a následne prenesená na nylónovú membránu (Roche, Germany). Próba bola značená
digoxigenínom-11-dUTP (alkali labile, Roche, Germany). Na detekciu próby sa pouţila protilátka
(Anti-digoxigenin-AP Fab fragmenty, Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko) a
chemiluminiscenčný substrát CDP-Star (Roche, Germany). Pre biochemický dôkaz nulovej GAD
aktivity sme pouţili pracovný postup podľa Turského a Bandţuchovej (1999). Ako substrát pre
enzým GAD sa pouţila U-14C- glutámová kyselina, ktorá sa konvertuje na produkt 14Cγ- GABA.
Všetky submerzné kultivácie ako aj kultivácie na tuhom médiu prebiehali pri teplote 26 0C na médiu
CZD bez prídavku kvasničného autolyzátu. Ako zdroj dusíka sme pouţili NH4NO3 namiesto NaNO3.
Analýza promotorovej oblasti GAD bola uskutočnená programom TESS (Transcription Element
Search System, http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess?RQ=WELCOME).
Výsledky a diskusia:
Vývoj: mutant Δgad nebol doteraz u vláknitej huby pripravený. Deficit GAD aktivity u T. atroviride
F-534 je sprevádzaný predĺţenou lag fázou, tvorbou štruktúr podobných chlamidospóram a
oneskorenou konidiáciou. Práve predĺţená lag fáza nás priviedla k tomu bliţšie sa pozrieť na proces
klíčenia, kde sme zistili, ţe mutantné kmene Δgad 10 a Δgad 21 klíčia mutipolárne a v neskoršej fáze
rastu sme pozorovali zvýšené vetvenie hýf.
Stres: analýzou promotorovej oblasti GAD génu bolo nájdených najmenej šesť hypotetických
väzbových miest pre FacB homológ, transkripčný aktivátor regulujúci expresiu génov potrebných
pre utilizáciu acetátu. Ajkeď naše dáta ukazujú, ţe acetát nemá priamy efekt na GAD aktivitu, 10%
prídavok acetátu spôsobil skoršiu konidiáciu mutantných kmeňov ako u divého kmeňa, čo by mohlo
naznačovať reakciu na stres. Efekt acetátu na expresiu GAD je predmetom súčasnej experimentálnej
práce.
Záver: enzým glutamat dekarboxyláza sa nachádza vo všetkých eukaryotických organizmoch, kde
plní rozmanité funkcie. Klíčenie spór vláknitých húb je proces, ktorý nie je stále objasnený a GAD v
ňom zohráva svoju úlohu. Tieto výsledky by mohli prispieť do zloţitej mozaiky procesov
prebiehajúcich pri klíčení a neskoršom vývoji mycélia. Pochopenie procesu klíčenia sa môţe
uplatniť v poľnohspodárstve a zdravotníctve.
Prostriedky pre túto prácu boli čerpané z grantu APVV 00642-07
Literatúra:
STRIGÁČOVÁ, J. et al: Glutamate decarboxylase activity in Trichoderma viride conidia and developing mycelia. In:
Archives of Microbiology, 2001, 175(1), s.32-40.
WEIGUO, L. et al: Properties of Glutamate Decarboxylase of Aspergillus oryzae and Its Application for
Biotransformation of Glutamate into gamma-Aminobutyric Acid. In: IBM Journal of Research and Development, 2010.
49
FUNKČNÁ CHARAKTERIZÁCIA PREDPOKLADANEJ EPOXIDHYDROLÁZY EphD
Z MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Jan Madacki, Katarína Mikušová, Jana Korduláková
Katedra biochémie, Prírodovedecká fakulta UK v Bratislave
Úvod: Napriek výrazným pokrokom vo vývoji antituberkulotík v minulom storočí zostáva pôvodca
tuberkulózy – baktéria Mycobacterium tuberculosis, jedným z najnebezpečnejších patogénov aj
v súčasnosti (WHO, 2011). V posledných rokoch sa navyše stretávame s výskytom kmeňov M.
tuberculosis, voči ktorým sú štandardne pouţívané antituberkulotiká neúčinné. Mykobaktérie sa
vyznačujú hrubým, hydrofóbnym bunkovým obalom s vysokým obsahom lipidov. Významnú súčasť
týchto lipidov tvoria mykolové kyseliny – dlhé, α-alkyl β-hydroxy mastné kyseliny. Mykolové kyseliny
zabezpečujú štruktúrnu integritu bunkovej steny a sú esenciálne pre viabilitu mykobakteriálnej bunky
(Leger a kol., 2009). Ich biosyntéza je cieľom pre pôsobenie jedného z najúčinnejších antituberkulotík –
izoniazidu, pričom predstavuje bohatý zdroj atraktívnych cieľov aj pre pôsobenie nových
antituberkulotík. Cyklopropylované a oxygenované (metoxy- a keto-) mykolové kyseliny M. tuberculosis
sú taktieţ dôleţitými faktormi vo virulencii tejto baktérie a jej interakcii s imunitným systémom hostiteľa
(Barry a kol., 1998).
Naša práca je zameraná na funkčnú charakterizáciu predpokladanej epoxidhydrolázy EphD z M.
tuberculosis a jej ortológu MSMEG_4280 z nepatogénneho druhu M. smegmatis. Predpokladali sme, ţe
tieto proteíny môţu zohrávať úlohu v metabolizme mykobakteriálnych lipidov.
Materiál a metódy: Proteín EphD, jeho mutovanú verziu, ako aj ortológ MSMEG_4280 sme
produkovali v E. coli a epoxidhydrolázovú aktivitu produkovaných proteínov sme stanovili v in vitro
reakciách pomocou rádioaktívne značeného generického substrátu – kyseliny [14C]-epoxysteárovej
(Arand a kol., 2005). Študované proteíny sme produkovali aj v štandardnom kmeni M. smegmatis
mc2155 a v kmeni s prerušeným génom msmeg_4280, ktorý sme mali k dispozícii (Korduláková
a Jackson, nepublikované výsledky). V pripravených kmeňoch sme sa zamerali na analýzu zloţenia
lipidov, mastných/mykolových kyselín, ako aj na analýzu morfológie tvorených biofilmov, ktorá súvisí
so zloţením mykolových kyselín. Subcelulárnu lokalizáciu študovaných proteínov sme analyzovali
pomocou western blotu vo frakciách cytosolu, membrán a bunkových stien získaných diferenciálnou
cetrifugáciou.
Výsledky a diskusia: Výsledky in vitro reakcií, v ktorých sme vyuţili generický substrát potvrdili, ţe
proteíny EphD a MSMEG_4280 majú epoxidhydrolázovú aktivitu. Ukázali sme, ţe epoxidhydrolázová
aktivita EphD je viazaná na predpokladanú α/β-hydrolázovú doménu tohto proteínu a ţe bodová mutácia
v predpokladanej katalytickej triáde v rámci tejto domény spôsobuje stratu aktivity enzýmu.
Analýzou subcelulárnej lokalizácie EphD produkovaného v M. smegmatis sme zistili, ţe tento proteín sa
nachádza takmer výlučne vo frakcii bunkových stien. Pozorovali sme, ţe kmene M. smegmatis
s prerušeným génom msmeg_4280 produkujú biofilmy s výrazne odlišnou morfológiou v porovnaní so
štandardným kmeňom, čo naznačuje úlohu tohto proteínu v metabolizme mastných kyselín. Tento
fenotyp je komplementovateľný funkčnou kópiou génu ephD. Ukázali sme taktieţ, ţe indukovateľná
nadprodukcia EphD, resp. MSMEG_4280 v M. smegmatis vedie k akumulácii derivátov mykolových
kyselín, ktorých prítomnosť v M. smegmatis dosiaľ nebola popísaná.
Záver: Výsledky našej práce dokazujú, ţe proteín EphD a jeho homológ MSMEG_4280 zohrávajú úlohu
v biosyntéze mykolových kyselín v mykobaktériách.
Literatúra:
Arand, M., Cronin, A., Adamska, M. and Oesch, F. (2005): Meth enzymol 400: 569-588.
Barry, C. E., 3rd, Lee, R. E., Mdluli, K., Sampson, A. E., Schroeder, B. G., Slayden, R. A. and Yuan, Y. (1998): Prog
lipid res 37(2-3): 143-179.
Leger, M., Gavalda, S., Guillet, V., van der Rest, B., Slama, N., Montrozier, H., Mourey, L., Quemard, A., Daffe, M. and
Marrakchi, H. (2009): Chem Biol 16(5): 510-519.
World Health Organization (2011): Tuberculosis progress report. Geneva, WHO Press.
Práca bola podporená grantom APVV-0441-10.
50
51
Sekcia IV.: Enzymológia a proteomika
52
MUTÁCIAMI INDUKOVANÁ SEPARÁCIA DVOCH KOOPERUJÚCICH AKTIVÍT ĽUDSKEJ LON
PROTEÁZY
Ľuboš Ambro, Vladimír Pevala, Gabriela Ondrovičová, Eva Kutejová, Jacob Bauer
Ústav molekulárnej biológie SAV, Bratislava
Úvod: Lon je ubikvitne rozšírená ATP-závislá proteáza. Jej primárnou funkciou je degradácia nezloţených,
nesprávne zloţených a oxidačne poškodených proteínov [1]. Lon patrí do rodiny serínových proteáz, no jej
proteolyticky aktívne miesto obsahuje nezvyčajnú katalytickú diádu serín-lyzín [2]. Na rozdiel od ostatných ATPzávislých proteáz, Lon rozpoznáva cieľové substráty na základe priestorovej konformácie [3, 4]. Tento enzým je
funkčný výlučne vo forme homooligoméru a vykazuje tri merateľné aktivity in vitro: ATPázovú, stimulovanú
v prítomnosti proteínového substrátu; proteázovú, ktorá je podmienená uvoľnením energie štiepením ATP
a peptidázovú nezávislú na ATP. Pre objasnenie mechanizmu degradácie u ľudskej Lon proteázy (hLon) sme
pripravili sériu mutantných proteínov s bodovými mutáciami v proteolyticky aktívnom mieste a sledovali zmeny
jednotlivých aktivít.
Materiál a metódy: Mutácie sme navrhli na základe kryštálových štruktúr proteolytickej domény hLon (Obr. 1.) a
E. coli Lon a sekvencie RadA/sms proteínu E. coli. cDNA ľuskej Lon proteázy vloţenú vo vektore pProEx-1 sme
podrobili in vitro mutagenéze (QuikChange XL, Stratagene). Proteín sme exprimovali v E. coli Rosetta 2 DE3
(Novagen), purifikovali pomocou afinitnej chromatografie s pouţitím náplne Ni-NTA agaróza (Qiagen).
Oligomerizáciu mutantov sme overili zosieťovaním proteínov glutaraldehydom a následnou SDS-PAGE, ako aj
gélovou filtráciou na SuperoseTM6 10/300 (GE Healthcare). Proteázová aktivita bola určená štiepením β-kazeínu
a vyhodnotením pomocou SDS-PAGE, a štiepením fluorescenčne značeného FITC-kazeínu s analýzou pomocou
prietokového fluorimetra (Perkin LS-2B). Meranie peptidázovej a ATPázovej aktivity je detailne popísané v iných
publikáciách [5, 6].
proteázová
peptidázová
FITC-K SDS(%)
(%)
PAGE
hLon wt
100
*****
100
T880V
22
**
<5
D852A
45
**
<5
ΔG847
20
***
<5
ΔG847, D852A
0
ţiadna
0
G853P
0
ţiadna
0
G893P
0
ţiadna
87
G893P, G894A
0
ţiadna
63
mutant
Tab. 1. Relatívne hodnoty (vzhľadom k wt
Obr. 1. Vizualizácia proteolytického
enzýmu) proteázovej aktivity po štiepení FITCmiesta hLon s farebným vyznačením
kazeínu (FITC-K) a peptidázovej aktivity.
katalytických zvyškov Ser855-Lys898
Proteázová aktivita určovaná podľa SDS-PAGE je
a ostatných zvyškov, ktoré boli mutované
vyhodnotená vizuálne.
(PyMOL sotware, DeLano Scientific).
Výsledky a diskusia: Testovanie oligomerizácie ukázalo, ţe všetky pripravené mutanty sú schopné tvoriť
hexaméry. Bazálna ATPázová aktivita nebola signifikantne ovplyvnená u ţiadneho z mutantov, rozdiely boli iba v
miere stimulácie substrátom. Namerané hodnoty proteázových a peptidázových aktivít sumarizuje tabuľka 1.
Prostredníctvom zavedených mutácií sa nám podarilo oddeliť proteázovú a peptidázovú aktivitu enzýmu, čo
indikuje, ţe celý substrát a jeho poštiepené fragmenty sú spracovávané odlišným spôsobom.
Záver: Štruktúra a pohyb dvoch loop-ov ohraničujúcich proteolyticky aktívne miesto hLon (Obr. 1) sú kritické pre
priebeh proteolýzy, pričom funkcia väčšieho z nich (zvyšky 843-854) pravdepodobne spočíva v uvoľňovaní
krátkych peptidov z aktívneho miesta enzýmu. Treonín 880 umiestňuje katalytický lyzín do správnej polohy pre
štiepenie peptidovej väzby substrátu.
Poďakovanie: Práca je financovaná grantmi VEGA 2/0122/11 a APVV-0123-10.
Literatúra: [1] Tsilibaris, V., Maenhaut-Michel, G., a Van Melderen, L., (2006) Res Microbiol 157, 701 [2] Botos, I.
a kol. (2004) J Biol Chem 279, 8140 [3] Major, T. a kol. (2006) Mol Cell Biol 26, 762 [4] Ondrovicova, G. a kol. (2005)
J Biol Chem 280, 25103 [5] Lanzetta, P.A. a kol. (1979) Anal. Biochem. 100, 90 [6] Goldberg, A.L. a kol. (1994)
Methods Enzymol. 244, 350
53
VÝVOJ UNIVERZÁLNEJ TECHNIKY NA IMOBILIZÁCIU BIOKATALYZÁTOROV
Marek Bučko, Peter Gemeiner
Chemický ústav SAV - Centrum glykomiky, Oddelenie glykobiotechnológie, Dúbravská cesta 9, 845
38 Bratislava; e-mail: [email protected]
Úvod: Mikrobiálne bunky a enzýmy nachádzajú vďaka mimoriadnej selektivite a ekologickej šetrnosti čoraz väčšie
uplatnenie ako biokatalyzátory na produkciu hodnotných bioaktívnych látok [1]. Obmedzenia pouţiteľnosti
voľných biokatalyzátorov boli jedným z hlavných motívov pre vývoj univerzálnej imobilizačnej techniky, ktorá by
priniesla recyklovateľnosť a stabilizáciu biokatalyzátorov. Z výsledkov z nedávneho obdobia je zrejmé, ţe vyvíjaná
technika enkapsulácie v polyelektrolytových (PEC) mikrokapsuliach s polopriepustnou membránou umoţňuje
zvýšenie produktivity kyseliny glukónovej ko-enkapsuláciou enzýmu glukóza oxidázy a tzv. nosičov kyslíka [2]
a tieţ stabilizáciu produktivity pri skladovaní [3] a opakovanom pouţití [4] enkapsulovaných rekombinantných
buniek E. coli s nadprodukovanými enzýmami zo skupiny Baeyer-Villigerových monooxygenáz (BVMO) pri
produkcii prekurzorov bioaktívnych látok. Imobilizačná technika sa osvedčila z hľadiska uniformity
produkovaných častíc v priamom porovnaní s konkurenčnými technikami v rámci celoeurópskeho testu [5].
Získané skúsenosti boli pouţité pri formulácii všeobecných poţiadaviek na enkapsulačné systémy vypracovaných
spolu so svetovými autoritami z oblasti bioenkapsulácie [6].
Materiál a metódy: Techniky enkapsulácie glukóza oxidázy, kyslíkových nosičov, buniek E. coli s BVMO v PEC
kapsuliach, pouţité materiály a metódy sú detailne opísané v príslušných publikáciách.
Výsledky a diskusia: Koenkapsuláciou glukóza oxidázy s kyslíkovými nosičmi poly(dimetylsiloxán)-om, ndodekánom a perflurodekalínom v PEC kapsuliach došlo takmer ku zdvojnásobeniu objemovo-časového výťaţku
produktu oxidácie glukózy (zmes kys. glukónovej a glukonolaktónu) zo 44.3±2.0 g/l·d na 83.4±3.4 g /l·d oproti
biokatalyzátoru bez nosičov kyslíka [2].
Enkapsuláciou rekombinantných buniek E. coli s monooxygenázou cyklopentanónu (CPMO) bola dosiahnutá
stabilizácia pri krátkodobom skladovaní oproti voľným bunkám (obr. 1). Významná operačná stabilizácia bola
dosiahnutá pri 14-násobnom pouţití enkapsulovaných buniek obsahujúcich monooxygenázu cyklohexanónu
(CHMO) počas Baeyer-Villigerovej biooxidácie v prietokovom bioreaktore (obr. 2) za produkcie prekurzorov
biologicky aktívnych látok.
Obr. 1 Skladovacia stabilita voľných (▲)
a enkapsulovaných (○) buniek E. coli
obsahujúcich CPMO pri Baeyer-Villigerovej
biooxidácii
bicyklo[3.2.0]hept-2-én-3-ónu.
Skladovacia teplota 4°C. [3]
Obr. 2 Operačná stabilita enkapsulovaných buniek E. coli
s CHMO pri opakovaných cykloch kontinuálnej BaeyerVilligerovej biooxidácie bicyklo[3.2.0]hept-2-én-3-ónu pri
25°C. [4]
Záver: Na základe dosiahnutých výsledkov je moţné konštatovať, ţe vyvíjaná technika enkapsulácie v PEC
mikrokapsuliach je univerzálne pouţiteľná na imobilizáciu biokatalyzátorov pre ich stabilizáciu a recyklovateľnosť.
Poďakovanie: Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV-51-033205 a Vedeckou grantovou
agentúrou MŠ SR a SAV VEGA (grant č. 1/0335/10).
Literatúra:
1. Straathof A.J.J. In: Industrial biotransformations. Weinheim: Wiley-VCH; 2006, p. 515-520
2. Bučko M. et al. (2010) Artif. Cells Blood Substit. Biotechnol. 38: 90-98
3. Hucík M., Bučko M. et al. (2010) Biotechnol. Lett. 32: 675-680
4. Bučko M. et al. (2011) Enzyme Microb. Technol. 49: 284-288
5. Prüsse U., Bilancetti L., Bučko M. et al. (2008) Chem. Papers 62: 364-374
6. De Vos P., Bučko M. et al. (2009) Biomaterials 30: 2559-2570
54
OPTIMALIZÁCIA PODMIENOK ELLMANOVEJ METÓDY
Dominika Dingová, Anna Hrabovská
Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta UK, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava
Úvod: Problematika cholínesteráz sa stáva čoraz atraktívnejšou témou. Stále častejšie sa objavujú
publikácie, ktoré popisujú korelácie medzi aktivitou cholínesteráz a rôznymi patológiami. Práve z
tohto dôvodu je potrebná spoľahlivá metóda na meranie ich aktivity. V súčasnosti je
najpouţívanejšou metódou na stanovovanie aktivity cholínesteráz Ellmanova esej. Táto metóda
umoţňuje kvantifikovať zlúčeniny, ktoré obsahujú voľné SH-skupiny. Avšak, napriek výhodám má
Ellmanova metóda isté limitujúce faktory, v dôsledku ktorých je problematické sledovať nízke
hladiny cholínesteráz resp. zaznamenávať ich aktivitu počas dlhších časových intervalov. Sú to
predovšetkým nestabilita Ellmanovho činidla v čase či prítomnosť nešpecifického signálu pri meraní
v biologických vzorkách. Cieľom tohto projektu bolo minimalizovať limitujúce faktory Ellmanovej
metódy a zaviesť tak spoľahlivú metodiku na stanovovanie aktivity cholínesteráz.
Materiál a metódy: Ako substrát sme pouţili butyryltiocholín jodid (BTC; 1mmol/l). Za modelový
enzým sme zvolili ľudskú butyrylcholínesterázu. Vlnovú dĺţku tvorby produktu (O.D/λ) a rýchlosť
tvorby produktu enzýmovej hydrolýzy (O.D./t) sme pozorovali vo fosfátovom tlmivom roztoku
(0.1mol/l) a tlmivom roztoku HEPES(0,5mmol/l) o pH = 7,0; 7,5; 8,0; 8,5 a 9,0. Následne sme
študovali hlavné limitujúce faktory Ellmanovej metódy a pozorovali sme stabilitu Ellmanovho
činidla (DTNB; 0,5mmol/l) a intenzitu nešpecifického signálu v spomínaných tlmivých roztokoch.
Výsledky a diskusia: V oboch skúmaných tlmivých roztokoch a pri všetkých hodnotách pH
dochádza k vzniku produktu reakcie pri rovnakej vlnovej dĺţke.
Rýchlosť tvorby produktu je v prítomnosti študovaných tlmivých roztokov obdobná, s výnimkou
HEPES pH = 7,0.
DTNB je vo všeobecnosti neporovnateľne stabilnejšie v tlmivých roztokoch HEPES ako v praxi
beţne pouţívaných fosfátových tlmivých roztokoch. Prítomnosť BTC túto skutočnosť neovplyvňuje,
aj keď absolútne hodnoty nameranej absorbancie sa zvyšujú (t.j. DTNB je menej stabilné v
prítomnosti substrátu).
Optimálna hodnota pH vodných roztokov je často jedným z hlavných kritérií ich stability. Doteraz
existuje len málo publikovaných poznatkov zaoberajúcich sa vzťahom stability DTNB a hodnoty pH
tlmivého roztoku. Podľa našich výsledkov sa stabilita DTNB zniţuje so zvyšujúcou sa hodnotou pH.
V biologickom materiáli sa nachádza veľké mnoţstvo zlúčenín, ktoré obsahujú voľné SH-skupiny,
ktoré interagujú s DTNB a prispievajú vo veľkej miere k nešpecifickému signálu. Takýmito
„problémovými” reagentmi sú najmä glutatión, hemoglobín či albumín. Na základe našich výsledkov
môţeme konštatovať, ţe najniţšiu intenzitu nešpecifického signálu v biologických vzorkách sme
zaznamenali pri fosfátovom tlmivom roztoku pH = 7,0 a pri tlmivom roztoku HEPES pH = 7,5.
Záver: Na základe našich výsledkov môţeme konštatovať, ţe zo všetkých študovaných tlmivých
roztokov poskytuje tlmivý roztok HEPES pH = 7,5 najoptimálnejšie podmienky pre Ellmanovu
metódu. Pouţitie tohto tlmivého roztoku umoţňuje merať nízke aktivity cholínesteráz a
zaznamenávať ich aktivitu počas dlhších časových intervalov.
Projekt bol podporený APVV, granty SK-CZ-0028-09 a SK-FR-0031-09.
55
KONSTRUKCE ELEKTROD BIOPALIVOVÉHO ČLÁNKU POMOCÍ KOMBINACE
NANOČÁSTIC
Jaroslav Filip, Ján Tkáč
Chemický ústav Slovenské akademie věd, Bratislava
Úvod: Imobilizované enzymy jako efektivní biologické katalyzátory jsou fundamentálním objektem
biotechnologických studií díky jejich relativně snadné dostupnosti, obnovitelnosti a vysoké selektivitě při
fyziologických podmínkách. Náhrada anorganických katalyzátorů enzymy s vyuţitím zmíněných výhod
je základem konstrukce tzv. biopalivových článků (biofuel cells - BFC). BFC sestává - stejně jako běţný
palivový článek - ze dvou vodivě propojených elektrod; na jedné (anoda) probíhá oxidace substrátu, na
druhé (katoda) redukce depolarizátoru. Reakce jsou katalyzovány enzymy imobilizovanými na povrchu
"bioanody" a "biokatody". Zásadní nevýhodou BFC je nepříznivý poměr velikosti vlastního reaktivního
centra a neaktivního proteinového "balastu" enzymů. To brání generování vysokých proudových hustot v
BFC, nicméně problém se daří efektně řešit s vyuţitím různých vodivých nanomateriálů.
V této práci je zkoumán vliv kombinace různých uhlíkových a zlatých nanočástic na imobilizaci fruktóza
dehydrogenázy (FDH) a bilirubin oxidázy (BOD) a vyuţití takto připravené bioanody a biokatody v BFC
s fruktózou jako palivem.
Materiál a metody: Uhlíkové Glassy carbon (GCE) elektrody byly vyčištěny (postup viz 1 a 2) a
následně modifikovány nanesením disperzí nanočástic, po jejímţ zaschnutí bylo aplikováno 5 μl FDH (3
U.μl-1) nebo 10 μl BOD (0,025 U.μl-1) s inkubací přes noc. Disperze nanočástic: CNT/CHI připravena
sonikací uhlíkových nanotrubiček (CNT; r = 1,1 nm, l = 0,5 – 100 μm) v roztoku chitosanu (CHI, 0,1% v
0,3% kys. octové); CNT/HA sonikací CNT v kyselině hyaluoronové (HA, 0,1% v dest. vodě). Disperze
KB-CNT/CHI připravena smícháním CNT/CHI se směsí KetjenBlack EC 600-JD (KB) a roztoku
chitosanu (viz 2). Měření byla prováděna na potenciostatu PGSTAT 128N (Ecochemie, Utrecht,
Nizozemsko) při tříelektrodovém (s modifikovanou GCE pracovní, Ag/AgCl referenční a Pt pomocnou
elektrodou) nebo dvouelektrodovém (BFC charakteristika) uspořádání.
Výsledky a diskuze: V první sérii experimentů bylo optimalizováno vyuţití zlatých (AuNP) a
uhlíkových nanočástic pro imobilizaci FDH, resp. jejího komplexu se zlatými nanočásticemi
připraveného smícháním roztoku FDH s komerčně dostupnou disperzí AuNP a jejich dvouhodinovou
inkubací. Adsorpcí FDH/AuNP na GCE modifikovanou CNT/HA bylo dosaţeno vyšší proudové odezvy
v přítomnosti 0,2M fruktózy neţ v případě adsorpce na čistou GCE nebo adsorpce samotné FDH na
modifikovanou GCE. V další sérii experimentů byla vyuţita kombinace CNT a sférických uhlíkových
nanočástic KB pro vytvoření stabilního imobilizačního rozhraní vhodného jak pro FDH, tak pro BOD.
Materiály typu KB bývají nejčastěji dispergovány v nepřírodních polymerech (PVDF, PTFE), pro méně
koncentrované disperze lze ovšem vyuţít i přírodní (levnější) polymery (chitosan). Zakomponováním
CNT do disperze lze navíc vodivě propojit jednotlivé částice KB. Jako optimální obsah KB a CNT v KBCNT/CHI byl určen 4,3 mg.ml-1 a 0,67 mg.ml-1, voltamperometrická charakteristika pak dokázala
vhodnost tohoto snadno připravitelného a levného nanorozhraní pro imobilizaci FDH i BOD. Z
optimalizovaných elektrod byl sestrojen biopalivový článek s maximálním výkonovou hustotou 50
μW.cm-2 při napětí 0,3 V.
Závěr: Kombinace dvou druhů nanočástic při konstrukci imobilizačních rozhraní BOD a FDH byla
vyuţita jednak při přípravě komplexu zlatých nanočástic s FDH adsorbovného na povrch GCE
modifikované CNT a dále při přípravě imobilizačního rozhraní se sférickými nanočásticemi vodivě
propojenými nanotrubičkami.
Publikace je součástí realizace projektu "CEntrum pre Materiály, vrstvy a systémy pre Aplikácie a CHemIcké procesy v
extrémNych podmienkAch" (www.machina.sk)
Výsledky jsou součástí:
1) Filip, et al., sborník Študentské vedecké konf. PriF UK 2010, ISBN 978-80-223-2819-7
2) Filip, et al., sborník konference Preveda 2011, ISBN 978-80-970712-1-9
56
VÝVOJ DETEKČNEJ METÓDY NA ŠTÚDIUM INTER-INDIVIDUÁLNEJ VARIABILITY
BUTYRYLCHOLÍNESTERÁZY
Katarína Mrvová, Anna Hrabovská
Katedra farmakológia a toxikológie, Farmaceutická fakulta UK, Odbojárov 10, 832 32 Bratislava
Úvod: Butyrylcholínesteráza (BChE) je sérová hydroláza, ktorá sa podieľa na metabolizme mnohých
liečiv, vychytáva cudzorodé látky a je spätá s mnohými patologickými stavmi. Jednou z jej
zvláštností je vysoká inter-individuálna variabilita aktivity u ľudí. Boli vypracované viaceré
hypotézy, ktoré sa snaţia vysvetliť tento paradox na základe rozdielnych katalytických vlastností
BChE a/alebo rozličnej hladiny expresie génu. Avšak do dnešného dňa neexistujú vhodné metódy,
pomocou ktorých by sa tieto domnienky dali overiť. Nedávno vyvinuté selektívne a špecifické
protilátky poskytujú moţnosť riešiť túto problematiku. Cieľom tohto projektu bolo štúdium interindividuálnej variability BChE, na základe Ellmanovej skúšky a metódy ELISA s pouţitím novosyntetizovaných monoklonálnych protilátok.
Metóda a materiál: BChE sme študovali v plazme 86 zdravých dobrovoľníkov (vek 18- 45, BMI
18,7-27,5). Aktivitu BChE sme merali Ellmanovou skúškou so substrátom butyryltiocholín jodidom
(BTC; 1 mmol/l), v prítomnosti Ellmanovho činidla (DTNB, 0,5 mmol/l), v tlmivom roztoku HEPES
(5 mmol/l, pH = 7,5). V metóde ELISA sme ukotvili sekundárne protilátky, na ktoré sme naviazali
nami pripravené primárne protilátky (11D8) a následne BChE z ľudskej plazmy. Aktivitu zachytenej
BChE sme merali v prítomnosti BTC (1 mmol/l) a DTNB (0,5 mmol/l).
Výsledky a diskusia: Metódu ELISA sme pouţili na meranie aktivity BChE vzťahujúcej sa na
rovnaké mnoţstvo tohto enzýmu. Ellmanovou skúškou sme stanovili aktivitu BChE v zvolenom
objeme plazmy. V prvom kroku sme optimalizovali podmienky obidvoch metód, t.j. na základe
saturačných kriviek sme určili optimálne mnoţstvo 11D8, ľudskej plazmy a koncentráciu BTC.
Inter-individuálnu variabilitu sme následne študovali porovnaním obidvoch získanych aktivít. Na
základe výsledkov bolo moţné sledované vzorky rozdeliť do dvoch skupín: (1) Vzorky s líšiacou sa
aktivitou BChE nameranou podľa Ellmana a totoţnými hodnotami aktivít nameraných metódou
ELISA nasvedčujú rozdielu v hladine enzýmu medzi jedincami. (2) Rozdielna aktivita BChE
nameraná v rovnakom objeme plazmy a korešpondujúca rozdielna aktivita ukotveného rovnakého
mnoţstva BChE nasvedčuje rozdielnym katalytickým vlastnostiam BChE u rôznych dobrovoľníkov.
V tejto sledovanej skupine sme zaznamenali jeden prípad s výrazne nízkou aktivitou BChE
v plazme, a to detegovanou podľa Ellmana aj metódou ELISA. Predpokladáme, ţe sa jedná
o niektorú z mutantných foriem BChE.
Záver: Vyvinuli sme metódu ELISA, ktorú sme následne vyuţili na štúdium inter-individuálnej
varibility BChE. Naše výsledky potvrdili, ţe inter-individuálna variabilita u ľudí je spôsobená
rozdielnou hladinou proteínu BChE a zároveň aj rozličnými katalytickými vlastnosťami enzýmu
v populácii.
Projekt bol podporený APVV grantmi SK-CZ-0028-09 a SK-FR-0031-09.
57
IÓNOVÉ KVAPALINY AKO PROTEÍN STABILIZUJÚCE SYSTÉMY
Jozef Parnica1, Marián Antalík1, 2
1
Katedra biochémie PF UPJŠ Košice, 2Ústav experimentálnej fyziky SAV Košice
Úvod: Iónové kvapaliny predstavujú novú technológiu s potenciálom pre dlhodobé procesy
vyuţiteľné v biochemickom a biotechnologickom priemysle, napr. ako náhrady rozpúšťadiel v
katalytických reakciách alebo tieţ v elektrochemických zariadeniach. Priestor pre vytváranie
iónových kvapalín sa v súčasnej dobe pohybuje v poriadku 1030 zlúčenín. Starostlivým výberom
vhodných katiónov a aniónov je moţné meniť fyzikálne vlastnosti iónových kvapalín a tak môţu byť
tieto systémy prispôsobené, aby spĺňali kritéria konkrétnej aplikácie. To má viesť k zavedeniu
termínu „designer solvents“ [1]. Cieľom našej práce je preskúmať vplyv špeciálnej skupiny iónových
kvapalín „deep eutectic solvents“ (DES) na konformačné prechody a stabilitu modelového proteínu,
cytochrómu c. Termín DES bol vytvorený ako prostriedok na ich rozlíšenie od pravých iónových
kvapalín a tieţ, aby odráţali veľké poklesy v bode tuhnutia (aţ niekoľko sto stupňov celzia)
eutektickej zmesi. DES sa ľahko pripravia v čistej podobe z lacných východiskových materiálov,
zvyčajne tým, ţe zmiešame kvartérnu amónnu soľ s organickým donorom vodíka (obr.1), napr.
amín, amid, alkohol, alebo karbox. kyselina. Získané poznatky ďalej vyuţijeme pri štúdiu interakcií
proteínov s inými biomakromolekulami, alebo látkami potenciálne stabilizujúcimi ich štruktúru.
Taktieţ týmto projektom chceme prispieť k štúdium biomakromolekúl v extrémnych,
vysokošpecifických podmienkach prostredia.
Materiál a metódy: Zloţkami pripravovaných DES ako organického donora vodíka sú okrem iných
(močovina, kys. malonová) aj glukóza a sorbitol v prípade ktorých uţ bol dokázaný stabilizačný
účinok na proteínové štruktúry. Kvartérna amónna soľ je na báze cholin (2-hydroxyethyltrimethylammonium) chloride (ChCl) ako
netoxickej,
bioodbúrateľnej
a beţne
pouţívanej zloţky v priemysle. Finálna
eutektická zmes pozostávala vţdy zo zmesi
dvoch zloţiek v rôznom molárnom pomere. Na
získanie poţadovaných experimentálnych dát
pri našom štúdiu vyuţijeme metódu UV-VIS
absorpčnej spektroskopie a
kruhového
dichroizmu (CD).
Výsledky a diskusia: Z výsledkov CD
spektroskopie
vyplýva,
ţe
najväčší
stabilizačný účinok na cytochróm c má zmes
ChCl + sorbitol. Cukorná zloţka poskytuje vo
Obrázok 1 Schematické znázornenie
všeobecnosti lepšie tepelné stabilizačné účinky
jednotlivých súčasti DES
na štruktúru daného proteínu ako močovina,
alebo kys.malonová. Močovina pôsobí ako
čiastočný denaturant za určitých podmienok a kyselina malonová vďaka svojmu nízkemu pH dodáva
do systému vysoký denaturačný potenciál.
Záver: Proteíny existujú v ţivých bunkách a sú súčasťou rôznych fyziologických procesov (proces
zbaľovania, translokácia cez membránu, atď). Premeny štruktúr a stabilitu proteínov výrazne
ovplyvňujú vzájomne interagujúce proteíny, prítomnosť ligandov a modulátorov ich aktivity ako aj
vplyv samotného prostredia, v ktorom sa proteíny nachádzajú. Hlavným cieľom projektu je príprava
nových jedinečných kombinácii DES s čo najlepšími stabilizačnými vlastnosťami v kombinácii s
biomakromolekulami (proteínmi), či uţ obmenou kvartérnej amónnej soli za jej derivát s podobnými
vlastnosťami, alebo obmenou organického donora vodíka.
Príspevok bol vypracovaný v rámci projektov č. 26220120033 a 26220220061 z ŠF EU, VEGA 2/0038/09, projekt
APVV-0171-10, VVGS UPJS 18/10-11 a VVGS PF 17/2011/Ch
[1] Freemantle M. 1998, Chem. Eng. News, 76, 32–37
58
59
Posterová sekcia
60
CHARAKTERIZÁCIA KVASINKOVÝCH MITOCHONDRIÁLNYCH PRENÁŠAČOV
Ivana Centárová, Igor Zeman
Katedra biochémie, Prírodovedecká fakulta Univerzity Komenského v Bratislave
Úvod: Mitochondriálny metabolizmus vyţaduje prenos substrátov cez vnútornú mitochondriálnu
membránu, ktorá je voľne nepriepustná pre všetky ióny a polárne molekuly. Tento transport
zabezpečuje rodina mitochondriálnych proteínových prenášačov (MCF). Členovia rodiny
mitochondriálnych prenášačov zdieľajú tripartitnú štruktúru, ktorá je charakterizovaná tromi
tandemovými homologickými repetíciami o pribliţnej veľkosti 100 aminokyselín. Kaţdá z repetícií
pozostáva z dvoch transmembránových α-helixov spojených hydrofilnou slučkou. Všetky
transportéry sú kódované jadrovými génmi. Naša práca bola zameraná na funkčnú analýzu génov
patogénnej kvasinky Candida parapsilosis, ktoré sú homologické s génmi kódujúcimi uţ známe
mitochondriálne prenášače Saccharomyces cerevisiae.
Materiál a metódy: V prvej časti našej experimentálnej práce sme sa zamerali na prípravu
konštruktov pre expresiu vybraných génov. Kvasinka C. parapsilosis má neštandardný genetický
kód. Kým triplet CTG kóduje v C. parapsilosis serín, v S. cerevisiae kóduje leucín. Gény, ktoré
CTG kodón obsahujú, sme rekódovali tak, aby boli správne translatované. Druhú časť experimentov
sme venovali funkčnej analýze týchto génov. A to hlavne sledovaniu rastu kmeňov S. cerevisiae
transformovaných pripravenými expresnými vektormi na tuhých médiách a taktieţ meraniu
respirácie týchto transformantov.
Výsledky a diskusia: Študovaných bolo niekoľko vybraných génov, pričom niţšie uvedené
výsledky sa týkajú jedného z nich a to konkrétne génu kódujúceho potencionálny ornitínový
prenášač (CpORT1) z C. parapsilosis. Gén CpORT1 má v svojej sekvencii 3 CTG kodóny, ktoré
boli postupne rekódované: CpORT1-R (L15S, L147S, L184S). Po expresii rekódovanej alely
CpORT1-R došlo k zníţeniu rastu štandardného kmeňa S. cerevisiae BY4742 počas kultivácie pri 37
°C. CpORT1 aj CpORT1-R dokázali komplementovať rastový deficit delečného kmeňa S. cerevisiae
Δort1, pričom spotreba kyslíka týmito bunkami dosahovala vyššiu úroveň ako u štandardného
kmeňa. V kmeni S. cerevisiae BY4742 po expresii génov CpORT1 a CpORT1-R taktieţ dochádzalo
k zvýšeniu bunkovej respirácie. Inhibičný efekt proteínu CpOrt1p na rast buniek S. cerevisiae
BY4742, aj jeho vplyv na ich respiráciu moţno pravdepodobne vysvetliť na základe funkcie
ornitínového prenášača. Jeho hlavná funkcia spočíva v transporte ornitínu do cytoplazmy na úkor
protónového gradientu, kde sa ornitín vyuţíva na syntézu arginínu. V prípade nefyziologickej
nadexpresie prenášača môţe dôjsť k abnormálnemu zníţeniu protónového gradientu, čo sa prejaví
dysfunkciou mitochondrií a následným zhoršením rastu. Zvýšená koncentrácia protónov v matrixe
môţe mať zase za následok zvýšenú aktivitu respiračného reťazca. V opačnom prípade, keď bunky
delečného mutanta S. cerevisiae Δort1 rastú horšie v dôsledku zníţenej hladiny arginínu, by im
expresia ornitínového prenášača mala zabezpečiť transport ornitínu do cytoplazmy, potrebného
pre obnovu biosyntézy arginínu. To korešponduje s pozorovaniami, keď CpOrt1p dokázal
komplementovať rastový aj respiračný deficit delečného kmeňa S. cerevisiae Δort1.
Záver: Identifikovali sme funkčný homológ génu ScORT1 z C. parapsilosis, pretoţe expresia
CpORT1 aj CpORT1-R umoţnila komplementáciu rastového deficitu kmeňa Δort1. V štandardnom
aj v delečnom kmeni Δort1 expresia CpORT1 aj CpORT1-R vedie k zvýšeniu respirácie buniek.
61
VTOK Ca2+ DO MYŠACÍCH TYMOCYTOV
Turáková Katarína, Lakatoš Boris, Michliková Monika, Varečka Ľudovít
Oddelenie Biochémie a Mikrobiológie FCHPT STU, Radlinského 9, 81237 Bratislava,
[email protected]
Úvod: Vápenaté ióny sú veľmi všestranné intracelulárne molekuly, ktoré sa podieľajú na mnohých
rozličných funkciách bunky. Aby sa dosiahla táto všestrannosť, Ca2+-signálny systém pracuje
viacerými spôsobmi, aby reguloval bunkové procesy známe svojim širokým dynamickým rozsahom.
Ide o procesy biogenézy membrán, udrţiavania a distribúcie organel, regulácie vlastností
cytoskeletu, transmembránovej signalizácie, kontraktility, či distribúcie iónov.
Transport Ca2+ v bunkách imunitného systému je zvyčajne študovaný v súvislosti s aktiváciou týchto
buniek mitogénmi a antigénmi, ktoré vo väčšine prípadov spôsobujú dlhotrvajúci vtok vápnika, ktorý
je potrebný pri prenose signálov. Málo sa však vie o homeostáze a transporte Ca2+ v bunkách v stave
pokoja. Cieľom tejto práce bolo zistiť, či v myšacích tymocytoch takýto transport existuje a popísať
jeho základné parametre.
Materiál a metódy: Tymocyty boli izolované vţdy pred experimentom z myší starých 4 aţ 8
týţdňov. Homeostáza vápenatých iónov bola charakterizovaná meraním bazálneho vtoku do
tymocytov pomocou rádioaktívne značeného izotopu vápnika 45Ca2+ a pomocou fluorescenčnej
sondy Fluo-3.
Výsledky a diskusia: Jedným zo základných parametrov vtoku je sledovanie jeho časového
priebehu. Meranie bolo vykonané pri 37 °C v časovom rozmedzí 0 aţ 60 minút. Pokojový vtok Ca2+
bol najrýchlejší počas prvých desiatich minút, ďalej nasledovalo postupné spomaľovanie. Rýchlosť
vtoku počas prvých desiatich minút bola 1,110 nmol.mg-1proteínov/min a v ďalšom priebehu merania
klesla na hodnotu 0,332 nmol.mg-1proteínov/min.
Bazálny vtok Ca2+ bol výrazne závislý na jeho extracelulárnej koncentrácii. Merania pomocou
rádioaktívneho izotopu v koncentračnom rozsahu (0,5 – 10,0; mmol/l) naznačili moţnú
saturovateľnosť tohto procesu pri pomerne nízkej koncentrácii 4,0 mmol/l, avšak merania vykonané
pomocou fluorescenčnej sondy túto moţnosť nepotvrdili.
Pozorovanie závislosti bazálneho vtoku Ca2+ od teploty prostredia ukázala, ţe pasívny vtok vápnika
prebieha najlepšie pri teplote 32 a 37 °C a teplotný kvocient Q10 má hodnotu 1,2. Porovnaním týchto
výsledkov s výsledkami získanými na ľudských lymfocytov bolo zistené, ţe grafický priebeh tejto
závislosti je veľmi podobný, rovnako ako aj teplotné kvocienty Q10.
Závislosť pokojového vtoku Ca2+ od pH extracelulárneho prostredia sledovaná oboma spôsobmi
jasne ukázala, ţe najvhodnejšie podmienky sú pri pH 7,2.
Záver: Dosiahnuté výsledky ukázali, ţe v myšacích tymocytoch existuje bazálny transport vápnika,
ktorý je svojimi parametrami podobný bazálnemu vtoku Ca2+ v iných, nami doteraz študovaných
ţivočíšnych bunkách.
Tento projekt bol podporený grantovou agentúrou VEGA č. 1/0471/11, 1/0650/09 a grantom APVV
VVCE 0064-07-05 „Biomembrány“.
62
Nekaspázové dráhy apoptózy a ich podiel na bunkovej smrti nádorov vystavených
fotodynamickej terapii s hypericínom
Lucia Mikešová, Jaromír Mikeš, Peter Fedoročko
Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta, Univerzita P.J. Šafárika
v Košiciach, Moyzesova 11, 040 01 Košice
Úvod: Keďţe je apoptóza ako komplexne regulovaný fyziologický proces zodpovedná za
odstránenie poškodených, neţiaducich alebo opotrebovaných buniek, narušenie jej regulácie sa často
spája s výskytom mnohých ochorení. Podstatná časť jej signalizácie je sprostredkovaná
mitochondriálnou dráhou, či uţ je vyvolaná vonkajšími alebo vnútornými stimulmi. Poškodenie
funkcie mitochondrií vedie k uvoľneniu mnohých apoptogénnych proteínov z intermembránového
priestoru do cytosolu. Patria k ním predovšetkým cytochróm c, druhý mitochondriálny aktivátor
kaspáz (Smac/DIABLO), HtrA2/Omi, ale aj ďalšie proteíny ako napr. faktor indukujúci apoptózu
(AIF) alebo endonukleáza G (EndoG). Kým niektoré z týchto proteínov stimulujú aktiváciu kaspáz,
iné sa podieľajú na dráhach, ktoré môţu byť od kaspáz nezávislé. Jedným z nich je aj proteín AIF,
ktorý na jednej strane prostredníctvom svojej oxidoreduktázovej funkcie podporuje preţívanie
buniek, ale na druhej strane sa po uvoľnení z mitochondriálneho intermembránového priestoru a
transporte do jadra stáva letálnym faktorom spôsobujúcim chromatínovú kondenzáciu a DNA
fragmentáciu. Preto nekaspázová dráha apoptózy je variáciou klasickej formy apoptózy, ktorá
prebieha bez aktivácie kaspáz alebo paralelne s nimi. Avšak mnohé štúdie sa rozbiehajú v tvrdeniach
o závislosti, resp. nezávislosti pro-apoptotickej funkcie AIF od kaspáz. Úloha AIF a mechanizmus
jeho účinku vo fotodynamickej terapii (PDT) sú doposiaľ málo preskúmané, rozporuplné a v prípade
PDT s hypericínom dokonca úplne neznáme.
Materiál a metódy: Typické apoptotické zmeny v morfológii jadra, viabilite a aktivácii kaspázovej
dráhy boli identifikované pomocou fluorescenčného farbenia bunkového jadra, štiepením
špecifického fluorescenčného substrátu kaspázy 3 a viabilným farbením na fluorescenčnom
mikroskope. Z viacerých testovaných bunkových línií boli následne pre analýzy prietokovou
cytometriou vybrané tri línie pochádzajúce z nádorov hrubého čreva. Sledované boli zmeny
externalizácie fosfatidylserínu, viabilita, metabolická aktivita, aktivácia kaspázy 3 a depolarizácia
mitochondriálnej membrány.
Výsledky a diskusia: Naše doterajšie výsledky ukazujú, ţe v niektorých bunkových modeloch
nádorov hrubého čreva dochádza k deregulácii klasických mechanizmov programovanej bunkovej
smrti indukovanej prostredníctvom PDT s hypericínom, čo naznačuje zapojenie aj alternatívnych
dráh. Pri podrobnejšej analýze sme pozorovali rozdiely v percentuálnom zastúpení buniek s
apoptotickou morfológiou pozitívnych resp. negatívnych na aktiváciu kaspázy 3, ako aj rýchlosť s
akou k nej dochádza. Analýza prietokovou cytometriou priniesla podrobnejšie informácie
o fyziologických zmenách spojených s bunkovou smrťou vyvolanou pôsobením fotodynamickej
terapie s hypericínom.
Záver: Výsledky analýz poukázali nielen na rozdielnu citlivosť testovaných nádorových bunkových
línií, ale aj rozdiely v regulácii programovanej bunkovej smrti z pohľadu aktivácie kaspáz.
Pochopenie týchto mechanizmov nám umoţní cielene sa zamerať na konkrétne molekuly alebo
kompletné signálne dráhy, ktorých regulácia umoţní zvýšiť účinnosť tohto terapeutického prístupu
a tým aj úspešnosť nádorovej terapie. Cieľom bude modifikovať účinnosť PDT tak, aby kaspázové aj
nekaspázové dráhy bunkovej smrti boli iniciované paralelne a zabezpečili tak ukončenie
sebadeštrukčného programu, ktorého pozmenenie alebo zablokovanie je jednou z príčin vzniku
samotného nádoru.
Poďakovanie: Práca bola finančne podporená grantovými projektmi: APVV-0040-10, APVV-032107, LPP-0062-09, VVCE-0001-07, VEGA 1/0475/10, VEGA 1/0626/11 a SEPO II (ITMS
26220120039).
63
DHPLC skríning kauzatívnych mutácií vybraných oblastí génov LRRK2 a parkin u pacientov s
Parkinsonovou chorobou
Csaba Bognár1, Miroslava Kovačovicová1, Marián Baldovič1, Andrea Zaťková1,2, Ľudevít Kádasi1,2
1
Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra molekulárnej biológie,
Mlynská dolina, Bratislava 4, 842 15
2
Ústav molekulárnej fyziológie a genetiky, Slovenská akadémia vied, Vlárska 5, Bratislava 833 34
Úvod: Parkinsonova choroba (Parkinson disease - PD) je po Alzheimerovej chorobe druhé
najčastejšie neurodegeneratívne ochorenie a v priemere postihuje viac ako 1% populácie vo veku nad
55 rokov a viac ako 3,5% nad 75 rokov. Ide o progresívne ochorenie s veľmi variabilným vekom
nástupu (priemer 60 rokov) ako aj klinickým fenotypom. Klinickými prejavmi PD sú pokojový
tremor, bradykinéza, rigidita a strata posturálnych reflexov. Napriek tomu, ţe ide o multifaktoriálne
ochorenie s viacerými genetickými ako aj environmentálnymi faktormi, v súčasnosti je známych uţ
niekoľko génov jadrového genómu, ktorých mutácie sú asociované so vznikom Parkinsonovej
choroby (SNCA, LRRK2, ATP13A2, P2A6G, FBXO7, PARK2, PINK1, DJ-1).
Materiál a metódy: Analýzy boli uskutočnené na súbore 195 DNA vzoriek od slovenských
pacientov vo vekovom rozmedzí 40-91 rokov, diagnostikovaných na Parkinsonovu chorobu na
II.Neurologickej klinike LFUK, Nemocnice Akademika Ladislava Dérera, pracovisko Kramáre.
DNA bola izolovaná z periférnej krvi odobratej do skúmaviek s antikoagulačnou látkou EDTA
pomocou izolačného kitu Qiagen–GENTRA Puregene blood kit (Qiagen) podľa postupu
doporučeného výrobcom. DHPLC (Denaturing High-Performance Liquid Chromatography) analýza
bola prevedená na prístroji WAVE System 3500 (Transgenomic, UK). Vzorky ktoré
vykazovali variantné chromatografické profily pri dHPLC analýze boli následne analyzované
priamym DNA sekvenovaním pomocou BigDye Terminator v 3.1 cycle sequencing kit na prístroji
ABI 3130xl (od firmy Applied Biosystems).
Výsledky a diskusia: Pomocou metódy dHPLC sme uskutočnili skríning na detekciu variantov v
exóne 2, 6, 7 génu parkin a exónov 31, 35, 41, 48 génu LRRK2. Podľa predchádzajúcich výskumov
práve v týchto exónoch boli identifikované najčastejšie patogénne mutácie vedúce ku vzniku
neskorej formy PD. Následne sme sekvenovaním určili zmeny v nukleotidovej sekvencií. Našli sme
rôzne intronické a exonické polymorfizmy, ale ţiadnu doteraz identifikovanú patogenickú mutáciu
asociovanú s PD. Fakt, ţe sme nenašli ţiadnu, doteraz identifikovanú patogenickú mutáciu, môţe
vysvetľovať viacero dôvodov. Okrem vyšetrených génov sú zodpovedné za vznik ochorenia aj iné
gény resp. lokusy (SNCA, ATP13A2, P2A6G, FBXO7, PINK1, DJ-1, PARK3, PARK10, NURR1 a
SNCAIP), v ktorých boli mutácie zriedkavejšie identifikované, ale nemôţeme vylúčiť ich častejší
výskyt v slovenskej populácii. Takisto nemôţeme vylúčiť vzťah environmentálnych faktorov za
vznik ochorenia.
Závery: V našej práci sa nám podarilo úspešne zvládnuť dHPLC analýzu za účelom skríningu
vybraných exónov. Aj keď sme nenašli ţiadnu patogenickú mutáciu, má zmysel pokračovať
v mutačnom skríningu lokusov asociovaných so vznikom PD, pretoţe včasná identifikácia
molekulárnej podstaty umoţňuje presnú diagnostiku a skoré zahájenie liečby. Preto by sme
v budúcnosti chceli rozšíriť spektrum uţ prebiehajúceho mapovania na ďalšie exóny ešte
nezahrnutých génov (najmä SNCA, PINK1, DJ-1) aby sme mohli zachytiť čo najširšiu škálu mutácií
u slovenských pacientov s PD.
64
EXTRACELULÁRNE CHITINÁZY A GLUKANÁZY V PROCESE
EMBRYOGENÉZY NIEKTORÝCH IHLIČNANOV
Lenka Fráterová, Ildikó Matušíková, Ján Salaj, Terézia Salaj
Ústav genetiky a biotechnológií rastlín SAV, Nitra
SOMATICKEJ
Úvod: Somatická embryogenéza (SE) má veľký potenciál na masové a rýchle mnoţenie rastlín v in
vitro podmienkach, vrátane ihličnatých drevín. Je dokázané, ţe tento proces je ovplyvňovaný aj
extracelulárnymi bielkovinami (Wiweger et al. 2003). V našej práci sme sa zamerali na štúdium
vzťahu embryogénneho potenciálu (EP) bunkových línií a extracelulárnych chitináz a glukanáz
vylučovaných týmito líniami. EP sme v bunkových líniách Pinus nigra a hybridných jedlí
charakterizovali na základe štruktúrnych pozorovaní a maturačnej schopnosti somatických embryí.
Materiál a metódy: Chitinázovú a glukanázovú aktivitu sme detegovali v suspenzných kultúrach 17
embryogénnych línií Pinus nigra (11 línií s vysokým a 6 s nízkym EP) a 7 línií hybridných jedlí
Abies alba x A. cephalonica a A. alba x A. numidica (6 línií s vysokým a 1 línia s nízkym EP)
pouţitím elektroforetickej separácie na polyakrylamidových géloch (SDS-PAGE).
Výsledky a diskusia: Mikromorfológia somatických embryí Pinus nigra vykazovala veľkú
variabilitu, niţšia variabilita bola pozorovaná v hybridných jedliach, čo sa odzrkadlilo aj
v rozdielnom EP skúmaných línií.
V suspenzných kultúrach P. nigra sme detegovali 9-11 izoforiem chitináz a v suspenzných kultúrach
jedlí 5-9 izoforiem chitináz. Zistené rozdiely v profiloch extracelulárnych chitináz u oboch druhov
svedčia o heterogenite testovaných línií. V suspenzných kultúrach 9 línií P. nigra s vysokým a 3 línií
s nízkym EP sme detegovali 6 izoforiem glukanáz. U hybridných jedlí sme analyzovali 6
embryogénnych línií s vysokým EP, najčastejšie s 1 izoformou glukanázy. Väčší počet detekovaných
izoforiem extracelulárnych chitináz v kultivačnom médiu embryogénnych pletív môţe naznačovať,
ţe v procesoch SE práve tieto enzýmy zohrávajú komplexnejšiu úlohu ako glukanázy. Naše výsledky
sú v súlade s tvrdeniami iných autorov, ţe zvýšenie hladiny extracelulárnych bielkovín chitináz
a glukanáz je doprovodným znakom procesu somatickej embryogenézy (Kragh et al. 1991;
Helleboid et al. 2000; Wiweger et al. 2003).
Záver: Analýzy profilov extracelulárnych chitináz a glukanáz v kultivačných médiách
embryogénnych línií naznačujú, ţe pravdepodobne neexistuje priama súvislosť medzi prítomnosťou
alebo absenciou konkrétnej izoformy chitinázy či glukanázy s embryogénnym poteciálom
sledovaných druhov.
Poďakovanie: Práca bola financovaná z projektu VEGA 2/0144/11.
Literatúra
HELLEBOID, S. – HENDRIKS, T. – BAUW, G. – INZE, D. – VASSEUR, J. – HILBERT, J. L. 2000. Three major
somatic embryogenesis related proteins in Cichorium identified as PR proteins. In Journal of Experimental Botany,
roč. 51, 2000, č. 348, s. 1189-1200.
KRAGH, K. M. – JACOBSEN, S. – MIKKELSEN, J. D. – NIELSEN, K. A. 1991. Purification and characterization of
three chitinases and one β-1,3-glucanase accumulating in the medium of cell suspension cultures of barley
(Hordeum vulgare L.). In Plant Science, roč. 76, 1991, č. 1, s. 65-77.
WIWEGER, M. – FARBOS, I. – INGOUFF, M. – LAGERCRANTZ, U. – VON ARNOLD, S. 2003. Expression of
Chi4-Pa chitinase genes during somatic and zygotic embryo development in Norway spruce (Picea abies):
similarities and differences betwen gymnosperm and angiosperm class IV chitinases In Journal of Experimental
Botany, roč. 54, 2003, č. 393, s. 2691-2699.
65
CHEMICKÁ ANALÝZA ODRÔD PŠENICE LETNEJ (TRITICUM AESTIVUM L.) S DÔRAZOM
NA ICH ZDRAVIU PROSPEŠNOSŤ
Renáta Kozáková, Lenka Duchoňová, Ernest Šturdík
Ústav biochémie, výživy a ochrany zdravia FCHPT STU Bratislava
Úvod: V súčasnej dobe je venovaná veľká pozornosť obilninám z hľadiska ich potenciálneho
vyuţitia vo vývoji funkčných potravín. Trendy širšieho vyuţívania obilnín v ľudskej výţive súvisia
predovšetkým so snahou zvýšiť spotrebu vlákniny, a tým podporiť jeden z faktorov zohrávajúcich
dôleţitú úlohu v boji proti niektorým civilizačným chorobám. Ďalším z faktorov, ktoré tieţ zvyšujú
funkčnosť potravín a zatiaľ sa mu u nás nevenuje takmer ţiadna pozornosť je nestráviteľný tzv.
rezistentný škrob (RS). Pre jeho priaznivý vplyv na fyziológiu trávenia sa označuje za prebiotikum
novej generácie diétnej vlákniny. Prínosom pre verejné zdravie by mohla byť zvyšujúca sa
dostupnosť chutných celozrnných (vysokovlákninových) výrobkov, napr. celozrnného chleba.
Materiál a metódy: V práci boli pouţité vybrané genotypy hexaploidnej pšenice letnej (Triticum
aestivum L. spp. aestivum). Konkrétne išlo o 17 genotypov (odrôd) pšenice letnej formy ozimnej
z kolekcie genetických zdrojov Génovej banky Slovenskej Republiky pri CVRV-VÚRV Piešťany.
Genotypy pochádzali z oblasti Malý Šariš, ročník 2008 a oblasti Borovce, 2009.
V rámci analýzy nutričných parametrov boli odrody podrobené nasledovným meraniam: stanovenie
vlákniny podľa normy STN 56 0031, popola v podľa STN 560512 – 8 (560512), bielkovín podľa
STN 56003, mokrého lepku v odrodách pšenice podľa STN EN ISO 21415 – 1 (461034), celkového
škrobu podľa Ewersa, amylózy a amylopektínu podľa normy STN EN ISO 6647 – 1:2007,
rezistentného škrobu analytickou súpravou Megazyme International Ireland Ltd.
Výsledky a diskusia: Obsah bielkovín predstavuje dôleţitý parameter technologickej kvality. Jeho
vyššie hodnoty boli zistené v odrodách MS 1544, Ilona, Hybred, Ilias a Torysa (13,26 %; 12,93 %;
12,76 %; 12,52 %; 12,20%). Najvyšší obsah škrobu bol zistený v odrodách Torysa (71,36 %)
a Malyska (70,17 %). Najviac rezistentného škrobu sa zistilo v genotypoch Torysa (1,67 %)
s potravinárskou kvalitou 4 (B) a Perceval (1,45 %) s potravinárskou kvalitou B. Preukázalo sa, ţe
obsah rezistentného škrobu úzko súvisí s obsahom amylózy v škrobovom zrne. Z hľadiska obsahu
vlákniny sú vhodné odrody Hybred (15,1 %), Magvas (14,3 %), Malvína a Hermann (13,4 %).
Posúdením všetkých získaných výsledkov sme dospeli k výberu odrôd pšenice letnej, ktoré by
spĺňali poţiadavku na nutričnú i technologickú kvalitu a zároveň mali zvýšený obsah zdraviu
prospešnej zloţky – vlákniny a rezistentného škrobu. Medzi takéto odrody sme zaradili genotypy
Torysa, Hybred, Clarus a Perceval.
Záver: Z uvedených výsledkov je zrejmé, ţe medzi analyzovanými odrodami pšenice existuje
variabilita. Na výrobu funkčnej potraviny, pšeničného chleba so zvýšeným obsahom vlákniny
a rezistentného škrobu, je zvlášť vhodný genotyp Torysa, má najvyšší obsah RS a vyššie hodnoty
ďalších nutričných komponentov a napriek tomu má dobrú chlebopekársku kvalitu (B). Okrem
odrody Torysa sa veľmi vhodnou voľbou zdá byť aj odroda Hybred, ktorá predstavuje hybridný druh
pšenice. Bol v nej zistený najvyšší obsah vlákniny a vyššie hodnoty ďalších parametrov a taktieţ
spĺňa aj poţiadavku na technologickú kvalitu (B).
Táto práca vznikla za podpory Agentúry Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu SR pre štrukturálne fondy EÚ,
operačného programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja realizovaním projektu
„Hodnotenie prírodných látok a ich výber pre prevenciu a liečbu civilizačných ochorení“ (ITMS 26240220040) a APVV
VMSP-II-0024-09.
66
APLIKÁCIA PRIETOKOVEJ CYTOMETRIE PRI SEPARÁCII CD133+ KMEŇOVÝCH BUNIEK
Z KOSTNEJ DRENE
J. Mlynárová1, P. Musil1, K. Stahlová1, L. Menšíková1, M. Hulman2,
J. Kyselovič1.
1
Katedra farmakológie a toxikológie, Farmaceutická fakulta UK v Bratislave, 2Národný ústav
srdcových a cievnych chorôb v Bratislave
Úvod: Výskum v oblasti vyuţitia kmeňových buniek ako terapeutického postupu sa stále viac
zameriava na aplikáciu kmeňových či progenitorových buniek pri nehematologických ochoreniach.
V súčasnosti existuje niekoľko prebiehajúcich alebo ukončených klinických štúdií, ktoré sledujú
moţnosť vyuţitia kmeňových buniek kostnej drene pri kardiovaskulárnych ochoreniach (rôzne
formy ischemickej choroby srdca, dilatačná kardiomyopatia). Takýmito bunkami sú aj CD133 +
kmeňové bunky. V našej práci sa zameriavame na CD133+/CD34+/CD45dim bunky pre ich moţné
vyuţitie pri terapii ischemickej choroby srdca. Našim cieľom bolo vyseparovať dané bunky z kostnej
drene, identifikovať a určiť ich počet pomocou prietokovej cytometrie.
Materiál a metódy: Vybrané kmeňové bunky sme separovali z kostnej drene získanej zo sterna.
Odber kostnej drene bol vykonaný u pacienta s ischemickou chorobou srdca pred zahájením
aortokoronárneho bypassu. Kostnú dreň sme inkubovali s magneticky značenou protilátkou na
CD133 marker a ďalej spracovali pomocou CliniMACS cell separation system. Na identifikáciu
a určenie počtu poţadovaných CD133+ buniek sme pouţili prietokovú cytometriu. Analýzu buniek
sme vykonali na základe povrchových markerov CD133, CD34 a CD45.
Výsledky a diskusia: Z odobratých 50ml kostnej drene sme oddelili dve frakcie: pozitívnu frakciu
s CD133+ bunkami (100ml) a negatívnu frakciu s CD133- bunkami (200ml). Pomocou prietokovej
cytometrie sme overili prítomnosť poţadovaných buniek v pozitívnej frakcii a určili ich počet.
Rovnako sme analyzovali aj negatívnu frakciu a kostnú dreň pred spracovaním. Získali sme frakciu
CD133+ buniek s 54% ţivotaschopnosťou. Tieto CD133+ bunky tvorili asi 10% celkových CD133+
buniek v kostnej dreni.
Záver: Kostná dreň je známy a vyuţivaný zdroj kmeňových buniek. Nám sa podarilo pripraviť
frakciu CD133+ kmeňových buniek z kostnej drene.
Projekt bol podporený grantmi: 1/0109/08, VEGA 1/0357/09,
FaF UK 23/2011, FaF UK 33/2011, Biomakro 2- ITMS 26240120027
67
VEGA
1/0786/11,
ŠTÚDIUM FUNKCIE PREDPOKLADANÉHO ABC TRANSPORTÉRA
MSMEG_3119/MSMEG_3118/MSMEG_3117 V MYKOBAKTÉRIÁCH
Michal Šarkan, Katarína Mikušová, Jana Korduláková
Katedra biochémie, Prírodovedecká fakulta UK v Bratislave
Úvod: Bunková stena mykobaktérií tvorí vysoko nepriepustnú hydrofóbnu bariéru, ktorá je pre
viabilitu týchto baktérií esenciálna. Jadro mykobakteriálnej bunkovej steny je tvorené kovalentne
viazanými molekulami peptidoglykánu, arabinogalaktánu a mykolových kyselín, ktoré spolu
vytvárajú tzv. mykolylarabinogalaktánpeptidoglykánový komplex lokalizovaný priamo nad
plazmatickou membránou (Kaur a kol., 2009). Heteropolysacharid arabinogalaktán je tvorený z
arabinánovej a galaktánovej zloţky a disacharidového mostíka, ktorý umoţňuje pripojenie galaktánu
na peptidoglykán. Neredukujúci koniec arabinánu je esterifikovaný mykolovými kyselinami, ktoré
spolu s extrahovateľnými lipidmi tvoria vonkajšiu membránu mykobaktérií. Významnou súčasťou
mykobakteriálnej bunkovej steny sú rôzne glykolipidy a lipoglykány.
Štruktúra jednotlivých zloţiek bunkovej steny mykobaktérií je v súčasnosti pomerne dobre
objasnená a bolo identifikovaných viacero enzýmov zúčastňujúcich sa ich biosyntézy. Poznatky o
prenose jednotlivých intermediátov cez plazmatickú membránu však dodnes chýbajú.
Náš projekt sa zameriava na objasnenie funkcie predpokladaného ABC transportéra
Rv1458c/Rv1457c/Rv1456c z Mycobacterium tuberculosis. Gény kódujúce tento transportér sa
nachádzajú v bezprostrednej blízkosti génu rv1459c, ktorý na základe výsledkov našej skupiny
kóduje arabinozyltransferázu zúčastňujúcu sa biosyntézy mykobakteriálneho arabinánu.
Materiál a metódy: Funkciu predpokladaného transportéra sme sa pokúsili odhaliť analýzou
kmeňov M. smegmatis, ktoré majú ortológy génov rv1456c (MSMEG_3117) a rv1457c
(MSMEG_3118) kódujúcich jednotlivé transmembránové podjednotky prerušené fragmentom
kódujúcim rezistenciu voči kanamycínu. Tieto kmene sme pripravili pomocou alelovej výmeny
štandardnej kópie študovaného génu za kópiu prerušenú Km kazetou, pričom sme vyuţili plazmid
pJQ200, ktorý nesie gény pre levansacharázu a katechol-2,3-dioxygenázu umoţňujúce selekciu
príslušných mutantných kmeňov. Následne sme sa zamerali na analýzu lipidov, lipoglykánov a
zloţenia bunkových stien pripravených kmeňov.
Výsledky a diskusia: Analýza fenotypov pripravených kmeňov odhalila, ţe predovšetkým v kmeni
M. smegmatis MSMEG_3117::Km dochádza v porovnaní so štandardným kmeňom k zníţenej tvorbe
lipopolysacharidov lipomanánu a lipoarabinomanánu a k akumulácii fosfatidylinozitolmanozidov,
ktoré predstavujú medziprodukty v biosyntéze týchto lipopolysacharidov. Štúdium
monosacharidového zloţenia bunkovej steny tohto kmeňa ukázalo taktieţ výrazne zníţený obsah
arabinózy v porovnaní so štandardným kmeňom. Redukciu arabinánovej zloţky arabinogalaktánu, a
teda zníţenie mnoţstva akceptora pre kovalentné naviazanie mykolových kyselín potvrdila aj
pozorovaná akumulácia trehalózamonomykolátov a trehalózadimykolátov v lipidovej frakcii
mutantného kmeňa. Tieto estery trehalózy predstavujú donorové molekuly mykolových kyselín
viazaných na bunkovú stenu. Pozorovaný fenotyp bol komplementovateľný funkčnou kópiou génu
rv1456c z M. tuberculosis.
Záver: Naše výsledky naznačujú, ţe predpokladaný ABC transportný systém
MSMEG_3119/MSMEG_3118/MSMEG_3117
z
M.
smegmatis
a
jeho
ortológ
Rv1458c/Rv1457c/Rv1456c z M. tuberculosis sa zúčastňujú prenosu medziproduktov biosyntézy
mykobakteriálneho arabinánu v bunkovej stene mykobaktérií.
Literatúra: Kaur, D., Guerin, M. E., Škovierová, H., Brennan, P. J. and Jackson, M. (2009)
Biogenesis of the cell wall and other glycoconjugates of Mycobacterium tuberculosis. Adv. Appl.
Microbiol. 69, 23 – 79.
Práca bola podporená grantom APVV-0499-07.
68
HETEROTRANSGLYKOZYLAČNÉ AKTIVITY PROTEÍNOV V SEMENÁCH
KAPUCÍNKY (TROPAEOLUM MAJUS)
Zuzana Zemková1, Dana Flodrová2, Jiří Šalplachta2, Ivan Zelko1, Renáta Vadkertiová1, Vladimír
Farkaš1, Eva Stratilová1
1
Chemický ústav, Slovenská akadémia vied, Dúbravská cesta 9, SK-845 38 Bratislava, Slovenská
republika,2Ústav analytickej chémie, Akadémia vied Českej republiky, Veveří 97, CZ-60200 Brno,
Česká republika
Úvod: Bunková stena rastlín je komplexná štruktúra zodpovedná za mechanické vlastnosti bunky
a interakcie rastlín s vonkajším prostredím. Je zloţená z komplexu polysacharidov, lignínu
a proteínov. K štrukturálnym zmenám komponentov bunkovej steny dochádza pôsobením rozličných
enzýmov. Enzým xyloglukánendotransglykozyláza (XET, EC 2.4.1.207) katalyzuje štiepenie β-(1-4)
glykozidových väzieb molekuly xyloglukánu (XG). Časť pôvodného reťazca XG, ktorá obsahuje
novovzniknutý redukujúci koniec, je prenášaná na hydroxylovú skupinu C-4 glukózovej jednotky
neredukujúceho konca akceptorovej molekuly XG alebo xyloglukánoligosacharidu (XGOS). Okrem
typickej transglykozylačnej reakcie katalyzovanej XET medzi substrátovými pármi XG/XGOS, bol
v semenách kapucínky popísaný aj nový typ transglykozylácie, heterotransglykozylácia, ktorá
predstavuje reakciu, kde akceptor a donor sú polysacharidy rozličného typu. Tieto aktivity boli
pripísané nešpecificite majoritnej formy XET. Prítomnosť iného typu heterotransglykozyláz ako
XET sa zatiaľ na molekulárnej úrovni v rastlinách potvrdiť nepodarilo.
Materiál a metódy: Na stanovenie transglykozylačných aktivít sa vyuţívajú fluorescenčne značené
oligosacharidy. Zabudovanie donora do takýchto akceptorov sme v tejto práci sledovali
v bielkovinových extraktoch získaných z klíčiacich semien kapucínky pomocou HPLC, na systéme
Hewlett Packard 1100 s pouţitím fluorescenčného detektora. Reakčné zmesi boli pred analýzou
inkubované pri laboratórnej teplote a v rozličných časových intervaloch. Viazanie fluorescenčne
značených oligosacharidov sa tieţ sledovalo priamo v bunkách mikroskopicky, s pouţitím
fluorescenčného mikroskopu Nikon Eclipse 80i.
Výsledky a diskusia: Metódou HPLC sa podarilo potvrdiť popísané heteroaktivity a detegovať
heterotransglykozylačné aktivity na nové, doposiaľ neznáme donor/akceptorové páry
(XG/arabinoxylooligosacharidy,
laminarín (LAM)/XGOS, XG/arabinogalaktooligosacharidy,
XG/manooligosacharidy, XG/galaktomanooligosacharidy, galaktomanán/XGOS, β-(1-3,1-4)glukán/XGOS). Do pustulooligosacharidov (PUOS) boli inkorporované časti XG, LAM
a hydroxyetylcelulózy (HEC). Mikroskopickým pozorovaním sa potvrdilo zabudovanie
fluorescenčne značených oligosacharidov do primárnej bunkovej steny, kde je lokalizovaná XET.
Výnimkou boli PUOS, ktoré sa prednostne zabudovávali do plazmatickej membrány, kde je
syntetizovaná celulóza.
Záver: Výsledky poukazujú na ešte širšie spektrum donor/akceptorových párov, ktorých reakciu je
schopná katalyzovať nešpecifická majoritná forma XET v klíčiacich semenách kapucínky, ako aj na
prítomnosť nového, zatiaľ nepopísaného heterotransglykozylačného enzýmu, ktorý je schopný
vyuţívať ako akceptor PUOS.
Táto práca vznikla vďaka podpore operačného programu Výskum a vývoj pre projekt Centrum
excelentnosti pre bielo-zelenú biotechnológiu, ITMS 26220120054, spolufinancovaný zo zdrojov
Európskeho fondu regionálneho rozvoja a grantov VEGA 2/0005/10, 2/0011/09, 2/0046/10, ako aj
Výskumného plánu AV0Z40310501 Ústavu analytickej chémie, Akadémie vied Českej republiky
69
Zoznam účastníkov
1
Ambro Ľuboš, Mgr.
[email protected]
2
Babic Stanislav, Mgr.
[email protected]
3
Blesák Karol, Mgr.
[email protected]
4
Bognár Csaba, Mgr.
[email protected]
5
Bubenčíková Tatiana, Mgr.
[email protected]
6
Bučko Marek, PhD.
[email protected]
7
Centárová Ivana, Mgr.
[email protected]
8
Danihelová Martina, Mgr.
[email protected]
9
Dingová Dominika, Mgr.
[email protected]
10
Duchoňová Lenka, Mgr.
[email protected]
11
Dugovičová Lea, Mgr.
[email protected]
12
Filip Jaroslav, Ing.
[email protected]
13
Fráterová Lenka, Mgr.
[email protected]
14
Frimmel Karel, Ing
[email protected]
15
Garaiová Martina, Mgr.
[email protected]
16
Gogola Daniel, Ing.
[email protected]
17
Hatok Jozef, PhD
[email protected]
18
Kaţmérová Zuzana, Mgr.
[email protected]
19
Kliková Katarína, Mgr.
[email protected]
20
Kohut Peter, PhD.
[email protected]
21
Kovalská Mária, Mgr.
[email protected]
22
Kozákova Renata, Mgr.
[email protected]
23
Kučera Matej, Mgr.
[email protected]
24
Lichvárová Lucia, Mgr.
[email protected]
25
Madacki Ján, Mgr.
[email protected]
26
Messingerová Lucia, Mgr
[email protected]
27
Mikeš Jaro, Mgr.
[email protected]
28
Mikešová Lucia, Mgr.
[email protected]
29
Mikuš Ľubomír, Ing.
[email protected]
30
Mikušova Lucia, Mgr.
[email protected]
31
Miláčková Ivana, Mgr.
[email protected]
32
Mlynárová Jana, Mgr.
[email protected]
33
Mrvová Katarína, Mgr.
[email protected]
34
Némethová Martina, Mgr.
[email protected]
35
Niţnanský Ľuboš, Ing.
[email protected]
36
Parnica Jozef, RNDr
[email protected]
37
Plšíková Jana, Mgr.
[email protected]
38
Prčina Michal, Ing..
[email protected]
39
Radvák Peter, Mgr.
[email protected]
40
Šarkan Michal, Bc.
[email protected]
41
Ševčík Róbert, PhD.
[email protected]
70
42
Stano Matej, Mgr.
[email protected]
43
Štefániková Andrea, Ing.
[email protected]
44
Tomášková Zuzana, PhD.
[email protected]
45
Turaková Katarína, Ing.
[email protected]
46
Vandruţová Anna, RNDr.
[email protected]
47
Zemková Zuzana, Ing.
[email protected]
Odborná komisia
1.
2.
prof. RNDr. Ľudovít Varečka, DrSc – predseda
RNDr. Imrich Barák, DrSc.
3. RNDR. Miroslav Barančik, DrSc
4. doc. Ing. Albert BREIER, DrSc.
[email protected]
[email protected]
[email protected]
[email protected]
5.
MVDr. Juraj KOPÁČEK DrSc
[email protected]
6.
doc. MVDr. Juraj KOPPEL, DrSc.
[email protected]
7.
doc. Ing. Oľga KRIŢANOVÁ, DrSc.
[email protected]
8.
doc. RNDr. Peter RAČAY, CSc.
[email protected]
9.
Ing. Zdena SULOVÁ, CSc.
[email protected]
10.
doc. Ing. Ernest ŠTURDÍK, CSc.
[email protected]
71
Sponzori Drobnicovho memoriálu
1.
EUFC s.r.o.
2.
Neulogy a.s.
3.
ProScience Tech s.r.o.
4.
Roche Slovakia
5.
BioTech a.s.
72
EUFC s.r.o. spoločne so spoločnosťou
Inowell s.r.o. sa zameriava na oblasť
informačných technológií, biotechnológií,
ergonómie a strojárstva. Prioritou sú projekty,
ktorých príleţitosti a riziká sú vyváţené a
ktoré je moţné efektívne a flexibilne uplatniť
v konkurenčnom prostredí. Máme záujem o
inovácie s jasne definovaným komerčným
potenciálom, ktoré sú v pokročilom štádiu
výskumu či vývoja. Pre tvorcov inovácií
vytvoríme právnu a finančnú štruktúru, ktorá
im umoţní rozvíjať inovácie v symbióze s
poţiadavkami
investorov.
Vytvorenú
štruktúru následne naplníme aktívnym
managementom orientovaným na dosiahnutie
spoločne definovaných cieľov. Pre podniky
prinášame
podporu
ich
inovatívnych
projektov, ktorá im umoţnia efektívnu cestu
k novým produktom alebo sluţbám. V oblasti
inovatívnej infraštruktúry podporujeme vznik
klastrov a efektívnu spoluprácu súkromného
a verejného sektora.
73
Ef
ekt
í
vnel
abor
at
ór
i
um j
enašapr
i
or
i
t
a
Kľ
úč
om k ús
pec
hu ak
éhok
oľ
vek vedec
k
ovýs
k
umného pr
oj
ek
t
u j
e opt
i
mál
ne t
ec
hnol
ogi
c
k
é
a ma
t
er
i
ál
ové vyba
veni
e. Pr
oSc
i
enc
e Tec
h ponúk
a kompl
exné sl
užby pr
e r
ôznor
odý t
yp
výskumnýc
hč
i
nnos
t
í
,od z
ák
l
adného ažpo apl
i
k
ovaný výs
k
um,na úr
ovniak
ademi
c
k
ýc
hi
nš
t
i
t
úc
i
íaj
k
omer
č
nýc
hs
pol
oč
nos
t
í
.
Vybudovani
e k
val
i
t
ného z
áz
emi
a výs
k
umu s
i vyž
aduj
e k
ompl
exný pohľ
ad. Pr
oSc
i
enc
e Tec
h
vys
t
upuj
e v poz
í
c
i
i i
nt
egr
át
or
a r
i
ešení t
ec
hnol
ogi
c
k
ého a ma
t
er
i
ál
ového vyba
veni
a.
To,ž
e nepr
ez
ent
uj
eme j
ednu z
nač
k
u,pl
a
t
f
or
mu al
ebo t
ec
hnol
ógi
u,nám dá
va pot
r
ebnú nezávi
sl
os
ť
as
c
hopnos
ťpr
i
ni
es
ťz
ák
az
ní
k
ovi
opt
i
mál
ner
i
ešeni
evakej
koľ
vekobl
as
t
ivýskumu.
Sl
užby
•Audi
tpr
oc
esov
•Pr
i
eskum t
r
huavyhodnot
eni
e
•Por
adenst
voar
ef
er
enci
evobl
ast
ivýskumnýcht
echnol
ógi
í
•St
r
at
egi
cképor
adenst
vo
•Real
i
záci
adodávok
•Tr
ansf
ert
echnol
ógi
í
Pr
e pr
i
ame k
onz
ul
t
ác
i
e na
vš
t
í
vt
e pr
os
í
m naš
us
t
r
ánku www.
pr
osc
i
enc
et
ec
h.
sk
Pr
oSc
i
enc
eTec
hs
.
r
.
o.
,
Dobš
i
ns
k
ého20,
81105Br
at
i
s
l
a
va
www.
pr
os
c
i
enc
et
ec
h.
s
k
Tel
:+421220721099
Fax:
+421220721099
Emai
l
:
i
nf
[email protected]
os
c
i
enc
et
ec
h.
s
k
Váš partner vo vede a výskume
Široká škála reagencií a kitov pre :
Genomiku
Proteomiku
Bunkovú biológiu
Molekulárnu biológiu
www.roche-applied-science.com
Vladislav Cucak
[email protected]
(tel: +421 918 707 774)
Špičkové systémy pre :
Real-Time PCR
Automatizovanú extrakciu NK
Sekvenovanie DNA
Bunkovú biológiu
Real-Time bunkové analýzy
Microarray
Download

Zborník prispevkov a program - Institute Of Molecular Physiology