UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE
JESSENIOVA LEKÁRSKA FAKULTA V MARTINE
ÚSTAV LEKÁRSKEJ BIOLÓGIE
CHROMOZÓMOVÉ ABERÁCIE A POLYMORFIZMUS
VYBRANÝCH GÉNOV U ZDRAVOTNÍCKYCH PRACOVNÍKOV
PROFESIONÁLNE EXPONOVANÝCH GENOTOXICKÝM LÁTKAM
RNDr. ĽUDOVÍT MUŠÁK, PhD.
HABILITAČNÁ PRÁCA
MARTIN 2009
1
Ďakujem MUDr. Pavlovi Vodičkovi, CSc. z Ústavu experimentální medicíny
Akademie věd ČR v Prahe; MUDr. Ludmile Vodičkovej, CSc. a RNDr. Pavlovi
Součkovi, CSc zo Státního zdravotního ústavu v Prahe za veľmi prospešnú a plodnú
spoluprácu pri stanovovaní polymorfizmov DNA reparačných génov a génov pre
enzýmy metabolizmu xenobiotík, bez ktorej by túto habilitačnú prácu nebolo možné
napísať, za pomoc, mnohé cenné rady a pripomienky, ktoré sa týkajú génových
polymorfizmov.
Ďakujem Doc. RNDr. Erike Halašovej, PhD., a Doc. MUDr. Otovi Osinovi, PhD.,
za materiálovú pomoc, podporu a ostatným spolupracovníkom a kolegom za podporu
a toleranciu.
Manželke Soni a deťom Oliverovi a Ivanke ďakujem za toleranciu, trpezlivosť a
podporu.
2
Obsah
Zoznam použitých skratiek ............................................................................. 5
1
ÚVOD ..................................................................................................... 7
2
CIEĽ PRÁCE ........................................................................................ 9
3
PREHĽAD LITERÁRNYCH ÚDAJOV ............................................. 11
3.1
3.1.1
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.1.5
GENOTOXICKÉ LÁTKY A RIZIKO EXPOZÍCIE .....................................
Charakteristika genotoxických látok .......................................................
Mutácie a mutagénny .............................................................................
Karcinogény a karcinogenéza ...............................................................
Teratogény a ich účinky .........................................................................
Účinok expozície genotoxickým látkam ..................................................
11
11
13
14
17
17
3.2
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
BIOMARKERY A ICH ROZDELENIE .......................................................
Biomarkery expozície ...........................................................................
Biomarkery účinku ...................................................................................
Biomarkery vnímavosti ............................................................................
Význam stanovenia biomarkerov ............................................................
21
22
27
27
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
CELKOVÉ ANESTETIKÁ A ICH CHARAKTERISTIKA ...........................
Plynné inhalačné anestetiká ....................................................................
Kvapalné (prchavé) inhalačné anestetiká ................................................
Toxický a genotoxický účinok anestetík ...................................................
28
28
28
32
3.4
ANTINEOPLASTICKÉ LIEKY A ICH CHARAKTERISTIKA ..................... 37
3.4.1 Rozdelenie cytostatík a ich účinok ........................................................... 37
3.4.2 Toxický a genotoxický účinok .................................................................. 39
3.5
XENOBIOTIKÁ A ENZÝMY ICH METABOLIZMU .................................... 44
3.5.1 Definícia xenobiotík ................................................................................. 44
3.5.2 Gény a enzýmy metabolizmu xenobiotík (XME) ....................................... 45
3.6
DNA REPARÁCIA ................................................................................... 56
3.6.1 Jednotlivé typy opráv ................................................................................ 57
3.6.2 Reparačné gény DNA a ich produkty ........................................................ 60
3.7
GENETICKÝ POLYMORFIZMUS ............................................................ 71
3.7.1 Expozícia prostrediu a genetické zmeny .................................................. 71
3.7.2 Individuálna vnímavosť ............................................................................. 72
4
MATERIÁL A METÓDY ..................................................................... 75
4.1
CHARAKTERISTIKA SÚBOROV ............................................................. 75
3
4.1.1 Profesionálna expozícia anestetikám ....................................................... 75
4.1.2 Profesionálna expozícia cytostatikám ............................................ ......... 77
4.1.3 Kontrolný súbor ....................................................................................... 78
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
POPIS JEDNOTLIVÝCH METODÍK ......................................................
Analýza chromozómových aberácií ........................................................
Polymorfizmus génov kódujúcich enzýmy metabolizmu xenobiotík ......
Polymorfizmus DNA reparačných génov ...............................................
Štatistické hodnotenie ............................................................................
79
79
81
84
87
5
VÝSLEDKY ........................................................................................... 88
5.1
BIOMARKERY GENOTOXICKÝCH ÚČINKOV ......................................... 88
5.2
HODNOTENIE POLYMORFIZMOV GÉNOV PRE ENZÝMY
METABOLIZMU XENOBIOTÍK .................................................................. 96
5.3
HODNOTENIE POLYMORFIZMOV DNA REPARAČNÝCH GÉNOV ...... 108
6
DISKUSIA ............................................................................................ 124
6.1
PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA ANESTETIKÁM .................................... 125
6.2
PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA CYTOSTATIKÁM................................... 130
7
ZÁVER ..................................................................................................... 135
7.1
PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA ANESTETIKÁM ...................................... 135
7.2
PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA CYTOSTATIKÁM ................................... 137
8
ZOZNAM LITERATÚRY ...................................................................... 141
Zoznam obrázkov, tabuliek a grafov ................................................................ 165
Prílohy ................................................................................................................. 170
4
Zoznam použitých skratiek
ADH
ALDH
ALL
AML
AP miesto
APTX
AT
B(a)P
BD
BER
BLM
COMT
CP
CPD
CPD
CS
CYP
DSB
DSBR
EH
EO
EPHX1
GSH
GST
HFIP
hOGG1
HPRT
HR
CHA
CHSA
CHTA
IARC
mEH
MGMT
MI
MM
MMC
MMR
MN
MTX
NAT
NBS
NER
NHEJ
NPEL
NQO
O6MeG
PARP
PAU
PCNA
PCR
– alkoholdehydrogenáza
– aldehyddehydrogenáza
– akútna lymfoblastická leukémia
– akútna myeloidná leukémia
– apurínové, apyrimidínové miesto
– aprataxin
– ataxia-telangiectasia
– benzo(a)pyrén
– 1,3-butadién
– bázová excízna oprava
– bleomycín
– katechol O-metyltransferáza
– cyklofosfamid
– cyklobután pyrimidínové diméry
– cyklobutánpyrimidínový dimér
– Cockaynov syndróm
– cytochróm P450
– dvojvláknový zlom (double strand break)
– reparácia dvojvláknových zlomov (double strand break reparation)
– epoxidhydroláza
– etylénoxid
– mikrozomálna epoxidhydroláza 1
– glutatión
– glutatión S-transferáza
– hexafluoroizopropanol
– ľudská 8-oxoguanín DNA glykozyláza 1 (human 8-oxoguanine DNA glycosylase)
– hypoxantín-guanín fosforibozyltransferáza
– homologická rekombinácia (homologous recombination)
– chromozómové aberácie
– aberácie chromozómového typu
– aberácie chromatidového typu
– medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny (International Agency for Research
of Cancer)
– mikrozómová epoxidhydroláza
– O6-metylguanín-DNA metyltransferáza
– mitotický index
– mnohopočetný myelóm
– mitomycín C
– reparácia nevhodného spojenia (mismatch repair)
– mikrojadro (micronucleus)
– metotrexát
– N-acetyltranferáza
– Nijmegen breakage syndróm
– nukleotidová excízna oprava
– nehomologické spojenie koncov (non-homologous DNA end joining)
– najvyšší prípustný expozičný limit
– NAD(P)H-chinónoxidoreduktáza
– O6-metylguanín
– poly(ADP-ribózo)polymeráza
– polyaromatické uhľovodíky
– proliferatívny jadrový antigén
– polymerázová reťazová reakcia (polymerase chain reaction)
5
PHA
PNC
PNK
PO
SCE
SNP
SOD
SSB
STM
TCR
TFIIH
TTD
UDPGT
XME
XP
– phytohaemagglutinin
– penicilín
– polynukleotidkináza
– propylénoxid
– sesterské chromatidové výmeny (sister chromatid exchanges)
– polymorfizmus jednotlivých nukleotidov (single nucleotide polymorphism)
– superoxiddismutáza
– jednovláknový zlom (single strand break)
– streptomycín
– transkripčne viazaná reparácia (transcription-coupled repair)
– transkripčný faktor IIH
– trichotiodystrofia
– UDP-glukuronyltransferáza
– enzým metabolizmu xenobiotík (xenobiotic metabolizing enzyme)
– xeroderma pigmentosum
6
1 ÚVOD
Každý jedinec je vo svojom životnom a
pracovnom prostredí vystavený
pôsobeniu rôznych látok s genotoxickým účinkom. Odhaduje sa, že v súčasnosti sa v
životnom a pracovnom prostredí nachádza viac ako 100.000 organických látok alebo
ich zlúčenín, ktoré negatívne vplývajú na zdravotný stav jedinca. Asi 3,5% populácie
je
vystavenej
látkam
s
karcinogénnym
účinkom.
V pracovnom
prostredí
zdravotníckych zariadení sa nachádza viac ako 140 látok, ktoré majú karcinogénny
alebo mutagénny účinok. Priamy účinok týchto látok nie je častý. Najvýznamnejší je
ich metabolický proces v organizme.
Anestéziologickí pracovníci sú na operačných sálach exponovaní inhalačným
anestetikám vrátane halogénovaných alifatických zlúčenín. Najstarším anestetikom z
tejto skupiny látok je halotan. V súčasnosti sa v praxi používajú inhalačné anestetiká,
ktoré sa v organizme minimálne metabolizujú, ako izofluran, sevofluran, desfluran,
enfluran. Do pracovného prostredia sa dostávajú počas anestézy alebo expirovaným
vzduchom pacienta.
Pracovníci onkologických oddelení sú pravidelne a dlhodobo profesionálne
exponovaní nízkym dávkam cytostatík. Sú to látky, ktoré majú antineoplastický účinok
a v chemoterapii sa používajú pri liečbe malígnych nádorov. Okrem toho, že sa u nich
prejavuje priamy cytotoxický alebo cytostatický účinok, významné riziko predstavuje
ich nepriamy účinok, tzn. ich mutagénny, karcinogénny alebo teratogénny vplyv.
Dlhodobá, nízka a pravidelná expozícia genotoxickým látkam, môže vyvolávať v
somatických bunkách mutácie, prípadne viesť k vzniku karcinómu. Dnes vieme, že
nádorové ochorenie postihuje takmer tretinu populácie, je príčinou 1/5 všetkých úmrtí
a finančné náklady na liečbu pacientov s nádorovým ochorením dosahujú 20%
všetkých liečebných nákladov (Nussbaum a
Grossman, 2003). Na iniciácii
nádorového procesu sa zúčastňujú gény, ktoré riadia signálne dráhy, podieľajú sa na
stavbe komponentov cytoskeletu, uplatňujú sa pri kontaktnej inhibícii, regulujú
mitotický cyklus, zapájajú sa do programovaného zániku bunky, sú prítomné pri
bunkovej proliferácii, ale zodpovedajú tiež za detekciu a opravu mutácií. Správna
funkcia všetkých týchto génov je v značnej miere ovplyvnená nielen ich chemickou
štruktúrou ale aj charakterom účinku týchto látok. V procese chemickej karcinogenézy
zohráva dôležitú úlohu metabolická aktivácia týchto látok a samotný proces ich
detoxifikácie. Bunky sú schopné prebudovať škodlivo pôsobiace chemické látky na
7
menej toxické metabolity a tie vylúčiť z organizmu. Bunky sú tiež schopné reparovať
väčšinu DNA poškodení, ktoré sa môžu vytvoriť účinkom expozície. Keď zlyhajú
všetky obranné mechanizmy, bunky môžu prejsť do apoptózy, aby tým zachránili
organizmus ako celok.
Odpoveď organizmu na ich pôsobenie závisí na celom rade faktorov, vrátane
genetickej výbavy jedinca. V mnohých sledovaných súboroch sa zistila výrazná
variabilita v metabolických procesoch. Môžu sa tým vysvetľovať aj značné rozdiely v
individuálnej vnímavosti na vznik nádorových ochorení. Rozdielnosť výsledkov môže
súvisieť s interindividuálnymi rozdielmi v metabolickej aktivite a reparačnej schopnosti
DNA jedincov, ktorá môže byť ovplyvnená polymorfizmom génov, kódujúcich enzýmy
metabolizmu xenobiotík (XME) a enzýmy, ktoré sa zúčastňujú na DNA oprave.
Podľa údajov Medzinárodnej agentúry pre výskum rakoviny (IARC) až 85%
všetkých zhubných nádorov vzniká
v
dôsledku pôsobenia zložiek životného
a pracovného prostredia (IARC, 1995; IARC, 1996). Na základe molekulovogenetickej podstaty polymorfizmov mnohých enzýmov metabolizmu xenobiotík a tých,
ktoré sa zúčastňujú na oprave DNA je možné zistiť jedincov so zvýšeným rizikom
vzniku karcinómu a cielene zlepšiť ich prevenciu a ochranu.
Ochrana zdravia človeka je v súčasnosti jednou z dôležitých úloh mnohých
lekárskych disciplín, medzi ktoré patrí i genetická toxikológia. Je nevyhnutné
vykonávať vyšetrenia a uskutočňovať opatrenia na zníženie genotoxického rizika
jednotlivcov a tým zlepšovať nielen zdravotný stav týchto jedincov, ale i celej ľudskej
populácie.
8
2 CIEĽ PRÁCE
Zdravotnícki pracovníci sú exponovaní celému spektru genotoxických látok.
Anestéziologickí pracovníci sú významne exponovaní inhalačným anestetikám, z
ktorých
väčšinu
tvoria
halogénové
alifatické
uhľovodíky
a
pracovníci
na
špecializovaných onkologických pracoviskách sú dlhodobo exponovaní nízkym
dávkam
antineoplastických
látok.
Nízka,
dlhodobá
a
pravidelná
expozícia
genotoxickým látkam, môže vyvolávať v somatických bunkách mutácie, prípadne
viesť k vzniku karcinómu.
Genotoxické
látky
môžu
u
vnímavejších
jedincov
zvyšovať
počet
chromozómových aberácií (CHA). Z mnohých literárnych údajov je známe že zvýšená
instabilita chromozómov, tzn. zvýšený výskyt CHA má veľmi úzky vzťah so zvýšeným
rizikom vzniku karcinómu (Bonassi a kol., 2000; Bonassi a kol., 2004, Hagmar a kol.,
2004a; Hagmar a kol., 2004b). Zdravotné riziko spojené s profesionálnou expozíciou
týmto látkam nie je v dostatočnej miere zdokumentované. Mnohé práce poukazujú na
ich nefrotoxicitu, hepatotoxicitu a karcinogenicitu (Vorlíček a kol., 2000; Byhahn a kol.,
2001; Karabiyik a kol., 2001). Genotoxický účinok anestetík a cytostatík popisujú
viacerí autori (Oestreicher a kol., 1990; Rugo, 1990; Rössner a kol., 1995; Rozgaj
a Kasuba, 2000; Karabiyik a kol., 2001; Rozgaj a kol., 2001; Szyfter a kol., 2004).
Nezreparovanú DNA je možné analyzovať pomocou vhodných cytogenetických a
molekulovo-genetických metód. Poškodenie štruktúry DNA sa prejavuje vyšším
výskytom chromozómových aberácií. Na základe molekulovo-genetickej podstaty
polymorfizmov génov kódujúcich mnohé enzýmy metabolizmu xenobiotík (XME)
a DNA reparačných génov je možné zistiť jedincov so zvýšeným rizikom vzniku
karcinómu a cielene zlepšiť ich prevenciu a ochranu.
Práca je zameraná na zistenie genotoxického rizika dvoch skupín zdravotníckych
pracovníkov profesionálne dlhodobo exponovaných nízkym dávkam genotoxických
látok. Jedna je exponovaná inhalačnýcm anestetikám a druhá antineoplastickým
látkam. Cieľom bolo zistiť výskyt celkových chromozómových aberácií (CHA) a ich
jednotlivých typov, tzn. aberácií chromatidového (CHTA) a chromozómového (CHSA)
typu v obidvoch skupinách, zhodnotiť ich podľa veku, pohlavia a pracovného
zaradenia.
9
Práca je tiež zameraná na hodnotenie faktorov individuálnej vnímavosti na
základe vzťahu medzi výskytom celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu
a polymorfizmom vybraných génov kódujúcich enzýmy metabolizmu xenobiotík
(XME) a DNA reparačných génov. Hodnotili sme vzťah u týchto génov kódujúcich
enzýmy metabolizmu xenobiotík: CYP1B1, EPHX1, GSTM1, GSTP1, GSTT1
a NQO1. Polymorfizmus
génu CYP1B1 sme hodnotili v exóne 3 kodón 453
(Asn453Ser) a kodón 432 (Leu432Val). Polymorfizmus
EPHX1 sme hodnotili v
exóne 3, kodón 113 (Tyr113His), *1/*3 a v exóne 4, kodón 139, (His139Arg), *1/*4.
Aktivita EPHX1 sa dedukovala z kombinácie polymorfizmov exónu 3 a 4. Kombinácie
*3/*3+*1/*1, *3/*3+*1/*4, *1/*3+*1/*1 a *3/*3+*4/*4 predstavovali nízku aktivitu EPHX1;
kombinácie *1/*1+*1/*1, *1/*3+*1/*4 a *1/*3+*4/*4 strednú a *1/*1+*1/*4 a *1/*1+*4/*4
vysokú aktivitu EPHX1. Polymorfizmus GST sme stanovovali v géne GSTM1
s prítomnosťou nulového a kladného variantu, v géne GSTP1 sme hodnotili
polymorfizmus v exóne 5, kodón 105 (Ile105Val), v géne GSTT1 ako nulový a kladný
variant, polymorfizmus génu GSTM3 v intróne 6 a génu NQO1 v exóne 6, kodón 187
(Pro187Ser).
V DNA reparačných génoch sme hodnotili vzťah u týchto génov: pre bázovú
excíznu reparáciu v génoch XRCC1, hOGG1, APE1; pre nukleotidovú excíznu
reparáciu XPD, XPG, XPC; pre reparáciu dvojvláknových zlomov v génoch XRCC3 a
NBS1; a kontrolného génu bunkového cyklu CCND1. Polymorfizmus génu XRCC1
sme hodnotili v exóne 10 (G→A) kodón 399 (Arg399Gln) a v exóne 6 (C→T) kodón
194 (Arg194Trp), polymorfizmus génu hOGG1 exón 7 (C→G) kodón 326
(Ser326Cys) a génu APE1 exón 5 (T→G) kodón 148 (Asp148Glu); polymorfizmus
génu XPD exón 23 (A→C) kodón 751 (Lys751Gln), génu XPG exón 15 (G→C)
kodón 1104 (Asp1104His), génu XPC exón 15 (A→C)
kodón 939 (Lys939Gln);
polymorfizmus génu XRCC3 v exóne 7 (C→T) kodón 241 (Thr241Met) a génu NBS1
exón 5 (G→C) kodón 185 (Glu185Gln); polymorfizmus génu CCND1 exón 4 (A→G)
kodón 241 (Pro241Pro).
Genotoxické riziko a vzťah biomarkerov účinku s polymorfizmom vybraných
génov sme hodnotili u pracovníkov príslušných pracovísk vo vybraných nemocniciach
severnej oblasti Stredoslovenského regiónu. Týchto pracovníkov sme porovnávali
s porovnateľnou kontrolnou skupinou zdravotníckych pracovníkov, ktorí neboli
exponovaní týmto genotoxickým látkam.
10
3 PREHĽAD LITERÁRNYCH ÚDAJOV
Ľudia sú v životnom a pracovnom prostredí exponovaní veľkému množstvu
toxických látok, ktorých účinok je podmienený schopnosťou organizmu ich
absorbovať, distribuovať, metabolizovať a vylučovať. Intenzita a doba trvania
toxického účinku závisí na jej koncentrácii v cieľových orgánoch. Metabolizmus
chemických látok prebieha dvomi typmi reakcií: a/ funkčnými a b/ konjugačnými.
Funkčný typ predstavujú oxidačné, redukčné a hydrolytické reakcie, prostredníctvom
ktorých sa vytvárajú nové funkčné skupiny a ich priebeh závisí od základného
chemického zloženia látky. Väčšinou dochádza k zvýšeniu polarity týchto látok, čím
sa zvýši schopnosť organizmu ich vylučovať a zníži schopnosť ich akumulovania v
niektorých tkanivách (napr. nervové tkanivo). Na reakciách sa zúčastňuje komplex
enzýmov cytochrómu P450 (CYP) a skupina hemoproteínových enzýmov; tzn.
alkoholdehydrogenáza (ADH) a aldehyddehydrogenáza (ALDH). Konjugačný typ
súvisí so zmenou pôvodného charakteru dvoch susediacich dvojmocných väzieb. Na
reakciách sa zúčastňuje enzým glutatión S-transferáza (GST), N-acetyltransferáza
(NAT),
UDP-glukuronyltransferáza
(UDPGT)
a
NAD(P)H-chinónoxidoreduktáza
(NQO).
3. 1 GENOTOXICKÉ LÁTKY A RIZIKO EXPOZÍCIE
Genotoxické látky môžeme definovať, ako látky rôznej chemickej štruktúry a
povahy, ktoré svojimi účinkami spôsobujú poškodenie molekuly DNA. Formou
biologického účinku genotoxických faktorov spôsobujú kvalitatívne a kvantitatívne
poškodenia DNA, ktoré vedú k jej štruktúrnym a informačným zmenám. Dôsledkom
týchto poškodení je vznik mutácií, zvýšený výskyt chromozómových aberácií, možný
rozvoj procesu karcinogenézy a v konečnom dôsledku zánik bunky, prípadne
ukončenie života jedinca.
3. 1. 1 Charakteristika genotoxických látok
Genotoxické látky spôsobujú zmeny genetického materiálu. Vzniknuté zmeny sa
prejavujú na úrovni nukleových kyselín, génov alebo chromozómov. Odhaduje sa, že
11
približne 3500 chemických látok, prítomných v životnom a pracovnom prostredí má
genotoxický účinok a takmer 800 má výrazne mutagénny účinok. Sú to látky bežnej
dennej spotreby - pesticídy, konzervačné látky, lieky, prípadne kozmetické prípravky
(Thilly, 2003). Zmeny genetického materiálu sa môžu vyskytovať na úrovni
nukleových kyselín, génov alebo chromozómov. Na genetický materiál môžu pôsobiť
priamo alebo nepriamo. Zahrňujú látky s klastogénnym a mutagénnym účinkom
(Hewitt, 1997).
Klastogény sú látky alebo činitele, ktoré spôsobujú na chromozómoch zlomy.
Výsledkom je ich nadpočetnosť, strata genetického materiálu, alebo jeho vzájomná
prestavba. Klastogény môžu spôsobovať sesterské chromatidové výmeny a medzi
chromozómami môžu vytvárať reunion komplexy, tzn. chromozómové preskupenia
buď počas mitózy alebo meiózy.
Mutagény sú chemické alebo fyzikálne faktory, ktoré spôsobujú v organizme
zmenu genetickej informácie (väčšinou DNA, príp. RNA). Zvyšujú frekvenciu
génových zmien, ktoré prebiehajú počas celého procesu reprodukcie bunky. Niektoré
z nich spôsobujú poškodenie buniek, prípadne vedú k vzniku nádoru (Thilly, 2003).
Vo svojom prostredí prichádza človek do styku aj s látkami, ktoré majú
karcinogénny alebo teratogénny účinok.
Karcinogény sú chemické látky alebo fyzikálne faktory, ktoré modifikujú štruktúru
alebo expresiu DNA génu bunky tým, že iniciujú vznik karcinómu, prípadne podporujú
proces malígnej transformácie. Karcinóm tak predstavuje „chorobu génov“.
Karcinogény sa prejavujú hlavne týmito znakmi: a/ zvyšujú incidenciu karcinómov v
porovnaní s kontrolou, b/ vytvárajú určité odlišné typy nádorov, ktoré sa bežne
nevyskytujú, c/ skracujú dobu latencie samotnej tvorby nádorov. Sú obyčajne
mutagénmi a vedú k vzniku DNA aduktov. Karcinogenéza predstavuje proces tvorby
nádoru (Ottender a Lutz, 1999; Poirier, 2004).
Teratogény sú faktory (chemické látky, vírusy, IŽ), ktoré zasahujú do normálneho
vývoja embrya alebo plodu, čím zvyšujú incidenciu kongenitálnych malformácií.
Endogénne faktory sa indukujú samotným organizmom a spôsobujú denne stovky
DNA poškodení bunky (Lindahl, 2000). Je to hlavne zmena DNA báz a tvorba
apurínových alebo apyrimidínových (AP) miest. Bunkové procesy, ktoré vedú k
poškodeniu DNA využívajú kyslík, čo má za následok vznik reaktívnych kyslíkových
skupín, napr. •O2, voľných hydroxylových radikálov •OH a peroxidu vodíka. Voľné
radikály po narušení rovnováhy s antioxidantmi poškodzujú dôležité makromolekuly
12
bunky, ako sú nukleové kyseliny, proteíny a lipidy, čím dochádza k tzv. oxidačnému
stresu. Lipoperoxidácia je oxidačným pôsobením voľných kyslíkových radikálov na
lipidy a môže viesť k zastaveniu činnosti membrán a tým aj regulovaného transportu.
Proces DNA replikácie je sám osebe veľmi citlivý a preto malá zmena, ktorú
polymeráza nerozlíši, môže byť včlenená do samotnej DNA a dochádza k chybe v
replikačnom procese. Frekvencia týchto endogénne sa tvoriacich DNA poškodení sa
môže zvyšovať účinkom exogénnych faktorov (Preston a Hoffmann, 2001).
3. 1. 2 Mutácie a mutagény
Genetický materiál je v organizme relatívne stály. DNA predstavuje dynamickú
makromolekulu, v ktorej neustále prebiehajú zmeny spôsobené jej ľahkou
reaktívnosťou s chemickými zlúčeninami a vplyvom fyzikálnych činiteľov, ktoré na ňu
pôsobia.
Mutácia predstavuje zmenu genetického materiálu (tzn. DNA alebo RNA) v živom
organizme, ktorá sa môže prenášať na potomkov. Podľa úrovne vzniku rozdeľujeme
mutácie na: a/ génové (bodové) mutácie, ktoré vznikajú vo vnútri molekulovej
štruktúry DNA a sú spôsobené zámenou, chýbaním alebo zmenou poradia
nukleotidov; b/ chromozómové mutácie (aberácie), ktoré zahrňujú poškodenia
chromozómovej sady bunky a môžu byť štruktúrne a numerické (Preston a Hoffmann,
2001; Thilly, 2003).
Mutagény spôsobujú v organizme zmenu genetickej informácie. Niektoré z nich
spôsobujú poškodenie buniek, alebo vedú k vzniku nádoru. Celistvosť DNA môže byť
porušená tromi skupinami mutagénov: a/ chemickými látkami; b/ fyzikálnymi faktormi;
c/ vírusmi. Chemické mutagény sa v organizme metabolizujú a patria medzi ne:
alkylačné látky, antimetabolity nukleových kyselín, komplexotvorné zlúčeniny, ktoré
vytvárajú spojenia s DNA, organické zlúčeniny ťažkých kovov, najmä arzénu, ortuti,
kadmia, chrómu, striebra a tiež alkaloidy, ktoré vplývajú na činnosť deliaceho
vretienka.
K
fyzikálnym
mutagénom
patrí
žiarenie
s
vyššou
energiou
(elektromagnetické a korpuskulárne), ktoré vyvoláva v podstate všetky druhy mutácií.
Mutagénny účinok žiarenia závisí od vlnovej dĺžky, energie a doby pôsobenia. Vznik
chromozómových aberácií nezávisí od syntézy DNA v bunke, pretože aberácie
vznikajú vo všetkých fázach bunkového cyklu (Thilly, 2003). Účinky vírusov nie sú
13
zatiaľ dostatočne preskúmané. Najznámejšia je kondenzácia chromozómov, fúzia
bunkových jadier, prípadne ich inzercia do DNA bunky (Thilly, 2003).
3. 1. 3 Karcinogény a karcinogenéza
Karcinogény sú podľa IARC (1996) látky, ktoré zvyšujú incidenciu malígnych
nádorov v populácii, ktorá bola vystavená ich účinku. Odhaduje sa, že 3,5% populácie
je vystavenej látkam s karcinogénnym účinkom (Hewitt, 1997). 5% nádorov u ľudí
spôsobuje žiarenie, 5% vyvolávajú vírusy a ostatných 90% karcinogénne chemické
látky a ich zmesi. Dôležitosť chemických látok v etiológii nádorov odráža aj
skutočnosť, že okolo 8% všetkých nádorov u ľudí je profesionálneho pôvodu (Pitot a
Dragan, 2001). Medzi expozíciou karcinogénu a prvou manifestáciou nádorového
ochorenia sa vyskytuje tzv. indukčno-latentné obdobie, ktoré môže trvať aj 15-25
rokov.
Karcinogenéza je viacstupňový proces, ktorý zahrňuje neprimeranú aktiváciu
normálnych génov bunky, ktoré sa stávajú onkogénmi, ale aj inaktiváciu iných
bunkových génov, tzn. tumor supresorových génov. V mechanizme karcinogenézy
rozlišujeme tri stupne: a/ iniciácia; b/ promócia; c/ progresia.
Iniciácia je výsledkom ireverzibilnej genetickej zmeny, ktorá súvisí s rastom
mutačnej aktivity niektorých karcinogénnych látok, ktoré priamo interagujú s DNA.
Mnohé karcinogény pôsobia nepriamo a na svoju mutagénnu činnosť potrebujú
metabolickú aktiváciu. Komplex detoxifikačných enzýmov, ktoré sú prítomné
v ľudskom organizme metabolizuje niektoré toxické látky na vysoko reaktívne
elektrofilné metabolity rozpustné vo vode. Cytochrómový enzýmový systém
(cytochróm P450) pomáha metabolizovať tieto toxické látky. Enzýmy sú špecifické
pre rôzne skupiny karcinogénov. Pri väčšine z nich sa prejavuje genetický
polymorfizmus (IARC, 1996). Iniciátory samotné sú karcinogénne, genotoxické,
elektrofilné a vysoko reaktívne látky, ktoré sa kovalentne viažu k nukleofilným
centrám a vedú k ireverzibilným zmenám genetického materiálu, sú aktívne v
krátkodobých testoch mutagenity, nedá sa u nich overiť prahová dávka a jedna
expozícia môže byť dostatočná na indukciu nádorového procesu.
Promócia súvisí s expanziou iniciovaných a na klon transferovaných buniek. Je
reverzibilným procesom a prebieha väčšinou epigenetickým mechanizmom. Pri
promócii netvoria agensy priame interakcie s DNA. Pri nepriamej interakcii s bunkou
14
vznikajú zmeny v génovej expresii, čo prispieva k tvorbe benígnych bunkových klonov
(IARC, 1996). Promótory samotné nie sú karcinogénne a genotoxické a neviažu sa
na DNA, ich účinok je pravdepodobne reverzibilný, nie sú aktívne v krátkodobých
testoch mutagenity, pravdepodobne existuje prahová dávka a na indukciu procesu je
potrebná opakovaná expozícia (IARC, 1996; Pitot a Dragan, 2001; Poirier, 2004).
Progresia sa prejavuje klinickou manifestáciou karcinómu. Malígne nádory sa
vyznačujú genetickou nestabilitou, ktorá sa prejavuje vznikom aneuploidií a
chromozómových aberácií. Keď sa nádorové bunky dostanú do neskorého štádia
progresie, stanú sa heterogénnymi a začnú sa rýchlo rozvíjať. Nadobúdajú
charakteristické vlastnosti, ako schopnosť rozpúšťať bunkovú stenu, prechádzať
bunkovou membránou, zostávať nažive v krvnom riečisku, stimulovať angiogenézu,
stať sa rezistentnými voči toxickým účinkom liekov a žiarenia, ako i paralyzovať
imunitný systém, (IARC, 1995; IARC, 1996).
Vzťah medzi mutáciou a vývojom karcinómu sa považuje za nepriamy základ
korelácie medzi mutagenitou a karcinogenitou genotoxických látok. Tieto látky sa
môžu
v biologických
systémoch
metabolicky
aktivovať.
Syndróm
nestability
chromozómu a porušenie opravy DNA úzko súvisí so zvýšeným rizikom vzniku
nádorov. Mnohé leukémie, rôzne druhy lymfómov a iné solídne tumory súvisia s
výskytom špecifických chromozómových zmien, ako sú delécie, translokácie
a inverzie (Mehes, 2005; Shanafelt a kol., 2006).
Štúdie o onkogénoch a tumor supresorových génoch na molekulovej úrovni nám
poskytli dostatočné dôkazy o tom, že mutácie zohrávajú kľúčovú úlohu pri vývoji
nádorového procesu. V štruktúre DNA sa nachádzajú úseky, tzv. protoonkogény,
ktoré prijímajú signály deliacej sa bunky obyčajne vo forme proteínového produktu.
Aktivácia génu, alebo jeho produktu, sa stáva rozhodujúcim činiteľom, ktorý indukuje
vznik nádoru, tzn. prechod protoonkogénov na onkogénny. Onkogény stimulujú
transformáciu normálnych buniek na bunky
nádorové. Vznikajú vtedy, keď sa
protoonkogény geneticky zmenia. Normálna regulácia bunkového delenia si vyžaduje
vytvorenie rovnováhy medzi faktormi, ktoré ho podporujú a tými, ktoré ho potláčajú.
Mutačná zmena protoonkogénov
môže
viesť
k
zvýšeným
prejavom
ich
aktivity. Medzi chromozómovými zmenami, ktoré aktivujú protoonkogény sú
mimoriadne rozšírené translokácie. Tie aktivujú protoonkogény ich posunutím na
nový
chromozómový
úsek.
Je
to
typické
pre
T-bunkový
receptor
alebo
imunoglobulínový gén, pričom sa jeho prejav zmení. Vyskytuje sa napr. pri
15
Burkittovom lymfóme a rôznych iných nádoroch hematopoetického systému.
Translokáciou sa môžu spojiť dva gény, čím dôjde k fúzii proteínu. Tumor
supresorové gény potláčajú premenu normálnej bunky na bunku nádorovú. Ak dôjde
k inhibícii tumor supresorového génu účinkom mutácie, bunky sa dostanú spod
kontroly delenia a stávajú sa potenciálne nádorovými (Hanahan a Weinberg, 2000).
Cytogenetické poškodenia chromozómov detegované analýzou chromozómov,
metódou sesterských chromatidových výmen (SCE) a mikrojadrovým testom (MN)
poukazujú na zvýšené riziko vzniku rakoviny (Bonassi a kol., 2000; Bos a Sessink,
2000; Norppa a kol., 2004a; Hagmar a kol., 2004a). Rozsiahle súbory zaoberajúce sa
vzájomnou koreláciou medzi cytogenetickým poškodením a včasnými štádiami
nádoru potvrdzujú, že jedinci, ktorí mali v predchádzajúcom vyšetrovanom období
zvýšený výskyt CHA, majú zvýšené riziko vzniku karcinómu (Bonassi a kol., 2000;
Mitelman, 2000; Natarajan, 2002; Bonassi a kol., 2003; Vilenchik a Knudson, 2003;
Bonassi a kol., 2004, Hagmar a kol., 2004a; Rössner a kol., 2005; Rössner, 2006).
Riziko vzniku nádoru je 1,8 – 2,4-krát
vyššie u osôb s vysokým výskytom CHA
(Hagmar a kol., 1994; Hagmar a kol., 2004a). Predikciou vzniku nádoru je
chromatidový (CHTA) aj chromozómový (CHSA) typ aberácie. Niektoré práce
uvádzajú, že CHSA typ aberácie má väčšiu mieru predikcie. Väčšinou sa vyskytujú
nádory rôznych typov, pozorovala sa však určitá asociácia medzi zvýšenými
hladinami CHA
a nádorov GITu. Výskyt CHA sa v súčasnosti viac hodnotí ako
skupinový expozičný test, avšak na základe určitých asociácií v súvislosti s
polymorfizmami génov metabolizmu xenobiotík, DNA reparácie a metabolizmu
folátov, ktoré môžu ovplyvňovať hladinu CHA sa bude môcť prejsť na individuálne
stanovenie rizika (Norppa a kol., 2006). Údené a grilované potraviny sú zdrojom
vyššieho výskytu PAU-DNA aduktov, ktoré môžu úzko súvisieť s procesmi
oxidatívneho poškodenia DNA. Zvýšený príjem flavonoidov a iných antioxidantov
môže výrazne znížiť hladinu DNA aduktov (Raimondi a kol., 2007). Frekvencia CHA
indukovaných B(a)P a CP môže byť výrazne inhibovaná pomocou antimutagénnych
látok ako dialylsulfid, indol-3-karbinol, kurkumin a polyfenoly čierneho čaju (Shukla a
kol., 2003). Historické kohorty od roku 1990 potvrdzujú vzťah medzi hladinou CHA v
periférnych lymfocytoch zdravých jedincov a rizikom vzniku nádoru. Pri hodnotení
výskytu
nádoru
u pracovníkov
exponovaných
IŽ,
chemickým
látkam
alebo
kombinovanej expozícii sa zistila miera incidencie výskytu nádoru 2,4. Pri CHSA type
aberácie bola miera incidencie vyššia ale štatisticky nevýznamná (Fucic a kol., 2007).
16
3. 1. 4 Teratogény a ich účinky
Teratogény sú faktory, ktoré zvyšujú incidenciu kongenitálnych malformácií.
Chemické látky môžu indukovať mutácie vo vyvíjajúcich sa gamétach. Vznikajú
hlavne genómové mutácie, ktoré sú následkom chýb v meiotickom delení.
Poškodenie pohlavných buniek muža alebo ženy môže znižovať fertilitu a expozícia
pred alebo počas gestácie môže spôsobiť u ženy infertilitu, spontánny potrat,
predčasný pôrod, zníženie pôrodnej hmotnosti novorodenca, poškodenie plodu,
abnormálny rast a vývoj. Reprodukčné alebo vývojové poškodenie bolo zistené pri
profesionálnej expozícii olovu, ortuti, niektorým organickým látkam a ionizujúcemu
žiareniu (Preston a Hoffmann, 2001).
3. 1. 5 Účinok expozície genotoxickým látkam
Účinok expozície na úrovni génov
Mutácie predstavujú zmeny genetického materiálu (DNA alebo RNA) v živom
organizme, ktoré sú schopné prenosu na potomkov. Tieto zmeny prebiehajú počas
celého procesu reprodukcie bunky. Považujú sa za hnaciu silu evolúcie, pri ktorej sa
malé účinné mutácie odstraňujú prirodzeným výberom, ale súčasne majú sklon sa
kumulovať. Môžu viesť k poruchám funkcie, zániku buniek a u vyšších organizmov k
vzniku závažných ochorení, prípadne k smrti.
Génové mutácie sú malé zmeny DNA sekvencií jedného génu. Tvoria ich
substitúcie, malé inzercie a delécie. Substitúcie môžeme rozdeliť na: a/ tranzície, kde
sa zamení pyrimidín za pyrimidín a purín za purín; b/ transverzie, kde sa zamení
purín za pyrimidín a opačne. Inzercie a delécie vnútri oblasti kódovaných génov môžu
spôsobovať tzv. „frameshift“ mutáciu. Je to typ mutácie, ktorá pozostáva z inzercie
alebo delécie jedného prípadne viac nukleotidov v štruktúre nukleovej kyseliny génu,
pričom počet bázových párov nie je viac ako tri. Ak adícia alebo delécia je násobkom
troch, nepostihnuté nukleotidy v genóme zostávajú v neposunutom poradí, čím môže
dôjsť k nesprávnej translácii na proteín. V tomto prípade inzercie alebo delécie
nespôsobujú posun, ale môžu sa tvoriť funkčne zmenené proteíny. Frameshift
mutácie spôsobujú veľa vážnych zmien v zložení proteínov, ktoré sú výsledkom
translácie mutovaného génu, pretože menia sekvencie aminokyselín od miesta vzniku
17
mutácie. Mutácie indukované IŽ vytvárajú väčšinou delécie rôznych veľkostí od
niekoľkých báz po multilokusové úseky. S narastajúcou reparáciou sa znižuje výskyt
DNA poškodení (Preston a Hoffmann, 2001).
Podľa mechanizmu indukcie génových mutácií rozdeľujeme chemické látky na: a/
rádiomimetické, ktoré tvoria genetické zmeny na všetkých stupňoch bunkového cyklu
a pôsobia ako žiarenie (napr. streptonigrín, bleomycín); b/ nerádiomimetické, ktoré
tvoria zmeny hlavne v S fáze bunkového cyklu (väčšina chemických látok).
Génové mutácie môžu vznikať aj bez expozície exogénnym faktorom. Spontánne
mutácie vznikajú väčšinou tzv. replikáciou zmenenej matrice. DNA zmeny sú tak
výsledkom oxidatívnych poškodení, alebo deamináze 5-metylcytozínu na tymín, ktorej
výsledkom je prechod z G:C na A:T.
Chemické látky a neionizujúce žiarenie vytvárajú substitúcie báz, malé adície a
delécie. Vysoký podiel tvoria chyby replikácie DNA na matrici. Relatívna mutačná
frekvencia je vzťahom medzi reparáciou a replikáciou, tzn. že väčšina reparácií,
vyskytujúcich
sa
pred
replikáciou
znižuje
frekvenciu
mutácií.
Významnými
regulačnými činiteľmi bunkového cyklu od nástupu S fázy na G1/S fázu sú kontrolné
gény.
Na hodnotenie génových mutácií v pohlavných bunkách je dôležitý vzťah medzi
expozíciou a priebehom DNA replikácie. Spermatogónie u ľudí majú dlhý čas
bunkového cyklu (8 dní a viac), a len malá časť z nich sa nachádza v S fáze. Pri
akútnej i chronickej expozícii sa DNA reparácia vyskytuje väčšinou pred DNA
replikáciou.
Spermatogónie
predstavujú
hlavné
genetické
riziko
v
priebehu
reprodukčného obdobia jedinca. Pri chronickej expozícii môžu sa v spermatogóniách
hromadiť genetické poškodenia. V zrelších spermatídach a samotných spermiách je
stupeň reparácie DNA nízky. Postmeiotické pohlavné bunky sú zvlášť citlivé na
indukciu mutácií spôsobených nerádiomimetickými látkami hlavne po akútnej
expozícii.
V oocytoch sa pozorovala podobná indukcia génových mutácií v priebehu S fázy
bunkového delenia, čo sa týka spôsobu i doby trvania. Primárne oocyty sú zastavené
vo vývoji ešte pred narodením človeka až do vzniku zygoty. Preto sú oocyty odolné
voči mutáciám génov vyvolaných nerádiomimetickými látkami, ale nie voči žiareniu
(Pitot a kol. 2001).
18
Účinok expozície na úrovni chromozómov
Základom vzniku chromozómových aberácií, sesterských chromatidových výmen
a mikrojadier je poškodená DNA. Chyby reparácie DNA po expozícii IŽ a
rádioaktívnym látkam, sú dôsledkom chybného spojenia dvojvláknových zlomov,
alebo vzájomným pôsobením reparovaných oblastí poškodených báz počas
nukleotidovej excíznej reparácie. Presnosť DNA reparácie ovplyvňuje pri indukcii
CHA senzitivitu buniek. Výsledkom je nesprávne pripojenie chromozómových úsekov
a tvoria sa chromozómové výmeny vo vnútri chromozómu (intersticiálne delécie a
inverzie) a medzi chromozómami (dicentrické chromozómy a vyvážené translokácie).
Zlyhanie opätovného spojenia dvojitých zlomov, alebo celková reparácia iných typov
poškodení DNA môže viesť k vzniku terminálnych delécií. Acentrické fragmenty
vznikajú z intersticiálnych a terminálnych delécií, alebo pri tvorbe dicentrických a
kruhových chromozómov. Porucha začlenenia acentrického fragmentu do dcérskeho
jadra v anafáze alebo telofáze bunkového delenia a porucha segregácie celého
chromozómu na bunkové póly v anafáze, môžu spôsobiť tvorbu mikrojadier, ktoré sa
môžu nachádzať v cytoplazme.
Poruchy DNA replikácie na poškodenej matrici môžu indukovať chromatidový typ
aberácií, pričom tvoria delécie alebo výmeny chromatíd. Nerádiomimetické látky
indukujú chromatidový typ aberácií. Žiarenie a rádiomimetické látky indukujú v S a G2
fáze bunkového cyklu chromatidový typ aberácie a v G1 fáze chromozómový typ
aberácie (Preston a Hoffmann, 2001). Pri profesionálnej expozícii nízkym dávkam Xžiarenia u 765 zdravotníkov sa najčastejším typom aberácií zistili acentrické
fragmenty. Dicentrické chromozómy významne korelovali s vekom a fajčením
(Kasuba a kol., 2008).
Numerické chromozómové zmeny, napr. monozómie, trizómie a aneuploidie,
môžu vznikať poruchou segregácie chromozómov. Niektoré chemické látky sa viažu
na mikrotubuly deliaceho vretienka a obmedzujú tak pohyb chromozómov. Je to napr.
benzimidazol, nokodazol, kolchicín, kolcemid, vinblastín a paclitaxel.
SCE tvorené počas S fázy, sa považujú za dôsledok chýb v procese replikácie,
pravdepodobne na miestach vynechaných replikačných komplexov. Intracelulárne
prostredie, ktoré znižuje proces replikácie DNA vedie k tvorbe SCE.
Syndróm nestability chromozómu a poškodenie reparácie DNA úzko súvisí so
zvýšeným rizikom vzniku nádorov. Mnohé leukémie, rôzne druhy lymfómov a iné
19
solídne tumory súvisia s výskytom špecifických zmien na chromozómoch, ako
delécie, translokácie a inverzie.
V biomonitorovacích štúdiách sa analyzujú hlavne krvné vzorky, ktoré sú tvorené
rôznymi typmi buniek. 25% z nich tvoria dlhoprežívajúce lymfocyty a 75%
krátkoprežívajúce granulocyty. Stanovenie hladín aduktov slúži na hodnotenie
odhadu rizika. Je základom individuálneho sledovania rizika a môže sa použiť na
ochranu vnímavejších jedincov. Pri akútnej expozícii môžu byť DNA adukty prítomné
v oboch typoch buniek, zatiaľ čo pri chronickej expozícii môžu byť výrazné rozdiely
v hladine aduktov medzi obidvoma typmi buniek. Zistilo sa napr., že fajčiari mali 2,5krát vyššiu hladinu aromatických DNA aduktov v lymfocytoch oproti nefajčiarom. V
granulocytoch sa tento rozdiel nezaznamenal. Rovnaké rozdiely v hladinách DNA
aduktov boli zistené v jednotlivých typoch bielych krviniek u jedincov, ktorí boli
exponovaní styrénu. Pri chronickej expozícii je na analýzu DNA aduktov výhodné
izolovať lymfocyty, pretože prežívanie granulocytov je krátke a neodrážajú expozičnú
anamnézu (Norppa a kol., 2006).
Aby sa udržal genofond ľudskej populácie zdravý,
je nevyhnutné znižovať
množstvá genotoxických látok a čo najviac eliminovať ich vplyv na ľudí, ktorí denne
alebo sporadicky prichádzajú s nimi do kontaktu. Predovšetkým je nutné sledovať
genotoxické riziká profesionálnej expozície, kde niektorých látok 100 až 1000
násobne prekračujú hodnoty namerané v životnom prostredí. Priamy účinok týchto
látok je pomerne vzácny. Organizmus ich dokáže prebudovať na menej toxické a tie z
organizmu vylúčiť. Metabolizmus bunky, ktorý je pod kontrolou génovej výbavy
jedinca, je do určitej miery schopný zabrániť genotoxickému účinku týchto látok Tento
proces je spojený s metabolickou aktiváciou a ich detoxifikáciou. Bunka je schopná
opraviť aj väčšinu poškodení DNA a tým zachrániť organizmus ako celok.
Neopravenú DNA možno analyzovať pomocou vhodných cytogenetických a
molekulovo-genetických metód. Poškodenie štruktúry DNA sa môže prejaviť
výskytom CHA, ktoré slúžia ako biomarker genotoxického účinku. Pomocou
molekulovo-genetickej analýzy polymorfizmu génov pre enzýmy metabolizmu
xenobiotík a reparačných génov DNA je možné zisťovať zvýšený výskyt DNA
poškodení u jedincov s určitým genotypom.
Pomocou matematických analýz je
možné zistiť, či medzi sledovanými parametrami existuje určitá zhoda a na základe
týchto analýz vyselektovať jedincov s vnímavejším genotypom na poškodenia DNA a
jej opravu. Po ich detekcii máme väčšiu možnosť preventívnej ochrany tých jedincov,
20
ktorí prichádzajú do kontaktu s genotoxickými látkami a ktorí sú na ne vnímavejší. Je
to jeden z možných významných prístupov prevencie vzniku genetických poškodení
a rozvoja nádorových ochorení u človeka (Norppa a kol., 2006).
3. 2 BIOMARKERY A ICH ROZDELENIE
Biologické markery sú významnými indikátormi expozície, ktorá je škodlivá
zdraviu a indikátormi vnímavosti na vznik alebo prejav choroby (Lander a kol., 2001;
Buchancová a kol., 2003). Rozdeľujeme ich na tri základné skupiny: a/ biomarkery
expozície; b/ biomarkery účinku; c/ biomarkery vnímavosti.
3. 2. 1 Biomarkery expozície
Biomarkery expozície (dávky) sú merateľnými indikátormi vonkajšej dávky alebo
metabolitu. Používajú sa pri sledovaní vzťahu expozícia-choroba (Obr.1). Zisťujú sa
jedinci, ktorí absorbujú nadmerné množstvo toxickej látky. Rýchlosť poklesu
biomarkera predstavuje dobu, počas ktorej sú jedinci ovplyvňovaní expozíciou.
Pomalý pokles ich koncentrácie odráža ich vysokú expozíciu, alebo viac nízkych
expozícií v dlhšom časovom období. Stanovujú sa metabolity v moči, DNA adukty,
proteínové adukty, jednoreťazcové zlomy v DNA (Buchancová a kol., 2003).
3. 2. 2 Biomarkery účinku
Biomarkery účinku sú merateľnými indikátormi stupňa biologického poškodenia
cieľového tkaniva alebo orgánu po expozícii (Obr. 2). Používajú sa pri sledovaní
vzťahu expozícia-choroba. Vyhodnocujú sa chromozómové aberácie, sesterské
chromatidové výmeny, mikrojadrá, mutácie v lókuse génu (HPRT), aktivácia
onkogénov, ktoré kódujú proteíny p53 alebo p21 merané na úrovní proteínov (Obe
a kol., 2002).
21
Obr. 1 Biomarkery expozície (voľne podľa Hemminkiho, 2001a)
EXPOZÍCIA
BIOLOGICKY ÚČINNÁ
DÁVKA
BIOMARKERY
EXPOZÍCIE
KARCINOGÉNY/MUTAGÉNY
METABOLITY
Krv, moč, stolica
tkanivá
PROTEÍNOVÉ
ADUKTY
DNA
ADUKTY
Hemoglobín
Albumín
Leukocyty
Moč
Tkanivo
Chromozómové aberácie (CHA)
Chromozómové poškodenia sú akékoľvek zmeny na molekule DNA, ktoré
porušujú jej integritu a vznikajú lézie, delécie, prípadne adície genetického materiálu.
Patria tu aj rôzne chemické zmeny na molekule DNA, tzn. v štruktúre dusíkatých báz,
päťuhlíkovom cukre alebo na zvyšku kyseliny fosforečnej.
22
Obr. 2 Biomarkery účinku (voľne podľa Hemminkiho, 2001a)
POŠKODENIE DNA
BIOMARKERY
ÚČINKU
CHROMOZÓMY
GÉNY
Aberácie
Mikrojadrá
SCE
Bodové mutácie
Delécie
Rekombinácie
Amplifikácie
OCHORENIA
Špecifické
nádorové zmeny
Mutácie
Onkogény
Tumor supresorové gény
Chromozómové aberácie (CHA) predstavujú štruktúrne a numerické zmeny, ktoré
sú prítomné v nízkej frekvencii aj v cirkulujúcich lymfocytoch zdravých jedincov a sú
prejavom biologického efektu genotoxických faktorov. Poukazujú priamo na expozíciu
človeka genotoxickým látkam, pričom zlomy, výmeny, translokácie a delécie
predstavujú riziko aktivácie onkogénov a deaktiváciu tumor supresorových génov.
Zvýšením ich frekvencie sa preukázateľne zvyšuje riziko vzniku nádorových
a degeneratívnych ochorení v somatických bunkách. CHA poškodzujú reparačné
mechanizmy a zasahujú do procesu apoptózy; negatívne ovplyvňujú kvalitu ľudského
genómu v pohlavných bunkách; Hodnotenie frekvencie CHA vo vzťahu k expozícií
23
genotoxickým faktorom prostredia je adekvátne, vhodné a odborne opodstatnené a je
odporúčané expertnými komisiami WHO.
Chromozómové aberácie (CHA) sa najčastejšie zisťujú v periférnych lymfocytoch.
Pretože sú periférne lymfocyty v G0 fáze bunkového cyklu, na delenie sa musia
stimulovať nešpecifickým antigénom najčastejšie PHA. Po 46,5 hodinách práve pred
fixáciou sa pridá inhibítor deliaceho vretienka najčastejšie kolcemid na zastavenie
buniek v metafáze prvej mitózy. CHA, ktoré sú mikroskopicky viditeľné, predstavujú
konečný výsledok komplexu bunkových procesov. Štruktúrne chromozómové
aberácie sú výsledkom: a/ priameho zlomu na DNA, b/ replikácie na poškodenom
DNA modeli, c/ inhibície DNA syntézy a enzýmov. Symetrické a asymetrické výmeny
(kvadriradikály) a rôzne typy vnútrochromozómových a medzichromozómových zmien
sa označujú ako chromatidový typ aberácií. Dicentrické chromozómy, kruhové
chromozómy a „diminute“ sa označujú ako chromozómový typ aberácií (Anderson
a kol., 2000; Cromie a kol., 2001; Obe a kol., 2002; Bonassi a kol., 2005). Väčšina
chemických látok indukuje dvojvláknové zlomy (DSB) nepriamo a preto sú
spôsobované činnosťou samotnej bunky. Najpravdepodobnejším mechanizmom
tvorby DSB je neefektívne pôsobenie reparačného systému DNA. Indukované
chromozómové aberácie môžeme rozdeliť do dvoch skupín: a/ chromatidové typy
aberácií, ktoré zahrňujú jednu z chromatíd; b/ chromozómové typy aberácií, ktoré
zahrňujú obidve chromatídy.
CHA je možné mikroskopicky detegovať. Ich frekvencia v somatických bunkách u
profesionálne i neprofesionálne exponovaných osôb mutagénom a karcinogénom je
kvantitatívnym indikátorom genetických poškodení, označovaným ako biomonitoring
genotoxického účinku genotoxickým látkam. V súčasnosti je to jediná priama
a rutinne dostupná laboratórna metóda, ktorá slúži ako biologický indikátor
genetického poškodenia a ktorá sa využíva v praxi príslušnými organizáciami (úrady
verejného zdravotníctva, zdravotnícke zariadenia) pre hodnotenie genotoxického
rizika časti populácie (skupinový expozičný test), alebo jedinca (individuálny test).
Používa sa tiež, ako jedno z kritérií pre stanovenie vhodných najvyšších prípustných
expozičných limitov
(NPEL) a pre určenie rizika expozície genotoxickým látkam.
Spontánna úroveň CHA v bežnej populácii zodpovedá Poissonovmu rozloženiu a nie
je závislá na veku a pohlaví. Exponované skupiny sú hodnotené vo vzťahu k
porovnateľnej kontrole (matching control), ktorá je vyberaná často vo forme
párovaného súboru. Množstvo aberantných buniek v periférnych lymfocytoch
24
neodpovedá kumulovanej dávke genotoxickej látky za viac ako 3 – 4 mesiace,
pretože doba prežívania lymfocytu je asi 100 dní. Pri dostatočnej koncentrácii, dĺžke
expozície a veľkosti dávky sa genotoxické látky stávajú potenciálne nebezpečné
a môžu byť základom vzniku nádorového procesu. Máme k dispozícii viac teórií
vzniku CHA pôsobením žiarenia. Klasická teória hovorí, že žiarenie vyvoláva zlomy
v chromonémach chromozómov. Ak sa vyskytnú 2 zlomy DNA vlákna pri sebe
v rovnakom čase, opticky sa nám javí ako chromatidový alebo chromozómový zlom.
Novšie teórie hovoria, že žiarenie nespôsobuje zlom, ale nestabilnú léziu. Ak takáto
lézia reaguje vhodným spôsobom, nastáva stav iniciácie, čo môže viesť ku vzniku
aberácie. Táto teória od klasickej ponecháva možnosť reverzibilnej zmeny. Podľa
molekulovej teórie je primárne nestabilná lézia v molekule DNA dvojvláknovým
zlomom, ktorý vedie k tvorbe CHA pomocou rekombinačného procesu, kedy sa
enzymaticky indukuje dvojvláknový zlom v mieste rekombinácie, čo je predpokladom
vzniku translokácii. Avšak proces tvorby CHA je v mnohom nejasný. Nevieme, či
zlom skutočne predstavuje vytvorenie medzery v DNA, pričom sa stratí určitý
genetický materiál, alebo nekondenzované oblasti DNA sa práve podrobujú oprave
DNA. Okrem toho mechanizmus pôsobenia žiarenia a chemických látok na vznik
CHA je pravdepodobne rozdielny, hoci konečný výsledok je rovnaký, tzn. vznik CHA.
Podľa uvedených teórií pri poruche opravy zlomu a znovuspojenia sa vytvárajú
štruktúrne zmeny, buď medzi dvoma rôznymi chromozómami, alebo v rámci jedného
chromozómu.v prípade asymetrickej medzichromozómovej zmeny sú obe centroméry
umiestnené na tom istom chromozóme (dicentrický chromozóm) a vzniká ešte
acentrický fragment. Ak vzniknú zlomy na 2 chromozómoch a vymenia si navzájom
acentrické časti vznikajú translokačné formy aberácií. V prípade zlomu na jednom
z ramien chromozómu vzniká chromatidový zlom (na jednej chromatide), alebo
chromozómový zlom (na obidvoch chromatidach). Ak sa vyskytnú 2 zlomy v rámci
jedného chromozómu, každý na inej strane centroméry, môže vzniknúť prstencový
(ring) chromozóm, alebo pericentrická inverzia s acentrickými fragmentmi. Malé
acentrické fragmenty, ktorých dĺžka je rovná alebo menšia ako priemer chromatidy sa
nazývajú minute, ak sa týkajú jednej chromatidy, alebo diminute ak sa týkajú
obidvoch chromatíd (Hayes a kol., 2000; Natarajan a Boei, 2003; Mušák, 2005;
Mateuca a kol., 2006).
V biomonitorovacích štúdiách sa sleduje expozícia rôznym genotoxickým látkam
prítomným v životnom alebo pracovnom prostredí - PAU, etylénoxidu (EO), butadiénu
25
(BD),
styrénu,
antineoplastickým
látkam,
plynným
anestetikám,
epoxidom,
propylénoxidu (PO), ferochrómovým zliatinám, toluénu ai. Výhodou FISH metódy je
možnosť detekcie chromozómových zlomov v interfáze bunkového delenia, čo
umožňuje hodnotiť väčšie bunkové populácie a iné typy buniek.
Sesterské chromatidové výmeny (SCE)
Sú výsledkom vzájomnej výmeny produktov DNA replikácie na identických
miestach sesterských chromatidov replikovaného chromozómu. Vznikajú počas
S fázy a indukujú sa mutagémni, ktoré vytvárajú DNA adukty, alebo ktoré narušujú
proces DNA replikácie. Frekvencia SCE v eukaryotických bunkách sa zvyšuje po
expozícii genotoxickým látkam, ktoré indukujú poškodenia DNA (napr. alkylačné
látky). Nezvyšuje sa účinkom genotoxických látok, ktoré indukujú len zlomy. SCE
môžu byť tvorené aj z dvojvláknových zlomov pomocou restrikčných enzýmov a v
menšej miere pôsobením enzýmov, ktoré nechávajú kohézne konce vnútri DNA.
Kohézne konce DSB môžu byť lepšie fixované bunkovými reparačnými systémami.
(Sonoda a kol., 2001; Norppa, 2004b).
Mikrojadrá (MN)
Mikrojadrá sú malé, mimojadrové telieska, tvorené v mitóze z acentrických
chromozómových fragmentov (klastogénny proces) alebo celých chromozómov
(aneugénny proces), ktoré sa nemôžu pri delení v anafáze začleniť do dcérskeho
jadra. Mikrojadrá, ktoré obsahujú celé chromozómy sú tvorené: a/ primárnym
poškodením deliaceho vretienka, kinetochoru alebo iných častí mitotického aparátu;
b/ poškodením subštruktúry chromozómov; c/ zmenami vo fyziológii bunky; d/
mechanickým poškodením bunky. MN prítomné v kultúre lymfocytov in vitro sú
výsledkom: a/ aberácií chromatidového typu, ktoré sú tvorené počas DNA replikácie
na poškodenom templáte; b/ aberácií chromozómového typu, ktoré sa začali pred
mitózou a replikovali sa; c/ porušením mitotického aparátu, čím sa oneskoruje pohyb
chromozómov (Albertini a kol., 2000; Hemminki a kol., 2000; Bonassi a kol., 2003).
26
3. 2. 3 Biomarkery vnímavosti
Sú merateľnými indikátormi genetických, biochemických a fyziologických faktorov,
ktoré sú nezávisle prítomné u jedinca pred expozíciou a ovplyvňujú pravdepodobnosť
vzniku choroby po expozícii. Slúžia na identifikáciu jedincov osobitne citlivých na
účinok xenobiotík (Hemminki, 2001a; Norppa, 2004a).
3. 2. 4 Význam stanovenia biomarkerov
Biomarkery hodnotenia genotoxického a karcinogénneho rizika u ľudí sú
v súčasnosti rôzne. Význam sledovania biomarkerov je i v tom, že viac ako 70%
novotvarov vzniká vplyvom faktorov životného a pracovného prostredia. Predstavujú
výsledky hodnotenia celého spektra interakcie medzi človekom a jednotlivými
genotoxickými látkami. Začínajú sa hodnotením expozície a zahrňujú proces
absorpcie, metabolizmu, distribúcie, interakcie na kritickom mieste (poškodenie DNA
a
jej
schopnosť
reparácie),
genetických
zmien
a
vzniku
choroby.
Pre
biomonitorovanie je možné používať jedine dostupné tkanivo, pričom informácie o
procesoch v cieľových tkanivách sú interpretovateľné s väčšou alebo menšou
presnosťou. Napr. SSB, CHA a
DNA adukty sa stanovujú v bielych krvinkách,
proteínové adukty v hemoglobíne, HPRT mutácie a chromozómové aberácie
v periférnych lymfocytoch.
Lymfocyty, ktoré sa používajú v biomonitorovacích štúdiách najčastejšie,
predstavujú pomerne zvláštny systém s obmedzenou metabolizačnou schopnosťou a
skôr
odrážajú
interakciu
cirkulujúceho
reaktívneho
intermediátu.
Podobne
nedostatočne je charakterizovaná reparačná kapacita lymfocytov, ktoré sa reparujú
bázovou excíznou reparáciou pomerne dobre, avšak nukleotidová excízna reparácia
je limitovaná nedostatočnou nukleotidovou zásobou. Napriek tomu lymfocyty
poskytujú cenné údaje pre analogické tkanivá, kde môžu poškodenia DNA
perzistovať a viesť k vzniku SSB a CHA. Iným prístupom je stanovenie aduktov DNA
báz z moču. Nevýhodou je to, že nám chýba informácia o cieľových orgánoch, ale
získame nepriamu informáciu o celkovej reparačnej kapacite (ak je známa dávka
genotoxickej látky) pre sledovaný DNA adukt. Hladina DNA a proteínových aduktov
závisí aj na schopnosti viazať sa na lipidy, afinite k metabolickým procesom a
spôsobe expozície.
27
3. 3 CELKOVÉ ANESTETIKÁ A ICH CHARAKTERISTIKA
Celkové anestetiká sú látky, ktoré tlmia činnosť CNS a vyvolávajú stav
bezvedomia spojený so stratou vnímania bolesti. Najsilnejšie pôsobia na tzv.
retikulárny aktivačný systém CNS a mozgovú kôru, najslabšie na životne dôležité
centrá v predĺženej mieche.
3. 3. 1 Plynné inhalačné anestetiká
Patrí tu oxid dusný (N2O), ktorý sa používa ako súčasť takmer každej
kombinovanej celkovej anestézie. Je bezfarebný, nehorľavý a nevýbušný plyn, s
mierne sladkastou vôňou, nedráždi sliznice dýchacieho systému. Pôsobí veľmi dobre
analgeticky, mierne hypnoticky a vôbec nevyvoláva svalovú relaxáciu. Vyvoláva
dobrú celkovú analgéziu a eufóriu (odtiaľ názov „rajský plyn“). Inhalácia samého N2O
vedie k hypoxii. Podáva sa v zmesi s kyslíkom (maximálne 75 % N2O + 25 % O2). Je
netoxický pre srdce, pľúca, pečeň a obličky. Toxický je pre kostnú dreň a
spermiogenézu. Dlhodobá expozícia môže vyvolávať príznaky z nedostatku vitamínu
B12, čím sa naruší syntéza DNA. Pri jednorazovom podaní nemá na pacienta škodlivý
účinok. Často sa diskutuje o tom, či chronická expozícia oxidu dusnému môže
negatívne vplývať aj na zdravotnícky personál (Bohuš a kol., 1992; Barash a kol.,
1993; Jeckova-Tholeová a kol., 1998; Firment a kol., 2001).
3. 3. 2 Kvapalné (prchavé) inhalačné anestetiká
Podľa chemickej štruktúry sa delia na dve skupiny: a/ éterické – dietyléter,
vinyléter, divinyléter); b/ halogénované – chloroform, trichlóretylén, etylchlorid,
halotan, enfluran, metoxyfluran, desfluran, izofluran). Niektoré z nich sa už dnes
nepoužívajú.
Éterické anestetiká
Najvýznamnejší je dietyléter (C2H5)20, ktorý je bezfarebnou horľavou kvapalinou,
a pary tvoria so vzduchom výbušnú zmes. Éter je veľmi účinné klasické anestetikum,
ktoré vyvoláva silný útlm CNS. Používa sa v koncentrácii 3-20 %. Tlmí dýchacie
centrum, dýchanie je však reflexne podporované dráždením dýchacích ciest, najmä
periférnych. Dráždením nervových zakončení v horných dýchacích cestách sa môže
vyvolať reflexné zastavenie dýchania a laryngospazmus. Tlmí aj centrum pre krvný
obeh, čo sa prejavuje v hlbšej anestézii poklesom krvného tlaku. Má dobrý
28
myorelaxačný účinok (tzn. znižuje napätie kostrového svalstva). Je netoxický pre
pečeň a obličky (Jeckova-Tholeová a kol., 1998; Firment a kol., 2001).
Halogénové anestetiká
Etylchlorid C2H5Cl je veľmi prchavá kvapalina, ktorá sa používa na lokálnu
anestéziu kože a slizníc. Rýchlym odparovaním sa koža a podkožie podchladia
a dosiahne sa anestézia mrazom. Je vysoko toxický, a nie je vhodný ako celkové
anestetikum. Štruktúrne vzorce jednotlivých anestetík sú uvedené na obr. 3.
Halotan (fluotan, narcotan) CF3-CHClBr patrí k
halogénovým alifatickým
uhľovodíkom. Je to nehorľavá, nevýbušná, nestála, pri izbovej teplote číra kvapalina.
Pred svetlom sa uchováva v hnedých fľašiach s pridaním tymolu ako stabilizátora. Má
sladkú vôňu, nedráždi sliznice dýchacích ciest. Nepôsobí analgeticky, ale vyslovene
hypnoticky. Ako veľmi účinné anestetikum sa aplikuje v zmesi s O2 a N2O. Používa sa
v koncentrácii 0,5 - 5%. Má sklon deponovať sa v tukovom tkanive, z ktorého sa po
skončení dlhotrvajúcej anestézie uvoľňuje a predlžuje anestetický stav. Mierne tlmí
a najmä zrýchľuje dýchanie. Má bronchodilatačný účinok, krvný tlak znižuje
oslabením sťahov srdcových komôr, rozširovaním ciev a útlmom nervového centra
pre krvný obeh v predlženej mieche.
Obr. 3 Štruktúrne vzorce jednotlivých halogénových anestetík
29
Zvyšuje vnímavosť srdcového svalu na adrenalín a noradrenalín, takže zvyšuje
výskyt srdcových arytmií. Relaxačný a analgetický účinok na kostrové svaly je
nedostatočný. Je hepatotoxický, najmä pri opakovanom a mnohonásobnom použití.
Znižuje sa prekrvenie obličiek, glomerulová filtrácia a tvorba moču. Pri oxidačnom
rozklade vzniká okrem iného kyselina trifluóroctová, ktorá sa vylučuje obličkami.
Uvoľnený fluór však nedosahuje nefrotoxické koncentrácie. Výsledkom redukčných
procesov prestavby sú potenciálne hepatotoxické metabolity. Voľné radikály, ktoré sa
vytvárajú v cytochrómovom systéme P450, sa môžu kovalentne viazať s bielkovinami
a tak spôsobiť nekrózu pečeňových buniek. Hypoxia a indukcia enzýmov napr.
barbiturátmi podporuje vznik hepatotoxických metabolitov (Barash a kol., 1993;
Jeckova-Tholeová a kol., 1998; Firment a kol., 2001).
Sevofluran, izofluran, desfluran a enfluran sú étery, tzn. že sa skladajú z dvoch
uhľovodíkových skupín spojených kyslíkovou väzbou a vyznačujú sa typickým
sladkým zápachom.
Sevofluran (CF3)2-CH-O-CH2F [SEVORANE] je nehorľavé a nevýbušné kvapalné
anestetikum podávané vaporizáciou. Patrí medzi halogénové étery. Bod varu je
58,6°C. Je to číra bezfarebná kvapalina s ovocnou vôňou, miešateľný s etanolom,
éterom, chloroformom a benzínom, ľahko rozpustný vo vode. U rôznych živočíšnych
druhov, vrátane človeka, sevofluran účinkuje ako rýchlo pôsobiace (do 2 minút)
nedráždivé anestetikum. Dochádza k hladkej strate vedomia na začiatku anestézie.
Pri prechode odparovačom vzniká chemická zlúčenina, tzv. zložka A, ktorá môže byť
potenciálne nefrotoxická. Sevofluran pôsobí ľahko vazodilatačne. Dýchanie tlmí viac
ako
halotan
a enfluran.
Znižuje
pooperačnú
nauzeu
a vracanie.
Asi
5%
absorbovaného sevofluranu sa metabolizuje cytochrómom P450 2E1 a vzniká
hexafluoroizopropanol (HFIP), uvoľňuje sa anorganický fluorid a oxid uhličitý. HFIP
sa konjuguje s kyselinou glukurónovou vylučuje ako močový metabolit. Iné
metabolické dráhy sa nezistili. Je jediné fluórované prchavé anestetikum, ktoré
nemetabolizuje na kyselinu trifluóroctovú (Barash a kol., 1993; Jeckova-Tholeová
a kol., 1998; Firment a kol., 2001; www Nobel-SEVORANE, 2008).
Izofluran CHF2-O-CHCl-CF3 [FORANE] je štruktúrnym stereoizomérom enfluranu
a medzi halogénovými uhľovodíkmi je najnovší. Pri izbovej teplote je číra, bezfarebná
kvapalina s podobným zápachom ako éter, je mierne dráždivý. Bod varu je 48,5°C.
Neobsahuje aditíva ani stabilizačné prostriedky. Na základe malej rozpustnosti v krvi
je úvod a záver anestézie rýchly. Účinky na respiračný systém sú rovnaké ako pri
30
halotane. Vyššie dávkovanie znižuje dychový objem, ale nemení dychovú frekvenciu.
Tlmí laryngálny aj faryngálny reflex. Môže zvýšiť krvný mozgový prietok. Vyvoláva
leukocytózu, zvyšuje sa glykémia, nastáva hypotenzia, útlm dýchania, nauzea,
vracanie a pooperačný ileus. Chemicky je mimoriadne stabilný a len 0,2% sa
odbúrava v pečeni na metabolity vylučované močom (Barash a kol., 1993; JeckovaTholeová a kol., 1998; Firment a kol., 2001; www.Nobel-FORANE, 2008).
Desfluran
CHF2-O-CHF-CF3 [SUPRANE]
patrí
do
skupiny
halogénových
metyletyléterov, po inhalačnej aplikácii dochádza k strate vedomia a vnímania bolesti,
potlačeniu vôľovej motorickej aktivity, modifikácii autonómnych reflexov a útlmu
respiračného a kardiovaskulárneho systému. Je halogénovaný iba fluórom. Je číra
bezfarebná, prchavá, málo rozpustná kvapalina, bod varu dosahuje pri izbovej
teplote, preto sa používajú špeciálne odparovače. Vedie k rýchlemu nástupu
a ukončeniu anestézie, pečeň a obličky poškodzuje minimálne. Je vylučovaný
pľúcami a iba minimálne metabolizovaný (0,02%). Vedie k vzniku tachykardie,
dráždi dýchacie cesty, spôsobuje laryngospazmus a zvyšuje bronchiálnu sekréciu.
Nepreukázali sa žiadne mutagénne vlastnosti (Barash a kol., 1993; Jeckova-Tholeová
a kol., 1998; Firment a kol., 2001; Nobel-SUPRANE, 2008).
Enfluran CHF2-O-CF2-CHFCl [ETRANE] do klinickej praxe bol zavedený
začiatkom 70. rokov minulého storočia. Je číry, bezfarebný, sladkasto voňajúci a pri
izbovej teplote tekutý,
môže sa uchovávať bez stabilizátora. Aplikuje sa v zmesi
s kyslíkom, vzduchom a oxidom dusným. Je vhodný na anestéziu detí aj dospelých.
Nezvyšuje bronchiálnu sekréciu ani slinenie, znižuje laryngálne a faryngálne reflexy.
Menej metabolizuje, degradačné produkty sa vylučujú močom. Vyvoláva pokles
krvného tlaku, mierne sa môže zvýšiť srdcová frekvencia. Produktom odbúravania
enfluranu je aj kyselina difluórmetoxydifluóroctová. Publikované boli správy
o poškodení funkcie obličiek po anestézii enfluranom u pacientov s predchádzajúcim
ochorením obličiek. U pacientov s nadváhou môžu vzniknúť nefropatie, najmä po
predchádzajúcom poškodení obličiek (Barash a kol., 1993; Jeckova-Tholeová a kol.,
1998; Firment a kol., 2001; Nobel-ETRANE, 2008).
Metoxyfluran CHCl2-CF2-O-CH3 je nehorľavý a nevýbušný. Je menej dráždivý ako
éter a analgeticky účinnejší ako halotan. Používa sa v koncentrácii 0,2-1,5%.
V porovnaní s halotanom tlmí dýchanie výraznejšie, no cirkuláciu ovplyvňuje menej.
Môže vyvolať prechodnú poruchu funkcie obličiek.
31
3. 3. 3 Toxický a genotoxický účinok anestetík
Dnes sme v období, ktoré môžeme označiť ako kritické ocenenie inhalačnej
anestézie. Poznáme už vedľajšie účinky prchavých inhalačných anestetík ako sú
halotan,
etran,
izofluran
a rajský
plyn.
Pribudli
diskusie
o nebezpečenstve
znečisťovania životného prostredia. No aj napriek tomu má inhalačná anestézia oproti
i.v. anestézii niektoré výhody: a/ pacient je v dostatočnej anestézii a analgézii; b/
inhalačné anestetiká možno jednoducho a presne dávkovať; c/ hĺbku anestézie
možno titráciou rýchlo meniť; d/ inhalačné anestetiká spôsobujú svalovú relaxáciu,
prípadne zosilňujú účinok myorelaxancií; e/ ich vylučovanie v podstate nezávisí od
funkcie pečene ani obličiek; f/ riziko pooperačnej depresie dýchania je malé.
Napriek rôznym chemickým štruktúram spôsobujú všetky opísané látky anestéziu.
Tento reverzibilný, spánku podobný funkčný stav CNS ešte nie je celkom objasnený.
Predpokladá sa, že anestetiká sa viažu na membrány neurónov a primárnou
vzájomnou interakciou ovplyvňujú ich biochemické správanie. Osud inhalačných
anestetík v organizme charakterizujú zákonitosti, ktoré sú vyslovene teoretické, ale
dôležité (Jeckova-Tholeová a kol., 1998; Firment a kol., 2001).
Halotan predstavuje okrem svojich pozitívnych vlastností celý rad toxických
a genotoxických vplyvov. Keď vychádzame z toho, že halotan patrí do skupiny
halogénovaných uhľovodíkov, možno dedukovať, že pracovníci operačných sál, ktorí
sú profesionálne exponovaní nízkym dávkam, majú podobné zdravotné ťažkosti ako
pracovníci v priemyselných závodoch, kde sa produkujú tieto toxické látky.
V súčasnosti
sa
neustále
diskutuje
otázka
mutagénneho,
karcinogénneho
a imunotoxického účinku halotanu. Najmä po opakovaných expozíciách sa
predpokladá imunotoxická aktivita metabolitov halotanu, tzn. kyseliny trifluóroctovej,
trifluóracetaldehydu
a
trifluóretanolu.
Predovšetkým
dochádza
k poruchám
homeostázy, špecifickej a nešpecifickej imunity. Eliminácia halotanu z organizmu
prebieha pľúcami, ale i metabolickou cestou. Jeden z metabolitov halotanu 2-bróm,2chlór,1,1-difluóretylén
je
štruktúrou
podobný
karcinogénnym
haloalkénom
-
vinylchloridu, vinylidénchloridu a trichlóretylénu a pripisuje sa mu zodpovednosť za
akútnu toxicitu a prípadný mutagénny účinok. Mnohé literárne údaje poukazujú na
zvýšenie frekvencie aberantných buniek u pracovníkov operačných sál. Koncentrácia
halotanu bez účinnej vzduchotechniky výrazne prekračuje hodnoty najvyššieho
prípustného expozičného limitu (NPEL). Rozsiahly výskum pracovných podmienok a
zdravotného stavu pracovníkov operačných sál ukázal, že iba na klimatizovaných
32
sálach s 10-12 násobnou výmenou vzduchu sa koncentrácia halotanu zníži na 50-80
3
mg/m (Gut a kol., 1993). Biologická medzná hodnota (BMH) v krvi je 22 μmol.l–1 (2,5
mg.l–1 ).
Nakoľko sa v poslednom období halotan nahradzuje novšími anestetickými plynmi
s menej toxickými účinkami, zvýšená pozornosť sa venuje práve toxicite týchto látok.
Jaloszynski a kol. (1999) sledovali genotoxicitu inhalačných anestetík halotanu
a izofluranu v ľudských lymfocytoch in vitro. Lymfocyty periférnej krvi exponované
1mM izofluranu boli schopné úplnej reparácie počas 60 minút, kým bunky
exponované 0,1mM halotanu sa čiastočne reparovali po 120 min. Zvýšenie DNA
migrácie spôsobené izofluranom alebo halotanom nespôsobuje zánik buniek, ale
môže pôsobiť genotoxicky. Genotoxicita desfluranu sa stanovovala aj kométovym
testom ako rozsah DNA fragmentácie ľudských periférnych lymfocytov in vitro. Zistila
sa zvýšená migrácia DNA ako v bunkách exponovaných desfluranu, tak i v bunkách
exponovaných halotanu, ktoré boli použité ako pozitívna kontrola. Výsledky tejto
práce poukazujú na to, že genotoxicita desfluranu je porovnateľná s genotoxicitou
halotanu (Karpinski a kol., 2005). Sledovali sa aj účinky chronickej expozície
subanestetickým koncentráciám halotanu, sevofluranu a desfluranu na poruchy
správania u laboratórnych potkanov. Po expozícii desfluranu sa zistili väčšie poruchy
učenia a pamäťových funkcií v porovnaní s halotanom a sevofluranom (Ozer a kol.,
2006). Expozícia halotanu v koncentráciách, ktoré sa uplatňujú v klinickej praxi
spôsobuje výrazné zníženie aortálneho prietoku krvi sledovaním ultrasonografickými
technikami
u slepačích
embryí
(Wojtczak,
2000).
Krátkodobým
pôsobením
sevofluranu nedochádza k indukovaniu tvorby sesterských chromatidových výmen
v periférnych lymfocytoch. Po anestéze sevofluranom sa zistila rovnaká frekvencia
SCE (7,92 vs. 7,93) u detí ako pred anestézou (Krause a kol., 2003). Na zistenie
mutagénneho
a karcinogénneho
účinku
sevofluranu
sa
použilo
stanovenie
mitotického indexu (MI) a hladiny SCE. 60 minút po anestéze sa zistil štatistický
pokles mitotického indexu, ktorý trval i 24 hodín po anestéze. K zvýšeniu MI došlo po
5 dňoch od anestézy. Hladiny SCE boli významne vyššie 60 minút po anestéze,
nižšie boli po 24 hodinách a po 5 dňoch sa zistili hladiny rovnaké ako pred anestézou
(Lüleci a kol., 2005). Signifikantné rozdiely sa pozorovali pri použití kométového testu
v lymfocytoch pacientov po anestéze izofluranom v 60. a 120. minúte po anestéze.
Po troch dňoch sa pozoroval návrat hodnôt smerom k východiskovému stavu, ktorý
sa zistil po 5 dňoch od anestézy (Sardas a kol., 1998b). Akin a kol. (2005) vo svojej
33
práci uvádzajú, že počet SCE v bunkách 60 a 120 minút po expozícii desfluranu bol
signifikantne vyšší, ako pred anestéziou v sledovanej skupine pacientov a vyslovujú
názor, že toto anestetikum môže vyvolávať genetické poškodenia. Halotan, enfluran,
izofluran a desfluran môže u pacientov so zvýšenou vnímavosťou vyvolať poškodenie
pečene v dôsledku priameho pôsobenia reaktívnych anestetických metabolitov, ktoré
sa kovalentne naviažu na proteíny. Incidencia hepatotoxicity priamo koreluje
s metabolizmom anestetík, ktorý je katalyzovaný prostredníctvom cytochrómu P450
2E1 (Njoku a kol., 1997). V incidencii prejavu chorobného motorického nepokoja
alebo delíria sa u mladých ľudí nezistil rozdiel medzi pôsobením sevofluranu
a izofluranu pri anestéze (Meyer, a kol., 2007). Sevofluran spôsobuje vyšší chorobný
motorický nepokoj po anestéze u detí ako halotan (Beskow a Westrin, 1999).
Anestetiká inhalované dobrovoľníkmi spôsobovali dráždenie dýchacích ciest v poradí
sevofluran, halotan, izofluran a desfluran. Podobne zvýšenie koncentrácie výrazne
zvyšovalo incidenciu dráždenia (Wilkes a kol., 2003). Propofol sa používa ako rýchle
a krátko pôsobiace intravenózne anestetikum. O jeho genotoxickom účinku je málo
informácií. Diazepam sa používa pri anestéze spolu s fentanylom. U pacientov po
anestéze sa počas operačného zákroku nezvýšila priemerná hodnota CHA (Karahalil
a kol., 2005). Zistilo sa, že pôsobenie sevofluranu počas 8 hodín 2 l/min vedie
k albuminúrii a enzymúrii v prípade, že dávka zmesi A prekročila 240 ppm, tzn., že
koncentrácia zmesi A 30 ppm vdychovaná viac ako 8 hodín, môže viesť k dočasnému
renálnemu poškodeniu (Goldberg a kol., 1999). Prechodným zvýšením hodnoty
plazmatickej alfa-GST po anestézii izofluranom, desfluranom a propofolom sa zistili
symptómy poškodenia hepatocelulárnej integrity (Granados Llamas a kol., 1999).
Ketorolac 90mg IM, rozdelený na dávky približne 10 hodín počas anestézy spolu so
sevofluranom nepreukázal klinicky významné zmeny v renálnej globulárnej alebo
tubulárnej funkcii (Laisalmi a kol., 2001). Pri nízko prietokovej anestézii sevofluanom
a izofluranom sa nezistili sa rozdiely v hodnote alfa GST v plazme, čo nasvedčuje
tomu, že anestézia obidvomi látkami má rovnaký účinok na funkciu pečene (Higuchi
a kol., 2001). Účinkom spinálnej anestézie sa počas trvania operácie nezvýšila
koncentrácia GST, ale 24 hod po operácii bola koncentrácia významne redukovaná
(Ray a kol., 2002). Desfluran je známy svojou nízkou rozpustnosťou v krvi a tkanivách
minimálnou hepatálnou biotransformáciou. Alfa-glutatión S-transferáza (alfa-GST),
špecifický biomarker na hodnotenie hepatálnej integrity bol významne zvýšený pri
34
expozícii desfluranu, jeho hodnota sa znížila po anestézii. Propofol nemá vplyv na
hepatocelulárnu funkciu počas a po operácii (Röhm a kol., 2005).
Biologické monitorovanie profesionálnej expozície sevofluranu popisujú vo svojej
práci Imbriani a kol., (2001). Sevofluran je metabolizovaný cytochrómom P450, ktorý
zabezpečuje oxidáciu fluórmetylových miest v molekulovom reťazci s nasledujúcou
glukuronidizáciou. Stanovovali dva metabolity metódou plynovej chromatografie,
anorganický fluór ako nešpecifický marker a hexafluórizopropanol (HFIP), ktorý sa
metabolizuje enzýmom glukuronidáza. Autori na základe meraní a matematických
prepočtov usudzujú, že hodnoty HFIP zistené v moči (488 mikrogramov/liter a 160
mikrogramov/liter korešpondujú s koncentráciou 2 a 0,5 ppm v ovzduší. Zbytky
halotanových
výparov
na
operačnej
sále
meral
Prokes
(1998).
Zistil,
že
najexponovanejšou skupinou anesteziológov sú inštrumentárne sestry, ktoré sú
najdlhšie prítomné pri anestetickom zariadení. Anesteziologickí lekári sú exponovaní
oveľa menej kvôli tomu, že sa nezúčastňujú na celom operačnom zákroku, ale často
opúšťajú priestor s priamou expozíciou. Boivin (1997) v epidemiologickej štúdii
poukazuje
na
zvýšenie
počtu
spontánnych
potratov
u žien
profesionálne
exponovaných anestetickým plynom. Signifikantné zvýšenie počtu lymfocytov
s migráciou DNA pozorovali autori u anestéziologických sestier a technikov, pričom
sa pozoroval aj aditívny vplyv fajčenia (Sardas a kol., 1998a). Genotoxicitu
pracovníkov profesionálne exponovaných vysokým a nízkym hladinám anestetických
plynov
sledovali
Wiesner
a kol.,
(2001)
v skupine
25
anestéziológov
a anestéziologických sestier z Univerzitných nemocníc východnej Európy (vysoká
expozícia)
a Nemecka
(nízka
expozícia).
Hodnotili
frekvenciu
mikrojadier
v stimulovaných periférnych lymfocytoch. V skupine s vysokou expozíciou zistili
zvýšený výskyt mikrojadier na 1000 dvojjadrových buniek (priemer 14,0) v porovnaní
so skupinou nízko exponovaných jedincov (priemer 9,8). Vysoká expozícia
inhalačným anestetikám zvyšuje chromozómové poškodenia, pričom ich hladina
závisí na výške expozície. Wiesner a kol., (2000) poukazujú na nutnosť znížiť
expozíciu kysličníku dusnému, halotanu a izofluranu, v univerzitných nemocniciach
východnej Európy na úroveň západoeurópskeho štandardu.Frekvenciu sesterských
chromatidových výmen v periférnych lymfocytoch zisťovali Hoerauf a kol., (1999)
v skupine pracovníkov exponovaných kysličníku dusnému a izofluranu. Pracovníci
boli exponovaní 11,8 ppm kysličníku dusnému a 0,5 ppm izofluranu. Po expozícii
zistili zvýšenú frekvenciu SCE (priemer 9,0). Expozícia zbytkovým množstvám
35
anestetických plynov môže viesť k zvýšeniu genetických poškodení porovnateľných
s poškodením u fajčiarov, ktorí vyfajčia 11-20 cigariet denne. Práca Bozkurta a kol.,
(2002) nepotvrdzuje vzájomný vzťah medzi profesionálnou expozíciou zbytkovým
anestetickým plynom a zvýšením hladiny SCE v lymfocytoch. Karelova a kol., (1992)
poukázali vo svojej práci na signifikantné zvýšenie frekvencie aberantných buniek
(AB.B.) a SCE u pracovníkov exponovaných anestetikám (3,84 % vs.1,87% AB.B.).
Zvýšenú frekvenciu CHA zistili Rozgaj a kol. (1999) u 129 pracovníkov operačných
sál, nezistili závislosť na pracovnom zaradení, pričom pozorovali výrazný vzostup
dicentrických chromozómov u lekárov-operatérov. Rozgaj a Kasuba (2000) a Rozgaj
a kol. (2001) sledovali výskyt CHA, MN a SCE u anestéziológov, pričom frekvencia
CHA a MN bola významne zvýšená najmä u žien, výskyt SCE nebol štatisticky
významne vyšší. Frekvenciu CHA, SCE a MN použili na sledovanie cytogenetického
účinku na operačných a reanimačných izbách aj Bilban a kol. (2005). Priemerné
percento CHA bolo 2,69% a bolo porovnateľné so sledovanou skupinou rádiológov.
Chandrasekhar a kol. (2006) zistili výrazné zvýšenie DNA poškodení hodnotených
kométovym testom, frekvencia MN bola vyššia aj v bunkách bukálnej sliznice
i v periférnej krvi. Hodnoty CHA v periférnych lymfocytoch boli zvýšené, ale
nevykazovali závislosť na veku a pohlaví.
3.4 ANTINEOPLASTICKÉ LIEKY A ICH CHARAKTERISTIKA
Antineoplastické lieky (cytostatiká) sú látky, ktoré sa v modernej chemoterapii
používajú na liečenie malígnych tumorov. Zabraňujú neregulovanému deleniu buniek,
alebo poškodzujú medzibunkové prostredie, čím spôsobujú zánik bunky. Okrem ich
priameho toxického účinku, ktorý má rôzne prejavy poškodenia zdravia organizmu, sa
u cytostatík objavujú aj účinky genotoxické. Genotoxicita cytostatík súvisí s priamym
alebo nepriamym poškodením genetického materiálu.
3. 4. 1 Rozdelenie cytostatík a ich účinok
Podľa mechanizmu účinku rozdeľujeme cytostatiká do 5 skupín:
1. Antimetabolity, z ktorých väčšina zasahuje do syntézy nukleových kyselín pričom
nemajú však výrazný vplyv na kompletné nukleové kyseliny. Zníženie koncentrácie
36
nukleotidov sa prejavuje hlavne v množiacich sa bunkách. Nespôsobujú sterilitu ani
dlhodobú myelosupresiu a vznik sekundárnych tumorov vyvolávajú v oveľa menšej
miere ako alkylačné cytostatiká. Podľa mechanizmu účinku ich rozdeľujeme do
niekoľkých
skupín:
antifoláty,
pyrimidínové
antimetabolity,
analógy
guanínu,
adenozínové analógy a inhibítory ribonukleotid reduktázy.
2. Alkylačné cytostatiká
predstavujú chemicky rôznorodú skupinu látok, ktoré vo
svojej štruktúre obsahujú reaktívne elektrofilné alkylové skupiny. Alkylačné cytostatiká
reagujú s nukleovými kyselinami nezávisle od fázy bunkového cyklu. Reaktívne
skupiny atakujú nukleofilné časti molekúl, kde sa nachádzajú atómy kyslíka, dusíka
alebo fosforu (aminoskupiny, imidazolové, karboxylové, sulfhydrylové, fosfátové
skupiny), s ktorými vytvárajú kovalentnú väzbu. Alkylácia DNA môže spôsobiť
nesprávne zaradenie bázy pri replikácii, odlúčenie purínovej bázy s následným
zlomom reťazca DNA. Cytotoxicita bifunkčných alkylačných činidiel (cyklofosfamid,
chlorambucil) sa prejavuje v tvorbe vnútroreťazcových alebo medzireťazcových
mostíkov. Alkylácia jedného miesta na reťazci DNA môže byť relatívne ľahko
opravená, mostíky vyžadujú prítomnosť viacerých reparačných mechanizmov. Tieto
mostíky môžu spôsobiť zastavenie replikácie DNA. Konečným efektom neopraveného
poškodenia DNA je indukcia apoptózy. Alkylačné cytostatiká likvidujú pomaly
proliferujúce nádorové bunky, ale tiež pomaly proliferujúce bunky hematopoézy.
Dochádza k dlhodobému a niekedy aj trvalému poškodeniu krvotvorby. Veľmi často
sa prejavuje amenorea a oligospermia. Mutagénne a karcinogénne pôsobenie týchto
látok na kmeňové bunky hematopoézy sa môže po rokoch prejaviť vypuknutím
akútnej leukémie rezistentnej na chemoterapiu. Patria tu oxazoforíny, deriváty
nitrozomočoviny, tetrazíny.
3. Protinádorové antibiotiká sú to štruktúrne odlišné látky získané z rôznych druhov
streptomycét. Majú antibakteriálny účinok, ale pre liečbu infekcií sú veľmi cytotoxické.
Nemajú spoločný mechanizmus účinku, väčšinou však pôsobia na nukleové kyseliny.
Spoločným
nežiadúcim
účinkom
všetkých
protinádorových
antibiotík
je
myelosupresia. Patria tu antracyklínové antibiotiká a látky príbuzné antracyklínom.
4. Rastlinné alkaloidy: Patrí tu viacero skupín. Najvýznamnejšie a najčastejšie sa
vyskytujúce sú vinca alkaloidy. Špecificky sa viažu na obidve podjednotky tubulínu
37
v priebehu S fázy bunkového cyklu. Zabraňujú tak formovaniu mikrotubulov,
vyvolávajú ich depolymerizáciu a rozklad mitotického vretienka, čím dochádza
k zastaveniu bunkového delenia. Ovplyvňujú aj mikrotubuly, pre chemotaxiu,
migráciu, intracelulárny transport a pohyb organel. Používajú sa najmä pri liečbe
hematologických
malígnych
ochorení.
K rastlinným
alkaloidom
patria
ďalej
podofylotoxínové alkaloidy, kamptotecínové analógy a taxány.
5. Cytostatiká nezaradené do uvedených skupín sa pripravujú synteticky a podľa
mechanizmu účinku nie sú zaradené do žiadnej z predchádzajúcich skupín. Partia tu
platinové cytostatiká a neplatinové cytostatiká. Platinové cytostatiká poškodzujú DNA
a spôsobujú vznik interkalačných väzieb medzi reťazcami, čo zamedzuje replikácii
nukleových kyselín. Niektoré z nich inhibujú činnosť ribonukleotid reduktázy,
ovplyvňujú medzibunkové prostredie na rôznych stupňoch a rôznymi smermi, pričom
zastavujú membránový prenos. Niektoré cytostatiká z tejto skupiny blokujú samotnú
proteosyntézu (Vorlíček a kol., 2000).
Väčšinou sa antineoplastické látky pripravujú synteticky, niektoré protinádorové
antibiotiká a mitotické inhibítory patria k prírodným látkam. Hlavnou úlohou cytostatík
je zastaviť proliferáciu malígnych buniek. Nežiaducim vedľajším účinkom je
poškodzovanie i normálnych deliacich sa buniek a tvorba sekundárnych tumorov.
3. 4. 2 Toxický a genotoxický účinok
Väčšina antineoplastických látok
potrebuje na
vyvolanie svojho účinku
metabolickú aktiváciu v pečeni a väčšina z nich sa vylučuje močom v metabolicky
aktívnej forme. Cytostatiká tým, že narušujú bunkový metabolizmus, rast buniek a
ich delenie, patria medzi látky s najväčšou incidenciou nežiaducich reakcií.
Medzi včasné vedľajšie účinky pri liečbe cytostatikami patrí celková nevoľnosť,
malátnosť, stomatitída, gastritída, vracanie, hnačky, zvýšená teplota, triaška,
vypadávanie
vlasov. Vážnym a typickým príznakom liečby prakticky všetkých
cytostatík je myelosupresia. Ide o poruchu hematopoézy s prejavom leukopénie,
anémie a
trombocytopénie s následným krvácaním. Narušuje sa funkcia srdca,
dochádza k poškodeniu pľúc a znižuje sa činnosť pohlavných žliaz.
Po dlhodobej liečbe cyklofosfamidom sa pozorovala testikulárna atrofia, sterilita,
pri podávaní vinca alkaloidov a alkylačných látok dysplázia gonád, zvýšený výskyt
38
spontánnych potratov a vrodených vývojových chýb. Cytostatiká majú výrazný
neurotoxický, nefrotoxický a hepatotoxický účinok. Potláčajú humorálnu a celulárnu
imunitu, čo svedčí hlavne o zvýšenej náchylnosti k bakteriálnym infekciám, zvýšenej
precitlivelosti kože a vzniku alergických reakcií (Vorlíček a kol., 2000).
Cytostatiká
pôsobia
vo
všetkých
štádiách
bunkového
cyklu.
Zníženie
reprodukčnej schopnosti je spojené s redukciou fertility oboch rodičov alebo
poškodením plodu. I v prezygotickom období sa mutagénny účinok prenáša na
potomstvo. Možné malformácie alebo smrť plodu, sú dôsledkom predchádzajúcich
mutácií zdedených v pohlavných bunkách, alebo následkom neomutácie počas
spermiogenézy alebo oogenézy. V postzygotickom období sa zmeny v bunkách plodu
môžu prejavovať buď priamo, účinkom mutagénov, alebo nepriamo, prostredníctvom
matky činnosťou mutagénnych látok, ktoré prechádzajú placentou.
Vo fibroblastoch kože u myší sa sledovala aktivita DNA polymerázy beta, ktorá sa
významnou mierou podieľa na bázovej excíznej reparácii. Neúplne reparovaná DNA
vyvoláva vznik chromozómových zlomov a môže slúžiť ako spúšťací mechanizmus
apoptózy (Ochs a kol. 1999). Trichostatín, inhibítor histónovej deacetylázy spôsobuje
nárast buniek v G1 fáze a vyvoláva apoptózu. Po jeho pôsobení došlo k zvýšeniu
počtu CHA a FISH metódou sa pozorovali zlomy na chromozómoch a straty
chromozómov 5, 7, 8 a 21 (Olarski a kol., 2006). Chronický príjem cyklofosfamidu
(CP) alebo uretanu (etylkarbamát) rozpusteného v pitnej vode vyvolával u samíc myší
signifikantné
zvýšenie
mikronukleových
monochromatidových
erytrocytov,
translokácie na chromozómoch neboli zistené (Director a kol., 1998). Metotrexát
(MTX) sa používa pri liečení leukémií. Indukuje cytogenetické poškodenia a má
cytostatický účinok. S narastajúcou koncentráciou sa znižuje mitotický index buniek.
Na zníženie toxicity MTX sa používajú leukovorín, vanilín a chlorofylín. Všetky
redukujú frekvenciu mikrojadier o 40-92% a počet aberantných buniek o 16-88%
(Keshava a kol., 1997-1998; Keshava a kol. 1998). Pri profesionálnej expozícii MTX
sa zistil mierny nárast MN, hodnotenie kométového testu preukázalo jeho významný
rozdiel 1,30 vs. 0,07 mikrom., podobne pri hodnotení mutačnej frekvencie v TCR
géne (Deng a kol., 2005). Pri intavenóznej
aplikácii karboplatiny potkanom došlo
k inhibícii erytro- a granulocytopoézy v kostnej dreni, čím došlo k hypodegeneratívnej
anémii, leukopénii a trombocytopénii v periférnej krvi, u myší sa v kostnej dreni
vyskytli CHTA a zvýšil sa počet erytrocytov s mikrojadrami (Karpova a kol., 2001).
Vinkristín sulfát spôsobuje neregulovanú anafázu a distribúciu chromozómov, čím sa
39
zvyšuje počet C mitóz. Cytostatická aktivita sa prejavuje deštrukciou interfázových
a profázových jadier, chromozómovej hmoty a prítomnosťou chromozómového
materiálu v malých kúskoch. Zásahom do funkcie mikrotubulov dochádza k tvorbe
dvojjadrových a mnohojadrových buniek (Nefic a Ibrulj, 1999).
Meraním dĺžky
telomér chromozómov v lymfocytoch sa hodnotil vplyv mitomycínu C (MMC)
a bleomycínu (BLM) na koncové časti chromozómov. MMC znižoval intenzitu
značených telomeráz, pričom došlo k významnému skráteniu na chromozómových
ramenách 2q, 3p, 5q, 7p, 10q, 11p, 13q, 17p, 18pq a 21q chromozómov. Najdlhšie
teloméry boli na ramenách 1p, 3p, 4q, 5p, 12q a 13q chromozómov a najkratšie na
ramenách
13p,
15p,
21p
a
22p
chromozómov
(Wick
a Gebhart,
2005).
Alkylfosfocholíny ako nové protinádorové lieky sa vyznačujú nižšou toxicitou.
Milefozín spôsoboval len slabý pokles proliferácie spermatogónií. Kombinácia
milefozínu
s CP
a hematopoetických
znižuje
deštruktívny
bunkách
myší
cytotoxický
(Martinova
účinok
a kol.,
v spermatogóniách
2006).
Pri
hodnotení
polymorfizmu génov GSTT1, GSTM1, XPD, XRCC1 a XRCC3 a hladinami
indukovaných mutácií bleomycínom (BLM) u zdravých jedincov sa zistil významný
vplyv pri GSTT(-) genotype a pri polymorfizme génu XPD (Angelini a kol., 2008).
Tuimala a kol. (2002) zistili zvýšený počet aberácií CHTA typu v lymfocytoch
ovplyvnených bleomycínom u jedincov s prítomnosťou variantnej alely v géne
XRCC1, kodón 280. Frekvencia CHAs indukovaných BLM nepriamo stanovuje
efektívnosť DNA reparačných mechanizmov. Zisťovala sa
korelácia medzi
frekvenciou CHA a polymorfizmami v génov DNA reparácie: BER - XRCC1; NER XPA, XPC, XPG, XPD, XPF, ERCC1;
HR -
NBS1, RAD51, XRCC2, XRCC3,
RAD51, BRCA1; ako aj génov XME - CYP1A, CYP2E1, NAT2, GSTT1, a EPHX
(mEH). Len XPC exón 15 a intrón 11 majú vzťah s CHAs indukovanými BLM, čo
poukazuje na význam NER pri reparácii CHA (Laczmanska a kol., 2007).
U niektorých pacientok s karcinómom prsníka dochádza k zvýšenej senzitivite buniek
exponovaných IŽ alebo chemickým mutagénom, čím sa indukujú chromozómové
poškodenia (Speit a Trenz, 2004). Významným prognostickým faktorom pri
mnohopočetnom myelóme (MM) je cytogenetické sledovanie. Vo väčšine vzoriek
(62%) sa vyskytujú numerické a štruktúrne aberácie. Väčšinou sa vyskytuje
hyperdiploidia (chromozómy 3, 5, 7, 15, 17, 18, 19) a hypodiploidia (chromozómy 8,
16, 17, 18, X, Y). Z delécií majú najčastejšie zastúpenie 5p11, 11p14, 14q32, 17p11
(Quintero a kol. 2003). Po 14 dňovej terapii liekmi s prítomným CP u pacientov so
40
systémovou lupus erytematosus sa počet CHA nezvýšil, ale došlo k predčasnej
kondenzácii chromozómov (Latipova a Aliavi, 2002). Pri sekundárnej leukémii, ktorá
sa prejavila po aplikácii cytostatickej liečby a/alebo radioterapie po primárnych
tumoroch (Hodgkinova choroba, lymfómy, akútna lymfoblastická leukémia, nádor
prsníka, iné solídne tumory) sa v 60% karyotypov zistila strata dlhých ramien, alebo
celých chromozómov 5 a 7 (Domracheva a kol. 2002). Bilban-Jakopin (2000)
pozoroval po ožiarení nielen prudký pokles mitotickej aktivity lymfocytov, ale aj pokles
ich počtu. Pri kvantitatívnom a kvalitatívnom hodnotení CHA po indukovaní
chemoterapiou u pediatrických pacientov sa najčastejšie vyskytovali zmeny na
chromozómoch 1, 3, 5, 6, 11, 12, 16 a17 (Lopez de Mesa a kol., 2000).
Vedľajšie účinky, ktoré sa prejavujú u pacientov liečených cytostatikami sa podľa
viacerých autorov môžu v určitom, podstatne menšom rozsahu prejavovať aj u
pracovníkov, ktorí s týmito látkami profesionálne prichádzajú do kontaktu. Expozícia
týmto látkam môže nastať pri riedení roztokov, odvzdušňovaní aplikačných súprav a
striekačiek, pri manipulácii s odpadom, výlučkami, bielizňou pacientov, iným
materiálom
kontaminovaným
cytostatikami,
ale
i vírením
usadeného
prachu.
Výnimočne môže dôjsť ku kontaminácii kože, ústnej sliznice, nosovej dutiny a očí
vystreknutím zo striekačky. Zvýšená možnosť ohrozenia zdravia pri profesionálnej
expozícii cytostatikám u zdravotníckeho personálu je predmetom zvýšeného záujmu
už od roku 1976, keď sa poukázalo na alergické reakcie kože, očí a dýchacieho
systému po kontakte s mustínom, metotrexátom a cyklofosfamidom. V roku 1979 sa
upozornilo na zvýšenú mutagénnu aktivitu
moču
u zdravotných
sestier,
ktoré
aplikovali cytostatiká. Poukázalo sa na vedľajšie účinky cytostatík u zdravotníckeho
personálu, hlavne na špecializovaných onkologických ústavoch, kde sa pracuje s
veľkým množstvom a širokou škálou cytostatík. V štúdiách sa poukazuje na celkovú
slabosť, malátnosť, pachute až pálenie a suchosť v ústach, pálenie až zdurenie
sliznice nosa, zápaly očných spojiviek, bolesti hlavy, kožné afekty, výnimočne
vypadávanie vlasov, infekcie respiračného systému, zmeny v krvnom obraze, v
pečeňových testoch a imunologických parametroch exponovaných jedincov (Vorlíček
a kol., 2000). Sledoval sa i vplyv cytostatík na priebeh tehotenstva, výskyt rizikových
gravidít, spontánnych potratov a vrodených vývojových chýb. Zistil sa zvýšený výskyt
spontánnych potratov a vrodených vývojových chýb u detí tých pracovníčok, ktoré
pracovali s cytostatikami hlavne v I. trimestri gravidity. Niektorí autori nezistili vzťah
medzi dĺžkou expozície a potratovosťou, iní tento vzťah pozorovali. Holá a Pyšný
41
(1990) nezistili rozdiel vo výskyte
spontánnych potratov medzi exponovanými a
neexponovanými ženami, ale poukázali na to, že exponované ženy mali 3,3-krát viac
predčasných pôrodov a pôrodov detí s vrodenými vývojovými chybami. Genotoxicita
cytostatík sa prejavuje hlavne nepriamym poškodením genetického materiálu.
Väčšina mutagénov má vlastnosti elektrofilných látok, alebo
látok, ktoré
sa
metabolizujú do elektrofilných intermediátorov schopných tvoriť kovalentné väzby s
nukleofilnými
štruktúrami
bunky
(Rössner
a kol.,
2005).
Bunky
disponujú
mechanizmami, ktoré eliminujú genotoxický účinok na DNA a reparujú vzniknuté
lézie. Konečný prejav mutácie je výsledkom primárneho genetického poškodenia a
reparačných procesov v bunke. Individuálna výkonnosť reparovať poškodenia môže
byť jednou z hlavných vlastností zdedenej predispozície k vzniku nádorov. Mnohí
zahraniční autori na základe svojich štúdií došli k názoru, že zvýšené riziko pri práci
s cytostatikami súvisí s
nedôsledným dodržiavaním bezpečnostných predpisov
súvisiacich s touto prácou. Podľa týchto autorov sa prejavy zvýšenej
cytostatikám
expozície
objavujú len tam, kde personál nie je dostatočne informovaný o
rizikovosti tejto práce a kde nie sú prísne dodržiavané bezpečnostné predpisy (Maluf
a Erdtmann, 2000).
Zvýšenú frekvenciu CHA, SCE a MN po profesionálnej expozícii cytostatickým
liekom popisujú viacerí autori (Mahrous a kol., 1998; Pilger a kol., 2000; Xu a kol.,
2003). Maluf a Erdtmann (2000) zistili vyšší výskyt MN a pozitívny kométový test,
Rubes a kol. (1998) zistil významne vyšší počet translokácií a nestabilných CHA,
Major a kol. (1999) zistili výrazne zvýšenú frekvenciu predčasne rozdelených
centromér, Burgaz a kol. (2002) zistili 2,5-krát vyšší výskyt CHA u exponovaných
pracovníkov. Pozitívny kométový test, vyššiu frekvenciu MN v bukálnej sliznici
a periférnej krvi a hladinu CP v moči zistili Rakhadevi a kol. (2007) a Cavallo a kol.
(2007). Musak a kol. (2006) zistili vyšší výskyt CHA u variantného typu alel v génoch
XRCC1 exón 10 a XRCC3 exón 7. Testa a kol. (2007) v hodnotení polymorfizmu
génov pre GST nezistili významný vzťah v súvislosti s vyšším výskytom CHA. Pri
zisťovaní možnej expozície kože počas prípravy a riedenia sa aj napriek používaniu
rukavíc zistila opakovane kontaminácia kože (Fransman a kol., 2005). Aj Connor
(2006) uvádza, že primárnou cestou kontaminácie antineoplastickým látkam je
expozícia kože. Fransman a kol. (2007a) sledovali aj kontamináciu posteľných
prestieradiel ôsmimi liekmi (cyklofosfamid, ifosfamid, metotrexát, 5-fluorouracil,
etopozid, cytarabin, gemcitabin, chlorambucil). Tieto sa následne zistili aj na koži
42
pracovníkov, ale vo vzduchu sa nenašli. Pri vysokej expozícii sa u pracovníčok
pozorovala dlhšia doba otehotnenia, predčasný pôrod a znížená pôrodná hmotnosť
novorodencov (Fransman a kol., 2007b). Genotoxicita sa analyzovala metódou
kométového testu, frekvenciou MN a oxidačným stresom. Oxidačný stres bol
analyzovaný v sére reaktívnymi zlúčeninami kyseliny tiobarbiturovej a meraním
antioxidačných enzýmov superoxiddismutáza (SOD) a kataláza (CAT). Exponovaní
pracovníci mali zvýšené hladiny DNA poškodenia, kométový test poukázal na
štatistickú koreláciu s dňami odberu vzoriek, frekvencia MN bola signifikantne vyššia
u exponovaných a predstavovala pozoruhodnú koreláciu s vekom a pracovným
časom. CAT bol signifikantne zvýšený, reaktívne zlúčeniny kyseliny tiobarbiturovej
boli významne vyššie na konci pracovného týždňa (Rombaldi a kol., 2008). Zvýšená
expresia
GST
súvisí
s objavením
nádorového
procesu
a s rezistenciou
na
cytostatické lieky. Enzýmová expresia je v priamej úmernosti k veľkosti orgánu
a poškodenia tkaniva a/alebo prítomnosti špecifických izoenzýmov, podozrivých
z tvorby nádoru, z tohto dôvodu monitorovanie GST expresie pomáha lekárom pri
stanovení diagnózy (Sarvary a kol. 1998). Membránovo viazaná mikrozómová GST1
(MGST1) chráni MCF7 bunky
voči účinku niektorých cytostatických liekov,
chlorambucilu, melfalanu a cisplatine nielen pri akútnej toxicite ale tiež i dlhodobých
testoch cytotoxicity (Johansson a kol., 2007). Bicyclol ako syntetický hepatoprotektant
sa prejavuje chemosenzitívnym účinkom na navrátenie rezistencie mnohých liekov a
cytostatických látok. Zhu a kol. (2006) prezentovali, že sa redukoval GST obsah,
GST aktivita a Bcl-2 expresia v stomatickom epidermoidnom karcinóme rezistentnom
sa vinkristín rezistentný (VinRKB) a karcinóme prsníka rezistentnom na adriamycín
(AdrRMCF-7).
P-glycoproteín, glutatión a GST sa nezúčastňujú v rezistencii SC6
buniek Ca prsníka na doxorubicín (Osmak a kol., 1998).
3. 5 XENOBIOTIKÁ A ENZÝMY ICH METABOLIZMU
3. 5. 1 Definícia xenobiotík
Xenobiotiká sú prírodné alebo umelo syntetizované chemické látky, ktoré sú pre
organizmus cudzie (napr. lieky, pesticídy, alkaloidy, znečisťujúce látky, metabolity a
toxíny tvorené hubami, rastlinami a zvieratami), pričom mnohé z nich môžu narušovať
endokrinný systém (Parkinson, 1996). V biotransformovanom stave môžu vyvolávať
43
DNA poškodenia a poruchy replikácie môžu viesť k ireverzibilným mutáciám, k vzniku
nádoru a/alebo k progresii karcinómu (Thilly, 2003). Z epidemiologických štúdií
vyplýva, že 80 - 90% všetkých nádorov vzniká pod vplyvom životného a pracovného
prostredia (fajčenie, životospráva, profesionálna expozícia). Individuálna schopnosť
biotransformácie toxických látok na netoxické metabolity môže byť prvým krokom
obrany pred ich toxickým účinkom. Biotransformácia sa vyznačuje premenou
lipofilných látok na látky hydrofilné, ktoré sa môžu z tela rýchlejšie vylúčiť.
3. 5. 2 Gény a enzýmy metabolizmu xenobiotík (XME)
Na ľudský organizmus neustále pôsobí veľké množstvo xenobiotík. Na svoju
ochranu pred týmito hlavne lipofilnými látkami má organizmus vytvorený rozsiahly
biotransformačný enzymatický systém. Biotransformačný proces rozdeľujeme na dve
fázy: a/ aktivačnú; b/ detoxifikačnú. V aktivačnej fáze dochádza k transformácii
xenobiotík tak, že sa zavádzajú hydroxylové skupiny a dochádza k vzájomnému
pôsobeniu vytvorených elektrofilných substrátov s DNA a proteínmi. Dochádza k
rozkladu nenasýtených dvojitých väzieb a k vzniku napr. epoxidov. Viac ako 90%
enzýmov I. fázy pripadá na systém cytochrómu P450 (CYP). V detoxifikačnej fáze
zabezpečujú
enzýmy
(napr.
epoxidhydroláza,
glutatión
S-transferáza,
N-
acetyltransferáza, metyltransferáza ai.) konjugáciu metabolického produktu prvej fázy
s glutatiónom, kyselinou glukurónovou, sulfátom, cysteínom alebo acetátom. Takto
vytvorený hydrofilný derivát sa môže ľahko vylúčiť do moču alebo žlče (Raunio a kol.,
1995; Salagovic a kol., 2000).
Metabolická aktivácia a detoxifikácia sú významné v procese chemickej
karcinogenézy. Väčšina chemických látok s karcinogénnym účinkom potrebuje pred
interakciou s makromolekulou bunky metabolickú aktiváciu. Enzýmy I. fázy podporujú
aktiváciu prokarcinogénov na genotoxické elektrofilné intermediáty. Enzýmy II. fázy
väčšinou pôsobia ako inaktivačné, tzn. katalyzujú väzbu metabolitov na kofaktory,
transformujú ich na viac elektrofilné produkty a tak umožňujú ich vylúčenie z tela.
Vyvážená expresia a regulácia enzýmov metabolizmu xenobiotík (XME) v oboch
fázach môže byť dôležitým faktorom vnímavosti jedinca k vzniku nádoru.
Mutácie v génoch môžu spôsobovať tvorbu defektných enzýmov, prípadne tvorbu
špecificky zmeneného substrátu s rozdielnym stupňom aktivity. Kombinácia alel
týchto génov môže spôsobiť zvýšenie alebo zníženie individuálnej vnímavosti jedinca
44
na určitú toxickú látku prostredia. Tieto rozdiely súvisia s polymorfizmom príslušných
génov (Ingelman-Sundberg, 1998). Enzýmy metabolizmu xenobiotík sa prejavujú
polymorfne a spolu s niektorými faktormi ako vek, pohlavie, rasová príslušnosť,
spôsob výživy, zdravotný stav, fajčenie a iné, môžu mať vplyv na distribúciu a stálosť
chemických látok (Nakajima a kol., 2000). Zvýšená pozornosť sa venuje zmenám
vnímavosti jedincov na vznik ochorenia a stanoveniu rizikových faktorov vo vzťahu k
prevencii. Génový polymorfizmus, ktorý predstavuje principiálne ovplyvnenie
metabolickej aktivácie alebo detoxifikácie karcinogénnych chemických látok, je
dôležitým faktorom vnímavosti (Perera, 1997). Venovať sa budeme génom a ich
produktom, ktorých polymorfizmus bol hodnotený v tejto habilitačnej práci, ktoré sú
dôležité v biotransformácii chemických látok a majú úzky vzťah k vzniku nádorov. Sú
to gény cytochrómu P450 – CYP1B1 kodón 453 a CYP1B1 kodón 432, gény
mikrozomálnej epoxidhydrolázy1 – EPHX1, gény glutatión S-transferázy – GSTM1,
GSTM3, GSTP1 a GSTT1 a gén pre NAD(P)H dehydrogenázu NQO1.
Cytochróm P450 (CYP)
Primárnou úlohou systému cytochróm P450 (CYP) je metabolizmus a
detoxifikácia exogénnych zložiek, ktoré sa dostanú do organizmu tráviacim traktom.
Najviac sa nachádza v pečeni a tenkom čreve. Lokalizovaný je v endoplazmatickom
retikule buniek. Základnými enzýmami systému P450 sú monooxygenázy, ktoré
katalyzujú mnohé reakcie, syntézu cholesterolu, steroidov a niektorých lipidov.
V systéme P450 je v súčasnosti známych viac ako 30 izoenzýmov. Väčšina
karcinogénov prostredia je aktivovaná hlavne génmi CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1,
CYP2E1, CYP2D2 a CYP3A. Niektoré sú polymorfné a vykazujú rozdielnu
metabolickú aktivitu (Autrup, 2000).
CYP1B1
CYP1B1 (cytochróm P450, skupina 1, podskupina B, polypeptid 1). Tento gén
patrí do skupiny CYP1 a nachádza sa na chromozóme 2, v úseku 2p21-22. Má
veľkosť okolo 10 kb a obsahuje 3 exóny a 2 intróny. V exóne 3 sú prítomné tri
polymorfizmy: v kodónoch 432, 449 a 453 – (C→G) Leu432Val, (C→T) Asp449 a
(A→G)
Asn453Ser.
monooxygenáza,
Cytochróm
ktorá
sa
P450
zúčastňuje
1B1
na
(CYP1B1)
je
hemotiolátová
NADPH-dependentnej
fáze
I
monooxygenáciou rôznych látok vrátane mastných kyselín, steroidov a xenobiotík
45
(www Genecards CYPIB1, 2008). CYP1B1 katalyzuje tvorbu genotoxického 4hydroxyestradiolu, ktorý je metabolitom katecholových estrogénov. Začleňuje 1 atóm
atmosférického kyslíka do molekuly, pričom dochádza k tvorbe nových funkčných
skupín (-OH, -NH2, -COOH). Je zahrnutý i do aktivácie PAU a heterocyklických
aromatických amínov a potenciálnych karcinogénov prsníka u experimentálnych
živočíchov. V niektorých experimentoch sa ukazuje, že gén CYP1B1 je viac aktívny
pri aktivácii PAU na genotoxické metabolity ako gén CYP1A1 (Sissung a kol., 2006;
Wanging a kol., 2007). Expresia CYP1B1 je klinicky významná v neoplastickom
procese, metabolizme nádorov a liečbe rakoviny. Expresia súvisí s výskytom
karcinómu hrubého čreva, pľúc, obličiek, močového mechúra, glaukómu a čiastočne
sa pozoruje vzťah pri karcinómoch, ktoré súvisia s aktivitou hormónov (prostata,
prsník, endometrium, ovaria). CYP1B1 je regulovaný niekoľkými kľúčovými
transkripčnými faktormi, ako napr. aryl hydrouhlíkový receptor (AhR), AhR jadrový
translokátorový (ARNT) komplex (AhR/ARNT), Sp1 transkripčný faktor, cyklický AMP
(cAMP)–response element–binding protein (CREB) a estrogén receptor (ER).
Polymorfizmus CYP1B1 génu (predovšetkým CYP1B1*3 alela)
môže významne
vplývať na riziko vzniku nádorov spojených s metabolizmom estrogénu. Najvyššia
hladina CYP1B1 sa zistila v endometriu. V nádorových bunkách je expresia CYP
génov nižšia, čím sa podmieňuje vyššia cytostatická stabilita nádorových buniek. Pri
expresii Ah receptora, ARNT a AHRR indukoval benzo(a)antracén zvýšenie mRNA
expresie inducibilných génov (Evteev a kol. 2006). 4-hydroxyestradiol (4-OHE2) ktorý
je oxidačným metabolitom 17-beta-estradiolu (E2) a prednostne sa tvorí pomocou
cytochrómu CYP1B1, reaguje s DNA a vznikajú adukty, ktoré pôsobia genotoxicky
a karcinogénne. 4-OHE2 metabolizuje na chinón oxidáciou dvoch elektrónov a počas
tohto procesu sa môžu vytvárať reaktívne kyslíkové skupiny, ktoré môžu spôsobovať
poškodenia DNA a bunkovú smrť (Chen a kol., 2005).
Aktivácia 17beta-estradiolu (E2) spojená s tvorbou katecholových estrogénových
metabolitov 2-OH-E2 a 4-OH-E2 a C-16alfa hydroxylového produktu 16alfa-OH-E2 sa
považuje za významný faktor karcinómu prsníka. Zisťovalo sa, či polymorfizmus má
vplyv na aktivitu estrogénovej hydroxylázy. Vytvorilo sa päť polymorfných variantov:
variant 1 (kodón 48Arg-Gly), variant 2 (kodón 119Ala-Ser), variant 3 (kodón 432ValLeu), variant 4 (kodón 453Asn-Ser), variant 5 (48Gly, 119Ser, 432Leu, 453Ser). Divý
typ CYP1B1 tvoril 4-OH-E2 ako hlavný produkt, nasledoval 2-OH-E2 a 16alfa-OH-E2.
Varianty tvorili tiež 4-OH-E2 ako hlavný produkt ale s 2,4 - 3,4-krát vyššou
46
katalytickou účinnosťou. Variantné typy tiež prevyšovali v 2- a 16alfa-hydroxylačnej
aktivite oproti divému typu alel. Hydroxylačná aktivita estrogénu môže byť výrazne
závislá na dedičnom základe a môže súvisieť s interindividuálnymi rozdielmi vo
výskyte karcinómu prsníka sprostredkovaného karcinogenitou estrogénu (Hanna
a kol., 2000). Expresia génu CYP1B1 v epitelových bunkách prsníka poukazuje na to,
že tento enzým môže zohrávať dôležitú úlohu v aktivácii environmentálnych
karcinogénov a endogénnych estrogénov
in situ. Katecholové estrogény sú
metabolicky inaktivované enzýmom katechol O-metyltransferáza (COMT). CYP1B1 a
COMT sú dôležité pri metabolizme estrogénov a pri hodnotení polymorfizmu
v kodóne 432 (C→G) Leu432Val sa u žien s genotypom Leu/Leu zistil 2,3-krát vyšší
výskyt karcinómu prsníka (Wanging a kol., 2007). Epidemiologické štúdie dokazujú,
že väčšina rizikových faktorov vzniku rakoviny prsníka súvisí s reprodukčnými
a hormonálnymi faktormi. Estrogén sa považuje za spúšťací mechanizmus, ktorý si
vyžaduje metabolizmus na metabolit katecholového estrogénu. Ženy s genotypom
CYP1B1*3 (Leu432Val) s alelou pre Val majú vyšší výskyt nádoru prsníka v závislosti
na veku, skoršom nástupe menarché, veku prvej tehotnosti, BMI indexe a fajčení.
Riziko sa zvyšovalo, keď BMI bol vyšší ako 24 kg/m(2) (Kocabas a kol., 2002).
Kocabas a kol. (2005) hodnotili polymorfizmus CYP1B1 (Leu432Val), COMT
(Val158Met) a MnSOD (Ala9Val) a zistili, že ženy s genotypom CYP1B1*3 a COMTL alely mali skorší nástup menarché. Pri hodnotení polymorfizmu CYP1B1 v kodóne
432 (Val-Leu) sa zistilo, že ženy s prítomnou alelou Val mali zvýšené riziko Ca
prsníka (Saintot a kol., 2004). V populácii poľských žien nesúviseli haplotypy
a individuálny SNP s rizikom Ca prsníka (Gaudet a kol., 2006). Pri sledovaní expresie
GST pi, mu, alfa a CYP1A1/2, 1A2, 3A4/5, 1B1, 2E1 sa zistilo, že expresia GST pi
súvisí s lepšou diferenciáciou nádoru a redukciou metastáz, GST mu expresia súvisí
s pozitívnym estrogénovým receptorom (Haas a kol., 2006). Kombinácia genotypu
105IV/VV a CYP1B1 119AA vykazovala 2 násobne vyššie riziko a kombinácia GSTP1
105IV/VV, CYP1B1 119AS/SS a GSTT1(-) genotypu 4 násobne vyššie riziko Ca
prsníka (Van Emburgh a kol., 2008). Polymorfizmus Ala-Ser v kodóne 119
signifikantne súvisel s výskytom nádoru prsníka alebo karcinómu epitelových buniek
pľúc (Watanabe a kol. 2000).
Pri hodnotení polymorfizmu CYP1B1 a Ca pľúc sa zistilo, že jedinci s variantným
genotypom CYP1B1 Arg48Gly a Ala119Ser polymorfizmom (CYP1B1*2) mali vyššie
riziko, pri sledovaní haplotypov v kodóne 48 (Arg48Gly) a kodóne 119 (Ala119Ser)
47
sa zistili rozdiely v troch haplotypoch (G-T-C-A, G-T-G-A and G-T-C-G). Fajčenie
významne
zvyšovalo
riziko
pľúcneho
karcinómu
u pacientov
s kombináciou
genotypov CYP1B1 Ala119Ser a CYP1B1 Leu432Val (Shah a kol., 2008). V skupine
fajčiarov mala na vznik karcinómu hlavy a krku najväčší účinok kombinácia genotypov
CYP1B1 (Leu432Val) C/G a G/G genotyp, nasledoval genotyp CYP1B1 (Leu432Val)
a CYP2E1 (-70G>T) G/T (Harth a kol., 2008). Zvýšenú expresiu hCYP1B1 pozorovali
v nádorových tkanivách a premalígnych formách Ca prostaty ako rizikový faktor
extrahepatálnej karcinogenézy (Green a kol., 2008). Pri hodnotení expresie CYP1B1
a hladín lipidov v krvi sa zistila významne nižšia hladina HDL cholesterolu pri vysokej
expresii, triglyceridy, LDL cholesterol a celkový cholesterol nemali významný súvis
s expresiou.
Pracovníci s alelou CYP1B1*3
mali signifikantne vyšší HDL, LDL
a celkový CH v porovnaní s genotypom CYP1B1*1/*1 (Hu a kol., 2008).
Epoxidhydroláza (EH)
Enzým, ktorý zohráva dôležitú úlohu pri aktivácii a detoxifikácii exogénnych
chemických látok, hlavne polycyklických aromatických uhľovodíkov (PAU).
EPHX1
EPHX1 (mikrozómová epoxidhydroláza 1). Gén sa nachádza na chromozóme 1
v polohe 1q42.1, má veľkosť 20,29 kb a obsahuje 9 exónov a 8 intrónov. Veľkosť
intrónov je 335-6.696 bp a obsahujú početné opakujúce sa úseky DNA vrátane 18 Alu
sekvencií. N-koniec sa svojou štruktúrou vyskytuje v 6 izoformách. Zistili sa u
všetkých živých organizmov (cicavce, bezstavovce, rastliny, huby a baktérie).
Epoxidhydrolázy tvoria skupinu enzýmov, ktoré katalyzujú adíciu vody epoxidov a
vytvárajú trans dioly. Deriváty epoxidov sú reaktívne elektrofilné látky s trojčlenným
kruhom a veľkou polaritou C-O väzby a sú častými metabolitmi pri biotransformácii
rôznych
zlúčenín
(Cajas-Salazar
a kol.,
2003;
www
NCBI
EPHX1,
2008).
Mikrozómová epoxidhydroláza je bifunkčný proteín, ktorý zohráva dôležitú úlohu
nielen v metabolizme karcinogénov, ale je tiež schopný sprostredkovať na N závislú
absorpciu žlčových kyselín do hepatocytov. Zhu a kol. (2003) sledovali pacientov
s extrémne vysokou hladinou žlčových solí. EPHX1 proteín a hladiny mRNA boli
redukované o 85-95%. Sekvenčnou analýzou zistili v EPHX1 géne 2 bodové mutácie
transverziu
-4238T-A
a transverziu
2557C-G.
Popísala
sa
korelácia
medzi
mutantnými alelami EPHX a zníženou enzýmovou aktivitou. Aj štúdiou in vitro sa
48
dokázalo, že substitúcia His113 za bežnejšie sa vyskytujúci Tyr113 v exóne 3 znižuje
aktivitu EPHX približne o 40%. Variant tohto typu môže byť zodpovedný za genetickú
vnímavosť na prírodný karcinogén aflatoxín B1 a vysvetľuje sa tým rozdiel vo výskyte
hepatocelulárneho karcinómu (Hassett a kol., 1994). Laasanen a kol. (2002) zistili pri
analýze polymorfizmu v exóne 3 a 4 vysokú aktivitu haplotypu T/A v exóne 3
(Tyr113His) v skupine žien s preeklampsiou. Stanovila sa frekvencia polymorfizmov
biotransformačných enzýmov u pacientov s Hodgkinovým a non-Hodgkinovým
lymfómom a zdravých jedincov. Distribúcia genotypu CYP2E1 intrón 6 a EPHX1 exón
3 sa významne odlišovala vo všetkých lymfómoch v porovnaní s kontrolou. Geneticky
polymorfizmus biotransformačných enzýmov môže zohrávať významnú úlohu vo
vývoji lymfoidnej malignity ( Sarmanova a kol., 2001). Zistil sa slabo pozitívny vzťah
medzi polymorfizmom GSTP1 rs1695 a chronickou otravou benzénom. Riziko otravy
je vyššie u jedincov s EPHX1 GGAC/GAGT alebo AGAC/GAGT diplotypom.
Požívanie alkoholu u jedincov s genotypom EPHX1 rs3738047 GA+AA a abstinencia
u jedincov s genotypom GSTP1 rs1695 AA vedie k zvýšenej vnímavosti na toxicitu
benzénu (Sun a kol., 2008). CHA a SSB sa hodnotili ako biomarkery genotoxicity vo
vzťahu k polymorfizmu génov pre enzýmy metabolizmu xenobiotík (CYP1A1,
CYP2E1, EPHX1, GSTM1, GSTP1 a GSTT1) a DNA reparačných génov (XPD exón
23, XPG exón 15, XPC exón 15, XRCC1 exón 10 a XRCC3 exón 7) pracovníkov
gumární. Jedinci s nízkou aktivitou EPHX1 mali významne vyšší výskyt CHA, pričom
nižšia frekvencia sa pozorovala u variantných homozygotov (Vodicka a kol. 2004a).
Glutatión S-transferáza (GST)
Glutatión S-transferázy (GST) predstavujú komplex izoenzýmov, ktoré sa
vyskytujú v cytozolovej alebo membránovo viazanej forme. Zohrávajú dôležitú úlohu
v metabolizme bunky a detoxifikácii karcinogénov. Enzýmy katalyzujú reakciu
glutatiónu (GSH) s veľkým množstvom organických látok, pričom dochádza k tvorbe
tioéterov. Pri detoxifikácii sprostredkovávajú konjugáciu veľkého počtu elektrofilných
zlúčenín s redukovaným glutatiónom. Tieto konjugačné reakcie umožňujú vylúčiť
mnohé xenobiotiká, vrátane karcinogénov, toxínov a liekov vo forme kyseliny
merkapturovej
(Nakajima
a
Aoyama,
2000).
Pretože
konjugácia
glutatiónu
s xenobiotikami môže zabrániť ich toxickej väzbe na bunkové komponenty, zohráva
GST dôležitú úlohu v antioxidačnej ochrane organizmu. Bunková rovnováha
glutatiónu sa mení účinkom toxických zlúčenín a môže viesť k poškodeniu (napr.
49
peroxidáciou lipidov) alebo k zániku bunky. V súčasnosti je známych 8 skupín
izoenzýmov GST: alfa, kappa, mu, omega, pí, sigma, théta, dzéta. U všetkých foriem
sa prejavuje polymorfizmus, ktorý vedie k výraznej zmene metabolickej aktivácie
chemických karcinogénov medzi jedincami. Najviac sledovaným polymorfizmom GST
je neprítomnosť génu v homozygotnom stave GSTM1 alebo GSTT1. Predpokladá sa,
že obidve GST sa nachádzajú v lymfocytoch periférnej krvi, avšak len GSTT1 sa
nachádza v červených krvinkách (Wang a kol., 2000; Norppa, 2003).
GSTM1
GSTM1 (glutatión S-transferáza mu 1). Gén sa nachádza na chromozóme 1
v polohe 1p13.3. Má veľkosť 5,92 kb a obsahuje 8 exónov. Jeho polymorfizmus bol
popísaný v triede mu. Je polymorfný a predstavuje nefunkčnú nulovú alelu GSTM1*0
a dve aktívne alely GSTM1*A a GSTM1*B. Nulová alela má vysokú frekvenciu (70%).
GSTM1(-) fenotyp je prítomný vo viac ako 50% Ázijcov, Číňanov a Indov. Nulový
fenotyp je dôsledkom delécie GSTM1 génu. Deficit génu môže byť rizikovým faktorom
vzniku rakoviny a má za následok zvýšenú citlivosť na niektoré chemické
karcinogény. Zistil sa vzťah medzi GSTM1 nulovým fenotypom a sklonom k vzniku
karcinómu pľúc a kolorektálneho karcinómu. Frekvencia nulového genotypu GST(-) je
vyššia u belochov a frekvencia GSTT1(-) u černochov. Tvorba DNA a proteínových
aduktov je modulovaná polymorfizmom génov( www NCBI GSTM1, 2008).
Enzým
sa
zúčastňuje
na
detoxifikácii
elektrofilných
zlúčenín,
vrátane
karcinogénov, liekov, toxínov životného prostredia a produktov oxidačného stresu
konjugáciou s glutatiónom. Ľahko sa získava z pečene, obličiek, nadobličiek a
žalúdka a len veľmi ťažko z kostrových svalov a srdcového svalu. Katalyzuje
detoxifikáciu alkyl a polycyklických aromatických uhľovodíkov, ktoré sú prechodnými
stupňami mnohých karcinogénov.
Redukuje tiež niektoré superoxidy a produkty
oxidačného stresu, napr. DNA hydroperoxidy. Homozygotnosť pre GSTM1*0 má úzky
súvis so zvýšeným rizikom rôznych ochorení, vrátane chronickej bronchitídy,
arteriosklerózy a rôznych typov nádorov - adenokarcinóm, pľúcny a kolorektálny
karcinóm (www NCBI GSTM1, 2008).
U jedincov so zníženým stupňom detoxifikácie, napr. v GSTM1 géne vedie
k zvýšenej hladine DNA aduktov a zvyšuje sa počet CHA (Autrup, 2000). U pacientov
so zníženou schopnosťou metabolizovať environmentálne karcinogény alebo toxíny
sa môže zvyšovať riziko vzniku aplastickej anémie (Lee a kol. 2001). Godschalk a kol.
50
(2001) poukázali na kombinovaný účinok genetických polymorfizmov v 4 lókusoch
a následkom expozície komplexu karcinogénov, pričom simultánne hodnotenie
viacerých genotypov môže odhaľovať jedincov s vysokým rizikom výskytu nádoru.
Signifikantne nižšia GSTM1 nulová alela sa zistila u pacientov s chronickou
pankreatitídou (Verlaan a kol. 2003). Gilliland a kol. (2004) zistili, že GSTM1 a GSTP1
vplývajú na alergickú precitlivelosť účinkom výfukových plynov. Jedinci s GSTM1(-)
genotypom alebo GSTP1 Ile105 divým typom alel vykazovali významne vyššie
hladiny IgE a histamínu po pôsobení výfukových plynov. French a kol. (2005)
v skupine 126 detí s akútnou lymfoblastickou leukémiou zistili, že polymorfizmus
GSTM1(-) je významným prediktorom celkovej expresie génu a vyslovili možné
dôsledky expresie génu v rozdielnych tkanivách. Lohmueller a kol. (2003) poukázali
na vzťah homozygotnosti pre nulovú alelu GSTM1 génu a karcinómu hlavy a krku.
Genotyp GSTM1(-) má 2-násobne vyššie riziko vzniku slnečnej keratózy, čiastočne
spojenej s vyššou expozíciou slnku a synergickým vplyvom s fenotypovým rizikovým
faktorom tzn. svetlou kožou, ktorá sa ťažko opaľuje (Carless a kol. 2002). Nedostatok
GSTM, tzn. genotyp GSTM(-) súvisí so zníženou senzitivitou na genotoxicitu
tabakového dymu. U fajčiarov sa zistila zvýšená frekvencia CHA (Norppa, 2004).
GSTM1 a GSTT1 nulový genotyp vykazoval vyššie riziko výskytu rakoviny močového
mechúra.
Vplyv
GSTM1
nulového
variantu
bol
fajčiarov,
kombinovaný
s profesionálnou expozíciou aromatickým amínom (Hung a kol. 2004). Haase a kol.
(2002) zistili, že pacienti s karcinómom prsníka a dedičnosť založená na kombinácii
delécie génov GSTM1 a GSTT1 môže zvyšovať riziko vývoja sekundárnej
hematologickej
neoplazie
vyvolanej
terapiou.
Pri
hodnotení
výskytu
CHA
u zdravotných sestier vo vzťahu k polymorfizmu metabolických génov (GSTM1,
GSTT1, GSTP1, GSTA1) sa nezistili žiadne rozdiely (Testa a kol., 2007).
GSTM3
GSTM3 (glutatión S-transferáza mu 1). Gén je sa nachádza na chromozóme 1
v polohe 1p13.3 v tesnej blízkosti lókusu pre GSTM1. Glutatión S-transferáza mu 3
bola klonovaná z cDNA a je na 72% rovnaká ako GSTM1. Dochádza ku konjugácii
veľkého počtu exogénnych a endogénnych hydrofóbnych elektrofilných látok
s redukovaným glutatiónom. Vykonáva absorpciu a detoxifikáciu endogénnych
zlúčenín a xenobiotík. Prezentoval sa alelizmus v GSTM3 géne použitím PCR metódy
a špecifických primerov pre exón 6 a 7. Sekvenovanie ukázalo mutantnú alelu
51
GSTM*B, ktorá sa vyznačuje deléciou 3 bp v intróne 6 a má frekvenciu 16%.
GSTM*B významne súvisí s alelou GSTM1*A a je v tesnej blízkosti GSTM1 lókusu.
Expresia enzýmu sa prejavuje hlavne v testes a v hematoencefalickej bariére mozgu
(www NCBI GSTM3, 2008).
GSTP1
GSTP1 (glutatión S-transferáza pí 1). Je umiestnený na chromozóme 11, v
polohe 11q13-q22. Má veľkosť 2,84 kb a obsahuje 7 exónov. Je prítomný
v leukocytoch všetkých buniek a tkanív. V erytrocytoch nie je prítomný. Expresia
enzýmu sa prejavuje hlavne v placente, slezine, srdci a pľúcach. Vyššia expresia
GSTP1 sa zistila v nádorových bunkách v porovnaní s normálnymi. Vo veľkom
množstve je prítomný v koži. Izolovala sa cDNA, ktorá korešpondovala s tromi
polymorfnými alelami
GSTP1*A, GSTP1*B a GSTP1*C, ktoré sa prejavovali
v normálnych i nádorových bunkách. Variantné genotypy boli výsledkom tranzícií A-T
a C-T na nukleotidoch 313 a 341. Tranzície menia v GSTP1*A, GSTP1*B a GSTP1*C
kodón 105 z ATC (Ile) na GTC (Val) a kodón 114 GCG (Ala) na GTG (Val) v
GSTP1*C. Polymorfizmus v kodóne 105 vo forme Ile105Val (A→G) sa prejavuje
v špecificite substrátu a tepelnej stabilite, ktorá vedie k funkčnej premene a rozdielnej
katalytickej aktivite. Enzýmy s 105Val alelami majú 7-krát vyššiu katalytickú účinnosť
pre PAU diolové epoxidy, ale 3-krát nižšiu účinnosť pre 1-chlór-2,4-dinitrobenzén
v porovnaní s divým typom alely GSTP1*A. Zvýšenie expresie GSTP1 génu úzko
súvisí s malígnou transformáciou, odolnosťou na protinádorové lieky a zníženou
schopnosťou prežívania. V mnohých nádoroch a preneoplastických léziách sa
pozoroval zvýšený prejav GSTP1 proteínu (www NCBI GSTP1, 2008).
Alan a kol. (2001) na základe predpokladu, že polymorfizmus v génoch ktoré
kódujú GST mení vnímavosť karcinogenézy indukovanej chemoterapiou hlavne
terapie týkajúcej sa akútnej myeloidnej leukémie (AML) dospeli k výsledku, že v
GSTP1 alela Val105 signifikantne zvyšuje po cytotoxickej chemoterapii riziko vzniku
AML, ale po rádioterapii nezvyšuje. Wilk a kol. (2006) uvádzajú, že expozícia
herbicídom môže modifikovať vzťah medzi polymorfizmom GSTP1 génu a vekom
nástupu Parkinsonovej choroby. Polymorfizmus Ile105Val v exóne 5 môže mať podiel
na vulnerabilite psychóz súvisiacich s abúzom metamfetamínom (Hashimoto a kol.
2005). Karcinóm pľúc je na poprednom mieste v úmrtnosti a má priamu súvislosť
s fajčením a profesionálnou expozíciou karcinogénom. Pri sledovaní 31 génov I. a II.
52
fázy metabolizmu a antioxidačnej schopnosti sa zistilo, že niektoré SNP I. fázy
CYP1B1, CYP2D6, CYP2E1 a CYP3A4 majú úzky súvis s karcinómom pľúc. Našli sa
aj významné asociácie formou mnohopočetnej SNP génov II. fázy (ALDH2, COMT,
EPHX1, SOD2, NAT1, NAT2, GSTM3, GSTP1, GSTT2 a MPO). V podstate len štyri
kombinácie asociácií majú s karcinómom pľúc významný súvis GSTP1 (Ala114Val),
SOD2 (Val16Ala), EPHX1 (His139Arg) a NAT1 (Zienolddiny a kol. 2008).
GSTT1
GSTT1 (glutatión S-transferáza théta 1). V skupine théta sú stanovené dva gény:
GSTT1 a GSTT2. Sú umiestnené na chromozóme 22, v polohe 22q11.23. Má veľkosť
8,09 kb a obsahuje 4 exóny. Dlhú dobu sa tento gén prehliadal kvôli jeho nízkej
aktivite k 1-chlór-2,4-dinitrobenzénu (CDNB). Na 80% je sekvencia ľudského proteínu
identická s jeho homológom, ktorý je prítomný u potkanov. PCR metódou a Southern
blotom sa zistilo, že GSTT1 gén nie je prítomný v 38% populácie. GSTT1 je
polymorfný a zastúpený dvomi alelami: funkčný alebo divý typ alel (GSTT1*1) a
nefunkčný alebo nulový typ alely (GSTT1*0). GSTT1*0 alela súvisí s úplnou alebo
čiastočnou deléciou génu, ktorá má za následok stratu enzymatickej aktivity. Pri
tomto géne sú možné dva fenotypové prejavy. „GSTT1-nulový“ predstavuje
homozygota pre deletované alely a „GSTT1-pozitívny“ s najmenej jednou kópiou
génu. GSTT1 zohráva úlohu pri inaktivácii a aktivácii chemických látok. Jedinci
s GSTT1 nulovým genotypom majú menšiu schopnosť detoxifikovať metabolity
niektorých karcinogénov vrátane 1,3-BD, etylénoxidu, metylbromidu a iných látok,
z ktorých mnohé sú známe alebo možné karcinogény. Jedinci so zdedeným GSTT1
génom môžu vytvárať mutagénne metabolity dichlórmetánu a dibrómetánu a
následne konjugovať s glutatiónom. Jedinci s GSTT1(+) genotypom môžu katalyzovať
konjugáciu dichlórmetánu pomocou glutatiónu metabolickou dráhou, ktorá je známa
pri testovaní mutagenicity Salmonelly typhimurium. U ľudí sa GSTT1 enzým našiel
v erytrocytoch,
čím
môže
pôsobiť
ako
detoxifikátor.
Pacienti
so
zníženou
schopnosťou metabolizovať karcinogény alebo toxíny životného prostredia môžu
zvyšovať riziko vzniku aplastickej anémie. Frekvencia nulového genotypu v géne
GSTT1 je vyššia u černochov ako u belochov. Je ťažké predpokladať biologické
dôsledky nulového genotypu, pretože tento enzým má schopnosť aktivovať a
detoxifikovať mnohé polutanty prostredia (Hemminki, 2001a; www NCBI GSTT1,
2008).
53
V početných štúdiách ktoré sledujú vplyv fajčenia u tehotných žien sa poukazuje
na pokles pôrodnej hmotnosti detí (pod 2.500 g), pričom najväčší pokles je pri
genotype CYP1A1 Aa/aa a GSTT1(-) u matiek (Wang a kol., 2002). Delécia GSTM1 a
GSTT1 génu viac ako trojnásobne zvyšuje riziko vzniku aplastickej anémie. V 17,5%
pacientov sa zistili chromozómové abnormality pri
diagnostikovaní, pričom všetci
pacienti mali deléciu GSTT1 génu (Lee a kol., 2001). Vyššia frekvencia aberácií
chromozómového typu sa zistila u fajčiarov s genotypom GSTT1(-) (Tuimala a kol.,
2005). Musak a kol. (2008) uvádzajú vyšší výskyt CHA u pracovníkov gumární
s genotypom GSTT1(-) a nízkou aktivitou EPHX1. Kaymak a kol. (2008) pri hodnotení
vzťahu medzi polymorfizmom génu GSTP1 a koncentráciou alfa glutatión-transferázy
v sére, zistili významné zvýšenie u všetkých operovaných pacientov 24 hod po
operácii, pričom vysoké hodnoty zostali u pacientov s genotypom GSTP1 Ile105Val.
Pri hodnotení polymorfizmu GSTT1, GSTM1, GSTP1 a NAT2 sa nezistil genetický
vplyv na vznik karcinómu obličiek po pôsobení TCE. Nádorové bunky obličiek
vykazovali nepatrne vyššie hodnoty
u homozygotov divého typu GSTP1*A
(Wiesenhütter a kol., 2007).
NAD(P)H-dehydrogenáza, chinón 1 (NQO1)
NQO1 je dvojelektrónová reduktáza, ktorá detoxifikuje chinóny získané oxidázou
fenolových metabolitov benzénu. Homozygotní jedinci s prítomnosťou T/T formy 609
C-T polymorfizmu majú zvýšené riziko hematotoxicity spôsobenú benzénom.
NQO1
Gén je členom rodiny chinón NAD(P)H-dehydrogenázy a kóduje cytoplazmatickú
2-elektrónovú reduktázu. Tento FAD-viažúci proteín vytvára homodiméry a redukuje
chinóny na hydrochinóny. Proteínová enzymatická aktivita zabraňuje redukcii jedného
elektrónu chinónov, ktorého výsledkom je tvorba radikálov. Analýzou pomocou
Southernovho blottingu sa stanovila prítomnosť génu NMOR1 s veľkosťou asi 10 kb.
Gén je lokalizovaný na 16 chromozóme v oblasti 16q22.1(www NCBI NQO1, 2008).
Polymorfizmus sa prejavuje v exóne 4 v kodóne 139 (C→T) Arg139Trp a v exóne 6,
kodón 187 (C→T) Pro139Ser, s prejavom genotypu NQO1*1/*2. Mutácia v géne
súvisí s dyskinézou a zvyšuje riziko hematotoxicity po expozícii benzénu a sklonu
k vzniku rôznych foriem nádorov. Zmenená expresia tohto proteínu sa zistila
u mnohých nádorov a súvisí s Alzheimerovou chorobou. Boli stanovené alternatívne
54
transkripčné variantné spojenia, ktoré kódujú ich rozdielne izoformy. Fagerholm a kol.
(2008) predložil model defektnej antracyklínovej odpovede na NQO1 v súvislosti s
Ca prsníka, so zvýšením genómovej instability spôsobenej zvýšením reaktívnych
kyslíkových radikálov (ROS)
a navrhol, že genotyp NQO1 génu je prognostický
marker na karcinóm prsníka. Zistil, že homozygotnosť pre T/T genotyp NQO1 génu
(NQO1*2) presvedčivo poukazuje na nízke prežívanie žien s nádorom prsníka. účinok
bol zvlášť evidentný po adjuvantnej chemoterapii založenej na antracyklíne
s epirubicínom (Fagerholm a kol. 2008).
3. 6 DNA REPARÁCIA
Reparácia DNA (oprava DNA) predstavuje viackrokový proces, pri ktorom sa
pomocou reparačných enzýmov, zabezpečuje celistvosť genómu. Genóm človeka
obsahuje približne 3x109 bázových párov, ktoré kódujú 30.000-40.000 génov. Genóm
je neustále napádaný endogénnymi reaktívnymi metabolitmi a rôznymi exogénnymi
činiteľmi z prostredia, ktoré nepriaznivo pôsobia na jeho integritu. Predovšetkým
genotoxické látky spôsobujú kvalitatívne a kvantitatívne poškodenie molekuly DNA,
ktoré
vedie
k jej
štruktúrnym
a informačným
zmenám,
možnému
rozvoju
karcinogenézy a v konečnom dôsledku k zániku bunky. Stabilita genómu sa
zabezpečuje činnosťou reparačných mechanizmov, ktoré odstraňujú alebo tolerujú
premutagénne, preklastogénne a precytotoxické lézie DNA. Stanovením sekvencie
ľudského genómu) sa zistilo, že na ochrane genómu sa zúčastňuje obrovský počet
proteínov. U ľudí sa na DNA oprave zúčastňuje asi 130 génov (Lander a kol., 2001;
Venter a kol., 2001). Nie všetky už boli charakterizované a nie u všetkých sa zistila
ich funkcia. Bunky sú neustále postavené pred problém opravy poškodenia DNA. Ak
je poškodenie rozsiahle, môžu prejsť do apoptózy, pričom sa tento proces účinne
uplatňuje v prípade, keby mala v bunke vzniknúť mutácia. Ak je poškodenie menej
závažné, spúšťajú sa rozsiahle opravné procesy. Väčšinu opravných procesov
charakterizujú tieto kroky: a/ zistenie poškodenia; b/ odstránenie poškodenia (mimo
zlomov a pyrimidínových dimérov); c/ reparácia syntézy DNA; d/ ligácia (zviazanie).
Opravné mechanizmy likvidujú poškodenia DNA odstránením aduktov alebo inzerciou
báz na AP miesta. Ak sú rozdielne typy DNA poškodení, môžu bunky pri tvorbe
biosyntézy modifikovať proteínové komplexy aj inými procesmi, napr. transkripciou,
replikáciou a rekombináciou.
55
3. 6. 1 Jednotlivé typy opráv
Poškodenie DNA sa môže prejaviť modifikáciou všetkých štyroch dusíkových báz
v DNA (najčastejšia je strata aminoskupiny, čo môže viesť ku konverzii C na U),
nevhodným spojením báz (včlenenie U namiesto T), zlomami v hlavnom reťazci
(jedného alebo obidvoch vlákien), prekrížením na jednom vlákne (vnútrovláknové
prekríženie), alebo medzi dvoma vláknami (medzivláknové prekríženie).
Základnými mechanizmami opravy bunky sú: a) priama reverzná oprava, b)
bázová excízna oprava (BER), c) mismatch oprava (MMR), d) nukleotidová excízna
oprava (NER), e) oprava dvojvláknových zlomov DNA (DSB oprava).
Priama reverzná oprava
Najčastejšou príčinou bodových mutácií u ľudí je spontánna adícia metylovej
skupiny (-CH3), napr. alkyláciou na C, ktorá nasleduje po deaminácii na T. Väčšinu
týchto zmien reparujú enzýmy, označené ako glykozylázy. Tieto nahradzujú
nevhodne zaradený T za správny C. Reparácia sa vykonáva bez štiepenia dvojšpirály
DNA. Niektoré lieky používané v chemoterapii poškodzujú DNA procesom alkylácie.
O6-alkylguanín, i keď tvorí menej ako 8% všetkých alkyláci, je jednou z
najzávažnejších O-alkylačných lézií. Hlavne O6-metylguanín (O6MeG) a O6etylguanín vytvárajú nesprávne párované lézie, ktoré sú po alkylácii hlavnými zdrojmi
mutácie GCˆAT. O6-alkylácia sa opravuje jednokrokovým procesom pomocou
enzýmu O6-metylguanín-DNA metyltransferáza (MGMT). MGMT gén je lokalizovaný
na chromozóme 10 v polohe 10q26. Bol prvým reparačným génom cicavcov, ktorým
sa indukoval genotoxický stres (Christmann a kol., 2003).
Bázová excízna oprava
Bázovou excíznou opravou sa reparujú jednotlivé zmenené bázy (napr. etylová
alebo metylová skupina), ktoré môžu byť zistené špecifickými enzýmami, DNA
glykozylázami. Ide hlavne o poškodenie DNA činnosťou nízkomolekulových
xenobiotík, oxidácia DNA bázy,
ktorá vznikla spontánne vo vnútri bunky, počas
zápalových reakcií alebo expozíciou exogénnym činiteľom. BER sa opravujú DNA
alkylácie indukované endogénnymi alkylačnými procesmi a exogénnymi karcinogénmi
(napr. nitrozamíny). N-alkylpuríny, ktoré
sú citlivé na spontánnu hydrolýzu N-
glykozidovej väzby a ktoré vedú k tvorbe apurínových alebo apyrimídinových miest
56
(Lindahl, 2000). DNA glykozyláza štiepi väzbu medzi dusíkatou bázou a cukrom. Za
odstránenie cukor-fosfátových zvyškov sú zodpovedné
enzýmy DNA beta
polymeráza X-ray cross complementing group 1 (XRCC1) a DNA ligáza III.
Po
odstránení zvyškov pokračuje endonukleáza (FEN1) a bunkový proliferatívny jadrový
antigén (PCNA) v syntéze novej DNA pomocou polymerázy beta a gama. (Srivastava
a kol., 1998).
Nukleotidová excízna oprava
Nukleotidovou excíznou opravou sa opravujú bulky (objemné) DNA adukty PAU,
fotolézie indukované UV svetlom tzn. (6-4) fotoprodukty (6-4PP) a cyklobután,
pyrimidínové diméry (CPD), vnútrovláknové krížové väzby, veľké adukty vytvorené
expozíciou benzo(a)pyrénu,
aflatoxínu a inými genotoxickými látkami (Friedberg,
2001, Hanawalt, 2002). V NER je zahrnutých asi 30 enzýmov. Patrí tu aj transkripčná
párová
oprava
(transcription
coupled
repair-TCR),
ktorá
slúži
na
opravu
transkribujúceho reťazca DNA. Označuje sa často ako časť opravy NER (Tuimala
a kol., 2002; Tuimala a kol., 2004).
Mismatch oprava
Je to oprava nevhodného spojenia a zodpovedá za odstránenie nevhodných
spojení báz, ktoré boli spôsobené spontánnymi alebo indukovanými poruchami
deaminácie, oxidácie, metylácie a replikácie.
Oprava dvojvláknových zlomov
Dvojvláknové zlomy (DSB) patria k najzávažnejším typom poškodení DNA (okrem
medzivláknových prekrížení) a vznikajú pôsobením IŽ a mnohých chemických látok,
napr. bleomycínom. Spontánne vnikajú aj počas normálneho procesu replikácie DNA.
Indukujú chromozómové zlomy a výmeny, ktoré vedú k apoptóze (Lips a Kaina,
2001). Poznáme dva hlavné procesy reparácie dvojvláknových zlomov: a)
homologická rekombinácia (HR) , b) nehomologické spojenie koncov (NHEJ). U
nižších eukaryotov prevláda HR, u cicavcov NHEJ (Cromie a kol., 2001). Použitie HR
alebo NHEJ závisí na fáze bunkového cyklu. HR sa vyskytuje v neskorej S a G2
fáze, NHEJ hlavne v G0/G1 fáze (Jonson a Jasin, 2000).
57
Homologická rekombinácia
Zúčastňuje sa hlavne na oprave dvojvláknových zlomov DNA, ktoré sa nachádzajú
na tom istom mieste obidvoch reťazcov. Tieto zlomy pochádzajú z chromatidových
oblastí DNA v priebehu S alebo G2 fázy. Poškodený chromozóm sa dostáva do
priameho kontaktu s nepoškodenou molekulou DNA, s ktorou sa páruje. HR zohráva
v bunke dvojitú funkciu: a) zvyšuje genetickú variabilitu v meióze, b) zabezpečuje
stabilitu genómu v mitotických bunkách opravovaním chromozómových zlomov, pri
ktorých ako podklad (templát) používa sesterské chromatidy.
Nehomologické spojenie koncov
Uplatňuje sa pri oprave počas všetkých fáz bunkového cyklu. Najdôležitejšiu úlohu
zohráva v tých oblastiach DNA, ktoré ešte neboli replikované a nachádzajú sa v G1 a
S fáze.
Zabezpečuje
spojenie
dvoch
koncov
DSB
bez
potreby
vytvorenia
homologickej sekvencie medzi koncami DNA.
3. 6. 2 Reparačné gény DNA a ich produkty
Experimentálne údaje s geneticky modifikovanými zvieratami poukazujú na to, že
reparačné gény DNA zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri
ochrane organizmu proti
chorobám (Nakajima a Aoyama, 2000, Kelada a kol., 2003).
Gény bázovej excíznej opravy (BER)
XRCC1
Gén XRCC1 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster
cells1; X-ray cross-complementation group 1) bol u cicavcov prvým klonovaným
génom, ktorý opravuje poškodenia DNA spôsobené žiarením. Je umiestnený na
chromozóme 19, v polohe 19q13.2. Tvorí ho 31,9 kb a obsahuje 17 exónov. XRCC1
zohráva významnú úlohu pri malých opravách jednovláknových zlomov DNA
mechanizmom bázovej excíznej opravy. U ľudí je zložený zo 633 aminokyselín
(Thompson a West, 2000). Na
ľudskom XRCC1 géne sa stanovili tri vzájomne
pôsobiace oblasti, ktoré viažu DNA polymerázu β, poly(ADP-ribózo)polymerázu
(PARP) a DNA ligázu III. N-koniec proteínu špecificky viaže jednovláknové zlomy
(SSB). Proteín, ktorý je kódovaný týmto génom sa zúčastňuje na účinnej reparácii
58
jednovláknových zlomov DNA, ktoré vznikajú expozíciou ionizujúcemu žiareniu a
účinkom alkylačných látok. Pôsobí spolu s DNA ligázou III, polymerázou beta a poly
(ADP-ribózo) polymerázou na BER. Po zistení poruchy a začiatku incízie DNA
monofunkčnou glykozylázou sa bez incízie viaže na medzery indukované rôznymi
chemickými látkami (napr. bleomycín). Do medzery zavádza DNA polymerázu β,
syntetizuje novú DNA pomocou PARP a uzatvára medzeru pomocou DNA ligázy III
(Rice, 1999; Thompson a West, 2000). PARP je proteín, ktorý deteguje zlomy DNA
vláken, vytvorené priamo alebo nepriamo činnosťou genotoxických látok (www NCBI
XRCC1, 2008). Polymorfizmus tohto génu bol zistený v 3 exónoch exón 6 (C→T)
Arg194Trp; exón 9 (G→A) Arg280His a exón 10 (G→A) Arg399Gln (Shen a kol.,
1998). Whitehouse a kol. (2001) prezentovali, že XRCC1 interaguje s ľudskou
polynukleotidovou kinázou (PNK) spojením jej interakcie s DNA polymerázou-beta
(POLB) a DNA ligázou III (LIG3). Tieto 4 proteíny sú vo vzájomnej asociácii a tvoria
v ľudskom bunkovom extrakte multiproteínové komplexy. Reparujú jednovláknové
zlomy
indukované reaktívnymi kyslíkovými radikálmi a IŽ. Je pozoruhodné, že
XRCC1 stimuluje DNA kinázovú a DNA fosfatázovú aktivitu PNK na poškodenom
DNA konci, čím sa urýchľuje celkový proces reparácie. Vyjadruje sa tým význam
XRCC1 a PNK pri iniciačnom procese poškodeného DNA konca. Sano a kol. (2004)
prezentovali, že s koncovou doménou XRCC1 interaguje aprataxin (APTX). Na
vytvorenie dominantného inhibičného efektu je potrebná interakcia variantného POLB
a XRCC1 (Bhattacharyya a Banerjee, 2001). Loizou a kol. (2004) poukázali na to, že
kazeínkináza II (CK2) fosforyluje XRCC1, čím umožňuje vytvorenie a aktivitu
komplexu - jednovláknový zlom DNA a reparačný proteín in vitro na mieste
chromozómového poškodenia. Luo a kol. (2004) informovali, že 2 predformované
XRCC1 proteínové komplexy existujú v cyklínových HeLa bunkách. Jeden komplex
obsahuje známe enzýmy dôležité pri reparácii jednovláknových zlomov vrátane LIG3,
PNK a POLB, iné sú súčasťou nového komplexu, ktorý obsahuje LIG3 a aprataxín.
Pri hodnotení vzťahu medzi rizikom vzniku karcinómu prsníka, hladinou karotenoidov
v plazme a polymorfizmom v XRCC1 géne a 4 predstavovanými haplotypmi
(Arg194Trp, C26602T, Arg399Gln a Gln632Gln) sa u zdravotných sestier zistila
výrazná redukcia rizika vzniku nádoru u variantu 194Trp (Han a kol., 2003). Moser
a kol. (2007) poukázali na rozdielnu potrebu DNA polymerázy a ligázy pre DNA
reparáciu sprostredkovanú NER počas bunkového cyklu. Wang a kol. (2008b) zistili,
že pacienti ktorí majú najmenej jeden variant XRCC1 Arg399Gln alely majú 2,5 krát
59
zvýšené
riziko
výskytu
3
alebo
4
stupňa
gastrointestinálnej
toxicity
pri
chemoterapeutickej liečbe založenej na cis-platine. Grlickova-Duzevik a kol. (2006a)
a Grlickova-Duzevik a kol. (2006b) hodnotili CHA a účinok génu XRCC1 u ľudí
s nádorom pľúc, ktorí boli exponovaní zlúčeninám Cr6+ a Pb. Deficit génu XRCC1
ovplyvňoval celkový výskyt chromozómových poškodení. Gén XRCC1 prvotne
redukoval tvorbu chromatidových poškodení na rozdiel od izochromatidových.
Skjelbred a kol. (2006) sledovali účinok genetického polymorfizmu reparačných génov
v lymfocytoch periférnej krvi (vrátane XRCC1 a XRCC3) na frekvenciu CHA
u fajčiarov a nefajčiarov v rôznych vekových skupinách. Zistili, že jedinci, ktorí mali
alely génu XRCC1 399Gln, mali zvýšené riziko chromozómových poškodení a jedinci
s alelou XRCC1 194Trp znížené. Nefajčiari s alelou XRCC1 280His mali tiež zvýšené
riziko chromozómových poškodení. Ochranný účinok alely XRCC3 241Met bol
nájdený len u staršej vekovej skupiny a nefajčiarov. Indukcia DNA reparačnej
kapacity sa použila ako marker včasného účinku. Hodnotil sa vzťah polymorfizmu
XME génu CYP2E1 detoxifikačných génov NQO1 a GSTT1 a tiež DNA reparačných
génov XRCC1 exón 399
u pracovníkov profesionálne exponovaných benzénu.
Jedinci s genotypom 399Arg/Gln alebo Gln/Gln vykazovali nižšiu DNA reparačnú
kapacitu (Chanvaivit a kol., 2007). Ster a kol. (2001) sledovali polymorfizmus génu
XRCC3 kodón Thr241Met v spojitosti s výskytom nádoru močového mechúra
a s vplyvom cigaretového dymu. Zistili určitý prejav ochranného účinku u jedincov
s variantom alely T u homozygotov. V géne XRCC1 kodón Arg399Gln sa prejavil
ochranný účinok v prítomnosti alely A. Hodnotila sa úloha polymorfizmu XRCC1 génu
(kodón 194 a kodón 399) a XPD génu (kodón 751) na výskyt nádoru pľúc. Pri géne
XPD v kombinácii genotypov Lys/Lys a Lys/Gln sa zistilo 3 krát vyššie riziko vzniku
karcinómu. Toto riziko sa zvýšilo na deväťnásobok u jedincov s kombináciou
genotypu XRCC1 194 Trp/Trp a XPD 751 Lys alela (Chen a kol., 2002).
hOGG1
Gén hOGG1, 8-oxoguanín DNA glykozyláza (8-@ oxoguanine DNA glykosylase).
Fluorescenčnou in situ hybridizáciou sa zistilo, že gén je lokalizovaný na chromozóme
3 v oblasti 3p26.2. Tvorí ho 3,93 kb, má 6 exónov a kóduje proteín, ktorý tvorí 424
aminokyselín a má veľkosť 47 kD. Výraznou mutagénnou bázovou léziou v DNA
spôsobenou expozíciou reaktívnym kyslíkovým látkam je 8-oxoguanín (8-oxoG). Táto
poškodená báza je odstránená DNA glykozylázou so spojenou aktivitou lyázy na
60
poškodenom reťazci. Klonovala sa ľudská cDNA s čiastočnou homologickou
sekvenciou ako u kvasiniek 8-oxoguanínDNA glykozyláza (OGG1) gén. Ukázalo sa,
že sa týka voľného 8-hydroxyguaninu z oxidovanej DNA. Hlavným mechanizmom
jeho odstraňovania je bázová excízna oprava, ktorá sa uskutočňuje pomocou
proteínu OGG1 (8-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanozín DNA glykozyláza 1), ktorý má
glykozylázovú a AP lyázovú aktivitu. (www. NCBI, hOGG1, 2008). Glykozyláza
človeka hOGG1 zodpovedá za opravu 8-oxoG DNA jadra a mitochondrií. Poznáme
dve izoformy – alfa-OGG1, ktorá je prítomná hlavne v jadre a beta-OGG1, ktorá je
prítomná len v mitochondriách (Hashiguchi a kol., 2004). Audebert a kol. (2000)
analyzovali 99 tumorov obličiek na zistenie alterácií v OGG1 géne a zistenie vzťahu
v procese karcinogenézy. Strata heterozygotnosti v oblasti 3p25 sa zistila v 85%
prípadov. Biochemickou analýzou mutantného proteínu sa zistila substitúcia
Arg46Gln, ktorá narušovala enzymatickú aktivitu. Popísalo sa niekoľko polymorfizmov
a tiež aberácií OGG1 transkriptov. Pri renálnom karcinóme sa našla tranzícia 445G-A.
DNA glykozylázová/AP lyázová aktivita bola dramaticky redukovaná v prípade tohto
mutanta. Jeho špecifická aktivita bola 4- krát nižšia ako pri divom type alel a našla sa
výrazná porucha v DNA reparačnej kapacite. V E.coli zistili Kohno a kol. (1998), že
DNA reparačná aktivita variantu Cys326 OGG1 génu je nižšia ako pri variante
Ser326. Wang a kol. (2006a) zisťovali vzťah variantu Ser326Cys s inzulínovou
senzitivitou u jedincov, ktorí nemali pozitívnu anamnézu na vznik rakoviny. Jedinci
s genotypom
Cys/Cys
mali
významne
nižšiu
hladinu
inzulínovej
senzitivity
v porovnaní s genotypom Ser/Ser a Ser/Cys. Multilineárna regresná analýza ukázala,
že genotyp Cys/Cys bol nezávislý a významne súvisel so stupňom inzulínovej
rezistencie. Kovtun a kol. (2007) demonštrovali, že somatická CAG expanzia závislá
na veku súvisí s Huntingtonovou chorobou. Zistilo sa priame molekulové spojenie
medzi oxidatívnym poškodením a toxicitou v postmitotických neurónoch počas ich
reakcie poškodenej DNA a error-prone reparácia jednovláknových zlomov. Trapp a
kol. (2007) zistili, že OGG1 deficiencia u myší vedie k zvýšeniu základnej hladiny 7,8dihydro-8oxo-2prima-deoxyguanozínu (8-oxoG) a zvyšuje frekvenciu spontánnych
mutácií i keď reparácia 8-oxoG nie je úplne odstránená.
APE1
Gén APE1 Apex nukleáza, tiež označovaná ako apurínová endonukleáza (Apex
nuclease; APEX; Apurinic endonuclease) je lokalizovaný na chromozóme 14 v oblasti
61
14q11.2-q12, tvorí ho 5 exónov a 4 malé intróny (130-566 bp). Predstavuje DNA
reparačný enzým, ktorý má aktivitu apurínovej/apyrimidínovej (AP) endonukleázy, 3prima, 5-prima-exonukleázy, DNA 3-prima reparačnej diesterázy a DNA 3-primafosfatázy. AP miesta sú výsledkom straty bázy a sú najčastejšími léziami, ktoré sa
vyskytujú in vivo v bunkovej DNA. AP miesta vznikajú spontánnou hydrolýzou,
účinkom rôznych chemických látok a žiarenia, a tiež glykozylázou DNA, ktorou sa
presúva konkrétna abnormálna báza z DNA. Abázové miesta môžu zastavovať
proces DNA replikácie a spôsobovať mutácie. Tieto miesta musia byť opravené kvôli
zachovaniu genetickej integrity. Aktivita APE1 promótora bola stanovená na základe
expresie v HeLa a TK6 bunkách u ľudí (www. NCBI, APE1, 2008). Hadi a kol. (2000)
stanovili 7 variantov alel APEX génu so zámenou aminokyseliny. Na základe funkčnej
charakteristiky sa zistilo, že 3 substitúcie Leu104Arg, Glu126Asp, Arg237Ala redukujú
aktivitu incízie o 40-60%. Substitúcia na aktívnom mieste Asp283Gly má za následok
len 10% reparačnej kapacity. Najčastejšia substitúcia Asp148Glu, ktorá bola zistená
vo frekvencii 0,38, nemala vplyv na endonukleázu a na DNA väzobnú aktivitu.
Podobne aj vzácne sa vyskytujúca substitúcia Gly306Ala. Substitúcia Gly241Arg,
ktorá má predikciu k nízkej stabilite helixu 9, vedie k slabému zvýšeniu
endonukleázovej aktivity pri divom type alel. Polymorfizmus s nízkou penetranciou
môžu predstavovať 4 redukované funkčné varianty, ktoré úzko súvisia so zvýšenou
vnímavosťou na choroby. Huamani a kol. (2004) zistili, že frekvencia spontánnych
mutácií sa zvýšila 2-krát v pečeni a slezine u 3 mesačnej heterozygotnej mutantnej
myši v porovnaní s frekvenciou divo žijúcej myši. Mutačná frekvencia bola následne
zvýšená
v somatických
tkanivách.
Genetická
instabilita
bola
oneskorená
v spermatogénnych bunkách, ale zachovaná u 9 mesačného mutanta na úrovni
jedinca s divým typom alel.
Gény nukleotidovej excíznej opravy (NER)
XPD (ERCC2)
Gén XPD (ERCC2) (Xeroderma pigmentosum, komplementačná skupina D;
Excision-Repair, Complementing Defective, In Chinese Hamster, 2) je umiestnený na
chromozóme 19, v oblasti 19q13.2-q13.3. Má veľkosť 20,73 kb a tvorí ho 23 exónov
veľkých od 5bp (exón1) po 169 bp (exón 11). ERCC2 gén koriguje senzitivitu na UV
žiarenie a defektnú NER v bunkách xerodermy pigmentosum, komplementačná
62
skupina D (XPD). Gén je homologický s génom RAD3 tvorený kvasinkou
Saccharomyces cerevisiae. Zriedkavé autozómovo recesívne dedičné ochorenia u
ľudí: xeroderma pigmentosum (XP), Cockaynov syndróm (CS) a trichtiodystrofia
(TTD), súvisia s poškodením aktivity NER. XP pacienti sú extrémne citliví na slnečné
svetlo, čo môže u nich zvýšiť incidenciu vzniku rakoviny kože (asi 1000x viac oproti
bežnej populácii). Asi u 20 % pacientov s XP sa okrem kožných problémov vyvíjajú aj
neurologické abnormality. Doposiaľ bolo určených sedem rozdielnych DNA NER
génov, ktoré opravujú sedem odlišných genetických XP komplementačných skupín
XPA-XPG (Bootsma a kol., 1998). Kóduje 760 aminokyselín 5´-3´ helikázy, ktorá je
súčasťou transkripčného faktora TFIIH. Helikáza môže byť zahrnutá do odvíjania
DNA na 3´ konci v susedstve poškodenej bázy a v obrátenom smere XPB helikázy.
Fenotypové prejavy mutácií sa v tomto géne spájajú s
rozdielnymi klinickými
prejavmi: XPD s TTD alebo zriedkavou kombináciou XP a Cockaynovho syndrómu.
Väčšina TTD pacientov vykazuje UV senzitivitu poklesom XPD komplementačnej
skupiny. V mnohých prípadoch XPD sú pacienti s trichotiodystrofiou (TTD) nositeľmi
mutácií
v karboxy-terminálnej
doméne
XPD
helikáza
subjednotiek transkripčno/reparačného faktora TFIIH.
predstavuje
jednu
zo
XPD (ERCC2) interaguje
hlavne s p44, inou subjednotkou TFIIH a tá zodpovedá za stimuláciu 5-3 aktivity
helikázy. Mutácia v XPD C-terminálnej doméne zabraňuje interakcii s p44, čím sa
vysvetľuje zníženie aktivity XPD helikázy a porucha nukleotidovej excíznej reparácie
(NER). XPB a XPD redukuje retrovírusovú integračnú efektivitu zvýšením degradácie
retrovírusovej cDNA, na základe čoho sa redukuje integračná schopnosť poolu cDNA
molekúl. Mutácia v XPD géne súvisí najmenej s 3 rozdielnymi fenotypmi XP. Pri TTD
sa zistila najčastejšie substitúcia Leu461Val a delécia AK 716-730 na jednej
alele, substitúcia
Ala725Pro,
mutácia
Arg112His,
Arg722Trp,
Arg658
alebo
Leu485Pro. Pri XP skupina D sa zistila transverzia 1411 C-G v ERCC2 géne, ktorej
expresiou bola substitúcia Leu461Val. Pozorovala sa i tranzícia 2176C-T v exóne 22
ERCC2 génu so zmenou v kodóne 726 z CAG (Gln) na TAG (Stop) (Yoder a kol.,
2006). Pre aktivitu XPD helikázy je dôležité Fe-S zoskúpenie XPD proteín je ako člen
TFIIH komplexu dôležitý pri transkripcii bunky a jej schopnosti života. Žiaden pacient
nemôže mať dve nulové alely. Pre TTD je charakteristické uloženie hranice vlasov,
ichtyóza (šupinatosť kože), predčasný pohlavný vývoj, nízky vzrast a špecifický výzor
tváre (Rudolf a kol., 2006). Chen a kol. (2003) poukázali na to, že TFIIH komponent
Xpd u drozofily, ktorý je homológom ľudského ERCC2 negatívne ovplyvňuje reguláciu
63
bunkového cyklu funkcie funkciou Cdk7 aktivity CAK. Pri zvýšenej činnosti Xpd je
výsledkom znížená Cdk T-loop fosforylácia, poškodenie mitózy a letalita, zníženie
Xpd sa prejavuje zvýšením CAK aktivity a bunkovou proliferáciou. Xpd je regulovaný
na začiatku mitózy, tzn., že znížená regulácia Xpd môže byť hlavným mechanizmom
mitotického pokoja (www NCBI XPD, 2008).
XPG (ERCC5)
Gén XPG (ERCC5) (Xeroderma pigmentosum, komplementačná skupina G) je
umiestnený na chromozóme 13, v oblasti 13q32-33, tvorí ho 29,93 kb a obsahuje 15
exónov (Emert a kol., 2001). Kóduje 1186 aminokyselín nukleázy, ktorá vykonáva
incíziu DNA 3´ poškodeného miesta. ERCC5 gény opravujú excíznou reparáciou
poškodenia CHO bunkovej línie UV135 komplementačnej skupiny 5. Ľudský génový
produkt je štruktúrne špecifická endonukleáza, ktorá vyžaduje na svoju tvorbu 3
primárnu incíziu počas DNA nukleotidovej excíznej reparácie (NER). XP-G
komplementačná skupina je zriedkavá a väčšina prípadov je známych z Európy.
Pacienti sú veľmi postihnutí a často sa u nich prejavuje kombinácia symptómov XP a
CS. Kombinácia týchto symptómov sa použila i na odhalenie druhej funkcie XPG,
reparácie oxidatívnych poškodení. Niektoré mutácie špecificky pôsobia na NER, ale
nepôsobia na reparáciu oxidatívnych poškodení. Tento proteín zohráva úlohu
v reparácii poškodených báz viazaných na transkripciu. U pacientov sa prejavili kožné
tumory (www. NCBI, XPG, 2008). Volker a kol. (2001) popísali XPC komplex HR23B
(RAD23B), ktorý sa javil ako nevyhnutný na získanie všetkých ďalších NER faktorov
v preincíznom komplexe, vrátane transkripčného reparačného faktora TFIIH. Sarker
a kol. (2005) zistili, že XPG interaguje s elongačnou RNA polymerázou II v HeLa
bunkách a viaže ternárne komplexy in vitro nielen nezávisle, ale aj v súčinnosti
s ERCC6. XPG viazané, veľkosťou prispôsobené transkripčné DNA bubliny cez dve
domény nie sú potrebné pri incízii, sú však stimulované ERCC6 viazanými DNA
bublinami a zlepšujú ATP aktivitu EPCC6. Koordinované hľadanie zastavenej
transkripcie prostredníctvom XPG a ERCC6 iniciuje transkripčne viazanú reparáciu
a tento TFIIH závislý prebudovaný RNA polymerázou II bez uvoľnenia môže byť
účinný na vykonanie reparácie. XPG
tvoria stabilné komplexy s TFIIH, ktoré sú
schopné reparácie DNA poškodení in vitro pomocou NER s použitím extraktov z XPB,
XPD alebo XPG buniek. Mutácia v XPG géne, ktorá sa prejavuje nedostatkom C
konca, a nie je schopná viazať TFIIH zodpovedá za niektoré fenotypové prejavy
64
s XPG/Cockaynov syndróm, zatiaľ čo mutácia, ktorá ponecháva C koniec má
schopnosť viazať TFIIH. Výsledkom toho je miernejší XPG fenotyp. XPG zohráva
teda významnú úlohu pri stabilizácii TFIIH a v regulácii génovej expresie. Pri géne
ERCC5 bola zistená mutácia transverzia 3075G-T s prejavom Glu960Ter, tranzícia
2572C-T s prejavom substitúcie Ala792Val, pričom žiadny mutovaný proteín nie je
schopný sa opravovať UV senzitivitou. Našiel sa aj mutant 2972delT proteín, so
stratou C konca, ktorý nebol schopný viazať TFIIH komplex (Ito a kol., 2007).
XPC
Gén XPC (Xeroderma pigmentosum, komplementačná skupina C) je umiestnený
na chromozóme 3, v polohe 3p25.1. Tvorí ho 33,9 kb a obsahuje 16 exónov. Kóduje
940 aminokyselín jednovláknového proteínu, ktorý je dôležitý na reparáciu
netranskribovaných oblastí genómu. XP-C pacienti sú medzi väčšinou bežných foriem
XP a prejavujú sa predovšetkým rakovinou kože bez neurologických príznakov.
V roku 1980 bola popísaná systematická choroba lupus erytematosus u pacienta
s typom C Xeroderma pigmentosum. Pacienti s komplementačnou skupinou C sú
zvlášť
náchylní
k vzniku
malígneho
melanómu.
Sledovala
sa
i frekvencia
chromozómových zlomov indukovaných UV žiarením v lymfoblastoidných bunkových
líniách pacientov s Cockaynovym syndrómom a s Xerodermou pigmentosum. Pri
obidvoch chorobách mali bunky abnormálne zvýšený počet indukovaných aberácií.
Frekvencia zlomov na chromozómoch indukovaných UV žiarením z buniek XP
skupiny C nevysvetľuje sklon týchto pacientov na vznik nádorov kože indukovaných
slnečným svetlom. Našiel sa klonovaný XPC gén, ktorý kóduje vysoko hydrofilný
proteín, ktorý je tvorený 823 AK a čiastočne je homológom produktu kvasinky
označovaný ako DNA reparačný gén RAD4. XPC transkript nebolo možné detegovať
vo väčšine XPC sledovaných bunkových líniách. (www. NCBI, XPC, 2004). Volker
a kol. (2001) popísali zloženie komplexu nukleotidovej excíznej reparácie (NER)
v normálnych a reparačne deficientných bunkách (xeroderma pigmentosum) použitím
novej techniky lokálneho UV žiarenia kombinovaného s fluorescenčným značením
protilátok. Shimizu a kol. (2003) uvádzajú, že XPC-HR23B komplex prispieva
k potláčaniu spontánnych mutácií a má kompromisnú funkciu u XPC pacientov a že
môže podporovať proces karcinogenézy. Gozukara a kol. (2001) zistili tranzíciu C-T
v nukleotide 1840 v exóne 8, ktorý konvertoval Arg579 na stop kodón. Emmert a kol
(2000)
zistili,
že
XPC
gény
vedú
k selektívnej
reparácii
cyklobutánových
65
pyrimidínových dimérov (CPD) skôr ako 6-4 fotoproduktov (6-4PP). Zvýšenie XPC
génovej expresie in vivo viedlo k selektívnej reparácii CPD v celom genóme. Khan a
kol. (2004) identifikoval homozygozitu -9T-A tranverzie v intróne 3 u dvoch
súrodencov s Xerodermou pigmentosum a mnohopočetným karcinómom kože. Pri
miernej forme XP stanovil homozygozitu -24A-G tranzíciu v intróne 3.
Gény opravy dvojvláknových zlomov (DSBR)
XRCC3
Gén XRCC3 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster
cells3; X-ray cross-complementation group 3) bol zistený po prvý raz v bunkových
líniách čínskeho škrečka (Jones a kol., 1987). Je umiestnený na chromozóme 14,
v polohe 14q32.3. Tvorí ho 17,85 kb a obsahuje 10 exónov. Je dôležitý
na
zachovanie chromozómovej stability u cicavcov.
XRCC3 gén bol pôvodne stanovený kvôli jeho schopnosti opravovať poškodenia
komplementárnej DNA. Bunkové línie bez aktivity XRCC3 génu sa vyznačujú
zvýšeným počtom delécií, zlomov a hlavne translokácií. Je potrebný hlavne pri
opravách dvojvláknových zlomov DNA a pri správnej segregácii chromozómov do
novovzniknutých buniek (Brenneman a kol., 2000, Griffin a kol., 2000, www NCBI
XRCC3, 2008).
Tento gén je potrebný tiež pri oprave zlomov homologickou rekombináciou.
V literatúre sa popisuje polymorfizmus génu v exóne 7 (C→T) v jednej substitúcii AK
Thr241Met (Shen a kol., 1998). Či tento polymorfizmus funkčne postihuje proteín nie
je zatiaľ známe. XRCC3 priamo interaguje s génom RAD51 a môže mať s ním súvis
aj počas rekombinačnej reparácie. Expozícia UV žiareniu je najvýznamnejším
faktorom vzniku malígneho melanómu. DNA poškodenie spôsobené UV žiarením
zohráva najdôležitejšiu úlohu
v karcinogenéze. Pri sledovaní vzťahu medzi
polymorfizmami v DNA reparačných génoch a vznikom malígneho melanómu, zistili
Winsey a kol. (2000) že prítomnosť T alely v polohe18067 v exóne 7 XRCC3 génu
mala významný súvis s vývojom melanómu. Tranzícia 18067C-T súvisí so zámenou
Thr-Met v proteíne. Brenneman a kol. (2002) zistili že XRCC3 mutované bunky
vykazovali radikálne zmenený produkt homologickej rekombinácie (HR) so zvýšenou
prestavbou génu čo sa týka dĺžky, zvýšenej frekvencie nespojených častí a početnými
prestavbami súvisiacimi s HR. Tieto výsledky indikovali, že funkcia XRCC3 nie je
66
limitovaná iniciáciou HR, ale vystupuje ako neskorší stupeň v tvorbe a rozhodovaní
intermediátov HR, možno pri stabilite heteroduplexu DNA. Výsledky ďalej ukázali, že
poškodenie HR môže zvyšovať genómovú instabilitu a to nielen zlyhaním začatej HR
(ktorá vedie k nehomologickej reparácii), ale tiež abnormálne procesy intermediátov
HR. Obidva mechanizmy môžu prispievať k procesu karcinogenézy v bunkách
s deficientnou HR. Kuschel a kol. (2002) poukázali na genetickú asociáciu založenú
na výskyte karcinómu prsníka a polymorfizmom 7 génov zahrnutých do reparácie
DNA. Pri géne XRCC3 sa zistila okrem 4 bežných haplotypov i prítomnosť 4 raritných,
ktoré vznikli rekombináciou. Homozygoti s mutáciou M241 majú zvýšené riziko
výskytu karcinómu prsníka. Dva haplotypy AGC a GGC súviseli s nevýznamným
znížením rizika vzniku karcinómu prsníka, ale naopak raritný haplotyp GAT riziko
vzniku rakoviny významne zvyšoval.
NBS1
Gén NBS1 (Nijmegen breakage syndróm). Je lokalizovaný na chromozóme 8 v
mieste 8q21.3. Má viac ako 50 kb a obsahuje 16 exónov. Popísal sa gén, ktorý
kódoval proteín označený ako nibrin a bol zmapovaný vo vnútri kritickej oblasti pre
tzv. Nijmegen breakage syndróm (NBS) na chromozóme 8q21. Identifikovala sa 5-bp
delécia a NBS fenotyp poukazuje na to, že táto choroba je spôsobená defektnou
odpoveďou DNA na dvojvláknové zlomy (Varon a kol., 1998; Carney a kol., 1998).
Wang a kol. (2000a) navrhli, že komplex BASC môže slúžiť ako senzor pre
abnormálnu štruktúru DNA a/alebo ako regulátor postreplikačného reparačného
procesu. Podobnosť medzi ataxia-telangiectasiou (AT) a NBS viedla autorov
k hodnoteniu funkčných interakcií medzi ataxia-telangiectasia mutovanými (ATM)
a NBS1 génmi. Zhao a kol (2000) demonštrovali, že fosforylácia NBS1 indukovaná IŽ
vyžaduje katalyticky aktívny ATM. Komplexy obsahujúce ATM a NBS1 sú prítomné in
vivo ako v bunkách neovplyvnených tak i bunkách ovplyvnených IŽ. Nálezy, že gén
pre AT je zahrnutý do patogenézy T-buniek prolymfotickej leukémie a iných foriem
leukémie, že je vysoká predispozícia NBS pacientov na rozvoj lymfoidnej malignity a
skutočnosť, že NBS a ATM sú nerozoznateľné na bunkovej úrovni uviedli vo svojej
práci Varon a kol. (2001). Varon a kol. (2001) sa tiež zaujímali vzťahom, či NBS1 gén
zahrňuje akútnu lymfoblastickú leukémiu (ALL) a či účinok priebehu choroby má súvis
s tumor supresorovými génmi. Wu a kol. (2000) prezentovali, že NBS je špecificky
fosforylovaný
gén ako odpoveď na gama žiarenie, UV žiarenie a expozíciu
67
hydroxymočovine.
Fosforylácia
NBS
sprostredkovaná
gama
žiarením,
ale
neindukovaná hydoxymočovinou alebo UV žiarením bola v ATM bunkách výrazne
redukovaná. Komplex RAD50/MRE11)/NBS1 (R/M/N) má dynamickú štruktúru, ktorá
tvorí globulárnu doménu ktorá viaže DNA. Tento komplex je výrazne ovplyvnený DNA
väzbou, pričom DNA naviazaná na doménu vedie k paralelnej orientácii (MorenoHerrero a kol., 2005).
Kontrolný gén bunkového cyklu
CCND1
Gén CCND1 (Cyklín D1) je lokalizovaný na chromozóme 11, v polohe 11q13. Fu
a kol. (2004) stanovili, že gén obsahuje 5 exónov a uviedli jeho normálnu a
abnormálnu funkciu. Gén predstavuje regulačnú podjednotku holoenzýmu, ktorá
fosforyluje a aktivuje retinoblastoma proteín (RB1) a podporuje jeho prechod počas
G1-Sfázy bunkového cyklu v rôznej závislosti na cyklín-dependentných kinázách.
CCND1 má početné funkcie pre bunkový cyklus a funkcie nezávislé na Cdk. Spája sa
s transkripčními faktormi, koaktivátormi a korepresormi, ktoré ovládajú acetyláciu
histónov a premenu chromatínového proteínu. Má tiež úlohu v bunkovom raste,
metabolizme a diferenciácii buniek. Amplifikácia a zvýšená expresia CCND1 zohráva
kľúčovú úlohu vo vývoji niektorých druhov rakoviny, vrátane paratyreoidného
adenómu, lymfómu a melanómu, karcinómu prsníka, hrubého čreva a prostaty (www.
NCBI, CCND1, 2008). Gén CCND1 obsahuje často G/A polymorfizmus na nukleotide
870 (kodón 242), ktorý moduluje mRNA spojenie pričom tvorí 2 transkripty.
Polymorfizmus súvisí s vnímavosťou na kolorektálny karcinóm (Le Marchand a kol.,
2003). Curtin a kol. (2005) zistili, že melanómy s divým typom alel BRAF génu a
NRAS génu majú často zvýšený počet kópií génov pre cyklín dependentnú kinázu 4
(CDK4) a CCND1,
ktoré sú súčasťou dráhy RAS-BRAF. Počítačovou analýzou
expresie vzoriek tisícov génov okolo stovky druhov tumorov Lamb a kol. (2003) zistili,
že gén pre CEBP-beta (CEBPB) participuje v dôsledku zvýšenej expresie cyklínu D1.
Funkčnou analýzou sa potvrdilo, že zapojenie CEBPB do regulácie génov, ovplyvňuje
cyklín B1 a zistený CEBPB je hlavným efektorom aktivity cyklínu D1 pri karcinóme
u ľudí. Wang a kol. (2006b) zistili, že cyklin D1 koordinuje funkciu mitochondrií
a syntézu jadrovej DNA. Proteín viazaný na RNA ako TLS (tumor lysis syndrome),
slúži ako kľúčový transkripčný regulačný senzor DNA poškodenia. Signálna68
indukovaná nekódujúca RNA (ncRNA) umiestnená v regulačnej oblasti transkripčnej
jednotky môže pôsobiť spoločne ako selektívna liganda, ktorá sa aktivuje a moduluje
jasne odlišnou skupinou koregulátorov viazaných na RNA ako reakcia na špecifické
signály, poskytuje nečakanú nekódujúcu RNA/RNA väzbu založenú na proteíne
(Wang a kol., 2008).
3. 7 GENETICKÝ POLYMORFIZMUS
Genetický polymorfizmus predstavujú zmeny v sekvencii DNA určitého génu
medzi jedincami. Niektoré z týchto zmien pôsobia na funkciu proteínu, ktorý je
kódovaný génom, napr. cytochróm P450 alebo glutatión S-transferáza. Keďže tieto
polymorfizmy ovplyvňujú metabolizmus a detoxifikáciu toxických chemických látok,
môžu poškodením DNA zvýšiť riziko vzniku choroby.
Mnohé epidemiologické štúdie potvrdzujú, že u jedincov so špecifickými zmenami
génov sa vyskytuje zvýšené riziko určitej formy rakoviny. Vyšší metabolizmus alebo
znížená schopnosť detoxifikácie karcinogénov zo životného prostredia prináša vyšší
výskyt
DNA aduktov v bunkách. Jedinci s určitou genetickou zmenou
sú
viac
vnímaví na poškodenia spôsobené mutagénmi (napr. cigaretovému dymu), čím sa
môže incidencia zhubných ochorení u nich zvyšovať. Experimentálne údaje
s geneticky modifikovanými zvieratami poukazujú na to, že DNA reparačné gény
zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri ochrane organizmu proti chorobám (Kelada a kol.,
2003; Nakajima a Aoyama, 2000).
3. 7. 1 Expozícia prostrediu a genetické zmeny
Postupnosť zmien v génoch kódujúcich enzýmy biotransformácie je výsledkom
náhodných genetických procesov. Zmeny sa v populácii hromadia pod selekčným
tlakom. Ak je frekvencia špecifických zmien vyššia ako 1% označuje sa
polymorfizmom. Bežná frekvencia je v niektorých prípadoch viac ako 10%. Zmeny
v génoch obsahujú rozdielne sekvencie variantov. Výsledkom procesu zmeny v géne
alebo chromozóme sú
haplotypy. Polymorfizmus nemusí byť účinný, vtedy je v
„latentnom“ stave, alebo je funkčný a prejavuje sa zmeneným katalytickým procesom,
stabilitou a/alebo expresiou koncového proteínu (Kelada a kol., 2003).
69
Funkčný polymorfizmus zahrňuje: a) bodové mutácie v kódovaných oblastiach
génu,
čím
spôsobujú
substitúciu
aminokyselín,
môže
sa
zmeniť
katalýza,
enzymatická stabilita a/alebo špecifita substrátu; b) zdvojené alebo mnohopočetné
gény, ktoré spôsobujú vyššiu hladinu enzýmov; c) úplne alebo čiastočne deletované
gény, čím sa nevytvára génový produkt; d) vzájomné pripojenie určitých miest génov,
následkom čoho sa proteínové produkty
buď nevytvárajú alebo spájajú iným
procesom. Polymorfizmus v regulačných oblastiach génov môže vplývať na expresiu
proteínu a mutácia v nekódovaných oblastiach môže vplývať na stabilitu alebo
pripojenie mRNA. Proteíny predstavujú produkty génov, a preto polymorfné formy sú
jednoducho odrazom alelových zmien v géne. Populácia môže obsahovať dva alebo
viac variantov enzýmu kódovaného jedným lókusom. Varianty sa odlišujú v sekvencii
ich AK, čo spôsobuje rozdielny pohyb pri ich elektroforéze (Harms a kol., 2004).
3. 7. 2 Individuálna vnímavosť
Individuálna vnímavosť poukazuje na to, aké zmeny v génoch zvyšujú alebo
znižujú vnímavosť jedinca voči faktorom životného a pracovného prostredia.
Pozornosť sa venuje hlavne genetickému polymorfizmu, ktorý môže meniť reakciu
organizmu na vplyv genotoxickej látky. Určitý polymorfizmus, ktorý ovplyvňuje
metabolizmus xenobiotík, alebo bunková odpoveď na DNA poškodenie, môže zmeniť
individuálnu vnímavosť na rôzne genotoxíny. V mnohých štúdiách si autori kladú
otázku, či určitý genotyp enzýmov metabolizmu xenobiotík zodpovedá za vznik
určitého nádorového ochorenia. Stanovenie vzťahu medzi expozíciou a prejavom
choroby je často veľmi náročné kvôli dlhému indukčno-latentnému obdobiu medzi
expozíciou a samotným prejavom choroby. Iným prístupom je sledovanie vplyvu
genetického polymorfizmu na biomarkery genotoxickej expozície alebo účinku a
porovnanie hladín týchto biomarkerov v rámci rozdielnych skupín genotypov. Vzťah
medzi expozíciou a účinkom nie je spojený s dlhou dobou latencie, čím môžeme
získať dostatočne presné údaje o expozícii. Môže sa tým uľahčiť identifikácia
rizikových skupín pracovníkov a zvýšiť senzitivita biomarkerov v ich biomonitorovaní.
Popri biomonitorovacích štúdiách, môže byť genetický polymorfizmus významný pri
objasnení
individuálnej
variability
genotoxického
účinku
toxínov.
Genetický
polymorfizmus niektorých enzýmov metabolizujúcich xenobiotiká sa prejavuje pri
hodnotení hladiny genotoxických poškodení. U iných jedincov ovplyvňuje „normálnu“
70
hladinu poškodenia. Je dôležitý pre stanovenie celkového hodnotenia genotoxického
účinku látok. Frekvencia rozdielnych alel môže vykazovať výrazné rozdiely i v rámci
etnických skupín. Veľmi dôležitá je presná charakteristika exponovaných skupín
a rozsah alebo charakter expozície (Kelada a kol., 2003).
Individuálna vnímavosť na vznik karcinómu je výsledkom niekoľkých základných
faktorov:
rozdielu
v
metabolizme,
DNA
reparácii,
zmene
expresie
tumor
supresorových génov a protoonkogénov, ako i v celkovom stave organizmu. Záujem
o polymorfizmus, ktorý súvisí so zmenami v ľudskom genóme, stále narastá
v súvislosti s modifikáciou účinku expozície látkam, ktoré sú zdraviu škodlivé. Často
sa hovorí o tzv. génovo-environmentálnej interakcii, ktorá u niektorých jedincov vedie
k vzniku choroby. Na určenie frekvencie CHA v kultúrach ľudských lymfocytov sa
stanovili niektoré polymorfizmy génov, ktoré aktivujú XME. Neprítomný gén glutatión
S-transferázy M1 (GSTM1) u fajčiarov poukazuje na vyššiu frekvenciu CHA, pretože
vplyv genotypu GSTM1 sa vzťahuje na chromatidový typ aberácií. U jedincov
s neprítomným GSTM1 a GSTT1 génom sa zistila vyššia hladina CHA v porovnaní
s prítomným GSTM1 génom a neprítomným GSTT1 génom. U šoférov autobusov,
nefajčiarov, s neprítomným GSTM1 génom, a nízkou hladinou N-acetyltransferázy 2
(NAT2) v genotype, sa v bunkách zistila zvýšená frekvencia CHA (Norppa, 2000;
Norppa, 2004a; Norppa a kol., 2006). Pri senzitivite alebo genetickej vnímavosti na
genotoxický účinok PAU má význam polymorfizmus mEH, GSTM1 a GSTP1 (Leng a
kol., 2004). Polymorfizmy NAT2, GSTT1 a GSTM1 vplývajú na hladinu poškodení
chromozómov, rovnako polymorfizmus XRCC1 pôsobí na frekvenciu CHA. Jedinci
s variantnými
alelami
pre
XRCC1
vykazovali
zníženú
hladinu
zlomov
chromozómového typu (Tuimala a kol., 2002; Tuimala a kol., 2004). Záujem o
polymorfizmus, ktorý súvisí so zmenami v ľudskom genóme, stále narastá v súvislosti
s modifikáciou účinku expozície látkam, ktoré sú zdraviu škodlivé. Často sa hovorí o
tzv. génovo-environmentálnej interakcii, ktorá u niektorých jedincov vedie k vzniku
choroby. Senzitivita bleomycínu je odrazom individuálnej schopnosti reparovať DNA
lézie a je čiastočne ovplyvnená genetickým polymorfizmom XRCC1 génu, ktorý
pôsobí na DNA reparáciu in vitro (Tuimala a kol., 2002; Tuimala a kol., 2004).
Vodička a kol., (2004a) hodnotili vzťah polymorfizmu DNA reparačných génov
XRCC1, XRCC3, XPD, XPG a XPC na výskyt CHA a frekvenciu SCE. Zistili zvýšenú
frekvenciu CHA u jedincov s prítomnou alelou A v XPD géne exón 23, tzn. u jedincov
s genotypom AA a AC. Jedinci s určitou genetickou zmenou - variantom sú viac alebo
71
menej vnímaví na poškodenia spôsobené mutagénmi (napr. aj cigaretovému dymu),
čím sa môže incidencia zhubných ochorení u nich zvyšovať (Vodička a kol., 2004b).
Pretože polymorfizmy ovplyvňujú metabolizmus a detoxifikáciu toxických chemických
látok, môžu zmenou DNA zvýšiť riziko vzniku ochorenia.
V súčasnosti sa sústreďuje pozornosť hlavne na stanovenie rizikových faktorov
a na hodnotene individuálnej vnímavosti, aby sa zabezpečila preventívna ochrana
jedincov.
Práca predstavuje pre človeka súhrn činností, ktoré musí vykonávať pri plnení
pracovných úloh na konkrétnom pracovisku. Činnosti sú vymedzené pracovnými
postupmi a technológiou. V práci strávi viac ako polovicu svojho života. V pracovnom
prostredí pôsobia na človeka rôzne fyzikálne, chemické, biologické, fyziologické,
psychologické a sociálno-ekonomické faktory, z ktorých každý predstavuje za určitých
okolností zdravotné riziko. Pracovné prostredie obyčajne zahrňuje identifikovateľné
a dobre kontrolovateľné expozičné stavy spojené s vyššou koncentráciou škodlivých
látok. Na základe toho sa vytvárajú určité profesijné rizikové skupiny, u ktorých je
potrebné vykonávať zdravotný dozor, vrátane genotoxikologického monitorovania.
Zdravotnícke prostredie je známe prítomnosťou asi 120 látok, ktoré majú mutagénny,
príp.
karcinogénny
účinok.
Sú
to
hlavne
pracovníci
anestéziologických
a
resuscitačných oddelení profesionálne exponovaní anestetickým plynom a pracovníci
onkologických oddelení exponovaní cytostatickým liekom. Pri posudzovaní vplyvov
pracovného prostredia na zdravie človeka treba pamätať, že zdravie je výsledkom
genetickej predispozície, životného štýlu a vzájomného pôsobenia faktorov životného
a pracovného prostredia. Pracovné prostredie je zdrojom vyššej expozície škodlivým
faktorom a z toho vyplýva aj vyššie zdravotné riziko.
72
4 MATERIÁL A METÓDY
Práca dodržiava všetky platné zákony SR, tzn. Zákon č. 363/2005 Z.z. o ochrane
osobných údajov, oznámenie MZV SR č. 40/2000 Z.z., Dohovor o ochrane ľudských
práv a dôstojnosti človeka v súvislosti s aplikáciou biológie a medicíny - dohovor
o ľudských právach a biomedicíne, Zákon č. 576/2004 Z.z. o zdravotnej starostlivosti,
službách súvisiacich s poskytovaním zdravotnej starostlivosti a o zmene a doplnení
niektorých zákonov. Bola schválená Etickou komisiou Martinskej fakultnej nemocnice
Martin a odber biologického materiálu sa uskutočnil v rámci špecializovaných
preventívnych prehliadok pracovníkov jednotlivých pracovísk. Všetci pracovníci
zaradení do súboru poskytli informovaný súhlas so zahrnutím do štúdie.
Každý pracovník vyplnil pred odberom biologického materiálu anamnestický
dotazník, v ktorom podrobne uviedol svoje pracovné zaradenie, dĺžku a spôsob
expozície, doplnil údaje týkajúce sa exogénnych vplyvov a možných vedľajších
faktorov vplývajúcich na výskyt chromozómových aberácií (CHA), napr. fajčenie,
užívanie liekov, expozícia žiareniu, pitie alkoholu, kávy, diéta, a pod. (Príloha 1). Pri
celkovom spracovaní výsledkov sa tieto údaje brali do úvahy.
4. 1 CHARAKTERISTIKA SÚBOROV
4. 1. 1 Profesionálna expozícia anestetikám
Exponovaný súbor tvorilo 76 pracovníkov. 60 z nich bolo z Kliniky anestéziológie
a intenzívnej medicíny (KAIM) Martinskej fakultnej nemocnice (MFN) v Martine a 16 z
Kliniky anestéziológie, resuscitácie a
intenzívnej medicíny (KARIM) Ústrednej
vojenskej nemocnice (ÚVN) v Ružomberku, profesionálne exponovaných inhalačným
anestetikám. Pracovne boli zaradení ako anestéziologickí lekári a anestéziologické
sestry. Títo pracovníci sa pravidelne zúčastňovali pri aplikácií plynných anestetík na
jednotlivých operačných sálach pri chirurgických zákrokoch v celkovej anestéze.
Väčšinu z nich tvorili ženy (N=61), fajčiarov bolo 23, tzn. 30,26% (Tab. 1). Doba
expozície jednotlivých podskupín pracovníkov je uvedená v tab. 2.
73
Tab. 1 Všeobecná charakteristika súboru exponovaného anestetikám
Súbor exponovaný anestetikám
Počet (N)
76
Vek (roky±SD)
36,89±8,75
Expozícia (roky±SD)
11,75±9,35
Pohlavie (N) M/Ž
15 / 61
Fajčenie (N) F/NF
23 / 53
Pracovné zaradenie (N) VŠ/SZP
41 / 35
Tab. 2 Porovnanie doby expozície fajčiarov a nefajčiarov, mužov a žien, lekárov a SZP
v súbore exponovanom anestetikám
Súbor exponovaný anestetikám
EXPOZÍCIA (roky)±SD
Fajčiari
13,52±9,21
Nefajčiari
10,98±9,29
Muži
9,83±8,70
Ženy
13,15±9,21
Lekári
8,34±8,70
Anesteziologické sestry
15,75±9,21
74
4. 1. 2 Profesionálna expozícia cytostatikám
Exponovaný
súbor
tvorilo
72
pracovníkov
profesionálne
exponovaných
cytostatikám, ktorí pracovali na špecializovaných onkologických pracoviskách a
pochádzali z 3 nemocníc severnej časti Stredoslovenského regiónu. 28 pracovníkov
bolo z Poliklinického oddelenia klinickej onkológie (POKO) Martinskej fakultnej
nemocnice v Martine, 31 pracovníkov z Oddelenia radiačnej a klinickej onkológie
(ORKO) ÚVN v Ružomberku a 13 pracovníkov z Oddelenia paliatívnej starostlivosti
Hornooravskej nemocnice s poliklinikou (HNsP) v Trstenej. Všetci prichádzali
pravidelne do kontaktu s cytostatikami, ktoré riedili a aplikovali pacientom. Pracovne
boli zaradení ako lekári a zdravotné sestry. Väčšinu z nich tvorili ženy (N=65;
90,28%), fajčiarov bolo 19, tzn. 26,39% (Tab. 3). Doba expozície jednotlivých
podskupín je uvedená v tab. 4.
Tab. 3 Všeobecná charakteristika súboru exponovaného cytostatikám
Súbor exponovaný cytostatikám
Počet (N)
72
Vek (roky±SD)
41,19±8,95
Expozícia (roky±SD)
11,31±8,98
Pohlavie (N) M/Ž
7 / 65
Fajčenie (N) F/NF
19 / 53
Pracovné zaradenie (N) VŠ/SZP+NZP
14 / 58
75
Tab. 4 Porovnanie doby expozície fajčiarov a nefajčiarov, mužov a žien, lekárov a SZP
v súbore exponovanom cytostatikám
Súbor exponovaný cytostatikám
EXPOZÍCIA (roky)±SD
Fajčiari
10,87±9,10
Nefajčiari
11,47±8,98
Muži
9,71±8,02
Ženy
11,47±8,98
Lekári
11,71±9,28
SZP+NZP
11,22±8,98
4. 1. 3 Kontrolný súbor
Kontrolný súbor tvorilo 76 pracovníkov MFN a závodu Biotika Pharmacia a.s, ktorí
pracovali na takých oddeleniach alebo úsekoch, kde nedochádzalo ku kontaktu
s inhalačnými anestetikami ani cytostatikami (tab. 5).
Tab. 5 Všeobecná charakteristika kontrolného súboru
Kontrolný súbor
Počet (N)
Vek (roky±SD)
76
35,99 ±7,73
Pohlavie (N) M/Ž
16 / 60
Fajčenie (N) F/NF
15 / 61
Pracovné zaradenie (N) VŠ/SZP
20 / 56
76
Pochádzali z Kliniky pracovného lekárstva a toxikológie, Kliniky
telovýchovného
lekárstva, Ústavu lekárskej biológie Jesseniovej lekárskej fakulty UK a 19 zo závodu
Biotika Pharmacia a.s. Martin. Súbor sme vyberali vekovo a pohlavím porovnateľný s
exponovanými skupinami.
4. 2 POPIS JEDNOTLIVÝCH METODÍK
4. 2. 1 Analýza chromozómových aberácií
Odber biologického materiálu
Vzorky krvi sme odoberali v súlade s vyhlásením Helsinskej deklarácie o odbere
biologického materiálu. Odoberali sme periférnu krv (3 ml) na stanovenie
chromozómových aberácií do striekačiek prepláchnutých heparínom.
Nakladanie vzoriek, kultivácia, spracovanie
Periférnu krv sme naložili do rastového média, ktoré bolo zložené z tekutého média
RPMI-1640 5x koncentrovaného, prekolostrálneho teľacieho séra, vody pro
injectione,
rastového stimulátora fytohemaglutinínu (PHA) na vyvolanie mitotickej
aktivity, zmesi antibiotík /PNC:STM/ a 7,5% hydrogénuhličitanu sodného na
zabezpečenie potrebného pH. Pre každého jedinca sme založili 2 kultúry krvnej
vzorky. Do každej kultivačnej nádoby s rastovým médiom sme pridali 10–15 kvapiek
periférnej krvi. Kultivovali sme 48 hod. pri 37oC v biologickom termostate. Dve hodiny
pred ukončením kultivácie sme do kultivačnej zmesi pridali pracovný roztok kolchicínu
(80 μl), tzn. 0,75 μg kolchicínu/1 ml kultúry na zastavenie bunkového delenia.
Kultivačnú zmes sme hypotonizovali v 0,075M roztoku KCl 10min v termostate. Po
centrifugovaní 10 min/1000 ot. a resuspendovaní zmesi sme pridali 4% kyselinu
octovú a po 5 minútach pôsobenia centrifugovali 10 min/1000 ot. Po zliati
supernatantu sme sediment po resuspendovaní fixovali v zmesi metanol-kyselina
octová v pomere 3:1. Celkom sme fixovali 3 krát s postupnými dobami pôsobenia
fixačnej zmesi medzi centrifugovaním 20, 10 minút a bezprostredne po pridaní
fixačnej zmesi. Po poslednej centrifugácii sme k sedimentu pridali 60% kyselinu
octovú a pripravili mikroskopické preparáty kvapkovacou metódou. Z každej kultúry
sme pripravili dva preparáty, tzn. 4 preparáty od každého jedinca. Preparáty sme
farbili
bázickým
farbivom
Giemsa-Romanowski
10
minút
zriedenom
v pufri
77
s upraveným pH (6,8-7,2) pomocou kyseliny citrónovej (Hungerford, 1965; AHEM,
1989; Rössner a kol., 2000).
Mikroskopická analýza
Mikroskopicky sme od každého pracovníka vyhodnotili 100 mitóz v svetelnom
mikroskope pri zväčšení 1500-krát. Hodnotili sme chromozómy v metafáze
bunkového delenia (tzv. c-metafáza) s dostatočne oddelenými chromatidami. Keďže
CHA delíme na aberácie chromatidového typu (poškodená je jedna chromatida
chromozómu) a aberácie chromozómového typu (poškodené sú obidve chromatidy
na chromozóme), stanovovali sme počet aberantných buniek, v ktorých sa vyskytol
chromatidový alebo chromozómový zlom, príp. chromatidová alebo chromozómová
výmena. Chromatidové a chromozómové zlomy (obr.1-2) tvorili atypické tvary
chromozómov ako minute, diminute, terminálne delécie, terminálne zlomy a
acentrické fragmenty. Chromatidové a chromozómové výmeny (obr.3-4) tvorili
triradiály,
kvadriradiály,
dicentrické
chromozómy
s
fragmentom,
tricentrické
chromozómy s fragmentom, translokované chromozómy odlišného tvaru od normy a
prstencové (ring) chromozómy (AHEM, 1989; Rössner a kol., 2000; AHEM, 2000;
AHEM, 2007).
Záznam výsledkov
Do laboratórneho protokolu sme zaznamenávali chromatidové a chromozómové
zlomy (Z1, Z2), chromatidové a chromozómové výmeny (V1, V2), chromatidové a
chromozómové gapy (G1, G2) , asociácie satelitov akrocentrických chromozómov
(AS) a predčasne rozdelené centroméry (Príloha 2).
Vyhodnotenie
Podľa genotoxikologických kritérií sa za aberantné považujú tie bunky, v ktorých sa
vyskytne chromatidový alebo chromozómový zlom (Z1, Z2), alebo chromatidová
alebo chromozómová výmena (V1, V2). Za spontánnu úroveň chromozómových
aberácií je u kontroly (neprofesionálne exponovaná populácia) potvrdená hodnota do
2,00% výskytu aberantných buniek (AB.B.). Hodnoty v rozmedzí 2,01 – 4,00% AB.B.
predstavujú zvýšenú expozíciu genotoxickým látkam a hodnoty 4,01 % a viac AB.B.
predstavujú jedincov s vysokou expozíciou genotoxickým látkam. Individuálne riziko
zvýšenej a vysokej expozície predstavuje hodnotu 5 a viac % AB.B.
78
Obr. 4 Chromatidový zlom (Z1)
Obr. 5 Chromozómový zlom (Z2)
Obr. 6 Chromatidová výmena (V1)
Obr. 7 Chromozómová výmena (V2)
4. 2. 2 Polymorfizmus génov kódujúcich enzýmy metabolizmu xenobiotík
Odber biologického materiálu
Na stanovenie polymorfizmov génov kódujúcich enzýmy metabolizmu xenobiotík sme
odoberali 5 ml periférnej krvi do skúmaviek s prítomnosťou antikoagulancia K3EDTA.
Stanovenie polymorfizmov
Polymorfizmus v géne CYP1B1 sme hodnotili v kodóne 453 CYP1B1 Asn453Ser
a v kodóne 432 CYP1B1 Leu432Val (Nedelcheva-Kristensen a kol., 1996).
Polymorfizmus
EPHX1 sme hodnotili v exóne 3, EcoRV,
Tyr113His, *1/*3 a v exóne 4, RsaI,
kodón 113, EPHX1
kodón 139, EPHX1 His139Arg, *1/*4.
(Fairbrother a kol., 1998). Aktivita EPHX1 sa dedukovala z kombinácie polymorfizmov
exónu 3 a 4 (Hassett a kol., 1994). Polymorfizmus GST sme stanovovali v géne
GSTM1 s prítomnosťou nulového a kladného variantu, polymorfizmus v géne GSTP1
79
sme hodnotili v exóne 5, BsmAI, kodón 105, GSTP1 Ile105Val,*1/*2 a polymorfizmus
v géne GSTT1 ako nulový a kladný variant, polymorfizmus génu NQO1 sme hodnotili
v exóne 6 (C→T), kodón 187 Pro187Ser (Nedelcheva-Kristensen a kol., 1998; www
NCBI NQO1, 2008).
CYP1B1
Pre PCR reakciu sa použili tieto primery: 1B1-F (forward): CAG GCA GAA TTG GAT
CAG GT; 1B1-R (reverse): TTT GGA CAG CAC TAT CAA GGA G. Podmienky
amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 1,6 mM, získaný fragment mal veľkosť 536 bp.
Pred restrikciou bol celý objem rozdelený na dve polovice na stanovenie dvoch
polymorfizmov, kodónu 453 a kodónu 432.
CYP1B1 exón 3, kodón 453 (Asn453Ser)
Podmienky štiepenia CYP 1B1 kodón 453: 2U/vzorka restrikčného enzýmu MwoI1,
restrikčný pufer Tango, dĺžka restrikcie 2 hodiny, 37°C. Hodnotenie genotypu v 3%
géle - veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot (Asn453Asn) 392 bp; 2)
heterozygot (Asn453Ser) - 392+248+144 bp; 3) variantný homozygot (Ser453Ser) 248+144 bp.
CYP1B1 exón 3 kodón 432 (Leu432Val)
Podmienky štiepenia CYP 1B1 kodón 432: 4U/vzorka restrikčného enzýmu OliI,
restrikčný pufer R, dĺžka restrikcie 4 hodiny, 37°C. Hodnotenie genotypu 3% gél veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot (Leu432Leu) - 308+228 bp; 2)
heterozygot (Leu432Val) - 536+308+228 bp; 3) variantný homozygot (Val432Val) 536bp.
EPHX1 exón 3
Pre PCR reakciu sa použili tieto primery: EPHX3-F (forward): GAT CGA TAA GTT
CCG TTT CAC C; EPHX3-R (reverse): AAT CTT AGT CTT GAA GTG AGG AT;
Podmienky amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 1,8 mM, získaný fragment mal veľkosť
163
bp. Podmienky štiepenia: 2U/vzorka restrikčného enzýmu EcoRV, restrikčný
pufer 3, BSA-0,2 μl/vzorka, dĺžka restrikcie 2 hodiny, 37°C. Hodnotenie genotypu v
3% géle - veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot (Tyr113Tyr) - 140 bp; 2)
heterozygot (Tyr113His) - 163+140 bp; 3) variantný homozygot (His113His) - 163 bp
80
EPHX1 exón 4
Pre PCR reakciu sa použili tieto primery: EPHX4-F (forward): ACA TCC ACT TCA
TCC ACG T; EPHX4-R (reverse): ATG CCT CTG AGA AGC CAT. Podmienky
amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 1,8 mM, získaný fragment mal veľkosť 210 bp.
Podmienky štiepenia: 2U/vzorka restrikčného enzýmu RsaI, restrikčný pufer
Y+/Tango, dĺžka restrikcie 2 hodiny, 37°C. Hodnotenie genotypu v 3% géle - veľkosť
fragmentov: 1) normálny homozygot (His139His) - 210 bp; 2) heterozygot (His139Arg)
- 210+164 bp; 3) variantný homozygot (His113His) - 164 bp.
Aktivita EPHX1 sa určuje z kombinácií určených genotypov EPHX1 v exóne 3 a 4:
nízka: *3/*3+*1/*1, *3/*3+*1/*4, *1/*3+*1/*1 a *3/*3+*4/*4; stredná: 1/*1+*1/*1,
*1/*3+*1/*4 a *1/*3+*4/*4; vysoká: 1/*1+*1/*4 a *1/*1+*4/*4 (Hassett a kol., 1994).
GSTM1
Toto stanovenie sa vykonáva ako alelovo-špecifické a ako pozitívny štandard sa
používa fragment GSTM2, ktorého prítomnosť signalizuje, že PCR prebehla
v poriadku a neprítomnosť fragmentu GSTM1 indikuje prítomnosť delécie génu
v homozygotnom stave. Naopak prítomnosť fragmentu GSTM1 znamená, že
sledovaný jedinec má k dispozícii aspoň jednu funkčnú alelu GSTM1. Stanovenie nie
je schopné rozlíšiť normálnych homozygotov s divým typom alel od heterozygotov.
Pre PCR rekciu sa použili tieto primery: GSTM1-F (forward) CTG CCC TAC TTG ATT
GAT G (slúži ako GSTM2-F); GSTM1-R (reverse): CTG GAT TGT AGC AGA TCA
TGC; GSTM2-R (reverse): GAC TCA CTC TGA GCA TAG CAC; Podmienky
amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 1,8 mM, získaný produkt GSTM1 mal veľkosť 275
bp, GSTM2 175 bp. Produkty sa ďalej neštiepili, aplikovali sa priamo na gél.
Hodnotenie genotypu v 3% géle - veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot alebo
heterozygot (GSTM1-plus) - 275 bp (GSTM1) a 175 bp (GSTM2); 2) variantný
homozygot (GSTM-null) - produkt GSTM1 nevzniká a 175 bp (GSTM2).
GSTT1
GSTP1 exón 5 (A→G), kodón 105 (Ile105Val)
Delécia génu GSTT1 a jednotlivé genotypy GSTP1 boli stanovované zároveň.
Prítomnosť fragmentu GSTP1 slúži ako pozitívny štandard pre prípad neprítomnosti
fragmentu GSTT1. Na vykonanie PCR reakcie sa aplikovalo 8 μl produktu na gél
a bola určená delécia génu GSTT1. Potom nasledovala restrikcia a boli určené
81
genotypy GSTP1. Pre PCR sa použili tieto primery: GSTP1-F (forward): TCC TTC
CAC GCA CAT CCT CT; GSTP1-R (reverse): AGC CCC TTT CTT TGT TCA GC;
GSTT1-F (forward):
TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC; GSTT1-R (reverse):
TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA; Podmienky amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 0,8
mM. Hodnotenie genotypu GSTT1 v 3% géle - veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot
alebo heterozygot (GSTT1-plus) - 480 bp; 2) variantný homozygot
(GSTM-null) - produkt sa PCR nevytvoril. Podmienky štiepenia: 2U/vzorka
restrikčného enzýmu BsmAI, restrikčný pufer 3, dĺžka restrikcie 2 hodiny, 55°C.
Hodnotenie genotypu GSTP1 v 3% géle - veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot (Ile105Ile) - 294 bp; 2) heterozygot (Ile105Val) - 294+234+60 bp; 3)
variantný homozygot (Val105Val) - 234+60 bp.
GSTM3 intrón 6
Pre PCR reakciu sa použili tieto primery: GSTM3-F (forward): TCA TGG TTT GCC
GGG GAA; GSTM3-R (reverse): GGA ACT CAT CCA GGC ACT TG; Podmienky
amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 1,5 mM, získaný fragment mal veľkosť 189 bp.
Podmienky štiepenia: 2U/vzorka restrikčného enzýmu EamI, restrikčný pufer Tango,
dĺžka restrikcie 2 hodiny, 37°C. Hodnotenie genotypu v 3% géle - veľkosť fragmentov:
1) normálny homozygot (*A/*A) - 153 bp; 2) heterozygot (*A/*B) - 189+153 bp; 3)
variantný homozygot (*B/*B) - 189 bp.
NQO1 exón 6 (C→T), kodón 187 (Pro187Ser)
Pre PCR reakciu sa použili tieto primery: NQO-F (forward): GTA TCC TCA GAG TGG
CAT TC; NQO-R (reverse): TCT CCT CAT CCT GTA CCT CT; Podmienky
amplifikácie: koncentrácia MgCl2: 1,8 mM, získaný fragment mal veľkosť 233 bp.
Podmienky štiepenia: 1U/vzorka restrikčného enzýmu HinfI, restrikčný pufer 2, dĺžka
restrikcie 2 hodiny, 37°C. Hodnotenie genotypu v 3% géle - veľkosť fragmentov: 1)
normálny homozygot (Pro187Pro) - 233 bp; 2) heterozygot (Pro187Ser) 233+198+35 bp; 3) variantný homozygot (Ser187Ser) - 198+35 bp.
4. 2. 3 Polymorfizmus DNA reparačných génov
Jednotlivé nukleotidové polymorfizmy v génoch kódujúce rôzne DNA reparačné
enzýmy sa stanovili metódou založenou na PCR-RFLP. Na PCR sa použilo 10 ng
genómovej DNA. Reakcia prebiehala v 10 μl zmesi obsahujúcej 20 mM Tris-HCl, 50
82
mM KCl, 2,0 mM MgCl2, 0,11 mM každého dNTP, 0,3 μM každého základu sekvencie
a 0,3 U Taq DNA polymerázy. Amplifikované fragmenty boli natrávené restrikčnými
endonukleázami a analyzované. Výsledky genotypov sa stanovili priamym procesom
sekvencie amplifikovaných fragmentov.
Bázová excízna oprava (BER)
XRCC1 exón 6 (C→T), kodón 194 (Arg194Trp)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5′-GCC CCG TCC CAG
GTA-3′; R (reverse): 5′-AGC CCC AAG ACC CTT TCA CT-3′; Na štiepenie sa použil
restrikčný enzým MspI; veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot (Arg194Arg) 292+21 bp; 2) heterozygot (Arg194Trp) - 313+292+21 bp; 3) variantný homozygot
(Trp194Trp) - 313 bp.
XRCC1 exón 10 (G→A), kodón 399 (Arg399Gln)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5´-GCC CCT CAG ATC
ACA CCT AAC-3´; R (reverse): 5´-CAT TGC CCA GCA CAG GAT AA-3´; Na
štiepenie sa použil restrikčný enzým MspI; veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot (Arg399Arg) - 374+221 bp; 2) heterozygot (Arg399Gln) - 615+374+221
bp; 3) variantný homozygot (Gln399Gln) - 615 bp.
hOGG1 exón 7 (C→G), kodón 326 (Ser326Cys)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5´-AGT GGA TTC TCA
TTG CCT TCG-3´; R (reverse): 5'-GGT GCT TGG GGA ATT TCT TT-3´; Na štiepenie
sa použil restrikčný enzým Fnu4HI; veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot
(Ser326Ser) - 100; 2) heterozygot (Ser326Cys) - 200+100 bp; 3) variantný homozygot
(Cys326Cys) - 200 bp.
APE1 exón 5 (T→G), kodón 148 (Asp148Gln)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5´-CTG TTT CAT TTC
TAT AGG CTA-3´; R (reverse): 5'-AGG AAC TTG CGA AAG GCT TC-3´; Na
štiepenie sa použil restrikčný enzým BfaI; veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot (Asp148Asp) - 153 bp; 2) heterozygot (Asp148Gln) - 206+153+53; 3)
variantný homozygot (Gln148Gln) – 206 bp.
83
Nukleotidová excízna oprava (NER)
XPD exón 23 (A→C), kodón 751 (Lys751Gln) – ERCC2
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5'-CCC CTC TCC CTT
TCC TCT GTT-3'; R (reverse): 5'-GCT GCC TTC TCC TGC GAT TA-3'; Na štiepenie
sa použil restrikčný enzým PstI; veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot
(Lys751Lys) - 290+146 bp; 2) heterozygot (Lys751Gln) - 290+227+146+63 bp; 3)
variantný homozygot (Gln751Gln) - 227+146+63 bp.
XPG exón 15 (G→C), kodón 1104 (Asp1104His) – ERCC5
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): F: 5'-TGG ATT TTT
GGG GGA GAC CT-3'; R (reverse): 5'-CGG GAG CTT CCT TCA CTG AGT-3';
Na štiepenie sa použil restrikčný enzým Hsp92II; veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot (Asp1104Asp) - 159 bp; 2) heterozygot (Asp1104His) - 59+100+159 bp;
3) variantný homozygot (His1104His) - 59+100 bp.
XPC exón 15 (A→C), kodón 939 (Lys939Gln)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5'-GAT GCA GGA GGT
GGA CTC TCT-3'; R (reverse): 5'-GTAGTGGGGCAGCAGCAACT-3'; Na štiepenie sa
použil restrikčný enzým PvuII; veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot
(Lys939Lys) - 281 bp; 2) heterozygot (Lys939Gln) - 150+131+281 bp; 3) variantný
homozygot (Gln939Gln) - 150+131 bp.
Reparácia dvojvláknových zlomov (DSBR)
XRCC3 exón 7 (C→T), kodón 241(Thr241Met)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5'-GCT CGC CTG GTG
GTC ATC-3'; R (reverse): 5'-CTT CCG CAT CCT GGC TAA AAA-3'; Na štiepenie sa
použil restrikčný enzým Hsp92II; veľkosť fragmentov: 1) normálny homozygot
(Thr241Thr) - 315+140 bp; 2) heterozygot (Thr241Met) - 315+210+140+105 bp; 3)
variantný homozygot (Met241Met) - 210+140+105 bp.
84
NBS1 exón 5 (G→C), kodón 185 (Glu185Gln)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5´-GGA TGT AAA
CAG CCT CTT G-3´; R (reverse): 5'-CAC AGC AAC TAT TAC ATC CT-3´;
Na
štiepenie sa použil restrikčný enzým HinfI; veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot (Glu185Glu) - 129+49 bp; 2) heterozygot (Glu185Gln) - 174+129+49 bp;
3) variantný homozygot (Gln185Gln) - 174 bp.
Kontrolný gén bunkového cyklu
CCND1 exón 4 (A→G), kodón 241 (Pro185Pro)
Pre PCR- RFLP reakciu sa použili tieto primery: F (forward): 5´-GTG AAG TTC
ATT TCC AAT CCG C-3´; R (reverse): 5'-TAA GTG AGG GTG ATG TCC C-3´; Na
štiepenie sa použil restrikčný enzým MspI; veľkosť fragmentov: 1) normálny
homozygot (Glu185Glu) - 145+22 bp; 2) heterozygot (Glu185Gln) - 167+145+22 bp;
3) variantný homozygot (Gln185Gln) - 167 bp.
4. 2. 5 Štatistické hodnotenie
Štatistickú analýzu sme vykonali programom Statgraphics, verzia 7 (Manugistics,
Cambridge, MA). Hardy-Weinbergova rovnováha sa testovala χ2 testom. Nulovú
hypotézu sme testovali pomocou ANOVA testu. Pri údajoch, ktoré nemali normálne
rozloženie, sme použili neparametrický Mann-Whitneyov U-test na testovanie
rozdielov medzi skupinami a Spearmanova korelačná analýza na výpočet korelácie
medzi jednotlivými parametrami. Analýza variancie (ANOVA) sa použila na testovanie
vzťahov medzi biomarkermi a určitým genotypom. Rozdiely v distribúcii genotypov sa
vyhodnotili chí-kvadrát testom. Hodnoty v tabuľkách sú uvedené ako priemer±SD (pri
veku, dĺžke expozície, hodnotení chromozómových aberácií a polymorfizmov DNA.
85
5 VÝSLEDKY
5. 1 BIOMARKERY GENOTOXICKÝCH ÚČINKOV
U zdravotníckych
pracovníkov
dlhodobo
exponovaných
nízkym
dávkam
anestetických plynov(exponovaná skupina-anestetiká, EXP1) a antineoplastických
látok (exponovaná skupina-cytostatiká, EXP2) sme vykonali cytogenetickú analýzu
v stimulovaných
lymfocytoch
chromozómových
aberácií
periférnej
(CHA)
a
krvi
ich
a
hodnotili
jednotlivých
výskyt
typov,
celkových
tzn.
aberácií
chromatidového typu (CHTA) a aberácií chromozómového typu (CHSA). Zistené
výsledky sme analyzovali a štatisticky porovnávali s kontrolnou skupinou (KONTR).
Percentuálny výskyt celkových chromozómových aberácií (CHA) v jednotlivých
exponovaných skupinách a kontrolnej skupine je uvedený v tab. 6.
Tab. 6 Počet chromozómových aberácií a ich percentuálne vyjadrenie v exponovaných
skupinách a kontrole
Počet hodnotených
mitóz (N)
Počet AB.B. (N)
AB.B. (%) ± SD
Exponovaná skupinaanestetiká (EXP1)
7600
192
2,53±1,46***
Exponovaná skupinacytostatiká (EXP2)
7200
137
1,90±1,34***
Kontrolná skupina
(KONTR)
7600
96
1,26±0,93
*** P=0,0008 (EXP1); *** P=0,001 (EXP2)
Najvyššiu frekvenciu celkových chromozómových aberácií (CHA) sme zistili
v exponovanej skupine EXP1(2,53±1,46%), pričom táto hodnota bola štatisticky
významne
vyššia
v porovnaní
s kontrolnou
skupinou
(Mann-Whitney
U-test,
P=0,0008). Podobne v skupine EXP2 sme zistili štatisticky významne vyšší výskyt
celkových CHA v porovnaní s kontrolou (EXP2: 1,90±1,34% vs. KONTR: 1,26±0,93%;
Mann-Whitney U-test, P=0,001). V skupine EXP1 sme zistili štatistický vysoko
významný rozdiel medzi aberáciami chromatidového (CHTA)
a chromozómového
86
typu (CHSA) – CHTA: 0,61±0,83% vs. CHSA: 1,92±1,38%; Man-Whitney U-test,
P=0,0009). V skupine EXP2 a kontrolnej skupine sme tento rozdiel nezistili ( tab. 7).
Tab. 7 Počet aberácií chromatidového (CHTA) a chromozómového (CHSA) typu a ich
percentuálne vyjadrenie v exponovaných skupinách a kontrole
CHTA
CHSA
Počet (N)
%± SD
Počet (N)
%± SD
Exponovaná skupinaanestetiká (EXP1)
46
0,61±0,83
146
1,92±1,38***
Exponovaná skupinacytostatiká (EXP2)
66
0,92±1,04
71
0,98±1,17
Kontrolná skupina
(KONTR)
40
0,53±0,62
56
0,73±0,81
*** P = 0,0009
Na grafe 1 je znázornený výskyt jednotlivých typov chromozómových aberácií –
CHTA a CHSA v exponovanej skupine EXP1. Pri porovnaní výskytu týchto typov sme
zistili viac ako 3-násobne vyšší výskyt aberácií chromozómového typu v porovnaní
s aberáciami chromatidového typu (CHSA typ: 1,92±1,38% vs. CHTA typ:
0,61±0,83%).
Graf 1
Výskyt chromatidového a chromozómového typu aberácií v skupine EXP1
87
V exponovanej
skupine EXP2 sme nezistili rozdiel v zastúpení jednotlivých typov
aberácií (CHTA typ: 0,92±1,04% vs. CHSA typ: 0,98±1,17%), ako je to zobrazené na
grafe 2. Zastúpenie aberácií chromatidového typu v porovnaní s chromozómovým
typom bolo takmer zhodné.
Graf 2
Výskyt chromatidového a chromozómového typu aberácií v skupine EXP2
V kontrolnej skupine sme tiež nezistili rozdiel v zastúpení jednotlivých typov aberácií
(graf 3). Zastúpenie aberácií CHSA typu bolo mierne vyššie v porovnaní s CHTA
typom (CHSA typ: 0,73±0,81% vs. CHTA typ: 0,53±0,62%).
Graf 3
Výskyt chromatidového a chromozómového typu aberácií v kontrolnej skupine
Pri porovnaní výskytu celkových CHA a ich jednotlivých typov v závislosti na pohlaví
sme v skupine EXP1 (graf 4) zistili vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu
88
u žien v porovnaní s mužmi (CHA – Ž: 2,61±1,45% vs. M: 2,20±1,55%; CHSA typ – Ž:
2,03±1,39% vs. M: 1,47±1,49%), aberácie CHTA typu boli vyššie u mužov (M:
0,73±0,77% vs. Ž: 0,57±0,84%). V skupine EXP2 (graf 5) sme zistili vyšší výskyt
celkových CHA, CHTA typu a CHSA typu u mužov (CHA – M: 2,43±1,39% vs. Ž:
1,85±1,34%; CHTA typ – M: 1,00±0,99% vs. Ž: 0,91±1,04%; CHSA typ – M:
1,43±1,28% vs. Ž: 0,94±1,17%).
Graf 4
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v skupine
EXP1 v závislosti na pohlaví
Graf 5
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v skupine
EXP2 v závislosti na pohlaví
89
V kontrolnej skupine (graf 6) sme zistili rovnaký trend výskytu celkových CHA a ich
jednotlivých typov ako v skupine EXP2, tzn. že výskyt celkových CHA a ich
jednotlivých typov bol vyšší u mužov v porovnaní so ženami (CHA – M: 1,44±0,90%
vs. Ž: 1,22±0,93%; CHTA typ – M: 0,69±0,63% vs. Ž: 0,49±0,62%; CHSA typ – M:
0,75±0,77% vs. Ž: 0,73±0,81%).
V skupine EXP1 (graf 7) sa výskyt celkových CHA medzi skupinou fajčiarov a
nefajčiarov neodlišoval (F: 2,56±1,45% vs. NF: 2,51±1,45%). Pri
hodnotení
Graf 6
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v kontrolnej
skupine v závislosti na pohlaví
Graf 7
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v skupine
EXP1 u fajčiarov a nefajčiarov
90
jednotlivých typov chromozómových aberácií sme zistili vyšší výskyt aberácií CHTA
typu v skupine nefajčiarov v porovnaní s
fajčiarmi
(NF: 0,70±0,83% vs.
F:0,39±0,84%), rozdiel však nebol štatisticky významný a naopak vyšší výskyt
aberácií CHSA typu u fajčiarov v porovnaní s nefajčiarmi (F: 2,17±1,39% vs.
NF:1,81±1,40%), rozdiel však tiež nebol štatisticky významný.
Podobne sme v skupine EXP2 (graf 8) nezistili rozdiel medzi skupinou fajčiarov
a nefajčiarov (F: 1,95±1,38% vs. NF: 1,89±1,34%).
Medzi jednotlivými typmi
chromozómových aberácií sme zistili podobné zastúpenie aberácií ako v skupine
EXP1, tzn. vyšší výskyt
aberácií CHTA typu v skupine nefajčiarov v porovnaní
s fajčiarmi (NF: 0,96±1,04% vs. F: 0,79±1,07%) a vyšší výskyt aberácií CHSA typu
v skupine fajčiarov v porovnaní s nefajčiarmi (F: 1,16±1,17% vs. NF: 0,92±1,17%).
Graf 8
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v skupine
EXP2 u fajčiarov a nefajčiarov
Rovnaký trend výskytu celkových CHA a ich jednotlivých typov ako v skupine EXP1
a EXP2 (graf 9) sme zistili i v kontrolnej skupine, tzn. vyšší výskyt celkových CHA
a aberácií CHSA typu u fajčiarov v porovnaní s nefajčiarmi a aberácií CHTA typu u
nefajčiarov (CHA – F: 1,33±0,92% vs. NF: 1,25±0,93%; CHTA typ – F: 0,40±0,61%
vs. NF: 0,56±0,62%; CHSA typ – F: 0,93±0,78% vs. NF: 0,69±0,81%).
91
Graf 9
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov u fajčiarov
a nefajčiarov v kontrolnej skupine
Pri hodnotení výskytu celkových aberácií a ich jednotlivých typov podľa pracovného
zaradenia sme vo v obidvoch exponovaných skupinách (graf 10-11) a kontrole (graf
12) zistili vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu u zdravotných sestier
(ZS) v porovnaní s lekármi (L) - EXP1: CHA – ZS: 2,86± 1,45% vs. L: 2,24±1,55%;
CHSA typ – ZS: 2,06±1,39% vs. L: 1,80±1,49%; EXP2: CHA – ZS: 1,93± 1,35% vs. L:
1,79±1,37%; CHSA typ – ZS: 1,09±1,17% vs. L: 0,57±1,13%; KONTR: CHA – ZS:
1,32± 0,93% vs. L: 1,10±0,90%; CHSA typ – ZS: 0,77±0,81% vs. L: 0,65±0,77%.
Graf 10 Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v skupine
EXP1 podľa pracovného zaradenia
92
Pri CHTA type aberácií sme zistili v skupine EXP1 a KONTR vyšší výskyt
u zdravotných sestier (EXP1 – ZS: 0,80± 0,84% vs. L: 0,44±0,77%; KONTR – ZS:
0,55±0,62% vs. L: 0,45±0,63), ale v skupine EXP2 u lekárov, v porovnaní so
zdravotnými sestrami (L: 1,21± 1,08% vs. ZS: 0,84±1,04%).
Graf 11 Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v skupine
EXP2 podľa pracovného zaradenia
Graf 12 Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v kontrolnej
skupine podľa pracovného zaradenia
93
5. 2 HODNOTENIE POLYMORFIZMOV GÉNOV PRE ENZÝMY METABOLIZMU
XENOBIOTÍK
V práci sme sledovali faktory individuálnej vnímavosti na základe hodnotenia
vzťahu medzi výskytom celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
s polymorfizmami vybraných génov kódujúcich enzýmy metabolizmu xenobiotík
(XME)
v skupinách
exponovaných
pracovníkov
a
kontroly.
Hodnotili
sme
polymorfizmus týchto génov XME: CYP1B1, EPHX1, GSTM1, GSTP1, GSTT1
a NQO1.
Polymorfizmus génu CYP1B1 sme hodnotili v exóne 3 kodón 453 (Asn453Ser)
a kodón 432 (Leu432Val). Polymorfizmus EPHX1 sme hodnotili v exóne 3, EcoRV,
kodón 113 (Tyr113His), *1/*3 a v exóne 4, RsaI,
kodón 139, (His139Arg), *1/*4.
Aktivita EPHX1 sa dedukovala z kombinácie polymorfizmov exónu 3 a 4. Kombinácie
*3/*3+*1/*1, *3/*3+*1/*4, *1/*3+*1/*1 a *3/*3+*4/*4 predstavovali nízku aktivitu EPHX1;
kombinácie *1/*1+*1/*1, *1/*3+*1/*4 a *1/*3+*4/*4 strednú a *1/*1+*1/*4 a *1/*1+*4/*4
vysokú aktivitu EPHX1. Polymorfizmus GST sme stanovovali v géne GSTM1
s prítomnosťou nulového a kladného variantu, v géne GSTP1 sme hodnotili
polymorfizmus v exóne 5, kodón 105 (Ile105Val), v géne GSTT1 ako nulový a kladný
variant, polymorfizmus génu GSTM3 v intróne 6 a polymorfizmus génu NQO1 v
exóne 6, kodón 187 (Pro187Ser).
Gén CYP1B1 Asn453Ser
Pri hodnotení polymorfizmu v géne CYP1B1 Asn453Ser (grafy 13-15) sme
v skupine exponovanej anestetikám (EXP1), skupine exponovanej cytostatikám
(EXP2) a kontrolnej skupine zistili pokles počtu celkových CHA s prítomnosťou
variantnej alely. Pri aberáciách CHTA typu sme s variantnou alelou pozorovali ich
pokles v obidvoch exponovaných súboroch, ale v kontrolnej skupine mierny vzostup.
Počet aberácií CHSA typu sa v obidvoch exponovaných súboroch aj kontrole slabo
znižoval s prítomnosťou variantnej alely.
94
Graf 13
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CYP1B1 Asn453Ser v skupine exponovanej anestetikám
Graf 14 Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CYP1B1 Asn453Ser v skupine exponovanej cytostatikám
95
Graf 15 Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CYP1B1 Asn453Ser v kontrolnej skupine
Gén CYP1B1 Leu432Val
Pri hodnotení polymorfizmu génu CYP1B1 Leu432SVal (grafy 16-18) sme ani v
jednej z exponovaných skupín nezistili rozdiel v celkovom počte CHA, v kontrolnej
skupine sa ich počet zvyšoval s prítomnosťou variantnej alely. Pri CHTA type aberácií
sme zistili ich mierny vzostup v obidvoch exponovaných skupinách a kontrolnej
skupine. Počet aberácií CHSA typu sa v obidvoch exponovaných súboroch znižoval
s prítomnosťou variantnej alely, v kontrolnom súbore sme ich pokles nezaznamenali.
Graf 16
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CYP1B1 Leu432Val v skupine exponovanej anestetikám
96
Graf 17
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CYP1B1 Leu432Val v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 18
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CYP1B1 Leu432Val v kontrolnej skupine
Gén EPHX1
Pri hodnotení polymorfizmu génu EPHX1, sme v skupine EXP1 (graf 19) zistili
vyšší výskyt celkových CHA u jedincov s vysokou aktivitou EPH, ale v skupine
EXP2 a kontrole sme zistili ich pokles. Počet aberácií CHTA typu sa tiež znižoval s
narastajúcou aktivitou. Pri CHSA type aberácií sme zistili vzostup v skupine EXP1,
97
ale naopak ich pokles so stúpajúcou aktivitou EPH v skupine EXP2 a KONTR (grafy
20-21).
Graf 19
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
EPHX1 podľa aktivity EPH v skupine exponovanej anestetikám
Graf 20
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
EPHX1 podľa aktivity EPH v skupine exponovanej cytostatikám
98
Graf 21
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
EPHX1 podľa aktivity EPH v kontrolnej skupine
Gén GSTM1
Pri hodnotení polymorfizmu
génu GSTM1 sme v obidvoch exponovaných
skupinách a kontrole zistili vyšší výskyt celkových CHA pri nulovom genotype, pri
CHTA type aberácií sme zistili v skupine EXP1 ich pokles, ale v skupine EXP2
a KONTR
ich
vzostup.
Vyšší
výskyt
aberácií
CHSA
typu
bol
v obidvoch
exponovaných skupinách, ale nižší v kontrolnej skupine pri nulovom genotype (grafy
22-24).
Graf 22
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTM1 v skupine exponovanej anestetikám
99
Graf 23
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTM1 v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 24
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTM1 v kontrolnej skupine
Gén GSTP1 Ile105Val
Pri hodnotení polymorfizmu génu GSTP1 Ile105Val (grafy 25-27) sme ani v jednej
hodnotenej skupine nezistili výrazné rozdiely v celkovom počte CHA a ich jednotlivých
typoch. Počet celkových CHA bol rovnaký v obidvoch exponovaných skupinách
a slabo sa zvyšoval v kontrolnej skupine s variantnou alelou. Počet aberácií
100
CHTA typu sa v EXP1 a EXP2 mierne znižoval, naopak v KONTR zvyšoval
s prítomnosťou variantnej alely. Počet CHSA aberácií sa v skupine EXP1 a KONTR
vyskytoval bez výrazného rozdielu, v skupine EXP2 sme zistili ich mierny vzostup
s prítomnosťou variantnej alely.
Graf 25
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTP1 Ile105Val v skupine exponovanej anestetikám
Graf 26
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTP1 Ile105Val v skupine exponovanej cytostatikám
101
Graf 27
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTP1 Ile105Val v kontrolnej skupine
Gén GSTT1
Pri hodnotení polymorfizmu v géne GSTT1 (grafy 28-30) sme vo všetkých troch
hodnotených skupinách zistili vyšší výskyt celkových CHA pri nulovom genotype, pri
aberáciách CHTA typu sme zistili pokles ich počtu v skupine EXP1, ale v skupine
EXP2 a KONTR bol ich výskyt vyšší. Pri CHSA type aberácií bol ich výskyt štatisticky
vyšší v skupine EXP1 (Mann-Whitney U-test P<0,05) pri nulovom genotype, v EXP2
a kontrole ich zvýšený výskyt pri nulovom variante nebol štatisticky významný.
Graf 28
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v géne
GSTT1 v skupine exponovanej anestetikám
102
Graf 29
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v géne
GSTT1 v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 30
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov v géne
GSTT1 v kontrolnej skupine
Gén GSTM3
Pri hodnotení polymorfizmu génu GSTM3 (grafy 31-33) sme v skupine
exponovanej anestetikám (EXP1) a kontrole zistili pokles počtu celkových CHA
s prítomnosťou variantnej alely, v skupine exponovanej cytostatikám sme zistili ich
mierny nárast. Pri CHTA type aberácií sme v obidvoch exponovaných skupinách
103
zistili zvýšenie ich počtu s prítomnosťou variantnej alely. V kontrolnej skupine bol
počet aberácií CHTA typu nižší. Pri CHSA type aberácií sme v obidvoch
exponovaných skupinách aj kontrole zistili nižší počet aberácií s prítomnosťou
variantnej alely.
Graf 31
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTM3 v skupine exponovanej anestetikám
Graf 32
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTM3 v skupine exponovanej cytostatikám
104
Graf 33
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
GSTM3 v kontrolnej skupine
Gén NQO1 Pro187Ser
Hodnotením
polymorfizmu
génu
NQO1
(grafy
34-36)
sme
v obidvoch
exponovaných skupinách aj kontrole zistili zvýšenie počtu celkových CHA a aberácií
CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely. Počet aberácií CHTA typu bol v obidvoch
exponovaných skupinách rovnaký a v kontrolnej skupine slabo znížený.
Graf 34
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
NQO1 Pro187Ser v skupine exponovanej anestetikám
105
Graf 35
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
NQO1 Pro187Ser v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 36
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
NQO1 Pro187Ser v kontrolnej skupine
5. 3 HODNOTENIE POLYMORFIZMOV DNA REPARAČNÝCH GÉNOV
Faktory individuálnej vnímavosti sme sledovali aj na základe hodnotenia vzťahu
medzi výskytom celkových
chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
a polymorfizmami vybraných DNA reparačných génov v skupinách exponovaných
pracovníkov a kontroly. Hodnotili sme polymorfizmus týchto DNA reparačných génov:
106
pre bázovú excíznu reparáciu XRCC1, hOGG1, APE1; pre nukleotidovú excíznu
reparáciu XPD, XPG, XPC; pre reparáciu dvojvláknových zlomov XRCC3 a NBS1;
kontrolného génu bunkového cyklu CCND1.
Polymorfizmus génu XRCC1 sme hodnotili v exóne 10 (G→A) kodón 399
(Arg399Gln) a v exóne 6 (C→T) kodón 194 (Arg194Trp), polymorfizmus génu
hOGG1 exón 7 (C→G) kodón 326 (Ser326Cys) a génu APE1 exón 5 (T→G) kodón
148 (Asp148Glu); polymorfizmus génu XPD exón 23 (A→C) kodón 751 (Lys751Gln),
génu XPG exón 15 (G→C) kodón 1104 (Asp1104His), génu XPC exón 15 (A→C)
kodón 939 (Lys939Gln); polymorfizmus génu XRCC3 v exóne 7 (C→T) kodón 241
(Thr241Met) a génu NBS1 exón 5 (G→C) kodón 185 (Glu185Gln); polymorfizmus
génu CCND1 exón 4 (A→G) kodón 241 (Pro241Pro).
Gény bázovej excíznej opravy (BER)
Gén XRCC1 Arg194Trp
Hodnotením polymorfizmu v géne XRCC1 Arg194Trp (grafy 37-39) sme v
skupine exponovanej anestetikám (EXP1) zistili nárast a v skupine EXP2 a
Graf 37
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC1 Arg194Trp v skupine exponovanej anestetikám
KONTR nepatrný pokles celkových CHA s prítomnosťou variantnej alely. Počet
aberácií CHTA typu bol v obidvoch exponovaných skupinách a kontrole nižší (v EXP2
štatisticky významne, Mann-Whitney U-test, P<0,05) s prítomnosťou variantnej alely
T, naopak počet aberácií CHSA typu bol vyšší u heterozygotov CT v obidvoch
exponovaných skupinách a kontrole.
107
Graf 38
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC1 Arg194Trp v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 39
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC1 Arg194Trp v kontrolnej skupine
Gén XRCC1 Arg399Gln
Hodnotením polymorfizmu v géne XRCC1 Arg399Gln (grafy 40-42) sme v skupine
exponovanej anestetikám (EXP1) a kontrole zistili nárast a v skupine EXP2
pokles celkových CHA s prítomnosťou variantnej alely, pri aberáciách CHTA
108
typu v skupine EXP1 a EXP2 ich pokles, ale v kontrolnej skupine ich nárast. Pri
aberáciách CHSA typu sme zistili ich nárast s prítomnosťou variantnej alely, tzn.
počet týchto aberácií bol vyšší v skupine heterozygotov GA a variantných
homozygotov AA.
Graf 40
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC1 Arg399Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 41
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC1 Arg399Gln v skupine exponovanej cytostatikám
109
Graf 42
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC1 Arg399Gln v kontrolnej skupine
Gén hOGG1 Ser326Cys
Hodnotením polymorfizmu v géne hOGG1 Ser326Cys (grafy 43-45) sme pri
hodnotení celkových CHA zistili pokles v prítomnosti variantnej alely G v obidvoch
exponovaných skupinách a kontrole. Podobne pri aberáciách CHTA typu sme
pozorovali pokles v obidvoch exponovaných skupinách a kontrole, pri hodnotení
aberácií CHSA typu sme zistili nepatrný pokles v skupine EXP1 a KONTR, ale
v skupine EXP2 sme v ich počte nezistili rozdiel.
Graf 43
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
hOGG1 Ser326Cys v skupine exponovanej anestetikám
110
Graf 44
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
hOGG1 Ser326Cys v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 45
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
hOGG1 Ser326Cys v kontrolnej skupine
Gén APE1 Asp148Glu
Pri hodnotení polymorfizmu v géne APE1 Asp148Glu (grafy 46-48) sme v EXP1 a
kontrole zistili nižší počet celkových CHA s prítomnosťou variantnej alely G, naopak
v skupine EXP2 sme zistili ich počet vyšší. Počet aberácií CHTA typu bol nižší
v obidvoch exponovaných skupinách, v kontrole sa však ich počet výrazne nelíšil. Pri
hodnotení aberácií CHSA typu sme zistili ich pokles s prítomnosťou variantnej alely G
111
v skupine
exponovanej
anestetikám
a kontrole,
naopak
vzostup
v skupine
exponovanej cytostatikám.
Graf 46
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
APE1 Asp148Glu v skupine exponovanej anestetikám
Graf 47
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
APE1 Asp148Glu v skupine exponovanej cytostatikám
112
Graf 48
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
APE1 Asp148Glu v kontrolnej skupine
Gény nukleotidovej excíznej opravy (NER)
Gén XPD Lys751Gln
Pri hodnotení polymorfizmu v géne XPD Lys751Gln (grafy 49-51) sme zistili
mierny vzostup celkových CHA v skupine EXP1 a KONTR s prítomnosťou variantnej
alely, v EXP2 sme tento rozdiel nepozorovali. Pri
aberáciách CHTA
typu sme
nezistili rozdiel v skupine EXP1 a KONTR, v skupine EXP2 sa pozoroval
Graf 49
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPD Lys751Gln v skupine exponovanej anestetikám
113
ich mierny vzostup. Počet aberácií CHSA typu bol vyšší v obidvoch exponovaných
skupinách a kontrole u heterozygotov AC a variantných homozygotov CC.
Graf 50
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPD Lys751Gln v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 51
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPD Lys751Gln v kontrolnej skupine
114
Gén XPG Asp1104His
Hodnotením polymorfizmu v géne XPG Asp1104His (grafy 52-54) sme v skupine
EXP1 nezistili výrazný rozdiel v počte celkových CHA, v EXP2 sme zistili štatisticky
významný pokles s prítomnosťou variantnej alely C (Mann-Whitney U-test, P<0,05) v
KONTR sme zistili tiež ich pokles, ale nebol štatisticky významný. Pri hodnotení
aberácií CHTA typu sme pozorovali ich rozdielny výskyt
Graf 52
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPG Asp1104His v skupine exponovanej anestetikám
Graf 53
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPG Asp1104His v skupine exponovanej cytostatikám
115
v jednotlivých skupinách - EXP1 mierny vzostup, v EXP2 ich štatisticky významný
pokles (Mann-Whitney U-test, P<0,05) a v KONTR bez výrazného rozdielu. Pri
aberáciách CHSA typu sme v EXP1 nezistili rozdiel v ich počte, v skupine EXP2 a
kontrole sme zistili ich nižší počet u heterozygotov a variantných homozygotov.
Graf 54
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPG Asp1104His v kontrolnej skupine
Gén XPC Lys939Gln
Hodnotením polymorfizmu génu XPC Lys939Gln (grafy 55-57) sme ani
v exponovaných skupinách ani v kontrole nezistili rozdiely. Počet aberácií CHTA typu
bol nižší vo všetkých troch skupinách s prítomnosťou variantnej alely C, naopak
mierne vyšší počet CHSA vo všetkých troch hodnotených skupinách.
Graf 55
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPC Lys939Gln v skupine exponovanej anestetikám
116
Graf 56
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPC Lys939Gln v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 57
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XPC Lys939Gln v kontrolnej skupine
Gény opravy dvojvláknových zlomov (DSBR)
Gén XRCC3 Thr241Met
Pri hodnotení polymorfizmu génu XRCC3 Thr241Met (grafy 58-60) sme zistili
mierny pokles celkových CHA v skupine exponovanej anestetikám (EXP1), v skupine
EXP2 a kontrole sme nezistili v ich počte žiaden rozdiel. Pri CHTA type
117
aberácií sme v skupine EXP1 a KONTR zistili mierny pokles a v skupine EXP2 mierny
vzostup
s prítomnosťou
variantnej
alely.
Počet
aberácií
CHSA
typu
bol
s prítomnosťou variantnej alely T v obidvoch exponovaných skupinách nižší, naopak
v kontrolnej skupine sa pozoroval ich mierny vzostup.
Graf 58
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC3 Thr241Met v skupine exponovanej anestetikám
Graf 59
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC3 Thr241Met v skupine exponovanej cytostatikám
118
Graf 60
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
XRCC3 Thr241Met v kontrolnej skupine
Gén NBS1 Glu185Gln
Hodnotením polymorfizmu v géne NBS1 Glu185Gln (grafy 61-63) sme v obidvoch
exponovaných skupinách zistili nepatrný pokles celkového počtu CHA, a aberácií
CHSA typu, naopak v kontrolnej skupine sme pozorovali ich mierny vzostup
s prítomnosťou variantnej alely. Pri aberáciách CHTA typu sme pozorovali rozdielny
výskyt ich počtu – v EXP1 sme rozdiel nepozorovali, v skupine EXP2 sme zistili ich
nepatrný vzostup a v kontrolnej skupine naopak ich mierny pokles v prítomnosti
variantnej alely.
Graf 61
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
NBS1 Glu185Gln v skupine exponovanej anestetikám
119
Graf 62
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
NBS1 Glu185Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 63
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
NBS1 Glu185Gln v skupine exponovanej anestetikám
Kontrolný gén bunkového cyklu
Gén CCND1 Pro241Pro
Pri hodnotení polymorfizmu v géne CCND1 Pro241Pro (grafy 64-66) sme vo
všetkých hodnotených skupinách zistili vyšší počet celkových CHA v prítomnosti
variantnej alely G. Podobne bol počet aberácií CHTA typu vyšší s prítomnosťou
variantnej alely, i keď rozdiel v kontrolnej skupine bol zanedbateľný. Pri aberáciách
CHSA typu sme pozorovali mierny vzostup v skupine EXP1 a kontrole, naopak
v skupine EXP2 bol ich rozdiel zanedbateľný.
120
Graf 64
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CCND1 Pro241Pro v skupine exponovanej anestetikám
Graf 65
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CCND1 Pro241Pro v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 66
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov génu
CCND1 Pro241Pro v kontrolnej skupine
121
6 DISKUSIA
Každý živý organizmus je exponovaný nepriaznivým vplyvom vonkajšieho
prostredia. Množstvo jedincov je v pracovnom prostredí exponovaných škodlivým
látkam, ktoré sa u nich pri dostatočnej koncentrácii, veľkosti dávky a dĺžke expozície
stávajú potenciálne nebezpečnými pre vznik a rozvoj nádorového procesu. Pracovné
prostredie, v ktorom sú jedinci exponovaní mutagénom alebo karcinogénom, je
obyčajne veľmi dobre monitorované a pravidelne sa vyhodnocuje výška expozície. Na
základe toho sa vytvárajú určité profesijné rizikové skupiny, u ktorých je potrebné
vykonávať častejšie zdravotné kontroly, vrátane genotoxikologického vyšetrenia.
Genotoxické látky sa môžu v biologických systémoch metabolicky aktivovať a vo
forme aktívnych metabolitov výraznejšie poškodzovať molekulu DNA. Prejavuje sa to
rôznymi léziami, chromozómovými aberáciami, génovými mutáciami, tzn. zvýšenou
instabilitou chromozómov a vlastne celého genómu ako takého (Preston a Hoffmann,
2001). Zvýšená frekvencia CHA predstavuje včasný biologický účinok, ktorý môže
úzko súvisieť s celkovou instabilitou genómu a možnosťou vážnych zdravotných
ťažkostí, často spojenou so zvrhnutím bunky na nádorovú. Hypotéza o pozitívnej
asociácii medzi frekvenciou CHA v periférnych lymfocytoch a rizikom nádorov je
podporovaná celým radom dôkazov. Okrem teoretických úvah (Cheng a Loeb, 1993;
Mitelman, 2000), je množstvo klinických pozorovaní u pacientov s hereditárnymi
syndrómami lámavosti chromozómov (Mathur a kol., 2000). Syndróm nestability
chromozómu a poškodenie reparácie DNA má úzky súvis so zvýšeným rizikom vzniku
nádorov. Mnohé leukémie, rôzne druhy lymfómov a iné solídne tumory súvisia s
výskytom špecifických chromozómových zmien, ako sú delécie, translokácie a
inverzie (Mehes, 2005; Shanafelt a kol., 2006). Poruchy DNA replikácie na
poškodenej matrici môžu indukovať chromatidový typ aberácií, pričom dochádza k
vzniku delécií, ale i k sesterským chromatidovým výmenám. Chromatidový typ
aberácie sa vytvára v S fáze bunkového cyklu z DNA lézií pôvodne indukovaných
v G0 fáze rôznymi klastogénmi prítomnými napr. v tabakovom dyme (Natarajan, 2002;
Norppa, 2004a). Nerádiomimetické látky tvoria väčšinou aberácie CHTA typu,
rádiomimetické látky indukujú v S a G2 fáze bunkového cyklu aberácie CHTA typu a v
G1 fáze aberácie CHSA typu (Preston a Hoffmann, 2001; Bonassi a kol., 2000; Obe
a kol., 2002; Natarajan, 2002; Natarajan a Boei, 2003; Mateuca a kol., 2006).
Dvojreťazcové zlomy sú typmi chromozómových poškodení, ktoré sa
vyskytujú
122
v S fáze bunkového cyklu a majú najužší súvis s modifikáciou bunky na bunku
nádorovú (Hagmar a kol., 2004a).
Gény, ktoré sa zúčastňujú v procese opravy DNA zohrávajú kritickú úlohu
v procese genotoxicity/karcinogenicity, tzn. pri udržovaní genómovej integrity a pri
ochrane organizmu pred vznikom nádorového procesu, alebo dedičných ochorení
(Berwick a Vineis, 2000). Súčasné poznatky potvrdzujú, že expozícia toxickým látkam
môže výrazne modulovať DNA opravu. Spojenie zvýšenej frekvencie CHA s
profesionálnou expozíciou genotoxickým látkam môže slúžiť ako podklad na zvýšenie
ochrannej činnosti exponovaných osôb (Bonassi a kol., 2000).
6. 1 PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA ANESTETIKÁM
Pracovníci anestéziologických a resuscitačných oddelení tvoria na operačných
sálach neoddeliteľnú súčasť operačných tímov a pri svojej činnosti sú vo významnej
miere exponovaní anestetickým plynom. Tieto plyny svojou chemickou štruktúrou
patria do skupiny halogénových alifatických zlúčenín (Harbison, 1998; Garte, 1992;
IARC, 1995). Do tejto skupiny patrí aj halotan, u ktorého sa najmä po opakovaných
expozíciách
prejavuje
imunotoxická
aktivita
jeho
metabolitov,
tzn.
kyseliny
trifluóroctovej, trifluóracetaldehydu a trifluóretanolu. Neustále sa diskutuje otázka jeho
mutagénneho, karcinogénneho a imunotoxického účinku. Z organizmu sa halotan
eliminuje väčšinou pľúcami, ale v ľudskom organizme nezanedbateľným ostáva
i proces jeho metabolizmu. Jeden z metabolitov halotanu 2-bróm,2-chlór,1,1difluóretylén je štruktúrou podobný karcinogénnym haloalkénom - vinylchloridu,
vinylidénchloridu a trichlóretylénu a pravdepodobne zodpovedá za svoj mutagénny
účinok. Mnohé literárne údaje poukazujú na zvýšenú frekvenciu aberantných buniek u
pracovníkov operačných sál (Karelova a kol., 1992; Natarajan, 2002; Karpinski a kol.,
2005). Halotan sa v poslednom období nahradzuje novšími anestetickými plynmi s
menej toxickými účinkami ako je sevofluran, izofluran, desfluran a enfluran. Všetky
však svojou štruktúrou patria k halogénovým alifatickým uhľovodíkom a mnohé práce
potvrdzujú, že ich toxicita je v mnohom porovnateľná s toxicitou halotanu (Karpinski
a kol., 2005).
V našej
práci
sme
zistili
štatisticky
významne
vyšší
výskyt
celkových
chromozómových aberácií (CHA) v skupine pracovníkov exponovaných anestetikám
v porovnaní s kontrolou (2,53±1,46% vs. 1,26±0,93; Mann-Whitney U-test P=0,0008).
123
Na
základe
získaných
výsledkov
a monitorovania
pracovného
prostredia
usudzujeme, že vysoký výskyt aberantných buniek (AB.B.) mohol byť zapríčinený
nevhodnými pracovnými podmienkami, v ktorých títo pracovníci pracovali (neúčinná
alebo nedostatočne účinná vzduchotechnika, operačné sály bez inštalovanej
klimatizácie). Mnohé epidemiologické štúdie poukazujú na to, že koncentrácia
halotanu bez účinnej vzduchotechniky výrazne prekračuje hodnoty najvyššieho
prípustného expozičného limitu (NPEL). Rozsiahly výskum pracovných podmienok a
zdravotného stavu pracovníkov operačných sál ukázal, že iba na klimatizovaných
sálach s 10-12 násobnou výmenou vzduchu sa koncentrácie halotanu znížia na 50-80
mg.m-3 (Prokes, 1998; Sardas a kol., 1998a; Wiesner a kol., 2000; Wiesner a kol.,
2001).
Pri
hodnotení
aberácií
podľa
typu
tzn.
chromatidového
(CHTA)
a chromozómového (CHSA) sme v exponovanej skupine zistili viac ako trojnásobne
vyššie a štatisticky vysoko významne zastúpenie aberácií chromozómového typu
v porovnaní s chromatidovým typom (CHSA:1,92±1,38% vs. CHTA:0,61±0,83%;
Man-Whitney U-test, P=0,0009). Bunky každého živého organizmu sa dokážu účinne
brániť voči poškodeniam toxickými látkami. Svojimi reparačnými mechanizmami
dokážu účinne eliminovať genotoxický účinok týchto látok a reparovať vzniknuté
poškodenia na molekule DNA. Poruchy DNA replikácie na poškodenej matrici môžu
indukovať chromatidový typ aberácií, pričom dochádza k vzniku delécií, ale i
sesterským chromatidovým výmenám. Nerádiomimetické látky tvoria väčšinou
aberácie CHTA typu, rádiomimetické látky indukujú v S a G2 fáze bunkového cyklu
CHTA typ aberácií a v G1 fáze CHSA typ aberácií. (Preston a Hoffmann, 2001;
Bonassi a kol., 2000; Obe a kol., 2002; Natarajan, 2002; Natarajan a Boei, 2003;
Mateuca a kol., 2006). Nenašli sme jednoznačné vysvetlenie, prečo sa v skupine
exponovanej anestetikám vyskytol trojnásobne vyšší výskyt aberácií CHSA typu
v porovnaní s aberáciami CHTA typu.
U žien sme zistili vyšší výskyt celkových CHA (Ž:2,61±1,45% vs. M:2,20±1,55%)
a aberácií CHSA typu (Ž:2,03±1,39% vs. M: 1,47±1,49%) v porovnaní s mužmi. Vyšší
výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu u exponovaných si môžeme čiastočne
vysvetliť ich dlhšou dobou expozície (Ž: 13,15±9,21 rokov vs. M: 9,83±8,70 rokov).
V prácach, ktoré hodnotia výskyt CHA sa nezistil ich zvýšený výskyt v závislosti na
pohlaví (Hagmar a kol., 2004b; Rössner a kol., 2005; Rössner, 2006; Musák a kol.,
2006). Počet celkových CHA sa medzi podskupinou fajčiarov a nefajčiarov nelíšil
(F:2,56±1,45% vs. NF:2,51±1,45%), počet aberácií CHTA typu bol vyšší u
124
nefajčiarov, naopak aberácií CHSA typu u fajčiarov. V prácach, ktoré sa zaoberajú
výskytom chromozómových aberácií vo vzťahu k fajčeniu sa väčšinou nezisťuje
korelácia medzi fajčením a hladinou celkových CHA (Hagmar a kol., 1994; Rössner a
kol., 1995; Klimentová a kol., 1995; Tates a kol., 1996; Mušák a kol., 1996; Rössner
a kol., 2000; Norppa, 2000; Halašová a kol., 2001, Albertini a kol., 2003; Vodička
a kol., 2004b; Bonassi a kol., 2004, Hagmar a kol., 2004a; Hagmar a kol., 2004b;
Vodička a kol., 2004a; Rössner a kol., 2005; Rössner, 2006; Musák a kol., 2006).
Vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHTA a CHSA typu sme zistili u
anestéziologických sestier v porovnaní s lekármi (SZP: CHA 2,86±1,45%, CHTA
0,80±0,84%, CHSA 2,06±1,39% vs. L: CHA 2,24±1,55%, CHTA 0,44±0,77%, CHSA
1,80±1,49%). Prokes (1998) vo svojej práci vyhlásil, že najexponovanejšou skupinou
sú anestéziologické sestry, ktoré sú najdlhšie prítomné pri anestetickom zariadení.
Zvýšenie počtu lymfocytov s migráciou DNA pozorovali autori u anestéziologických
sestier a technikov, pričom pozorovali aj aditívny vplyv fajčenia (Sardas a kol.,
1998a). Wiesner a kol., (2001) hodnotili v skupine 25 anestéziologických sestier a
lekárov frekvenciu mikrojadier v stimulovaných periférnych lymfocytoch. Pri vysokej
expozícii zistili zvýšený výskyt mikrojadier (priemer 14,0) v porovnaní s nízkou
expozíciou (priemer 9,8). Vysoká expozícia inhalačným anestetikám zvyšuje
chromozómové poškodenia, pričom ich hladina závisí na výške expozície. Jedným
z možných vysvetlení vyššieho výskytu celkových CHA a ich jednotlivých typov
u anestéziologických sestier môže byť ich dlhšia doba expozície v porovnaní
s lekármi (SZP:15,75±9,21 vs. VŠ: 8,34±8,70 rokov).
Mnohé epidemiologické štúdie poukazujú na to, že u jedincov so špecifickými
zmenami génov sa vyskytuje zvýšené riziko určitej formy rakoviny. Vyšší
metabolizmus alebo znížená schopnosť detoxifikácie karcinogénov zo životného
prostredia prináša vyšší výskyt DNA aduktov v bunkách. Jedinci s určitou genetickou
zmenou sú viac vnímaví na poškodenia spôsobené mutagénmi (napr. cigaretovému
dymu), čím sa môže incidencia zhubných ochorení u nich zvyšovať. Experimentálne
údaje s geneticky modifikovanými zvieratami poukazujú na to, že DNA reparačné
gény zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri ochrane organizmu proti chorobám (Kelada a
kol., 2003; Nakajima a Aoyama, 2000).
Záujem o polymorfizmus, ktorý súvisí so zmenami v ľudskom genóme, stále
narastá. Často sa hovorí o tzv. génovo-environmentálnej interakcii, ktorá u niektorých
jedincov vedie k vzniku choroby. Na určenie frekvencie CHA v kultúrach ľudských
125
lymfocytov sa stanovili niektoré polymorfizmy génov, ktoré aktivujú XME. CYP2E1 a
CYP1A1 sú základnými CYP izoenzýmami, ktoré sa zúčastňujú v
procese
metabolizmu xenobiotík a polymorfizmus génov kódujúcich tieto enzýmy môže vo
významnej miere ovplyvňovať individuálnu vnímavosť na tieto toxické látky
(Sarmanova a kol., 2000, 2003).
Pri hodnotení polymorfizmu v géne CYP1B1 Asn453Ser sme zistili pokles počtu
celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely. Pri
géne CYP1B1 Leu432SVal sme rozdiel v celkovom počte CHA nezistili, pri CHTA
type aberácií bol mierny vzostup a pri CHSA type ich pokles s prítomnosťou
variantnej alely. Pri géne EPHX1, sme zistili vyšší výskyt celkových CHA a aberácií
CHSA typu u jedincov s vysokou aktivitou EPH, ale naopak pokles počtu aberácií
CHTA typu so stúpajúcou aktivitou EPH. EPHX1 zohráva kľúčovú úlohu pri
detoxifikácii a premene reaktívnych epoxidov na relatívne netoxické glykoly. Vodička
a kol. (2001) uvádzajú, že jedinci s genotypom pre nízku aktivitu EPHX vykazovali
vyššiu frekvenciu chromozómových aberácií, ako jedinci so strednou a vysokou
aktivitou. Signifikantne vyššiu frekvenciu chromozómových aberácií u jedincov s
nízkou aktivitou EPHX1 genotypu popisujú aj Abdel-Rahman a kol., (2001). Dôležitým
procesom v detoxifikácii reaktívnych metabolitov mnohých genotoxických látok je ich
konjugácia s glutatiónom katalyzovaná glutatión S-transferázou. Pri géne GSTM1
sme zistili vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu pri nulovom genotype,
pri géne GSTP1 Ile105Val sme nezistili výrazné rozdiely v celkovom počte CHA a ich
jednotlivých typoch s prítomnosťou variantnej alely a pri géne GSTT1 sme zistili
nevýznamne vyšší výskyt celkových CHA, ale štatisticky vyšší výskyt aberácií CHSA
typu pri nulovom variante. Pri hodnotení polymorfizmu génu GSTM3 sme zistili pokles
počtu celkových CHA a aberácií CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely.
Neprítomný gén glutatión S-transferázy M1 (GSTM1) u fajčiarov poukazuje na vyššiu
frekvenciu CHA, pričom vplyv genotypu GSTM1 sa vzťahuje na chromatidový typ
aberácií (Norppa, 2000; Norppa, 2004a). Norppa a kol. (2006) zistili u jedincov
s neprítomným GSTM1 a GSTT1 génom vyššiu hladinu CHA v porovnaní
s prítomným GSTM1 génom a neprítomným GSTT1 génom. U šoférov autobusov,
nefajčiarov, s neprítomným GSTM1 génom, a nízkou hladinou N-acetyltransferázy 2
(NAT2) v genotype, zistil v bunkách zvýšenú frekvencia CHA. Scarpato a kol. (1997)
zistili u fajčiarov s neprítomným GSTM1 génom (GSTM1 nulový variant) vyššiu
126
frekvenciu CHA. Pri géne NQO1 sme zistili zvýšenie počtu celkových CHA a aberácií
CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely.
Pri hodnotení polymorfizmu génov bázovej excíznej opravy (BER) sme v géne
XRCC1 Arg194Trp zistili vzostup celkového počtu CHA a aberácií CHSA typu u
heterozygotov CT, naopak pokles počtu aberácií CHTA typu s prítomnosťou
variantnej alely. V géne XRCC1 Arg399Gln sme podobne zistili nárast celkových CHA
a aberácií CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely a pri aberáciách CHTA typu ich
pokles. Pri polymorfizme v géne hOGG1 Ser326Cys sme zistili pokles celkových
CHA, aberácií CHTA a CHSA typu v prítomnosti variantnej alely G. Podobne pri
hodnotení polymorfizmu v géne APE1 Asp148Glu sme zistili nižší počet celkových
CHA, aberácií CHTA a CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely. Polymorfizmus
reparačného génu XRCC1 exón 10 sa spája so zvýšeným rizikom nádorov krku,
hlavy a hrubého čreva (Divine a kol., 2001). Chýbanie génu XRCC1, alebo jeho
poškodenie výrazne zvyšuje počet chromozómových výmen, čo svedčí o tom, že gén
XRCC1 významne prispieva k zabezpečeniu stability chromozómov pred vplyvom
genotoxických
látok.
Skjelbred
a kol.
(2006)
sledovali
účinok
genetického
polymorfizmu génov XRCC1 a XRCC3 na frekvenciu CHA u fajčiarov a nefajčiarov
v rôznych vekových skupinách. U jedincov s alelou A pre gén XRCC1 399Gln zistili
zvýšenie počtu CHA a u jedincov s alelou T pre gén XRCC1 194Trp zníženie.
Nefajčiari s alelou A pre gén XRCC1 280His mali rovnako zvýšený výskyt
chromozómových poškodení. Ochranný účinok alely T v géne XRCC3 241Met bol
nájdený len u nefajčiarov a jedincov vyššej vekovej skupiny.
Pri hodnotení polymorfizmu génov nukleotidovej excíznej opravy (NER) sme
v géne XPD Lys751Gln zistili mierny vzostup celkových CHA a aberácií CHSA typu
s prítomnosťou variantnej alely. Pri géne XPG Asp1104His sme nezistili výrazné
rozdiely v počte celkových CHA ani aberácií CHSA typu, pri CHTA type sme
pozorovali mierny vzostup s variantnou alelou. Podobne pri géne XPC Lys939Gln
sme nezistili rozdiel v celkovom počte CHA a aberácií CHSA typu.
Pri hodnotení polymorfizmov génov opravy dvojvláknových zlomov (DSBR) sme
pri géne XRCC3 Thr241Met zistili mierny pokles celkových CHA, aberácií CHTA
a CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely T. V géne NBS1 Glu185Gln sme zistili
mierny pokles celkového počtu CHA a aberácií CHSA typu s variantnou alelou.
Pri hodnotení polymorfizmu kontrolného génu bunkového cyklu sme v géne
CCND1 Pro241Pro zistili vyšší počet celkových CHA, aberácií CHTA s CHSA typu
127
v prítomnosti variantnej alely G. Vodička a kol. (2004a) analyzovali vzťah medzi
polymorfizmami reparačných génov XRCC1, XRCC3, XPD, XPG a XPC a hladinami
chromozómových aberácií a jednovláknových zlomov (SSB) v stredoeurópskej
populácii. Zistili zvýšenú frekvenciu CHA u jedincov s alelou A v homozygotnom alebo
heterozygotnom stave (AA a AC) v géne XPD.
6. 2 PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA CYTOSTATIKÁM
V skupine exponovanej antineoplastickým látkam sme zistili štatisticky významne
vyšší výskyt celkových CHA v porovnaní s kontrolou (1,90±1,34% vs. 1,26±0,93%;
Mann-Whitney U-test, P=0,001). Nezistili sme však rozdiel v zastúpení jednotlivých
typov aberácií (CHTA typ: 0,92±1,04% vs. CHSA typ: 0,98±1,17%).
Cytostatiká patria medzi mutagénne a karcinogénne látky (Vorlíček a kol., 2000).
Svojimi účinkami spôsobujú rôzne poškodenia DNA. Zvýšenú frekvenciu CHA, SCE
a MN po profesionálnej expozícii cytostatickým liekom popisujú Xu a kol. (2003). Xu
a kol., (2003) zistili, že frekvencia chromozómových aberácií bola štatisticky
významne vyššia u exponovaných pracovníkov v porovnaní s kontrolou. Maluf
a Erdtmann (2000) zistili u jedincov profesionálne exponovaných cytostatikám
(zdravotné sestry a lekárnici), významne vyšší výskyt mikrojadier ako v kontrolnej
skupine. Rubes a kol. (1998) zistili významne vyšší počet translokácií a nestabilných
CHA. Burgaz a kol. (2002) sledovali účinok 9 druhov cytostatík a Cavallo a kol. (2005)
5 druhov cytostatík u zdravotných sestier a farmaceutických pracovníkov, ktorí
pripravovali lieky na aplikáciu, riedili ich a aplikovali. Vyšetrovali i pracovníkov, ktorí
prichádzali do kontaktu s kontaminovaným materiálom (posteľná bielizeň) prípadne
výlučkami liečených pacientov. Burgaz a kol. (2002) zistili 2,5-krát vyšší výskyt CHA
u exponovaných pracovníkov. Obidvaja pozorovali zvýšenú frekvenciu CHA a
zvýšený počet mikrojadier v bunkách bukálnej sliznice u exponovaných pracovníkov.
Pozitívny kométový test, vyššiu frekvenciu MN v bukálnej sliznici a periférnej krvi
a hladinu CP v moči zistili Rakhadevi a kol. (2007) a Cavallo a kol. (2007). V skupine
exponovanej cytostatikám sme zistili vyšší, ale štatisticky nevýznamný výskyt
celkových CHA a aberácií CHTA a CHSA typu u mužov v porovnaní so ženami.
Nezistili sme rozdiel v počte celkových CHA medzi fajčiarmi a nefajčiarmi, ale vyšší
výskyt aberácií CHTA typu sme zistili u nefajčiarov a CHSA typu u fajčiarov. Väčšina
autorov nezistila zvýšený výskyt AB.B. u fajčiarov v porovnaní s nefajčiarmi (Norppa,
128
2000; Vodička a kol., 2004a; Vodička a kol., 2004b; Mušák, 2005; Rössner a kol.,
2005). Bonassi a kol. (2003) pozorovali určitý vplyv fajčenia na frekvenciu mikrojadier.
Vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu sme zistili u zdravotných sestier
v porovnaní s lekármi, aberácie CHTA typu boli vyššie u lekárov. Mnohí zahraniční
autori na základe svojich štúdií došli k názoru, že zvýšené riziko pri práci
s cytostatikami úzko súvisí s nedôsledným dodržiavaním bezpečnostných predpisov
súvisiacich s touto prácou. Prejavy zvýšenej expozície cytostatikám sa objavujú len
tam, kde personál nie je dostatočne informovaný o rizikovosti tejto práce a kde nie sú
prísne dodržiavané bezpečnostné predpisy.
Pri hodnotení polymorfizmu v géne CYP1B1 Asn453Ser sme zistili pokles počtu
celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely. Pri
géne CYP1B1 Leu432SVal sme rozdiel v celkovom počte CHA nezistili, pri CHTA
type aberácií sme zistili mierny vzostup a pri CHSA type pokles s prítomnosťou
variantnej alely. Pri géne EPHX1 sme zistili pokles celkových CHA a aberácií CHTA
a CHSA typu so stúpajúcou aktivitou EPH. Polymorfizmus v génoch kódujúcich
CYP2E1 a CYP1A1, ktoré sú spojené s metabolizmom BD na epoxidy a PAU, môže
ovplyvňovať susceptibilitu voči týmto toxickým látkam. Na druhej strane enzýmy II.
fázy (EPHX a GST) majú veľký význam pri skrátení polčasu výskytu reaktívnych
metabolitov (Vodička a kol. 2001). Vyššiu frekvenciu CHA u jedincov s nízkou
aktivitou EPHX1 genotypu a v prítomnosti alel divého typu AA a heterozygotov AC pri
géne XPD exón 23 popisujú Abdel-Rahman a kol. (2001) a Naccarati a kol. (2006). V
kombinácií genotypov sa so zvyšujúcim počtom génov znižuje štatistická sila
neúmerným nárastom možných kombinácií. Doposiaľ boli testované predovšetkým
binárne kombinácie. Pri géne GSTM1 sme zistili vyšší výskyt celkových CHA,
aberácií CHTA a CHSA typu pri nulovom variante, pri géne GSTP1 Ile105Val sme
nezistili výrazné rozdiely v celkovom počte CHA a CHTA typu, pri CHSA type sme
zistili ich mierny vzostup s prítomnosťou variantnej alely. Pri géne GSTT1 sme zistili
vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHTA a CHSA typu pri nulovom variante. Pri
géne GSTM3
sme zistili mierny nárast celkových CHA a aberácií
CHTA
typu
s prítomnosťou variantnej alely. Počet aberácií CHSA typu sa s prítomnosťou
variantnej alely znižoval. V géne NQO1 sme zistili zvýšenie počtu celkových CHA
a aberácií CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely. Testa a kol. (2007) v hodnotení
polymorfizmu génov pre GST nezistili významný vzťah v súvislosti s vyšším výskytom
CHA. Väčšina chemických látok neindukuje CHA a SSB priamo, ale prostredníctvom
129
činnosti bunky. S najväčšou pravdepodobnosťou je tvorba dvojvláknových zlomov
spojená s poškodením DNA reparačného systému. Niektoré polymorfizmy génov pre
XME poukazujú na vplyv spontánnej úrovne počtu CHA v lymfocytoch periférnej krvi.
U fajčiarov, ktorí majú neprítomný GSTM1 gén (GSTM1 nulový variant), sa zistila
vyššia frekvencia CHA oproti jedincom, u ktorých bol gén prítomný; vplyv GSTM1
genotypu sa vzťahoval na chromatidový typ aberácií (Scarpato a kol., 1997). V
mnohých štúdiách si autori kladú otázku, či určitý genotyp enzýmov metabolizmu
xenobiotík zodpovedá za vznik určitého nádorového ochorenia. Stanovenie vzťahu
medzi expozíciou a prejavom choroby je často veľmi náročné kvôli dlhému indukčnolatentnému obdobiu medzi expozíciou a samotným prejavom choroby. Iným
prístupom je sledovanie vplyvu genetického polymorfizmu na biomarkery genotoxickej
expozície alebo účinku a porovnanie hladín týchto biomarkerov v rámci rozdielnych
skupín genotypov. Vzťah medzi expozíciou a účinkom nie je spojený s dlhou dobou
latencie, čím môžeme získať dostatočne presné údaje o expozícii. Môže sa tým
uľahčiť identifikácia rizikových skupín pracovníkov a zvýšiť senzitivita biomarkerov v
ich biomonitorovaní (Kelada a kol., 2003).
Ľudský genóm sa neustále zúčastňuje na oprave DNA, aby prežili bunky
a organizmus ako celok. Podľa použitých ciest DNA opravy môžu byť pozorované aj
rôzne frekvencie chromozómových aberácií. Môžeme predpokladať aj určitú selekčnú
výhodu heterozygotných jedincov v porovnaní s homozygotnými.
Hodnotením polymorfizmu pre gény BER sme v géne XRCC1 Arg194Trp zistili
mierny pokles celkových CHA a štatisticky významný pokles aberácií CHTA typu
s prítomnosťou variantnej alely. Počet aberácií CHSA typu bol u heterozygotov vyšší.
V géne XRCC1 Arg399Gln sme zistili pokles celkových CHA a aberácií CHTA
a CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely. V géne hOGG1 Ser326Cys sme zistili
pokles celkových CHA a aberácií CHTA typu v prítomnosti variantnej alely G. V géne
APE1 Asp148Glu sme zistili vyšší počet celkových CHA a aberácií CHSA typu.
Musak a kol. (2006) zistili vyšší výskyt CHA u variantného typu alel v génoch XRCC1
exón 10 a XRCC3 exón 7.
Pri hodnotení génov NER sme v géne XPD Lys751Gln zistili mierny vzostup
aberácií CHTA a CHSA typu. Pri géne XPG Asp1104His sme zistili štatisticky
významný pokles celkových CHA s prítomnosťou variantnej alely C, podobne aj
aberácií CHSA typu, avšak pokles nebol štatisticky významný. V géne XPC
130
Lys939Gln sme nezistili výrazné rozdiely. Počet aberácií CHTA typu bol nižší a počet
aberácií CHSA typu mierne vyšší s prítomnosťou variantnej alely C.
Pri polymorfizme génov DSBR sme pri géne XRCC3 Thr241Met zistili mierny
vzostup aberácií CHTA a pokles aberácií CHSA typu s prítomnosťou variantnej alely.
Pri géne NBS1 Glu185Gln sme zistili mierny pokles celkového počtu CHA a mierny
vzostup aberácií CHTA typu s prítomnosťou variantnej alely.
Pri kontrolnom géne bunkového cyklu CCND1 Pro241Pro sme zistili vzostup
počtu celkových CHA a aberácií CHTA typu v prítomnosti variantnej alely G.
Polymorfizmus viacerých génov zahrnutých do procesu NER, BER a reparácie
dvojvláknových zlomov úzko súvisí so zvýšeným rizikom vzniku nádorov a DNA
poškodení (Hemminki a kol., 2001a, Hou a kol., 2002, Kumar a kol., 2003). Harms
a kol. (2004), nezistili významnú súvislosť medzi polymorfizmom reparačných génov
XRCC1 a XRCC3 a rakovinou pľúc. Stern a kol. (2001) hodnotili genotypy XRCC1
génu v kodónoch 194, 280 a 399 v spojitosti s nádormi močového mechúra, pričom
zistili určitý protektívny účinok u jedincov s prítomnosťou alely T v kodóne 194, a alely
G v kodóne 399. Polymorfizmus DNA reparačného génu XRCC3 exón 7 úzko súvisí
so zvýšeným rizikom vzniku kožného melanómu (Winsey a kol., 2000). Genotoxický
účinok gama žiarenia znižuje schopnosť opravy DNA (Sudprasert a kol., 2006).
Znížená schopnosť opravy DNA sa zistila po expozícii UV žiareniu a mitomycínu C v
malígnych bunkách prostaty. Variantné alely AA génu XRCC1 v kodóne 280 a alely
TT toho istého génu v kodóne 194 úzko súvisia so zvýšenou schopnosťou opravy
DNA reťazca, ktorá sa zistila v mestskej populácii (Tuimala a kol., 2002). Gén
XRCC3,
ktorý
je
potrebný
pri
oprave
zlomov
vzniknutých
homologickou
rekombináciou a jeho polymorfizmus pravdepodobne pôsobí na zníženie frekvencie
sesterských chromatidových výmen a CHA (Tuimala a kol., 2004). Títo autori
nepotvrdili súvislosť medzi polymorfizmom génu XRCC3 v kodóne 241(Thr241Met) a
frekvenciou chromozómových aberácií po expozícii bleomycínu. Varianty génu
XRCC1 399Glu a XRCC3 241Met znižovali schopnosť opravy DNA pri gama alebo
UV žiarení formou BER opravy (Au, 2006). Kuricova a kol. (2005) zistili, že jedinci s
genotypom GG v géne XRCC1 Arg399Gln exponovaní styrénu mali znížený počet
CHA v porovnaní s jedincami s prítomnou aspoň jednou alelou A.
Pomerne málo je preskúmaná oblasť génových interakcií DNA reparačných
génov. Je to spôsobené skutočnosťou, že na DNA reparácii sa zúčastňuje viac ako
100 génov, z ktorých takmer 40 je polymorfných (Mohrenweiser a kol., 2002).
131
V súčasnosti nie je dostatočne objasnený vzťah medzi génmi metabolizmu
xenobiotík, reparačnými génmi a ich funkciou, tzn. ich prejavom vo fenotype. Veľká
pozornosť sa venuje otázke kombinácií genotypov, kde môže dochádzať k
medzigénovej interakcii pri genotoxických účinkoch látok u exponovaných jedincov.
Pri posudzovaní vplyvov pracovného prostredia a práce na zdravie človeka treba
mať na zreteli, že zdravie je výsledkom vzájomného pôsobenia faktorov životného
a pracovného prostredia, genetických faktorov a životného štýlu. Pracovné prostredie
je vo všeobecnosti zdrojom vyššej expozície škodlivým faktorom a
z
toho
vyplývajúceho zdravotného rizika pre určitú pracovnú skupinu.
Z literatúry je známe, že rôzne genetické polymorfizmy môžu ovplyvňovať
incidenciu
rôznych
ochorení,
čiastočne
nádorov
a
genotoxických
účinkov
indukovaných profesionálnou expozíciou genotoxickým látkam (Norppa, 2003).
Ideálne by bolo sledovať individuálnu vnímavosť s tým, aby sa stanovili „pozitívne“ a
„negatívne“ genotypy preto, aby sa mohlo minimalizovať riziko expozície u
senzitívnych jedincov. Nie je to však možné kvôli nedostatočným informáciám o
genotypoch a tiež kvôli nedostatočným informáciám o vzájomných interakciách
jednotlivých génov.
Naša práca je príspevkom k sledovaniu výskytu chromozómových aberácií
u zdravotníckych
pracovníkov
profesionálne
exponovaných
anestetikám
a
cytostatikám a tiež k hodnoteniu výskytu celkových chromozómových aberácií a ich
jednotlivých typov v súvislosti s génmi pre niektoré enzýmy metabolizmu xenobiotík
a DNA reparačné gény. Ani v súčasnosti sa úplne nepoznajú všetky vzťahy, ktoré
súvisia s profesionálnou expozíciou anestetikám a antineoplastickým látkam, ich
metabolickým procesom v bunkách a procesom DNA reparácie pri jej poškodení,
z pohľadu individuálnej vnímavosti jedinca. Odhaľovanie týchto vzťahov prispeje
k preventívnej ochrane takto exponovaných jedincov.
132
7 ZÁVERY
Hodnotili sme celkové chromozómové aberácie a
ich jednotlivé typy –
chromatidový (CHTA) a chromozómový (CHSA) v dvoch skupinách zdravotníckych
pracovníkov:
a/ v skupine profesionálne exponovanej plynným anestetikám a b/
v skupine profesionálne exponovanej antineoplastickým látkam vo vzťahu k
polymorfizmom génov kódujúcich enzýmy metabolizmu xenobiotík (XME) CYP1B1,
EPHX1, GSTM1, GSTP1, GSTT1, NQO1; a DNA reparačných génov: pre bázovú
excíznu reparáciu XRCC1, hOGG1, APE1; pre nukleotidovú excíznu reparáciu XPD,
XPG, XPC; pre reparáciu dvojvláknových zlomov XRCC3 a NBS1 a kontrolného génu
bunkového cyklu CCND1.
Prezentované výsledky poukazujú na dôležitosť faktorov individuálnej vnímavosti
pri hodnotení účinkov genotoxických látok v prípade, keď koncentrácia genotoxických
látok spravidla nepresahuje najvyšší prípustný expozičný limit (NPEL). Informácie o
vzťahu genetických polymorfizmov na markery genotoxicity sú relatívne skromné,
pretože niektoré dôležité alely sú relatívne vzácne a metódy stanovenia špecifických
markerov genotoxicity vylučujú vykonanie rozsiahlej populačnej štúdie.
Na základe získaných výsledkov možno vysloviť nasledujúce závery:
7. 1 PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA ANESTETIKÁM
1/
V exponovanej skupine sme zistili štatisticky vyššiu frekvenciu celkových CHA
v porovnaní s kontrolou (EXP1: 2,53±1,46% vs. KONTR: 1,26±0,93%; MannWhitney U-test, P=0,0008).
2/
Pri hodnotení CHA podľa jednotlivých typov sme zistili štatisticky vyšší výskyt
aberácií chromozómového typu v porovnaní s chromatidovým typom (CHSA
typ: 1,92±1,38% vs. CHTA typ: 0,61±0,83%; Man-Whitney U-test, P=0,0009).
3/
Zistili sme vyšší výskyt celkových CHA a
aberácií CHSA typu u žien
v porovnaní s mužmi (CHA Ž: 2,61±1,45% vs. M: 2,20±1,55%; CHSA typ Ž:
2,03±1,39% vs. M: 1,47±1,49%).
4/
Výskyt celkových CHA sa medzi fajčiarmi a nefajčiarmi neodlišoval (F:
2,56±1,45% vs. NF: 2,51±1,45%). Počet aberácií CHTA typu bol vyšší u
nefajčiarov (NF: 0,70±0,83% vs. F: 0,39±0,84%) a aberácií CHSA typu u
fajčiarov (F: 2,17±1,39% vs. NF: 1,81±1,40%).
133
5/
Výskyt celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu bol vyšší u zdravotných
sestier v porovnaní s lekármi (CHA ZS: 2,86±1,45% vs. L: 2,24±1,55%; CHTA
typ ZS: 0,80± 0,84% vs. L: 0,44±0,77%; CHSA typ ZS: 2,06±1,39% vs. L:
1,80±1,49).
6/
Pri hodnotení polymorfizmu v géne CYP1B1 Asn453Ser sme s prítomnosťou
variantnej alely zistili pokles počtu celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA
typu, tzn. počet aberácií bol nižší v skupine heterozygotov a variantných
homozygotov.
7/
Pri géne CYP1B1 Leu432SVal sme nezistili rozdiel v celkovom počte CHA,
počet aberácií CHTA typu sa s prítomnosťou variantnej alely zvyšoval, počet
aberácií CHSA typu znižoval.
8/
Pri géne EPHX1 sme zistili vyšší výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu,
ale nižší výskyt aberácií CHTA typu u jedincov s vysokou aktivitou EPH.
9/
Pri géne GSTM1 sme medzi kladným a nulovým variantom nezistili rozdiel
v počte celkových CHA, počet aberácií CHTA typu bol vyšší pri kladnom
variante a počet aberácií CHSA typu vyšší pri nulovom variante.
10/
Pri géne GSTP1 Ile105Val sme v prítomnosti variantnej alely nezistili rozdiel
v počte celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
11/
Pri géne GSTT1 sme pri nulovom variante zistili vyšší výskyt celkových CHA
a štatisticky vyšší výskyt aberácií CHSA typu (P<0,05), ale nižší výskyt aberácií
CHTA typu.
12/
Pri géne GSTM3 sme s prítomnosťou variantnej alely zistili pokles celkových
CHA a aberácií CHSA typu, ale vzostup počtu aberácií CHTA typu.
13/
Pri géne NQO1 Pro187Ser sme s prítomnosťou variantnej alely zistili vyšší
počet celkových CHA a aberácií CHSA typu, počet aberácií CHTA typu sa s
prítomnosťou variantnej alely nemenil.
14/
Pri DNA reparačnom géne XRCC1 Arg194Trp sme s prítomnosťou variantnej
alely zistili vyšší počet celkových CHA a aberácií CHSA typu, počet aberácií
CHTA typu sa s prítomnosťou variantnej alely výraznejšie nemenil.
15/
Pri géne XRCC1 Arg399Gln sme s prítomnosťou variantnej alely zistili vyšší
počet celkových CHA a aberácií CHSA typu, ale nižší počet aberácií CHTA
typu.
134
16/
Pri géne hOGG1 Ser326Cys sme s prítomnosťou variantnej alely zistili pokles
počtu celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
17/
Pri géne APE1 Asp148Glu sme s prítomnosťou variantnej alely zistili pokles
počtu celkových CHA a aberácií CHSA typu, počet aberácií CHTA typu sa s
prítomnosťou variantnej alely nemenil.
18/
Pri géne XPD Lys751Gln sme s prítomnosťou variantnej alely zistili zvýšenie
počtu celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
19/
Pri géne XPG Asp1104His sme s prítomnosťou variantnej alely nezistili
rozdiely v počte celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
20/
Pri géne XPC Lys939Gln sme s prítomnosťou variantnej alely zistili zvýšenie
počtu celkových CHA a aberácií CHSA typu, počet aberácií CHTA typu sa s
prítomnosťou variantnej alely nemenil.
21/
Pri géne XRCC3 Thr241Met sme s prítomnosťou variantnej alely zistili pokles
počtu celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
22/
Pri géne NBS1 Glu185Gln sme s prítomnosťou variantnej alely nezistili
výrazné rozdiely v počte celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
23/
Pri géne CCND1 Pro241Pro sme s prítomnosťou variantnej alely zistili
zvýšenie počtu celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
7. 2 PROFESIONÁLNA EXPOZÍCIA CYTOSTATIKÁM
1/
V exponovanej skupine sme zistili štatisticky vyšší výskyt celkových CHA
v porovnaní s kontrolou (EXP2: 1,90±1,34% vs. KONTR: 1,26±0,93%; MannWhitney U-test, P=0,001).
2/
Pri hodnotení CHA podľa jednotlivých typov sme v nezistili rozdiel v zastúpení
jednotlivých
typov
aberácií
(CHTA
typ:
0,92±1,04%
vs.
CHSA
typ:
0,98±1,17%).
3/
Výskyt celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu bol vyšší u mužov
v porovnaní so ženami (CHA M: 2,43±1,39% vs. Ž: 1,85±1,34%; CHTA typ M:
1,00±0,99% vs. Ž: 0,91±1,04%; CHSA typ M: 1,43±1,28% vs. Ž: 0,94±1,17%).
4/
Nezistili sme rozdiel vo výskyte celkových CHA medzi fajčiarmi a nefajčiarmi
(F: 1,95±1,38% vs. NF: 1,89±1,34%), počet aberácií CHTA typu bol vyšší u
nefajčiarov (NF: 0,96±1,04% vs. F: 0,79±1,07%) a aberácií CHSA typu u
fajčiarov (F: 1,16±1,17% vs. NF: 0,92±1,17%).
135
5/
Výskyt celkových CHA a aberácií CHSA typu bol vyšší u zdravotných sestier
v porovnaní s lekármi (CHA ZS: 1,93± 1,35% vs. L: 1,79±1,37%; CHSA typ ZS:
1,09±1,17% vs. L: 0,57±1,13%), výskyt aberácií CHTA typu bol vyšší u lekárov
(L: 1,21± 1,08% vs. ZS: 0,84±1,04%).
6/
Pri hodnotení polymorfizmu v géne CYP1B1 Asn453Ser sme s prítomnosťou
variantnej alely zistili pokles počtu celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA
typu.
7/
Pri géne CYP1B1 Leu432SVal sme s prítomnosťou variantnej alely nezistili
rozdiel v celkovom počte CHA, počet aberácií CHTA typu sa zvyšoval a počet
aberácií CHSA typu znižoval.
8/
Pri géne EPHX1 sme s narastajúcou aktivitou EPH zistili pokles počtu
celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
9/
Pri géne GSTM1 sme pri nulovom variante zistili vyšší výskyt celkových CHA a
aberácií CHTA a CHSA typu.
10/
Pri géne GSTP1 Ile105Val sme v prítomnosti variantnej alely nezistili výrazný
rozdiel v počte celkových CHA, aberácií CHTA a CHSA typu.
11/
Pri géne GSTT1 sme pri nulovom variante zistili vyšší výskyt celkových CHA a
aberácií CHTA a CHSA typu.
12/
Pri géne GSTM3 sme s prítomnosťou variantnej alely zistili mierny vzostup
celkových CHA a aberácií CHTA typu, ale pokles počtu aberácií CHSA typu.
13/
Pri géne NQO1 Pro187Ser sme s prítomnosťou variantnej alely zistili vyšší
počet celkových CHA a aberácií CHSA typu, počet aberácií CHTA typu sa s
prítomnosťou variantnej alely nemenil.
14/
Pri DNA reparačnom géne XRCC1 Arg194Trp sme s prítomnosťou variantnej
alely zistili nižší počet celkových CHA a aberácií CHTA typu, a vyšší počet
aberácií CHSA typu.
15/
Pri géne XRCC1 Arg399Gln sme s prítomnosťou variantnej alely zistili pokles
počtu celkových CHA a aberácií CHTA typu, ale zvýšenie počtu aberácií CHSA
typu.
16/
Pri géne hOGG1 Ser326Cys sme s prítomnosťou variantnej alely zistili mierny
pokles počtu celkových CHA a aberácií CHTA, počet aberácií CHSA typu sa s
prítomnosťou variantnej alely nemenil.
136
17/
Pri géne APE1 Asp148Glu sme s prítomnosťou variantnej alely zistili vyšší
počet celkových CHA a aberácií CHSA typu, a mierne nižší počet aberácií
CHTA typu.
18/
Pri géne XPD Lys751Gln sme s prítomnosťou variantnej alely nezistili rozdiel
v počte celkových CHA, počet aberácií CHTA typu bol nižší a CHSA typu
vyšší.
19/
Pri géne XPG Asp1104His sme s prítomnosťou variantnej alely zistili štatisticky
významný pokles počtu celkových CHA (P<0,05) a aberácií CHTA typu
(P<0,05), počet aberácií CHSA typu bol tiež nižší, ale štatistický rozdiel sa
nezistil.
20/
Pri géne XPC Lys939Gln sme s prítomnosťou variantnej alely nezistili rozdiel v
počte celkových CHA, počet aberácií CHTA typu bol nižší a počet aberácií
CHSA typu vyšší.
21/
Pri géne XRCC3 Thr241Met sme s prítomnosťou variantnej alely nezistili
rozdiel v počte celkových CHA, počet aberácií CHTA typu bol vyšší a počet
aberácií CHSA typu nižší.
22/
Pri géne NBS1 Glu185Gln sme s prítomnosťou variantnej alely zistili pokles v
počte celkových CHA a aberácií CHSA typu, ale vzostup pri aberáciách CHTA
typu.
23/
Pri géne CCND1 Pro241Pro sme s prítomnosťou variantnej alely zistili
zvýšenie počtu celkových CHA a aberácií CHTA typu, počet aberácií CHSA
typu sa výraznejšie nelíšil.
Výsledky našej práce poukazujú na to, že zdravotnícki pracovníci profesionálne
exponovaní plynným anestetikám a antineoplastickým látkam majú štatisticky vysoko
významne vyšší počet celkových chromozómových aberácií. Zvlášť závažným je
trojnásobne vyšší výskyt aberácií chromozómového typu (CHSA), ktorý je štatisticky
vysoko významný v porovnaní s chromatidovým typom (CHTA) u anestéziologických
pracovníkov. Vo výskyte celkových CHA a ich jednotlivých typov sa nezistili
nevýrazné rozdiely medzi mužmi a ženami, podobne medzi fajčiarmi a nefajčiarmi,
u anestéziologických a zdravotných sestier
sa pozoroval ich vyšší výskyt
ako
u lekárov.
137
Hodnotenie individuálneho rizika genotoxických a karcinogénnych účinkov by
malo byť založené na štúdiu genetických faktorov, tzn. polymorfizmov v génoch pre
enzýmy metabolizmu xenobiotík (XME) a v génoch pre DNA reparáciu, spolu
s funkčným
prejavom
vo
fenotype.
Pre
hodnotenie
individuálneho
rizika
karcinogénnych účinkov je rozhodujúce pochopenie úlohy kombinácie genetických
polymorfizmov v celom rade týchto génov s cieľom vymedziť tzv. pozitívne a
negatívne kombinácie genetických polymorfizmov, pri zachovaní všetkých etických
noriem vo vzťahu k vyšetrovaným osobám.
Na záver treba zdôrazniť že prevencia je najlepším liekom v ochrane zdravia u
každého jedinca, ktorý je exponovaný genotoxickým látkam. Je potrebné ju
vykonávať tak, aby riziko expozície bolo čo najnižšie. Pre zníženie rizika
profesionálnej expozície anestetikám je potrebné prísne dodržiavať bezpečnostné
opatrenia, operačné sály musia byť vybavené klimatizačným a výkonným odsávacím
zariadením aby sa expozícia znížila na minimum. Pracovníci na špecializovaných
onkologických pracoviskách, musia pripravovať lieky na aplikáciu v laminárnych
boxoch.
Pracovníci sa musia pravidelne zúčastňovať na preventívnych prehliadkach
a navyše by sa u nich mali vykonávať špecializované preventívne prehliadky spojené
aj s cytogenetickou analýzou, ktorá je i v tomto období nezastupiteľnou metódou na
hodnotenie chromozómových poškodení.
138
8 ZOZNAM LITERATÚRY
1.
Abdel-Rahman SZ, Ammenhauser MM, Ward JB Jr: Human sensitivity to 1,3butadiene: role of microsomal epoxide hydrolase polymorphisms.
Carcinogenesis. 2001; 22(3):415-423.
2.
AHEM, Metody biologického monitorování genotoxických účinků faktorů
prostředí Cytogenetická analýza periferních lymfocytů-standardní metodika.
Príloha k AHEM 20/1989, IHE, Praha, 1989; 56s.
3.
AHEM, Metody biologického monitorování genotoxických účinků faktorů
prostředí. Cytogenetická analýza periferních lymfocytů. Aktualizácia platnej
štandardnej metodiky. Príloha k AHEM 5/2000, SZÚ, Praha, 2000; 27s
4.
AHEM, Metody biologického monitorování genotoxických účinků faktorů
prostředí. Cytogenetická analýza periferních lymfocytů. Aktualizácia platnej
štandardnej metodiky. AHEM 1/2007, SZÚ, Praha, 2007; 30s
5.
Akin A, Ugur F, Esmaoglu A, Gunes I, Ergul H: Desflurane anaesthesia
increases sister chromatid exchanges in human lymphocytes. Acta
Anaesthesiol Scand. 2005; 49(10):1559-1561.
6.
Albertini RJ, Anderson D, Douglas GR, Hagmar L, Hemminki K, Merlo F, et al.:
IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in
humans. International Programme on Chemical Safety. Mutat Res. 2000;
463(2):111-172.
7.
Albertini R, Clewell H, Himmelstein MW, Morinello E, Olin S, Preston J,
Scarano L, Smith MT, Swenberg J, Tice R, Travis C: The use of non-tumor
data cancer risk assessment reflections on butadiene, vinyl chloride, and
benzene. Regul Toxicol and Pharmacol. 2003; 37(1):105-132.
8.
Allan JM, Wild CP, Rollinson S, Willett EV, Moorman AV, Dovey GJ, Roddam
PL, Roman E, Cartwright RA, Morgan GJ: Polymorphism in glutathione Stransferase P1 is associated with susceptibility to chemotherapy-induced
leukemia. Proc Nat Acad Sci. 2001; 98(20):11592-11597.
9.
Anderson RM, Marsden SJ, Wright EG, et al.: Complex chromosome
aberrations in peripheral blood lymphocytes as potential biomarker of exposure
to high-LET alpha-particles. Int J Radiat Biol. 2000; 76(1):31-42.
10.
Angelini S, Kumar R, Carbone F, Bermejo JL, Maffei F, Cantelli-Forti G,
Hemminki K, Hrelia P: Inherited susceptibility to bleomycin-induced
micronuclei: correlating polymorphisms in GSTT1, GSTM1 and DNA repair
genes with mutagen sensitivity. Mutat Res. 2008; 638(1-2):90-97.
11.
Au WW: Heritable susceptibility factors for the development of cancer. J Radiat
Res. (Tokyo), 2006; 47 Suppl B:13-17.
139
12.
Audebert M, Chevillard S, Levalois C, Gyapay G, Vieillefond A, Klijanienko J,
et al.: Alterations of the DNA repair gene OGG1 in human clear cell
carcinomas of the kidney. Cancer Res. 2000; 60(17): 4740-4744.
13.
Autrup H: Genetic polymorphisms in human xenobiotica metabolizing enzymes
as susceptibility factors in toxic response. Mutat Res. 2000; 464(1):65-76.
14.
Barash PG, Cullen BF, Stoelting RK: Handbook of Clinical anesthesia, 2nd
edition J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1993;650s.,ISBN:0-397-51297X.
15.
Berwick M, Vineis P: Markers of DNA repair and susceptibility to cancer in
humans : an epidemiologic review. J Natl Cancer Inst. 2000; 92(11):874-897.
16.
Beskow A, Westrin P: Sevoflurane causes more postoperative agitation in
children than does halothane. Acta Anaesthesiol Scand. 1999; 43(5):536-541.
17.
Bhattacharyya N, Banerjee S: A novel role of XRCC1 in the functions of a DNA
polymerase beta variant. Biochemistry. 2001; 40(30): 9005-9013.
18.
Bilban-Jakopin C: Chromosomal changes in somatic cells in seminoma
patients after treatment with ionizing radiation or cytostatics. Neoplasma. 2000;
47(1):48-55.
19.
Bilban M, Jakopin CB, Ogrinc D: Cytogenetic tests performed on operating
room personnel (the use of anaesthetic gases). Int Arch Occup Environ Health.
2005; 78(1):60-64.
20.
Bohuš O. a kol.: Anesteziológia, resuscitológia a intenzívna medicína, Osveta
Martin, 1992; 416s., ISBN: 80-217-0436-5.
21.
Boivin JF: Risk of spontaneous abortion in women occupationally exposed to
anaesthetic gases: a meta-analysis. Occup Environ Med. 1997; 54(8):541-548.
22.
Bonassi S, Hagmar L, Strömberg U, Montagug AH, Tinnerberg H, Forni A.,
Heikkilä P, Wanders S, Wilhardt P, Hansteen IL, Knudsen LE, Norppa H:
Chromosomal aberrations in lymphocytes predict human cancer independently
of exposure to carcinogens. Cancer Res. 2000; 60(6):1619-1625.
23.
Bonassi S, Neri M, Lando C, Ceppi M, et al: Effect of smoking habit on the
frequency of micronuclei in human lymphocytes: results from the Human
MicroNucleus project. Mutat Res. 2003; 543(2):155-166.
24.
Bonassi S, Znaor A, Norppa H, Hagmar L: Chromosomal aberrations and risk
of cancer in humans: an epidemiologic perspective. Cytogen Genome Res.
2004; 104(1-4):376-382.
25.
Bonassi S, Ugolini D, Kirsch-Volders M, Strömberg U, Vermeulen R, Tucker
JD: Human population studies with cytogenetic biomarkers: review of the
140
literature and future prospectives. Environ Mol Mutagen. 2005; 45(2-3):258270.
26.
Bootsma D, Kraemer KH, Cleaver JE, Hoeijmakers JH: Nucleotide excision
repair syndromes: xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and
trichothiodystrophy. Vogelstein B, Kinzler KW. (eds). The Genetic Basis of
Human Cancer. McGraw-Hill, New York, 1998; 245-274.
27.
Bos RP, Sessink PJ: Biomonitoring of occupational exposures to cytostatic
anticancer drugs. Rev Environ Health. 1997;12(1):43-58.
28.
Bozkurt G, Memis D, Karabogaz G, Pamukcu Z, Ture M, Karamanlioglu B,
Gunday I, Algunes C: Genotoxicity of waste anaesthetic gases. Anaesth
Intensive Care. 2002; 30(5):597-602.
29.
Brenneman MA, Weiss AE, Nickoloff JA, Chen DJ: XRCC3 is required for
efficient repair of chromosome breaks by homologous recombination. Mutat
Res. 2000; 459(2): 89-97.
30.
Brenneman MA, Wagener BM, Miller CA, Allen C, Nickoloff JA: XRCC3
controls the fidelity of homologous recombination: roles for XRCC3 in late
stages of recombination. Molec Cell. 2002; 10(2):387-395.
31.
Buchancová J, Klimentová G, Šulcová M, Fabiánová E a kol: Pracovné
lekárstvo a toxikológia, 1. slovenské vydanie, Martin, 2003; 1133s., ISBN 808063-113-1.
32.
Burgaz S, Karahalil B, Canhi Z, Terzioglu F, Ancel G, Anzion RB, Bos RP,
Hüttner E: Assessment of genotoxic damage in nurses occupationally exposed
to antineoplastics by the analysis of chromosomal aberrations. Hum Exp
Toxicol. 2002; 21(3):129-135.
33.
Byhahn C, Wilke HJ, Westpphal K: Occupational exposure to volatile
anaesthetics: epidemiology and approaches to reducing the problem. CNS
Drugs. 2001; 15(3):197-215.
34.
Cajas-Salazar N, Au WW, Zwischenberger JB, Sierra-Torres CH, Salama SA,
Alpard SK, Tyring SK: Effect of epoxide hydrolase polymorphisms on
chromosome aberrations and risk for lung cancer. Cancer Genet Cytogenet.
2003; 145(2):97-102.
35.
Carless MA, Lea RA, Curran JE, Appleyard B, Gaffney P, Green A, Griffiths
LR: The GSTM1 null genotype confers an increased risk for solar keratosis
development in an Australian Caucasian population. J Invest Derm. 2002;
119(6):1373-1378.
36.
Carney JP, Maser RS, Olivares H, Davis EM, Le Beau M, Yates JRIII, Hays L,
Morgan WF, Petrini JHJ: The hMre11/hRad50 protein complex and Nijmegen
breakage syndrome: linkage of double-strand break repair to the cellular DNA
damage response. Cell. 1998; 93(3):477-486.
141
37.
Cavallo D, Ursini LC, Perniconi B, Di Francesco A, Giglio M, Rubino FM.,
Marinaccio A, Iavicoli S: Evaluation of genotoxic effects induced exposure to
antineoplastic drugs in lymphocytes and exfoliated buccal cells of oncology
nurses and pharmacy employees. Mutat Res. 2005; 587(1-2):45-51.
38.
Cavallo D, Ursini CL, Omodeo-Sale E, Iavicoli S: Micronucleus induction and
FISH analysis in buccal cells and lymphocytes of nurses administering
antineoplastic drugs. Mutat Res. 2007; 628(1):11-18.
39.
Connor TH: Hazardous anticancer drugs in health care: environmental
exposure assessment. Ann N Acad Sci. 2006; 1076:615-623.
40.
Cromie GA, Connelly JC, Leach DR: Recombination at double-strand breaks
and DNA ends: conserved mechanisms from phage to humans. Mol Cell.
2001; 8(6):1163-1174.
41.
Curtin JA, Fridlyand J, Kageshita T, Patel HN, Busam KJ, Kutzner H, Cho K-H;
Aiba S, Brocker E-B, LeBoit PE, Pinkel D, Bastian BC: Distinct sets of genetic
alterations in melanoma. New Eng J Med. 2005; 353(20):2135-2147.
42.
Deng H, Hang M, He J, Wu W, Jin L, Zheng W, Lou J, Wang B: Investigating
genetic damage in workers occupationally exposed to methotrexate using
three genetic end-points. Mutagenesis. 2005; 20(5):351-357.
43.
Director AE, Tucker JD, Ramsey MJ, Nath J: Chronic ingestion of clastogens
by mice and the frequency of chromosome aberrations. Environ Mol
Mutagen.1998; 32(2): 139-147.
44.
Divine KK, Gilliland FD, Crowell RE, Stidley CA, Bocklage TJ.,
Belinsky SA: The XRCC1 399 glutamine allele is a risk
adenocarcinoma of the lung. Mutat Res. 2001; 461(4):273-278.
45.
Domracheva EV, Aseeva EA, Udovichenko AI, Obukhova TN, Olshanskaia
IuV, Zakharova AV, Vodinskaia LA: Induced leukemias and their connection
with radiation exposure. Radiats Biol Radioecol. 2002;42(6):715-9.
46.
Emmert S, Kobayashi N, Khan SG, Kraemer KH: The xeroderma pigmentosum
group C gene leads to selective repair of cyclobutane pyrimidine dimers rather
than 6-4 photoproducts. Proc Nat Acad Sci. 2000; 97(5):2151-2156.
47.
Emmert S, Schneider TD, Khan SG, Kraemer KH: The human XPG gene:
gene architecture, alternative splicing and single nucleotide polymorphisms.
Nucleic Acids Res. 2001; 29(7):1443-1452.
48.
Evteev VA, Shcherbak NP, Kobliakov VA: A comparative study of induction
regulation in cytochromes family 1 P450 in cell cultures at different stages of
tumor transformation.Tsitologiia. 2006; 48(9):717-722.
Cook DL,
factor for
142
49.
Fagerholm R, Hofstetter B, Tommiska J, Aaltonen K, Vrtel R, Syrjakoski K et
al.: NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 NQO1*2 genotype (P187S) is a strong
prognostic and predictive factor in breast cancer. Nat Genet. 2008; 40(7):844853.
50.
Fairbrother KM, Grove J, De Waziers I, Steimel DT, Day ChP, Crespi ChL,
Daly AK: Detection and characterization of novel polymorphisms in the
CYP2E1 gene. Pharmacogenetics. 1998; 8(6):543-552.
51.
Firment J, Studená A a kol.: Anesteziológia a intenzívna medicína.
Vysokoškolské učebné texty, UPJŠ Košice, 2001; 328s., ISBN: 80-7097-442-7.
52.
Fransman W, Vermeulen R, Kromhout H: Dermal exposure to
cyclophosphamide in hospitals during preparation, nursing and cleaning
activities. Int Arch Occup Environ Health. 2005; 78(5):403-412.
53.
Fransman W, Huizer D, Tuerk J, Kromhout H: Inhalation and dermal exposure
to eight antineoplastic drugs in an industrial laundry facility. Int Arch Occup
Environ Health. 2007a; 80(5):396-403.
54.
Fransman W, Roeleveld N, Peelen S, de Kort W, Kromhout H, Heederik D:
Nurses with dermal exposure to antineoplastic drugs: reproductive outcomes.
Epidemiology. 2007b; 18(1):112-119.
55.
French D, Wilkinson MR, Yang W, de Chaisemartin L, Cook EH, Das S, Ratain
MJ, Evans WE, Downing JR, Pui C-H, Relling MV: Global gene expression as
a function of germline genetic variation. Hum Mol Genet. 2005; 14(12):16211629.
56.
Friedberg EC: How nucleotide excision repair protects against cancer. Nat Rev
Cancer. 2001; 1(1):22-33.
57.
Fu M, Wang C, Li Z, Sakamaki T, Pestell RG: Minireview Cyclin D1: normal
and abnormal functions. Endocrinology. 2004; 145(12):5439-5447.
58.
Fucic A, Znaor A, Strnad M, van der Hel O, Aleksandrov A, Miskov S, Grah J,
Sedlar M, Jazbec AM, Ceppi M, Vermeulen R, Boffetta P, Norppa H, Bonassi
S: Chromosome damage and cancer risk in the workplace: the example of
cytogenetic surveillance in Croatia. Toxicol Lett. 2007; 172(1-2):4-11.
59.
Garte SJ: Environmental Carcinogenesis, In: Rom WN: Environmental and
Occupational Medicine, sec.ed. Little Brown and Co., Boston, 1992:105-124,
1493s.
60.
Gaudet MM, Chanock S, Lissowska J, Berndt SI, Yang XR, Peplonska B,
Brinton LA, Welch R, Yanger M, Bardin-Mikolajczak A, Sherman ME, Sutter
TR, Garcia-Closas M: Genetic variation of Cytochrome P450 1B1 (CYP1B1)
and risk of breast cancer among Polish women. Pharmacogenet Genomics.
2006; 16(8):547-553.
143
61.
Genecards: CYP1B [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CYP1B1
62.
Gilliland FD, Li Y-F, Saxon A, Diaz-Sanchez D: Effect of glutathione-Stransferase M1 and P1 genotypes on xenobiotic enhancement of allergic
responses: randomised, placebo-controlled crossover study. Lancet. 2004;
363(9403):119-125.
63.
Godschalk RWL, Dallinga JW, Wikman H, Risch A, Kleinjans JCS, Bartsch H,
Van Schooten F-J: Modulation of DNA and protein adducts in smokers by
genetic polymorphisms in GSTM1, GSTT1, NAT1 and NAT2.
Pharmacogenetics. 2001; 11(5):389-398.
64.
Goldberg ME, Cantillo J, Gratz I, Deal E, Vekeman D, McDougall R, Afshar M,
Zafeiridis , Larijani G: Dose of compound A, not sevoflurane, determines
changes in the biochemical markers of renal injury in healthy volunteers.
Anesth Analg. 1999;8(2):437-45.
65.
Gozukara EM, Khan SG, Metin A, Emmert S, Busch DB, Shahlavi T, Coleman
DM, Miller M, Chinsomboon N, Stefanini M, Kraemer KH: A stop codon in
xeroderma pigmentosum group C families in Turkey and Italy: molecular
genetic evidence for a common ancestor. J Invest Dermatol. 2001; 117(2):197204.
66.
Granados Llamas LM, Navas Rivera E, Marenco de la Fuente ML, Balanza
Ortiz R, Suárez Collazos F, Puente Eqido JJ: Mobilization of alpha-glutathione
S-transferase in the anesthetized patient. Rev Esp Anestesiol Reanim. 1999;
46(8):350-353.
67.
Green RM, Hodges NJ, Chipman JK, O´Donovan MR, Graham M: Reactive
oxygen species from the uncoupling of human cytochrome P4501B1 may
contribute to the carcinogenicity of dioxin-like polychlorinated biphenyls.
Mutagenesis. 2008; 23(6):457-463.
68.
Griffin CS, Simpson PJ, Wilson CR, Thacker J: Mammalian recombinationrepair genes XRCC2 and XRCC3 promote correct segregation. Nat Cell Biol.
2000; 2(10): 757-761.
69.
Grlickova-Duzevik E, Wise SS, Munroe RC, Thompson WD, Wise JP Sr:
XRCC1 protects against particulate chromate-induced chromosome damage
and cytotoxicity in Chinese hamster ovary cells. Toxicol Sci. 2006a; 92(2):409415.
70.
Grlickova-Duzevik E, Wise SS, Munroe RC, Thompson WD, Wise JP Sr:
XRCC1 protects cells from chromate-induced chromosome damage, but does
not affect cytotoxicity, Mutat Res. 2006b; 610(1-2):31-37.
71.
Gut J, Christen U, Huwyler J: Mechanisms of halothane toxicity: Novel insights.
Pharm Ther. 1993; 58(2):133-155.
144
72.
Haas S, Pierl C, Harth V, Pesch B, Rabstein S, Bruning T, Ko Y, et al.:
Expression of xenobiotic and steroid hormone metabolizing enzymes in human
breast carcinomas. Int J Cancer. 2006; 119(8):1785-1791.
73.
Haase D, Binder C, Bünger J, Fonatsch C, Streubel B, Schnittger S et al.:
Increased risk for therapy-associated hematologic malignancies in patients
with carcinoma of the breast and combined homozygous gene deletions of
glutathione transferases M1 and T1. Leuk Res. 2002; 26(3):249-254.
74.
Hadi MZ, Coleman MA, Fidelis K, Mohrenweiser HW, Wilson DM: Functional
characterization of APE1 variants identified in the human population. Nucleic
Acids Res. 2000; 28(20):3871-3879.
75.
Hagmar L, Brogger A, Hansteen IL, Heim S, Hogstedt B, Knudsen L, Lambert
B, Linnainmaa K, Mitelman F, Nordenson I, Reuterwall C, Salomaa S,
Skerfving S, Sorsa M: Cancer risk in humans is predicted by increased levels
of chromosomal aberrations in lymphocytes: nordic study group on the health
risk of chromosome damage. Cancer Res. 1994; 54(11):2919-2922.
76.
Hagmar L, Strömberg U, Tinnerberg H, Mikoczy Z: Epidemiological evaluation
of cytogenetic biomarkers as potential surrogate endpoints for cancer. IARC
Sci Publ. 2004a; 157:207-215.
77.
Hagmar L, Strömberg U, Bonassi S, Hansteen IL, Knudsen LE, Lindholm C,
Norppa H: Impact of types of lymphocyte chromosomal aberrations on human
cancer risk: results from Nordic and Italian cohorts. Cancer Res. 2004b;
64(6):2258-2263.
78.
Han J, Hankinson SE, De Vivo I, Spiegelman D, Tamimi RM, Mohrenweiser
HW, Colditz GA, Hunter DJ: A prospective study of XRCC1 haplotypes and
their interaction with plasma carotenoids on breast cancer risk. Cancer Res.
2003; 63(23):8536-8541.
79.
Hanahan D, Weinberg RA: The hallmarks of cancer. Cell. 2000; 100(1):57-70.
80.
Hanawalt PC: Subpathways of nucleotide excision repair and their regulation.
Oncogene. 2002; 21(58):8949-8956.
81.
Hanna IH, Dawling S, Roodi N, Guengerich FP, Parl FF: Cytochrome P450
1B1 (CYP1B1)pharmacogenetics: association of polymorphisms with functional
differences in estrogen hydroxylation activity. Cancer Res. 2000; 60(13):34403443.
82.
Harbison RD: Reproductive Toxicology. In: Harbison
RD:
Industrial
Toxicology (Hamilton and Hardy´s), Mosby Year Book Inc., Toronto 1998:611624, 682s.
83.
Harms C, Salama AS, Sierra-Torres CH, Cajas-Salazar, N, Au WW:
Polymorphisms in DNA repair genes, chromosome aberrations, and lung
cancer. Environ Mol Mutagenesis. 2004; 44(1):74-82.
145
84.
Harth V, Schafer M, Abel J, Maintz L, Neuhaus T, Besuden M, et al.: Head and
neck squamous-cell cancer and its association with polymorphic enzymes of
xenobiotic metabolism and repair. J Toxicol Environ Health A. 2008; 71(1314):887-897.
85.
Hashiguchi K, Stuart JA, de Souza-Pinto NC, Bohr VA: The C-terminal alpha
O helix of human OGG1 is essential for 8-oxoganine DNA glycosylase activity:
the mitochondrial beta-OGG1 lacks this domain and does not have glycosylase
activity. Nucleic Acids Res. 2004; 32(18):5596-5608.
86.
Hashimoto T, Hashimoto K., Matsuzawa D, Shimizu E, Sekine Y, et al.: A
functional glutathione S-transferase P1 gene polymorphism is associated with
methamphetamine-induced psychosis in Japanese population. Am J Med
Genet. (Neuropsychiat Genet.) 2005; 135B(1):5-9.
87.
Hassett C, Aicher L, Sidhu S, Omiecinski CJ: Human microsomal epoxide
hydrolase genetic polymorphism and functional expression in vitro of amino
acid variants. Hum Mol Genet. 1994; 3(3):421-428. Erratum in: Hum Mol
Genet. 1994; 3(7):1214.
88.
Hayes RB, Zhang L, Yin S, Swenberg JA, Xi L, Wiencke JK, Bechtold WE, Yao
M, Rothman N et al.: Genotoxic markers among butadiene-polymer workers
in China. Carcinogenesis. 2000; 21(1):55-62.
89.
Halašová E, Bukovská E, Kukura F, Červeňová T, Oravec P, Kereškéni J: Do
works concerning ferrochromium alloys mean risk for the inhabitants living in
their surrounding? A cytogenetic study. Biológia. 2001; 56(6):679-683.
90.
Harms C, Salama AS, Sierra-Torres CH, Cajas-Salazar N, Au WW:
Polymorphisms in DNA repair genes, chromosome aberrations, and lung
cancer. Environ Mol Mutagenesis. 2004; 44(1):74-82.
91.
Hemminki K, Xu G, Curieux FL: Markers of DNA repair and susceptibility to
cancer in humans: an epidemiologic review. J Nat Cancer Inst. 2000;
92(18):1536-1537.
92.
Hemminki K: Bimarkers of exposure and effect for carcinogenicity. Appendix I.
In: WHO Library Cataloguing-in-Publication Data, Biomarkers in risk
assessment: validity and validation (Environmental health criteria) 222, WHO,
Geneva, 2001a; 241s, 47-94.
93.
Hemminki K, Xu G, Angelini S, Jansen T, Lambert B, Hou SM: XPD exon 10
and 23 polymorphisms and DNA repair in human skin in situ. Carcinogenesis.
2001b; 22(8): 1185-1188.
94.
Hewitt JP: Health effects of occupational exposure to antineoplastic drugs: An
Integrative Research Review, University of Wisconsin-Milwaukee, Occup.
Disease Panel, Ontario, 1997; 23s.
146
95.
Higuchi H, Adachi Y, Wada H, Kanno M, Satoh T: Comparison of plasma alpha
glutathione S-transferase concentrations during and after low-flow sevoflurane
or isoflurane. Acta Anaesthesiol Scand. 2001; 45(10):1226-1229.
96.
Hoerauf KH, Wiesner G, Schroegendorfer KF, Jobst BP, Spacek A, et al.:
Waste anaesthetic gases induce sister chromatid exchanges in lymphocytes of
operating room personnel. British J Anaesth. 1999; 82(5):764-766.
97.
Holá N, Pyšný P: Profesionální riziko extraparentálním cytostatikům u
zdravotníckych pracovníků. Prakt Lék. (Praha) 1990;70(15-16):596-600.
98.
Hou SM, Fält S, Angelini S, Yang K, Nyberg F, Lambert B, Hemminki K: The
XPD variant alleles are associated with increased aromatic DNA adduct level
and lung cancer risk. Carcinogenesis. 2002; 23(4):599-603.
99.
Hu SW, Lin P, Chen CC: Association of cytochrome P450 1B1 gene
expression in peripheral leukocytes with blood lipid levels in waste incinerator
workers. Ann Epidemiol. 2008; 18(10):784-791.
100.
Huamani J, McMahan CA, Herbert DC, Reddick R, McCarrey JR, MacInnes
MI, Chen DJ, Walter CA: Spontaneous mutagenesis is enhanced in Apex
heterozygous mice. Molec Cell Biol. 2004; 24(18):8145-8153.
101.
Hung RJ, Boffetta P, Brennan P, Malaveille C, Hautefeuille A, Donato F, et al.:
GST, NAT, SULT1A1, CYP1B1 genetic polymorphisms, interactions with
environmental exposures and bladder cancer risk in a high-risk population. Int
J Cancer. 2004; 110(4):598-604.
102.
Hungerford DA: Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the
preparation of the metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl.
Stain Technol. 1965; 40(6):333-338.
103.
Chandrasekhar M, Rekhadevi PV, Sailaja N, Rahman MF, Reddy JP,
Mahboob M, Grover P: Evaluation of genetic damage in operating room
personnel exposed to anaesthetic. Mutagenesis. 2006; 21(4):249-254.
104.
Chanvaivit S, Navasumrit P, Hunsonti P, Autrup H, Ruchirawat M: Exposure
assessment of benzene in Thai workers, DNA-repair capacity and influence of
genetic polymorphisms. Mutat Res. 2007; 626(1-2):79-87.
105.
Chen S, Tang D, Xue K, Xu L, Ma G., Hsu Y, Cho SS: DNA repair gene XRCC1
and XPD polymorphisms and risk of lung cancer in a Chinese population.
Carcinogenesis. 2002; 23(8):1321-1325.
106.
Chen J, Larochelle S, Li X, Suter B: Xpd/ERCC2 regulates CAK activity and
mitotic progression. Nature. 2003; 424(6945):228-232.
107.
Cheng KC, Loeb LA: Genomic instability and tumor progression: mechanistic
considerations. Adv Cancer Res. 1993; 60:121-156.
147
108.
Chen ZH, Na HK, Hurh YJ, Surh YJ: 4-Hydroxyestradiol induces oxidative
stress and apoptosis in human mammary epithelial cells: possible protection by
NF-kappaB and ERK/MAPK.Toxicol Appl Pharmacol. 2005; 208(1):46-56.
109.
Christmann M, Tomicic MT, Roos WP, Kaina B: Mechanisms of human DNA
repair: an update.Toxicology. 2003; 193(1-2):3-34.
110.
IARC: Monographs the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human. List of
IARC Evaluations, Lyon. 1995; 36s.
111.
IARC Monographs on the evaluation of carcinogenetic risks to humans. Some
pharmaceutical drugs. Lyon, International Agency for Research on Cancer.
1996; 66, 87s.
112.
Imbriani M, Zadra P, Negri S, Alessio A, Maestri L, Ghittori S: Biological
monitoring of occupational exposure to sevoflurane. Med Lav. 2001; 92(3):173180.
113.
Ingelman-Sundberg M: Functional consequences of polymorphism
xenobiotic metabolizing enzymes. Toxicol Lett. 1998; 102-103:155-160.
114.
Ito S, Kuraoka I, Chymkowitch P, Compe E, Takedachi A, Ishigami C, Coin F et
al.: XPG stabilizes TFIIH, allowing transactivation of nuclear receptors:
implications for Cockayne syndrome in XP-G/CS patients. Mol Cell. 2007;
26(2): 231-243.
115.
Jaloszynski P, Kujawski M, Wasowicz M, Szulc R, Szyfter K: Genotoxicity of
inhalation anesthetics halothane and isoflurane in human lymphocytes studied
in vitro using the comet assay. Mutat Res. 1999; 439(2):199-206.
116.
Jecková-Tholeová S, Hallbaumová I, Pichlmayrová I: Anesteziológia, praktická
príručka, Osveta Martin, 1998, 312 s., ISBN: 80-88824-81-8.
117.
Johansson K, Åhlen K, Rinaldi R, Sahlander K, Siritantikorn A, Morgenstern
R: Microsomal glutathione transferase 1 in anticancer drug resistance.
Carcinogenesis. 2007; 28(2):465-470.
118.
Jones NJ, Cox R, Thacker J: Isolation and cross-sensitivity of X-ray-sensitive
mutants of V79-4 hamster cells. Mutat Res., 1987; 183(3):279-286.
119.
Johnson RD, Jasin M: Sister chromatid gene conversion is a prominent
double-strand break repair pathway in mammalian cells. EMBO J. 2000;
19(13):3398-3407.
120.
Karabiyik L, Sardas S, Polat U, Kocabas NA, Karakaya AE: Comparison of
genotoxicity of sevoflurane and isoflurane in human lymphocytes studied in
vivo using the comet assay. Mutat Res. 2001; 492(1-2):99-107.
121.
Karahalil B, Yagar S, Bahadir G, Durak P, Sardas S: Diazepam and propofol
used as anesthetics during open-heart surgery do not cause chromosomal
of
148
aberrations in peripheral blood lymphocytes. Mutat Res. 2005; 581(1-2):181186.
122.
Karelova J, Jablonicka A, Gavora J, Hano L: Chromosome and sisterchromatid exchange analysis in peripheral lymphocytes, and mutagenicity of
urine in anesthesiology personnel. Int Arch Occup Environ Health. 1992;
4(4):303-306.
123.
Karpinski TM, Kostrzewska-Poczekaj M, Stachecki I, Mikstacki A, Szyfter K:
Genotoxicity of the volatile anaesthetic desflurane in human lymphocytes in
vitro, established by comet assay. J Appl Genet. 2005; 46(3):319-324.
124.
Karpova GV, Fomina TI, Voronova OL, Abramova EV, Loskutova OP: Early
and delayed effects of carboplatin on the blood system. Bull Exp Biol Med.
2001;132(5):1065-1069.
125.
Kasuba V, Rozgaj R, Jazbec A: Chromosome aberrations in peripheral blood
lymphocytes of croatian hospital staff occupationally exposed to low levels of
ionising radiation. Arh Hig Rada Toksikol. 2008;59(4):251-259.
126.
Kaymak C, Karahalil B, Ozcan NN, Oztuna D: Association between GSTP1
gene polymorphism and serum alpha-GST concentrations undergoing
sevoflurane anaesthesia. Eur J Anaeshesiol. 2008; 25(3):193-199.
127.
Kelada SN, Eaton DL, Wang SS, Rothman NR, Khoury MJ: The role of genetic
polymorphisms in environmental health-research review. Environ Health
Perspect. 2003; 111(8):1055-1064.
128.
Keshava C, Keshava N, Whrong WZ, Nath J, Ong TM: Inhibition of
methotrexate-induced chromosomal damage by vanillin and chlorophyllin in
V79 cells. Teratog Carcinog Mutagen. 1997-1998; 17(6):313-326.
129.
Keshava C, Keshava N, Whong WZ, Nath J, Ong TM: Inhibition of
methotrexate-induced chromosomal damage by folinic acid in V79 cells. Mutat
Res. 1998; 397(2):221-228.
130.
Khan SG, Metin A, Gozukara E, Inui H, Shahlavi T, Muniz-Medina V, et al.:
Two essential splice lariat branchpoint sequences in one intron in a xeroderma
pigmentosum DNA repair gene: mutations result in reduced XPC mRNA levels
that correlate with cancer risk. Hum Mol Genet. 2004; 13(3):343-352.
131.
Klimentová G, Fabiánová E, Mušák Ľ, Knižková M, Buchancová J, Meško
D, Kišová V: Hodnotenie expozície pracovníkov gumárenského závodu.
Pracov Lék. 1995; 47(1): 51-57.
132.
Kocabas NA, Sardas S, Cholerton S, Daly AK, Karakaya AE: Cytochrome
P450
CYP1B1
and
catechol
O-methyltransferase
(COMT)genetic
polymorphisms and breast cancer susceptibility in a Turkish population. Arch
Toxicol. 2002; 76(11):643-649.
149
133.
Kocabas NA, Sardas S, Karakaya AE: Polymorphisms related to estrogen and
xenobiotic metabolism in healthy Turkish women. Arch Med Res. 2005;
36(1):9-23.
134.
Kohno T, Shinmura K, Tosaka M, Tani M, Kim S-R, Sugimura H, Nohmi T,
Kasai H, Yokota J: Genetic polymorphisms and alternative splicing of the
hOGG1 gene, that is involved in the repair of 8-hydroxyguanine in damaged
DNA. Oncogene. 1998; 16(25): 3219-3225.
135.
Kovtun IV, Liu Y, Bjoras M, Klungland A, Wilson SH, McMurray CT: OGG1
initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature.
2007; 447(7143):447-452.
136.
Krause T, Scholz J, Jansen L, Boettcher H, Koch C, et al.: Sevoflurane
anaesthesia does not induce the formation of sister chromatid exhcanges in
peripheral blood lymphocytes of children. B J Anaesth. 2003; 90(2):233-235.
137.
Kumar R, Höglund L, Zhao CH, Försti A, Snellman E, Hemminki K: Single
nucleotide polymorphisms in the XPG gene: determination of role in DNA
repair and breast cancer risk. Int J Cancer. 2003; 103(5):671-675.
138.
Kuricová M, Naccarati A, Kumar R, Koskinen M, Sanyal S, Dusinská M,
Tulinská J, Vodičková L, Lišková A, Jahnová E, Fuortes L, Haufroid V,
Hemminki K, Vodička P: DNA repair and cyclin D1 polymorphisms and styrene
induced genotoxicity and immunotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2005;
1(207) 2 Suppl:302-309.
139.
Kuschel B, Auranen A, McBride S, Novik KL, Antoniou A, et al.: Variants in
DNA double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility. Hum
Mol Genet. 2002; 11(12):1399-1407.
140.
Laasanen J, Romppanen E-L, Hiltunen M, Helisalmi S, Mannermaa A,
Punnonen K, Heinonen S: Two exonic single nucleotide polymorphisms in the
microsomal epoxide hydrolase gene are jointly associated with preeclampsia.
Europ J Hum Genet. 2002; 10(9):569-573.
141.
Laczmanska I, Gil J, Karpinski P, Stembalska A, Trusewicz A, Pesz K, Ramsey
D, Schlade-Bartusiak K, Blin N, Sasiadek MM: Polymorphism in nucleotide
excision repair gene XPC correlates with bleomycin-induced chromosomal
aberrations. Environ Mol Mutagen. 2007; 48(8):666-671.
142.
Laisalmi M, Teppo AM, Koivusalo AM, Honkanen E, Valta P, Lindgren L: The
effect of ketorolac and sevoflurane anesthesia on renal glomerular and tubular
function. Anesth Analg. 2001; 93(5):1210-1213.
143.
Lamb J, Ramaswamy S, Ford HL, Contreras B, Martinez RV, Kittrell FS,
Zahnow CA, Patterson N, Golub TR, Ewen ME: A mechanism of cyclin D1
action encoded in the patterns of gene expression in human cancer. Cell.
2003; 114(3):323-334.
150
144.
Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K,
Dewar K, Doyle M, Fitzhugh W: Initial sequencing and anylysis of the human
genome. Nature. 2001; 409(6822):860-921.
145.
Latipova NS, Aliavi AL: Chromosomal aberrations in lymphocytes of patients
with systemic lupus erythematosus during cytostatic therapy. Ter Arkh. 2002;
74(5):35-38.
146.
Lee KA, Kim SH, Woo HY, Hong YJ, Cho HC: Increased frequencies of
glutathione S-transferase (GSTM1 and GSTT1) gene deletions in Korean
patients with acquired aplastic anemia. Blood. 2001; 98(1):3483-3485.
147.
Le Marchand L, Seifried A, Lum-Jones A, Donlon T, Wilkens L: Association of
the cyclin D1 A870G polymorphism with advanced colorectal cancer. JAMA.
2003; 290(21):2843-2848.
148.
Leng S, Dai Y, Niu Y, Pan Z, Li X, Cheng J, Heand F, Zheng Y. Effects of
genetic polymorphisms of metabolic enzymes on cytokinesis-block
micronucleus in peripheral blood lymphocyte among coke-oven workers.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2004; 13(10):1631-1639.
149.
Lindahl T: Suppression of spontaneous mutagenesis in human cells by DNA
base excision-repair. Mutat Res. 2000; 462(2-3):129-135.
150.
Lips J, Kaina B: DNA double-strand breaks trigger apoptosis in p53-deficient
fibroblasts. Carcinogenesis. 2001; 22(4):579-585.
151.
Lohmueller KE, Pearce CL, Pike M, Lander ES, Hirschhorn JN: Meta-analysis
of genetic association studies supports a contribution of common variants to
susceptibility to common disease. Nature Genet. 2003; 33(2):177-182.
152.
Loizou JI, El-Khamisy SF, Zlatanou A, Moore DJ, Chan DW, Qin J, Sarno S,
Meggio F, Pinna LA, Caldecott KW: The protein kinase CK2 facilitates repair
of chromosomal DNA single-strand breaks. Cell. 2004; 117(1): 17-28.
153.
Lopez de Mesa R, Sierrasesumaga L, Calasanz MJ, Lopez de Cerain AL,
Patino-Garcia A: Nonclonal chromosomal aberrations induced by anti-tumoral
regimens in childhood cancer: relationship with cancer-related genes and
fragile sites. Cancer Genet Cytogenet. 2000; 121(1):78-85.
154.
Luo H, Chan DW, Yang T, Rodriguez M, Chen BP, Leng M, Mu JJ, et al.: A
new XRCC1-containing complex and its role in cellular survival of methyl
methanesulfonate treatment. Mol Cell Biol. 2004; 24(19): 8356-8365.
155.
Lüleci N, Sakarya I, Topcu E, Lüleci E, Erincler T, Solak M: Effects of
Sevofluran on cell division and levels of sister chromatid exchange.
Anästhesiol Intensivmed Notfallmed Schmertzher. 2005; 40(4):213-216.
151
156.
Mahrous HS, Ismail SR, Hashishe MM, Kohail HM: Sister chromatid
exchanges and chromosome aberrations in lymphocytes of medical personnel
handling cytostatic drugs. J Egypt Public Health Assoc. 1998; 73(3-4):297-323.
157.
Major J, Jakab MG, Tompa A: The frequency of induced premature centromere
division in human populations occupationally exposed to genotoxic. Mutat Res.
1999; 445(2):241-9.
158.
Maluf SW, Erdtmann B: Follow-up study of the genetic damage in lymphocytes
of pharmacists and nurses handling antineoplastic drugs evaluated by
cytokinesis-block micronuclei analysis and single cell gel electrophoresis.
Mutat Res. 2000; 471(1-2):21-27.
159.
Martinova Y, Topashka-Ancheva M, Konstantinov S, Petkova S, Karaivanova
M, Berger M: Miltefosine decreases the cytotoxic effect of epirubicine and
cyclophosphamide on mouse spermatogenic, thymic and bone marrow cells.
Arch Toxicol. 2006; 80(1):27-33.
160.
Mateuca R, Lombaert N, Aka PV, Decordier I, Kirsch-Volders M.:
Chromosomal changes: induction, detection methods, and applicability in
human biomonitoring. Biochimie. 2006; 88(11):1515-1531.
161.
Mathur R, Chowdhury MR, Singh G: Recent advances in chromosome
breakage syndromes and their diagnosis. Indian Pediatr. 2000; 37(6):615-625.
162.
Mehes G: Chromosome abnormalities with prognostic impact in B-cell chronic
lymphocytic leukemia. Pathol Oncol Res. 2005; 11(4):205-210
163.
Meyer RR, Münster P, Werner C, Brambrink AM: Isoflurane is associated with
a similar incidence of emergence agitation/delirium as sevoflurane in young
children – a randomized controlled study. Ped Anesth. 2007; 17(1):56-60.
164.
Mitelman F: Recurent chromosome aberrations in cancer. Mutat Res. 2000;
462(2-3): 247-253.
165.
Mohrenweiser HW, Xi T, Vazquez-Matias J, Jones IM: Identification of 127
amino acid substitution variants in screening 37 DNA repair genes in humans.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2002; 11(10):1054-1064.
166.
Moreno-Herrero F, de Jager M, Dekker NH, Kanaar R, Wyman C, Dekker C:
Mesoscale
conformational
changes
in
the
DNA-repair
complex
Rad50/Mre11/Nbs1 upon binding DNA. Nature. 2005; 437(7057):440-443.
167.
Moser J, Kool H, Giakzidis I, Caldecott K, Mullenders LHF, Fousteri MI: Sealing
of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1
and DNA ligase III-alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 2007;
27(2):311-323.
168.
Mušák Ľ, Buchancová J, Meško D: Chromozómové aberácie pracovníkov
zlievární v závode Martinmetal Martin. Pracov Lék. 1996; 48(6):240-244.
152
169.
Mušák, Ľ.: Hodnotenie vzťahu medzi výskytom chromozómových poškodení
a génovými polymorfizmami u gumárenských pracovníkov exponovaných
genotoxickým látkam. Doktorandská dizertačná práca, UK Bratislava JLF
Martin, 2005, 111s.
170.
Musák L, Vodicka P, Klimentová G, Soucek P, Hánová M, Mikulková R,
Buchancová J, Vodicková L, Poláková V, Péc M: Chromosomal damage and
polymorphisms of DNA repair genes XRCC1 and XRCC3 in workers exposed
to cytostatics. Neuro Endocrinol Lett. 2006; Suppl 2:57-60.
171.
Musak L, Soucek P, Vodickova L, Naccarati A, Halasova E, Polakova V,
Slyskova J, Susova S, Buchancova J, Smerhovsky Z, Sedikova J, Klimentova
G, Osina O, Hemminki K, Vodicka P: Chromosomal aberrations in tire plant
workers and interaction with polymorphisms of biotransformation and DNA
repair genes. Mutat Res. 2008; 641(1-2):36-42.
172.
Naccarati A, Soucek P, Stetina R, Haufroid V, Kumar R, Vodickova L,
Trtkova K, Dusinska M, Hemminki K, Vodicka P: Genetic polymorphisms and
possible gene-gene interactions in metabolic and DNA repair genes: effect on
DNA damage. Mutat Res. 2006; 593(1-2):22-31.
173.
Nakajima T, Aoyama T: Polymorphism of drug-metabolizing enzymes in
relation to individual susceptibility to industrial chemicals. Industrial Health.
2000;38(2):143-152.
174.
Natarajan AT: Chromosome aberrations: past, present and future. Mutat Res.
2002; 504(1-2):3-16.
175.
Natarajan AT, Boei JJWA: Formation of chromosome aberrations: insights from
FISH. Mutat Res, 2003; 544(2-3):299-304.
176.
NCBI, APE1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=107748.
177.
NCBI, CCND1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=168461.
178.
NCBI, EPHX1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=132810.
179.
NCBI, GSTM1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=138350.
180.
NCBI, GSTM3 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=138390.
181.
NCBI, GSTP1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=134660.
153
182.
NCBI, GSTT1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=600436.
183.
NCBI, hOGG1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=601982.
184.
NCBI, NBS1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=602667.
185.
NCBI, NQO1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=125860.
186.
NCBI, XPC [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=278720.
187.
NCBI, XPD [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=126340.
188.
NCBI, XPG [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=278780.
189.
NCBI, XRCC1 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=194360.
190.
NCBI, XRCC3 [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?cmd=entry&id=600675.
191.
Nedelcheva-Kristensen V, Andersen T, Erikstein B, Geitvik G, Skovlund F,
Nesland JM, Boerresen-Dale AL: Single tube multiplex polymerase chain
reaction genotype analysis of GSTM1, GSTT1 and GSTP1: relation of
genotypes to TP53 tumor status and clinicopathological variables in breast
cancer patients. Pharmacogenetics. 1998; 8(5):441-447.
192.
Nedelcheva-Kristensen V, Persson I, Ingelman-Sundberg M: Genetic
polymorphism of human cytochrome P450 2E1. Methods in Enzymology.
1996; 272:218-225.
193.
Nefic H, Ibrulj S: Genotoxic effect of the antitumor agent vincristine sulfate on
human peripheral blood lymphocytes in vitro [Article in Croatian]. Med Arh.
1999; 53(4):185-8.
194.
Njoku D, Laster MJ, Gong DH, Eger EI, Reed GF, Martin JL: Biotransformation
of halothane, enflurane, isoflurane and desflurane to trifluoroacetylated liver
proteins: association between protein acylation and hepatic injury. Anesthesia
& Analgesia. 1997; 84(1):173-178.
195.
Nobel, Etrane [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www. nobel. sk SPC.aspx?what=spc&code =93632.
196.
Nobel, Forane [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
154
http://www. nobel. sk SPC.aspx?what=spc&code =93632.
197.
Nobel, Sevorane [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www. nobel.sk SPC.aspx?what= spc&code=13375.
198.
Nobel, Suprane [citované 28.8.2008]. Dostupné na:
http://www. nobel.sk SPC.aspx?what=spc&code =13024.
199.
Norppa H: Influence of genetic enzyme polymorphisms on cytogenetic
biomarkers, in human monitoring after environmental and occupational
exposure to chemical and physical agent, Anderson, D. et al. (Eds.) IOS Press,
2000, s. 300-311.
200.
Norppa H: Genetic susceptibility, biomarker responses, and cancer. Mutat.
Res. 2003; 544(2-3):339-348.
201.
Norppa H: Cytogenetic biomarkers and genetic polymorphisms. Toxicol Lett.
2004a; 149(1-3):309-334.
202.
Norppa H: Cytogenetic biomarkers. In: Buffler P, Rice J, Baan R, Bird M,
Boffeta P: (Eds.), Mechanism of Carcinogenesis: Contributions of Molecular
Epidemiology. IARC Scientific Publication. 2004b; 157:79-205.
203.
Norppa H, Bonassi S, Hansteen IL, Hagmar L, Strömberg U, Rössner P,
Boffetta P, Lindholm C, Gundy S, Lazutka J, Cebulska-Wasilewska A,
Fabianova E, Sram RJ, Knudsen LE, Barale R, Fucic A: Chromosomal
aberrations and SCEs as biomarkers of cancer risk. Mutat Res. 2006; 600 (12):37-45.
204.
Nussbaum RH, Grossman CM: Environmental contamination and health
studies: conflicts of interest and reasons for community-based participatory
studies. Arch Environ Health. 2003; 58(5):261-262.
205.
Obe G, Pfeiffer P, Savage JRK, Johannes C, Goedcke W, Jeppesen P,
Natarajan AT, et al: Chromosomal aberrations:formation, identification and
distribution. Mutat. Res. 2002; 504(1-2):17-36.
206.
Oestreicher U, Stephan G, Glatzel M: Chromosome and SCE analysis in
peripheral lymphocytes of persons occupationally exposed to cytostatic drugs
handled with and without use of safety covers. Mutat Res. 1990; 242(4):271277.
207.
Ochs K, Sobol RW, Wilson SH, Kaina B: Cells deficient in DNA polymerase
beta are hypersensitive to alkylating agent-induced apoptosis and
chromosomal breakage. Cancer Res. 1999; 59(7):1544-1551.
208.
Olaharski AJ, Ji Z, Woo JY, Lim S, Hubbard AE, Zhang L, Smith MT: The
histone deacetylase inhibitor trichostatin a has genotoxic effects in human
lymphoblasts in vitro. Toxicol Sci. 2006; 93(2):341-347.
155
209.
Osmak M, Brozovic A, Ambriovic-Ristov A, Hadzija M, Pivcevic B, Smital T:
Inhibition of apoptosis is the cause of resistance to doxorubicin in human
breast adenocarcinoma cells. Neoplasma. 1998; 45(4):223-230.
210.
Ottender M, Lutz WK: Correlation of DNA adduct levels with tumor incidence:
carcinogenic potency of DNA adducts. Mutat Res.1999; 424(1-2):237-247.
211.
Ozer M, Baris S, Karakaya D, Kocamanoglu S, Tur A: Behavioral effects of
chronic exposure to subanesthetic concentration of halothane, sevoflurane and
desflurane in rats. Canadian J Anesth. 2006; 53(7):653-658.
212.
Parkinson A: Biotransformation of xenobiotics. In Casarett & Doull´s
Toxicology. The Basic Science of Poisons (C.D.Klaassen, ed)., 5th Ed. New
York/Saint Louis/San Francisco: McGraw-Hill. 1996; 113-186.
213.
Perera FP: Environment and cancer: Who are susceptible? Science. 1997;
278(5340):1068-1073.
214.
Pilger A, Köhler I, Stettner H, Mader RM, Rizovski B, Terkola R, diem E, FranzHainzl E, Konnaris Cm Valic E, Rüdinger HW: Long-term monitoring of sister
chromatid exchanges and micronucleus frequencies in pharmacy personnel
occupationally exposed to cytostatic drugs. Int Arch Occup Environ Health.
2000; 73(7):442-448.
215.
Pitot HC, Dragan YP: Chemical carcinogenesis. Chapter 8. In Casarett and
Doull´s: Toxicology The basic science of poisons, 6-th.ed., C.D.Klaassen, New
York, 2001; 1236s, 241-319.
216.
Poirier MC: Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat Rev
Cancer. 2004; 4(8):630-637.
217.
Preston RJ, Hoffmann RG: Genetic toxicology. In Cassaret and Doull´s,
Toxicology, The basic Science of Poisons, 6.ed., C.D.Klaassen, New York,
2001, 1236s., 321-350.
218.
Prokes B: Levels of „waste“ halothane in operating rooms at gynecologic and
obsterical clinics-preliminary results. Med Pregl. 1998; 51(11-12):532-536.
219.
Quintero M, Rojas-Atencio A, Ruis A, Gonzalez M, Herrera J, Atencio F,
Delgado W, Urdaneta K, Perez F: Chromosome anomalies in Venezuelan
patients with multiple myeloma. Invest Clin. 2003; 44(4):327-335.
220.
Raimondi S, Garte S, Sram RJ, Binkova B, Kalina I, Lyubomirova K, Taioli E,
Singh R, Farmer PB: Effects of diet on biomarkers of exposure and effects,
and on oxidative damage. Mutat Res. 2007; 620(1-2):93-102.
221.
Raunio H, Husgafvel-Pursiainen K, Anttila S, Hietanen E, Hirvönen A, Peltonen
O: Diagnosis of polymorphisms in carcinogen-activating and inactivating
enzymes and cancer susceptibility - a review. Gene. 1995; 159(1):113-121.
156
222.
Ray DC, Robbins AG, Howie AF, Beckett GJ, Drummond GB: Effect of spinal
anaesthesia on plasma concentrations of glutathione S-transferase. Br J
Anaesth. 2002; 88(2):285–287.
223.
Rekhadevi PV, Sailaja N, Chandrasekhar M, Mahboob M, Rahman MF,
Grover P: Genotoxicity assessment in oncology nurses handling antineoplastic drugs. Mutagenesis. 2007; 22(6):395-401.
224.
Rice PA: Holding damaged DNA together. Nature Struct. Biol.1999; 9(9):805806.
225.
Rombaldi F, Cassini C, Salvator M, Saffi J, Erdtmann B: Occupational risk
assessment of genotoxicity and oxidative stress in workers handling antineoplastic drugs during a working week. Mutagenesis. 2008; Nov 14. [Epub
ahead of print].
226.
Rozgaj R, Kasuba V, Peric: Chromosome aberrations in operating room
personnel. Am J Ind Med. 1999; 35(6):642-646.
227.
Rozgaj R, Kasuba V: Chromosome aberrations and micronucleus frequency in
anaesthesiology personnel. Arh Hig Rada Toksikol. 2000; 51(4):361-368.
228.
Rozgaj R, Kasuba V, Jazbec A: Preliminary study of cytogenetic damage in
personnel exposed to anesthetic gases. Mutagenesis. 2001; 16(2):139-143.
229.
Röhm KD, Suttner SW, Boldt J, Schöllhorn TA, Piper SN: Insignificant effect of
desflurane-fentanyl-thiopental on hepatocellular integrity - a comparison with
total intravenous anaesthesia using propofol-remifentanil. Eur J Anaestesiol.
2005; 22(3):209-214.
230.
Rössner P st: Je spojena vyšší frekvence chromozomových aberací v lidských
periferních lymfocytech s vyšším rizikem vzniku nádorových onemocnění? Čes
Prac Lék. 2006; 7(2):86-87.
231.
Rössner P, Bavorová H, Očadlíková D: Metody biologického monitorování
genotoxických účinků faktorů prostředí. Cytogenetická analýza periferních
lymfocytů. Aktualizace platné standardní metodiky. Príloha AHEM 20/89. Acta
hygienica, epidemiologica et microbiologica, SZÚ Praha. 2000; 1-27.
232.
Rössner P, Boffetta P, Ceppi M, Bonassi S, Smerhovsky Z, Landa K, Juzová
D, Sram RJ: Chromosomal aberrations in lymphocytes of healthy subjects and
risk of cancer. Environ Health Perspect. 2005;113(4):517-520.
233.
Rössner P, Černá M, Bavorová H, Pastorková A, Očadlíková D: Monitoring of
human exposure to occupational genotoxicants. Centr Eur J Publ Hlth. 1995;
3(4):219-223.
234.
Rubes J, Kucharová S, Vozdová M, Musilová P, Zudová Z: Cytogenetic
analysis of peripheral lymphocytes in medical personnel by means of FISH.
Mutat Res. 1998; 412(3):293-298.
157
235.
Rudolf J, Makrantoni V, Ingledew WJ, Stark MJR, White MF: The DNA repair
helicases XPD and FancJ have essential iron-sulfur domains. Mol Cell. 2006;
23(6):801-808.
236.
Rugo HS: Occupational
Hematology. In: La Dou J: Occupational
Medicine. 1990; 1173-1178. Dtsch.-Krankenpflegen. 1989; 42(9):1-10.
237.
Saintot M, Malaveille C, Hautefeuille A, Gerber M: Interaction between genetic
polymorphism of cytochrome P450-1B1 and environmental pollutants in breast
cancer risk. Eur J Cancer Prev. 2004; 13(1):83-86.
238.
Salagovic J, Kalina I, Dudas M: Genetický polymorfizmus enzýmov
metabolizmu xenobiotík ako faktor susceptibility pri vzniku nádorových
ochorení. Bratisl Lek Listy. 2000; 101(9):512-521.
239.
Sano Y, Date H, Igarashi S, Onodera O, Oyake M, Takahashi T, et al.:
Aprataxin, the causative protein for EAOH is a nuclear protein with a potential
role as a DNA repair protein. Ann Neurol. 2004; 55(2):241-249.
240.
Sardas S, Aygun N, Gamli M, Unal Y, Unal N, Berk N, Karakaya AE: Use of
alkaline comet assay (single cell gel electrophoresis technique) to detect DNA
damages in lymphocytes of operating room personnel occupationally exposed
to anaesthetic gases. Mutat Res. 1998a; 418(2-3):93-100.
241.
Sardas S, Karabiyik L, Aygun N, Karakaya AE: DNA damage evaluated by the
alkaline commet assay in lymphocytes of humans anaesthetized with
isoflurane. Mutat Res. 1998b; 418(1):1-6.
242.
Sarker AH, Tsutakawa SE, Kostek S, Ng C, Shin DS, Peris M, et al.:
Recognition of RNA polymerase II and transcription bubbles by XPG, CSB,
and TFIIH: insights for transcription-coupled repair and Cockayne syndrome.
Mol Cell, 2005; 20(2):187-198.
243.
Sarmanova J, Benesova K, Gut I, Nedelcheva-Kristensen V, Tynkova L,
Soucek, P: Genetic polymorphisms of biotransformation enzymes in patients
with Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphomas. Hum Mol Genet. 2001;
10(12):1265-1273.
244.
Sarmanova J, Tynkova L, Susova S, Gut I, Soucek P: Genetic polymorphisms
of biotransformation enzymes: allele frequencies in the population of the Czech
Republic.
Pharmacogenetics.
2000;
10(9):781-788;
erratum
in
Pharmacogenetics. 2003; 13(4): 243.
245.
Sarvary E, Blázovics A, Varga M, Sulyok B, Járay J, Lakatos M, Perner F:
Diagnostic value of glutathione-S-transferase. Orv Hetil. 1998; 139(25):15311537.
246.
Scarpato R, Hirvonen A, Migliore L, Falck G, Norppa H: Influence of GSTM1
and GSTT1 polymorphisms on the frequency of chromosome aberrations in
158
lymphocytes of smokers and pesticide-exposed greenhouse workers. Mutat
Res. 1997; 389(2-3): 227-235.
247.
Shah PP, Singh AP, Singh M, Mathur N, Mishra BN, Pant MC, Parmar D:
Association of functionally important polymorphisms in cytochrome P4501B1
with lung cancer. Mutat Res. 2008; 643(1-2):4-10.
248.
Shanafelt TD, Witzig TE, Fink SR, Jenkins RB, Paternoster SF, et al.:
Prospective evaluation of clonal evolution during long-term follow-up of
patients with untreated early-stage chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol.
2006; 24(28):4634-4641.
249.
Shen MR, Jones IM, Mohrenweiser H: Nonconservative amino acid substitution
variant exist at polymorphic frequency in DNA repair genes in healthy humans,
Cancer Res. 1998; 58(4):604-608.
250.
Shimizu Y, Iwai S, Hanaoka F, Sugasawa K: Xeroderma pigmentosum group C
protein interacts physically and functionally with thymine DNA glycosylase.
EMBO J. 2003,; 22(1):164-173.
251.
Shukla Y, Arora A, Taneja P: Antigenotoxic potential of certain dietary
constituents. Teratog Carcinog Mutagen. 2003; Suppl 1:323-335.
252.
Sissung TM, Price DK, Sparreboom A, Figg WD: Pharmacogenetics and
regulation of human Cytochrome P450 1B1: Implications in hormone-mediated
tumor metabolism and a novel target for therapeutic intervention. Mol Cancer
Res. 2006; 4(3):135-150.
253.
Skjelbred CF, Svendsen M, Haugan V, Eek AK, Clausen KO, Svendsen MV,
Hansteen IL: Influence of DNA repair gene polymorphisms of hOGG1, XRCC1,
XRCC3, ERCC2 and the folate metabolism gene MTHFR on chromosomal
aberration frequencies. Mutat Res. 2006; 602(1-2):151-162.
254.
Sonoda E, Takata M, Yamashita YM, Morrison C, Takeda S: Homologous DNA
recombination in vertebrate cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2001;
98(15):8388-8394.
255.
Speit G, Trenz K: Chromosomal mutagen sensitivity associated with mutations
in BRCA genes. Cytogenet Genome Res. 2004;104(1-4):325-332.
256.
Srivastava DK, Van De Berg BJ, Prasad R, Molina JT, Beard WA, Tomkinson
AE, Wilson SH: Mammalian abasic site base excision repair: identification of
the reaction sequence and rate-limiting steps. J Biol Chem.
1998;
273(33):21203-21209.
257.
Stern MC, Umbach DM, Van Gils CH, Lunn RM, Taylor JA: DNA repair gene
XRCC1 polymorphisms, smoking, and bladder cancer risk. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev. 2001; 10(2):125-131.
159
258.
Sudprasert W, Navasumrit P, Ruchirawat M: Effects of low-dose gamma
radiation on DNA damage, chromosomal aberration and expression of repair
genes in human blood cells. Int J Hyg Environ Health. 2006; 209(6):503-511.
259.
Sun P, Qian J, Zhang ZB, Wan JX, Wu F, Jin XP, et al.: Polymorphisms in
phase I and phase II metabolism genes and risk of chronic benzene poisoning
in a Chinese occupational population. Carcinogenesis. 2008; 29(12):23252329.
260.
Szyfter K, Szulc R, Mikstacki A, Stachecki I, Rydzanicz M, Jaloszynski P:
Genotoxicity of inhalation anaesthetics: DNA lesions generated by sevoflurane
in vitro and in vivo. J Appl Genet. 2004; 45(3):369-374.
261.
Tates AD, van Dam FJ, de Zwart FA, Darroudi F, Natarajan AT, Rossner P,
Peterkova K, PeltonenK, Demopoulos NA, Stephanou G, Vlachodimitropoulos
D, Sram RJ: Biological effect monitoring in industrial workers from the Czech
Republic exposed to low levels of butadiene. Toxicology. 1996; 113(1-3):91-99.
262.
Testa A, Giachelia M, Palma S, Appolloni M, Padua L, Tranfo G, Spagnoli M,
Tirindelli D, Cozzi R: Occupational exposure to antineoplastic agents induces a
high level of chromosome damage. Lack of an effect of GST polymorphisms.
Toxicol Appl Pharmacol. 2007; 223(1):46-55.
263.
Thilly WG: Have environmental mutagens caused oncomutations in people?
Nat Gen. 2003; 34(3):255-259.
264.
Thompson LH, West MG: XRCC1 keeps DNA from getting stranded. Mutat
Res. 2000; 459(1):1-18.
265.
Trapp C, Reite K, Klungland A, Epe B: Deficiency of the Cockayne syndrome B
(CSB) gene aggravates the genomic instability caused by endogenous
oxidative DNA base damage in mice. Oncogene. 2007; 26(27):4044-4048.
266.
Tuimala J, Szekely G, Gundy S, Hirvonen A, Norppa H: Genetic
polymorphisms of DNA repair and xenobiotic-metabolizing enzymes: role in
mutagen sensitivity. Carcinogenesis. 2002; 23(6):1003-1008.
267.
Tuimala J, Szekely G, Wikman H, Järventaus H, Hirvonen A, Gundy S, Norppa
H: Genetic polymorphisms of DNA repair and xenobiotic-metabolizing
enzymes: effects on levels of sister chromatid exchanges and chromosomal
aberrations. Mutat Res. 2004;554(1-2):319-333. Erratum in Mutat Res. 2005
570(2):303.
268.
Van Emburgh BO, Hu JJ, Levine EA, Mosley LJ, Perrier ND, Freimanis RI,
Allen GO, Rubin P, Sherrill GB, Shaw CS, Carey LA, Sawyer LR, Miller MS:
Polymorphisms in CYP1B1, GSTM1, GSTT1 and GSTP1, and susceptibility to
breast cancer. Oncol Rep. 2008; 19(5):1311-1321.
160
269.
Varon R, Vissinga C, Platzer M, Cerosaletti KM, Chrzanowska KH, Saar K, et
al.: Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in
Nijmegen breakage syndrome. Cell. 1998; 93(3):467-476.
270.
Varon R, Reis A, Henze G, Einsiedel HG, Sperling K, Seeger K: Mutations in
the Nijmegen breakage syndrome gene (NBS1) in childhood acute
lymphoblastic leukemia (ALL). Cancer Res. 2001; 61(9):3570-3572.
271.
Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, Smith HO,
Yandell M, Evans CA, Holt RA: The sequence of the human genome. Science.
2001; 291(5507):1304-1351.
272.
Verlaan M, de Morsche RHM, Roelofs HMJ, Laheij RJF, Jansen JBMJ, Peters
WHM, Drenth JPH: Glutathione S-transferase mu null genotype affords
protection against alcohol induced chronic pancreatitis. Am J Med Genet.
2003, 120A(1):34-39.
273.
Vilenchik MM, Knudson AG: Endogenous DNA-double strand breaks:
production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci
U.S.A. 2003; 100(22): 12871-12876.
274.
Vodicka P, Tates, AD, Dusinska M, Sarmanova J, Zamecnikova M, Vodickova
L, Koskinen M, De Zwart F, Natarajan AT, Hemminki K: Association between
genetic polymorphisms and biomarkers in styrene-exposed workers. Mutat
Res. 2001; 482(1-2):89-103.
275.
Vodicka P, Kumar R, Stetina R, Musak L, Soucek P, Haufroid V, Sasiadek M,
Vodickova L, Naccarati A, Sedikova J, Sanyal S, Kuricova M, Brsiak V, Norppa
H, Buchancova J, Hemminki K: Markers of individual susceptibility and DNA
repair rate in workers exposed to xenobiotics in a tire plant. Environ Mol
Mutagen. 2004a; 44(4):283-292.
276.
Vodicka P, Kumar R, Stetina R, Sanyal S, Soucek P, Haufroid V, Dusinska M,
Kuricova M, Zamecnikova M, Musak L, Buchancova J, Norppa H, Hirvonen A,
Vodickova L, Naccarati A, Matousu Z, Hemminki K: Genetic polymorphisms in
DNA repair genes and possible links with DNA repair rates, chromosomal
aberrations and single-strand breaks in DNA.
Carcinogenesis. 2004b,
25(5):757-763.
277.
Volker M, Mone MJ, Karmakar P, van Hoffen A, Schul W, Vermeulen W, et al.:
Sequential assembly of the nucleotide excision repair factors in vivo. Mol Cell.
2001; 8(1):213-224.
278.
Vorlíček J, Vyzula R, Adam Z: Praktická onkologie, vybrané kapitoly. Grada
Publishing s.r.o., Praha. 2000; 77-154.
279.
Wang Y, Cortez D, Yazdi P, Neff N, Elledge SJ, Qin J: BASC, a super complex
of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and repair of
aberrant DNA structures. Genes Dev. 2000a; 14(8):927-939.
161
280.
Wang L, Groves MJ, Hepburn MD, Bowen DT: Glutathione S-transferase
enzyme expression in hematopoietic cell lines implies a differential protective
role for T1 and A1 isoenzymes in erythroid and M1 in lymphoid lineages.
Haematologica. 2000b; 85(6):573-579.
281.
Wang X, Zuckerman B, Pearson C, Kaufman G, Chen C, Wang G, Niu T, Wise
PH, Bauchner H, Xu X: Maternal cigarette smoking, metabolic gene
polymorphism, and infant birth weight. JAMA. 2002; 287(2):195-202.
282.
Wang C-L, Hsieh M-C, Hsin S-C, Lin H-Y, Lin K-D, Lo C-S,et al.: The hOGG1
Ser326Cys gene polymorphism is associated with decreased insulin sensitivity
in subjects with normal glucose tolerance. J Hum Genet. 2006a; 51(2):124128.
283.
Wang C, Li Z, Lu Y, Du R, Katiyar S, Yang J, Fu M, Leader JE, et al.: Cyclin D1
repression of nuclear respiratory factor 1 integrates nuclear DNA synthesis and
mitochondrial function. Proc Nat Acad Sci. 2006b; 103(31), 11567-11572.
284.
Wang X, Arai S, Song X, Reichart D, Du K, Pascual G, Tempst P, Rosenfeld
MG, Glass CK, Kurokawa R: Induced ncRNAs allosterically modify RNAbinding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 2008; 454(7200):126-130.
285.
Wang Z, Xu B, Lin D, Tan W, Leaw S, Hong X, Hu X: XRCC1 polymorphisms
and severe toxicity in lung cancer patiens treated with cisplatin-based
chemotherapy in Chinese population. Lung Cancer. 2008b; 62(1):99-104.
286.
Wanging W, Zefang R, Xiao OS, Qiuyin C, Chuanzhong Y, Yu-Tang G, Wei Z:
Expression of Cytochrome P450 1B1 and Catechol-O-Methyltransferase in
Breast Tissue and Their Associations with Breast Cancer Risk. Cancer
Epidemiol Biomarkers & Prev. 2007; 16(5):917-920.
287.
Watanabe J, Shimada T, Gillam EM, Ikuta T, Suemasu K, Higashi Y, Gotoh O,
Kawajiri K: Association of CYP1B1 genetic polymorphism with incidence to
breast a lung cancer. Pharmacogenetics. 2000; 10(1):25-33.
288.
Whitehouse CJ, Taylor RM, Thistlethwaite A, Zhang H, Karimi-Busheri F,
Lasko DD, Weinfeld M, Caldecott KW: XRCC1 stimulates human
polynucleotide kinase activity at damaged DNA termini and accelerates DNA
single-strand break repair. Cell. 2001; 104(1):107-117.
289.
Wick U, Gebhart E: Studies on the action of mitomycin C and bleomycin on
telomere lengths of human lymphocyte chromosomes. Int J Mol Med. 2005;
16(3):463-469.
290.
Wiesenhütter B, Selinski S, Golka K, Brüning T, Bolt HM: Re-assessment of
the influence of polymorphisms of phase-II metabolic enzymes on renal cell
cancer risk of trichloroethylene-exposed workers. Int Arch Occup Environ
Health. 2007; 81(2), 247-251.
162
291.
Wiesner G, Harth M, Hoerauf K, Szulc R, Jurczyk W, Sobczynski P, Hobbhahn
J, Taeger K: Occupational exposure to inhaled anaesthetics: A follow-up study
on anaesthetists of an eastern European university hospital. Acta Anaestesiol.
Scand. 2000; 44(7):804-806.
292.
Wiesner, G., Hoerauf, K., Schroegendorfer, K., Sobczynski, P., Harth, M.,
Ruediger H.W.: High-level, but not low-level, occupational exposure to inhaled
anesthetics is associated with genotoxicity in the micronucleus assay. Anesth
Analg. 2001; 92(1):118-122.
293.
Wilk JB, Tobin JE, Suchowersky O, Shill HA, Klein C, Wooten GF, et al.:
Herbicide exposure modifies GSTP1 haplotype association to Parkinson onset
age: the GenePD study. Neurology. 2006; 67(12):2206-2210.
294.
Wilkes AR, Raj N, Hall JE: Adverse airway events during nasal inhalations of
volantile anaesthetics: the effekt of humidity and repeated exposure on
incidence in volunteers preselected by response to desflurane. Anaesthesia.
2003; 58(3):207-216.
295.
Winsey SL, Haldar NA, Marsh HP, Bunce M, Marshall SE, Harris AL,
Wojnarowska F, Welsh KI: A variant within the DNA repair gene XRCC3 is
associated with the development of melanoma skin cancer. Cancer Res.
2000; 60(20):5612-5616.
296.
Wojtczak JA: The hemodynamic effects of halothane and isoflurane in chick
embryo. Anasth Analg. 2000; 90(6):1331-1335.
297.
Wu X, Ranganathan V, Weisman DS, Heine WF, Ciccone DN, O'Neill TB,et al.:
ATM phosphorylation of Nijmegen breakage syndrome protein is required in a
DNA damage response. Nature. 2000; 405(6785):477-482.
298.
Xu SJ, Wang JX, Yang DP: An investigation on the chromosomal damage in
nurses occupationally exposed to antineoplastic drugs [Article in Chinese].
Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2003; 37(2):119-120.
299.
Yoder K, Sarasin A, Kraemer K, McIlhatton M, Bushman F, Fishel, R: The DNA
repair genes XPB and XPD defend cells from retroviral infection. Proc Natl
Acad Sci. U.S.A. 2006; 103(12):4622-4627.
300.
Zhao S, Weng Y-C, Yuan S-SF, Lin Y-T, Hsu H-C, Lin S-CJ,et al.: Functional
link between ataxia-telangiectasia and Nijmegen breakage syndrome gene
products. Nature. 2000; 405(6785):473-477.
301.
Zhu Q, Xing W, Qian B, von Dippe P, Shneider BL, Fox VL, Levy D: Inhibition
of human m-epoxide hydrolase gene expression in a case of hypercholanemia.
Biochim Biophys Acta. 2003; 1638(3):208-216.
302.
Zhu B, Liu GT, Zhao YM, Wu RS, Strada SJ: Chemosensitizing multiple drug
resistance of human carcinoma by Bicyclol involves attenuated p-glycoprotein,
GST-P and Bcl-2. Cancer Biol Ther. 2006; 5(5):536-543.
163
303.
Zienolddiny S, Campa D, Lind H, Ryberg D, Skaug V, Stangueland LB,
Canzian F, Haugen A: A comprehensive analysis of phase I and phase II
metabolism gene polymorphisms and risk of non-small cell lung cancer.
Carcinogenesis. 2008; 29(6):1164-1169.
164
Zoznam obrázkov, tabuliek a grafov
Obr. 1
Biomarkery expozície
Obr. 2
Biomarkery účinku
Obr. 3
Štruktúrne vzorce jednotlivých halogénových anestetík
Obr. 4
Chromatidový zlom (Z1)
Obr. 5
Chromozómový zlom (Z2)
Obr. 6
Chromatidová výmena (V1)
Obr. 7
Chromozómová výmena (V2)
Tab. 1
Všeobecná charakteristika súboru exponovaného anestetikám
Tab. 2
Porovnanie doby expozície fajčiarov a nefajčiarov, mužov a žien,
lekárov a SZP v súbore exponovanom anestetikám
Tab. 3
Všeobecná charakteristika súboru exponovaného cytostatikám
Tab. 4
Porovnanie doby expozície fajčiarov a nefajčiarov, mužov a žien,
lekárov a SZP v súbore exponovanom cytostatikám
Tab. 5
Všeobecná charakteristika kontrolného súboru
Tab. 6
Počet chromozómových aberácií a
v exponovaných skupinách a kontrole
Tab. 7
Počet aberácií chromatidového (CHTA) a chromozómového (CHSA)
typu a ich percentuálne vyjadrenie v exponovaných skupinách
a kontrole
ich
percentuálne
vyjadrenie
165
Graf 1
Výskyt chromatidového a chromozómového typu aberácií v skupine
EXP1
Graf 2
Výskyt chromatidového a chromozómového typu aberácií v skupine
EXP2
Graf 3
Výskyt chromatidového a chromozómového typu aberácií v kontrolnej
skupine
Graf 4
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v skupine EXP1 v závislosti na pohlaví
Graf 5
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v skupine EXP2 v závislosti na pohlaví
Graf 6
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v kontrolnej skupine v závislosti na pohlaví
Graf 7
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v skupine EXP1 u fajčiarov a nefajčiarov
Graf 8
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v skupine EXP2 u fajčiarov a nefajčiarov
Graf 9
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov u
fajčiarov a nefajčiarov v kontrolnej skupine
Graf 10
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v skupine EXP1 podľa pracovného zaradenia
Graf 11
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v skupine EXP2 podľa pracovného zaradenia
Graf 12
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
v kontrolnej skupine podľa pracovného zaradenia
Graf 13
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CYP1B1 Asn453Ser v skupine exponovanej anestetikám
Graf 14
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CYP1B1 Asn453Ser v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 15
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CYP1B1 Asn453Ser v kontrolnej skupine
Graf 16
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CYP1B1 Leu432Val v skupine exponovanej anestetikám
Graf 17
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CYP1B1 Leu432Val v skupine exponovanej cytostatikám
166
Graf 18
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CYP1B1 Leu432Val v kontrolnej skupine
Graf 19
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu EPHX1 podľa aktivity EPH v skupine exponovanej anestetikám
Graf 20
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu EPHX1 podľa aktivity EPH v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 21
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu EPHX1 podľa aktivity EPH v kontrolnej skupine
Graf 22
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTM1 v skupine exponovanej anestetikám
Graf 23
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTM1 v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 24
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTM1 v kontrolnej skupine
Graf 25
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTP1 Ile105Val v skupine exponovanej anestetikám
Graf 26
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTP1 Ile105Val v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 27
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTP1 Ile105Val v kontrolnej skupine
Graf 28
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTT1 v skupine exponovanej anestetikám
Graf 29
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich
typov génu GSTT1 v skupine exponovanej cytostatikám
jednotlivých
Graf 30
Výskyt celkových chromozómových
typov génu GSTT1 v kontrolnej skupine
jednotlivých
Graf 31
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTM3 v skupine exponovanej anestetikám
Graf 32
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTM3 v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 33
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu GSTM3 v kontrolnej skupine
Graf 34
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu NQO1 Pro187Ser v skupine exponovanej anestetikám
aberácií
a ich
167
Graf 35
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu NQO1 Pro187Ser v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 36
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu NQO1 Pro187Ser v kontrolnej skupine
Graf 37
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC1 Arg194Trp v skupine exponovanej anestetikám
Graf 38
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC1 Arg194Trp v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 39
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC1 Arg194Trp v kontrolnej skupine
Graf 40
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC1 Arg399Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 41
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC1 Arg399Gln v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 42
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC1 Arg399Gln v kontrolnej skupine
Graf 43
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu hOGG1 Ser326Cys v skupine exponovanej anestetikám
Graf 44
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu hOGG1 Ser326Cys v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 45
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu hOGG1 Ser326Cys v kontrolnej skupine
Graf 46
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu APE1 Asp148Glu v skupine exponovanej anestetikám
Graf 47
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu APE1 Asp148Glu v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 48
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu APE1 Asp148Glu v kontrolnej skupine
Graf 49
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPD Lys751Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 50
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPD Lys751Gln v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 51
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPD Lys751Gln v kontrolnej skupine
168
Graf 52
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPG Asp1104His v skupine exponovanej anestetikám
Graf 53
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPG Asp1104His v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 54
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPG Asp1104His v kontrolnej skupine
Graf 55
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPC Lys939Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 56
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPC Lys939Gln v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 57
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XPC Lys939Gln v kontrolnej skupine
Graf 58
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC3 Thr241Met v skupine exponovanej anestetikám
Graf 59
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC3 Thr241Met v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 60
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu XRCC3 Thr241Met v kontrolnej skupine
Graf 61
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu NBS1 Glu185Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 62
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu NBS1 Glu185Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 63
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu NBS1 Glu185Gln v skupine exponovanej anestetikám
Graf 64
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CCND1 Pro241Pro v skupine exponovanej anestetikám
Graf 65
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CCND1 Pro241Pro v skupine exponovanej cytostatikám
Graf 66
Výskyt celkových chromozómových aberácií a ich jednotlivých typov
génu CCND1 Pro241Pro v kontrolnej skupine
169
Prílohy
Príloha 1:
Dotazník na cytogenetické vyšetrenie
Príloha 2:
Laboratórny protokol – cytogenetická analýza
170
Dátum ....................
Ev.č.: ..............................
DOTAZNÍK
NA CYTOGENETICKÉ VYŠETRENIE
Meno a priezvisko ........................................... Rodné číslo .............................................
Narodený(á) kedy ................... kde ........................... Rodinný stav ...................................
Bydlisko........................................................... Okres .........................................................
Zdravotná poisťovňa …...........................
Diagnóza ......................................
Zamestnanie:
zamestnávateľ ...................................................... prevádzka .........................................
zamestnaný ako ........................ koľko rokov ................. zmennosť …............................
predchádzajúce zamestnanie kde ......................... ako .................... koľko .....................
Expozícia genotoxickým látkam:
druh škodliviny ............................................... denná expozícia (hod.) ..............................
Vzdelanie: základné, učilište, SOU, stredné odborné / všeobecné s maturitou,
vysokoškolské
Deti: počet, vek, pohlavie, zdravotný stav …........................................................................
…............................................................................................................................................
…............................................................................................................................................
Rodičia: vek, žijú / nežijú, umreli (kedy, v akom veku, na čo) …...........................................
…............................................................................................................................................
…............................................................................................................................................
…............................................................................................................................................
Výskyt vrodených vývojových chýb (rázštepy, hemofília ai.): ...............................................
Spontánny potrat (u žien): počet, kedy, dôvod .....................................................................
Tehotenstvo (u žien): normálne, rizikové …..........................................................................
Pôrod (u žien): predčasný, normálny, rizikový ....................................................................
Hormonálna antikoncepcia (u žien): nie / áno
Posledných 3 – 6 mesiacov:
užívanie antibiotík: nie / áno
užívanie analgetík (paralen, ataralgin): nie / áno
prekonané vírusové ochorenie (bez užívania antibiotík): nie / áno
očkovanie: nie / áno
RTG vyšetrenie: nie / áno
RTG terapia: nie / áno
Fajčenie:
nefajčiar,
fajčiar: koľko cig./deň ..................... koľko rokov ........................................
ex-fajčiar: prestal kedy .................. predtým fajčenie
koľko cig./deň ..........................
koľko rokov ..............................
Požívanie alkoholu: vôbec nie, príležitostne, pravidelne
množstvo za deň: pivo ............ víno ......... destiláty ............................
Pitie kávy:
nie / áno, koľko denne ...............
Diétna strava: nie / áno, aká …..................
171
Laboratórny protokol – cytogenetická analýza
Označenie preparátu: ...........................
Meno a priezvisko: ............................
Dátum odberu vzorky : ...........................
Dátum vyhodnotenia vzorky:......................
Výsledok cytogenetickej analýzy
N
AB.B.
Z1
Z2
V1
V2
AF
G1
G2
AS
PRC
ANEUPL
HYPO
HYPER
172
Download

univerzita komenského v bratislave jesseniova lekárska fakulta v