SLOVAK UNIVERSITY OF AGRICULTURE IN NITRA, SLOVAK REPUBLIC
PEDAGOGICAL UNIVERSITY IN CRACOW, POLAND
SZENT ISTVAN UNIVERSITY IN GÖDÖLLŐ, HUNGARY
TOMAS BATA UNIVERSITY IN ZLÍN, CZECH REPUBLIC
RISK FACTORS OF FOOD CHAIN
SEPTEMBER, 13th – 14th 2010,
NITRA, SLOVAK REPUBLIC
Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic
Faculty of Biotechnology and Food Sciences
Pedagogical University of Cracow, Poland
Faculty of Geography and Biology
Szent Istvan University in Gödöllő, Hungary
Faculty of Agriculture and Environmental Sciences
Tomas Bata University in Zlín, Czech Republic
Faculty of Technology
Proceeding Book
of X International Scientific Conference
RISK FACTORS OF FOOD CHAIN
SEPTEMBER, 13th – 14th 2010
NITRA, SLOVAK REPUBLIC
Editors:
doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD.
doc. MVDr. Peter Massányi, PhD.
doc. Ing. Marcela Capcarová, PhD.
Ing. Eva Tvrdá
Ing. Zuzana Kňažická
Authorized by the Rector of SUA in Nitra on 30.08.2010 as a Proceedings Book
©SUA in Nitra
ISBN 978-80-552-0436-9
Scientific Committee of the Conference:
László Bárdos, prof. DVM. Ph.D. (Chair)
Faculty of Agricultural and Environmental Sciences,
Szent István University, Gödöllő, Hungary
Jozef Bíreš, prof. DVM. D.Sc.
Clinic of Ruminants,
University of Veterinary Medicine and Pharmacy in Košice, Slovakia
Jozef Bulla, prof. M.Sc., D.Sc.
Faculty of Biotechnology and Food Sciences,
Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic
Małgorzata Dżugan, Dr. Ph.D.
Department of Food Chemistry and Toxicology,
University of Rzeszow, Poland
Zsolt Forgács, Dr. Ph.D.
National Institute of Chemical Safety, Budapest, Hungary
Manabendra Dutta Choudhury, prof. Dr., Ph.D.
Department of Life Science,
Assam University Silchar, India
Jaroslav Kováčik, prof. M.Sc., Ph.D.
Faculty of Biotechnology and Food Sciences,
Slovak University of Agriculture in Nitra, Slovak Republic
Stanislav Kráčmar, prof. M.Sc., D.Sc.
Faculty of Technology,
Tomas Bata University in Zlín, Czech Republic
Robert Stawarz, prof. Dr., Ph.D.
Faculty of Geography and Biology,
Pedagogical University of Cracow, Poland
Barbara Pinto, Dr. Ph.D.
Department of Experimental Pathology,
University of Pisa, Italy
Jozef Trandžík Assoc. Prof., M.Sc., Ph.D.
Faculty of Natural Sciences,
Constantine the Philosopher University in Nitra, Slovakia
Organizing committee of the conference:
Chair:
Norbert Lukáč (SUA Nitra, Slovakia)
Co-Chair:
Annamária Kerti (SzIU Gödöllő, Hungary)
Grzegorz Formicki (UP Cracow, Poland)
František Buňka (TBU Zlín, Czech Republic)
Jozef Golian (SUA Nitra, Slovakia)
Secretariat:
Marcela Capcarová (SUA Nitra, Slovakia)
Members:
Peter Massányi (SUA Nitra, Slovakia)
Adriana Kolesárová (SUA Nitra, Slovakia)
Peter Brezovský (UAF Nitra, Slovakia)
Zuzana Gálová (SUA Nitra, Slovakia)
Tomek Laciak (UP Cracow, Poland)
Csaba Szabó (SzIU Gödöllő, Hungary)
Robert Toman (SUA Nitra, Slovakia)
Anna Kalafová (SUA Nitra, Slovakia)
Jiřina Kročková (SUA Nitra, Slovakia)
Monika Schneidgenova (SUA Nitra, Slovakia)
Peter Čupka (SUA Nitra, Slovakia)
Alena Balážová (SUA Nitra, Slovakia)
Shubhadeep Roychoudhury (AU, India)
Terézia Filipejová (SUA Nitra, Slovakia)
Eva Tvrdá (SUA Nitra, Slovakia)
Zuzana Kňažická (SUA Nitra, Slovakia)
Anton Kováčik (SUA Nitra, Slovakia)
Marína Medveďová (SUA Nitra, Slovakia)
Jana Slivková (SUA Nitra, Slovakia)
Reviewers:
prof. MSc. Mária Angelovičová, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. MSc. Marcela Capcarová, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
Dr. Grzegorz Formicki, PhD. (UP Cracow, Poland)
doc. MSc. Roman Gálik, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. MSc Jozef Golian, Dr. (SUA Nitra, Slovakia)
MSc. Róbert Chlebo, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
MSc. Miroslav Juráček, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
MSc. Anna Kalafová, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. MSc. Adriana Kolesárová, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. MSc. Miroslava Kačániová, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. MSc. Norbert Lukáč, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. DVM. Peter Massányi, PhD. (SUA U Nitra, Slovakia)
prof. Dr. Robert Stawarz, PhD. (UP Cracow, Poland)
doc. MSc. Róbert Toman, Dr. (SUA Nitra, Slovakia)
doc. MSc. Dana Tančinová, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
MSc. Radoslav Židek, PhD. (SUA Nitra, Slovakia)
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Contents
RABBIT KIDNEY STRUCTURE AFTER PERORAL BENDIOCARBAMATE ADMINISTRATION
ALMÁŠIOVÁ Viera, HOLOVSKÁ Katarína jr., CIGÁNKOVÁ Viera
7
7
THE SPECIES IDENTIFICATION OF FRESHWATER FISH AS A POTENTIAL FOOD ALLERGENS 10
BAJZÍK Pavol, ŽIDEK Radoslav, GOLIAN Jozef, BELEJ Ľubomír
DNA FRAGMENTATION IN DEER MEAT THE INFLUENCE OF VARIOUS COOKING TIMES
BELEJ Ľubomír , ŽIDEK Radoslav, GOLIAN Jozef, BARNOVÁ Miroslava
10
16
16
THE INFLUENCE OF NATURAL BIOACTIVE SUBSTANCES ON IMMUNOLOGICAL PARAMETERS
21
BERTKOVÁ Izabela, PETRÁŠOVÁ Darina, BOMBA Alojz
21
EFFECT OF ENVIRONMENT ON HISTAMINE PRODUCTION OF ENTEROBACTER AEROGENES
CCM 2531 STRAIN
27
BUPKOVÁ Leona, BUPKA František, KLČOVSKÁ Pavlína, DOLEŽÁLKOVÁ Iva, KRÁČMAR Stanislav
RISK ELEMENT ACCUMULATION RELATED TO THE ANATOMICAL PARTS OF
BUCKWHEAT(FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH.)
BYSTRICKÁ Judita, VOLLMANOVÁ Alena, ČIČOVÁ Iveta, MUSILOVÁ Janette
MORPHOMETRIC CHANGES IN THE RAT TESTIS CAUSED BY INTRAPERITONEAL
ADMINISTRATIUON OF DIAZINON AND SELENIUM
27
33
33
37
CABAJ Michal1, TOMAN Róbert, ADAMKOVIČOVÁ Mária, MASSÁNYI Peter, ŠIŠKA Branislav, LUKÁČ Norbert,
GOLIAN Jozef
37
CADMIUM AS A CONTAMINANT IN SELECTED TYPES OF FOOD
CIMBOLÁKOVÁ Iveta, LOVÁSOVÁ Eva, NOVÁKOVÁ Jaroslava
CALCIUM AND IRON CONTENT IN HUMAN MILK FRACTIONS
CZAJKOWSKA M., STAWARZ R., FORMICKI G., CHROBACZYOSKA M., WYRZYKOWSKA A., CHRYC K.
51
51
56
56
PHOTOCHEMILUMINESCENT DETECTION OF OXIDATIVE STRESS IN LEPIDIUM SATIVUM L.
EXPOSED TO CADMIUM AND ZINC
62
DŽUGAN Małgorzata*, PAKLA Magdalena*, PASTERNAKIEWICZ Anna*, GRABEK-LEJKO Dorota**
62
EVALUATION OF INTERACTIONS BETWEEN SELECTED PESTICIDES AND HEAVY METALS ON
ARTEMIA FRANCISCANA LETHALITY
68
FALIS Marcel, ŠPALEK Milan, LEGÁTH Jaroslav, KRUPICER Ivan
SELECTED RISK COMPONENTS OF NUTRITIONAL INTAKE IN ADULTS
FATRCOVÁ-ŠRAMKOVÁ Katarína, MRÁZOVÁ Jana, KOLESÁROVÁ Anna, SCHWARZOVÁ Marianna
68
73
73
1
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
HEAVY METALS – CONTAMINANTS OF BEE POLLEN AND USE OF POLLEN IN NUTRITION
1
2
FATRCOVÁ-ŠRAMKOVÁ Katarína , NÔŽKOVÁ Janka
79
79
GENETIC RISK FACTORS FOR THROMBOSIS
85
FEČKOVÁ Monika1, MINDEKOVÁ S.1, JAKABOVÁ Daniela1, TRANDŽÍK Jozef2, BULECA Ján ml.3, KOZLÍK Peter1,
1
1
4
4
CHRASTINA Jozef , RYBA Štefan , MASSÁNYI Peter , ROYCHOUDHURY Shoubhadeep
85
SELECTED BIOCHEMICAL PARAMETERS OF ENERGY, ENZYMATIC AND NITROGENOUS
PROFILE OF DAIRY COWS IN BLOOD PLASMA
FILIPEJOVÁ Terézia, KOVÁČIK Jaroslav
86
86
NUTRITIVE QUALITY OF CEREALS, PSEUDOCEREALS AND LEGUMINOUS FROM THE POINT
OF VIEW COELIAC AGENS
91
GÁLOVÁ Zdenka, POLÓNIOVÁ Zuzana, CHPAPEK Milan, KEČKÉŠOVÁ Monika, PÁLENČÁROVÁ Eva
PASTEURIZATION OF LIQUID EGG WITH MICROWAVE METHOD
GÉCZI Gábor
91
96
96
MEAT PRODUCTION FOLLOWING AND THE DEVELOPMENT OF FAT TISSUE AT ROSS 308
CHICKENS INFLUENCE OF PROBIOTIC PREPARATION APPLICATIONS IN THEIR NUTRITION
101
HAŠČÍK Peter, MIHOK Michal, KAČÁNIOVÁ Miroslava, CAPCAROVÁ Marcela, ARPÁŠOVÁ Henrieta,
BENCZOVÁ Emília
101
EFFICIENCY IMPROVEMENT OF INULIN PREBIOTICS USING BIOACTIVE FOOD COMPONENTS
109
HIJOVÁ E., CHMELÁROVÁ A., BOMBA A.
109
ANTIBIOTIC RESISTANCE OF ENTEROBACTERIACEAE GENERA ISOLATED FROM
UNPASTEURISED MILK
HLEBA Lukáš, KAČÁNIOVÁ Miroslava, POCHOP Jaroslav, KUNOVÁ Simona*
115
115
ANTIBIOTIC RESISTANCE OF UBIQUITOUS BACTERIAL CENOSE ISOLATED FROM RECTAL
SWABS OF CHICKEN
119
HLEBA Lukáš, KAČÁNIOVÁ Miroslava, POCHOP Jaroslav, NOVÁKOVÁ Ivana, ANGELOVIČOVÁ Mária *, KUNOVÁ
Simona*
119
THE EFFECT OF ENVIRONMENTAL STRESS ON ANIMAL LIVER
HOLOVSKÁ Katarína jr., ALMÁŠIOVÁ Viera, CIGÁNKOVÁ Viera
123
PESTICIDES IN CEREALS AND BABY FOOD AS A FOOD CHAIN RISK FACTOR
CHODKOWSKA Eliza M., JEDRAL Szczepan, ŚWIATEK Bernadetta, ZACHARA Alicja
ACUTE EFFECT OF NICKEL ON FEMORAL BONE STRUCTURE OF LABORATORY RATS
1
1
2
CHOVANCOVÁ H. , MARTINIAKOVÁ M. , OMELKA R. , TOMAN R.
123
3
126
126
132
132
2
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
INFLUENCE OF THE HEAVY METALS ON THE PEDOFAUNA OF THE SELECTED HABITATS IN
THE NIEPOŁOMICE PRIMEVAL FOREST
138
1
1
CHRZAN Anna , MARKO- WORŁOWSKA Maria , ŁACIAK Tomasz
2
138
POULTRY PRODUCTS IN THE FOOD CHAIN AS A SOURCE OF CAROTENOIDS
143
JUNG Ivett, SZABÓ Csaba, KERTI Annamária, BÁRDOS László
143
THE EFFECT OF NICKEL AND ZINC EXPERIMENTAL ADMINISTRATION ON THE ENZYMATIC
PROFILE OF RABBIT BLOOD
148
1
1
1
1
1
KALAFOVÁ Anna , KOVÁČIK Jaroslav , CAPCAROVÁ Marcela , MASSÁNYI Peter , KOLESÁROVÁ Adriana ,
CHRASTINOVÁ Ľubica2, LUKÁČ Norbert1, SCHNEIDGENOVÁ Monika1, ČUPKA Peter1, JURČÍK Rastislav2
148
EGG YOLK OXYCAROTENOIDS OFFER PROTECTION AGAINST AMD
152
KERTI Annamária, KISS Zsuzsanna, LAKNER Hajnalka, BÁRDOS László
152
TOXIC AND BIOGENIC METALS IN HUMANS’ TEETH FROM MALOPOLSKA DISTRICT
157
KILIAN K., GOC Z., STAWARZ R., FORMICKI G., OBRZUT M., CIĄGŁO A., KUCZKOWSKA – KUŹNIAR A.
157
SEASONAL VARIATIONS OF YOLK COLOUR AND IgY CONCENTRATION IN NATURAL REARED
HENS’ YOLK
163
KISS Zsuzsanna, BURAI Ibolya, BORDÁN Judit
163
ANALYSIS OF THE PROPERTIES OF CIDERS PRODUCED BY NATURAL METHOD
167
KLUZ M.1, GRABEK-LEJKO D.1, DŻUGAN M.2, PASTERNAKIEWICZ A.2, KISAŁA J.2, KAPUSTA I.3,MROZEK T.3 167
THE INFLUENCE OF NICKEL AND ZINC ON THE OCCURRENCE OF ABNORMAL FORMS OF
RABBIT SPERMS IN VIVO
172
KPAŽICKÁ Zuzana 1, TVRDÁ Eva 1, LUKÁČ Norbert 1, MASSÁNYI Peter 1, KALAFOVÁ Anna 1, SCHNEIDGENOVÁ
Monika 1, ONDRUŠKA Ľubomír 2
172
STRUCTURAL CHANGES OF RABBIT TESTES KEPT AT HIGH TEMPERATURES
1
1
1
2
177
2
KOLESÁROVÁ Anna , LUKÁČ Norbert , MASSÁNYI Peter , PARKÁNYI Vladimír , ONDRUŠKA Ľubomír , JURČÍK
2
2
Rastislav , SLAMEČKA Jaroslav st.
177
NUTRITIONAL AND SENSORY EVALUATION OF MEAT KILLED AND SHOT WILD RABBITS 182
KORÉNEKOVÁ B., POPELKA P., MARCINČÁK S., MAČANGA J.,
COMPARISION OF CADMIUM LEVELS IN SHOT AND KILLED WILD RABBITS
1
2
1
KORÉNEKOVÁ B. , SKALICKÁ M. , MAČANGA J.
182
187
187
RESULTS OF MONITORING THE PESTICIDAL RESIDUA OCCURENCE IN VARIOUS COUNTRIES
OF WORLD (A REVIEW)
190
1
2
KOVALKOVIČOVÁ N. , ŠUTIAKOVÁ I. , PISTL J.
1
DETECTION OF LASALOCIDE RESIDUES IN BROILER CHICKEN TISSUES
190
196
KOŽÁROVÁ I., MAČANGA J., ŠIMKOVÁ J., MAĎAROVÁ M., SÝKOROVÁ GOFFOVÁ Z., LEVKUT M. ml., MAJOR P.
196
3
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
THE CONTENT OF Hg, Cd AND Pb IN HONEY AND WAX SAMPLES ORGINATING FROM
POLAND AND RUSSIA
1
1
2
1
1
202
1
KUCZKOWSKA-KUŹNIAR A ., CIĄGŁO A ., KUŹNIAR T ., FORMICKI G ., STAWARZ R ., ZAMACHOWSKI W . 202
EVALUATION POSSIBILITY USE OF SELECTED FOODSTUFFS IN THE BREEDING OF
ENTOMOPATHOGENIC FUNGUS OF ISARIA FUMOSOROSEA
1
1
1
2
2
2
KUŹNIAR T ., PARTYKA A ., ROPEK D ., KUCZKOWSKA-KUŹNIAR A ., CIĄGŁO A ., STAWARZ R .
207
207
THE EFFECT OF LONG-LASTING CADMIUM EXPOSURE ON PHYSIOLOGICAL, REPRODUCTIVE
AND ANTIOXIDANT PARAMETERS IN RATS
211
LOVÁSOVÁ E., CIMBOLÁKOVÁ I., NOVÁKOVÁ J.
IN VITRO EFFECT OF LEAD ON RABBIT SPERMATOZOA MOTILITY
MARETTA Mário, KROČKOVÁ Jiřina, MASSÁNYI Peter, SLIVKOVÁ Jana
211
216
216
TOPSOIL, SOIL MACROFAUNA AND SCOTS PINE BARK AS INDICATORS OF ENVIRONMENTAL
POLLUTION
222
MARKO-WORŁOWSkA Maria, WĄTOR Gabriela1, KOZIK Ryszard2, ŁACIAK Tomasz3, CHRZAN Anna1
222
HEAVY METAL CONTENT IN BONES AND FEMORAL BONE STRUCTURE OF BANK VOLE
(MYODES GLAREOLUS) AND COMMON VOLE (MICROTUS ARVALIS) FROM POLLUTED
BIOTOPES IN SLOVAKIA
234
MARTINIAKOVÁ M.1, OMELKA R.2, JANČOVÁ, A. 1, STAWARZ R.3, FORMICKI G. 3
THE EFFECT OF ABIOTIC FACTORS ON THE IMMUNE SYSTEM
MARTINIAKOVÁ M.1, OMELKA R.2, MASSÁNYI P.3, LUKÁČ N.3
234
241
241
IN VITRO STUDY OF THE EFFECT OF DEOXYNIVALENOL ON THE SECRETORY ACTIVITY OF
PORCINE OVARIAN GRANULOSA CELLS
246
MEDVEĎOVÁ Marína 1, KOLESÁROVÁ Adriana 1, CAPCAROVÁ Marcela 1, LABUDA Roman 3, SIROTKIN
2
1
1
Alexander V. , KOVÁČIK Jaroslav , BULLA Jozef
COMPARISON OF CHOSEN COMPONENTS OF FRUITS AND VEGETABLES FROM THE
TRADITIONAL AND ECOLOGICAL CULTIVATION
PASTERNAKIEWICZ Anna *, KRÓL Wioleta *, DŽUGAN Małgorzata *, KLUZ Maciej
ESTROGENIC AND ANTIESTROGENIC ACTIVITY OF TOMATO FRUITS
PINTO Barbara, SANFILIPPO Katy, CRISTOFANI Renza, REALI Daniela
THE STEP ONE REAL-TIME PCR FOR DETECTION OF SALMONELLA SPP., SALMONELLA
ENTERICA SER. TYPHIMURIUM AND ENTERITIDIS IN AXILLA OF CHICKENS
POCHOP Jaroslav, KAČÁNIOVÁ Miroslava, HLEBA Lukáš, NOVÁKOVÁ Ivana, KUNOVÁ Simona *
246
252
252
257
257
264
264
EFFECT OF GLYCEROL SUPPLEMENTATION ON BLOOD BIOCHEMICAL PARAMETERS IN EWES
269
QOJA Abdulhadi, ŠTASTNÝ Pavel
269
4
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
THEORETICAL ASPECTS OF USING BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVES IN FEED SUPPLY OF
POPULATION IN RUSSIA
277
RYAZANOVA O.A., PIROGOVA O.O.
277
APPLICATION OF THE ENZYMATIC KIT "ALKOTEST" FOR ETHANOL ASSAY IN FRUIT WINES,
SOFT DRINKS AND JUICES
282
SIBIRNY Vladimir1, KAMIOSKA-KISZKA Ewelina2, SIBIRNA Larysa1, GONCHAR Mykhailo2,3
282
THE INFLUENCE OF WILD CHAMOMILE (MATRICARIA CHAMOMILLA) ON THE
ACCUMULATION OF CADMIUM IN TISSUES AND ORGANS OF JAPANESE QUAILS
1
289
2
SKALICKÁ Magdaléna , KORÉNEKOVÁ Beáta , NAĎ Pavel
289
MYCOLOGICAL FLORA OF DOG'S SKIN - A PROBLEM OF CITY ECOLOGY
294
STOJANOV Igor, STOJANOVIČ Dragica, PUŠID Ivan, PRODANOV RADULOVIČ Jasna
294
A COMPARATIVE STUDY ON THE SENSITIVITY OF MICROBIOLOGICAL INHIBITORY TESTS
USED FOR DETECTION OF AMINOGLYCOSID ANTIBIOTIC RESIDUES IN MILK
297
SÝKOROVÁ GOFFOVÁ Z., KOŽÁROVÁ I., MÁTÉ D.
297
THE EFFECT OF DIETARY CAROTENOIDS ON IMMUNOSTIMULATION AND ANTIOXIDANT
STATUS IN JAPANESE QUAIL
302
SZABÓ Csaba, JUNG Ivett, BÁRDOS László
302
RISK OF FEEDING WHOLE BARLEY IN SHEEP
308
ŠIMKO Milan, BÍRO Daniel, JURÁČEK Miroslav, GÁLIK Branislav, PETRÁNEK Pavel
308
ANALYSIS OF RABBIT LYMPH–NODE AFTER BENDIOCARB EXPERIMENTAL
ADMINISTRATION
1
1
313
1
ŠPALEKOVÁ Eliška, MASSÁNYI Peter, HOLOVSKÁ Katarína , ALMÁŠIOVÁ Viera , PETROVOVÁ Eva , DANKO
Ján1
313
USE OF MICRONUCLEUS TEST AS BIOMARKER OF EFFECT IN THE GENOME STABILITY
STUDIES
1
2
2
ŠUTIAKOVÁ I. , KOVALKOVIČOVÁ N. , ŠUTIAK V. , TULENKOVÁ M.
1
319
METAL CONCENTRATIONS IN SEMEN OF MEN WITH FERTILITY DISORDERS
1
2
2
1
TOMAN, R. , STAWARZ, R. , FORMICKI, G. , MASSÁNYI, P. , LUKÁČ, N.
319
1
325
325
HIGHER PLANTS –USEFUL GENETIC BIOMARKERS FOR ENVIRONMENTAL HEAVY METALS
SCREENING AND MONITORING
332
TULENKOVÁ M., ŠUTIAKOVÁ I.
332
THE EFFECT OF LEAD ON THE MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF RABBIT EMBRYOS
337
TVRDÁ Eva1, KPAŽICKÁ Zuzana1, MASSÁNYI Peter1, KOLESÁROVÁ Adriana1, CHRENEK Peter2,3, MAKAREVIČ
Alexander3, LUKÁČ Norbert1
337
5
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
ASSESSMENT OF DIETARY NATURAL EXTRACT, TITRATED IN POLYPHENOLS, ON RABBIT
SPERMATOZOA MOTILITY USING CASA SYSTEM: PRELIMINARY STUDY
342
1
2
3
1
VIZZARRI F. , MASSANYI P. , ONDRUSKA L. , PALAZZO M. , CASAMASSIMA D.
1
342
INFLUENCE OF AIR POLLUTIONS ON pH-REACTION AND CONCENTRATION OF HEAVY
METALS IN SOIL AND PINE BARK PINUS SILVESTRIS L.
1
1
2
WĄTOR GABRIELA , MARKO-WORŁOWSKA MARIA , KOZIK RYSZARD , ŁACIAK TOMASZ
3
346
346
THE ROLE OF VISUAL ARTS IN ECOLOGICAL EDUCATION - WORKS OF ART SHAPING SOCIAL
SENSITIVENESS TO ECOLOGICAL PROBLEMS
355
WORŁOWSKA Magdalena*, MARKO-WORŁOWSKA Maria**
355
6
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ŃTRUKTÚRA OBLIČIEK KRÁLIKA PO EXPERIMENTÁLNEJ PERORÁLNEJ
APLIKÁCII BENDIOKARBAMÁTU
RABBIT KIDNEY STRUCTURE AFTER PERORAL BENDIOCARBAMATE
ADMINISTRATION
ALMÁŃIOVÁ Viera, HOLOVSKÁ Katarína jr., CIGÁNKOVÁ Viera
Ústav histológie a embryológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, 041
81 Košice, Slovenská republika
Abstract
Bendiokarbamate is a carbamate insecticide commonly used in agriculture. After peroral
administration it is readily absorbed by the gastrointestinal tract and rapidly metabolized by the
microsomal enzymes of the liver. After then it is rapidly excreted mainly in a form of sulfate and betaglucuronide conjugates mainly by the urinary tract, however the minor amount may be eliminated
together with the faeces. The histological structure of the rabbit kidney (breed Hyla-27) after
bendiocarbamate administration was investigated in the present work. Bendiocarbamate (96%
Bendiocarb, Bayer) in a dose 5 mg.kg-1 per day was administered for 3 days by the peroral form (the
oral LD 50 for bendiocarb in rabbits is 35-40 mg.kg-1). We noted a strong reaction of the animal
organism as the response on the submitted bendiocarbamate dose. This reaction manifested by the
acute diarrhoea with subsequent dehydration. The tissue of the kidney showed apparent focal changes
of the cortex and medulla as well. The connective tissue was strongly infiltrated by the lymphocytes,
and the blood vessels were heavy congested. With respect to the kidney parenchyma we observed
considerable changes in some cells of the proximal tubules, distal tubules and also the collecting
tubules. The mentioned cells had shrivelled nuclei and significantly disturbed cytoplasm. They
underwent the cell death and we found them exfoliated inside the lumen of the tubules. Results of this
study confirm the negative effect of bendiocarbamate on the kidney structure after peroral
administration.
Key words: kidney, morphology, rabbit, bendiocarb, insecticide
Úvod
Bendiokarbamát (bendiokarb, C11H13NO4, 2,2-dimetyl-1,3-benzodioxol-4-yl-N-metylkarbamát)
je insekticíd karbamátovej rady, ktorý sa pouņíva na ońetrovanie rastlín postrekom, na morenie osiva a
proti rozmanitým druhom hmyzu a slimákov. Vyrába sa vo forme práńku, granúl a postrekov. Tak ako
ostatné karbamátové insekticídy, aj bendiokarbamát patrí medzi reverzibilné inhibítory cholínestetázy,
(organofosfáty inhibujú acetylcholínesterázu ireverzibilne). Spomenutý enzým je potrebný na správne
fungovanie nervového systému nielen hmyzu, ale aj stavovcov. Konjugáty vznikajúce pri inhibícii
cholínesterázy sú smerované priamo na ńkodcov, ale za urĉitých okolností sa môņu stať nebezpeĉnými
aj pre ľudí a zvieratá (Danko et al., 2005).
Do organizmu sa bendiokarbamát môņe dostať tráviacim traktom, dýchacími cestami, koņou
alebo spojivkami. Hlavnými príznakmi otravy bendiokarbamátom sú nevoľnosť, slabosť, neostré
videnie, bolesti hlavy, zvracanie, nadmerná salivácia, zúņenie zreniĉiek, svalová triańka, nepokoj aņ
strata reflexov. V tkanivách sa nekumuluje a z organizmu sa pomerne rýchlo vyluĉuje. U hlodavcov sa
po perorálnom podaní bendiokarbamátu aņ 80-95 % vylúĉi do 24-48 hodín najmä moĉom, menej
fekáliami a ĉiastoĉne aj vydychovaným vzduchom (Nationale Pesticide Information Center, 2002).
V doterajńích prácach, ako vyplýva z literárnych údajov, boli preńtudované organotoxické,
ekotoxické, teratogénne, mutagénne, karcinogénne a tieņ imunosupresívne vplyvy bendiokarbamátu
a iných karbamátov (Tuĉková et al., 2005; Fleńárová et al., 2007). Potvrdil sa aj nepriaznivý vplyv
karbamátov na reprodukĉné orgány (Han et al., 2009).
V práci sme ńtudovali ńtruktúru obliĉiek dospelých králikov, ktorým bol perorálne podávaný
bendiokarbamát po dobu 3 dní.
7
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Materiál a metodika
V experimente sme pouņili 6 králikov domácich (Oryctolagus cuniculus), hybrid Hyla-27 vo
veku 54 dní, oboch pohlaví, s priemernou hmotnosťou 1250 g. Zvieratám bol kaņdý deņ po dobu 3 dní
podávaný bendiokarbamát (96% Bendiokarb, Bayer) perorálne v tobolkách v dávke 5 mg.kg-1 ņivej
hmotnosti. Reakcia organizmu na podanú dávku bendiokarbamátu bola silná a klinicky sa prejavila
hnaĉkou a dehydratáciou.
V kontrolnej skupine bolo 6 králikov s pribliņne rovnakými parametrami ako v pokusnej
skupine. Pokusné aj kontrolné zvieratá boli chované v klietkach, kŕmené granulami KK-0 10 a
mali voľný prístup k vode.
Zvieratá boli bezbolestne usmrtené v éterovej narkóze. Bezprostredne po eutanázii sme odobrali
excízy na histologické vyńetrenie. Vzorky veľkosti asi 1 mm 3 sme odobrali z kôrovej aj dreņovej ĉasti
obliĉiek a následne fixovali v 10% neutrálnom formole. Potom boli spracované beņnou metodikou
zaliatím do parafínu. Rezy hrubé 7-12 µm sme ofarbili hematoxylín – eozínom, montovali do Entelanu
a pozorovali svetelným mikroskopom Jenamed s digitálnym fotozariadením Sony.
Výsledky
V kontrolnej skupine bol morfologický obraz parenchýmu obliĉiek z kôrovej aj dreņovej ĉasti
normálny.
Po trojdņovom vplyve bendiokarbamátu sme pozorovali v obliĉkách výrazné loņiskové zmeny.
Vo väzive kôry aj drene sa nachádzali rôzne veľké infiltrácie lymfocytmi a krvné cievy boli silne
preplnené krvinkami. Zjavné morfologické zmeny sme zaznamenali aj v niektorých bunkách
proximálnych a distálnych kanálikov, ako aj zberacích kanálikov. Jadrá buniek boli scvrknuté a
cytoplazma znaĉne poruńená. Bunky odumierali, odlupovali sa a kopili v lúmene kanálikov.
Výsledky nańich pozorovaní poukazujú na nepriaznivý úĉinok bendiokarbamátu na ńtruktúru
obliĉiek.
Diskusia
Karbamáty sa v tkanivách cicavcov nekumulujú a z tela sú relatívne rýchlo vylúĉené. Po
absorbcii v gastrointestinálnom aparáte sa rýchlo metabolizujú v peĉeni, kde dochádza k ich
detoxikácii a exkrécii. Pri metabolických premenách ĉasto vznikajú produkty so silnejńím toxickým
úĉinkom, ako mala pôvodná cudzorodá látka. Bendiokarbamát sa hydrolyticky ńtiepi na
metylkarbamát a heterocyklickú zlúĉeninu (2,2-dimetyl-1,3-benzodioxol-4-ol), alebo sa oxiduje na 7hydroxybendiokarb. U potkanov je hlavným metabolitom prítomným v moĉi fenol, ktorý je
vyluĉovaný ako beta-glukuronid a sulfátový konjugát (Bendiokarb, 1982; Challis a Adrock, 2006).
Práve produkty týchto metabolických premien sa môņu podieľať na celkovej toxicite karbamátov.
Podľa údajov National Pesticide Information Center (2002) sa po orálnej aplikácii hlodavcom vylúĉi
do 24-48 hodín aņ 80-95% bendiokarbamátu. Vyluĉuje sa hlavne moĉom (89-90%), fekáliami (3-8%)
a minimálne mnoņstvo vydychovaným vzduchom (2%). Zmeny aktivít superoxid dismutázy, katalázy,
glutation peroxidázy a obsah reaktívnych látok kyseliny tiobarbiturovej v peĉeni, obliĉkách, slezine
a týmuse ale nepoukazujú na rýchle metabolizovanie a vyluĉovanie bendiokarbamátu z organizmu
(Sobeková et al., 2009). Jeho dlhodobé podávanie králikom vyvolalo výraznú supresiu funkĉných
aktivít lymfocytov a fagocytov, leukopéniu, neutropéniu a relatívnu lymfocytózu (Mojņińová, 2004).
Podľa viacerých autorov toxický úĉinok cyklických organických zlúĉenín je zapríĉinený
zvýńenou tvorbou reaktívnych kyslíkových radikálov (Kimáková et al., 2009). Sobeková et al.,. (2009)
predpokladajú, ņe práve signifikantné zvýńenie superoxid dismutázy v obliĉkách a kyseliny
tiobarbiturovej v peĉeni pońkodzuje aktivitu obranného antioxidaĉného systému a toxický úĉinok
bendiokarbamátu nespoĉíva len v inhibícii acetylcholínesterázy, ale tieņ v produkcii voľných
kyslíkových radikálov. Vplyv organofosfátu VX na inhibíciu cholinesterázy v erytrocytoch a rôznych
tkanivách a orgánoch potkanov, ako aj protektívny úĉinok zeolitu zaznamenali Mojņiń et al. (1994).
Záver
Nami zistené histologické zmeny na niektorých bunkách proximálnych, distálnych a zberacích
kanálikov svedĉia o nepriaznivom vplyve bendiokarbamátu na obliĉky králikov. Výrazné zmeny na
jadre a cytoplazme svedĉia o bunkovom odumieraní pravdepodobne formou nekrózy. Rozńírené, silne
8
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
preplnené krvné cievy a výrazná lymfocytárna infiltrácia väziva svedĉia o zápalovom procese.
Reakcia organizmu zvierat na podanú dávku testovaj látky bola silná a klinicky sa prejavila hnaĉkou
a dehydratáciou.
Predpokladáme, ņe opísané morfologické zmeny vznikli následkom toxického pôsobenia
metabolitov bendiokarbamátu, ako aj oxidatívnym stresom v dôsledku zvýńenej tvorby voľných
kyslíkových radikálov.
V rámci detailnejńieho ńtúdia zmien v obliĉkách spôsobených perorálnym podaním
bendiokarbamátu sa v budúcnosti zameriame na analýzu ultrańtuktúry buniek na úrovni transmisnej
elektrónovej mikroskopie.
Literatúra
BENDIOKARB, C.O. 1982. Pesticide residues in food. 1982 evaluations, file:
//E:\Lymfatic\legath\carbamates\bendiocarb.htm
DANKO, J. – LEŃNÍK, F. – JENĈA, A. et al. 2005. Xenobiotiká vo vzťahu ku zdraviu. Końice :
Univerzita veterinárskeho lekárstva, 2005, 105 s. ISBN 80-8077-015-8.
FLEŃÁROVÁ, S. – LUKÁĈ, N. – DANKO, J. – MASSÁNYI, P. 2007. Bendiocarbamate induced
structural alterations in rabbit thymus after experimental peroral administration. In J. Environ. Sci.
Health, Part B Pesticides, Food Contaminants and Agricultural Wastes, vol. 42, 2007, no. 3, pp. 329334.
HAN, J. – PARK, M. – KIM, J.H. – KIM, A. – WON, M. – LEE, D.R. – KO, J.J. – SIM, S.H. - LEE,
K. – BAE, J. 2009. Increased expression of the testicular estrogen receptor alpha in adult mice
exposed to low doses of methiocarb. In J. Appl. Toxicol., vol. 29, 2009, pp. 446-451.
CHALLIS, I.R. – ADCOCK, J.W. 2006. The metabolism of the carbamate insecticide bendiocarb in
the rat and in man. In Pesticide Sci., vol.12, 2006, no. 6, pp. 638-644.
KIMÁKOVÁ, T. – PORÁĈOVÁ, J. – DOPIRÁKOVÁ, T. 2009. The extent of risk of using natural
antioxidants from region with ecological load in East Slovakia. In Planta Medica, vol. 75, 2009, no. 9,
p.
982.
MOJŅIŃOVÁ, J. 2004. The changes of the immunological and haematological parameters in rabbits
after bendiocarbamate application (In Slovak) In Eds. Danko J., Lešník F. Proc. Agrochem.
Morphogen., 2004, Końice: UVM, p. 37.
MOJŅIŃ, J. – NIŃTIAR, F. – KOVÁĈ, G. 1994. Tissue and erythrocyte cholinesterase inhibition and
protection by clinoptiloite pretreatment. In Veter. Hum. Toxicol., vol. 36, 1994, no. 6, pp. 533-535.
PETROVOVÁ, E. – SEDMERA, D. – MÍŃEK, I. – LEŃNÍK, F. – LUPTÁKOVÁ, L. 2009.
Bendiokarbamate toxicity in the chick embryo. In Folia Biologica, vol. 55, 2009, no. 2, pp. 61-65.
PETROVOVÁ, E. – SEDMERA, D. – LEŃNÍK, F. – LUPTÁKOVÁ, L. 2009. Bendiokarb effect on
liver and central nervous system in chick embryo. In J. Environ. Sci. Health, Part B Pesticides, Food
Contaminants and Agricultural Wastes, vol. 44, 2009, no. 4, pp. 383-388.
SOBEKOVÁ, A. – HOLOVSKÁ, K. – LENÁRTOVÁ, V. – FLEŃÁROVÁ, S. – JAVORSKÝ, P.
2009. The another toxic effect if carbamate insecticides. In Acta Biologica Hungarica, 2009, vol. 60,
no. 1, pp. 45-54.
TUĈKOVÁ, M. – DANKO, J. – BÁTOR, R. 2005. Öĉinok bendiokarbamátu na vnútorné prostredie
králikov. In Eds. Danko J., Lešník F., Jenĉa A. a kol. Xenobiotiká vo vzťahu ku zdraviu. Końice :
Univerzita veterinárskeho lekárstva a LF UPJŃ, 2005, s. 35-40, ISBN 80-8077-015-8.
Kontaktná adresa
MVDr. Viera Almáńiová, PhD.
Östav histológie a embryológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie,
Komenského 73, 041 81 Końice, Slovenská republika
9
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
DRUHOVÁ IDENTIFIKÁCIA SLADKOVODNýCH RÝB AKO POTENCIÁLNYCH
POTRAVINOVÝCH ALERGÉNOV
THE SPECIES IDENTIFICATION OF FRESHWATER FISH AS A POTENTIAL
FOOD ALLERGENS
BAJZÍK Pavol, ŅIDEK Radoslav, GOLIAN Jozef, BELEJ Ľubomír
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra
hygieny a bezpeĉnosti potravín, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika
Abstract
The need for identification of fishery products in food is currently ongoing issue for both consumers
and
producers
of
food.
Consumer
interest
is
driven
in
one
the healthy diet, which prefers fish products, as an indispensable ingredient
food and on the other hand, is a potential allergen causing health problems in humans
allergic to fish protein. Allergy is a phenomenon that significantly affects human health, as well as
overall life expectancy of an individual. The large number of fish species are known to trigger allergic
reactions directly food intake or inhalation of fumes only, depending on the sensitivity orgamizmu.
Large quantity of fish allergens are proteins from the stock protein to enzymes.
Key words: allergy, PCR, freshwather fish, identification
Úvod
Alergia je jav, ktorý výrazne ovplyvņuje ľudské zdravie ako aj celkovú dĺņku ņivota jedinca.
Prevaņná ĉasť populácie znáńa rôzne druhy potravín bez akýchkoľvek zdravotných problémov.
U malého percenta ľudí urĉité druhy potravín môņu vyvolať negatívne reakcie, v rozmedzí od ľahkého
zaĉervenania koņe aņ po fatálne, ņivot ohrozujúce alergické reakcie (Rimárová, Lovayová, 2007).
Potravinová alergia je forma potravinovej intolerancie, ktorá sa prejavuje abnormálnou imunologickou
reakciou na ńpecifickú potravinu alebo prísadu, ktorá nie je fyziologickej povahy (Rujner, Cichanska,
2006).
Alergické reakcie na potraviny sú významným lekárskym problémom v celom
industrializovanom svete. Postihujú veľkú ĉasť ľudskej populácie, najviac postihnutými sú vńak deti
(Dreskin, 2006; Sicherer et al., 2003).
Prakticky ńtvrtina ľudí na svete trpí nejakou formou intolerancie, prevalencia a závaņnosť
ochorení stále narastá. Táto skutoĉnosť má vplyv ako na potravinársky priemysel, tak na spotrebiteľa,
ktorý má právo dozvedieť sa o výrobku ĉo najviac na základe deklarovaného zloņenia na jeho obale
(Woods et al., 2002).
Ryby sa dávajú do súvislosti s prípadmi úmrtí v dôsledku anafylaktických reakcií. Výskyt alergií
na ryby je ĉastejńí v oblastiach, kde je ich spotreba nadpriemerná. Napr. alergia na tresku je
najĉastejńia potravinová alergia v ńkandinávskych krajinách. Hlavným alergénom tresky je Gad c 1.
Patrí do skupiny proteínov svaloviny známych ako parvalbumíny. Parvalbumíny regulujú vstup
vápnika do buniek i jeho výstup. V svalovine iných druhou rýb, napr. kapra a ńťuky boli zistené
ńtrukturálne príbuzné parvalbumíny, priĉom zhoda s Gad c 1 sa odhaduje na cca 34 %. Obsah Gad c 1
v ĉerstvej bielej svalovine tresky je 0,05 – 0,1 %. Minoritnými alergénmi rýb sú protaminsulfát
a surimi 63-kDa proteín. Varenie, alebo konzervovanie zniņuje alergenicitu rýb (Renĉová, 2006).
Okrem moņných ekonomických strát, správny druh identifikácie je dôleņitý pre spotrebiteľov,
aj pre iné dôvody, ako sú poņiadavky na zdravotný stav osôb, ktoré môņu mať konkrétne potravinové
alergie, alebo náboņenské a diétne obmedzenia. Na zistenie týchto podvodov a ochranu spotrebiteľa je
potrebný vývoj spoľahlivých a jednoduchých nástrojov, ktoré uľahĉia rutinnú kontrolu v celom
potravinovom reťazci (Verkaar, Nijman, Boutaga 2002).
Metódy pre identifikáciu rýb sú tieņ zaloņené na analýze DNA. V porovnaní s bielkovinovo
zaloņenými technikami, DNA techniky sa ukázali byť spoľahlivé, pretoņe DNA je stabilná za
10
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
podmienok vysokej teploty, tlaku a chemickom ońetrení pouņívaných pri príprave niektorých potravín
(Arslan, Ilhak, Calicioglu, 2006).
Molekulárne techniky vyvinuté v posledných dvoch desaťroĉiach umoņnili rozvoj autentických
a spoľahlivých metód na druhovú identifikáciu rýb. Tieto techniky sú sľubné a môņu prekonať
nevýhody mnohých konvenĉných metód. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je najĉastejńie
pouņívanou technikou v mnohých oblastiach molekulárnej biológie z dôvodu jej citlivosti,
ńpecifickosti a schopnosťi detegovať aj jednu kópiu DNA sekvencie z jedinej bunky vzorky (Chikuni,
Tabata, Kosugiyama, 1994).
Na základe variability mtDNA kaprovitých rýb bol navrhnutý analytický nástroj na detekciu
druhovo ńpecifickej DNA kapra obyĉajného (Caprinus carpio). Vzhľadom na poĉetnú medzidruhovú
variabilitu v genóme kapra obyĉajného bol navrhnutý univerzálny marker na identifikáciu druhu vo
vńetkých líniach. Navrhnutý marker je schopný identifikovať a detegovať proteíny rýb aj v tepelne
upravených potravinách, pretoņe mtDNA sa na rozdiel od jadrovej DNA nedenaturuje, ale len
fragmentuje (Baņárová, 2009).
V práci sme sa zamerali na navrhnutý molekulárno – genetický marker kapra obyĉajného
(Caprinus carpio), ktorý pochádza z mtDNA kontrolovanej D – loop oblasti. Zo vzoriek rýb sme
izolovali DNA, ktorú bola amplifikovaná pomocou PCR reakcie s pouņitím primerov Carp1 – F a
Carp1 – R. Na agarózovom géli sme vizualizovali PCR produkty.
Materiál a metodika
DNA sme izolovali z 15 – tich druhov sladkovodných rýb a pracovali sme podľa protokolu na izoláciu
ĉistej DNA z jedla.
Tab. 1 Vybrané druhy rýb
Ĉíslo vzorky
Slovenský názov
Latinský názov
1.
Pstruh potoĉný
Salmo trutta fario
2.
Hlaváĉ pásoplutvý
Cottus poecilopus
3.
Lipeņ tymiánový
Thymallus thymallus
4.
Pstruh dúhový
Oncorhynchus mykiss
5.
Sumĉek ĉierny
Ameiurus melas
6.
Öhor sťahovavý
Anguilla anguilla
7.
Ńťuka severná
Esox lucius
8.
Sumec veľký
Silurus glanis
9.
Jeseter malý
Acipenser ruthenus
10.
Ostrieņ rieĉny
Perca fluviatilis
11.
Pleskáĉ vysoký
Abramis brama
12.
Jalec hlavatý
Leuciscus cephalus
13.
Mrena severná
Barbus barbus
14.
Podustva severná
Chondrostoma nasus
15.
Pstruh dúhový
Oncorhynchus mykiss
16.
Kapor obyĉajný (pozitívna kontrola)
Caprinus carpio
17.
Destilovaná voda (negatívna kontrola)
11
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Teplotný a časový reņim PCR reakcie
Teplotný a ĉasový reņim PCR ovplyvņuje úspeńnosť amplifikácie a výťaņok PCR produktu.
Amplifikácia DNA bola realizovaná pomocou Mini Personal Thermal Cyceler BioRAD
termocykléra. Prístroj zabezpeĉuje správne striedanie teplôt a ĉasu pri ohrievaní i chladení reakĉnej
zmesi poĉas prísluńných cyklov.
Tab. 2 Teplotný profil reakcie
Poĉet cyklov
Teplota
Ĉas
Ńtart
1x
94°C
2 min
Denaturácia
94°C
45 sek
Annealing
40x
61°C
45 sek
Polymerizácia
72°C
1,5 min
Elongácia
1x
72°C
10 min
Schladzovanie
1x
20°C
5 sek
Detekcia PCR produktu
PCR produkty sa môņu vizualizovať rôznymi farbivami. Medzi najpouņívanejńie farbivá patria
etídiumbromid, Red®, SYBR®Green, alebo sa pouņíva na farbenie striebrom. Fluorescenĉné farbiĉky
reagujú s DNA a následne po vystavení UV svetlu fluoreskujú.
Nevýhodou pouņívania etídiumbromidu je jeho toxicita a z toho dôvodu je nutné dodrņiavať
bezpeĉnosť pri práci.
Vyizolovaná DNA sa vizualizuje v agarózovom géli pomocou fluoreskujúceho etídiumbromidu.
Táto metóda sa zaraćuje medzi najĉastejńie metódy vizualizácie.
Výsledky a diskusia
Vizualizácia DNA v agarózovom géle
Vyizolovanú DNA vzoriek rýb sme amplifikovali PCR reakciou s pouņitím navrhnutých
primerov. Kaņdú vzorku sme následne napipetovali do prísluńných komôrok v agarózovom géle
s pouņitím etídiumbromidom a vizualizovali pomocou transiluminátora (obrázok 1).
Vpravo vidíme rozvrstvenie hmotnostného markera (M) (obr. 1). V prvej dráhe sa nachádzala
vzorka DNA pstruha potoĉného, ktorý nereagoval s navrhnutými primermi. Druhá dráha obsahovala
vzorku DNA hlaváĉa pásoplutvého reagujúceho negatívne. V tretej dráhe bola napipetovaná vzorka
DNA lipņa tymiánového, výsledkom bola negatívna reakcia. Ńtvrtá dráha s DNA pstruh dúhového,
mala pozitívnu reakciu. Dráha päť so vzorkou DNA sumĉeka ĉierneho a dráha ńesť so vzorkou DNA
úhora sťahovavého boli negatívne. DNA vzoriek ńťuky severnej v dráhe sedem a sumca veľkého
v dráhe osem, vykazovali pozitívnu reakciu. Keć porovnáme vizuálne vzorku DNA ńťuky a sumca na
agarózovom géle, vidíme, ņe napriek pozitívnemu výsledku oboch vzoriek, vizualizovaná DNA ńťuky
severnej bola výraznejńia. Pre vzorky DNA jesetera malého v dráhe deväť, ostrieņa rieĉneho v dráhe
desať, pleskáĉa vysokého v dráhe jedenásť a jalca hlavatého v dráhe dvanásť, bola výsledná reakcia
negatívna. Dráha trinásť so vzorkou DNA mreny severnej a dráha ńtrnásť so vzorkou DNA podustvy
severnej vykazovali pozitívnu reakciu, hoci vzorka mreny severnej je výraznejńia oproti vzorke DNA
podustvy. V päťnástej dráhe vzorka DNA pstruha dúhového mala negatívnu reakciu. Dráha ńesťnásť
s obsahom vzorky DNA kapra obyĉajného, oznaĉovanej aj ako pozitívna kontrola, vykazovala
najvýraznejńiu pozitívnu reakciu. Do sedemnástej dráhy bola napipetovaná destilovaná voda, oznaĉená
ako negatívna kontrola, namiesto DNA.
12
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
12
11
10
9
8
7
17
6
5
16
4
15
3
14
2
1
13
M
M
Obr. 1 Vizualizácia na agarózovom géli
Dráhy v elektroforetickom gély sú nasledovné: dráha M: 100 bp ladder hmotnostný ńtandard,
dráha 1: vzorka 1, dráha 2: vzorka 2, dráha3: vzorka 3, dráha 4: vzorka 4, dráha 5: vzorka 5, dráha 6:
vzorka 6, dráha 7: vzorka 7, dráha 8: vzorka 8, dráha 9: vzorka 9, dráha 10: vzorka 10, dráha 11:
vzorka 11, dráha 12: vzorka 12, dráha 13: vzorka 13, dráha 14: vzorka 14, dráha 15: vzorka 15, dráha
16: vzorka 16, dráha 17: vzorka 17.
V tabuľke 3 môņeme vidieť kríņovú reakciu vzoriek s ĉíslami: 4 (pstruh dúhový), 7 (ńťuka
severná), 8 (sumec veľký), 13 (mrena severná) a 14 (podustva severná) s navrhnutými primermi.
Vzorka 16 bola oznaĉená ako pozitívna kontrola (obsahovala DNA kapra obyĉajného, pre ktorého boli
dané primery navrhnuté) a vzorka 17 ako negatívna kontrola, do ktorej sa namiesto DNA napipetovala
destilovaná voda.
PCR metódy vrátane komerĉných kitov sú vhodné na zistenie autenticity rýb a rybích
produktov, ĉo dokázal vo svojej práci Gil (2007) a podľa neho sa dajú pouņiť pri ochrane zákazníka
pred falńovanými výrobkami.
Lin (et al., 2007) pouņil úspeńne metódu PCR – RFLP na idnetifikáciu ôsmych druhov tuniaka
pomocou génu mitochondriálneho cytochrómu b aj Pardo (et al., 2004) vo svojej práci uvádza
moņnosť vyuņitia nested primer PCR – RFLP pri autentifikácii tuniaka obyĉajného v náleve, oleji,
nakladaného v octe, udeného alebo doplneného korením a omáĉkou spracovaného konzervárenským
priemyslom.
13
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tab. 3 Výsledok vizualizácie na agarózovom géle
Ĉíslo vzorky
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Ĉíslo vzorky
13.
14.
15.
16.
17.
Výsledok
cross reakcia
+
+
+
Výsledok
cross reakcia
+
+
+
-
Záver
Touto prácou sme chceli zistiť, ĉi pomocou ńpecificky navrhnutého molekulárno – genetického
markera je moņná len identifikácia kapra obyĉajného, alebo daný marker reaguje aj s inými druhmi
rýb. Zamerali sme sa na 15 druhov sladkovodných rýb a zistili sme, ņe ńtyry reagujú pozitívne a to
ńťuka severná, sumec veľký, mrena severná a podustva severná. Naopak negatívnu reakciu sme zistili
u pstruha dúhového, hlaváĉa pásoplutvého, lipņa tymiánového, sumĉeka ĉierneho, úhora sťahovavého,
jesetera malého, ostrieņa rieĉneho, pleskáĉa vysokého
a jalca hlavatého. V ńtvrtej aj pätnástej
dráhe bola pouņitá DNA pstruha dúhového, ale výsledky vyńli rozdielne. DNA v ńtvrtej dráhe
reagovala s navrhnutými primermi, teda výsledok bol pozitívny, ĉo je zachytené na obrázku 3 ako
prúņok. Zatiaľ ĉo DNA pstruha v dráhe pätnástej vykazovala negatívny výsledok s navrhnutými
primermi. Aj napriek trom opakovaniam nám vyńli výsledky presne rovnaké. Na základe potvrdených
výsledkov vizualizácie DNA pstruha potoĉného môņeme hovoriť o jeho indiferentnosti, prípadne
o zmene v genotype.
Poďakovanie
Práca bola podporená grantom VEGA 1/0619/10 Bezpeĉnosť vybraných potravín vo vzťahu k ich
autentifikácii, hygienickým ńtandardom a zdraviu ĉloveka.
Literatúra
ARSLAN, A., - ILHAK, O. I:, - CALIGIOGLU, M. 2006. Effect of method of cooking on
identification of heat procesed beef using polymerase chain reaction (PCR) technique. In: Meat
Science, 72, p. 326-330
BAŅÁROVÁ, I. 2009. Vytvorenie molekulárno – genetického markera na detekciu prítomnosti
alergénu kaprovitých rýb v potravinách. Diplomová práca. Nitra, SPU, 2009, 65s.
DRESKIN, S. C. 2006. Genetics of food allergy. Current Allergy and Asthma Reports, 6, 2006, p. 5864.
GIL, L. A. 2007. PCR-based methods for fish and fishery products authentication. Food
Science & Technology, roĉ. 18, 2007, s. 558 – 566
14
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
CHIKUNI, K. - TABATA, T. - KOSUGIYAMA, M. - MOMMA, M. - SAITO, M., 1994. Polymerase
chain reaction assay for detection of sheep and goat meats. Meat Science, 37(3),337–345
LIN, W. F. – HWANG, D. F. 2007. Application of PCR – RFPL analysis on species identification of
cannes tuna. In Food Control, roĉ. 18, 2007, s. 252 – 261
PARDO, M. A. – BERGOÑA, P. – V. 2004. Identification of commercial canned tuna species by
restriction site analysis of mitochondrial DNA products obtained by nested primer PCR. Food
Chemistry, roĉ. 86, 2004, s. 143 – 150
RIMÁROVÁ, K. – LOVAYOVÁ, V. 2007. Alergény a lepok v potravinách, prístupy k ich detekcii
a oznaĉovaniu v EÖ. In: HYGIENA ALIMENTORUM XXVIII „Bezpeĉnosť a kvalita mlieka
a mlieĉnych výrobkov“. Slovakia : Ńtrbské Pleso – Vysoké Tatry, 2007, s. 165-169. ISBN 978-808077-055-6.
RENĈOVÁ, E. 2006. Potravinové alergeny a vhodné metody pro jejich stanovení. In: XXXVI.
LENFELDOVY A HÖKLOVY DNY Konference o hygieně a technologii potravin. Brno : Veterinární a
farmaceutická univerzita, 2006, s. 32-35. ISBN 80-7305-570-8.
RUJNER, J. – CICHANSKA, B. A. 2006. Bezlepková a bezmléĉná dieta. Brno: Computer Press.
2006, 108s. ISBN 80-251-0775-2.
SICHERER, S. H. – MUNOZ-FURLONG, A. – MURPHY, R. – WOOD, R. A. – SAMPSOM, H. A.
2003. Symposium. Pediatric food allergy, 111, 2003, p. 1591-1594.
VERKAAR, E. L. C., NIJMAN, I. J., BOUTAGA, K., LENSTRA, J. A. (2002). Differentiation of
cattle species in beef by PCR-RFLP of mitochondrial and satellite DNA. Meat Sci. 60, 365-369.
WOODS, R. K. – THIEN, F. – RAVEN, J. – WALTERS, E. H. – ABRAMSON, M. 2002. Prevalence
of food allergies in young adults and their relationship to asthma, nasal allergies, and eczema. Annals
of Allergy Asthma & Immunology, 88, 2002, p. 183-189.
Kontaktná adresa
Ing. Pavol Bajzík
Katedra hygieny a bezpeĉnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, Tr. A.
Hlinku 2, 949 01 Nitra
 [email protected]
15
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
FRAGMENTÁCIA DNA V JELEŇOM MÄSE VPLYVOM RÔZNYCH DÔB
VARENIA
DNA FRAGMENTATION IN DEER MEAT THE INFLUENCE OF VARIOUS
COOKING TIMES
BELEJ Ľubomír , ŅIDEK Radoslav, GOLIAN Jozef, BARNOVÁ Miroslava
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra
hygieny a bezpeĉnosti potravín, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika
Abstract
Nutrition and biological value of wild animal meat is treated higher than farm animals. By heating
process are destoryed nucleotic acids in different levels (partionally or fully). Residuals of DNA are
one of the most important factors for detection, tracebility and reverse authentication of deer meat. In
this project we isolated DNA from deer processed meat and analysed by electrophoresis. Goal of the
study was compute ratio between raw meat and several heat processed deer meat. Samples were
prepared by boiled heat treatment techniques in different time intervals. In technological adjustments
highest amount of DNA and 1927 ng, so the total yield of 192,7 ng.μl-1 was observed in the sample we
cooked for two hours at boiling temperature.
Key words: deer meat, DNA, electrophoresis, traceability, authentication
Úvod
V poslednej dobe vzrástol záujem spotrebiteľov o divinu (zverinu). Jedná sa totiņ o ekonomicky
významný produkt poľovníctva a pre svoj vysoký obsah bielkovín, nízky obsah tuku s vysokým
zastúpením nenasýtených mastných kyselín je vhodnou súĉasťou modernej výņivy ĉloveka. Má aj
vysoký obsah minerálnych látok a vitamínov, pomerne nízky obsah cholesterolu a obsahuje viac
ĉervených svalových vlákien ako mäso hospodárskych zvierat, takņe je aj jemnejńie. Jej energetická
hodnota je niņńia ako pri mäse hospodárskych zvierat a jej dietetické vlastnosti sú veľmi pozitívne
(Hell et al., 2005).
Divina sa pokladá za biologický hodnotnejńiu potravinu ako mäso jatoĉných zvierat. Vlastnosti
a zloņenie diviny ovplyvņuje druh, pohlavie, vek, ņivotné prostredie (Stevenson, Seman, Littlejohn,
1992; Volpelli et al., 2002) a spôsob ņivota, vrátane výņivy zvierat (Smetana et al. 1979)
Vćaka svojmu relatívne nízkemu obsahu tuku patrí divina k druhom mäsa najbohatńím na
bielkoviny. Obsahom bielkovín predstihuje dokonca aj nańe hospodárske zvieratá. Okrem toho sú
v divine bielkoviny mimoriadnej hodnoty, tzn. ņe vykazujú vysokú stráviteľnosť v prospech výstavby
vlastných bielkovín ĉloveka. Svalové vlákna v divine sú jemnejńie ako v mäse hospodárskych zvierat
tzn. ņe sú veľmi nahustené, pretoņe aponeurózy, ĉo sú plońne rozńírené ńľachy jednotlivých svalových
vlákien, sú nimi tesne obklopené (Winkelmayer, 2004).
Pretoņe mäso je súĉasťou ľudskej výņivy, má byť nutriĉne hodnotené zo vńetkých aspektov
výņivy. Mäso má byť posudzované ako potravina, ktorá ĉloveku poskytuje nielen vńetky potrebné
výņivové zloņky, ale ĉasto tieņ neņiaduce látky (Chudý et al., 2000). Pojem kvalita mäsa nie je vo
svete chápaný jednoznaĉne, pretoņe v jednotlivých ńtátoch sú rôzne kritéria na kvalitu mäsa. Väĉńina
autorov rozdeľuje pojem kvalita mäsa na ĉasť objektívnu, ktorú moņno stanoviť merateľnými
chemickými a fyzikálnymi metódami a na subjektívnu ĉasť, hodnotiteľnú zmyslovými orgánmi
ĉloveka, priĉom koneĉné zhodnotenie subjektívnej zloņky kvality mäsa je ovplyvnené tieņ cenou,
dostupnosťou mäsa a nutriĉnou hodnotou (Chudý et al., 2000). Pod kvalitou mäsa rozumieme súhrn
vńetkých senzorických, spracovateľsko-technických, výņivno fyziologických a hygienickotoxikologických vlastností mäsa (Hofmann, 1994).
Makromolekuly izolovanej DNA sa svojimi vlastnosťami podstatne líńia od ostatných
biopolymerov, hlavne bielkovín, tak aj od syntetických biopolymerov. Základné faktory
charakterizujúce túto odlińnosť sú obrovská molekulová hmotnosť DNA a relatívna tuhosť ich
lineárnej molekuly, daná povahou ich dvojzávitnicovej konfirmácie. Z tohto charakteru potom
16
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
vyplývajú makromolekulové vlastnosti DNA in vitro. Pri izolácií a manipulácií s DNA dochádza k
mechanickej (ĉasto aj enzýmovej) degradácií, takņe urĉenie molekulovej hmotnosti DNA je veľmi
ťaņké (Vodráņka, 1999). DNA je chemickým podkladom dediĉnosti. Je organizovaná do génov,
základných jednotiek genetickej informácie. Gény riadia syntézu rôznych typov RNA, z ktorých
väĉńina zasahuje do syntézy proteínov (Murray et al., 2002).
Poĉas spracovania dochádza k fragmentácii DNA, priĉom obsah DNA (vrátane nukleotidov) nie
je zväĉńa ovplyvnený. Vznikajú rôzne veľké fragmenty, priĉom ich veľkosť je nepriamo úmerná ĉasu
opracovania potravinovej matrice (Klein et al., 1998). Degradácia DNA je závislá od podmienok,
ktoré vznikajú poĉas výrobného procesu a od potravinovej matrice, ktorej je súĉasťou. Degradáciu
DNA ovplyvņujú vnútorné faktory ako sú zloņky potravín, pH, nukleázy a exogénne faktory napr.
spracovanie, uskladnenie potravín. Vzhľadom na veľkú variabilitu týchto faktorov je zrejmé, ņe rozsah
degradácie pre konkrétny potravinový produkt sa nedá predpovedať (Bauer et al., 2004).
Agarózová elektroforéza patrí medzi jednoduché, pomerne rýchle metódy na izoláciu,
identifikáciu a preĉistenie fragmentov DNA (Holme et al., 1998). Produkty reńtrikĉných alebo
amplifikaĉných reakcií sa delia podľa svojej relatívnej molekulovej hmotnosti a veľkosti náboja
agarózovou elektroforézou DNA fragmentov v géle (Sambrook et al. 1989).
Materiál a metodika
Vzorky mäsa sme nakrájali na kocky rovnakej veľkosti 2,5 cm. Vzorky boli skladované v
mraziacom boxe pri teplote –18 °C do nasledujúceho dņa, kedy sme vzorky tepelne upravovali
rôznymi spôsobmi. Vzorky mäsa sme rozdelili do troch varných kadiĉiek a zaliali 100 ml destilovanej
vody, následne sme vzorky mäsa varili jednu, dve a tri hodiny.
DNA z tkanív sme izolovali pomocou NucleoSpin®Food Isolation Kit (MachereyNagel,Germany).
Kvalitu extrahovanej DNA sme stanovovali elektroforeticky v 1 % agarozóvom géli. Gél sme si
rozpustili v mikrovlnnej rúre pri teplote 130 °C po dobu 1,5 minúty. Po rozpustení gélu sme do varnej
kadiĉky naliali destilovanú vodu aby sme dosiahli obsah 100 ml. Opäť sme takto pripravený gél
zohrievali 1,5 minúty pri teplote 130 °C. Celý proces sme opakovali 2x. Takto tepelne upravený gél
sme vychladili pod studenou teĉúcou vodou. Po vychladení sme do gélu pridali 10 μl etídium
bromidu, jedná sa o interkalaĉnú látku, ktorá sa pouņíva pri vizualizácii fragmentov DNA. Dokáņe sa
vĉleniť medzi nukleotidy DNA a pri pouņití UV transiluminátora dochádza k vizualizácii DNA a jej
ńpecifických fragmentov. Na mastný papierik sme si po kvapkách veľkosti 3 μl naniesli nanáńaciu
farbu (Loading Dye Solution,6X Mass Ruler) a dve kvapky veľkosti 3 μl Fast ruller DNA. Jedna sa o
farbu, ktorá nám v konĉenom dôsledku zobrazí 5 fragmentov bázových párov, na základe ktorých sme
urĉovali intenzitu pońkodenia DNA. Jednu kvapku nanáńacej farby sme premieńali s kvapkou Fast
ruller DNA a naniesli do gélu do prvej kolónky a rovnako druhu kvapku farby sme naniesli do
poslednej kolónky. Rovnako sme postupovali pri nanáńaní vzorky. Na gél sme naniesli 10 μl DNA
vzorky s pridaním 2,9 μl nanáńacej farby. Elektroforézu v horizontálnom usporiadaní sme uskutoĉnili
pri potenciálovom spáde 125 V/cm poĉas 45 minút. DNA sme vizualizovali UV ņiarením o vlnovej
dĺņke 312 nm. Elektroforetické gély sme zdokumentovali pomocou digitálneho fotografického
prístroja.
Tepelným opracovaním a následnou PCR reakciou sme získali podklad na gélovú elektroforézu
ktorej vyjadrením je histogram intenzity farby, ktorý sme analyzovali programom Gel-Pro Analyzer
3.1 (Media Cybernetics, USA).
17
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Výsledky
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
81%
19%
L ane 7
64
7
3
9
7
3
9
1
14
21
29
36
48
63
77
18
43
10
68
13
93
16
56
19
38
32
20
45
02
58
84
71
66
B as eline
83
96
0%
Graf 1 Grafické vyjadrenie vzorky svaloviny upravenej varom 1 hodinu (vnútro svaloviny)
Graf je vyjadrením vzorky, ktorá bola odobratá z vnútra svaloviny a upravovaná varením po
dobu jednej hodiny pri teplote varu. Výsledkom bolo zistenie celkového mnoņstva DNA v danej
vzorke, ktoré bolo 171,152 ng, to znamená, ņe celková výťaņnosť analýzy bola 17,1152 ng.μl-1 . Na
základe kalorimetrickej analýzy sme zistili mnoņstvo DNA, ktorá sa zachovala, priĉom zachovanú,
nepońkodenú, DNA sme si percentuálne vyjadrili. Dospeli sme k záverom z ktorých vyplýva, ņe 81 %
(intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) DNA z celkového mnoņstva17,1152 ng.μl-1 sa
zachovalo 13, 893 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe hodinové varenie nemalo vplyv na kvalitu DNA, získali
sme DNA vysokej kvality, ktorá sa pohybuje v rozpätí 2000-10 000 bp, takņe v takomto prípade DNA
je veľmi málo pońkodená. Z celkového mnoņstva 17,152 ng.μl-1 sa zachovalo 0 % DNA (intenzita piku
+ intenzita neńpecifického pozadia) 0 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe DNA nebola pońkodená, pretoņe
v rozpätí od 500-2000 bp sa DNA nevyskytovala. Z toho dôvodu sme nezískali DNA strednej kvality.
Výsledok 19 % (intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) znamená, ņe vo vzorke z celkového
mnoņstva 17,152 ng.μl-1 sa zachovalo 3,26 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe DNA bola veľmi pońkodená,
pretoņe sme získali DNA nízkej kvality, ktorá sa pohybovala v rozpätí 0-500 bp.
1,2
40%
47%
13%
L ane 5
1
B as eline
0,8
0,6
0,4
0,2
Graf 2
64
1
14
7
21
9
7
3
3
29
36
48
63
9
77
18
43
10
68
13
16
93
19
56
38
32
20
45
02
58
84
71
83
96
66
0
Grafické vyjadrenie vzorky svaloviny upravenej varom 2 hodiny (vnútro svaloviny)
18
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Graf 2 je vyjadrením vzorky, ktorá bola odobratá z vnútra svaloviny a upravovaná varením po
dobu dvoch hodín pri teplote varu. Výsledkom bolo zistenie celkového mnoņstva DNA v danej
vzorke, ktoré bolo 1927 ng.μl-1, to znamená, ņe celková výťaņnosť analýzy bola 192,7 ng.μl-1. Na
základe kalorimetrickej analýzy sme zistili mnoņstvo DNA, ktorá sa zachovala, priĉom zachovanú,
nepońkodenú, DNA sme si percentuálne vyjadrili. Dospeli sme k záverom z ktorých vyplýva, ņe 40 %
(intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) DNA z celkového mnoņstva 192,7 ng.μl-1 sa
zachovalo 77,08 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe dvojhodinové varenie nemalo vplyv na kvalitu DNA,
získali sme DNA vysokej kvality, ktorá sa pohybuje v rozpätí 2000-10 000 bp, takņe v takomto
prípade DNA je veľmi málo pońkodená. Z celkového mnoņstva 192,7 ng.μl-1 sa zachovalo 47 % DNA
(intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia). 90,56 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe DNA bola slabo
pońkodená, získali sme DNA strednej kvality, ktorá sa pohybovala v rozpätí 500-2000 bp. Výsledok
13 % (intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) znamená, ņe vo vzorke z celkového mnoņstva
192,7 ng.μl-1 sa zachovalo 25,051 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe DNA bola veľmi pońkodená, pretoņe sme
získali DNA nízkej kvality, ktorá sa pohybovala v rozpätí 0-500 bp.
0,8
56%
29%
15%
0,7
L ane 2
0,6
B as eline
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Graf 3
64
7
3
1
14
21
29
9
36
3
9
7
48
63
77
18
43
10
68
13
93
16
56
19
38
32
20
45
58
02
84
71
83
96
66
0,0
Grafické vyjadrenie vzorky svaloviny upravenej varom 3 hodiny (vnútro svaloviny)
V tomto prípade sa jedna o grafické vyjadrenie vzorky, ktorá bola odobratá z vnútra svaloviny
a upravovaná varením po dobu 3 hodín pri teplote varu. Výsledkom bolo zistenie celkového mnoņstva
DNA v danej vzorke, ktoré bolo 897,36 ng, to znamená, ņe celková výťaņnosť analýzy bola 89,7 ng.μl1
. Na základe kolorimetrickej analýzy sme zistili mnoņstvo DNA, ktorá sa zachovala, priĉom
zachovanú, nepońkodenú, DNA sme si percentuálne vyjadrili. Dospeli sme k záverom z ktorých
vyplýva, ņe 56 % (intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) DNA z celkového mnoņstva 89,7
ng.μl-1 sa zachovalo 50,232 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe trojhodinové varenie nemalo vplyv na kvalitu
DNA, získali sme DNA vysokej kvality, ktorá sa pohybuje v rozpätí 2000-10 000 bp, takņe v takomto
prípade DNA je veľmi málo pońkodená. Z celkového mnoņstva 89,7 ng.μl-1 sa zachovalo 29 % DNA
(intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) 26,013 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe DNA bola
slabo pońkodená, získali sme DNA strednej kvality, ktorá sa pohybovala v rozpätí 500-2000bp.
Výsledok 15 % (intenzita piku + intenzita neńpecifického pozadia) znamená, ņe vo vzorke z celkového
mnoņstva 89,7 ng.μl-1 sa zachovalo 13,455 ng.μl-1 z ĉoho vyplýva, ņe DNA bola veľmi pońkodená,
pretoņe sme získali DNA nízkej kvality, ktorá sa pohybovala v rozpätí 0-500 bp.
Záver
Z technologických úprav varením po dobu 1- 3 hodiny najvyńńie mnoņstvo DNA 1927 ng a teda
celková výťaņnosť analýzy 192,7 ng.μl-1 bola zaznamenaná u vzorky, ktorú sme upravovali varením
po dobu dvoch hodín pri teplote varu, priĉom kvalitnej a najmenej pońkodenej DNA sa z celkovej
výťaņnosti zachovalo 40 % - 77,08 ng.μl-1 (10 000-2000 bp), DNA strednej kvality 47 %- 90,56
ng.μl-1 (2000- 500 bp) a nízkej kvality 13 % - 25,05 ng.μl-1 (500 bp<).
19
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Poďakovanie
Práca bola podporená grantom VEGA 1/0619/10 Bezpeĉnosť vybraných potravín vo vzťahu k ich
autentifikácii, hygienickým ńtandardom a zdraviu ĉloveka
Literatúra
BAUER, T., WELLER,P., HAMMES, W. P., HERTEL, C. 2003. The effect of processing on the
DNA degradation in Food. European Food Research and Technology 217: 338-343.
HELL, P.- SLAMEČKA, J. – GAŃPARÍK, J.- VODŇANSKÝ, M. 2005 Zhodnotenie produkcie diviny
na Slovensku v rokoch 1969- 2004 – Valution of the production of venison in Slovakia in the years
1969 – 2004. Folia venatoria, 253 s. ISBN 80-8093-000-7
HOFMANN, K. 1994. What is quality? In: Meat Focus International, 3, 1994, ĉ. 2, s 73-82.
HOLME, D.- PECK, H. 1998. Analytical biochemistry. 3. vyd. London: Longman, 1998. 481 s. ISBN
0-582-29438-10
CHUDÝ, J. et al. 2000. Hodnotenie surovín a potravín ņivočíńneho pôvodu. Nitra: Vydavateľské a
edičné stredisko SPU, 2000. s. 204. ISBN 80-7137-692-2.
KLEIN, J., ALTENBUCHNER, J., MATTES, R. 1998. Nucleic acid and protein elimination during
the sugar manufacturing process of conventional and transgenic sugar beets. Journal of Biotechnology,
60 : 145- 153.
MURRAY, R.- GRANNER, D.- MAYES, P.- RODWELL V. 2002. Harperova biochemie. Jinočany:
H+H, 2002. 872 s. ISBN 80-7319-013-3.
SAMBROOK, J., FRITZ, E. F., MANIATIS, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual 2nd
ed., Cold. Spring. Harb. Lab. Press, USA. Vols. 1-3, 1989
SMETANA, M., KUKLA, F., HELL, P. 1979. Ońetrovanie diviny a koņí. 1. vyd. Bratislava: Príroda,
vydavateľstvo kníh a časopisov, 1979, 82 s. 64-110-79
STEVENSON, J. M., SEMAN, D. L., & LITTLEJOHN, R.P. (1992). Seasonal variation in venison
quality of mature, farmed red deer stags in New Zealand In Journal of Animal Science 70, 1389–1396
VODRÁŅKA, Z. 1999 Biochemie. Praha: Academia, 1999. 180 s. ISBN 80-200-0600-1.
VOLPELLI, L. A., VALUSSO, R., & PIASENTIER, E.(2002). Carcass quality in Male fallow deer
(Dama dama): effects of age and supplementary feeding Meat Science,60,423–427
WINKELMAYER, R. 2004. Ńpecifická kvalita diviny. In Divina dietetická zloţka výţivy moderného
človeka: zborník prednášok z medzinárodnej vedeckej konferencie. Nitra: VUŅV, 2004, 80 s.
Kontaktná adresa
Ing. Ľubomír Belej
Katedra hygieny a bezpeĉnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, Tr. A.
Hlinku 2, 949 01 Nitra
 [email protected]
20
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
VPLYV BIOAKTÍVNYCH LÁTOK NATURÁLNEHO PôVODU NA
IMUNOLOGICKÉ PARAMETRE
THE INFLUENCE OF NATURAL BIOACTIVE SUBSTANCES ON
IMMUNOLOGICAL PARAMETERS
BERTKOVÁ Izabela, PETRÁŃOVÁ Darina, BOMBA Alojz
Ústav experimentálnej medicíny Lekárskej fakulty UPJŠ, Košice, Slovenská republika
Abstract
Colon cancer is one of the most commonly diagnosed forms of cancer across the world. The
epidemiological studies and animal experiments suggested that several foods and dietary components
modify the incidence and biological behavior of tumors. The objective of our investigation was to
study the effect of probiotic and plant extract on some immunological parameters in rats with colon
cancer induced by N, N-dimethylhydrazine (DMH). We used six-month-old male and female Wistar
albino rats (n=80, with a mean body weight of 379g (range 275 - 487.5g). Two groups of animals
were fed a conventional laboratory diet (2,5% of fat) and five groups were fed high fat diet (HF)
containing 10% of fat and two weeks after beginning feeding of the experimental diets, rats were
administered with DMH at a dose of 20 mg/kg s.c., two times at week interval. For the treatment of
animals was HF diet supplemented with probiotic Lactobacillus plantarum and nutritional plant Hyppocastani extractum siccum (1% of HF diet). In the end of eight weeks experimental period rats
were anaesthetized and obtained blood serum was used for determination of tumor necrosis factor
alpha (TNFα) and interleukin-6 (IL-6) which were performed by ELISA method. Application of
probiotic microorganisms and bioactive compounds in all treated groups significantly increased serum
TNFα level (p<0.001) and decreased IL-6 level in comparison to the control rats. The work contributes
to existing knowledge in the field of probiotic and extends possibilities of effective prevention of
chronic diseases using suitable combination of probiotic microorganisms with bioactive sustances of
natural origin in nutrition.
Key words: colon cancer, high fat diet, Lactobacillus, Hyppocastani extractum, TNFα, IL-6
Úvod
Rakovina hrubého ĉreva je treťou najĉastejńie sa vyskytujúcou formou rakoviny. Príĉinou
vysokej incidencie tohto ochorenia sú exogénne a hereditárne faktory. Výskyt kolorektálneho
karcinómu závisí od geografickej polohy krajiny, veku, pohlavia a od zloņenia stravy a ņivotného
ńtýlu. Aktuálna lieĉba vrátane chemoterapie, rádioterapie a chirurgie sú spojené s vysokým rizikom
komplikácií a nie je vņdy úspeńná, preto je nevyhnutné vytvárať nové stratégie lieĉby. Výņiva zohráva
dôleņitú úlohu v prevencii nádorov modifikáciou aktivít ochranných systémov, vrátane imunitného.
V súĉasnosti sa pozornosť odborníkov obracia na identifikáciu a ńtúdium obranného úĉinku niektorých
súĉastí diéty vrátane probiotík a rastlinných extraktov. Probiotiká majú lokálny ako aj systémový
biomedicínsky úĉinok. Vykazujú inhibiĉný vplyv voĉi patogénnom, optimalizaĉný vplyv na tráviace
procesy, antitumorovú a antialergickú aktivitu (Rafter, 2004, Szabadosová et al., 2009). Je známe, ņe
probiotické mikroorganizmy majú priaznivý vplyv na sliznicu ĉreva a ĉrevný imunitný systém.
Vhodnou kombináciou probiotík a bioaktívnych látok naturálneho pôvodu moņno tento vplyv na
imunitu eńte zvýńiť. Cieľom práce bolo sledovanie úĉinku probiotika a rastlinného extraktu pagańtanu
na vybrané imunologické parametre potkanov s chemicky indukovanou karcinogenézou hrubého
ĉreva.
21
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Materiál a metodika
Do experimentu bolo zaradených 80 potkanov kmeņa Wistar (52 samcov a 28 samíc), vo veku 6
mesiacov a s priemernou hmotnosťou na zaĉiatku pokusu 379g (hmotnosti v rozsahu 275 - 487,5g).
Zvieratá boli chované v konvenĉných podmienkach na akreditovanom pracovisku LF UPJŃ, ktorý má
akreditáciu na chov a vykonávanie pokusov na zvieratách v súlade s legislatívnymi ustanoveniami
schválenými Etickou komisiou. Zvieratá prijímali Larsenovu diétu s obsahom tuku 2,5% (TOP
DOVO, Dobrá voda, SR) a vysokotukovú diétu s obsahom tuku 10% na kg krmiva (Biofer, s.r.o., SR)
a vodu ad libitum. Spotreby krmiva a vody boli denne sledované.
Pokusné zvieratá boli rozdelené do 7 experimentálnych skupín:
 1.skupina - Larsenova diéta
 2.skupina - vysokotuková diéta
 3.skupina - Larsenova diéta + DMH
 4.skupina - vysokotuková diéta + DMH
 PAG skupina - vysokotuková diéta + DMH + pagańtan
 PRO skupina - vysokotuková diéta + DMH + probiotikum
 PRO + PAG - vysokotuková diéta + DMH + pagańtan + probiotikum
Doba trvania experimentu bola 8 týņdņov, dva týņdne po jeho zaĉatí bol zvieratám v piatich
skupinách aplikovaný prokarcinogén N,N-Dimetylhydrazine (DMH - fy Merck, Nemecko) indukujúci
rakovinu hrubého ĉreva u potkanov, v dávke 20 mg.kg-1 ņ.hm., s.c., dva krát s týņdenným odstupom.
Z probiotických mikroorganizmov (PRO skupina) bol v experimente pouņitý kmeņ Lactobacillus
plantarum v dávke 3x109 CFU.ml-1 média, pripraveného za aeróbnych podmienok cez noc pri teplote
37°C. Pred podávaním boli 4 ml kultúry L. plantarum zmieńané s 36 ml odstredeného mlieka. Mlieko
s teplotou 22-25°C bolo plnené do patentných NTS fliań a podávané denne.
Na základe in vitro testovania nádorových bunkových línií bol zo spektra prírodných látok
izolovaných z lieĉivých rastlín vyselektovaný extrakt z pagańtanu pre jeho antiproliferatívne úĉinky na
nádorové bunky. Suchý extrakt z pagańtanu konského (Hyppocastani extractum siccum, Calendula,
SR) bol podávaný pokusným zvieratám v dávke 1% na kg krmiva.
Po skonĉení experimentu boli pokusným zvieratám v celkovej anestéze (Ketamín v dávke 100
mg/kg + Xylazín 15 mg/kg ņ.hm., i.p.) odobraté vzorky krvi, ktoré boli následne centrifugované 15
min pri 2500G a uchovávané pri teplote -80°C.
Na stanovenie sérových hladín faktora
nekrotizujúceho nádory (TNFα) a interleukínu 6 (IL-6) boli pouņité ELISA súpravy (Ray Biotech,
Inc., USA a Thermo Scientific, USA).
Pre porovnanie významnosti rozdielov medzi jednotlivými skupinami boli pouņité Studentov ttest a ANOVA.
Výsledky a diskusia
Priemerná hmotnosť zvierat na zaĉiatku pokusu bola 379 ± 71,75g a na konci experimentu dońlo
k minimálnemu nárastu priemernej hmotnosti na 380,4 ± 80,25g. Pri hodnotení jednotlivých skupín
sme zaznamenali pokles hmotnosti o 3,69%, 1,73% a 8,04% v skupinách 1. - 3. V ńtvrtej skupine
(kontrolnej) bol nárast hmotnosti o 2,14%. V skupinách suplementovaných o naturálne látky bol nárast
hmotnosti o 1,16% (skupina PAG), 6,92% (PRO) a 6,27% v skupine PAG+PRO.
Pri porovnaní skupín bez bioaktívnych substancií (1. vs. 3. skupina a 2. vs. 4. skupina) dońlo
k poklesu hladín TNFα ako aj IL-6 u potkanov, u ktorých bolo aplikovaný DMH (graf 1 a 2). V
pokusných skupinách zvierat, u ktorých bola diéta obohatená o extrakt z pagańtanu alebo probiotikum
sme zaznamenali ńtatisticky významne zvýńené hladiny TNFα (4,19 a 8,33 pg.ml-1 /p<0,001/)
oproti kontrolnej skupine (1,16 ± 0,23 pg.ml-1) ako ukazuje Graf 3. Priĉom najvyńńie hodnoty boli
v skupine, kde bolo probiotikum obohatené o pagańtan (PAG+PRO) - 9,74 pg.ml-1.
22
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
TNF alfa
1,8
(pg/mL)
1,5
1,2
0,9
0,6
0,3
0
1.
3.
2.
4.
Graf 1 Sérové hladiny TNFα v skupinách potkanov s diétou neobsahujúcou
bioaktívne substancie
IL-6
180
150
***
(pg/mL)
120
90
60
30
0
1.
3.
2.
4.
Graf 2 Sérové hladiny IL-6 v skupinách potkanov s diétou neobsahujúcou
bioaktívne substancie
23
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
(pg/mL)
TNFalfa
14
12
10
8
6
4
2
0
***
***
PRO
PRO+PAG
***
Kontroly
(4.skup.)
PAG
Graf 3 Sérové hladiny TNFα v skupinách potkanov s vysokotukovou diétou
obohatenou o bioaktívne látky
Sérové hladiny interleukínu-6 boli v skupinách PAG a PRO mierne zvýńené oproti kontrolnej
skupine (118,36 a 110,05 vs.98,7 pg.ml-1), naopak v skupine s dvojkombináciou suplementovaných
naturálnych látok (PAG+PRO) bola jeho hladina zníņená (graf 4).
IL-6
150
**
(pg/mL)
120
90
60
30
0
Kontroly
(4.skup.)
PAG
PRO
PRO+PAG
Graf 4 Sérové hladiny IL-6 v skupinách potkanov s vysokotukovou diétou
obohatenou o bioaktívne látky
Probiotické mikroorganizmy udrņujú sliznicu ĉreva a ĉrevný imunitný systém v stave neustáleho
imunitného dozoru vćaka ich schopnosti adherencie k bunkám ĉrevnej sliznice, ĉím znemoņņujú
osídlenie ĉreva patogénmi. Navyńe prepojenie probiotických baktérií s bunkami ĉrevného imunitného
systému (GALT) vyvoláva kaskádu signálov, ktorej výsledkom je zvýńená odolnosť ĉreva voĉi
patogénnym baktériam a alergénom. Pouņitie probiotických baktérií vedie k stimulácií neńpecifickej
imunity - stimuláciou fagocytózy, cytotoxickej aktivity a ovplyvnením produkcie cytokínov ale aj
humorálnej imunity - stimuláciou tvorby protilátok IgA a IgG a potlaĉením tvorby IgE. Expresia
cytokínov v GALT-e, vrátane TNFα, IL-6 a IL-10 môņe byť modulovaná diétou suplementovanou
o probiotiká a naturálne látky. Sekine et al. (1994) zistili podporný úĉinok Bifidobacterium longum
24
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
and B. animalis na indukciu zápalových cytokínov (TNFα a IL-6) peritoneálnymi bunkami u myńí.
Podávanie Enterococcus faecium CRL 183 potkanom s aplikovaným DMH zapríĉinilo zvýńenie
hladiny TNF-α a ćalńích cytokínov v porovnaní so skupinou s DMH, bez probiotík (Sivieri et al.,
2008).
Je známe, ņe úĉinnosť probiotík môņeme zvýńiť selekciou úĉinnejńích kmeņov
mikroorganizmov, génovými manipuláciami, kombináciou viacerých kmeņov mikroorganizmov,
alebo kombináciou probiotík a synergicky pôsobiacich komponentov. Z praktického hľadiska sa
ukazuje ako najvýhodnejńia metóda zvýńenia úĉinnosti probiotických prípravkov kombináciou
probiotík so synergicky pôsobiacimi komponentmi prirodzeného pôvodu - rastlinnými extraktami,
prebiotikami, alebo polynenasýtenými mastnými kyselinami.
Farmakologicky úĉinné látky v semenách pagańtana konského predstavuje zmes triterpénových
saponínov - escín (aņ 13 percent), flavonoidy- spireozid, kumaríny, fytosteríny, vitamíny C, B, a
a katechínové triesloviny. Semená obsahujú aj ńkrob (50 aņ 60 %), proteíny, olej a iné látky. Extraktu
pagańtanu sa pouņíva hlavne pri ochoreniach ciev, priĉom jeho úĉinná látka - escín pôsobí
pravdepodobne tak, ņe blokuje uvoľņovanie enzýmov, ktoré rozruńujú kolagén a elastín v stenách ciev.
Okrem toho pôsobí escín priaznivo na tonus ciev, najmä ņíl, jeho úĉinok je pozoruhodný
predovńetkým v zaĉiatoĉných fázach zápalu, ktorý sa prejavuje predovńetkým zvýńenou
priepustnosťou (permeabilitou) cievnych stien, ktorá je sprevádzaná vznikom kapilárnych a cievnych
exudátov. Niektoré ńtúdie uvádzajú jeho moņné úĉinky antiproliferatívne, antihistamínové
a chemopreventívne (Sato et al.., 2006, Patlolla et al., 2006). Kombinácia probiotík s rastlinami a ich
extraktami je ćalńou moņnosťou zvýńenia úĉinnosti probiotík. Rastlinné extrakty môņu potencovať
antibakteriálne a imunostimulaĉné úĉinky probiotík a môņu zvýńiť neutralizaĉný úĉinok niektorých
laktobacilov voĉi enterotoxínu E.coli (Kuchta et al., 2006).
Výņiva nepochybne patrí medzi dôleņité faktory ovplyvņujúce vznik karcinómu hrubého
ĉreva. V dlhodobom procese vývoja kolorektálneho karcinómu sa výņiva môņe uplatniť ako faktor,
ktorý sa podieľa na iniciaĉnej fáze kancerogenézy v prípade, ņe obsahuje chemické mutagény, oveľa
ĉastejńie vńak faktory výņivy ovplyvņujú promoĉnú a progresívnu fázu karcinogenézy, kedy sa vyvíja
a diseminuje malígny proces. K protektívnym faktorom pri kolorektálnom karcinóme patria vo výņive
prítomné zloņky rastlinnej potravy, vlákniny, vitamíny, ale aj fyziologicky úĉinné probiotické
baktériálne kultúry. Probiotiká zohrávajú dôleņitú úlohu pri úprave bakteriálnej mikroflóry zvýńením
poĉtu prospeńných baktérií a redukciou patogénnych mikroorganizmov. Táto stratégia má potenciál
inhibovať vývoj a progresiu nádoru úĉinnými mechanizmami - zníņením ĉrevných zápalov, zlepńením
imunitných funkcií a protinádorovou aktivitou. Kombinácie probiotík s niektorými bioaktívnymi
látkami naturálneho pôvodu môņu eńte výraznejńie modulovať zloņenie ĉrevnej mikroflóry a ĉrevnú
sliznicu a pri ich aplikácii v praxi tak môņu zefektívniť prevenciu závaņných chorôb ľudí i zvierat.
Záver
V ńtúdii sme sa zamerali na sledovanie vplyvu probiotika a extraktu pagańtanu jednotlivo aj v
kombinácii na vybrané imunologické parametre laboratórnych potkanov s N,N-Dimetylhydrazínom
indukovanou karcinogenézou hrubého ĉreva. Nańe výsledky poukázali na zvýńenie hladín TNFα
a zníņenie hladín IL-6 v skupinách suplementovaných probiotickými mikroorganizmami
a bioaktívnymi látkami na rozdiel od kontrolnej skupiny bez bioaktívnych substancií. Práca prispieva
k doterajńím poznatkom v oblasti probiotík a rozńiruje moņnosti úĉinnej prevencie chronických chorôb
vhodnými kombináciami probiotických mikroorganizmov a bioaktívnych látok naturálneho pôvodu vo
výņive.
Poďakovanie
Práca bola realizovaná vćaka podpore grantov AV 4/0028/07 a VEGA 1/0372/10.
Literatúra
KUCHTA, M. - PRUŅINEC, P. et al. 2006: Probiotiká, ich výskum, vývoj a bezpeĉnosť. Bonus
CCS,s.r.o., 2006, 163 s., s. 28.
25
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
PATLOLLA, L.M. - RAJU, J. - SWAMY, M.V. - RAO, C.V. 2006. Beta-escin inhibits colonic
abberant crypt foci formation in rats and regulates the cell cycle growth by inducing p21 (waf1/cip1)
in colon cancer cells. In Mol Cancer Ther, vol. 5, 2006, p.1459-1466.
SATO, I. - KOFUJITA, H. - SUŅUJI, T. - KOBAYASHI, H. - TSUDA, S. 2006 Antiinflammatory
Effect of Japanese Horse Chestnut (Aesculus turbinata) Seeds. In J. Vet. Med. Sci., vol. 68, 2006, p.
487-489.
SEKINE, K. - KAWASHIMA, T. - HASHIMOTO, Y. 1994. Comparison of the TNFα levels induced
by human-derived Bifidobacterium longum and rat-derived Bifidobacterium animalis in mouse
peritoneal cells. In Bifidobacteria Microflora, vol. 13, 1994, p. 79–89.
SIVIERI, K. - SPINARDI-BARBISAN A.L.T. - BARBISAN, L.F. et al. 2008. Probiotic Enterococcus
faecium CRL 183 inhibit chemically induced colon cancer in male Wistar rats. In European Food
Research and Technology, vol. 2, 2008, p. 231-237.
SZABADOSOVÁ, V. - HIJOVÁ, E. - BOMBA, A. 2009. Koncept probiotík a prebiotík v prevencii
a terapii chorôb. In Slovenský lekár, roĉ. 19 (33), 2009, ĉ. 3-4, 2009, s.54-60.
RAFTER, J. 2004. The effect of probiotics on colon cancer development. In Nutr Res Rev, vol. 17,
2004, p. 277-284.
Kontaktná adresa
Mgr. Izabela Bertková
Östav experimentálnej medicíny Lekárskej fakulty UPJŃ, Tr. SNP 1, 040 11 Końice
Slovenská republika
26
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
VLIV VNĚJŃÍHO PROSTŘEDÍ NA PRODUKCI HISTAMINU KMENEM
ENTEROBACTER AEROGENES CCM 2531
EFFECT OF ENVIRONMENT ON HISTAMINE PRODUCTION OF
ENTEROBACTER AEROGENES CCM 2531 STRAIN
BUŇKOVÁ Leona, BUŇKA Frantińek, KLČOVSKÁ Pavlína, DOLEŅÁLKOVÁ Iva,
KRÁČMAR Stanislav
Ústav technologie tuků, tenzidů a kosmetiky, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně,
Zlín, Ĉeská republika
Abstract
High concentrations of biogenic amines may have negative effects on the human health. Higher
content of these substances in food mostly depends on the decarboxylase aktivity of present
microorganisms and generally, it is considered to be unfavorable. Therefore, the aim of our study was
to examine the environmental factors (temperature, pH, presence of oxygen, aminoacids and
pyridoxalphosphate addition) which can influence the decarboxylase aktivity of Enterobacterias. The
highest histamine production was detected when Enterobacter aerogenes CCM 2531 was cultivated
in broth enriched with 2.0% (w/v) of histidine and 0.005% (w/v) of pyridoxalphosphate, under
anaerobic conditions with a temperature of 37°C and a pH of 6. The decarboxylase activity was
influenced mainly by pH, oxygen availability and aminoacid concentration, other factors tested had
a weaker impact on the histamine production.
Keywords: histamine, histidine, decarboxylase aktivity, pH, aerobic/anaerobi environment,
Enterobacterias, Enterobacter
Úvod
Biogenní aminy jsou nízkomolekulární alifatické, aromatické nebo heterocyklické bazické
slouĉeniny odvozené od aminokyselin. Jsou významnými slouĉeninami vyskytujícími se v ņivých
organizmech jako metabolické meziprodukty a produkty, které vykazují biologickou aktivitu.
Biogenní aminy se nacházejí také v potravinách, kde vznikají ĉinností některých mikroorganizmŧ
(zejména hnilobných bakterií a bakterií mléĉného kvańení), které mají aktivní dekarboxylázy
odńtěpující z aminokyselin karboxylovou skupinu. Základní podmínkou vzniku biogenních aminŧ je
přítomnost dostupných aminokyselin v daném substrátu, přítomnost mikroorganizmŧ
s dekarboxylázovou aktivitou, vhodné podmínky pro jejich rŧst, mnoņení a aktivita dekarboxyláz
(Halász et al., 1994; Kalaĉ & Kříņek, 2005).
Biogenní aminy jsou pro ĉlověka nepostradatelné, avńak ve vysokých koncentracích se mohou
projevovat jako látky psychoaktivní a vazoaktivní. Symptomy konzumace vysokých dávek biogenních
aminŧ jsou zvracení, dýchací potíņe, pocení, buńení srdce, hypotenze nebo hypertenze (histamin) a
migrény (fenyletylamin, tyramin) (Kalaĉ & Krausová, 2005). Při hodnocení toxického úĉinku je nutné
zvaņovat nejen přítomnost konkrétního aminu, ale i ostatních faktorŧ, jakými jsou mnoņství
spotřebované potraviny, přítomnost jiných toxických látek apod. Z tohoto dŧvodu je velmi obtíņné
stanovit hranici toxicity biogenních aminŧ. Koncentrace histaminu vyńńí neņ 500 – 1000 mg/kg se
povaņují pro ĉlověka za nebezpeĉné. Zvýńené mnoņství histaminu mŧņe vyvolat aņ anafylaktický ńok
(Silla Santos, 1996).
Tvorba biogenních aminŧ bakteriemi mŧņe být ovlivněna mnohými vnějńími faktory, které
mohou pŧsobit zejména na kinetiku dekarboxylázových reakcí. Mezi vnějńí faktory ovlivņující tvorbu
biogenních aminŧ u bakterií, patří teplota a pH prostředí, aero-/anaerobióza, dostupnost zdrojŧ uhlíku
(např. glukózy), přítomnost rŧstových faktorŧ, rŧstová fáze buněk, koncentrace NaCl, vodní aktivita
aj. (Greif et al., 1997, 1998, 2006; Gardini et al., 2001, 2005; Santos et al., 2003; Fernández et al.,
2007; Bover-Cid et al., 2008; Emborg & Dalgaard, 2008). Některé z výńe zmíněných faktorŧ (např.
koncentrace glukózy) mají malý vliv na produkci biogenních aminŧ, jiné naopak výrazněji ovlivņují
27
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
jejich syntézu. Mezi posledně zmíněné faktory lze zařadit anaerobní prostředí (v případě fakultativně
anaerobních bakterií), teplotu, pH nebo koncentraci NaCl (Gardini et al., 2001; Greif et al., 2006;
Bover-Cid et al., 2008). Kromě výńe zmíněných faktorŧ mohou produkci biogenních aminŧ ovlivņovat
dalńí chemické látky, jako jsou např. fenolické slouĉeniny (Alberto et al., 2007), etanol (Gardini et al.,
2005; Mazzoli et al., 2009), oxid siřiĉitý nebo dalńí sacharidy (např. arabinóza) (Gardini et al., 2005).
Schopnost dekarboxylace aminokyselin byla zjińtěna u mikroorganizmŧ disponujícími
přísluńnými enzymy. Mezi takové mikroorganizmy lze zařadit mnohé bakterie ĉeledi
Enterobacteriaceae (Veciana-Nogués et al., 2004; Pircher et al., 2007), zástupce rodŧ Pseudomonas
(Baixas-Nogueras et al., 2003), Clostridium, Bacillus (Halász et al., 1994), bakterie mléĉného kvańení
(Buņková et al., 2009) a mnohé dalńí mikroorganizmy. Produkce biogenních aminŧ je vlastnost
specifická spíńe pro urĉité kmeny mikroorganizmŧ neņ vlastnost typická pro daný druh, takņe rŧzné
kmeny téhoņ druhu se mohou lińit v produkci biogenních aminŧ (Arena &Manca de Nadra, 2001;
Buņková et al., 2009).
Sledování výskytu biogenních aminŧ v potravinách mŧņe být zdrojem cenných informací o
bezpeĉnosti a kvalitě potravin a hygieně potravinářských provozŧ. Obsah biogenních aminŧ
v potravinách mŧņe znaĉně kolísat, někdy aņ v rozmezí dvou řádŧ. Obvyklé obsahy biogenních aminŧ
v potravinách se pohybují řádově v jednotkách aņ desítkách miligramŧ na kilogram (Kalaĉ & Kříņek,
2005). Ani chladírenské skladování nemusí zamezit vzniku biogenních aminŧ. Vinci & Antonelli
(2002) zjistili, ņe se obsah biogenních aminŧ zvyńuje i během skladování při teplotě +4 °C.
Odstranění jiņ vzniklých biogenních aminŧ z potravin je velmi obtíņné. Nejvhodnějńím zpŧsobem
výroby potravin obsahujících malé mnoņství biogenních aminŧ je vńak dodrņování takových
technologických postupŧ a hygienických podmínek výroby, které brání jejich vzniku (Halász et al.,
1994; Silla Santos, 1996).
Cílem této práce bylo provést prvotní studii, ve které budou sledován soubor vnějńích faktorŧ,
jeņ mohou ovlivnit produkci histaminu u enterobakterií, konkrétně u kmene Enterobacter aerogenes
CCM 2531.
Materiál a metodika
Vliv teploty, pH prostředí, dostupnost kyslíku, přídavku aminokyseliny v rŧzné koncentraci a
pyridoxal-5-fosfátu (Sigma-Aldrich) na produkci histaminu byl testován u kmene Enterobacter
aerogenes CCM 2531. Kultivace probíhala v masopeptonovém bujónu (MPB; HiMedia) s přídavkem
histidinu (Sigma-Aldrich) o přísluńné koncentraci (0,1; 0,2; 0,3; 0,5;, 1,0 a 2,0 % w/v) a popř. i
přídavkem pyridoxalfosfátu (0,005 %w/v) při 30 ± 1 °C nebo 37 ± 1 °C v rozmezí 1 aņ 3 dnŧ. MPB
byl upraven na výsledné pH 6, respektive pH 7. Přísluńný bujón o objemu 5 ml byl zaoĉkován vņdy 25
μl suspenze bakterií narostených přes noc v MPB s přídavkem 0,2 % (w/v) histidinu. Vliv
aerobního/anaearobního prostředí na produkci biogenních aminŧ byl sledován tak, ņe polovina
zkumavek byla kultivována aerobně a druhá anaerobně. Anaerobního prostředí bylo dosaņeno
zakápnutím kultivaĉního média sterilním parafinovým olejem (1 ml; Pliva-Lachema). Odběr vzorkŧ
pro analýzy probíhal v ĉasech 24, 48 a 72 hod a to tak, ņe vņdy byly náhodně odebrány od kaņdého
kmene a kaņdé úrovně faktoru 2 zkumavky. Celý experiment byl opakován třikrát.
Po inkubaci bakterií byly buņky odstraněny centrifugací (10000 × g, 5 min) a supernatant byl
filtrován přes 0,45 m filtr. Produkce histaminu byla zjińťována pomocí iontově-výměnné
chromatografie (IEC; Automatický analyzátor aminokyselin AAA400, Ingos Praha, ĈR) v médiu po
odstranění buněk a po filtraci podle Buņková et al. (2009). Kaņdý izolát byl analyzován alespoņ
třikrát. Standard histaminu byl získán ze Sigma-Aldrich.
Výsledky a diskuze
Obsah biogenního aminu histaminu v bujónu po kultivaci E. aerogenes CCM 2531 se v ĉase u
testovaných MPB po přídavku histidinu v koncentracích 0,3% (w/v) a vyńńích bez ohledu na dalńí
sledované faktory postupně zvyńoval. Větńí rozdíly byly shledány mezi 24. a 48. hodinou neņ mezi 48.
a 72. hodinou. Pokud bylo do MPB přidáno menńí mnoņství aminokyseliny, nebyly ve větńině případŧ
shledány výraznějńí rozdíly mezi jednotlivými ĉasovými intervaly odběrŧ. Tento jev mŧņe být
zpŧsoben tím, ņe v případě kultivace při niņńích koncentracích aminokyseliny dońlo k rychlejńímu
nárŧstu produkce histaminu a v uvedené ĉasy odběrŧ se jiņ produkce výrazněji neměnila. Obrázky 1 a
2 znázorņují produkci histaminu po 3 dnech kultivace v závislosti na sledovaných faktorech prostředí.
28
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Kultivaĉní teplota 30 °C a 37 °C neměla významný vliv na produkci histaminu kmenem E. aerogenes
CCM 2531 (obr. 1 a 2), coņ mŧņe být dáno faktorem, ņe obě teploty vyhovují optimální rŧstové teplotě
dané bakterie a tím i produkci biogenního aminu.
18,0
16,0
Obsah histaminu (g/l) .
14,0
12,0
10,0
AE
AN
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
30
30
30
30
30
30
37
37
37
37
37
37
30
30
30
30
30
30
37
37
37
37
37
37
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
Kultivační podmínky
Obr. 1 Produkce histaminu u E. aerogenes CCM 2531 po 72 hodinách kultivace při pH=7
AE – aerobní prostředí; AN – anaerobní prostředí; nP – bez přídavku pyridoxalfosfátu; P –
s přídavkem pyridoxalfosfátu; 30 a 37 – kultivaĉní teplota ve °C; 0,1 – 2,0 – koncentrace
aminokyseliny histidinu.
Z výsledkŧ je rovněņ patrné, ņe produkce histaminu byla nejvíce ovlivněna pH kultivaĉního
prostředí, přiĉemņ vyńńí produkce byla zaznamenána při niņńím pH, kdy bylo detekováno zhruba
dvojnásobné mnoņství biogenního aminu (obr. 1 a 2). Tento jev je v souladu i s poznatky jiných autorŧ
(např. Fernández et al., 2007), podle kterých je dekarboxylázová aktivita bakterií vyńńí při niņńím pH.
Dekarboxylázové enzymy mohou být bakteriemi vytvářeny k regulaci vnitrobuněĉného pH za úĉelem
jejich přeņití a rŧstu v kyselém prostředí.
Vyńńí produkce histaminu byla zpravidla zaznamenána v přítomnosti pyridoxalfosfátu, který
pŧsobí jako kofaktor dekarboxylázových enzymŧ (Shalaby, 1996). Nicméně přítomnost kofaktoru
neměla výraznějńí vliv na produkci histaminu za daných testovaných podmínek.
Z obrázkŧ 1 a 2 je rovněņ patrné, ņe se zvyńující se koncentrací přidané aminokyseliny, která je
substrátem pro sledovaný amin, bylo detekováno vyńńí mnoņství histaminu. Z výsledkŧ lze zároveņ
vypozorovat, ņe mezi obsahem histaminu a koncentrací aminokyseliny histidinu nebyla zjińtěna přímá
úměrnost, v případě vyńńích koncentrací aminokyseliny byla konverze biogenního aminu niņńí. Pokud
vztáhneme mnoņství detekovaného histaminu k mnoņství aminokyseliny v bujónu, zjistíme, ņe
optimální koncentrace aminokyseliny pro produkci biogenního aminu se u E. aerogenes CCM 2531
pohybovala v rozmezí 0,1 – 0,3 % (w/v).
29
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
30,0
27,5
25,0
Obsah histaminu (g/l) .
22,5
20,0
17,5
AE
15,0
AN
12,5
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
nP
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
P
30
30
30
30
30
30
37
37
37
37
37
37
30
30
30
30
30
30
37
37
37
37
37
37
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
0,1
0,2
0,3
0,5
1,0
2,0
Kultivační podmínky
Obr. 2 Produkce histaminu u E. aerogenes CCM 2531 po 72 hodinách kultivace při pH=6
AE – aerobní prostředí; AN – anaerobní prostředí; nP – bez přídavku pyridoxalfosfátu; P –
s přídavkem pyridoxalfosfátu; 30 a 37 – kultivaĉní teplota ve °C; 0,1 – 2,0 – koncentrace
aminokyseliny histidinu.
Dalńím faktorem, který byl sledován za úĉelem ovlivnění produkce histaminu u E. aerogenes
CCM 2531, bylo aerobní a anaerobní prostředí. Z výsledkŧ (obr. 1 a 2) je patrné, ņe u větńiny
testovaných parametrŧ dońlo k vyńńí produkci histaminu v prostředí, ve kterém nebyl kyslík dostupný.
Tyto výsledky jsou v souladu s dalńími studiemi (např. Buņková et al., 2010), ve kterých se uvádí, ņe
dekarboxylázové enzymy mají větńí aktivitu v prostředí bez přístupu kyslíku.
Závěr
Anaerobní prostředí, pH a koncentrace aminokyseliny měly největńí vliv na produkci histaminu u
Enterobacter aerogenes CCM 2531. Vliv teploty a kofaktoru pyridoxalfosfátu jiņ nebyl tak výrazný.
Nejvyńńí mnoņství histaminu bylo detekováno v případě, ņe byly tyto enterobakterie kultivovány
v MPB o pH 6, v přítomnosti 2,0 % (w/v) histidinu a 0,005 % (w/v) pyridoxalfosfátu při teplotě 37 °C
bez přístupu kyslíku.
Poděkování
Práce vznikla za podpory projektu MŃMT: MSM 7088352101.
Literatura
ALBERTO, M. R.. - ARENA, M. E. - MANCA de NADRA, M. C. 2007. Putrescine production from
agmatine by Lactobacillus hilgardii: Effect of phenolic compounds. In Food Control, roĉ. 18, 2007, s.
898-903.
ARENA, M. E. - MANCA DE NADRA, M. C. 2001. Biogenic amine production by Lactobacillus. In
Journal of Applied Microbiology, roĉ. 90, 2001, s, 158-162.
BAIXAS-NOGUERAS, S. - BOVER-CID, S. - VECIANA-NOGUÉS, M. T. - VIDAL-CAROU, M.
C. 2003. Amino acid-decarboxylase activity in bacteria associated with Mediterranean hake spoilage.
In European Food Research and Technology, roĉ. 217, 2003, s. 164-167.
BOVER-CID, S. - MIGUÉLEZ-ARRIZADO, M. J. - BECKER, B. - HOLZAPFEL, W. H. - VIDALCAROU, M. C. 2008. Amino acid decarboxylation by Lactobacillus curvatus CTC273 affected by the
pH and glucose availability. In Food Microbiology, roĉ. 25, 2008, s. 269-277.
30
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
BUŅKOVÁ, L. - BUŅKA, F. - HLOBILOVÁ, M. - VAŅÁTKOVÁ, Z. - NOVÁKOVÁ, D. - DRÁB,
V. 2009. Tyramine production of technological important strains of Lactobacillus, Lactococcus and
Streptococcus. In European Food Research and Technology, roĉ. 229, 2009, s. 533-538.
BUŅKOVÁ, L. - BUŅKA, F. - POLLAKOVÁ, E. - PODEŃVOVÁ, T. - DRÁB, V. - KRÁĈMAR, S.
2010. Vliv aerobního/anaerobního prostředí na dekarboxylázovou aktivitu vybraných bakterií
mléĉného kvańení. In Potravinárstvo, roĉ. 4(2), 2010, s. 5-7.
EMBORG, J. - DALGAARD, P. 2008. Modelling the effect of temperature, carbon dioxide, water
activity and pH on growth and histamine formation on Morganella psychrotolerans. In International
Journal of Food Microbiology, roĉ. 128, 2008, s. 226-233.
FERNÁNDEZ, M. - LINARES, D. M. - RODRÍGUEZ, A. - ALVAREZ, M. A., 2007. Factors
affecting tyramine production in Enterococcus durans IPLA 655. In Applied Microbiology and
Biotechnology, roĉ. 73, 2007, s. 1400-1406.
GARDINI, F. - MARTUSCELLI, M. - CARUSO, M. C. - GALGANO, F. - CRUDELE, M. A. FAVATI, F. - GUERZONI, M. E. - SUZZI, G., 2001. Effects of pH, temperature and NaCl
concentration on the growth kinetics, proteolytic activity and biogenic amine production of
Enterococcus faecalis. In International Journal of Food Microbiology, roĉ. 64, 2001, s. 105-117.
GARDINI, F. - ZACCARELLI, A. - BELLETI, N. - FAUSTINI, F. - CAVAZZA, A. MARTUSCELLI, M. - MASTROCOLA, D. - SUZZI, G., 2005. Factors influencing biogenic amine
production by a strain of Oenococcus oeni in a model system. In Food Control, roĉ. 16, 2005, s. 609616.
GREIF, G. - GREIFOVÁ, M. - DVORAN, J. - KAROVIĈOVÁ, J. - BUCHTOVÁ, V. 1998. Ńtúdium
rastu a produkcie biogénnych amínov neiktorými mikroorganizmami za modelových podmienok. In
Czech Journal of Food Science, roĉ. 17, 1998, s. 15-21.
GREIF, G. - GREIFOVÁ, M. - KAROVIĈOVÁ, J., 1997. Tvorba kadaverínu a amoniaku ĉinnosťou
niektových baktérií za modelových podmienok. In Czech Journal of Food Science, roĉ. 16, 1997, s.
53-56.
GREIF, G. - GREIFOVÁ, M. - KAROVIĈOVÁ, J., 2006. Effects of NaCl concentration and initial
pH value on biogenic amine formation dynamics by Enterobacter spp. bacteria in model conditions. In
Journal of Food and Nutrition Research, roĉ. 45, 2006, s. 21-29.
HALÁSZ, A. - BARÁTH, Á. - SIMON-SARKADI, L. - HOLZAPFEL, W. 1994. Biogenic amines
and their production by microorganisms in food. In Trends in Food Science and Technology, roĉ. 5,
1994, s. 42-49.
KALAĈ, P. - KRAUSOVÁ, P., 2005. A reviw of dietary polyamines: Formation, implications for
growth and health and occurrence in foods. In Food Chemistry, roĉ. 90, 2005, s. 219-230.
KALAĈ, P. - KŘÍŅEK, M., 2005. Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské
zdraví. In Potravinářská revue, roĉ. 2, 2005, s. 40-42.
MAZZOLI, R. - LAMBERTI, C. - COISSON, J. D. - PURROTTI, M. - ARLORIO, M. GIUFFRIDA, M. G. - GIUNTA, C. - PESSIONE, E., 2009. Influence of ethanol, malate and arginine
on histamine production of Lactobacillus hilgardii isolated from Italian red wine. In Amino Acids, roĉ.
36, 2009, s. 81-89.
PIRCHER, A. - BAUER, F. - PAULSEN, P. 2007. Formation of cadaverine, histamine, putrescine and
tyramine by bacteria isolated from meat, fermented sausages and cheeses. In European Food Research
and Technology, roĉ. 226, 2007, s. 225-231.
SANTOS, W. C. - SOUZA, M. R. - CERQUEIRA, M. M. O. P. - GLÓRIA, M. B. A.. 2003. Bioactive
amines formation in milk by Lactococcus in the presence or not of rennet and NaCl at 20 and 32 °C. In
Food Chemistry, roĉ. 81, 2003, s. 595-606.
SILLA SANTOS, M. H., 1996. Biogenic amines: their importance in foods. In International Journal
of Food Microbiology, roĉ. 29, 1996, s. 213-231.
VECIANA-NOGUÉS, M. T. - BOVER-CID, S. - MARINÉ-FONT, A. - VIDAL-CAROU, M. C.
2004. Biogenic amine production by Morganella morganii and Klebsiella oxytoca in tuna. In
European Food Research and Technology, roĉ. 218, 2004, s. 284-288.
SHALABY, A. R., 1996. Significance of biogenic amines to food safety and human health. In Food
Research International, roĉ. 29, 1996, s. 675 – 690.
VINCI, G. - ANTONELLI, M. L. 2002. Biogenic amines: quality index of freshness in red and white
meat. In Food Control, roĉ. 13, 2002, s. 519-524.
31
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Kontaktní adresa
doc. RNDr. Leona Buņková, Ph.D. Östav technologie tukŧ, tenzidŧ a kosmetiky, Fakulta
technologická, Univerzita Tomáńe Bati ve Zlíně, nám. T.G. Masaryka 275, 762 72 Zlín, Ĉeská
republika
 00420 576 031 154
 [email protected]
32
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
KUMULÁCIA RIZIKOVÝCH PRVKOV VO VZŤAHU K ANATOMICKEJ ČASTI
RASTLÍN POHÁNKY JEDLEJ (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH.)
RISK ELEMENT ACCUMULATION RELATED TO THE ANATOMICAL PARTS
OF BUCKWHEAT(FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH.)
BYSTRICKÁ Judita, VOLLMANOVÁ Alena, ČIČOVÁ Iveta, MUSILOVÁ Janette
Katedra chémie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v
Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika
Abstract
Cumulating and dynamics of selected risky elements content (Cd, Pb) changes in individual
anatomical parts of common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) during vegetation in 6
varieties of common buckwheat: Pyra, Ńpaĉinská, Emka, Kasho, Jana C1 and Hrusowska were
surveyed in our work. All tested varieties of common buckwheat exerted high ability of cadmium and
lead cumulating. In all tested varieties the line of cumulated heavy metals was as following: leaves >
seeds > stems. When observing the changes of heavy metals content during cultivation, there was
increasing tendency of the concentrations of both heavy metals in all tested varieties at the end of
cultivation. The highest enhancement of Cd content was evaluated in variety Pyra (leaves) and
presented the value 1.38 mg.kg-1. The most obvious enhancement was assessed in Kasho variety
(leaves) (7.30 mg.kg-1) and was determined at the end of vegetation period.
Key words: heavy metals, cadmium, lead, buckwheat
Úvod
Pseudocereálie zaujímajú významné miesto v racionálnej výņive. Je to zapríĉinené vynikajúcim
nutriĉným profilom, obsahom vysokohodnotných bielkovín s vyváņenou aminokyselinovou skladbou,
vysokým obsahom vlákniny a nenasýtených mastných kyselín (Alvarez-Jubete et al., 2010). Okrem
toho pseudocereálie obsahujú primerané mnoņstvo minerálnych látok a vitamínov, významné
mnoņstvo iných bioaktívnych zlúĉenín ako sú saponíny, fytosteroly, fagopyritoly a polyfenoly
(Wijngaard a Arendt 2006), s rôznymi bioaktívnymi úĉinkami , zahrņujúc antioxidaĉné,
antibakteriálne, protizápalové a protirakovinové pôsobenie a prispievajú aj k ochrannému úĉinku pri
vzniku kardiovaskulárnych ochorení (Pirjo et al., 2003; Gorinstein et al., 2008). Majú aj vysoký obsah
arginínu a histidínu, obe aminokyseliny sú esenciálne pre deti a dojĉatá. Pseudocereálie obsahujú
veľmi malé mnoņstvo prolamínu, na rozdiel od klasických cereálií, teda sú vhodné pre výņivu ľudí
trpiacich celiakiou (Berti et al., 2005).
Medzi veľmi významné environmentálne problémy v súĉasnosti, ktoré zasahujú vńetky zloņky
ņivotného prostredia patrí kontaminácia ťaņkými kovmi. Ako kontaminanty sa do ekosystémov
dostávajú i prirodzenou cestou ale pochádzajú aj z emisie priemyslu, dopravy a poľnohospodárstva.
Potravový reťazec je od svojho primárneho ĉlánku aņ po finalizáciu a distribúciu potravín otvorený
prenikaniu cudzorodých látok. Pravidelný aj nízky príjem toxických prvkov môņeme povaņovať za
rizikový pre jeho kumulaĉnú schopnosť v cieľových orgánoch a v tkanivách. Ťaņké kovy indukujú
v rastlinách výrazné toxické symptóny. K najdôleņitejńím patria inhibícia rastu, zmena konformácie
biomolekúl, zmeny ultrańtruktúry bunky, pońkodenie DNA, naruńenie metabolizmu a celkové zníņenie
ņivotaschopnosti organizmov (Patra et al., 2004). Nadlimitné obsahy rizikových prvkov zniņujú
výņivovú a senzorickú hodnotu rastlinných produktov a negatívne vplývajú aj na zdravie konzumenta.
Materiál a metodika
V práci sme sledovali dynamiku obsahu ťaņkých kovov (Cd, Pb, ) v konzumných ĉastiach
pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum Moench.) poĉas vegetácie. Analyzovali sme 6 odrôd: Pyra,
Ńpaĉinská, Emka, Kasho, Jana C1 a Hrusowska.
Vzorky sme mineralizovali mokrou cestou s pouņitím kyseliny dusiĉnej prostredníctvom
prístroja Xpress podľa prísluńnej metodiky XprAG-1 (2004). Získané mineralizáty sme následne
33
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
prefiltrovali a zriedili destilovanou vodou na výsledný objem 50 cm-3. Analytickou koncovkou bola
atómová absorpĉná spektrofotometria (AAS Varian AA Spectr DUO 240FS/240Z/UltrAA). Obsahy
ťaņkých kovov (Cd, Pb) vyjadrené ako mg.kg-1 rastlinného materiálu sme porovnávali s najvyńńími
prípustnými mnoņstvami (NPM) urĉenými Potravinovým kódexom SR.
Výsledky a diskusia
Ťaņké kovy vyskytujúce sa v ņivotnom prostredí (As, Cd, Cr, Pb, Hg, Ni) predovńetkým v
dôsledku intenzívnej antropogénnej ĉinnosti, sú pre rastlinné organizmy toxické uņ v nízkych
koncentráciách. Vstup týchto rizikových kovov cez kontaminovanú pôdu a poľnohospodárske
plodiny do potravového reťazca predstavuje závaņné riziko pre ľudské zdravie.
Testovanou plodinou bola pohánka jedlá (Fagopyrum esculentum Moench.). V jednotlivých
anatomických ĉastiach (stonka, listy, naņky) sme sledovali mieru akumulácie vybraných ťaņkých
kovov (Cd, Pb ) poĉas vegetácie. Pri sledovaní obsahu kumulácie kadmia sme zistili rozdiely medzi
jednotlivými anatomickými ĉasťami. V kaņdej odrode okrem odrody Pyra najviac akumulovali tento
nebezpeĉný ťaņký kov listy, potom nasledovali stonky a naņky.
0,8
1,6
0,7
1,4
1
2.odber
0,4
3.odber
0,8
3.odber
0,3
4.odber
0,6
4.odber
0,2
NPM
0,4
NPM
Graf 1 Zmeny obsahu Cd v stonkách (mg.kg-1)
sk
a
C
ru
so
w
H
Ja
na
Em
a
Py
r
sk
a
1
C
ru
so
w
H
Ja
na
Em
Py
r
Ka
sh
o
0
ka
0
a
0,2
Sp
ac
in
sk
a
0,1
1
1.odber
2.odber
Ka
sh
o
1,2
0,5
ka
1.odber
Sp
ac
in
sk
a
0,6
Graf 2 Zmeny obsahu Cd v listoch (mg.kg-1)
0,35
0,3
1.odber
0,25
2.odber
0,2
3.odber
0,15
4.odber
0,1
NPM
0,05
sk
a
1
C
ru
so
w
H
Ja
na
ka
Ka
sh
o
Em
Sp
ac
in
sk
a
Py
r
a
0
Graf 3 Zmeny obsahu Cd v naņkách (mg.kg-1)
Pri sledovaní dynamiky obsahu kadmia poĉas vegetácie (1.odber = tvorba pukov, 2. odber =
zaĉiatok kvitnutia, 3. odber = plné kvitnutie, 4. odber = plná zrelosť) okrem odrody Pyra vo vńetkých
sledovaných odrodách koncentrácie obsahu kadmia mali stúpajúcu tendenciu. Najvyńńie prípustné
mnoņstvo (NPM) pre kadmium (0,1 mg.kg -1) bolo niekoľkonásobne prekroĉené, priĉom
najvyńńie prekroĉenie obsahu kadmia sme zaznamenali v odrode Pyra v stonkách na zaĉiatku
vegetácie (0,761 mg.kg-1) a v listoch takisto v odrode Pyra na konci vegetácie. Najvyńńie prekroĉenie
obsahu kadmia v naņke bolo zaznamenané v odrode Hruńovska a Jana C1, priĉom v obidvoch
prípadoch to bola hodnota 0,310 mg.kg-1. Kadmium môņe ľahko vstúpiť do interakcií s biologickými
aktívnymi molekulami ako sú bielkoviny, lipidy, nukleové kyseliny a môņe meniť aj aktivitu
enzýmov. Uņ vo veľmi malých dávkach môņe inhibovať enzýmy, ktoré obsahujú –SH skupiny. Okrem
toho ťaņké kovy môņu zapríĉiniť zvýńenú produkciu bioreaktívnych foriem kyslíka, ĉo môņe
zapríĉiniť oxidaĉný stres v bunkách. Je to následok toxického úĉinku ťaņkých kovov a tieņ vyĉerpania
antioxidantov v organizme (Lovásová et al., 2002).
34
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
V prípade olova sme takisto zaznamenali prekroĉenie NPM.
2,5
8
7
2
1,5
1
1.odber
6
1.odber
2.odber
5
2.odber
3.odber
4
3.odber
4.odber
3
4.odber
2
NPM
NPM
0,5
1
0
sk
a
1
C
ru
so
w
H
Ja
na
Ka
sh
o
ka
Em
a
Py
r
Graf 4 Zmeny obsahu Pb v stonkách (mg.kg-1)
Sp
ac
in
sk
a
sk
a
1
C
ru
so
w
H
Ja
na
Ka
sh
o
ka
Em
a
Py
r
Sp
ac
in
sk
a
0
Graf 5 Zmeny obsahu Pb v listoch (mg.kg-1)
1,4
1,2
1.odber
1
2.odber
0,8
3.odber
0,6
4.odber
0,4
NPM
0,2
sk
a
1
C
ru
so
w
H
Ja
na
ka
Ka
sh
o
Em
a
Py
r
Sp
ac
in
sk
a
0
Graf 6 Zmeny obsahu Pb v naņkách (mg.kg-1)
V stonkách pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum Moench.) najväĉńie prekroĉenie NPM pre
olovo (0,2 mg.kg-1) bolo zaznamenané v odrode Pyra a predstavovalo hodnotu 1,8 mg.kg-1. Najvyńńia
hodnota prekroĉenie NPM vńak bola zaznamenaná v listoch pohánky v odrode Kasho (7,30 mg.kg-1),
ĉo predstavuje aņ 36,5 násobné zvýńenie a bola zaznamenaná na konci vegetaĉného obdobia.
Negatívne môņeme hodnotiť aj obsahy olova v naņkách pohánky jedlej, kde pri kaņdej odrode bola
prekroĉená NPM. Najvyńńia hodnota prekroĉenia bola v odrode Pyra (0,7 mg.kg-1) a Hruńowska (1,2
mg.kg-1). Sledovaním obsahu jednotlivých ťaņkých kovov v pseudocereáliach sa zaoberali viacerí
autori (Vollmannová et al., 2006, Margitanová et al., 2009), ktorí takisto zaznamenali nadlimitné
obsahy kadmia a olova v zrnách jednotlivých pseudocereálií. Nańe výsledky koreńpondujú
s výsledkami Tamura et al. (2005), ktorí udávajú koncentráciu Pb v stonkách pohánky jedlej 2 mg.kg1
, v listoch 8 mg.kg-1 a v koreņoch 3,3 mg.kg-1. Ťaņké kovy (Cd, Pb) môņu vstupovať do ņivotného
prostredia a sú veľmi nebezpeĉné uņ v nízkych koncentráciach. Jednotlivé rastliny na stres vyvolaný
úĉinkom taņkých kovov reagujú rôznym spôsobom. Toxicita závisí od typu prijímaných iónov,
koncentrácie iónov, od rastlinných druhov a od fázy rastu rastlín (Memon a Schröder 2009). Toxické
úĉinky ťaņkých kovov sa spájajú s oxidaĉným stresom (Krizbai et al., 2005; Liu et al., 2009). Ióny
ťaņkých kovov môņu tvoriť komplexy s bielkovinami ( so skupinami –COOH, -NH2, -SH). Funkĉné
skupiny sa modifikujú, molekuly strácajú biologickú aktivitu a môņe nastať aņ smrť buniek. Takto sa
môņu inaktivovať aj mnohé dôleņité enzymatické systémy. Kadmium a olovo sa radia medzi obzvláńť
nebezpeĉné ťaņké kovy, ktoré vyvolávajú oxidaĉný stres a ovplyvņujú obrovské mnoņstvo
biochemických procesov (Manna et al., 2009). Kumulácia ťaņkých kovov v organizme ĉloveka vedie
k hormonálnej nerovnováhe, spôsobuje neurologické poruchy, môņe viesť ku vzniku rôznych typov
rakoviny a ćalńích chronických ochorení (Massányi et al., 2004).
Záver
Nańe výsledky naznaĉujú signifikantné riziko kumulácie ťaņkých kovov (Cd, Pb) jednotlivými
anatomickými ĉasťami pohánky jedlej (Fagopyrum esculentum Moench.). NPM pre olovo (0,2
mg.kg1) a kadmium (0,1 mg.kg-1) boli pri vńetkých sledovaných odrodách niekoľkokrát prekroĉené.
Na základe zistení môņeme konńtatovať, ņe napriek pozitívnemu úĉinku konzumácie pseudocereálií na
35
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ľudské zdravie treba dôsledne sledovať obsahy rizikových kovov v jej konzumných ĉastiach a tak
zamedziť vstupu nebezpeĉných ťaņkých kovov do ľudského organizmu.
Literatúra
ALVAREZ-JUBETE, L. - WIJNGAARD, H. - ARENDT, E.K. - GALLAGHER, E. 2010. Polyphenol
composition and in vitro antioxidant activity of amaranth, quinoa buckwheat and wheat as affected by
sprouting and baking. In Food Chemistry, vol. 119, 2010, pp. 770-778.
BERTI, C. - RISO, P. - BRUSAMOLINO, A. - PORRINI, M. 2005. Effect of appetite control of
minor cereal and pseudocereal products. In Brtitish Journal of Nutrition, vol. 94, 2005, pp. 850-858.
GORINSTEIN, S. - LOJEK, A. - ĈÍŅ, M. - PAWELZIK, E. - DELGADO-LICON, E. - MEDINA,
O.J. - MORENO, M. - SALAS, I.A. - GOSHEV, I. 2008. Comparison of composition and antioxidant
capacity of some cereals and pseudocereals. In International Journal of Food Science and Technology,
vol. 43, 2008, pp. 629-637.
KRIZBAI, I.A. - BAUER, H. - BRESGEN, N. - ECKL, P.M. - FARKAS, A. - SZATMARI, E. TRAWEGER, A. - WEJKSZA, K. - BAUER, H.C. 2005. Effect of oxidative stress on the functional
proteins of cultured cerebrál endothelial cells. In Cell. Mol. Neurobiol., vol. 25, 2005, pp.129–139.
LIU, J. - QU, W. - KADIISKA, M.B. 2009. Role of oxidative stress in cadmium toxicity and
carcinogenesis. In Toxicol Appl Pharmacol, 2009, vol. 238, pp. 209-214.
LOVÁSOVÁ, E. - ŃIPULOVÁ, A. - NIŃTIAR, F. - RÁCZ, O. - 2002. The effect of chronic cadmium
and Merkury exposure on the plasma total antioxidant status in rats. In Folia Veterinaria, vol. 46,
2002, no. 2, pp. 61-64.
MANNA, P. - SINHA, M. - SIL, P.C. 2009. Taurine plays a beneficial role against cadmium-induced
oxidative renal dysfunction. In Amino Acids, vol. 36, 2009, pp. 417-428.
MARGITANOVÁ, E. - VOLLMANNOVÁ, A. - KRÍŅOVÁ, L. - SZABÓOVÁ, G. - HARANGOZO,
L. 2009. Kumulácia rizikových kovov zrnom pseudocereálií. In Potravinárstvo, vol. 3, 2009, pp. 5356.
MASSÁNYI, P. - TOMAN, R. - UHRÍN, V. - RENON, P.2004. Distribution of cadmium in selected
organs of rabbits after an acute and chronic administration. In Ital. J. FoodSci., vol. 3, 2004, pp. 311316.
MEMON A.R. - SCHRÖDER, P. 2009. Implications of metal accumulation mechanisms to
phytoremediation. In Environ Sci Pollut Res Int., vol. 16, 2009, pp.162-75.
PATRA, M. - BHOWMIK, N. - BANERJEE, B. - SHARMA, A. 2004. Comparison of mercury, lead
and arsenic with respect to genotoxic effects on plant systems and the development of genetic
tolerance. In Environ. Exp. Bot. vol. 52, 2004, pp. 199-223.
PIRJO, M. - JARKKO, H. - PILHA, V. - MATTI, J. 2003. The content of phenolic acids in some
grain products. In Abstract books, 1st international conference on polyphenols and health. ClermontFerraud: Institut National de la Recherche Agronomiqe, 2003, pp. 207-208.
TAMURA, H. - HONDA, M. - SATO, T. - KAMACHI, H. 2005. Pb hyperaccumulation and
tolerance in common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.). In J. Plant Res, vol. 118, 2003,
pp. 355-359.
VOLLMANNOVÁ, A. - TÓTH, T. - LAHUČKÝ, L. - STANOVIČ, R. 2006. Vyuņitie láskavca na
zníņenie pôdnych obsahov kadmia. In Enviromentálne inţinierstvo, TU Końice, 2006, pp. 121-124.
WIJNGAARD, H.H. - ARENDT, E.K. 2006. Buckwheat. In Cereal Chemistry, vol. 83, 2006, pp. 391401.
Kontaktná adresa
Ing. Judita Bystrická, PhD.
Katedra chémie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v
Nitre, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika
 [email protected]
36
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
MORFOMETRICKÉ ZMENY SEMENNÍKA POTKANA PO
INTRAPERITONEÁLNEJ APLIKÁCII DIAZINONU A SELÉNU
MORPHOMETRIC CHANGES IN THE RAT TESTIS CAUSED BY
INTRAPERITONEAL ADMINISTRATIUON OF DIAZINON AND SELENIUM
CABAJ Michal1, TOMAN Róbert, ADAMKOVIČOVÁ Mária, MASSÁNYI Peter, ŃIŃKA
Branislav, LUKÁČ Norbert, GOLIAN Jozef
Katedra veterinárskych disciplín, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Tr. A. Hlinku 2,
94976 Nitra, Slovenská republika
1
Abstract
The aim of this study was to find the structural changes in the rat testis after a diazinon, selenium and
combined administration of both compounds. The testis structural changes after the diazinon
intraperitoneal administration of 20 mg.kg-1 b.w., selenium 2 mg.kg-1 b.w. and both diazinon 20 mg.kg1
b.w. and selenium 2 mg.kg-1 b.w. were killed 36 hours following administration. After preparation
of histological samples were evaluated by histological and morphometric methods in light microscopy.
36 hours after the diazion i.p. administration weight of testis were increased (P<0.05) - revealed
occurrence of edemas; reduced diameter and area of seminiferous tubuli (P<0.05), reduced volume of
functional epithelium (P<0.05), the vacuolization of the seminiferous epithelium volume (P<0.05),
evacuation of germ cells into the tubule lumen – deluminization (P<0.05), epithelium necrosis and
disintegration, interstitium volume extension (P<0.05), blood vessles volume (P<0.05), fibrotization
and Leydig cell necrosis were observed. The germ cells released from the basal lamina and
subsequently they were visible in the tubule lumen. Blood vessels were damaged. In selenium treated
group disintegration of cellular associations in the seminiferous epithelium, damaged and separating
spermatids lines, reduced spermatogenesis and significant reduction of functional seminiferous
epithelium volume (P<0.05), interstitium extension volume (P<0.05) were observed. Similar changes
as in selenium threated group occured, significant vacuolization of seminiferous epithelium volume
(P<0.05) was seen. In combined diazinon and selenium treated group were morphometric observed
similar changes to diazinon treated group, but protective effects of selenium in seminiferous
epithelium and interstitium were histologicaly observed. Diazinon causes the damage of the germinal
epithelium and interstitium in the testes leading to the spermatogenesis failure. The infertility can then
appear. Selenium causes disintegration of cellular associations in the seminiferous epithelium and
reduced spermatogenesis. In combined diazinon and selenium treated group protective effects of
selenium in seminiferous epithelium and interstitium were histologicaly noticed. Further investigation
of combined diazinon and selenium interaction is needed to practical use this results.
Key words: diazinon, selenium, testis, histology, morphometry, rat
Úvod
Diazinon je organofosforeĉný pesticíd urĉený na niĉenie rôzneho hmyzu. Vyuņíva sa
v poľnohospodárstve na ońetrenie pôdy, poľných plodín, sadov, krmív, v domácnostiach na ońetrenie
trávnikov, niĉenie mravcov, ńvábov a iné pouņitie, na reguláciu hmyzu v ņom zamorených oblastiach
a vo veterinárnej medicíne na niĉenie koņných parazitov. Má dlhú perzistenciu a relatívne nízku
toxicitu pre cicavce (EPA, 2006; Melendres et al., 1993). Jeho pouņívanie zasahuje na rôznych
stupņoch potravového reťazca ĉloveka. Pôsobí ako kontaminant ņivotného prostredia a jeho priama
aplikácia, alebo rezíduá ako cudzorodá látka v potravinách a krmivách (Potravinový kódex SR, 2010).
V posledných piatich rokoch bolo rýchlym výstraņným systémom pre potraviny a krmivá (Rapid alert
system for food and feed) slúņiacim na ochranu spotrebiteľa v ĉlenských ńtátoch Európskej únie
hlásených niekoľko zistených nadlimitných koncentrácií diazinonu z kontrolovaných vzoriek. V roku
2005 bola hlásená ryņa z Portugalska; v roku 2006 klementínky zo Ńpanielska; 2008 vińne, ĉereńne
(2x) z Turecka, pomaranĉe z Egypta; 2009 kapusta z Poľska, jablká z USA (3x), pńenica z Bulharska,
37
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
uhorky z Jordánska, jablká z Uruguaya, vińne a jahody z Turecka; 2010 pomaranĉe z Egypta (RASFF,
2010). Problém kontaminácie potravín a krmív nadlimitnými mnoņstvami toxických
organofosforeĉných pesticídov a ćalńích agrochemikálií je stále aktuálny. Toxicita diazinonu je
zapríĉinená inhibíciou enzymatického, cholínesterázového, odbúravania cholinergných mediátorov
nervového vzruchu (acetylcholínu) na takto inervovaných miestach organizmu. Pôsobenie sa prejavuje
navonok príznakmi otravy, ako sú bolesti hlavy, úzkosť, slabosť, strach, rozńírené zrenice, rozmazané
videnie, nevoľnosť, zvracanie, kŕĉe brucha, hnaĉka, sťaņené dýchanie, kóma aņ smrť (ATSDR, 2008).
Öĉinok diazinonu v ņivých organizmoch na molekulárnej úrovni sa prejavuje zvýńenou tvorbou
voľných radikálov, ktoré peroxidáciou lipidov a ćalńími mechanizmami ich úĉinku narúńajú vývoj,
ńtruktúru a funkcie génov, DNA, biologických membrán, bunkových organel a tak aj funkĉných
jednotiek – buniek (Okamura et al., 2009; Harris et al., 2009; Oostingh et al., 2009; Salazar-Arredondo
et al., 2008; Sarabia et al., 2009a, Pourkhalili et al., 2009; Giordano et al., 2007; Piña-Guzmán et al.,
2005; Sadri et al., 2010; Slotkin a Seidler, 2009; Sutcu et al., 2007; Altuntas et al., 2004, Rastogi et al.,
2009). Na tkanivách a orgánoch sa tieto úĉinky prejavujú neurotoxickými (Giordano et al., 2007;
Slotkin a Seidler, 2007, 2009; Roegge et al., 2008; Rush et al., 2010) genotoxickými (Sarabia et al.,
2009a; Salazar-Arredondo et al., 2008; Piña-Guzmán et al., 2005), hepatotoxickými (Amirkabirian et
al., 2007; Kalender et al., 2005), imunotoxickými (Alluwaimi a Hussein, 2007; Oostingh et al., 2009)
a ćalńími úĉinkami. Toxicky ćalej pôsobí na bunky prieĉne pruhovaných svalov (Wecker et al., 1985;
Cavaliere et al., 1998; Amirkabirian et al., 2007), srdcovej svaloviny (Akturk et al., 2006), pankreasu
(Pourhkalili et al., 2009), vajeĉníka (Dutta a Maxwell, 2003), semenníka (Sarabia et al., 2009a,b;
Salazar-Arredondo et al., 2008; Piña-Guzmán et al., 2005) a ćalńie orgány. Mnohé bunky vystavené
takémuto cytotoxickému pôsobeniu diazinonu podliehajú nekróze alebo apoptóze (Wecker et al.,
1985; Aluigi et al., 2010; Rush et al., 2010; Sarabia et al., 2009b; Cavaliere et al., 1998). Tkanivá
a orgány zasiahnuté týmto pôsobením podliehajú fyziopatologickým a histopatologickým zmenám
(Slotkin a Seidler, 2007; Pourkhalili et al., 2009; Giordano et al., 2007; Salazar-Arredondo et al.,
2008; Maxwell a Dutta, 2005, Dutta a Maxwell, 2003; Roegge et al., 2008). Diazinon patrí medzi
látky spôsobujúce hormonálny rozvrat (El-Aziz et al., 1994; El-Hoda a Zidan, 2009; Alahyary et al.,
2008). Výrazné zmeny sú pozorované aj na samĉom pohlavnom systéme (Sarabia et al., 2009a,b;
Salazar-Arredondo et al., 2008; Piña-Guzmán et al., 2005). Toxické úĉinky diazinonu sa teda
prejavujú komplexne na fyziologických, biochemických a histologických patologických zmenách
zasiahnutého organizmu (Yehia et al., 2007). Niektorí autori navrhujú vyuņívať úĉinky silných
antioxidantov (melatonínu, vitamínu C, E, N-acetyl-cysteínu, pentoxifilínu) na zníņenie negatívnych
úĉinkov diazinonu (Sarabia et al., 2009b; Sutcu et al., 2007; Akturk et al., 2006; Kalender et al., 2005;
Shadnia et al., 2007; Amirkabirian et al., 2007).
Hladina Se v ņivoĉíńnych organizmoch je závislá od obsahu v systéme pôda - rastlina. Rozdiely
v hladinách selénu v potravinách vyplývajú z rôzneho obsahu a bioprístupnosti z pôdy, ĉím je urĉené
jeho mnoņstvo v celom potravovom reťazci. Moņnosti ovplyvnenia obsahu vo výslednom krmive,
alebo potravine sa dajú zvýńiť jeho pridávaním do krmív, potravín, alebo suplementáciou. Slovensko
je charakterizované ako krajina s nízkym obsahom selénu v pôdach a nízkym selénovým statusom
v krvi ľudí, ĉo môņe narúńať biologické procesy na ktorých sa zúĉastņuje (Chovancová a Krajņáková,
2004). Rýchlym výstraņným systémom pre potraviny a krmivá boli v posledných piatich rokoch
zaznamenané nasledovné nepovolené odobraté vzorky. V roku 2005: nepovolené aditívum –
organický selén v selénovom premixe z Írska, organický selén v krmive z Nemecka, Veľkej Británie,
organický selén v selénoaminokyselinovom komplexe z Veľkej Británie (2x), organický selén
v kvasnicovom selénovom výrobku z Francúzska. V roku 2006: Nepovolené aditívum - organický
selén v krmive pre psov a maĉky z Kanady (2x), Brazílie. 2007: vysoký obsah selénu (2,62 mg.kg -1)
v krmive odstavĉiat z Veľkej Británie. 2008: vysoký obsah selénu (330 mg.kg-1) v doplnkovej výņive
z Nemecka. 2009: vysoký obsah selénu v (343 mg.kg-1) v premixe. V roku 2010 zatiaľ neboli hlásené
ņiadne záznamy (RASFF, 2010). Selén je esenciálny mikroelement s rozmanitými funkciami v ņivom
organizme. Pri vysokých dávkach pôsobí toxicky. Ako kofaktor sa zúĉastņuje dejodácie
tyreoideálnych hormónov (ATSDR, 2003). Je súĉasťou antioxidaĉných enzýmov ako
seléndependentnej glutatiónperoxidázy a ćalńích antioxidaĉne pôsobiacich látok ochraņujúcich
membrány buniek a DNA pred pońkodením voľnými radikálmi. Selén teda zohráva významnú úlohu v
etiopatogenéze nádorových, kardiovaskulárnych a iných ochorení, funkciách imunitného systému,
starnutí organizmu a pri pôsobení toxických látok (Wojtczak, 2003; Sun, Mu a Ma et al., 2005;
38
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ATSDR, 2003). Pôsobí ochranne pred toxickými úĉinkami niektorých ťaņkých kovov – kadmia, ortuti,
hlinníka (Xu et al., 2003; Mozofarian, 2009; El-Demerash, 2004; Abubakar et al., 2003). Výrazné je
pôsobenie na pohlavný systém samcov. Pri prekroĉení optimálnych dávok pôsobí toxicky na ńtruktúry
semenníka (Kaur a Kaur, 2000; Parshad a Sud, 1989; Chowdhury a Venkatakrishna-Bhat, 1983;
Nebbia et al., 1987). Selén vo forme selénoproteínu P a seléndependentnej fosfolipidovej
hydroxiperoxidovej glutatión peroxidázy (PHGPx) je u cicavcov nevyhnutný pre normálny priebeh
spermatogenézy (Boitani a Puglishi, 2008). Zistené boli pozitívne úĉinky selénu na Leydigove bunky
a sekréciu testosterónu u muņov (Akinloye et al., 2005). Známe sú úĉinky selénu v prevencii rakoviny
prostaty (Clark et al., 1998). Selén podporuje plodnosť samcov a muņov zvýńenou produkciou
a zlepńením pohyblivosti spermií (Keskes-Ammar et al., 2003). Mnohí autori navrhujú vyuņívať rôzne
formy selénu ako indikátor parametrov kvality ejakulátu u zvierat (Stradioli et al, 2009; Kaoruko,
1999) a ľudí (Shinohara et al., 2005; Foresta, Flohé a Garolla, 2002). Selén samostatne alebo
v kombinácii s vitamínom E alebo N-acetyl-cysteínom sa odporúĉa vyuņívať na lieĉbu niektorých
foriem neplodnosti muņov (Keskes-Ammar et al, 2003; Safarinejad a Safarinejad, 2009).
Takmer neznáme sú úĉinky kombinácie a interakcií diazinonu a selénu. Kashanian et al. (2008)
uvádzajú ochranné pôsobenie selénu pred ńkodlivými úĉinkami diazinonu na DNA týmusu teliat.
Autori inej ńtúdie zaznamenali oproti úĉinku samotného diazinonu výraznejńí, ale ńtatisticky
nepreukazný pokles aktivity cholínesterázy v krvnej plazme potkanov po podaní kombinácie selénu
a diazinonu, ĉo znaĉí moņné znásobenie úĉinku na pokles aktivity cholínesterázy (Ńińka et al., 2008)
s následným úĉinkom na tkanivá.
Cieľom experimentu bolo popísať a vyhodnotiť ńtrukturálne zmeny semenníka potkana po
intraperitoneálnom podaní selénu, diazinonu a ich kombinácie.
Materiál a metodika
40 samcov potkanov línie Wistar vo veku 3 mesiace bolo náhodne rozdelených do ńtyroch
skupín po 10 nasledovne: kontrolná skupina (K), skupina s podaním selénu (Se), diazinonu (DZN)
a kombinácie diazinonu a selénu (DZN+Se). Zvieratá boli umiestnené individuálne v plastových
nádobách na podstieľke z drevených hoblín. V priestoroch pokusného zariadenia sa dodrņiavali
základné nároky na ņivotné podmienky (teplota 20 – 22 °C, vlhkosť 55 ± 10 %, 12 hodinový svetelný
reņim) a neobmedzený prístup k vode a krmivu. Samcom skupiny Se bol podaný jednorazovo
intraperitoneálne selén (Reachem, Bratislava) vo forme seleniĉitanu sodného v dávke 2 mg.kg-1.
Samcom skupiny DZN sa aplikoval jednorazovo intraperitoneálne diazinon 99 % (Sigma-Aldrich,
USA) v dávke 20 mg.kg-1. Tretej skupine samcov (DZN+Se) bol podaný diazinon v dávke 20 mg.kg-1
a selén 2 mg.kg-1 v samostatnej aplikácii do rozdielnych miest bruńnej dutiny v rovnakom ĉase. Po 36
hodinách boli vńetci samci usmrtení humánnym spôsobom, vykonala sa anatomická pitva a odobrali sa
vzorky semenníkov, ktoré sa fixovali v modifikovanom Davidsonovom roztoku (Latendresse et al.,
2002). Vzorky sa ofarbili hematoxilín-eozínom a skúmali sa v svetelnom mikroskope Nikon Eclipse
E600. Hodnotenie mikrofotografií bolo uskutoĉnené komputerizovaným systémom vyhodnocovania
pomocou PC morfometrického softwaru M.I.S. Quick Photo a mikroskopom Olympus AX 70. Vzorky
semenníkov na histologických preparátoch sa ćalej vyhodnotili kvantitatívnymi morfometrickými
metódami modifikovanými podľa Uhrína a Kulíńeka (1980). V semenníku sa vyjadrili: plocha
skúmanej ńtruktúry (µm2); absolútny objem ńtruktúry semenníka (μm3) pre: semenotvorný epitel,
lúmen semenotvorných kanálikov, prázdne miesta v semenotvornom epiteli, intersticiálne tkanivo,
krvné cievy; ćalej sa vyjadrili priemer (μm) a plocha semenotvorného kanálika (μm2). Porovnávaná
bola aj priemerná hmotnosť semenníka (g). Rozdiely medzi kontrolnou a jednotlivými
experimentálnymi skupinami sa otestovali Scheffeho testom v software Statgraphics Centurion XV v.
15.2.05 na hladine preukaznosti α=0,05.
Výsledky a diskusia
Na mikroskopických preparátoch kontrolnej skupiny bola pozorovaná normálna ńtruktúra
semenotvorných kanálikov a intersticiálneho tkaniva. Semenotvorné kanáliky mali kruhovitý aņ
výrazne elipsovitý tvar, prebiehala v nich spermatogenéza. Boli zreteľne ohraniĉené neporuńenou
bazálnou membránou. Na bazálnu membránu nasadali Sertoliho bunky, spermatogónie, spermatocyty,
spermatidy aņ po spermie uvoľņujúce sa do lúmenu semenotvorného kanálika. Priestor medzi
jednotlivými kanálikmi vypĺņalo úzke intersticiálne tkanivo s viditeľnými krvnými cievami
39
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
a Leydigovými bunkami (Obrázok 1). Hmotnosť semenníkov zobrazuje tabuľka 1; plochu skúmanej
ńtruktúry semenníka tabuľka 2; relatívny a absolútny objem skúmaných ńtruktúr zobrazujú tabuľky 34; plochu a priemer semenotvorného kanálika tabuľka 5.
Po intraperitoneálnom podaní 20 mg.kg-1 diazinonu významne stúpla hmotnosť semenníka
(P<0,05), ĉo poukazuje na moņnú akútnu zápalovú reakciu a následný vznik edému semenníkov. ElHoda a Zidan (2009) pozorovali v chronickom teste po aplikácii 5 a 50 ppm diazinonu v krmive
potkanom po dobu 65 dní pokles hmotnosti semenníkov. Oproti náńmu experimentu sa jednalo o iný
spôsob aplikácie a dlhodobý pokus s celkovým niņńím toxickým pôsobením. Chattopadhyay et al.
(1999) po jednorázovej intraperitoneálnej aplikácii 3000 mg.kg-1 chloridu mećnatého zaznamenal
zníņenie hmotnosti semenníkov. Llobet et al. (1995) tieņ zaznamenal pokles hmotnosti semenníkov po
intraperitoneálnej aplikácii
200 mg.kg-1 dusiĉnanu hlinitého denne poĉas ńtyroch týņdņov
myńiam zníņenie hmotnosti semenníkov. Chandra et al. (2007) tieņ pozoroval zníņenie hmotnosti
semenníkov potkanov po podávaní 0,4-0,6 mg Cr6+.kg-1 ņ. h. v krmive poĉas subchronického testu.
Jana et al. (2006) po podávaní 5 mg arzenitanu sodného.kg-1 ņ. h. v krmive zaznamenal tieņ zníņenie
hmotnosti semenníkov a de Souza Predes et al. (2010) po intraperitoneálnej aplikácii 1,2 mg.kg-1 ņ.h.
chloridu kademnatého potkanom zaznamenal rovnako pokles hmotnosti semenníkov. Diazinon oproti
úĉinku iných toxických látok v nańom experimente akútnej toxicity spôsoboval významné zvýńenie
relatívnej priemernej hmotnosti semenníkov. Histologicky sme pozorovali výrazné pońkodenia
semenotvorného epitelu, vznik prázdnych miest, významné zníņenie jeho zastúpenia. Ćalej bolo
pozorované rozńírenie intersticiálneho tkaniva a dilatácia krvných ciev. Na mnohých miestach sa od
epitelu oddeľovala bazálna membrána. Výrazná bola deluminizácia kanálikov spôsobená rozpadom a
uvoľnením sa zárodoĉných buniek zo semenotvorného epitelu do lúmenu kanálika, ĉo sa prejavilo na
zníņení zastúpenia lúmenu. Vńetky zmeny sa prejavili ńtatisticky preukazne v morfometrickom
hodnotení. Zastúpenie objemu a plochy semenotvorného epitelu bolo oproti kontrole významne
zníņené (P<0,05), semenotvorné kanáliky podliehali konstrikcii, zniņoval sa ich priemer (P<0,05)
a plocha (P<0,05), rozpadala sa ich histoarchitektúra. Pokles priemeru semenotvorných kanálikov,
zvýńenie objemu interstícia a zníņenie objemu semenotvorného epitelu zaznamenal aj de Souza Predes
(2010) po intraperitoneálnej aplikácii 1,2 mg.kg-1 ņ.h. chloridu kademnatého potkanom. Zaznamenal
tieņ vakuolizáciu, vznik prázdnych miest v epiteli, ktoré vznikli uvoľnením odumretých buniek do
lúmenu. Massányi et al. (2007a) pozoroval po intraperitoneálnej aplikácii 50 mg.kg-1 PbNO3 ņ.h.,
podobne ako v nańom experimente, dilatáciu krvných ciev v interstíciu a zvlnenia bazálnej membrány,
odumieranie spermatogénnych buniek a rovnako aj vznik prázdnych miest v epiteli. Massányi et al.
(2007) po intraperitoneálnom podaní 20 mg.kg-1 HgCl2 zvlnenia bazálnej membrány, dilatáciu ciev,
vznik prázdnych miest v epiteli a zníņenie zastúpenia epitelu. Akútne pôsobenie týchto kovov je
v uvedených ukazovateľoch (najmä zníņenie zastúpenia semenotvorného epitelu, odumieranie
zárodoĉných buniek, rozńírenie interstícia) podobné akútnym úĉinkom diazinonu. To by mohlo
súvisieť s rovnakým výsledným mechanizmom neurohumorálnej stresovej reakcie uvedených
toxických látok s podobným úĉinkom na patologické zmeny ńtruktúr semenníka. Histopatologické
zmeny a zvýńenie lokálnej apoptózy v semeníkoch myńí po intraperitoneálnej aplikácii 2/3 LD50
diazinonu zaznamenal tieņ Sarabia et al. (2009b). Sarkar et al. (2003) po intraperitoneálnej aplikácii 6
mg.kg-1 arzenitanu sodného zaznamenal masívnu degeneráciu zárodoĉných buniek. Spoloĉným
znakom úĉinku týchto toxických látok je zvýńenie tvorby voľných radikálov narúńajúcich ńtruktúru
a funkcie semenníka. Rozpadom epitelu a uvoľņovaním jeho buniek v ņom vznikali mnohé prázdne
miesta, ĉo sa preukazne prejavilo ich nárastom v jeho plońnom a objemovom zastúpení (P<0,05),
oddeľovala sa bazálna membrána, uvoľnené zárodoĉné bunky zapĺņali lúmen kanálika, dochádzalo
k jeho deluminizácii a tým k poklesu jeho plochy a objemu (P<0,05). V ľahńích prípadoch boli v
lúmene kanálika pozorované masy pońkodených alebo odumretých spermií, v najťaņńích prípadoch
bolo pozorované úplné zastavenie spermatogenézy po rozpade a dezintegrácii nekrotizovaného
epitelu. Viacerí autori zaznamenali genotoxické úĉinky diazinonu na DNA spermií ĉloveka, potkanov
a myńí (Sarabia et al., 2009a; Salazar-Arredondo et al., 2008; Piña-Guzmán et al., 2005). Ńkodlivé
úĉinky na spermie potvrdzujú aj nańe histopatologické zistenia. Jana et al. (2006) po aplikácii 5 mg
arzenitanu sodného.kg-1 v krmive zaznamenal tieņ naruńenie spermatogenézy a pońkodenie
zárodoĉných buniek semenotvorného epitelu. Naopak významne plońne a objemovým zastúpením sa
zvýńilo zastúpenie interstícia (P<0,05), kolagénové a retikulárne vlákna boli uvoľnené zo svojej úzkej
kondenzovanej ńtruktúry, oproti kontrole sa zdali byť zmnoņené, dochádzalo k rozńíreniu a fibrotizácii
40
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
interstícia, ĉo tieņ podporuje hypotézu zápalu a následného edému. Edém interstícia zaznamenal aj
Massányi et al. (2007b) po intraperitoneálnej aplikácii 20 mg.kg-1 HgCl2 potkanom. Leydigove bunky
interstícia boli zväĉńa odumreté. Pedersen et al. (2003) zaznamenal po intraperitoneálnej aplikácii 500
mg.kg-1 bizmutu rovnako odumieranie Leydigových buniek. Rovnako Stoltenberg et al. (2002)
pozoroval selektívnu distribúciu subnitrátu bizmutu v lyzozómoch Leydigových buniek, ĉo viedlo
k ich odumieraniu a poklesu hladiny sérového testosterónu, bez ovplyvnenia hladín LH a FSH. Na
niektorých mikrofotografiách bola pozorovaná dilatácia zväĉńením objemu krvných ciev interstícia, ĉo
sa morfometricky významne prejavilo nárastom ich objemu (P<0,05). Nami pozorované zmeny
(odumieranie Leydigových buniek, dilatácia a pońkodenie ciev) by potencionálne mohli súvisieť
s následnou produkciou testosterónu a iných androgénov. Rozliĉné zmeny v koncentráciách
testosterónu po aplikácii diazinonu zaznamenal El-Aziz et al. (1994) po orálnom podávaní diazinonu
potkanom v dávke 1,5 alebo 3 mg.kg-1 poĉas 65 dní. Zaznamenal pokles hladiny plazmatického
testosterónu a zníņenú oplodņovaciu schopnosť oproti kontrolnej skupine. Podobné výsledky v
poklese hladiny testosterónu zaznamenal po orálnom podávaní 50 mg.kg -1 ņivej hmotnosti diazinonu
po dobu 65 dní El-Hoda a Zidan (2009) u potkanov. Biswas et al. (2001) zistil pokles koncentrácie
sérového testosterónu po jednorazovej subkutánnej aplikácii 0,45 mg chloridu kademnatého.kg-1 ņivej
hmotnosti. Naproti tomu, Alahyary et al. (2008) zaznamenal po orálnom podávaní diazinonu
potkanom v subakútnom teste poĉas 28 dní zvýńenie plazmatickej hladiny testosterónu. El-Hoda
a Zidan (2009) pozorovali u potkanov zníņenú sekréciu folikulostimulaĉného hormónu a
luteinizaĉného hormónu pri podávaní 50 mg.kg-1 diazinonu orálne poĉas 65 dní, ako hormónov
hypofýzy zabezpeĉujúcich normálny priebeh spermatogenézy v semenotvorných kanálikoch
a sekréciu testosterónu v Leydigových bunkách. Jana et al. (2006) po aplikácii 5 mg arzenitanu
sodného.kg-1 ņ.h. zaznamenal zníņenie LH, FSH, testosterónu a zvýńenie koncentrácie kortikosterónu.
Princíp hormonálnej stresovej reakcie je aj pri úĉinku toxických látok rovnaký. Ako odpoveć na
stresový podnet sa zvýńi sekrécia adrenokortikotropného hormónu ktorého úĉinkom sa vyluĉujú
glukokortikoidy s následnými úĉinkami na metabolizmus, tkanivá a orgány, ĉo spôsobí zvýńenú
tvorbu voľných radikálov. Zvýńená hladina glukokortikoidov má navyńe aj priamy vplyv na indukciu
apoptózy Leydigových buniek potkanov, ĉo môņe potencionálne viesť k zníņeniu hladiny
cirkulujúceho testosterónu (Gao et al. 2002, 2003). Naruńenie steroidogenézy a zníņenie kvality
ejakulátu úĉinkami glukokortikoidov vplyvom na glukokortikoidové receptory semenníkov
s následnou represiou génov pre biosyntézu androgénov zaznamenali viacerí autori (Hu et al., 2008,
2008a; Martin et al., 2008; Reisch et al., 2009; Xiao et al., 2010). V nańom experimente boli cievy
oproti kontrolnej skupine pońkodené a dilatované. Kojima et al. (1993) v pokuse s aortou potkanov
zaznamenal tieņ hypotenzívny-dilataĉný úĉinok diazinonu na hladkosvalové bunky aorty súvisiaci
s pohybom a vyuņitím vápnika ako konstrikĉného faktora svalových buniek. Najĉastejńie pozorované
zmeny sú vyznaĉené na obrázku 2.
V skupine s podaním 2 mg.kg-1 selénu nepreukazne poklesla hmotnosť semenníkov. Zastúpenie
semenotvorného epitelu sa rovnako ako v skupine s podaním diazinonu zníņilo, interstícium bolo
rozńírené. Zvýńenie zastúpenia plochy a objemu lúmenu a ciev bolo rovnako nepreukazné.
Mikroskopicky sme pozorovali degeneratívne histopatologické zmeny v spojení buniek
semenotvorného epitelu. To spôsobovalo v niektorých kanálikoch uvoľņovanie odumretých buniek
epitelu (najmä spermatíd) do lúmenu, ĉo sa preukazne prejavilo na ploche a objeme ńtruktúr
semenníka, vznikom prázdnych miest v epiteli (P<0,05), zníņením zastúpenia plochy a objemu epitelu
(P<0,05) a rozńírením plochy a objemu interstícia (P<0,05). Zvýńené, ale ńtatisticky nepreukazné, bolo
zastúpenie plochy a objemu lúmenu kanálika a ciev; zníņenie zastúpenia plochy a priemeru
semenotvorného kanálika. Bazálna membrána, kolagénové, retikulárne vlákna, Leydigove bunky
a cievy v interstíciu mali neporuńenú ńtruktúru (Obrázok 3). Podobné zmeny v zníņení výńky epitelu a
poĉtu spermatogénnych buniek, pońkodení bunkových spojení boli pozorované po perorálnom
podávaní 6 a 8 ppm selénu potkanom po dobu 6, resp. 9 týņdņov (Kaur a Kaur, 2000). Ćalńí autori
uvádzajú podobné výsledky po skrmovaní na selén bohatej pńenice potkanmi. Zaznamenali
pońkodenie semenotvorného epitelu, pońkodenie spermatogénnych buniek, tvorbu zhlukov spermatíd a
uvoľņovanie spermatogénnych buniek do priestorov lúmenu kanálikov. Tieto zmeny boli závislé od
dávky a dĺņky ĉasu podávania selénu (Parshad a Sud, 1989). Nebbia et al. (1987) zaznamenali
u potkanov po podávaní 16 ppm selénu potkanom v pitnej vode degenerované spermatídy,
oligospermiu a intertubulárny edém. Rovnako Massányi et al. (2007b) zaznamenali po
41
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
intraperitoneálnom podávaní 20 mg.kg-1 ņ.h. HgCl2 potkanom vyńńie zastúpenie lúmenu kanálika ako
aj v nańom experimente. Chowdhury a Venkatakrishna-Bhat (1983) zaznamenali po orálnom podávaní
6 a 10 µg Se poĉas 90 dní významné pońkodenia spermatogénnych buniek a celkovú degeneráciu
semenníka, ĉo viedlo k atrofii semenníkov. Oproti náńmu akútnemu testu sa jednalo o niņńie dávky
selénu a orálne dávkovanie, no výsledky sú takmer zhodné.
Po podaní kombinácie 20 mg.kg-1 diazinonu a 2 mg.kg-1 selénu nepreukazne vzrástla
hmotnosť semenníkov. Hmotnosť bola vyńńia ako v skupine s podaním selénu, ale niņńia ako
v skupine s podaním diazinonu. To poukazuje na celkové niņńie toxické pôsobenie na semenník oproti
samostatnej aplikácii diazinonu. Histopatologické zmeny po podaní kombinácie (obrázok 4) boli
morfometricky podobné ako v skupine s podaním diazinonu, no zároveņ boli histopatologicky
omnoho menej výrazné. Pońkodenia semenotvorného epitelu sa prejavili na zníņení zastúpenia plochy
a objemu epitelu (P<0,05). Významne pońkodené boli spojenia buniek semenotvorného epitelu, ĉo
spôsobovalo po odumretí ich uvoľņovanie do lúmenu a ńtatisticky významný nárast plochy a objemu
prázdnych miest (P<0,05). Nárast bol ale niņńí, ako v skupine s podaním diazinonu. Semenotvorné
kanáliky podliehali konstrikcii, významne sa zniņovalo zastúpenie ich plochy (P<0,05) a priemeru
(P<0,05). Mierny pokles absolútneho objemu lúmenu kanálika v pravom semenníku bol nepreukazný,
rovnako aj zvýńenie objemu ciev. Výrazné bolo pońkodenie spermatíd aņ ich úplné odlupovanie
a strata ich vrstiev do lúmenu, ĉím sa zniņovala plocha a objem epitelu. Vo väĉńine lúmenov kanálikov
boli pozorované nízke mnoņstvá pońkodených spermií a uvoľnených buniek semenotvorného epitelu.
Tým sa zastúpenie plochy lúmenu oproti kontrole výrazne zníņilo (P<0,05). Výrazne rozńírené boli
objem a plocha interstícia (P<0,05), rovnako objem ciev bol zvýńený (P<0,05). Oproti úĉinkom
diazinonu nebolo zaznamenané oddeľovanie sa bazálnej membrány a poruńenie kondenzovanej
ńtruktúry interstícia, ani odumieranie Leydigových buniek. Ozen et al. (2008) po aplikácii
formaldehydu s melatonínom potkanom zaznamenal ochranný úĉinok melatonínu, zníņenie hladiny
malondialdehydu, zvýńenie hladiny superoxid dismutázy a glutatión peroxidázy, pokles apoptózy
v semenníkoch. Kara et al. (2007) po subkutánnej aplikácii 1 mg.kg-1 chloridu kademnatého
samostatne a spolu s kombináciami antioxidantov: 60 mg.kg-1 vitamínu E+1 mg.kg-1 seleniĉitanu
sodného; 10 mg.kg-1 melatonínu; a kombinácia vitamínu E, seleniĉitanu a melatonínu v uvedených
dávkach. V skupine bez antioxidantov významne stúpla hladina malondialdehydu a významne
poklesla aktivita superoxid dismutázy; v skupinách s podaním antioxidantov hladina malondialdehydu
významne poklesla a významne stúpla aktivita superoxid dismutázy. Acharya et al. (2008) po
intraperitoneálnej aplikácii chloridu kademnatého myńiam ktorým bol suplementovaný vitamín C (10
mg.kg-1 ņ.h.) a vitamín E (100 mg.kg-1 ņ.h.) zaznamenal oproti úĉinkom kadmia bez suplementácie
vitamínov zníņenú peroxidáciu lipidov, zvýńený poĉet spermií, niņńí výskyt patologických spermií a
zvýńenú aktivitu antioxidaĉných enzýmov. Vplyv antioxidantov má ochrannú funkciu pred oxidaĉným
stresom vyvolaným úĉinkami toxických látok. Mishra a Acharya (2004) po podaní 10 mg.kg-1 octanu
olovnatého buć s vitamínom C (10 mg.kg-1 ņ.h.), vitamínom E (100 mg.kg-1 ņ.h.) a kombináciou
vitamínu C a E (10+100 mg.kg-1 ņ.h.) zaznamenal oproti úĉinku samotného olova zvýńenie poĉtu
spermií a niņńí výskyt ich patologických foriem. Whanger et al. (1980) udáva ochranné pôsobenie
injekĉne podaného selénanu a selenidu pred úĉinkami kadmia na semenníky potkana. Yiin et al.
(1999) pozoroval po injekĉnej aplikácii kombinácie kadmia a selénu zníņenie peroxidácie lipidov
a zníņené vytesņovanie ņeleza, medi a zinku zo semenníkov oproti úĉinkom samotne podaného
kadmia. Kadmium má odlińný spôsob biotransformácie a akumulácie ako diazinon. Selén spôsoboval
v uvedených experimentoch zníņenie akumulácie kadmia, zníņenie peroxidácie lipidov a zníņené
vytesņovanie esenciálnych mikroelementov zo semenníka s následným niņńím toxickým úĉinkom na
tkanivá. Podobne Kashanian et al. (2008) uvádzajú ochranné pôsobenie selénu pred ńkodlivými
úĉinkami diazinonu na DNA týmusu teliat. Potrebné sú ćalńie výskumy na objasnenie danej
problematiky. Kombinácia diazinonu a selénu napriek morfometrickým zisteniam spôsobovala
histolopatologicky výrazne niņńie toxické úĉinky oproti podaniu diazinonu, ĉím pôsobila na ńtruktúry
tkanív semenníka ochranne doposiaľ neznámou interakciou. To je dôleņité zistenie pre moņnosť
zníņenia toxicity organofosforeĉných pesticídov. V nańom experimente je uvedený ochranný
interakĉný mechanizmus zatiaľ neznámy.
42
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 1 Hmotnosť semenníka (g)
Hmotnosť semenníka
Skupina
X ± SD
Kontrola
1,45±0,25
Se
1,44±0,08
DZN+Se
1,49±0,10
DZN
1,62±0,10*
X-priemer, SD-ńtandardná odchýlka; * P<0,05
Tabuľka 2 Plocha skúmanej ńtruktúry semenníka (μm2)
Skupina
Semenotvorný
epitel
Prázdne miesta v
epiteli
Lúmen
kanálika
Interstícium
Cievy
X ± SD
Kontrola
4,60±0,51
0,03±0,07
1,67±0,63
0,78±0,31
0,02±0,04
Se
3,95±0,65*
0,15±0,16*
1,80±0,67
1,14±0,48*
0,05±0,21
DZN+Se
3,56±0,54*
0,18±0,15*
1,39±0,68*
1,91±0,68*
0,06±0,12
DZN
3,91±0,63*
0,49±0,39*
0,51±0,59*
2,12±0,67*
0,07±0,10
Interstícium
Cievy
X-priemer, SD-ńtandardná odchýlka; * P<0,05
Tabuľka 3 Absolútny objem ńtruktúry semenníka (μm3)
Skupina
Semenotvorný
epitel
Prázdne miesta v
epiteli
Lúmen
kanálika
X ± SD
Kontrola
90,42±10,50
0,53±1,42
32,90±12,45
15,24±6,02
0,41±0,74
Se
77,20±12,59*
2,87±3,14*
35,09±13,10
22,29±9,30*
1,05±4,16
DZN+Se
72,01±10,99*
3,68±2,96*
28,03±13,76*
38,58±13,76*
1,21±2,37*
DZN
85,77±13,83*
10,72±8,61*
11,10±12,85*
46,45±14,66*
1,46±2,25*
X-priemer, SD-ńtandardná odchýlka; * P<0,05
43
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 4 Relatívny objem ńtruktúry semenníka (%)
Skupina
Semenotvorný
epitel
Prázdne miesta v
epiteli
Lúmen
kanálika
Interstícium
Cievy
X ± SD
Kontrola
62,79±7,30
0,37±0,99
22,85±8,64
10,58±4,18
0,28±0,51
Se
53,61±8,74*
1,99±2,18*
24,36±9,09
15,48±6,46*
0,73±2,89
DZN+Se
50,00±7,64*
2,55±2,05*
19,46±9,56*
26,79±9,56*
0,84±1,65*
DZN
59,56±9,60*
7,45±5,98*
7,71±8,93*
32,26±10,18*
1,01±1,56*
X-priemer, SD-ńtandardná odchýlka; * P<0,05
Tabuľka 5 Plocha (μm2) a priemer (μm) jedného semenotvorného kanálika
Plocha semenotvorného kanálika
Priemer semenotvorného kanálika
x± SD
x ± SD
Kontrola
1,48±0,52
244,72±42,15
Se
1,33±0,51
231,48±42,09
DZN+Se
1,10±0,57*
210,84±41,37*
DZN
1,14±0,47*
214,39±42,52*
Skupina
X-priemer, SD-ńtandardná odchýlka; * P<0,05
Obrázok 1 Semenník potkana kontrolnej skupiny
(200x, HE).
1-semenotvorný epitel, 2-lúmen kanálika so
spermiami, 3-intersticiálne tkanivo, 4-krvná cieva
Obrázok 2 Semenník potkana po i.p. podaní
diazinonu (200x, HE).
1-dezintegrovaný nekrotizovaný epitel, 2-lúmen
vyplnený bunkami epitelu, 3-rozńírené interstícium
s nekrotizovanými Leydigovými bunkami, 4dilatovaná pońkodená cieva, ńípka-odlupovanie
epitelu od bazálnej membrány
44
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Obrázok 3 Semenník potkana po i.p. podaní
selénu (200x, HE).
1-semenotvorný epitel, 2-lúmen s odlúpnutými
bunkami epitelu, 3-intersticiálne tkanivo, 4-krvná
cieva
Obrázok 4 Semenník potkana po i.p. podaní
diazinonu a selénu (200x, HE).
1-semenotvorný epitel, 2-lúmen s odlúpnutými
bunkami epitelu, 3-intersticiálne tkanivo, 4-krvná
cieva, ńípka-prázdne miesta v epiteli
Záver
Výsledky intraperitoneálneho podania diazinonu ukázali, ņe spôsobuje výrazné pońkodenia
semenotvorného epitelu a intersticiálneho tkaniva. Narúńa ńtruktúru aņ dezintegruje semenotvorný
epitel, utlmuje aņ zastavuje spermatogenézu, rozńiruje intersticiálne tkanivo a pońkodzuje cievy.
Takéto pońkodenie funkĉných tkanív semenníka môņe spôsobiť naruńenie plodnosti aņ neplodnosť pri
akútnych otravách. Selén po i.p. podaní spôsobuje degeneratívne zmeny v spojení buniek
semenotvorného epitelu, narúńa jeho celistvosť a ńtruktúru najmä oddeľovaním spermatíd z epitelu,
ĉím sa priamo narúńa spermatogenéza, ĉo môņe viesť k zníņeniu plodnosti po akútnom predávkovaní
selénom alebo otravách. Kombinácia intraperitoneálne podaného diazinonu a selénu vykazuje
ochranný vplyv selénu voĉi úĉinkom diazinonu. Histopatologické pońkodenia semenníka po interakcii
diazinonu a selénu v organizme sú podobné úĉinkom samostatne podaného selénu – zmeny celistvosti
a ńtruktúry epitelu, pońkodenie a uvoľnenie spermatíd, naruńenie spermatogenézy. Zmeny sú vńak
slabńie ako po podaní samostatného diazinonu. Ochranné pôsobenie je potrebné ćalej skúmať, sú
potrebné ćalńie, najmä biochemické výskumy na objasnenie úĉinkov a následné vyuņívanie selénu
proti ńkodlivým úĉinkom diazinonu a potencionálne aj ćalńích organofosforeĉných pesticídov v praxi.
Negatívne úĉinky rezíduí pesticídov sa dajú zníņiť aj dodrņiavaním správnej agrotechnickej,
hygienickej a výrobnej praxe na strane jednej, na druhej strane primeranou kontrolou kontrolných
orgánov. Do budúcna je perspektívne namiesto synteticky vyrobených pre ņivé organizmy ńkodlivých
pesticídov vyuņitie biotechnológií na produkciu rastlín schopných produkovať biopesticídy, alebo
priamym pouņitím biopesticídov s omnoho niņńími negatívnymi úĉinkami na jednotlivé ĉlánky
potravového reťazca ĉloveka.
Poďakovanie
Práca bola finanĉne podporená projektom VEGA 1/0619/10.
Literatúra
ABUKABAR, M.G. - TAYLOR, A. - FERNS, G.A. 2004. The effects of aluminium and selenium
supplementation on brain and liver antioxidant status in the rat. In Afr. J. Biotechnol., vol. 3, 2004, no.
1 s. pp. 88-93.
ACHARYA, U.R. - MISHRA, M. - PATRO, J. - PANDA, M.K. 2008. Effect of vitamins C and E on
spermatogenesis in mice exposed to cadmium. In Reprod Toxicol., vol. 25, 2008, no. 1, pp. 84-88.
AKINLOYE, O. - AROWOJOLU, A.O. - SHITTU, O.B. - ADEJUWON, C.A. - OSOTIMEHIN, B.
2005. Selenium status of idiopathic infertile Nigerian males. In Biol. Trace Elem. Res., vol. 104, 2005,
no. 1, pp. 9-18.
ALAHYARY, P. - POOR, M.I. - AZARBAIJANI F.F. - NEJATI, V. 2008. The potential toxicity of
diazinon on physiological factors in male rat. In Pak. J. Biol. Sci., vol. 11, 2008, no. 1, pp. 127-130.
45
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
AKTURK, O. - DEMIRIN, H. - SUTCU, R. - YILMAZ, N. - KOYLU, H. - ALTUNTAS, I. 2006.
The effects of diazinon on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in rat heart and ameliorating
role of vitamin E and vitamin C. In Cell Biol. Toxicol., vol. 22, 2006, no. 6, pp. 455-461.
ALLUWAIMI, A.M. - HUSSEIN, Y. 2007. Diazinon immunotoxicity in mice: modulation of
cytokines level and their gene expression. In Toxicology, vol. 236, 2007, no. 1-2, pp. 123-131.
ALTUNTAS, I. - KILINC, I. - ORHAN, H. - DEMIREL, R. - KOYLU, H.- DELIBAS, N. 2004. The
effects of diazinon on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in erythrocytes in vitro. In Hum.
Exp.toxicol., vol. 23, 2004, no. 1, pp. 9-13.
ALUIGI, M.G. - GUIDA, C. - FALUGI, C. 2010. Apoptosis as a specific biomarker of diazinon
toxicity in NTera2-D1 cells. In Chem. Biol. Interact., vol. 35, 2010, in Press.
AMIRKABIRIAN, N. - TEIMOURI, F. - ESMAILY, H. - MOHAMMADIRAD, A. - ALIAHMADI,
A. - ABDOLLAHI, M. 2007. Protection by pentoxifylline of diazinon-induced toxic stress in rat liver
and muscle. In Toxicol. Mech. Methods, vol. 17, 2007, no. 4, pp. 215-221.
ATSDR - Agency for toxic substances and disease registry, 2003. Toxicological profile for selenium.
U.S. Department of health and human services, 2003. 457 s.
ATSDR - Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2008. Toxicological profile for
diazinon. U.S. Department of health and human services, 2008. 298 s.
BISWAS, N.M. - SEN GUPTA, R. - CHATTOPADHYAY, A. - CHOUDHURY, G.R. - SARKAR,
M. 2001. Effect of atenolol on cadmium-induced testicular toxicity in male rats. In Reprod. Toxicol.,
vol. 15, 2001, no. 6, pp. 699-704.
BOITANI, C. - PUGLISI, R. 2008. Selenium, a key element in spermatogenesis and male fertility. In
Adv. Exp. Med. Biol., vol. 63, 2008, no. 6, pp. 65-73.
CAVALIERE, M. J. - PUGA, F.R. - CALORE, E.E. - CALORE, N.M. - PELEGRINO, J.R. - DA
ROSA, A.R. - WEG, R. 1998. Protective effect of pralidoxime on muscle fiber necrosis induced by
organophosphate compounds. In J. Toxicol. Clin. Toxicol., vol. 36, 1998, no. 4, pp. 295-300.
CLARK, L.C. - DALKIN, B. - KRONGRAD,A. - COMBS, G.F. - TURNBULL, B.W. - SLATE, E.H.
- WITHERINGTON, R. - HERLONG, J.H. - JANOSKO, E. - CARPENTER, D. - BOROSSO, C. FALK, S. - ROUNDER, J. 1998. Decreased incidence of prostate cancer with selenium
suplementation: results of a double-blind cancer prevention trial. In British Jurnal of Urology, vol. 81,
1998, no. 6, pp. 730-734. CHOWDHURY, A.R. - VENKATAKRISHNA-BHATT, H. 1983. Effect of
selenium dioxide on the testes of rat. In Indian J. Physiol. Pharmacol., vol. 27, 1983, no. 3, pp. 237240.
DE SOUZA PREDES, F. - DIAMANTE, M.A. - DOLDER, H. 2010. Testis response to low doses of
cadmium in Wistar rat. In Int. J. Exp. Pathol., vol. 91, 2010, no. 2, pp. 125-131.
DUTTA, H.M. - MAXWELL, L.B. 2003. Histological examination of sublethal effects of diazinon on
ovary of bluegill, Lepomis macrochirus. In Environ. Pollut., vol. 121, 2003, no. 1, pp. 95-102.
DUTTA, H.M. - MEIJER H.J. 2003. Sublethal effects of diazinon on the structure of the testis of
bluegill, Lepomis macrochirus: a microscopic analysis. In Environ. Pollut., vol. 125, 2003, no. 3, pp.
355-360.
EARL, F.L. - MELVEGER, B.E. - REINWALL, J.E. et al. 1971. Diazinon toxicity--comparative
studies in dogs and miniature swine. In Toxicol. Appl. Pharmacol., vol. 18, 1971, no. 2, pp. 285-295.
EL-AZIZ, A.M.I. - SAHLAB, A.M. - EL-KHALIK A.M. 1994. Influence of diazinon and
deltamethrin on reproductive organs and fertility of male rats. In Dtsch. Tierarztl. Wochenschr., vol.
101, 1994, no. 6, pp. 230-232.
EL-DEMERASH, F.M. 2004. Antioxidant effect of vitamin E and selenium on lipid
peroxidation, enzyme activities and biochemical parameters in rats exposed to aluminium. In
J. Trace Elem. Med. Biol., vol. 18, 2004, no. 1, pp. 113-121.
EL-HODA, N. - ZIDAN, A. 2009. Evaluation of the reproductive toxicity of chlorpyrifos methyl,
diazinon and profenofos pesticides in male rat. In Int. J. of Pharm., vol. 5, 2009, no. 1, pp. 51-57.
EPA - Environmental Protection Agency, 2006. Interim reregistration eligibility decision. Diazinon.
Washington, D. C.: U. S. Environmental Protection Agency, 2006.
FORESTA, C. - FLOHÉ, L. - GAROLLA, A. - ROVERI, A. - URSINI, F. - MAIORINO, M. 2002.
Male fertility is linked to the selenoprotein phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. In
Biol. Reprod., vol. 67, 2002, no. 3, pp. 967-971.
46
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
GAO, H.B. - TONG, M.H. - HU, Y.Q. - GUO, Q.S. - GE, R. - HARDY, M.P. 2002. Glucocorticoid
induces apoptosis in rat leydig cells. In Endocrinology, vol. 143, 2002, no. 1, pp. 130-138.
GAO, H.B. - TONG, M.H. - HU, Y.Q. - YOU, H.Y. - GUO, Q.S. - GE, R.S. - HARDY, M.P. 2003.
Mechanisms of glucocorticoid-induced Leydig cell apoptosis. In Mol. Cell Endocrinol., vol. 199,
2003, no. 1-2, pp. 153-163.
GIORDANO, G. - AFSHARINEJAD, Z. - GUIZZETTI, M. - VITALONE, A. - KAVANAGH, T.J. COSTA, L.G. 2007. Organophosphorus insecticides chlorpyrifos and diazinon and oxidative stress in
neuronal cells in a genetic model of glutathione deficiency. In Toxicol. Appl. Pharmacol., vol. 219,
2007, no. 2-3, pp. 181-189.
HARRIS, W. - SACHANA, M. - FLASKOS, J. - HARGREAVES, A.J. 2009. Proteomic analysis of
differentiating neuroblastoma cells treated with sub-lethal neurite inhibitory concentrations of
diazinon: identification of novel biomarkers of effect. In Toxicol Appl Pharmacol., vol. 240, 2009, no.
2, pp. 159-165.
HU, G.X. - LIAN, Q.Q. - LIN, H. - LATIF, S.A. - MORRIS, D.J. - HARDY, M.P. - GE, R.S. 2008.
Rapid mechanisms of glucocorticoid signaling in the Leydig cell. In Steroids, vol. 73, 2008, no. 9-10,
pp. 1018-1024.
HU, G.X. - LIN, H. - SOTTAS, C.M. - MORRIS, D.J. - HARDY, M.P. - GE, R.S. 2008a. Inhibition
of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase enzymatic activities by glycyrrhetinic acid in vivo supports
direct glucocorticoid-mediated suppression of steroidogenesis in Leydig cells. In J. Androl., vol. 29,
2008, no. 3, pp. 345-351.
CHANDRA, A.K. - CHATTERJEE, A. - GHOSH, R. - SARKAR, M. - CHAUBE, S.K. 2007.
Chromium induced testicular impairment in relation to adrenocortical activities in adult albino rats. In
Reprod. Toxicol., vol. 24, 2007, no. 3-4, pp. 388-396.
CHATTOPADHYAY, A. - SARKAR, M. - SENGUPTA, R. - ROYCHOWDHURY, G. - BISWAS,
N.M. 1999. Antitesticular effect of copper chloride in albino rats. In J. Toxicol. Sci., vol. 24, 1999, no.
5, pp. 393-397.
CHOVANCOVÁ, D. - KRAJŅÁKOVÁ, M. 2004. Moņnosti stanovenia selénu s ohľadom na jeho
premeny v biologických systémoch. In Nova Biotechnologica, vol. 4, 2004, no. 1, pp. 27-40.
JANA, K. - JANA, S. - SAMANTA, P.K. 2006. Effects of chronic exposure to sodium arsenite on
hypothalamo-pituitary-testicular activities in adult rats: possible an estrogenic mode of action. In
Reprod. Biol. Endocrinol., vol. 16, 2006, no. 4, p. 9.
KALENDER, S. - OGUTCU, A. - UZUNHISARCIKLI, M. - AÇIKGOZ, F. - DURAK, D. ULUSOY, Y. - KALENDER, Y. 2005. Diazinon-induced hepatotoxicity and protective effect of
vitamin E on some biochemical indices and ultrastructural changes. In Toxicology, vol. 21, 2005, no.
3, pp. 197-206.
KAORUKO, M. - SHUJI, H. - KAZUHIKO, H. - ATSUKO, S. - MOMOKO, CH. - YUTAKA, I.
1999. Selenium-dependent phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) mRNA in rat
spermatozoa. In Biomed Res. Trace Elem., vol. 10, 1999, no. 1, pp. 19-23.
KARA, H. – CEVIK, A. – KONAR, V. – DAYANGAC, A. - YILMAZ M. 2007. Protective effects of
antioxidants against cadmium-induced oxidative damage in rat testes. In Biol. Trace Elem. Res., vol.
120, 2007, no. 1-3, pp. 205-211.
KASHANIAN, S. - GHOLIVAND, M.B. - AHMADI, F. - RAVAN, H. 2008. Interaction of diazinon
with DNA and the protective role of selenium in DNA damage. In DNA Cell Biol., vol.27, 2008, no. 6,
pp. 325-332.
KAUR, R. - KAUR, K. 2000. Effects of dietary selenium (SE) on morphology of testis and cauda
epididymis in rats. In Indian J. Physiol. Pharmacol., vol. 44, 2000, no.3, pp. 265-272.
KESKES-AMMAR, L. - FEKI-CHAKROUN, N. - REBAI, T. - SAHNOUN, Z. - GHOZZI, H. HAMMAMI, S. - ZGHAL, K. - FKI, H. - DAMAK, J. - BAHLOUL, A. 2003. Sperm oxidative stress
and the effect of an oral vitamin E and selenium supplement on semen quality in infertile men. In
Arch. Androl., vol. 49, 2003, no. 2, pp. 83-94.
LATENDRESSE, J.R. - WARBRITTION, A.R. - JONASSEN, H. - CREASY, D.M. 2002. Fixation
of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional
Davidson's fluid. In Toxicol. Pathol., vol. 30, 2002, no. 4, pp. 524-533.
47
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
MARTIN, L.J. - TREMBLAY, J.J. 2008. Glucocorticoids antagonize cAMP-induced Star
transcription in Leydig cells through the orphan nuclear receptor NR4A1. In J. Mol. Endocrinol., vol.
41, 2008, no. 3, pp. 165-175.
MELENDRES, J. - SEDIK, L. - WESTER, R.C. 1993. Percutaneous absorption of diazinon in
humans. In Food Chem. Toxicol., vol. 3, 1993, no. 8, pp. 569-572.
MISHRA, M. - ACHARYA, U.R. 2004. Protective action of vitamins on the spermatogenesis in leadtreated Swiss mice. In J. Trace Elem. Med. Biol., vol. 18, 2004, no. 2, pp. 173-178.
MOZAFARIAN, D. 2009. Fish, mercury, selenium and cardiovascular risk: current evidence and
unanswered questions. In Int. J. Environ. Res. Public Health., vol. 6, 2009, no. 6, pp. 1894-1916.
NEBBIA, C. - BRANDO, C. - BURDINO, E. - RASERO, R. - VALENZA, F. - ARISIO, R. UGAZIO, G. 1987. Effects of the chronic administration of sodium selenite on rat testes. In Res.
Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., vol. 58, 1987, no. 2, pp. 183-197.
OKAMURA, A. - KAMIJIMA, M. - OHTANI, K. - YAMANOSHITA, O. - NAKAMURA, D. - ITO,
Y. - MIYATA, M. - UEYAMA , J. - SUZUKI, T. - IMAI, R. - TAKAGI, K. - NAKAJIMA, T. 2009.
Broken sperm, cytoplasmic droplets and reduced sperm motility are principal markers of decreased
sperm quality due to organophosphorus pesticides in rats. In J. Occup. Health., vol. 51, 2009, no. 6,
pp. 478-487.
OOSTINGH, G.J. - WICHMANN, G. - SCHMITTNER, M. - LEHMANN, I. - DUSCHL, A. 2009.
The cytotoxic effects of the organophosphates chlorpyrifos and diazinon differ from their
immunomodulating effects. In J. Immunotoxicol., vol. 6, 2009, no. 2, pp. 136-145.
OZEN, O.A. - KUS, M.A. - KUS, I. - ALKOC, O.A. - SONGUR, A. 2008. Protective effects of
melatonin against formaldehyde-induced oxidative damage and apoptosis in rat testes: an
immunohistochemical and biochemical study. In Syst. Biol. Reprod. Med., vol. 54, 2008, no. 4-5, pp.
169-176.
PARSHAD, R.K. - SUD, M. 1989. Effect of selenium-rich wheat on rat spermatogenesis. In
Andrologia, vol. 21, 1989, no. 5, pp. 486-489.
PIÑA-GUZMÁN, B. - SOLÍS-HEREDIA, M.J. - QUINTANILLA-VEGA B. 2005. Diazinon alters
sperm chromatin structure in mice by phosphorylating nuclear protamines. In Toxicol. Appl.
Pharmacol., vol. 202, 2005, no. 2, pp. 189-198.
RECIO-VEGA, R. - OCAMPO-GÓMEZ, G. - BORJA-ABURTO, V.H. - MORAN-MARTÍNEZ, J. CEBRIAN-GARCIA, M.E. 2008. Organophosphorus pesticide exposure decreases sperm quality:
association between sperm parameters and urinary pesticide levels. In J. Appl. Toxicol., vol. 28, 2008,
no. 5, pp. 674-680.
SAFARINEJAD, M.R. - SAFARINEJAD, S. 2009. Efficacy of selenium and/or N-acetyl-cysteine for
improving semen parameters in infertile men: a double-blind, placebo controlled, randomized study.
In J. Urol., vol. 181, 2009, no. 2, pp. 741-751.
SALAZAR-ARREDONDO, E. - DE JESÖS SOLÍS-HEREDIA, M. - ROJAS-GARCÍA, E. HERNÁNDEZ-OCHOA, I. - QUINTANILLA-VEGA, B. 2008. Sperm chromatin alteration and DNA
damage by methyl-parathion, chlorpyrifos and diazinon and their oxon metabolites in human
spermatozoa. In Reprod. Toxicol., vol. 25, 2008, no. 4, pp. 455-460.
SARABIA, L. - MAURER, I. - BUSTOS-OBREGÓN, E. 2009a. Melatonin prevents damage elicited
by the organophosphorous pesticide diazinon on mouse sperm DNA. In Ecotoxicol. Environ. Safety,
vol. 72, 2009, no. 2, pp. 663-668.
SARABIA, L. - MAURER, I. - BUSTOS-OBREGÓN, E. 2009b. Melatonin prevents damage elicited
by the organophosphorous pesticide diazinon on the mouse testis. In Ecotoxicol. Environ. Safety, vol.
72, 2009, no. 3, pp. 938-942.
KOJIMA, T. - TSUDA, S. - SHIRASU, Y. 1993. Inhibitory effect of fenthion and diazinon on the
contraction of rat aorta, and its contribution to lethality. In J. Vet. Med. Sci., vol. 55, 1993, no. 3, pp.
383-385.
LLOBET, J.M. - COLOMINA, M.T. - SIRVENT, J.J. - DOMINGO, J.L. - CORBELLA, J. 1995.
Reproductive toxicology of aluminum in male mice. In Fundam. Appl. Toxicol., vol. 25, 1995, no. 1,
pp. 45-51.
MASSÁNYI, P. - LUKÁĈ, N. - MAKAREVICH, A.V. - CHRENEK, P. - FORGÁCS, Z. ZAKRZEWSKI, M. - STAWARZ, R. - TOMAN, R. - LAZOR, P. - FLESAROVÁ, S. 2007. Lead-
48
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
induced alterations in rat kidneys and testis in vivo. In J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard Subst.
Environ. Eng., vol. 42, 2007a, no. 5, pp. 671-676.
MASSÁNYI, P. - LUKÁĈ, N. - SLIVKOVÁ, J. - KOVÁĈIK, J. - MAKAREVICH, A.V. CHRENEK, P. - TOMAN, R. - FORGÁCS, Z. - SOMOSY, Z. - STAWARZ, R. - FORMICKI, G.
2007b. Mercury-induced alterations in rat kidneys and testes in vivo. In J. Environ. Sci. Health A Tox.
Hazard Subst. Environ. Eng., vol. 42, 2007, no. 7, pp. 865-870.
MAXWELL, L.B. - DUTTA, H.M. 2005. Diazinon-induced endocrine disruption in bluegill sunfish,
Lepomis macrochirus. In Ecotoxicol. Environ. Saf., vol. 60, 2005, no. 1, pp. 21-27.
PEDERSEN, L.H. - STOLTENBERG, M. - ERNST, E. - WEST, M.J. 2003. Leydig cell death in rats
exposed to bismuth subnitrate. In J. Appl. Toxicol, vol. 23, 2003, no. 4, pp. 235-238.
PIÑA-GUZMÁN, B. - SOLÍS-HEREDIA, M.J. - QUINTANILLA-VEGA, B. 2005. Diazinon alters
sperm chromatin structure in mice by phosphorylating nuclear protamines. In Toxicol. Appl.
Pharmacol., vol. 202, 2005, no. 2, pp. 189-198.
POTRAVINOVÝ KÓDEX SLOVENSKEJ REPUBLIKY. Výnos MP SR a MZ SR z 11. septembra
2006 ĉ.18558/2006-SL a Výnos MP SR a MZ SR z 29.októbra 2007 ĉ.14300/2007-OL).
POURKHALILI, N. - POURNOURMOHAMMADI, S. - RAHIMI, F. - VOSOUGH-GHANBARI, S.
- BAEERI, M. - OSTAD, S.N. - ABDOLLAHI, M. 2009. Comparative effects of calcium channel
blockers, autonomic nervous system blockers, and free radical scavengers on diazinon-induced
hyposecretion of insulin from isolated islets of Langerhans in rats. In Arh. Hig. Rada Toksikol., vol.
60, 2009, no. 2, pp. 157-164.
RASFF - Rapid Alert System for Food and Feed, 2010. Rýchly výstraņný systém pre potraviny a
krmivá [cit.:2010-17-5].
http://www.svssr.sk/sk/spotrebitel/rapidalert.asp?psearch=diazinon&Submit=+H%BEadaj+
http://www.svssr.sk/sk/spotrebitel/rapidalert.asp?psearch=selen&Submit=+H%BEadaj+
RASTOGI, S.K. - SATYANARAYAN, P.V.V. - RAVISHANKAR, D. - TRIPATHI, S. 2009. A study
on oxidative stress and antioxidant status of agricultural workers exposed to organophosphorus
insecticides during spraying. In Indian J. Occup. Environ. Med, vol. 13, 2009, no. 3, pp. 131-134.
REISCH, N. - FLADE, L. - SCHERR, M. - ROTTENKOLBER, M. - PEDROSA, G.F. BIDLINGMAIER, M. - WOLFF, H. - SCHWARZ, H.P. - QUINKLER, M. - BEUSCHLEIN, F. REINCKE, M.J. 2009. High prevalence of reduced fecundity in men with congenital adrenal
hyperplasia. In Clin. Endocrinol. Metab., vol. 94, 2009, no. 5, pp. 1665-1670.
ROEGGE, C.S. - TIMOFEEVA, O.A. - SEIDLER, F.J. - SLOTKIN, T.A. - LEVIN, E.D. 2008.
Developmental Diazinon Neurotoxicity in Rats: Later Effects on Emotional Response. In Brain Res.
Bull., vol. 75, 2008, no. 1, pp. 166-172.
RUSH, T. - LIU, X.Q. - HJELMHAUG, J. - LOBNER, D. 2010. Mechanisms of chlorpyrifos and
diazinon induced neurotoxicity in cortical culture. In Neuroscience, vol. 166, 2010, no. 3, pp. 899-906.
SADRI, S. - BAHRAMI, F. - KHAZAEI, M. - HASHEMI, M. - ASGARI, A. 2010. Cannabinoid
receptor agonist WIN-55,212-2 protects differentiated PC12 cells from organophosphorus- induced
apoptosis. In Int. J. Toxicol., vol. 29, 2010, no. 2, pp. 201-208.
SARKAR, M. - CHAUDHURI, G.R. - CHATTOPADHYAY, A. - BISWAS, N.M. 2003. Effect of
sodium arsenite on spermatogenesis, plasma gonadotrophins and testosterone in rats. In Asian J.
Androl., vol. 5, 2003, no. 1, pp. 27-31.
SHADNIA, S. - DASGAR, M. - TAGHIKHANI, S. - MOHAMMADIRAD, A. - KHORASANI, R. ABDOLLAHI, M. 2007. Protective Effects of alpha-Tocopherol and N-Acetyl-Cysteine on DiazinonInduced Oxidative Stress and Acetylcholinesterase Inhibition in Rats. In Toxicol. Mech. Methods., vol.
17, 2007, no. 2, pp.109-115.
SHINOHARA, A. - CHIBA, M. - TAKEUCHI, H. - KINOSHITA, K. - INABA, Y. 2005. Trace
elements and sperm parameters in semen of male partners of infertile couples. In Nippon Eiseigaku
Zasshi., vol. 60, 2005, no. 4, pp. 418-425.
STRADAIOLI, G. - SYLLA, L. - MONACI, M. - MAIORINO, M. 2009. Phospholipid hydroperoxide
glutathione peroxidase in bull spermatozoa provides a unique marker in the quest for semen quality
analysis. In Theriogenology, vol. 72, 2009, no. 1, pp. 91-98.
SLOTKIN,
T.A. - SEIDLER,
F.J. 2007. Comparative developmental neurotoxicity of
organophosphates in vivo: transcriptional responses of pathways for brain cell development, cell
49
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
signaling, cytotoxicity and neurotransmitter systems. In Brain Res. Bull., vol. 72, 2007, no. 4-6, pp.
232-274.
SLOTKIN, T. A. - SEIDLER, F.J. 2007. Comparative Developmental Neurotoxicity of
Organophosphates in vivo: Transcriptional Responses of Pathways for Brain Cell Development, Cell
Signaling, Cytotoxicity and Neurotransmitter Systems. In Brain Res. Bull., vol. 72, 2007, no. 4-6, pp.
232-274.
SLOTKIN, T.A. - SEIDLER, F.J. 2009. Oxidative and excitatory mechanisms of developmental
neurotoxicity: transcriptional profiles for chlorpyrifos, diazinon, dieldrin, and divalent nickel in PC12
cells. In Environ. Health Perspect., vol. 117, 2009, no. 4, pp. 587-596.
STOLTENBERG, M. - FLYVBJERG, A. - SONDERGAARD, L.G. - RUNGBY, J. 2002. Decreased
serum testosterone levels in rats exposed intraperitoneally to bismuth subnitrate. In J. Appl. Toxicol.,
vol. 22, 2002, no. 2, pp. 111-115.
SUN, Y. - MU, Y. - MA, S. - GONG, P. - YAN, G. - LIU, J. - SHEN, J. - LUO, G. 2005. The
molecular mechanism of protecting cells against oxidative stress by 2-selenium-bridged betacyclodextrin with glutathione peroxidase activity. In Biochim. Biophys. Acta, vol. 17, 2005, no. 3, pp.
199-204.
SUTCU, R. - ALTUNTAS, I. – BUYUKVANLI, B. – AKTURKA, O. – OZTURKA, O. – KOYLU,
H. - DELIBAS N. 2007. The effects of diazinon on lipid peroxidation and antioxidant enzymes in rat
erythrocytes: role of vitamins E and C. In Toxicol. Ind .Health, vol. 23, 2007, no. 1, pp. 13-17.
ŃIŃKA, B. - TOMAN, R. - GOLIAN, J. - KRAĈÍROVÁ, A. - HLUCHÝ, S. 2008. Selenium and
diazinon interaction and effect on rat serum cholinesterase activity after intraperitoneal administration.
In Met. Ions Biol. Med., vol. 10, 2008, no. 1, pp. 615-620.
UHRÍN, V. - KULÍŃEK, V. 1980. Vyuņitie morfometrických metód pre stanovenie hrúbky svalových
vlákien. In Ţivoĉíšna výroba, roĉ. 53, 1980, ĉ. 12, s. 935-942.
WECKER, L. - MRAK, R E. - DETTBARN, W.D. 1985. Evidence of necrosis in human intercostal
muscle following inhalation of an organophosphate insecticide. In J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol.,
vol. 6, 1985, no. 2, pp. 171-175.
WHANGER, P.D. - RIDLINGTON, J.W. - HOLCOMB, C.L. 1980. Interactions of zinc and selenium
on the binding of cadmium to rat tissue proteins. In Ann .N. Y. Acad. Sci., vol. 35, 1980, no. 5, pp. 333346.
WOJTCZAK, A. 2003. Selenium as an anticarcinogenic agent. In Acta Pol. Pharm., vol. 60, 2003, no.
3, pp. 215-217.
XIAO, Y.C. - HUANG, Y.D. - HARDY, D.O. - LI, X.K. - GE, R.S. 2010. Glucocorticoid Suppresses
Steroidogenesis in Rat Progenitor Leydig Cells. In J. Androl., vol. 31, 2010, no. 2, v tlaĉi. [cit.:201007-05].Dostupnéna internete: http://www.andrologyjournal.org/cgi/rapidpdf/jandrol.109.009019v1.pdf
XU, D.X. – SHEN, H.M. - ZHU, Q.X. - CHUA, L. - WANG, Q.N. - CHIA, S.E. - ONG, C.N.2003.
The associations among semen quality, oxidative DNA damage in human spermatozoa and
concentrations of cadmium, lead and selenium in seminal plasma. In Mutat. Res., vol. 53, 2003, no. 12, pp. 155-163.
YEHIA, M.A. - EL-BANNA, S.G. - OKAB, A.B. 2007. Diazinon toxicity affects histophysiological
and biochemical parameters in rabbits. In Exp. Toxicol. Pathol., vol. 59, 2007, no. 3-4, pp. 215-225.
YIIN, S.J. - CHERN, C.L. - SHEU, J.Y. - LIN, T.H. 1999. Cadmium induced lipid peroxidation in rat
testes and protection by selenium. In Biometals, vol. 12, 1999, no. 4, pp. 353-359.
Kontaktná adresa
Ing. Michal Cabaj
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, FAPZ, Katedra veterinárskych disciplín, Tr.
A. Hlinku 2, 94976 Nitra, Slovenská republika
 ++421-37-641 4503,
 [email protected]
50
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
PREHĽAD OBSAHU KADMIA AKO KONTAMINANTA VO VYBRANÝCH
POTRAVINÁCH
CADMIUM AS A CONTAMINANT IN SELECTED TYPES OF FOOD
CIMBOLÁKOVÁ Iveta, LOVÁSOVÁ Eva, NOVÁKOVÁ Jaroslava
Ústav patologickej fyziológie, Lekárska fakulta, Univerzita Pavla Jozefa Šafárika
v Košiciach, Slovenská republika
Abstract
The heavy metals are some of the most dangerous elements which are produced and contaminate the
environment (cadmium, mercury, lead, arsenic). They can occur in environment like residuals in
various quantities. They cause contamination of food and their presence in food belongs to main
quality parameters of food safety. It is not important the way of contamination but important is the
quantity of contaminant in food at all. How contamination risk raises, interest of activity consequences
of toxic elements to live organism raises too. The cadmium is important contaminant which enters to
food chain from polluted environment. Contamination sources originate mainly from using of fossil
fuels. It enters to the organism through alimentary and inhalation way. Important problem of cadmium
is its ability to accumulate in organism. According to presented data is cadmium content in food in
Slovak republic under the maximum allowed concentrations but concentration of cadmium has
positive downtrend.
Key words: cadmium, contaminant, food, heavy metals
Úvod
V súĉasnom pretechnizovanom svete sme vystavení úĉinkom chemických prvkov. Niektoré
z nich sú pre zdravie prospeńné (nutriĉné zloņky potravín), ale niektoré, ktoré môņu byť prítomné
v potravinách alebo v ņivotnom prostredí ako kontaminanty môņu mať nepriaznivé zdravotné úĉinky.
Pravdepodobnosť nepriaznivého zdravotného úĉinku súvisí s veľkosťou, frekvenciou a ĉasovým
trvaním expozície kontaminácie. Jedným z najrizikovejńích prvkov, ktoré sa dostávajú do
potravinového reťazca sú ťaņké kovy (kadmium, ortuť, olovo, arzén). Ako reziduá sa v prírodnom
prostredí môņu vyskytovať v rôznych mnoņstvách. Spôsobujú kontamináciu potravín a ich prítomnosť
patrí medzi hlavné ukazovatele zdravotnej nezávadnosti a bezpeĉnosti potravín. Vysoké riziko
kontaminácie ťaņkými kovmi je hlavne v okolí kovospracujúcich závodoch, elektrární,
ņeleziarenských podnikov, cementární, ktoré svojimi exhalátmi zneĉisťujú pôdu, ovzduńie a následne
sa dostávajú do potravinového reťazca. Neschopnosť degradovať sa prírodnými procesmi pôsobením
minerálnych a biologických pochodov spôsobuje, ņe sa tieto kovy hromadia (geo-bioekokumulácia).Ťaņké kovy predstavujú jednu z najnebezpeĉnejńích skupín ńkodlivín. Tvoria
prirodzenú súĉasť zloņenia zemského povrchu, a z toho dôvodu sa vyskytujú vńade (Kennedy, 2008,
Nińtiar, 2006). Priamo cez potravinové reťazce spôsobujú akútne alebo chronické intoxikácie. Ich
koncentrácia v zloņkách ņivotného prostredia pri krátkodobej expozícii nemusí mať zdravotné
následky, ale úĉinok ťaņkých kovov sa prejaví obyĉajne po dlhodobej expozícii, vyvolávajúc
chronické intoxikácie a postihnutia reprodukĉných funkcií (Massányi et al., 2004, Lukáĉ et al., 2007,
Nać et al., 2007, Kimáková, 2004). Pri posudzovaní mnoņstva ťaņkých kovov nie je dôleņitý spôsob
akým sa do potravy dostali (ĉistá forma alebo zlúĉeniny), ale dodrņiavanie limitov platných
v legislatíve EÖ. A preto tak, ako rastie stupeņ zneĉistenia ņivotného prostredia, tak stúpa aj záujem
o následky pôsobenia toxických látok na ņivé organizmy. Je potrebné preto vyvarovať sa pred
katastrofálnymi úĉinkami bezohľadnej priemyselnej devastácie prírodného bohatstva, zneĉisťovania
ovzduńia, vodných zdrojov a zasahovania do ekologickej rovnováhy fauny a flóry.
Ťaņké kovy – prípustné mnoņstvo v potravinách
Ako kontaminanty sa môņu v potravinách vyskytovať len v nevyhnutne najmenńom mnoņstve
51
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
podľa zásad správnej výrobnej praxe, najviac vńak v najvyńńom prípustnom mnoņstve, ktoré
predstavujú celkové mnoņstvo ťaņkých kovov v jedlej ĉasti potraviny. Toto najvyńńie prípustné
mnoņstvo ťaņkých kovov v potravinách predstavuje ich tolerovateľnú hornú hranicu výskytu
v potravinách v ĉíselnom vyjadrení. Tak sa zabezpeĉuje minimalizácia odhadovaného zdravotného
rizika pre ľudí. Správna výrobná prax má zabezpeĉovať zniņovanie mnoņstva ťaņkých kovov
v potravinách na také mnoņstvo, ktoré umoņņuje minimalizovať aj odhadové riziká (VÝNOS MP SR
A MZ SR, 2004), (Egyudová, 2004).
Kadmium - kontaminant
Kadmium trvalo zneĉisťuje ņivotné prostredie. Patrí medzi toxické prvky, ktorým sa venuje
veľká pozornosť, a to pre jeho toxicitu a ubikvérnosť. Základným zdrojom vstupu kadmia do
potravinového reťazca je aplikácia fosforeĉných hnojív, produkcia ņeleza, spaľovanie ropných palív,
uhlia, odpadu a aplikácia nevhodných superfosfátových hnojív (Ńalgoviĉová, 2009). Kadmium
vzhľadom k svojim chemickým vlastnostiam ľahko reaguje s celým radom biologicky aktívnych
molekúl, vrátane proteínov, fosfolipidov, nukleových kyselín a enzýmov. Do organizmu sa dostáva
inhalaĉnou a alimentárnou cestou. Exhaláty kadmia sa hromadia vo vode a pôde. Po vstupe do
organizmu je transportovaný do peĉene, obliĉiek, ĉrevnej sliznice a ostaných tkanív. Okrem toho môņe
za urĉitých podmienok prechádzať aj transplacentárne z krvi matky do plodu a vo veľmi nízkom
rozsahu aj hematoencefalickou bariérou. Viaņe sa na plazmatické bielkoviny, erytrocyty a
metalothionín. Po prekroĉení väzobnej kapacity metalothionínu dochádza k reverzibilným
a ireverzibilným zmenám spôsobenými voľnými iónmi kadmia. Výrazne zniņuje aktivitu
antioxidaĉných obranných systémov, následne aj antioxidaĉnú kapacitu organizmu. Z hľadiska
prestupu do rastlín má kadmium vyńńiu prijateľnosť ako olovo, meć a zinok. Obsah kadmia je
v rastlinách veľmi dôleņitý vzhľadom na to, ņe rastlinné produkty tvoria veľkú ĉasť výņivy ľudí.
Rastlinné tkanivá môņu byť tieņ zdrojom kontaminácie bylinoņravcov a následne aj potravín
ņivoĉíńneho pôvodu. Zvýńený obsah kadmia v pôde je výsledkom zvýńenej absorpcie kadmia
rastlinami. Zvieratá sú v oveľa ńirńom rozsahu vystavené vplyvom geochemického prostredia ako
ĉlovek, a preto zviera slúņi ako úĉinný pufer v nutriĉnom reťazci, pri redukcii nepriaznivých vplyvov
prostredia na konzumenta. Optimalizácia výņivy zvierat môņe vplývať na potravinový reťazec
siahajúci aņ po ĉloveka (Jesenská et al., 2003). A preto z hľadiska zabezpeĉenia zdravia ľudskej
populácie sa za dôleņitú povaņuje ochrana potravinového reťazca pred kontamináciou ťaņkými kovmi.
To si vynútilo zvýńený záujem o kontrolu zdravotnej nezávadnosti potravín. Bezpeĉnosť potravín
predstavuje súbor opatrení, a to hlavne na úseku ochrany zdravia a pohody zvierat a úseku potravín
a krmív (Sinclair et al., 2008). Ich realizáciou sa dosiahne bezpeĉnosť vńetkých zloņiek potravinového
reťazca. Výskyt cudzorodých látok v zloņkách ņivotného prostredia a v produktoch poľnohospodárskej
a potravinovej výroby sa sleduje prostredníctvom náhodnej kontroly a pravidelným monitoringom
(Ganga a Hettiarachchi, 2006). Vzťah medzi zdravotným stavom zvierat, ľudí a ņivotného prostredia
je historicky známy uņ z ĉias Aristotela a Hippokrata a súĉasné poznatky hovoria o tom, ņe chemické
polutanty vstupujú do potravinového reťazca na rozdielnych a ĉasto opakujúcich sa miestach. Celkové
mnoņstvo potenciálne kontaminujúcich látok pre veterinárske a verejné zdravie je ńiroké a rozdielne
podľa ich zdroja, chemickej povahy a mechanizmu úĉinku na biologické systémy. Prevencia zdravia
ľudí a zvierat pred chemickými rizikami predpokladá ich kontrolu v celom potravinovom reťazci –
pole – stôl (Bíreń et al., 2008). V tabuľke 1 sú vyjadrené najvyńńie prípustné mnoņstvá kadmia
v niektorých potravinách, v tabuľke 2 a v grafe 1 je prehľad priemerných nálezov kadmia vo
vybraných potravinách.
52
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 1
Najvyńńie prípustné mnoņstvá kadmia v niektorých potravinách
(Vestník MPSR a MZSR,2004 a príloha ĉ.9/2008 Z.z)
Najvyńńie prípust.
PRVOK
mnoņstvo mg.kg -1
POTRAVINA
0,01
mlieko, pivo,
0,02
vajcia, cukor
0,03
Ovocie – jablká, hruńky...
Cd
0,05
mäso-hovädzie, bravĉové,hydinové,
ovĉie, kozie
0,06
tvrdé syry
0,5
kakaový práńok, ĉokoláda
0,8
mak
0,2
listová zelenina
Tabuľka 2
Prehľad priemerných nálezov kadmia v niektorých potravinách(mg.kg-1).
(Ńalgoviĉová, 2009)
2005
Potravina
2006
2007
2008
2009
Mnoņstvo
Mnoņstvo
Mnoņstvo
Mnoņstvo
Mnoņstvo
v mg.kg -1
v mg.kg -1
v mg.kg -1
v mg.kg -1
v mg.kg -1
Máso hovädzie
0,00249
0,00214
0,00184
0,00158
0,00135
Mäso bravĉové
0,002350
0,00205
0,00180
0,00157
0,00138
Mlieko plnotuĉné
0,00134
0,00125
0,00119
0,00112
0,00105
Tvrdé syry
0,00314
0,00285
0,00205
0,00236
0,00215
Vajcia
0,00252
0,00230
0,00209
0,00191
0,00174
Cukor
0,00247
0,00222
0,00200
0,00179
0,00161
Ĉokoláda
0,00930
0,00851
0,00779
0,00713
0,00652
Kakao a práńková
čokoláda
0,095670
0,10125
0,10716
0,11341
0,12002
Pivo
0,00138
0,00126
0,00115
0,00105
0,00095
jablká
0,00228
0,00206
0,00187
0,00169
0,00153
53
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Graf 1 Grafické znázornenie priemerných nálezov kadmia vo vybraných potravinách
Záver
Podľa uvedených údajov je výskyt kadmia vo vybraných potravinách v SR pod maximálnymi
prípustnými koncentráciami. Je zaujímavé, ņe výskyt kadmia vo vybraných potravinách má pozitívnu klesajúcu tendenciu. To vńak neplatí pre kakao, ktorý napriek tomu, ņe je v norme má stúpajúcu
tendenciu. Kontrola kvality potravín v SR patría medzi základné úlohy potravinového dozoru aj
s úĉasťou ńtátneho zdravotného dozoru. Limity cudzorodých látok v potravinových komoditách SR sú
harmonizované s limitmi EÖ.
Literatúra
BÍREŃ, J. - HÖSKA, M. - JENĈÍK, F. 2008. Chemické riziká potravinového reťazca v ĉlenských
ńtátoch EÖ. In XVII. Vedecké sympózium s medzinárodnou úĉasťou, Hrádok, roĉ.3, 2008, ĉ. 3, s.16-18.
EGYUDOVÁ, I. - ŃTURDÍK E. 2004. Ťaņké kovy a pesticitídy v potravinách. In Nova
Biotechnologica, 2004, s. 155-173.
GANGA, M. - HETTIARACHCHI, I. 2006. Ecosystems bioavailability, toxicity, and risk
relationships. In Environ. Qual., vol. 35, 2006, pp. 951 - 952.
JESENSKÁ, M. - HIŃĈÁKOVÁ, M. - NOVOTNÝ, J. - LINK R. - KOVÁĈ, G. 2003. Koncentrácia
olova v krvnom sére, mlieku a moĉi dojníc. In Rizikové faktory potravového reťazca III. SPU: Nitra,
2003, s. 51-52.
KENNEDY S, 2008. EPIDEMIOLOGY: Why can't we test our way to absolute food safety? In
Science, vol. 322, 2008, pp. 1641 - 1643.
KIMÁKOVÁ, T. - KORÉNEKOVÁ, B. 2004.Vplyv kadmia na histologické zmeny Japonských
prepelíc. In V. Moravský morfologický den, 2004, zborník abstrakt. - Olomouc : Lékařská fakulta UP,
2004,
s.24.
LUKÁĈ, N. – MASSÁNYI, P. – ZAKRZEWSKI, M. – TOMAN, R. - CIGÁNKOVÁ , V. –
STAWARZ, R. 2007. Cobalt induced alterations in hamster testes in vivo. In J. Environ. Sci. Health
A, vol. 42, 2007, pp. 389-392.
MASSÁNYI, P. – TOMAN, R. – UHRÍN, V. – RENON, P. 2004. Distribution of cadmium in
selected organs of rabbits after an acute and chronic ad chronic administration. In Ital. J. Food Sci.,
vol. 3, 2004, pp. 211-316.
NAĆ, P. – MASSÁNYI, P. – SKALICKÁ, M. – KORÉNEKOVÁ, B. - CIGÁNKOVÁ V.,
ALMÁŃIOVÁ, V. 2007. The effect of kadmium in combination with zinc and selenium on ovaria
structure in Japanese quails. In J. Environ. Sci. Health A, vol. 42, 2007, pp. 2017-2022.
NIŃTIAR, F. 2006. Övod do imunopatológie, http//www..patfyz.medic.upjs.sk//
54
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
SINCLAIR, R. – BOONE, S.A. - GREENBERG , D. – KEIM, P. - GERBA CH.P. 2008. Persistence
of Cate-gory A Select Agents in the Environment. In Appl. Envir. Microbiol., vol. 74, 2008, pp. 555 563.
ŃALGOVIĈOVÁ, D. 2009. Hodnotenie expozície kadmiom v podmienkach Slovenskej republiky.
2009, s.1-31, http://www.land.gov.sk//
Kontaktná adresa
Ing. Iveta Cimboláková
Univerzita Pavla Jozefa Ńafárika v Końiciach, Lekárska fakulta, Östav patologickej fyziológie,
Tr. SNP ĉ. 1, Końice, Slovenská republika
 [email protected]
55
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
CALCIUM AND IRON CONTENT IN HUMAN MILK FRACTIONS
CZAJKOWSKA M., STAWARZ R., FORMICKI G., CHROBACZYŃSKA M.,
WYRZYKOWSKA A., CHRYC K.
Institute of Biology, Pedagogical University of Cracow, Department of Vertebrate Zoology and
Human Biology, ul. Podbrzezie 3, 31-045 Kraków, Poland
Abstract
The purpose of this study was to determine the content of calcium and iron in foremilk available at the
beginning of a feeding and hindmilk available later. Milk was collected from six women of different
ages come from Silesia and Lesser Poland region. Milk samples were collected through seven
consecutive days in the morning and in the evening. The total number of 231 samples (n = 231) were
collected and analyzed. Statistical tests have shown that the content of iron in three different fractions
of milk has been diversified but the differences was small. Iron content is more stable in the women‟s
morning milk .Calcium contents of three different fractions of milk are at very similar levels. Calcium
was found in all tested samples in the higher amount than iron.
Key words: calcium, iron, breast milk
Introduction
The natural breastfeeding in recent years is becoming less popular. This is the most appropriate
way of feeding neonates and infants, which provides nutrients, which has also a huge impact on the
child health. It is also worth to emphasize the psychological, sociological, environmental and
economic benefits of breastfeeding (Gartner et al., 2005). The composition of human milk changes
during lactation. These changes concern carbohydrates, proteins, vitamins, fats and other substances
allow adapt the composition of milk to the infant stage of development (Broadfoot et al., 2005). The
secretion of first milk (colostrum) starts already in the third trimester of pregnancy and lasts for a few
days after birth. It milk has a lower calorific value than the mature milk (Lawrence, 2005). Another
phase is the transition milk. This milk is started to produce in 3-4 days after birth. Unlike the
colostrum this milk is more watery and white color. The last, third phase is the mature milk. Its
amount is greater, content more caloric, lactose and fat, and the levels of proteins are lowered. This
milk includes everything what the child needs (Lawrence, 2005).
Iron is a constant and essential component of the body. This element is used for synthesis of
hemoglobin, myoglobin and enzymes (Seńczuk, 2002). Daily requirement for iron varies depending
on age, sex and condition of the organism.
The vast majority of calcium constitutes form related to the bones. The remainder constitutes the
ionized form in cellular fluids, and performs many functions. Most authors agree that the calcium is
the most important trace element during childhood and adolescence periods, when organism strives to
achieve peak bone mass. The purpose of this research was to determine the content of selected trace
elements (calcium and iron) in the different fractions of human milk.
Material and methods
The women come from Silesia and Malopolska provinces. The experimental material – human
milk - was taken from women during lactation. Each of the women agreed to give material for
research. Every woman received a set of test-tubes to collect the milk, and detailed instruction on how
to fill and store the milk. After each feeding women put milk into the test-tube, and then placed milk
in the freezer. Additionally, each mother participating in the experiment completed questionnaire and
a table of food types. Milk was collected from six women of different ages (27, 28, 29, 30, 31, 31
years old). Each of them gave milk for 7 consecutive days. Five of them gave milk in the morning and
evening, and one of them only in the evening. During each feeding, every woman collected the milk
into the test-tube 3 times - fractions respectively 1st (A), 2nd (B) and 3rd (C). Each of women gathered
42 samples of milk during 7 days, with one exception – woman which fed only in the evening
collected 21 samples. In total, 231 samples were collected (n=231). Samples were mineralized in the
56
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
process of wet mineralization. Each sample of thawed milk was placed in separate mineralization tube,
dissolved by adding 1 mL of concentrated HNO3-HClO4 mixture in the proportion 4:1 and heated in a
thermostat digestion block at 120°C for 90 minutes. The resulting solution was diluted to 5 mL with
demineralizated water. Metal contents were determined by the method of flame atomic absorption
spectrometry (FAAS). As a source of radiation hollow cathode lamps (HCL) were used. Statistical
calculations were performed with StatSoft Statistica 7.0 program.
Results
I. Calcium
Analysis and comparison of results between the calcium content in morning and evening milk
samples show the existence of small, statistically not significant differences. Calcium contents of three
different fractions of milk are at a very similar level. The smallest amount of calcium from all three
fractions in morning milk was 57,738 mg•L-1, the highest 196,916 mg•L-1. The lowest average calcium
content resulting from a comparison of three fractions (A, B, C) in morning milk was 108,652 mg•L -1,
the highest 110,544 mg•L-1. Among the lowest content of all three factions (A, B, C) in evening milk
was 6,792 mg•L-1, the highest 276,230 mg · L-1. As for as the lowest average calcium content is
amounted to 108,371 mg•L-1, the highest is 112,655 mg•L-1.
It was found that the differences between the average contents of calcium in fraction of morning
and evening milk samples are not statistically significant. Calcium contents in morning and evening
milk
samples
are
stable:
(morning
milk
p=0.958,
evening
milk
p=0.869).
The calcium contents in milk samples of individual women were diversified. Lowest content of
calcium in the first fraction (A) of morning milk was 59,941 mg•L-1, and the highest
154,676 mg•L-1. The lowest average calcium content was 100,972 mg•L -1, the average highest content
117,434 mg•L-1. Lowest content in the first fraction (A) of evening milk was 60,716 mg•L-1, and the
highest 201,930 mg•L-1. The lowest average content was 135,584 mg•L -1, and the highest was 85,069
mg•L-1. The results are illustrated by Figure 2.
Figure 2 The average calcium content in the first fraction (A) of morning and evening milk (mg•L -1)
taken from feeding women during the experiment.
The lowest content in the second fraction (B) of the morning milk samples was 71,974 mg•L-1,
and the largest 186,888 mg•L-1. The lowest average calcium content was 99,408 mg•L-1, the highest
126,216 mg•L-1. The lowest content in the second fraction (B) of the evening milk samples was
49,685 mg•L-1, the highest 188,256 mg•L-1. The lowest average content was 82,833 mg•L-1, and the
highest was 137,619 mg•L-1. The results are shown in Figure 3.
Figure 3 The average calcium content in the second fraction (B) of morning and evening milk samples
(mg•L-1) taken from feeding women during the experiment.
57
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
The lowest content in the third fraction (C) in morning milk samples was 57,738 mg•L-1, the
highest 196,916 mg•L-1. The lowest average calcium content was 92,102 mg•L-1, the highest
145,369 mg•L-1. The lowest calcium content in the third fraction (C) of evening milk samples was
6,792 mg•L-1, the highest 276,23 mg•L-1. The lowest average content was 71,740 mg•L-1 and the
highest 166,604 mg•L-1. The results are shown in Figure 4.
Figure 4 The average calcium content in the third fraction (C) of morning and evening milk samples
(mg•L-1) taken from feeding women during the experiment.
Based on the statistical analysis, it was concluded that there were significant differences
between the calcium content of milk samples collected from the breastfeeding women. Regarding to
the first fraction of the morning and evening milk samples, the calcium contents remained at similar
levels. The calcium contents in the evening milk samples from women 4 th and 6th are the highest, but
the differences between the contents of the calcium in milk of those two women and the others are
small and statistically not significant. In the first fraction of evening milk samples calcium levels are
very similar to all studied samples. The calcium contents in second evening milk fractions in the
majority of samples are higher than in the morning milk. The calcium distribution in the evening milk
samples could be described as increasing, because calcium content in milk samples of each further
sample is higher than the calcium content in the previous one. The highest levels of calcium in the
milk (morning and evening) were found in the samples collected from the 6th woman. The levels of
calcium in the third milk faction are similar to those in the other fractions. The content of calcium in
each sample is higher in the evening milk than in the morning samples. The research shows that in 6th
woman sample (both morning and evening milk) there is the highest calcium content in the 1 st and 2nd
fraction. Based on the statistical analysis it was concluded that there were statistically significant
differences between samples taken from individual women. The least stable calcium content was
observed in 3rd fraction of morning milk samples. The greatest differences are between 1 st and 5th
woman and between 2nd and 5th. The morning and evening milk samples were characterized by the
most stable calcium content in the first fraction. The evening milk of 2 nd fraction was the least stable,
while the greatest differences were noted between woman 1 st and 6th, and 2nd and 6th. It is worth to
stress that evening milk is the less stable.
II.Iron
The content of iron in three different fractions of milk has been diversified, but the differences
were small and statistically not significant. The morning milk samples are characterized by instability
of iron content in the first fraction (A), and the stable content the third fraction (C). Both in evening
and morning milk samples the most stable was 3rd fraction, however differences between this fraction
and the other fractions were less visible. It was observed that iron content in evening milk samples is
more stable. The iron content in milk samples (both morning and evening) are characterized by small
differences between them. Iron content in three different fractions of milk remained at a very similar
level. The smallest iron content among of all three milk fractions was detected in the morning milk
samples (0,445 mg•L-1). The lowest average iron content resulting from a comparison of three
fractions (A, B, C) of morning milk samples was 1,422 mg•L-1, while the highest was 2,119 mg•L-1.
As a result of the analysis and comparison of all fractions of milk (morning and evening), it was
concluded that there are small and statistically not significant differences. The iron content in the
evening milk samples is characterized by greater stability (p=0,870) compared with the morning milk
(p=0,262). The levels of iron in the milk samples of individual woman were diversified. Lowest
58
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
content of iron in the first fraction (A) of morning milk was 0,445 mg•L-1, and the highest 12,865
mg•L-1. The lowest average content of this element was 0,720 mg•L-1, whereas the highest was 3,531
mg•L-1.The lowest content in the first fraction (A) of evening milk was 0,504 mg•L-1, the highest
13,475 mg•L-1. The lowest average content was 0,697 mg•L-1, the highest 3,634 mg•L-1. The results
are shown in Figure 6.
Figure 6 The average iron content in the first fraction (A) of morning and evening milk samples
(mg•L-1) taken from feeding women during the experiment.
The lowest content in the second fraction (B) of the morning milk samples was 0,445 mg•L-1,
the highest 3,665 mg•L-1. The lowest average iron content was 0,655 mg•L-1, and the highest 2,091
mg•L-1. The lowest content in the second fraction (B) of the evening milk was 0,386 mg•L-1, the
highest 4,581 mg•L-1. The lowest average content was 0,680 mg•L-1, the highest 2,413 mg•L-1. The
results are shown in Figure 7.
Figure 7 The average content of iron in the second fraction (B) morning and evening milk samples
(mg•L-1) taken from feeding women during the experiment.
The lowest content in the third fraction (C) of morning milk samples was 0,504 mg•L-1, the
highest 10,314 mg•L-1. The lowest average content was 0,720 mg•L-1, the highest was 2,992 mg•L-1.
Minimum content of iron in third fraction (C) of the evening milk was 0,445 mg•L-1, the highest 5,375
mg•L-1. The lowest average content was 0,638 mg•L-1, and the highest 3,510 mg•L-1. The results are
shown in Figure 8.
Figure 8 The average iron content in the third fraction (C) of morning and evening milk samples
(mg•L-1) taken from feeding women during the experiment.
There are statistically significant differences between the iron contents of milk samples. The
iron content in the morning and evening milk samples (taken from 1 st, 2nd and 5th) woman were at a
higher level than in the samples taken from other women. The content of iron in 2 nd milk fractions
were also the highest in samples taken from 2nd and 5th woman, however the level is lower in
comparison with the 1st fraction. The iron content in the 3rd milk fraction can be described as
intermediate between 1 st and 2nd fraction. The highest contents of iron were detected in 2 nd, 5th and 6th
samples. Based on the statistical analysis it was concluded that there are statistically significant
59
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
differences between the iron contents in the milk. The iron content in morning and evening milk
samples was most stable in 3rd fraction from morning milk, the least stable in 3rd evening milk fraction.
It was observed that iron content is more stable in the morning milk samples.
Discussion
The human milk, which is necessary for the body development is the main source of trace
elements during infancy. The breast milk is the source of nutrition for newborns (American Academy
of Pediatrics, 1979). Its composition is complex and change constantly (Fomon, 1995). The natural
milk composition which depends on mothers correct diet, provide all needed vitamins, minerals and
trace elements for child (Lonnerdal, 1989). The chronic effects of xenobiotics and the excess of trace
elements amount can result in the accumulation or loss of those elements (Stawarz et al., 2008).
Calcium was found in all tested samples in the largest quantities. Different studies show that
calcium level in milk is usually very high. Each of lactating woman is more vulnerable to
osteoporosis, however it must be remembered that neither pregnancy nor lactation are not direct
causes of this disease. Female body during pregnancy period needs increased doses of calcium and
minerals. Properly balanced diet provides all the necessary nutrients and minerals. There are
correlations between maternal age and the level of calcium in the milk. Lipsman et al (1985) showed
significantly lower levels of calcium in the milk of teenage mothers than in milk of mature mothers.
Maternal intake of calcium is an important factor influencing the level of lead in blood during
lactation, possibly through a competitive interaction between calcium and lead (Donangelo et al.,
1998, Goyer, 1997, Peraza et al., 1998).
Iron is an essential element included in the composition of human milk. The absorption of this
element depends on the age, health condition of the organism, the chemical form of iron, and the
proportions of various organic and inorganic diet ingredients. Approximately 70% of the total quantity
body iron is bound in blood and muscle, in the form of hemoglobin and myoglobin, respectively.
Certain amounts of iron are stored in the body including the liver, spleen and bone marrow. An
interesting compound which has a huge impact on the level of iron is a globular protein - lactoferrin. It
is present in milk and mucosal secretions. Lactoferrin has a huge affinity for iron. Its function is to
bind iron ions and make them available to child digestive system making them completely inaccessible
to the bacteria. It is essential for the formation of B and T lymphocytes, and thus in preventing
infections. As the results of many investigations show (Silvestre et al., 1999), the higher fluctuations
are observed in iron levels in the evening samples than in the morning the same day. It was confirmed
with the findings of several authors (Guthrie and Picciano, 1976, Feeley et al. 1983, Vaughan 1979),
while Clement et al (1982) observed a constant iron content. The results of our experiment do not
show clearly a higher level of fluctuation with iron content in the evening milk samples.
Conclusions
1. The milk of the younger women had higher content of iron and calcium, compared with milk taken
from mature women.
2. Iron content is more stable in the women‟s morning milk.
References
American Academy of Pediatrics. Breast-feeding, a commentary in International Year of the Child.
Pediatrics. 1979, 62, 591–601.
BROADFOOD, M. - TAPPIN, D.M. - MACKENZIE, J.M. 2005. The Baby Friendly Hospital
Initiative and Breast Feeding rates in Scotland. In Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2005, vol. 90(2),
114–116.
CLEMENTE, G.F. - INGRAO, G. - SANTARONI, G.P. 1982. The concentration of some trace
elements in human milk from Italy, Sci. Total Environ. 1982, 24, 255–265.
DONANGELO, C.M. - DÓREA, J.G. 1998. Mercury and lead exposure during early human life as
affected by food and nutritional status. Environ. Nutr. Interact. 1998, 2, 169–186.
FEELEY, R.M. - EITENMILLER, R.R.. - BENTON, J.B. - BARNHART, H. 1983. Copper, iron, and
zinc contents of human milk at early stages of lactation, Am. J. Clin. Nutr. 1983, 37, 443–448.
FOMON, S.J. 1995. Infant Nutrition. Mosby/Doyma, Madrid. 1995.
60
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
GARTNER, L.M. - MORTON, J. - LAWRENCE, R.A. - NAYLOR, A.J. - O'HARE, D. SCHANLER, R.J. - EIDELMAN, A.I. 2005. Breastfeeding and the Use of Human Milk. Pediatrics.
2005, 115(2):496-506.
GOYER, R.A. 1997 Toxic and essential metal interactions. Annu. Rev. Nutr. 1997,17, 37–50.
LAWRENCE, R.A. - LAWRENCE, R.M. 2005. Breastfeeding, A Guide for the Medical Profession,
6th Ed. Elsevier Mosby, Phila, PA. 2005.
LIPSMAN, S. - DEWEY, K.G. - LONNERDAL, B. 1985. Breast- feeding among teenage mothers:
milk composition, infant growth and maternal dietary intake. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1985, 4(3),
426-34.
LONNERDAL, B. 1989. Dietary factors affecting trace element bioavailability from human milk
during lactation: a 6 month longitudinal study in southern Brasil. J.Trop. Pediatr 1989.
PERAZA, M.A. - AYALA-FIERRO, F.D. - BARBER, S. - CASAREZ, E. - RAEL, L.T. 1998. Effects
of micronutrients on metal toxicity. Environ. Health Perspect. 1998, 106(1), 203–216.
PICCIANO, M. F. - GUTHRIE, H. 1976. Copper, iron, and zinc contents of mature milk, Am.J. Clin.
Nutr. 1976, 29, 242–254.
SEŃCZUK, W. 2002. Toksykologia. Państwowy Zakład Wydawnictw Lekarskich, 2002.
STAWARZ, R. - MASSANYI, P. - FORMICKI, G. - GUZIK, M. - GOC, Z. - KILIAN, K. 2008.
Relationships of heavy metals and nutritional elements in breast milk to heavy metals and nutritional
elements in urine of breastfeeding women in Poland. ICENV. 2008.
VAUGHAN, L.A. - WEBER, C.W.- KEMBERLING, S.R. 1979. Longitudinal changes in the mineral
content of human milk, Am. J. Clin. Nutr. 1979, 32, 2301–2306.
Contact address
Mgr. Magdalena Czajkowska
Institute of Biology, Pedagogical University of Cracow, Department of Vertebrate Zoology and
Human Biology, ul. Podbrzezie 3, 31-045 Kraków, Poland
 [email protected]
61
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
PHOTOCHEMILUMINESCENT DETECTION OF OXIDATIVE STRESS IN
LEPIDIUM SATIVUM L. EXPOSED TO CADMIUM AND ZINC
DŅUGAN Małgorzata*, PAKLA Magdalena*, PASTERNAKIEWICZ Anna*, GRABEKLEJKO Dorota**
*Department of Food Chemistry and Toxicology, University of Rzeszów, 2 Ćwiklińskiej St., 35-601
Rzeszów, Poland
**Department of Biotechnology and Microbiology, University of Rzeszów, 2 Ćwiklińskiej St., 35-601
Rzeszów, Poland
Abstract
In industrial areas, especially near steelworks and mines but also along roads and motorways, the
environment is polluted with toxic heavy metals. Tests of heavy metal toxicity consist of plant growth
parameters, physiological and biochemical indicators, including changes in carbohydrate, protein and
chlorophyll content measurements. The major damaging factors in plants exposed to environmental
pollutants is reactive oxygen species (ROS) generation. Plants cope with oxidative stress by using
complex system of oxidant scavengers including antioxidant enzymes and the low molecular weight
antioxidants. This study assessed whether total antioxidant capacity may be used as bioindicator of
stress caused by heavy metals in garden cress (Lepidium sativum L.) - a plant frequently used in
phytotoxicity tests for xenobiotic substances. The plants were cultivated in Petri dishes with cellulose
pads saturated with water solution of cadmium (0.3 - 1.4 mg Cd/g of medium), zinc (1.4 - 7 mg Zn/g
of medium) or mixture of both Cd and Zn ions in stable light and temperature conditions. On day 6 of
exposure growth parameters and chlorophyll content in cress leaves were determined. Total
antioxidant capacity (expressed in µmol of ascorbic acid as standard) in 1% water homogenates of
leaves was measured by photochemiluminescent method using PHOTOCHEM device (Analityk Jena
AG, Germany). Both of the tested heavy metals brought about a decrease of cress growth and
chlorophyll content in leaves. Cadmium showed higher toxicity; total inhibition of plants growth was
observed for the dose above 3.5 mg/g medium whereas 4 mg Zn dose caused plant growth inhibition
which equaled 40%. After 6 days of exposure an increase of antioxidant capacity in plant exposed to
cadmium and zinc was observed as compared to control sample (8,5 µmol ascorbic acid per g of fresh
leaves), i.e. for the highest doses to 52,9 for cadmium and 40,6 µmol ascorbic acid/g of plant for zinc.
Combined action of both metals was slightly lower than individual ones. Our results suggest that
photochemiluminescent measurement of antioxidant capacity in plant leaves can possibly serve to
detect of oxidative stress intensity caused by heavy metal pollution of land and water environment.
Key words: garden cress, heavy metals, oxidative stress, antioxidant capacity
Wstęp
Rośliny rosnące w naturalnych warunkach oraz uprawiane w tunelach foliowych i szklarniach,
przez cały okres wegetacyjny na stałe związane z podłożem, są narażone na działanie niekorzystnych
czynników, które mogą być przyczyną zaburzeń metabolicznych, zahamowania wzrostu,
zmniejszonego owocowania oraz uszkodzeń tkanek i organów. Wykształciły one szereg odmiennych
strategii obronnych, umożliwiających im lepsze dostosowanie się do zmiennych warunków
środowiska, zmniejszania skutków wywołanych działaniem niekorzystnych czynników albo
tolerowania zmian wywołanych stresem (Ciereszko et al. 2009). Stres na poziomie komórkowym
może być reakcją na zachwianie równowagi pomiędzy wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (RFT)
a ich usuwaniem przez systemy antyoksydacyjne (Kacperska 2002).
Minimalizacja skutków reakcji nieustannie tworzących się RFT z ważnymi biomolekułami
komórkowymi jest możliwa dzięki obecności niskocząsteczkowych antyutleniaczy służących jako
akceptory elektronów i wyspecjalizowanych enzymów rozkładających RFT([Bartosz 2003). Do
antyoksydantów nieenzymatycznych zalicza się antyoksydanty hydrofobowe ( np. α-tokoferol,
karotenoidy) i hydrofilowe (głównie kwas askorbinowy i glutation). Rolę antyoksydantów
enzymatycznych pełnią enzymy zaangażowane bezpośrednio w usuwanie RFT (dysmutaza
62
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza), jak również enzymy biorące udział w reakcjach utleniania i
redukcji askorbinianu lub redukcji glutationu (Blokhina et al. 2003).
Udział kadmu w indukcji stresu oksydacyjnego nie jest bezpośredni, i jest związany
z zaburzeniem przepływu elektronów w łańcuchu oddechowym oraz uwalnianiem metali
przejściowych, które biorą udział w reakcji Fentona i Habera-Weissa – głównie Fe(II) i Cu(I) z
miejsc ich występowania w komórce. Zwiększenie ilości RFT w komórkach narażonych na działanie
kadmu może być również wynikiem osłabienia mechanizmów antyoksydacyjnych, związanym przede
wszystkim ze zmniejszeniem stężenia zredukowanego glutationu (GSH) i zmian aktywności enzymów
antyoksydacyjnych w komórkach (Czeczot i Skrzycki, 2010).
Pomimo tego, że w ostatnich latach zagadnienia związane z odpowiedzią roślin na czynniki
stresowe są intensywnie badane i dyskutowane, nie uzyskano pełnego obrazu procesów zachodzących
w roślinach. Niewiele prac opisuje pełną reakcję danej rośliny na działanie jednego, wybranego
czynnika stresowego. Wrażliwość rzeżuchy ogrodowej (Lepidium sativum) na czynniki fitotoksyczne
stwarza możliwość zastosowania tego gatunku w testach biologicznych do oceny stanu środowiska
gruntowego i wodnego (Paczkowska et al. 2007). Test Lepidium jest szeroko stosowany do wstępnej,
szybkiej i taniej oceny fitotoksycznej gleby zanieczyszczonej m. in. metalami ciężkimi. W niniejszej
pracy zastosowano metodę fotochemiluminescencji do badania stresu oksydacyjnego u rzeżuchy
ogrodowej hodowanej na podłożu skażonym przez kadm i/lub cynk.
Materiał i metody
Materiał stanowiły nasiona rzeżuchy ogrodowej (Lepidium sativum), produkcji PNOS Ożarów
Mazowiecki. Hodowlę rzeżuchy (każdorazowo 50 nasion) przeprowadzono w szalkach Petriego, na
podłożu celulozowym o znanej masie i powierzchni. Podłoże było nasączane stałą objętością
roztworów soli metali ciężkich (CdCl2 i ZnSO4 cz.d.a, POCh Gliwice) o koncentracji zapewniającej
uzyskanie odpowiedniego skażenia podłoża kadmem (0,35; 0,7 i 1,4 mg Cd/g podłoża), cynkiem (1,4 i
7 mg Zn/g podłoża) oraz kombinacją obu jonów (0,7 mg Cg+ 1,4 mg Zn/g podłoża i 0,7 mg Cd+7 mg
Zn/g podłoża). Dla próby kontrolnej podłoże nasączano wodą destylowaną. Hodowlę prowadzono w
temp. 20-22oC, przy stałym oświetleniu 800 lx (10L:14D), uzupełniając straty związane z parowaniem
wodą destylowaną.
W 6. dniu ekspozycji określano następujące parametry % kiełkowania, długość części
nadziemnej i korzenia, masę roślin ( wraz z korzeniem). Zawartość chlorofili oznaczano metodą
spektrofotometryczną. Absorpcję acetonowego homogenatu świeżych liści (0,3% w/v) mierzono przy
645 i 663 nm w aparacie Spekol 11, zawartość chlorofili obliczano wg zależności opracowanych przez
MacKinney‟a (1941).
Zawartość
przeciwutleniaczy
rozpuszczalnych
w
wodzie
badano
metodą
fotochemiluminescencyjną w wodnym ekstrakcie liści rzeżuchy (1% v/w). Próbki liści o masie 0,1 g
rozcierano w moździerzu (z dodatkiem żelu krzemionkowego) z 10 cm3 wody destylowanej,
ekstrakcję prowadzono 30 min. w temp. 37°C w termostatowanej wytrząsarce. Po odwirowaniu (3500
obr/min., 10 min) mierzono potencjał antyoksydacyjny 100-krotnie rozcieńczonego ekstraktu z
użyciem aparatu Photochem®, stosując zestaw odczynników ACW wg metodyki producenta
(Analityk Jena AG, Germany). Do kalibracji użyto kwas askorbinowy (0,1-1 nmol), wyniki wyrażano
w równoważnikach kwasu askorbinowego w przeliczeniu na 1g liści rzeżuchy.
Doświadczenie przeprowadzono dwukrotnie, każdorazowo w dwóch powtórzeniach. Wyniki
poddano jednoczynnikowej analizie statystycznej ANOVA (Statistica 5.0). Określono istotność różnic
za pomocą testu NIR na poziomie istotności p ≤ 0,05.
Wyniki
Obecność analizowanych metali w podłożu powodowała zahamowanie wzrostu rzeżuchy
ogrodowej dotyczące zarówno części poziemnej jak i nadziemnej, w minimalnym stopniu wpływała
natomiast na proces kiełkowania roślin (Tab. 1). Rosnące skażenie kadmem (od 0,35 do 1,4 mg/g
podłoża) powodowało drastyczne skrócenie korzenia (przy najniższej zastosowanej dawce kadmu
>50%), osłabienie wzrostu roślin (od 44 do 84%) i spadek uzyskanej biomasy (od 19 do 77%).
Toksyczność kadmu była znacznie wyższa niż cynku, analogiczny stopień inhibicji obserwowano dla
5-krotnie wyższej dawki cynku. Jednakże obydwie zastosowane dawki tego metalu (1,4 i 7 mg/g
podłoża) hamowały wzrost roślin, o 68 i 86% odpowiednio. Zastosowanie kombinacji obu jonów
63
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
wywoływało silniejszą inhibicję wzrostu roślin niż w przypadku oddzielnego stosowania tych
pierwiastków.
Toksyczne działanie kadmu na rośliny objawiało się nie tylko osłabieniem wzrostu ale także
intensywną chlorozą związaną przede wszystkim ze stopniowym spadkiem zawartości chlorofilu
ogólnego oraz proporcji występowania formy chlorofilu a i b (Tab. 2). Dla roślin w grupie kontrolnej
stosunek formy a i b wynosił 1:0,8. Rosnące stężenie kadmu w podłożu powodowało stopniowy
spadek procentowego udziału chlorofilu a. Potwierdzają to poczynione obserwacje, dla roślin z grupy
kontrolnej i eksponowanych na kadm obserwowano zróżnicowane wybarwienie liści.
Tabela 1 Wpływ skażenia podłoża metalami ciężkimi na wzrost rzeżuchy
Kiełkowanie
[%]
Długość
korzenia
[mm]
1.
Zawartość
metali
[mg/g
podłoża]
Kontrola
100%
16,5±5,2
(100%)
2.
0,35 mg Cd
98%
9,2±6,5
(56%)
3.
0,7 mg Cd
99%
5,5±1,8
(33%)
4.
1,4 mg Cd
94%
-
5
1,4 mg Zn
100%
5,0+6,5
(30%)
6.
7 mg Zn
97%
3,5±2,2
(21%)
7.
0,7 mg Cd
+1,4 mg Zn
99%
4,0±1,9
(24%)
8.
0,7 mg Cd
+ 7 mg Zn
96%
-
Lp
.
Wzrost roślin
Masa roślin
[mm]
[g]
[%]
100%
0,792±0,021
100%
58%
0,640±0,033
81%
28%
0,259±0,048
33%
16%
0,185±0,032
23%
32%
0,345±0,052
44%
14%
0,155±0,024
20%
18%
0,167±0,063
21%
13%
0,134±0,019
17%
Min
25
Max 51
x±SD 0,2±14,3
Min
13,5
Max 45,5
x±SD 29,2±17,9
Min
10,0
Max 19,5
x±SD 14,3±5,8
Min
6,5
Max 10,0
x±SD 8,1±1,7
Min
9,5
Max 23,0
x±SD 16,2±9,5
Min
5
Max 8,5
x±SD 6,9±2,7
Min
5,5
Max 13,0
x±SD 9,2±5,3
Min
5,5
Max 7,5
x±SD 6,6±1,5
[%]
Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów liści rzeżuchy, związany z obecnością przeciwutleniaczy
rozpuszczalnych w wodzie (ACW), był dodatnio skorelowany z rosnącym stężeniem metali ciężkich
w podłożu (Rys. 1). Początkowo, dla najniższej zastosowanej dawki kadmu (0,35 mg/g podłoża),
obserwowano spadek potencjału (o 35%) w stosunku do próby kontrolnej. Zwiększanie skażenia
podłoża kadmem (dwu- i czterokrotne) powodowało drastyczny wzrost potencjału odpowiednio o ok.
300 i 600%. Zastosowane dawki cynku również powodowały 2- i 4-krotne zwiększenie potencjału
oksydacyjnego. Przy równoczesnym skażeniu podłoża jonami kadmu i cynku obserwowany wzrost
potencjału antyoksydacyjnego wynosił od. 300 do 400% w stosunku do kontroli (Rys. 1).
64
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Tabela 2 Zawartość chlorofilu w liściach rzeżuchy w 6.tym dniu ekspozycji na jony
kadmu
Lp.
1.
2.
3.
4.
Zawartość
kadmu
[mg/g podłoża]
0
0,35
0,7
1,4
Zawartość chlorofilu w liściach
[mg/100g]
ogółem
forma a
forma b
765,76
417,16
348,60
670,03
398,34
271,69
451,62
234,74
216,88
282,55
121,67
160,88
Stosunek
formy a:b
1:0,84
1:0,88
1:0,92
1:1,32
Nie obserwowano addytywności toksycznych efektów obu pierwiastków, sumaryczny wzrost
zdolności antyoksydacyjnych próbki na podłożu skażonym kadmem (0,7 mg/g podłoża) z dodatkiem
cynku był o 5 i 33% wyższy (Rys. 1) przy proporcji Cd:Zn w podłożu wynoszącej odpowiednio 1:2
oraz 1:10.
Rys. 1 Potencjał antyoksydacyjny liści rzeżuchy narażonej na jony metali ciężkich.
a,b,c średnie oznaczone różnymi literami są statystycznie różne (p<0,05)
Dyskusja
Przeprowadzone doświadczenia potwierdziły toksyczny wpływ kadmu i cynku na wzrost
rzeżuchy, skutkujący zmniejszeniem części podziemnej i nadziemnej roślin oraz zahamowaniem
syntezy barwników fotosyntetycznych. Obserwowany wzrost potencjału antyoksydacyjnego
ekstraktów liści rzeżuchy narażonej na badane metale potwierdza ich udział w indukcji stresu
oksydacyjnego u roślin, jak również istnienie obronnych mechanizmów adaptacyjnych związanych z
nasileniem syntezy antyoksydantów rozpuszczalnych w wodzie.
Rośliny są często wykorzystywane w badaniach nad pobieraniem metali ciężkich z podłoża,
znajdują zastosowanie w biomonitoringu i fitoremediacji. Fitotoksyczność kadmu u roślin obejmuje
skutki morfologiczne (spadek produkcji biomasy, zahamowanie wzrostu części nadziemnej i
podziemnej) i fizjologiczne (stres wodny, zaburzenia fotosyntezy, obniżenie stężenia barwników
fotosyntetycznych, indukcję syntezy fitochelatyn– białek odpowiedzialnych za wewnątrzkomórkowy
transport kadmu), (Gruca-Królikowska i Wacławek, 2006). Kadm może zaburzać syntezę chlorofilu
wg różnych mechanizmów, m.in. wskutek inhibicji enzymów w niej uczestniczących, agregacji
kompleksu z białkami czy też zastępowaniu jonu Mg2+ (Nikoliĉ 2006). Zwykle obserwuje się spadek
stężenia chlorofilu ogólnego i formy a, natomiast wzrost zawartości chlorofilu b (Nikoliĉ 2006;
Zengin i Munzuroglu, 2005). Przeprowadzone badania wykazały, że w liściach rzeżuchy wraz ze
65
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
zwiększającym się skażeniem podłoża kadmem spada zawartość chlorofilu ogólnego oraz procentowy
udział formy chlorofilu a.
Kadm jest pierwiastkiem śladowym nie wykazującym żadnej funkcji fizjologicznej, mimo
wysokiej toksyczności łatwo i intensywnie jest pobierany przez rośliny. Zawartość innych
pierwiastków w glebie może stymulować pobieranie kadmu przez rośliny. Wśród opisanych interakcji
międzypierwiastkowych wyróżnia się: interakcje antagonistyczne (ograniczające biodostępność
kadmu np. Cd-Cu czy Cd-Zn) oraz synergistyczne (wzmożona kumulacja kadmu np. Cd-Pb, Cdchelaty Fe), (Baker i Walker, 1989). Wydaje się, że szczególną rolę w ograniczeniu biodostępności
kadmu może spełniać cynk, który jest niezbędnym mikroelementem wchodzącym w skład wielu
enzymów i uczestniczącym w procesach metabolicznych roślin. Jednak przy dużej zawartości w
podłożu także ten pierwiastek kumuluje się głównie w korzeniach, gdzie zakłóca działalność białek
i rozregulowuje metabolizm roślin. (Gruca-Królikowska i Wacławek, 2006). Przeprowadzone badania
dotyczące możliwości ograniczenia toksyczności kadmu przez cynk nie przyniosły oczekiwanych
efektów. Obie zastosowane dawki cynku powodowały dodatkowe osłabienie wzrostu rzeżuchy
i zwiększały toksyczność kadmu. Nie obserwowano jednak addytywności toksycznych efektów obu
metali, obserwowany efekt wypadkowy równoczesnego działania obu pierwiastków był niższy niż
suma efektów wykazywanych oddzielnie. Lepsze wyniki uzyskane dla mieszaniny kadmu z cynkiem
w proporcji 1:2 niż 1:4 wydają się wskazywać, że cynk może ograniczać toksyczność kadmu dla roślin
ale jedynie wówczas kiedy jego stężenie w podłożu jest niskie.
Skażenie gleby metalami ciężkimi jest czynnikiem środowiskowym odpowiedzialnym za
wywoływanie stresu u roślin. Rośliny wykształciły jednak szereg mechanizmów, które umożliwiają
im wzrost w środowisku stresowym, określanych mianem tolerancji stresu. Stres oksydacyjny
wywołany przez metale ciężkie zwykle skutkuje wzrostem zawartości niskocząsteczkowych
antyoksydantów (prolina, retinol, kwas askorbinowy, α-tokoferol) (Mittler 2002, Fyer i Noctor 2005,
Zengin i Munzuroglu 2005). Przyjmuje się, że uczestniczą one w detoksykacji metali ciężkich, pełniąc
funkcję „łapaczy” wolnych rodników. Stąd stres oksydacyjny i całkowity potencjał antyoksydacyjny
to wielkości ściśle skorelowane ze sobą. Istnieje szereg metod oznaczania całkowitej zdolności
antyoksydacyjnej, w zależności od substancji indykatorowej wyróżnia się metody
spektrofotometryczne (TAS), fluorymetryczne (TRAP), rzadziej chemiluminescencyjne (z
wykorzystaniem luminolu). Wybór metody jest zawsze związany z ryzykiem oznaczenia tylko części
zawartości antyoksydantów, najczęściej hydrofilowych (Bartosz 2003, Popov i Levin 2000).
Fotochemiluminescencyjne badania całkowitej zawartości antyoksydantów rozpuszczalnych w
wodzie (ACW) w liściach rzeżuchy narażonej na toksyczne metale podczas rozwoju, wykazały
drastyczny wzrost potencjału antyoksydacyjnego (ponad 5-krotny dla najwyższej dawki kadmu), w
odpowiedzi roślin na stres oksydacyjny. Obserwowany przy niskiej ekspozycji na kadm, spadek
potencjału potwierdza, że indukcja biosyntezy niskocząsteczkowych antyoksydantów jest elementem
„strategii obronnej” roślin (Apel i Hirt 2004, Małecka i Tomaszewska 2005).
Metoda chemiluminescencyjna z wykorzystaniem aparatu PHOTOCHEM i odpowiedniego
zestawu odczynników pozwala zarówno na określenie zawartości antyoksydantów hydrofilowych
(ACW) jak i hydrofobowych (ACL). Metoda ta łączy bardzo szybką fotochemiczną (UV-A) generację
wolnych rodników z czułą detekcją chemiluminometryczną, przy czym obie funkcje:
fotosensybilizatora (generator wolnych rodników) i detektora pełni luminol. Aktywność
antyoksydacyjna próbki jest wyznaczana poprzez porównanie kinetyki reakcji próby kontrolnej (bez
substancji tłumiących chemiluminescencję) z analizą zawierającą antyoksydanty. Do zalet metody
chemiluminescencyjnej należy bardzo niski próg wykrywalności antyoksydantów (czułość metody jest
wielokrotnie wyższa), szeroki zakres liniowości i szybkość, która jest większa (10-1000 razy) niż przy
standardowych metodach (Popov i Levin, 2000).
Wnioski
Rosnące skażenie podłoża kadmem i/lub cynkiem powoduje stopniowe ograniczenie wzrostu
rzeżuchy ogrodowej, obejmujące skrócenie korzenia i części nadziemnej, spadek biomasy,
zahamowanie syntezy chlorofili. Skutkiem działania metali jest także indukcja stresu oksydacyjnego,
co potwierdzono w badaniach potencjału antyoksydacyjnego, dodatnio skorelowanego z rosnącą
ekspozycją roślin na metale ciężkie. Badania potwierdziły przydatność metody
66
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
fotochemiluminescencyjnej do badania stresu oksydacyjnego u roślin narażonych na substancje
toksyczne.
Literatura
APEL, K. - HIRT, H.. 2004. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal
transduction. In Plant Biol, vol. 55, 2004, p. 373-399.
BARTOSZ, G. 2003. Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Warszawa: PWN, 2003.
Baker, A.J.M. - WALKER, P.I. 1989. Physiological responses of plants to heavy metals and the
quantification of tolerance and toxicity. In Chem Spec Bioavailab., vol. 1, 1989, p. 7–17.
BLOKHINA, O. - VIROLAINEN, E. - FAGERSTEDT, K.V. 2000. Antioxidants, oxidative damage
and oxygen deprivation stress: a review. In Ann. Bot., vol. 91, 2000, p. 179-194.
CIERESZKO, I. - KOZLOWSKA-SZERENOS, B. - LEŚNIEVSKA, J. - SIEGIEŃ, I. 2009.
Dostosowania roślin do niekorzystnych warunków środowiska. In K. Kolanko (red.) Różnorodność
badań botanicznych – 50 lat Białostockiego Oddziału Polskiego Towarzystwa Botanicznego,
Białystok, 2009, p. 148-167.
CZECZOT, H. - SKRZYCKI, M. 2010. Kadm - pierwiastek całkowicie zbędny dla organizmu. In
Postepy Hig Med Dosw. (online), vol. 64, 2010, p. 38-49.
FOYER, C.H. - NOCTOR, G. 2005 .Oxidant and antioxidant signaling in plants: a reevaluation of the
concept of oxidative stress in a physiological context. In Plant Cell, vol. 28, 2006, p. 1056-1071.
GRUCA-KRÓLIKOWSKA, S. - WACLAWEK, W. 2006. Metale w środowisku. Cz. II. Wpływ
metali ciężkich na rośliny. In Chemia Dydaktyka Ekologia Metrologia, vol. 11, 2006, no. 1-2, p. 4154.
KACPERSKA, A. 2002. Reakcje roślin na abiotyczne czynniki stresowe. W: Kopcewicz J., Lewak S.
(red.) Fizjologia roślin. Warszawa: PWN, p. 512-678.
MACKINNEY, G. 1941. Absorption of light by chlorophyll solutions. In J. Biol. Chem., vol. 140,
1941, p. 315-322.
MALECKA, A. - TOMASZEWSKA, B. 2005. Reaktywne formy tlenu w komórkach roślinnych i
enzymatyczne systemy obronne. In Post. Biol. Kom., vol. 32, 2005, no. 2, p. 311-325.
MITTLER, R. 2002. Oxidative stress antioxidants and stress tolerance. In Trends Plant Sci, vol. 9,
2002, p. 405-409.
NIKOLIĈ, N. - KOJIĈ, D. - PILIPOVIĈ, A. - PAJEVIĈ, S. - KRSTIĈ, B. - BORIŃEV, M. ORLOVIĈ, S. 2008. Responses of Hybrid Poplar to Cadmium Stress, Photosynthetic characteristics,
Cadmium and Proline accumulation, and antioxidant Enzyme Activity. In Acta Biologica
Cracoviensia s. Botanica, vol. 50, 2008, no. 2, p. 95-103.
PACZKOWSKA, M. - KOZLOWSKA, M. - GOLINSKI, P. 2007. Oxidative stress enzyme activity in
Lemna Minor L., exposed to cadmium and lead. In Acta Biologica Cracoviensia, s. Botanica, vol. 49,
2007, no. 2, p. 33-37.
POPOV, I. - LEWIN, G. 2000. Photosensitized chemiluminescence, its medical and industrial
applications for antioxidizability tests. In: Garcia-Campana A.M, Baeyens W.R (eds)
Chemiluminescence in analitycal chemistry. New York: Marcel Dekker, 2000, p. 497-527.
ZENGIN, F. K. - MUNZUROGLU, O. 2005. Effects of Some Heavy Metals on Content of
Chlorophyll, Proline and Some Antioxidant Chemicals in Bean (Phaseolus vulgaris L.) Seedlings. In
Acta Biologica Cracoviensia s. Botanica, vol. 47, 2005, no. 2, p. 157-164.
67
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
HODNOTENIE VZÁJOMNÉHO PÔSOBENIA VYBRANÝCH PESTICÍDOV
A ŤAŅKÝCH KOVOV NA LETALITU ARTEMIA FRANCISCANA
EVALUATION OF INTERACTIONS BETWEEN SELECTED PESTICIDES AND
HEAVY METALS ON ARTEMIA FRANCISCANA LETHALITY
FALIS Marcel, ŃPALEK Milan, LEGÁTH Jaroslav, KRUPICER Ivan
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Košiciach, Komenského 73, 041 81, Slovenská
republika
Abstract
The goal of this study was to investigate influence of zinc disulphate, potassium dichromate, cadmium
chloride, azoxystrobin and glyphosate on lethality to Artemia franciscana. A significant decrease was
observed in lethality due to exposure to azoxystrobin and glyphosate in combination with potassium
dichromate alone, potassium dichromate and cadmium chloride and finaly with combination of
potassium dichromate and zinc disulphate 24 hours after exposure. These results may be caused by
attributes of chromium and zinc as direct bond at molecules of pesticides used, or as bond at
enzymatic system responsible for damaging influence of azoxistrobin and glyphosate.
Key words: azoxystrobin, glyphosate, Artemia franciscana, heavy metals
Úvod
Intenzívna poľnohospodárska výroba si vyņaduje zvýńené pouņívanie pesticídov hlavne
fugicídov a herbicídov, ĉo má za následok zvýńenú zaťaņ ekosystému. S rastúcim stupņom zneĉistenia
sa zvyńuje záujem o dôsledky vzájomného pôsobenia rôznych druhov cudzorodých látok na ņivé
systémy. Preto sme v predloņenej práci alternatívnym biotestom II. generácie na Artemia franciscana
(Dvořák, 1995; Dvořák, 2002), sledovali vzájomné interakcie najĉastejńie pouņívaných pesticídov
a ťaņkých kovov. Zo skupiny herbicídov bol vybratý glyfosát, a reprezentantom skupiny fungicídov
v tomto experimente je azoxystrobin. Ako najzávaņnejńie kontaminanty ņivotného prostredia sme
vybrali kadmium, chróm a zinok.
Materiál a metódy
V experimente boli pouņité Artemia franciscana vyliahnuté v ĉerstvo pripravenej morskej vode,
ktorá mala nasledovné zloņenie: (NaCl 23,900 g.l-1, MgCl2.6H2O 10,830 g.l-1, CaCl2.6H2O 2,250 g.l-1,
KCl 0,680 g.l-1, Na2SO4.10H2O 9,060 g.l-1, NaHCO3 0,200 g.l-1, SrCl2.6H2O 0,040 g.l-1, KBr 0,099 g.l1
, H3BO3 0,027 g.l-1 ; pH - 8,31.) (Dvořák, 2005). 10 ks ĉerstvo vyliahnutých naupliových ńtádií sme
umiestnili do polystyrénových Petriho misiek o priemere 60 mm pri celkovom objeme morskej vody
10 ml (vrátane vzorky). V pokuse boli pouņité roztoky:
- chlorid kademnatý (CdCl2.2H2O) v koncentrácii 25 mgl-1
- dichroman draselný (K2Cr2O7) v koncentrácii 10 mgl-1
- síran zinoĉnatý (ZnSO4.7H2O) v koncentrácii 100 mgl-1
- glyfosát v koncentrácii 500 mgl-1
- azoxystrobin v koncentrácii 0,1 mgl-1 samostatne a vo vzájomných kombináciách (tabuľka
1).
Vńetky skúmané roztoky boli riedené v morskej vode. Experiment bol rozdelený do 14 pokusných
skupín (tabuľka 1).
V kaņdom pokuse bolo 50 jedincov, ktorí boli rozdelení do 5 samostatných skupín (misiek) po 10
jedincov. V experimente bolo celkovo pouņitých 700 jedincov. Petriho misky boli po predchádzajúcej
dezinfekcii termostatu (Koĉińová, 2005) umiestnené pri teplote 20  1 C.
68
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 1 Pokusné objekty boli rozdelené do 14 pokusných skupín nasledovne
Rozdelenie
pokusných
skupín
K
A
G
Cd
Cr
Zn
AG
AGCd
AGCr
AGZn
AGCdCr
AGCdZn
AGCrZn
AGCdCrZn
Koncentrácia
K2Cr2O7 (mg/l)
0
0
0
0
10
0
0
0
10
0
10
0
10
10
Koncentrácia
CdCl2
.2H2O
(mg/l)
0
0
0
25
0
0
0
25
0
0
25
25
0
25
Koncentrácia
ZnSO4.7H2O
(mg/l)
0
0
0
0
0
100
0
0
0
100
0
100
100
100
Koncentrácia
azoxystrobinu
(mg/l)
0
0,1
0
0
0
0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Koncentrácia
glyfosátu
(mg/l)
0
0
500
0
0
0
500
500
500
500
500
500
500
500
V ĉasovom intervale 24, 48, 72 a 96 hod. sme vykonali odĉítanie ņivých artémií. Výsledky
sme porovnali oproti kontrolnej skupine a ńtatisticky vyhodnotili. Zároveņ boli ńtatisticky porovnané
skupiny obsahujúce azoxystrobin a glyfosát. Na vylúĉenie odľahlých hodnôt sme pouņili DeanovDixonov test (Dvořák, 1995). Rozdiely medzi jednotlivými skupinami sme testovali pomocou
signifikantných rozdielov preukázateľnosti (Wayland, 1991).
Výsledky a diskusia
Azoxystrobin je fungicíd so ńirokým spektrom úĉinku proti hlavným druhom patogénnych
plesní, hlavne z rodov Ascomicetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes a Oomycetes. Inhibuje klíĉenie
spór a rast mycélia. Je to jeden z najpouņívanejńích fungicídov v celosvetovom meradle. Azoxystrobin
je charakterizovaný ako nebezpeĉný pre ryby, a aj ostatné vodné ņivoĉíchy. O ĉom svedĉí aj jeho
toxicita v prezentovanom experimente (The pesticide manual 2000,2001).
Glyfosát sa pouņíva ako herbicíd, ktorý má ńiroké pouņitie vzhľadom na ońetrované
poľnohospodárske plodiny (sú to najmä obilniny, repka, repa cukrová a kŕmna, ľan, kukurica,
jadroviny, jahody, zemiaky a iné). Pouņíva sa aj na ońetrenie pasienkov, lesných ńkôlok
a nepoľnohospodárskej pôdy. Glyfosát bol zaradený do Zoznamu rizikových látok relevantných
pre SR v rámci Programu zniņovania zneĉistenia vôd ńkodlivými a obzvláńť ńkodlivými látkami, pre
ktoré je potrebné vypracovať program opatrení na zníņenie zneĉistenia vôd týmito látkami Vzhľadom
na aktuálne pouņitie glyfosátu v poľnohospodárstve je potrebné jeho pravidelné sledovanie vo vodnom
prostredí (Review report, 2002).
Kadmium je toxikologicky významný kontaminant ņivotného prostredia. Primárnym miestom
ńkodlivého úĉinku kadmia sú bunkové membrány, ktoré strácajú svoje ńtruktúrne a funkĉné vlastnosti.
Pôsobí inhibiĉne na aktivitu mnohých enzýmov. Je známy biologický antagonizmus kadmia a zinku
(Bencko, 1995).
Chróm je biogénny prvok ktorý ovplyvņuje metabolizmus cukrov a lipidov. Jeho zlúĉeniny
zráņajú bielkoviny a majú leptavý úĉinok (Bencko, 1995).
Zinok má znaĉnú afinitu k ligandom obsahujúcim dusík a síru. V biologických systémoch sa
nachádza vo väzbe s mnohými organickými látkami, napríklad bielkovinami, aminokyselinami,
nukleovými kyselinami. Zinok ako významný biogénny prvok je súĉasťou mnohých metaloenzýmov
(Bencko, 1995).
69
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 2 Letalita Artemia franciscana
Skupina experimentu
x
24 hod.
n
s
x
48 hod.
n
s
x
72 hod.
n
5
0.0
5
0.0
K*
0
0
0
A
5
8,6
5 12,9
6
56*
74*
G
5
0,0
5
0,0
0
0
0
Cd
5
0.0
5
0.0
0
0
6
Cr
5
0.0
5
0.0
0
0
78*
Zn
5
0.0
5
0.0
0
0
4
5 21,5
5 17,2
AG **
36*
44*
52*
5 12,9
5 17,2
AGCd
30*
58*
66*
5 12,9
5 25,8 **78*
AGCr
**8
36*
5 12,9
5 12,9
AGZn
20*
46*
52*
5 17,2
5
8,6 **80*
AGCdCr
**18*
50*
5
4,3
5
8,6
AGCdZn
**18*
42*
58*
5
8,6
5
4,3 **86*
AGCrZn
20*
56*
5
8,6 **84*
5 17,2 **94*
AGCdCrZn
20*
x–
letalita v %; n – poĉet testovaných skupín; s – smerodajná odchýlka
*ńtatistická významnosť preukázaná v porovnaní s kontrolnou skupinou
** ńtatistická významnosť preukázaná v porovnaní so AG skupinou
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
s
0.0
8,6
0,0
4,3
8,6
4,3
21,5
8,6
17,2
12,9
8,6
8,6
4,3
4,3
x
96 hod.
n
4
86*
0
22*
100*
4
60*
68*
**90*
68*
**100*
72*
**98*
**98*
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
V kontrolnej skupine sme pozorovali 4 % letalitu Artemia franciscana. Po 24 hodinách
expozície sme nepozorovali ńtatisticky významné zmeny medzi kontrolnou a experimentálnymi
skupinami, kde boli pouņité testované látky samostatne. Po 48 hodinách expozície sme pozorovali
ńtatisticky významnú letalitu v skupine obsahujúcej azoxystrobin v porovnaní s kontrolnou skupinou.
Po 72 hodinách sme pozorovali ńtatisticky významné zvýńenie letality v skupinách obsahujúcich
chróm a azoxystrobin v porovnaní s kontrolnou skupinou. Po 96 hodinách expozície sme v porovnaní
s kontrolnou skupinou pozorovali ńtatisticky významné zvýńenie letality v skupinách obsahujúcich
azoxystrobin, kadmium a chróm. Skupiny obsahujúce glyfosát a zinok samostatne nevykazovali
ńtatisticky významný rozdiel letality v porovnaní s kontrolnou skupinou. Vo vńetkých ostatných
skupinách ktoré obsahujú vzájomné kombinácie jednotlivých látok sme pozorovali ńtatisticky
významné zvýńenie letality artémií okrem skupiny AGCr po 24 hodinách expozície, kde rozdiel nebol
ńtatisticky významný.
V tomto experimente sme sa rozhodli porovnať úĉinok kombinácie azoxystrobin (fungicíd)
a glyfosát (herbicíd) s jednotlivými ťaņkými kovmi a ich vzájomnými kombináciami. 24 hodín po
expozícii sme pozorovali ńtatisticky významné zníņenie letality artémií v skupinách obsahujúcich
okrem pesticídov chróm samotný(AGCr), chróm v kombinácii s kadmiom(AGCdCr) a v skupine,
ktorá obsahovala kadmium a zinok(AGCdZn). V ostatných skupinách rozdiely letality neboli
ńtatisticky významné.
Po 48 hodinách expozície sme pozorovali ńtatisticky významné zvýńenie letality v skupine, ktorá
obsahovala v kombinácii vńetky skúmané zloņky (AGCdCrZn). V ostatných skupinách po 48
hodinách rozdiely letality neboli ńtatisticky významné.
V ĉasových intervaloch 72 a 96 hodín expozície sme pozorovali ńtatisticky významné zvýńenie
letality v skupinách, ktoré obsahovali pesticídnu kombináciu a chróm(AGCr), pesticídnu kombináciu
a chróm s kadmiom (AGCdCr), pesticídnu kombináciu a chróm so zinkom (AGCdZn) a v skupine
ktorá obsahovala v kombinácii vńetky skúmané zloņky (AGCdCrZn). V skupinách, ktoré obsahovali
okrem pesticídov aj kadmium a zinok (AGCd, AGZn) sme nepozorovali ńtatisticky významný rozdiel
v porovnaní so samotnou pesticídnou kombináciou. V skupinách obsahujúcich chróm pozorujeme
postupný nárast letality. K najzaujímavejńím pozorovaniam tohto experimentu patria interakcie
pesticídnej kombinácie a Chrómu(AGCr), pesticídnej kombinácie a chrómu s kadmiom(AGCrCd) a
pesticídnej kombinácie s kadmiom a zinkom(AGCdZn), kde po 24 hodinách expozície sme pozorovali
ńtatisticky významne zvýńenie preņívania artémií. Tento úĉinok mohol byť spôsobený buć priamou
väzbou zinku a chrómu na molekuly azoxystrobinu a glyfosátu, ĉo v koneĉnom dôsledku spôsobilo
70
s
4,3
17,2
0,0
12,9
0,0
4,3
25,8
8,6
12,9
17,2
0,0
17,2
4,3
4,3
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
obmedzenie ich ńkodlivých vlastností. Alebo tieņ väzbou na enzymatické systémy, ktorými sa
prejavuje ńkodlivé pôsobenie azoxystrobinu a glyfosátu.
Najtoxickejńou z hľadiska letality artémií bola kombinácia azoxystrobinu, glyfosátu, zinku,
kadmia a chrómu. K známym úĉinkom zinku patrí aj obmedzenie ńkodlivého úĉinku kadmia
(Koreneková, 2002; Kottferová, 2001; Dvořák, 2000).
100
90
80
70
60
50
40
%
30
20
10
hodín
K
A
G
d
r
96
72
48
24
C
C
Zn
A
A
G
A
G
C
dC
rZ
G n
C
A rZn
G
C
d
A Zn
G
C
dC
r
A
G
Zn
A
G
C
r
A
G
C
d
0
Graf 1 Letalita Artemia franciscana
Záver
Sledovaním letality v skupinách, kde sme pouņili chlorid kademnatý, dichroman draselný, síran
zinoĉnatý, glyfosát a azoxystrobin samostatne alebo v ich vzájomných kombináciách, sme pozorovali
zlepńenie preņívania skupín obsahujúcich azoxystrobin a glyfosát v kombinácii s chrómom, kadmiom
a chrómom a kadmiom a zinkom. Tento jav môņeme pravdepodobne vysvetliť ochranným úĉinkom
zinku a chrómu a ich zlúĉenín voĉi ńkodlivému pôsobeniu azoxystrobinu a glyfosátu.
Poďakovanie
Prezentovaná práca vznikla za podpory grantového projektu VEGA Ĉ. 1/0393/08 a Národného
referenĉného laboratória pre pesticícy UVLF-KE.
Literatúra
BENCKO, V. - CIKRT, M. - LENERT.1995. Toxické kovy v ţivotním a pracovním prostredí ĉloveka,
Grada Publishing, 1995, 288 s.
DVOŘÁK, P. 1995. Modifikovaný test s A. salina pro sledování vlivu interakcí cizorodých látek.
Toxicita a biodegradabilita odpadů a látek významných ve vodním prostředí (sborník). Výzkumný
ústav rybářský a hydrobiologický a Aqachemie, Milenovice 1995. s. 25-29.
DVOŘÁK, P. - BEŅOVÁ, K. 2002. The investigation of interactions of low doses of ionizing
radiation and risk factors by means of artemia salina biotest. In Folia Veterinaria, vol. 46, 2002, no.4,
pp. 195-197.
DVOŘÁK, P. - BEŅOVÁ, K. - TOROPILA, M. - GROLICHOVÁ, M. 2000. Interakcia nízkej dávky
gama ņiarenia s nízkymi koncentráciami chloridu kademnatého a dichromanu draselného. In Aktuálne
otázky bioklimatológie zvířat, VFU Brno, 2000, ISBN 80-7305-392-6, s. 5-8.
DVOŘÁK P. - BEŅOVÁ K. 2002. Sledovanie interakcií nízkych dávok ionizujúceho ņiarenia a
rizikových prvkov pomocou biotestu s Artemia salina. In Ekológia a veterinárna medicína V., Końice,
2002, ISBN 80-88985-72-2, 53 s.
DVOŘÁK, P. - ŃUCMAN, E. - BEŅOVÁ, K. 2005.The development of a ten day biotest using
artemia salina nauplii. In Biologia, Bratislava, vol. 60/5, 2005, pp. 593-597.
71
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
DVOŘÁK, P. - ŃUCMAN, E. 1995. Statistika ke cviĉením z biofyziky. Östav Biochemie a biofyziky
FVHE VFU, Brno, 1995, 13 s.
KOĈIŃOVÁ, A 2005. Dezinfekcia prostredia – súĉasť preventívnych opatrení pri infekĉných
chorobách a parazitózach v chovoch zvierat, In Dezinfekce, Dezinsekce, Deratizace, vol. 4, roĉník
XIV, 2005, s. 149–153.
KORENEKOVÁ, B. - SKALICKÁ, M. - KORÉNEK, M. 2002. Chróm vo vzťahu k organizmu
zvierat. In Infovet 4, 2002, IX. roĉník 35.
KOTTFEROVÁ, J. - KORÉNEKOVÁ, B. - SIKLENKA, P. - JACKOVÁ, A. - HURNÁ, E. - ŃÁLY,
J. 2001. The effect of Cd and vitamin D3 on the solidity of eggshell, In Eur. Food Res. Technol., vol.
212, 2001, pp. 153-155.
Review report for the active substance glyphosate, EC Health & Consumer Protection DirectorateGeneral, 6511/VI/99-final, 2002.
SKLENÁŘ Z. - DVOŘÁK P. - BEŅOVÁ K. 2006. Moņnosti vyuņití biotestu s Artemia salina při
studováni toxikologických úĉinku inhibitoru cyklin-dependentních kináz. In Klin. Farmakol.
Farm.,vol.20, 2006, pp. 62-65.
SMĚRNICE RADY EVROPY z 24.listopadu 1986 ke sblíņení právních a správních předpisŧ
ĉlenských státŧ pro ochranu zvířat pouņívaných pro pokusy a jiné vědecké úĉely (86/609/EWG)
"Evropská konvence o ochraně obratlovcŧ pouņívaných pro pokusné a jiné vědecké úĉely". Spoleĉnost
pro vědu o laboratorních zvířatech. Praha 1991. 39 s.
The e-Pesticide manual, twelfth edition Version 2,0 (200-2001).
WAYLAND, J. - HAYES, JR. Dosage and Other Factors Influencing Toxicity. In Handbook of
Pesticide Toxicology.. General Principles Academic Press, 1991, vol. 1, pp. 39-97.
Kontaktná adresa
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Końiciach, Komenského 73, 041 81 Końice,
Slovenská republika
 ++421-915-984682
 [email protected]
72
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
VYBRANÉ RIZIKOVÉ KOMPONENTY NUTRIČNÉHO PRÍJMU U DOSPELÝCH
OSOB
SELECTED RISK COMPONENTS OF NUTRITIONAL INTAKE IN ADULTS
FATRCOVÁ-ŃRAMKOVÁ Katarína, MRÁZOVÁ Jana, KOLESÁROVÁ Anna,
SCHWARZOVÁ Marianna
Katedra výţivy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, Slovenská poľnohospodárska
univerzita, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Slovenská republika
Abstract
The aim of the study was to monitor risk factors of cardiovascular diseases. In randomly selected adult
probands (n = 70) were with the aim overweight and obesity prevalence examination measured the
body fat content using bioelectrical impedance analyse. According to the obtained body fat values, the
probands were into four groups divided: slim 14 %, normal 40 %, overweight 29 %, obesity 17 %.
Recommended fats intake was determined in 32 %, intake of saturated fatty acids in 84 %.
Recommended intake of monounsaturated fatty acids had 16 % and polyunsaturated fatty acids 12 %.
High cholesterol intake was assed in 48 %.
Key words: nutrition, risk factors, cardiovascular diseases, fat, fatty acids, cholesterol
Úvod
Tuky sú vo výņive ľudí najbohatńím zdrojom energie. Pre dospelého jedinca s priemernou
fyzickou aktivitou, ktorého denná energetická potreba je pribliņne 10 000 kJ (cca 2 400 kcal), by malo
byť odporúĉané mnoņstvo prijímaných tukov maximálne 80 g denne (Ministerstvo zdravotníctva SR,
2001).
Podiel prijímaných tukov na celkovom objeme energie nemá presiahnuť 30 % z denného
energetického príjmu s odporúĉaním nasledujúcej ńtruktúry mastných kyselín: nasýtené (saturované)
mastné kyseliny (SFA - saturated fatty acids): 10 % na dennom energetickom príjme,
mononenasýtené (monoénové) mastné kyseliny (MUFA - monounsaturated fatty acids): 10-12 %
a polynenasýtené (polyénové) mastné kyseliny (PUFA - polyunsaturated fatty acids): 8-10 % (Vestník
MZ SR, 1997; Kajaba et al., 1999). Vńetky mastné kyseliny nejakým spôsobom ovplyvņujú hladinu
lipoproteínov v sére (tab. 1).
Tabuľka 1 Vplyv makronutrientov na sérový cholesterol (Grundy, 2003)
Mastné kyseliny
Saturované
palmitová
myristová
laurová
stearová
Mononenasýtené
trans-mononenasýtené
cis-mononenasýtené
Polynenasýtené
n-6
n-3
VLDL
LDL
HDL
C16:0
C14:0
C12:0
C18:0
–
–
–
–



–
–

–
– alebo 
trans C18:1 n-9
cis C18:1 n-9
–
–
 alebo 
–

–
C18:2 n-6
DHA, EPA
– alebo 

– alebo 
– alebo 
– alebo 
–
„–“ znamená, ņe nie je zmena v hladine v porovnaní s cis-mononenasýtenou mastnou kyselinou
(kyselinou olejovou) (C18:1 n-9). Vńetky lipoproteínové odpovede na kyselinu olejovú sú povaņované za
neutrálne, tzn. bez úĉinku; VLDL – lipoproteíny s veľmi nízkou hustotou (very low density
lipoproteins); LDL – lipoproteíny s nízkou hustotou (low density lipoproteins); HDL – lipoproteíny s
vysokou hustotou (high density lipoproteins); DHA – dokosahexaénová kyselina (C22:6 n-3); EPA –
eikosapentaénová kyselina (C20:5 n-3).
73
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Cieľom práce bolo zhodnotiť príjem vybraných nutriĉných faktorov, ktorých nadmerný príjem
predstavuje zvýńené riziko civilizaĉných, najmä kardiovaskulárnych chorôb.
Materiál a metódy
Do súboru bolo zaradených 70 probandov, z toho 50 ņien a 20 muņov (71 % a 29 %). Priemerný
vek bol 43,27  11,53 rokov (u ņien 41,58  10,42; u muņov 47,50  13,29 rokov), probandi boli vo
veku 24-74 rokov. Vekové zloņenie súboru je uvedené v tab. 2.
Telesný tuk bol meraný metódou bioelektrickej impedancie prístrojom Bodystat Quadscan 4000
(Bodystat Ltd, Doubles, Isle of Man, UK). Hodnotenie postavy podľa telesného tuku bolo nasledovné:
ńtíhla postava, normálna postava, nadhmotnosť, obezita.
Na hodnotenie príjmu vybraných nutriĉných faktorov bol pouņitý 24-hod. recall a software
Alimenta 4.3e (VÖP Bratislava). Vyhodnotili sme priemerný príjem ņivín za tri dni. Zamerali sme sa
na
príjem
nasledovných
vybraných
nutriĉných
faktorov:
tukov,
nasýtených,
monoénových, polyénových mastných kyselín a cholesterolu.
Tabuľka 2 Vekové zloņenie súboru
ņeny
Vek
n
16
16
12
5
1
 35 rokov
36-45 rokov
46-55 rokov
56-65 rokov
 65 rokov
muņi
%
32
32
24
10
2
n
4
5
3
7
1
spolu
%
20
25
15
35
5
n
20
21
15
12
2
%
29
30
21
17
3
Výsledky a diskusia
Z hodnotenia podielu telesného tuku v organizme (tab. 3) vyplýva, ņe ńtíhlej postave
zodpovedalo 14 % probandov (viac muņov: 8 % vs. 30 %), normálnej postave 40 % (viac muņov:
32 % vs. 60 %), nadváhe 29 % (viac ņien: 36 % vs. 10 %), obezite 17 % (viac ņien: 24 % vs. 0 %).
Zistený podiel môņe súvisieť s vekom, ako aj s ćalńími faktormi. V epidemiologickej ńtúdii
obyvateľov SR pozorovala Jurkoviĉová (2005) normálnu hmotnosť u 41,7 % ņien a 32,2 % muņov;
nadhmotnosť u 24,8 % ņien a 28,9 % muņov a obezitu u 33,5 % ņien a 38,9 % muņov. V nańom súbore
bol podiel osôb s obezitou niņńí.
Tabuľka 3 Hodnotenie telesného tuku (%)
Hodnotenie
ńtíhla
normálna
nadváha
obezita
norma
< 20
20-29
30-34
≥ 35
ņeny
n
%
4
16
18
12
8
32
36
24
norma
< 10
10-19
20-24
> 25
muņi
n
%
6
12
2
0
30
60
10
0
spolu
n
14
40
29
17
%
14
40
29
17
Pri hodnotení príjmu vybraných nutriĉných faktorov sme zistili, ņe príjem tukov zodpovedal
odporúĉaniu v zmysle Odporúĉaných výņivových dávok SR podľa Vestníka MZ SR (1997) a Kajabu
et al. (1999), t.j. max. 30 % denného energetického príjmu u pribliņne tretiny súboru (32 %).
Nepriaznivým výsledkom je, ņe extrémne vysoký podiel tukov v strave (viac ako 40 % denného
energetického príjmu) malo 16 % probandov (tab. 4).
74
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 4 Energetická hodnota z tukov (% súboru)
Hodnota parametra
%
max. 30 % energetického príjmu *
32
31-35 % energetického príjmu
36
36-40 % energetického príjmu
16
viac ako 40 % energetického príjmu
16
* odporúĉanie podľa Vestníka MZ SR (1997) a Kajabu et al. (1999)
Odporúĉaná energetická hodnota zo saturovaných mastných kyselín (max. 10 %) sa vyskytovala
u 84 % súboru (tab. 5). Naopak 16 % probandov toto odporúĉanie prekraĉovalo, t.j. malo v strave
nepriaznivo vysoký podiel nasýtených mastných kyselín z celkového denného energetického príjmu
(t.j. ich podiel predstavoval viac ako jednu tretinu z príjmu energie tukmi).
Tabuľka 5 Energetická hodnota zo saturovaných mastných kyselín (% súboru)
Hodnota parametra
%
max. 10 % energetického príjmu *
84
viac ako 10 % energetického príjmu
16
* odporúĉanie podľa Vestníka MZ SR (1997) a Kajabu et al. (1999)
Odporúĉaný príjem mononenasýtených mastných kyselín (minimálne jednu tretinu z príjmu
energie tukmi, t.j. 10 % aņ do 12 %) spĺņalo len 16 % osôb (tab. 6). Najväĉńí podiel probandov mal ich
príjem niņńí (viac ako dve tretiny súboru). Ide o nepriaznivé zistenie najmä vtedy, ak by probandi
súĉasne preferovali potraviny s vyńńím príjmom saturovaných mastných kyselín. Naopak ćalńích 16 %
osôb má v strave vyńńí podiel monoénových mastných kyselín, ako je odporúĉaný.
Tabuľka 6 Energetická hodnota z monoénových mastných kyselín (% súboru)
Hodnota parametra
%
menej ako 10 %
68
10 aņ 12 % *
16
viac ako 12 %
16
* odporúĉanie podľa Vestníka MZ SR (1997) a Kajabu et al. (1999)
Príjem polynenasýtených mastných kyselín maximálne 10 % z denného príjmu energie bol
charakteristický pre väĉńinu súboru (96 %). Odporúĉanie (8-10 % energetického príjmu) presiahli 4 %
probandov, ktorí mali vysokú energetickú hodnotu z uvedených mastných kyselín, t.j. v rozsahu 10,01
aņ 12,92 % (tab. 7). Nadmerný príjem polynenasýtených mastných kyselín, najmä ak nie je dostatoĉne
sprevádzaný prívodom antioxidantov potravou (napr. vitamínu E), zvyńuje náchylnosť na oxidáciu.
Naopak nízky príjem polyénových mastných kyselín (v rozsahu do 8 %) malo 84 % probandov.
Príjmu uvedených mastných kyselín v rozsahu 8-10 % zodpovedalo 12 % súboru.
Tabuľka 7 Energetická hodnota z polyénových mastných kyselín (% súboru)
Hodnota parametra
menej ako 8 %
84
8 aņ 10 % *
viac ako 10 %
12
4
%
96
4
* odporúĉanie podľa Vestníka MZ SR (1997) a Kajabu et al. (1999)
Vńetky doterajńie poznatky potvrdzujú, ņe nasýtené mastné kyseliny zvyńujú hladinu celkového
cholesterolu aj LDL-cholesterolu v krvi a naopak, nenasýtené mastné kyseliny ich zniņujú.
75
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Aterogénny potenciál nasýtených mastných kyselín je vńak podstatne vyńńí (pribliņne dvojnásobný)
ako antiaterogénny úĉinok nenasýtených mastných kyselín (Bada, 2001; Hegsted et al., 1995).
Epidemiologické ńtúdie potvrdili priamu a silnú závislosť medzi príjmom nasýtených tukov v potrave
a výskytom ischemickej choroby srdca (Kromhout et al., 1995). Ak sú nasýtené mastné kyseliny s
8-16 uhlíkmi prijímané potravou, zvyńujú koncentráciu sérového LDL-cholesterolu. V USA a v
Európe tvoria 12-15 % z celkového energetického príjmu. V priemere na kaņdé 1 % energie prijatej vo
forme nasýtených mastných kyselín (zvyńujúcich cholesterolémiu) sa hladina LDL-cholesterolu
v porovnaní s kyselinou olejovou zvýńi asi o 2 mg.dl-1 (0,025 mmol.l-1) (Grundy, 2003). Nenasýtené
mastné kyseliny zniņujú hladinu LDL-cholesterolu, ak v strave nahradia nasýtené mastné kyseliny
(Stone, 2002). Rasmussen et al. (2006) zistili, ņe zmena podielu prijímaných tukov v zmysle zníņenia
nasýtených a zvýńenia monoénových mastných kyselín zníņila diastolický krvný tlak. Prospeńný vplyv
na krvný tlak s ohľadom na kvalitu tukov bol negovaný vysokým príjmom tuku. Öĉinok mastných
kyselín typu n-3 na krvný tlak nebol signifikantný. Malé zníņenie príjmu saturovaných mastných
kyselín pomocou olivového oleja znaĉne zníņilo dennú dávku antihypertenzných liekov potrebných
pre pacientov s hypertenziou (Ferrara et al., 2000). Aj Ruitz-Gutierrez et al. (1996) uvádza, ņe v malej
skupine hypertenzných ņien mala strava bohatá na monoénové mastné kyseliny z olivového oleja
priaznivý úĉinok na krvný tlak. Rasmussen et al. (1993) zistili, ņe strava s vysokým obsahom
olivového oleja zníņila u normotenzných osôb s diabetes mellitus typu 2 systolický krvný tlak o
4 mmHg a diastolický o 5 mmHg v porovnaní so stravou bohatou na sacharidy.
WHO odporúĉa prijímať 5-10 dielov nenasýtených n-6 mastných kyselín k jednému dielu n-3
mastných kyselín (pomer n-3 : n-6 = 1 : 5-10). Podľa niektorých autorov neúmerne vysoký príjem n-6
mastných kyselín z rastlinných olejov môņe oslabiť priaznivé úĉinky n-3 mastných kyselín, ako sú
antisklerotické úĉinky a zniņovanie triacylglycerolov v krvi (Vojtańńáková et al., 2000).
V nańom vyńetrovanom súbore bol príjem cholesterolu v rámci odporúĉaných hodnôt (max. 300
mg) u viac ako polovice súboru (52 %). U 48 % probandov bol príjem cholesterolu vyńńí, ĉo je
nepriaznivé zistenie vzhľadom na kardiovaskulárne riziko (tab. 8).
K tukom v potrave, ktoré majú vplyv na hladiny tukových látok v krvi a na celkové
kardiovaskulárne riziko, patria najmä: cholesterol, nasýtené a nenasýtené tuky (resp. mastné kyseliny)
a osobitná forma nenasýtených mastných kyselín – trans-mastné kyseliny. Zdrojom exogénneho
cholesterolu sú najmä vnútornosti, vajeĉný ņĺtok a iné, výluĉne ņivoĉíńne potraviny (Jurkoviĉová,
2005). Jurkoviĉová (2005) pozorovala v súbore 16 403 osôb normálny cholesterol (menej ako 5,2
mmol.l-1) u 51,3 % ņien a 57,8 % muņov; zvýńené hladiny cholesterolu (5,2-6,2 mmol.l-1) u 30,5 %
ņien a 29,5 % muņov; a vysoký cholesterol (6,2 mmol.l-1 a viac) u 18,2 % ņien a 12,7 % muņov.
Tabuľka 8 Príjem cholesterolu (% súboru)
Mnoņstvo cholesterolu
%
max. 300 mg *
52
viac ako 300 mg
48
* odporúĉanie podľa Vestníka MZ SR (1997) a Kajabu et al. (1999)
Správnou výņivou moņno zníņiť hladinu sérového cholesterolu, a tým zabrániť alebo spomaliť
vznik a priebeh ischemickej choroby. Metaanalýzy epidemiologických údajov ukázali, ņe pokles
hladiny celkového cholesterolu o 1 % je spojený s poklesom kardiovaskulárneho rizika o 2-3 %.
Mnohé rizikové faktory kardiovaskulárnych chorôb (vysoký obsah cholesterolu, ale aj obezita,
diabetes, vysoký krvný tlak, fajĉenie, fyzická inaktivita) sa dajú modifikovať zmenou stravovania
a ņivotného ńtýlu. Öprava stravovania v rámci kardiovaskulárnej prevencie je aktuálna pri zvýńených
hladinách celkového cholesterolu, LDL-cholesterolu, triacylglycerolov a pri nízkej hladine HDLcholesterolu (Grundy, 2003).
V prípade, ak sme hodnotili súĉasné splnenie prvých ńtyroch odporúĉaní v dennom stravovaní
probandov (pre celkový príjem tukov, pre príjem saturovaných, monoénových a polyénových
mastných kyselín súĉasne), zistili sme nasledujúce: Ani jedno zo ńtyroch uvedených odporúĉaní
nemalo v stravovaní dodrņaných 8 % probandov (tab. 9). Najväĉńí podiel súboru splnil jedno aņ
súĉasne dve odporúĉania (spolu 88 %), avńak vńetky ńtyri výņivové odporúĉania nenaplnil ņiaden
proband.
76
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 9 Poĉet splnených odporúĉaní 1 (% súboru)
Počet splnených odporúčaní
%
0
8
1
2
3
4
44
44
4
0
z nasledujúcich ńtyroch kritérií: pre celkový príjem tukov, pre príjem saturovaných, monoénových a
polyénových mastných kyselín
1
Zo súĉasného naplnenia nutriĉného odporúĉania pre celkový príjem a súĉasne pre niektorú zo
skupín mastných kyselín sme zistili nasledujúce: Viac ako polovica probandov (52 %) splnila len
jedno odporúĉanie z uvedených dvoch (tab. 10). Kritérium pre celkový príjem tukov a pre príjem
saturovaných mastných kyselín súĉasne splnila takmer tretina súboru (32 %). U 16 % osôb nebolo
v stravovaní dodrņané ani jedno odporúĉanie.
Nepriaznivým zistením je, ņe kritérium pre celkový príjem tukov a pre príjem monoénových
mastných kyselín súĉasne nesplnil ņiaden proband (tab. 10). Strava v prípade viac ako polovice súboru
(52 %) nemala dodrņanú ani jednu z uvedených dvoch odporúĉaní, priĉom v prípade 48 % probandov
bolo splnené len jedno z vybratých dvoch hodnotených odporúĉaní.
Eńte o nieĉo nepriaznivejńiu situáciu sme pozorovali pri súĉasnom splnení kritéria pre celkový
príjem tukov a pre príjem polyénových mastných kyselín. Obidve súĉasne nenaplnil nikto, priĉom viac
ako polovica osôb (56 %) nesplnilo ani jedno kritérium (tab. 10).
Tabuľka 10 Poĉet splnených odporúĉaní pre celkový príjem tukov a pre príjem mastných kyselín
(MK) (% súboru)
Saturované MK
(%)
Monoénové MK
(%)
Polyénové MK
(%)
0
16
52
56
1
52
48
44
2
32
0
0
Počet splnených odporúčaní
V prípade komplexného zhodnotenia piatich nutriĉných kritérií, týkajúcich sa príjmu celkových
tukov, saturovaných, monoénových, polyénových mastných kyselín, ako aj príjmu cholesterolu
vyplynulo, ņe ich v stravovaní súĉasne vńetky nedodrņal v súbore nikto (tab. 13). Dve alebo viac zo
vńetkých piatich odporúĉaní naplnilo stravovanie 64 % osôb, priĉom viac ako tretina (36 %) splnila zo
vńetkých piatich práve dve kritéria súĉasne.
Tabuľka 13 Poĉet splnených odporúĉaní 2 (% súboru)
Počet splnených odporúčaní
%
0
0
1
36
2
3
4
5
36
24
4
0
z nasledujúcich piatich kritérií: pre celkový príjem tukov, pre príjem saturovaných, monoénových a
polyénových mastných kyselín, pre príjem cholesterolu
2
77
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Záver
Zhodnotením rizikových faktorov kardiovaskulárnych chorôb sme vo vybranej ĉasti dospelej
populácie zistili, ņe nadhmotnosť alebo obezitu má 46 % súboru, ĉo je znaĉný podiel. Nepriaznivo
vysoký príjem tukov má 68 % osôb a saturovaných mastných kyselín 16 %. Naopak odporúĉaný
príjem monoénových mastných kyselín sme pozorovali len u 16 % a polyénových mastných kyselín
iba u 12 % probandov. Vysoký príjem cholesterolu malo 48 %.
Komplexné zhodnotenie stravovania podľa vńetkých piatich hodnotených nutriĉných kritérií
(príjmu celkových tukov, saturovaných, monoénových, polyénových mastných kyselín ako aj
cholesterolu súĉasne) vyplynulo, ņe vńetky odporúĉania súĉasne neboli v súbore dodrņané u nikoho.
Dve alebo viac zo vńetkých piatich odporúĉaní splnilo stravovanie 64 % osôb. Vybrané ņiviny sú vo
veľkej ĉasti prítomné ako rizikové komponenty nutriĉného príjmu s ohľadom na riziko
kardiovaskulárnych chorôb.
Poďakovanie
Táto publikácia bola vytvorená realizáciou projektu „Excelentné centrum ochrany a vyuņívania
agrobiodiverzity (ECOVA) ĉ. ITMS 26220120015“, na základe podpory operaĉného programu
Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja.“ Práca bola rieńená aj
v rámci projektu KEGA 301-035SPU-4/2010.
Literatúra
BADA, V. 2001. Výņiva v prevencii kardiovaskulárnych ochorení podľa záverov 5. medzinárodnej
koferencie o preventívnej kardiológii v Osake, alebo ĉo spája Okinawu so Slovenskom. In Cardiol.,
2001, 10, 5.
FERRARA, L.A. - RAIMONDI, S. - d´EPISCOPO, L. - GUIDA, L. - DELLO RUSSO, A. - MArotta,
T. 2000. Olive oil and reduced need for antihypertensive medications. In Arch. Intern. Med., vol. 160,
2000, p. 837–842.
GRUNDY, S.M. 2003. Factors Determining Blood Cholesterol Levels. In: CABALLERO, B.,
TRUGO, L.C., FINGLAS, P.M.: Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition. Volume 2. Kidlington
: Elsevier Science, 2003. p. 1237-1243. ISBN 0-12-227055-X
HEGSTED, D.M. - MCGANDY, R.B. - MYERS, M.L. et al. 1995. Quantitative effects of dietary fat
on serum cholesterol levels in man. In Am. J. Clin. Nutr., vol. 17, 1965, no. 5, p. 281-295.
JURKOVIĈOVÁ, J. 2005. Vieme zdravo ņiť? Bratislava : Univerzita Komenského, 2005. 166 s. ISBN
80-223-2132-X
KAJABA, I. - ŃIMONĈIĈ, R. - GINTER, E. et al. 1999. Odporúĉané výņivové dávky pre
obyvateľstvo Slovenska (8. revízia OVD). In Výţiva a zdravie, roĉ. 44, 1999, ĉ. 2, s. 25-29.
Ministerstvo zdravotníctva, 2001. Skupiny potravinových komodít a kritériá pre hodnotenie ich
zdravotnej neškodnosti : Projekt Zdravá výņiva pre zdravé srdce. Ministerstvo zdravotníctva, máj
2001. 16 s.
RASMUSSEN, B.M. - VESSBY, B. - UUSITUPA, M. et al. 2006. Effects of dietary saturated,
monounsaturated, and n-3 fatty acids on blood pressure in healthy subjects. In Am. J. Clin. Nutr., vol.
83, 2006, no. 2, p. 221– 226.
RASMUSSEN, O.W. - THOMSEN, C. - HANSEN, K.W. - VESTERLUND, M. - WINTHER, E. HERMANSEN, K. 1993. Effects on blood pressure, glucose, and lipid levels of a highmonounsaturated fat diet compared with a high-carbohydrate diet in NIDDM subjects. In Diabetes
Care, vol. 16, 1993, p. 1565–1571.
RUITZ-GUTIERREZ, V. - MURIANA, F.J. - GUERRERO, A. - CERT, A.M. - VILLAR, J. 1996.
Plasma lipids, erythrocyte membrane lipids and blood pressure of hypertensive women after ingestion
of dietary oleic acid from two different sources. In J. Hypertens., vol. 14, 1996, p. 1483–1490.
VESTNÍK MZ SR. 1997. roĉ. 45, ĉiastka 7-8, zo dņa 28. apríla 1997.
VOJTAŃŃÁKOVÁ, A. et al. 2000. Potravinové tabuľky : Tuky, olejniny, oleje a orechy. 1. vyd.
Bratislava : VUP, 2000. 203 s. ISBN 80-85330-83-0
78
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ŤAŅKÉ KOVY – KONTAMINANTY VČELIEHO PEĽU A POUŅITIE PEĽU VO
VÝŅIVE
HEAVY METALS – CONTAMINANTS OF BEE POLLEN AND USE OF POLLEN IN
NUTRITION
FATRCOVÁ-ŃRAMKOVÁ Katarína1, NÔŅKOVÁ Janka2
Katedra výţivy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU Nitra, Slovenská republika
Inštitút ochrany biodiverzity a biologickej bezpeĉnosti, Fakulta agrobiológie a potravinových
zdrojov, SPU Nitra, Slovenská republika
1
2
Abstract
Bee-collected pollen is promoted as a health food/food supplement. The aim of the study was to
evaluate the heavy metals concentrations in bee gathered pollen (in case of three treatments: dried,
frozen, freeze-dried). Samples of bee-collected pollen were obtained from beekeepers, which
respected qualitative criteria for gathering, drying and storing. The samples were collected during the
spring season 2007 from different regions of west Slovakia. From the heavy metals, lead level was in
bee pollen 0.16 mg.kg-1 (in frozen pollen) and less than 0.1 mg.kg-1 (in dried and freeze-dried pollen).
The content of mercury was 0.002 mg.kg-1. Cadmium concentration was 0.034 mg.kg-1, and ranged
from 0.029 to 0.038 mg.kg-1.
Key words: Brassica napus subsp. napus L., bee pollen, heavy metals, contamination, nutrition
Úvod
Vĉelí obnôņkový peľ je povaņovaný za ńpeciálnu, nutriĉne hodnotnú potravinu, ktorá má
mnohé zdraviu prospeńné úĉinky a vyuņíva sa aj v apiterapii (Bogdanov, 2004). Obsahuje ņiviny ako
sacharidy, bielkoviny, aminokyseliny, lipidy, vitamíny, minerálne látky a stopové prvky (Serra
Bonvehi a Escola Jorda, 1997). Má viaceré farmakologické úĉinky, ako sú antibiotické,
antineoplastické, antidiarhoické, a pôsobí aj ako antioxidaĉný ĉiniteľ (Campos et al., 1997). Vyuņíva
sa nielen vo výņive ľudí, ale aj zvierat (Bíro et al., 2010).
Vzhľadom na vyuņitie peľu vo výņive treba rozlińovať tri druhy peľu: rastlinný (kvetový), ktorý
sa uvoľņuje z peľových komôrok rastlín a nie je ņiadnym spôsobom spracovaný; vĉelí obnôņkový peľ,
ktorý vĉely pozbierali z kvetov a upravili ho výluĉkami svojich ņliaz a medových vaĉkov; úľový
(plástový), fermentovaný peľ (perga), nazývaný aj „vĉelí chlieb“, ktorý uņ preńiel hydrolýzou
neredukujúcich cukrov a mlieĉnym kvasením v plástoch, priĉom tento je z hľadiska výņivy
najhodnotnejńí (Końlík, 1995; Końlík, 1997).
Peľ je vĉelí produkt ovplyvnený kontaminantami rôzneho pôvodu. Môņe byť kontaminovaný zo
vzduchu, napríklad ťaņkými kovmi a pesticídmi. Pre optimálnu kvalitu peľu sa odporúĉa zberať peľ
v oblastiach, ktoré sú vzdialené minimálne 3 km od zdroja kontaminácie, napríklad od intenzívnej
dopravy, priemyselných centier a poľnohospodárskych oblastí ońetrovaných pesticídmi (Bogdanov,
2004). V mnohých krajinách boli na zhodnotenie stupņa zneĉistenia ņivotného prostredia pouņité
vĉely a vĉelie produkty (Loper et al., 1980; Roman, 2000). Vĉelstvo a ich produkty môņe
kontaminovať vzduch a pôda, ktoré obsahujú ťaņké kovy väĉńinou z priemyslu a dopravy (Bogdanov,
2005).
Cieľom práce bolo zhodnotiť obsah vybraných ťaņkých kovov vo vĉeľom peli rastlinného
druhu Brassica napus subsp. napus L.
Materiál a metodika
Vzorky monoflorálneho vĉelieho peľu rastlinného druhu repky olejnej (Brassica napus subsp.
napus L.) boli získané od vĉelárov, ktorí spĺņali kvalitatívne kritériá pre zber, suńenie a skladovanie
peľu, ako ich uvádza Bogdanov (2004). Vzorky boli zberané poĉas jarnej sezóny 2007 z rôznych
regiónov západného Slovenska. Mrazený peľ bol pripravený tak, ņe vzorky ĉerstvého vĉelieho peľu
79
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
boli skladované pri teplote -18°C a 20 % vlhkosti pribliņne 6 mesiacov aņ do analýzy. Vzorky
suńeného peľu boli pripravené suńením ĉerstvého peľu (9-11 % vlhkosť) pribliņne 8 hodín pri
maximálnej teplote 35°C. Vlhkosť bola testovaná termogravimetrickým analyzátorom WPS 50SX/1
(RADWAG). Lyofilizované vzorky vĉelieho peľu boli suńené pouņitím stolového laboratórneho
lyofilizátora LYOVAC GT 2 (Amsco/Finn-Aqua), 80 hodín bez ohrevu, aņ do 2 % vlhkosti.
Ťaņké kovy (olovo, ortuť, kadmium) boli analyzované ńtandardnými metódami v
akreditovanom analytickom laboratóriu BEL/NOVAMANN International s.r.o. Nové Zámky. Vzorky
materiálu boli zhomogenizované, z homogenizovaných vzoriek bola vytvorená laboratórna vzorka,
ktorá sa ćalej spracovávala. Na stanovenie ortute bola pouņitá metóda zaloņená na uvoľnení pár ortute
z laboratórnej vzorky spaľovanej v prúde kyslíka pri teplote 900°C, na ich zachytení na amalgamátore,
rýchlom vyparení do meracích kyviet a meraní absorpĉného signálu. Skúńka sa vykonávala na
jednoúĉelovom prístroji AMA 254. Pri stanovovaní kadmia a olova sa laboratórna vzorka rozloņila
mikrovlnným spôsobom, mineralizát sa následne meral na atómovom absorpĉnom spektrofotometri s
elektrotermickou atomizáciou (AAS ETA). Obsah sledovaných ťaņkých kovov sme porovnali
s obsahom v monoflorálnom vĉeľom peli iného rastlinného druhu – maku siateho (Papaver
somniferum L.) (Kaĉániová et al., 2010).
Výsledky a diskusia
V obnôņkovom vĉeľom peli repky olejnej sme zistili obsah olova v prípade suńeného a
lyofilizovaného peľu menej ako 0.1 mg.kg-1, zatiaľ ĉo pri treťom type - v mrazenom peli bol obsah
o nieĉo vyńńí (tab. 1). Z porovnania so vĉelím obnôņkovým peľom z maku siateho (Kaĉániová et al.,
2010) vyplýva, ņe sme zistili podobné údaje. Kaĉániová et al. (2008, 2010) analyzovali koncentrácie
ťaņkých kovov (kadmium, ortuť, olovo) vo vzorkách vĉelieho peľu (po troch úpravách – po suńení,
zmrazení a lyofilizovaní peľu), ako aj vo vzorkách kvetového peľu.
Obsah ortute bol rovnaký vo vńetkých troch typoch monoflorálneho vĉelieho peľu podľa
spracovania, priĉom bol niņńí, ako dokumentuje Kaĉániová et al. (2010) v peli z maku siateho (0,004
aņ 0,005 mg.kg-1). V prípade kadmia sme vo vĉeľom peli repky olejnej zistili obsah v rozsahu 0,029 aņ
0,038 mg.kg-1 pre suńený, mrazený a lyofilizovaný typ. Namerané hodnoty sú omnoho niņńie, ako boli
v obnôņkovom vĉeľom peli z maku siateho (v rozsahu 0,220 aņ 0,260 mg.kg-1) (Kaĉániová et al.,
2010).
Tabuľka 1 Obsah ťaņkých kovov vo vĉeľom peli (mg.kg-1)
Ťaņké kovy Včelí peľ
Brassica napus subsp. napus L.
suńený
 0,1
0,16
mrazený
lyofilizovaný
 0,1
Olovo (Pb)
0,002
suńený
0,002
0,002
mrazený
0,002
Ortuť (Hg) lyofilizovaný
0,029
suńený
0,034
0,035
mrazený
Kadmium
0,038
(Cd)
lyofilizovaný
1
Kaĉániová et al. (2010)
Papaver somniferum L. 1
 0,1
 0,1
 0,1
 0,1
0,005
0,004
0,004
0,004
0,250
0,243
0,220
0,260
Bogdanov (2005) zosumarizoval viacero poznatkov z publikovaných ńtúdií, zameraných na
kontamináciu peľu, vĉelieho vosku a propolisu ťaņkými kovmi (Altmann, 1983; Cesco et al., 1994;
Maff, 1995; Leita et al., 1996; Conti a Botre, 2001; Madras-Majewska a Jasinski, 2003). Hodnoty sú
rôzne a pre peľ sa pohybujú v ńirokom rozpätí: olovo 0,02–3,90 mg.kg-1, kadmium v peli 0,05–2,30
mg.kg-1. Z vyńńie uvedeného prehľadu analýz vyplýva, ņe obsah olova ako aj kadmia bol vo vĉeľom
obnôņkovom peli vo väĉńom rozsahu ako pri nańich analýzach vĉelieho peľu repky olejnej. Obsah
kadmia bol v uvedenom prehľade jednoznaĉne vyńńí ako v nańich vzorkách.
Olovo a kadmium sú povaņované za hlavné toxické ťaņké kovy a sú tak najviac predmetom
ńtúdií (Bogdanov, 2005). Vĉely môņu aj so svojimi produktami slúņiť ako bio-indikátory kontaminácie
ťaņkými kovmi, najmä olovom (Höffel, 1982; Altmann, 1983; Bromenshenk et al., 1985; Bogdanov et
80
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
al., 1986; Jones, 1987; Balestra et al., 1992; Cesco et al., 1994; Conti a Botre, 2001; Yazgan et al.,
2002; Porrini et al., 2002; Devillers et al., 2002; Lebedev a Murashova, 2004). Podľa Kaĉániovej et al.
(2008, 2010) bol zistený obsah olova v kvetovom peli z maku siateho 0,64 mg.kg-1. Patruica et al.
(2008) analyzovali obsah olova vo fermentovanom (zmieńanom a slneĉnicovom) peli.
Výrazný rozvoj ťaņkého priemyslu a automobilovej dopravy zapríĉinil vysoký obsah ortute
v ņivotnom prostredí (Madras-Majewska a Jasiński, 2005). Podľa Kaĉániovej et al. (2008, 2010) bol
obsah ortute v kvetovom peli z maku siateho 0,019 mg.kg-1. Madras-Majewska a Jasiński (2005)
hodnotili obsah ortute vo vĉeľom chlebe (vo fermentovanom peli) z rôznych regiónov Poľska.
Uvádzajú, ņe ak je kontaminácia ortuťou vo vybraných oblastiach vysoká, potom je vysoká aj
kontaminácia vĉelieho chleba týmto prvkom. Celkovo bolo pozorované, ņe obsah ortute vo vĉeľom
peli bol na nízkej úrovni a neprekroĉil normy. Limit pre deti a dojĉatá bol podľa Ministerstva
zdravotníctva v Poľsku (Rozporządzenie Ministra Zdrowia, 2003) 0,01 mg.kg-1. Pritom vńetky
skúmané vzorky vĉelieho chleba ortuť obsahovali. Zistený obsah bol v rozsahu od 18.10-5 do 795.10-5
mg.kg-1, priemerný obsah bol 92.10-5 mg.kg-1. Podobný priemerný obsah ortute vo vĉeľom chlebe
pozoroval Żarski et al. (1996), a to 91.10-5 mg.kg-1.
Kaĉániová et al. (2008, 2010) uvádzajú koncentráciu kadmia v kvetovom peli 0,12 mg.kg-1.
Obsah kadmia bol niņńí v kvetovom peli ako vo vĉeľom peli, ale iné ťaņké kovy (olovo a ortuť)
dosiahli vyńńí obsah v peli kvetovom. Ĉermáková (1997) zistila, ņe vo vybraných sledovaných
územiach (Bardejov, Spińská Nová Ves, Gelnica, Ruņomberok a Bratislava) bola v roku 1989
nameraná maximálna hodnota kadmia v peli 0,172 mg.kg-1, priĉom v roku 1995 bola maximálna
hodnota 0,720 mg.kg-1. Vyńńie hodnoty boli zistené vo vzorkách z oblastí s poľnohospodárskou
produkciou.
Aj ćalńí autori uvádzajú, ņe peľ nie je len prírodný zdroj minerálnych látok, ale môņe
obsahovať tieņ prvky ńkodlivé pre ľudské zdravie: kadmium, olovo, ortuť a arzén (Free et al., 1983;
Lipińska a Zalewski, 1989; Migula, 1990; Konopacka et al., 1993; Szczęsna et al., 1993). Autori
upozorņujú na ĉasté príĉiny prekroĉenia prijateľných obsahov týchto zdraviu ńkodlivých prvkov a tieņ
na potrebu konńtantného monitorovania ich hladiny vo vĉeľom obnôņkovom peli. Öle zamerané na
produkciu peľu by nemali byť lokalizované v priemyselných oblastiach, v tesnej blízkosti ruńných
dopravných ciest alebo veľkých mestských aglomerácií (Szczęsna, 2007).
Dlhý polĉas rozpadu kovov, ich akumulácia v tele môņu spôsobiť dlhotrvajúcu záťaņ
organizmu a toxické pôsobenie. Toxicita rôznych kovov sa môņe meniť vzájomnou interakciou kovov
a iných substancií, napr. selén môņe zníņiť toxicitu metylortute a zinok zase toxický úĉinok kadmia.
V súĉasnosti sú hladiny koncentrácií toxických kovov v ņivotnom prostredí relatívne nízke,
s výnimkou oblastí s intenzívnou priemyselnou aktivitou, takņe sa priame pońkodenie zdravia nemusí
v priebehu ņivota ĉloveka prejaviť.
Systematický monitoring koncentrácie toxických kovov v atmosfére, pôde, vode a hygienické
a technologicko-preventívne opatrenia sú primárnou metódou na zniņovanie obsahu kovov v ņivotnom
prostredí, a tým aj v potravinovom reťazci. Vĉasné zachytenie zvýńeného mnoņstva cudzorodých látok
v ņivotnom prostredí je veľmi dôleņité. Preto je dôleņité pouņívať práve peľ zozbieraný vĉelami ako
jeden z citlivých bioindikátorov zneĉistenia ņivotného prostredia (Ĉermáková, 1997).
Podľa Chlebu a Ĉermákovej (2001) kontaminácia peľu hrozí hlavne z dvoch zdrojov –
priemyselnými exhalátmi a aplikáciou prípravkov na ochranu rastlín. V rokoch 1990 a 1999 uvedení
autori zisťovali prítomnosť vybraných chemických prvkov (tab. 2) v ńestnástich vzorkách peľu zo
ńtyroch regiónov Slovenska s vysokou ekologickou záťaņou (Stredný Spiń, Ruņomberok, Horná Nitra
a Bratislava). Za danej situácie bol stav ĉistoty ovzduńia na území Slovenska celkovo uspokojivý.
Nebolo to len zníņením výroby, ale aj ekologizáciou výroby u veľkých producentov exhalátov.
Tabuľka 2 Obsah ťaņkých kovov vo vzorkách peľu (mg.kg-1) (Chlebo a Čermáková, 2001)
Chemický
Olovo
Ortuť
Kadmium
Arzén
Chróm
prvok
1,700
0,018
0,180
0,605
0,650
rok 1990
0,380
0,003
0,043
0,182
0,120
rok 1999
1,000
0,050
0,100
1,000
0,500
Limit
81
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
V nańich analyzovaných vzorkách vĉelieho obnôņkového peľu z repky olejnej (tab. 1) bol
obsah ťaņkých kovov pre vńetky tri typy peľu niņńí, ako uvádza Chlebo a Ĉermáková (2001), priĉom
nańe hodnoty sú súĉasne aj pod limitom uvádzaným v tab. 2.
Bogdanov (2005) v prehľadovej ńtúdii uvádza, ņe hlavné nebezpeĉenstvo kontaminácie vĉelích
produktov pochádza viac z vĉelárskej praxe ako z environmentálnych faktorov. Vĉelári môņu úspeńne
predchádzať kontaminácii vĉelích produktov aj prostredníctvom ekologických alternatív. V oblasti
vĉelárstva môņe byť prínosom vypracovanie a aplikovanie systému HACCP (Hazard Analysis and
Critical Control Point) – systém analýzy rizika a kritických kontrolných bodov. Alternatívne
kontrolné stratégie a minimálne pouņitie syntetických chemikálií vo vĉelárskej praxi môņu zabezpeĉiť,
ņe vĉelie produkty budú ĉisté a bezpeĉné. Zavedenie organického vĉelárstva je ekologickým
prostriedkom s cieľom zabrániť vplyvu zdrojov vńetkých hlavných kontaminantov a dosiahnuť
produkciu vĉelích produktov s najvyńńou kvalitou a bez obsahu toxických kontaminantov.
Aby bolo zabezpeĉené minimálne riziko kontaminácie peľu pre potravinárske úĉely, je
potrebné vytypovať ekologicky vhodné oblasti a zabezpeĉiť dokonalú informovanosť a spoluprácu
medzi pestovateľmi a vĉelármi (Chlebo a Ĉermáková, 2001).
Záver
Vo vzorkách monoflorálneho vĉelieho peľu rastlinného druhu repky olejnej (Brassica napus
subsp. napus L.) sme zistili niņńí obsah vybraných ťaņkých kovov (olova, ortute, kadmia), ako uvádza
väĉńina literárnych zdrojov. Porovnanie troch typov peľu podľa úpravy poukazuje na vyńńí obsah
olova v mrazenom peli v porovnaní so suńeným a lyofilizovaným peľom. Obsah ortute bol rovnaký vo
vńetkých troch typoch monoflorálneho vĉelieho peľu podľa spracovania, obsah kadmia sa medzi
jednotlivými typmi líńil. Na stanovenie kvalitatívnych parametrov peľu sú nutné ćalńie ńtúdie. Je
potrebné zamerať úsilie na zníņenie rizika kontaminácie peľu ťaņkými kovmi, aby bolo moņné plné
vyuņitie peľu aj v humánnej výņive.
Poďakovanie
Práca bola rieńená v rámci projektu VEGA 1/0887/10 a KEGA 301-035SPU-4/2010.
Literatúra
ALTMANN, G.A. 1983. Untersuchung von Honig aus dem Raum Stolberg auf Schwermetalle :
Diplomarbeit. Aachen : Aachen Fachhochschule, 1983.
BALESTRA, V. - CELLI, G. - PORRINI, C. 1992. Bees, honey, larvae and pollen in biomonitoring of
atmospheric pollution. In Aerobiologia, vol. 8, 1992, p. 122-126.
BÍRO, D. - GÁLIK, B. - JURÁĈEK, M. - ŃIMKO, M. 2010. Vyuņitie peľu ako fytogénneho aditíva
vo výņive zvierat. In Formovanie obnôţkového peľu : Uĉebná pomôcka pre ńpecializované kurzy
v programe celoņivotné vzdelávanie. Nitra : SPU, 2010, s. 196-202. ISBN 978-80-552-0358-4
BOGDANOV, S. 2004. Quality and standards of pollen and beeswax. In Apiacta, vol. 38, 2004, p.
334-341.
BOGDANOV, S. 2005. Contaminants of bee products. In Apidologie, vol. 37, 2005, p. 1-18.
BOGDANOV, S. - ZIMMERLI, B. - ERARD, M. 1986. Schwermetalle in Honig. In Mitt. Geb.
Lebensm. Hyg., vol. 77, 1986, p. 153-158.
BROMENSHENK, J.J. - CARLSON, S.R. - SIMPSON, J.C. - THOMAS, J.M. 1985. Pollution
monitoring of puget sound with honey bees. In Science, vol. 227, 1985, p. 632-634.
CAMPOS, M. - MARKHAM, K.R. - MITCHELL, K.A. - da CUNHA, A.P. 1997. An approach to the
characterization of bee pollen via their flavonoid/phenolic profiles. In Phytochemical Analysis, vol. 8,
1997, no. 3, p. 181-185.
CESCO, S. - BARBATTINI, R. - AGABITI, M.F. 1994. Honey bees and bee products as possible
indicators of cadmium and lead environmental pollution: an experience of biological monitoring in
Portogruaro city (Venice, Italy). In Apicoltura, vol. 9, 1994, p. 103-118.
CONTI, M.E., BOTRE, F. 2001. Honeybees and their products as potential bioindicators of heavy
metals contamination. In Environ. Monit. Assess., vol. 69, 2001, p. 267-282.
ĈERMÁKOVÁ, T. 1997. Peľ ako indikátor kvality ņivotného prostredia. In Vĉelár, roĉ. 71, 1997, ĉ.
11, s. 170-171.
82
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
DEVILLERS, J. - DORÉ, J.C. - VIEL, C. - MARENCO, M. - POIRIER-DUCHÊNE, F. - GALAND,
N. - SUBIRANA, M. 2002. Typology of French acacia honeys based on their concentrations in
metallic and nonmetallic elements. In DEVILLERS, J., PHAM-DELÈGUE, M.H. (Eds.): Honey bees:
Estimating the environmental impact of chemicals. London and New York : Taylor & Francis, 2002,
p. 248-268.
FREE, J.B. - WILLIAMS, I.H. - PINSENT, R.J.F.H. - TOWNSEND, A.. - BASI, M.S. - GRAHAM,
C.L. 1983. Using foraging honeybees to sample an area for trace metals. In Environment
International, vol. 9, 1983, p. 9-12.
HÖFFEL, I. 1982. Apis mellifica L. als Indikator der 'Umweltgüte' im Stadtgebiet von Saarbrücken :
Diplomarbeit. Saarbrücken : Saarbrücken Universität des Saarlandes, 1982.
CHLEBO, R. - ĈERMÁKOVÁ, T. 2001. Potravinárske vyuņitie peľu. In Výţiva a potraviny pre tretie
tisícroĉie : zborník z vedeckej konferencie. Nitra : SPU, 2001, s. 171-173. ISBN 80-7137-847-X
JONES, K.C. 1987. Honey as an indicator of heavy metal contamination. In Water Air Soil Poll., vol.
33, 1987, p. 179-189.
KAĈÁNIOVÁ, M. - NÔŅKOVÁ, J. - FATRCOVÁ-ŃRAMKOVÁ, K. - KROPKOVÁ, Z. KUBINCOVÁ, J. 2008. Antioxidant, antimicrobial activity and heavy metals content in pollen of
Papaver somniferum L. Abstracts from the 8th International Conference on Risk Factors of Food
Chain, Kraków, Poland, September 17, 2008. In Slovak Journal of Animal Science, vol. 41, 2008, no.
4, p. 204.
KAĈÁNIOVÁ, M., NÔŅKOVÁ, J., FATRCOVÁ-ŃRAMKOVÁ, K., KROPKOVÁ, Z.,
KUBINCOVÁ, J. 2010. Antioxidant, antimicrobial activity and heavy metals content in pollen of
Papaver somniferum L. In Ecological Chemistry and Engineering (A), vol. 17, 2010, no. 1, p. 97-105.
KONOPACKA, Z. - POHORECKA, K. - SYROCKA, K. - CHABER, J. 1993. Zawartość kadmu,
ołowiu, azotanów i azotynów w obnóżach pyłkowych pochodzących z różnych miejsc w okolicach
Puław. In Pszczeln. Zesz. Nauk., vol. 37, 1993, p. 181-187.
KOŃLÍK, Ń. 1995. Moņnosti vyuņitia vĉelieho peľu v humánnej medicíne. In Vĉelár, roĉ. 69, 1995, ĉ.
7-8, s. 112-113
KOŃLÍK, Ń. 1997. Öspeńné pouņitie vĉelieho peľu u pacientov s akútnou vírusovou hepatitídou. In
Slovenský lekár, roĉ. 7, 1997, ĉ. 3, s. 15
LEBEDEV, V.I. - MURASHOVA, E. 2004. Ekologicheskaja cistota produktov pcelovodstvoch. In
Pcelovodstvo, vol. 82, 2004, p. 42-44.
LEITA, L. - MUHLBACHOVA, G. - CESCO, S. - BARBATTINI, R. - MONDINI, C. 1996.
Investigation of the use of honey bees and honey bee products to assess heavy metals contamination.
In Environ. Monit. Assess., vol. 43, 1996, p. 1-9.
LIPIŃSKA, J. - ZALEWSKI, W. 1989. Zawartość w produktach pszczelich mikroelementów oraz
pierwiastków szkodliwych dla zdrowia człowieka. In Pszczeln. Zesz. Nauk., vol. 33, 1989, p. 113-120.
LOPER, G.M. - STANDIFER, L.N. - THOMPSON, M.J. - GILLIAM, M. 1980. Biochemistry and
microbiology of bee-collected almond (Prunus dulcis) pollen and bee bread. I. Fatty acids, sterols,
vitamins and minerals. In Apidologie, vol. 11, 1980, no. 1, p. 63 – 73.
MADRAS-MAJEWSKA, B. - JASINSKI, Z. 2003. Lead content of bees, brood and bee products from
different regions of Poland. In J. Apic. Sci. (Poland), vol. 47, 2003, p. 47-55.
MADRAS-MAJEWSKA, B. - JASIŃSKI, Z. 2005. The content of mercury in bee bread originating
from different region of Poland. In Journal of Apicultural Science, vol. 49, 2005, no. 2, p. 69-73.
MAFF. 1995 Analysis of bee products for heavy metals, Food Surveillance Information Sheet Nr. 53,
http://www.archive.food.gov.uk/maff/archive/food/infsheet/1995/no53/53bee.htm (accessed on 7 July
2005).
MIGULA, P. 1990. Wskazania dla hodowli pszczół w warunkach zanieczyszczonego środowiska :
Praca zbiorowa. Katowice : Uniwersytet Śląski, Katedra Fizjologii Człowieka i Zwierząt, 1990.
PATRUICA, S. - JIVAN, A. - HARMANESCU, M. 2008. Researches regarding the mineral content
of pollen and bee bread samples rise from Banats area. In Bulletin of University of Agricultural
Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca : Animal Science and Biotechnologies, vol. 65, 2008,
no. 1-2, p. 447.
PORRINI, C. - GHINI, S. - GIROTTI, S. - SABATINI, A.G. - GATTAVECCHIA, E. - CELLI, G.
2002. Use of honey bees as bioindicators of environmental pollution in Italy. In DEVILLERS, J. -
83
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
PHAM-DELÈGUE, M.H. (Eds.): Honey bees: Estimating the environmental impact of chemicals.
London and New York : Taylor & Francis, 2002, pp. 186-247.
ROMAN, A. 2000. Badania porównawcze zawartooeci Cd, Pb i Zn w miodzie, propolisie i wosku
pochodzących z rejonów wałbrzyskiego i głogowskiego In XXXVII Nauk. Konf. Pszczel. Puławy,
2000, p. 76-77.
ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ZDROWIA z dnia 13 stycznia 2003 r. w sprawie maksymalnych
poziomów zanieczyszczeń chemicznych i biologicznych, które mogą znajdować się w żywnoości,
składnikach żywnoości, dozwolonych substancjach dodatkowych, substancjach pomagających w
przetwarzaniu albo na powierzchni żywności (Dz.U. 2003, nr 37, poz. 326).
SERRA BONVEHI, J. - ESCOLA JORDA, R. 1997. Nutrient composition and microbiological
quality of honeybee-collected pollen in Spain. In Journal Agricultural Food Chemistry, vol. 45, 1997,
no. 3, p. 725-732.
SZCZĘSNA, T. 2007. Concentration of selected elements in honeybee-collected pollen. In Journal of
Apicultural Science, vol. 51, 2007, no. 1, p. 5-13.
SZCZĘSNA, T. - RYBAK-CHMIELEWSKA, H. - ARCIUCH, H. 1993. Zastosowanie anodowej
woltamperometrii inwersyjnej do oznaczania Cd, Pb, Cu w obnóżach pyłkowych. In Pszczeln. Zesz.
Nauk., vol. 37, 1993, p. 171-179.
ŃALGOVIĈOVÁ, D. - ZMETÁKOVÁ, Z. 2006. Monitoring spotrebného końa. In Enviromagazín,
roĉ. 11, 2006, ĉ. 2 (mim. ĉ.), s. 20-21.
YAZGAN, S. - HORN, H. - ISENGARD, H.D. 2002. Honig, ein Bioindikator aufgrund seiner
Schwermetallgehalte? In Lebensmittelchemie, vol. 56, 2002, p. 97-116.
ŻARSKI, T. - JASIŃSKI, Z. - ŻARSKA, H. - FLISZKIEWICZ, C. 1996. Rtęć w produktach
pszczelarskich jako wskaźnik zanieczyszczenia środowiska naturalnego. In Biuletyn X Zjazdu PTNW
(III), 1996, p. 540.
84
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
GENETIC RISK FACTORS FOR THROMBOSIS
FEČKOVÁ Monika1, MINDEKOVÁ S.1, JAKABOVÁ Daniela1, TRANDŅÍK Jozef2,
BULECA Ján ml.3, KOZLÍK Peter1, CHRASTINA Jozef1, RYBA Ńtefan1, MASSÁNYI
Peter4, ROYCHOUDHURY Shoubhadeep4
1
Breeding Services of the Slovak Republic s.e., Bratislava, Slovakia
2
Constantine the Philosopher University, Nitra, Slovakia
3
University of Veterinary Medicine, Košice, Slovakia
4
Slovak University of Agriculture, Nitra, Slovakia
Abstract
Thrombosis is a multi-factorial disorder that arises from the combined effect of non-genetic and
inheritied risk factors. Hereditary thrombophilia is inherited tendency to increased blood clotting,
which occurs more rapidly stop bleeding, but also a higher probability of developing thrombosis.
Ethiology of genetic risk for thrombosis is determinated by mutation in several genes that encode for
coagulation proteins. The most important genetic risk for thrombosis is a point mutation in the Factor
V gene (Leiden) that is found in 20 to 50% of cases of inherited thrombophilia. It is also occurs in 37% of apparently normal individuals in European population. The mutation (G1691A) cause as
a resistance to cleavage of anti-coagulant proteins APC, that indicate a hypercoaguable state. Factor V
(Leiden)-associated thrombophilia during pregnancy can cause pregnancy complication (pregnancy
loss, preeclamsia, abruptio placentae, fetal growth retardation, interuterine fetal death). Another
genetic risk factor for thrombosis is the gene encoding Prothrombin (Factor II). Prothrombin is the
final effector of the clotting cacsade that leads to the formation of fibrin. Prothrombin is the precursor
of the serin protease thrombin which plays a central role in the control of blood coagulation. The point
mutation (G20210A) is associated with increased prothrombin activity, which has been identified as
an independent risk factor for thrombosis. The factor II mutation is detected in 18% of thrombosis
patients. In the context of non-genetics factors (age, lifestyle and diet, hormonal contraception,
pregnancy, cancer, operative procedures etc.), detection of genetic predisposition for thrombophilia is
importatnt for prevention. Genetic risk factors for thrombosis can be easily detected by known
molecular-genetic methods. The most widely used methods for determining these mutations are PCRRFLP (HindIII) or multiplex PCR using allele-specific primers.
Key words: thrombosis, factor V, prothrombin, thrombin, PCR
85
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
SELECTED BIOCHEMICAL PARAMETERS OF ENERGY, ENZYMATIC AND
NITROGENOUS PROFILE OF DAIRY COWS IN BLOOD PLASMA
FILIPEJOVÁ Terézia, KOVÁČIK Jaroslav
Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak Agricultural
University in Nitra, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovak Republic
Abstract
The aim of our study was to determine selected biochemical parameters of energy, enzymatic and
nitrogenous profile of dairy cows in the blood plasma and their evaluations. Fifteen dairy cows from
selected agricultural farms were divided into three groups as follow: group A - 3-4 weeks after calving
(the beginning of lactation), group B - 3-4 months after calving (the middle of lactation), and group C
- 2-3 weeks before calving (the dry period). Concentrations of selected biochemical parameters of
energy profile: glucose (GLU), cholesterol (CHOL); enzymatic profile: aspartate aminotransferase
(AST), creatinkinase, (CK) and nitrogenous profile: urea, total proteins (TP), albumins (ALB) in blood
plasma were measured. Significant differences among groups of dairy cows were evaluated by the
Scheffe´s – test using SAS statistical programme. Differences among the groups at p<0.05, p<0.01
using test ANOVA one way were considered as significant. In our observation, we detected some
significant differences of AST concentration in group A (1.36±0.20 μkat.l-1; p<0.05), group B
(1.93±0.45 μkat.l-1; p<0.01) and following group C (1.13±0.12 μkat.l-1; p<0.01). The cholesterol
concentration was significantly higher in group B (4.44±0.73 mmol.l-1; p<0.05) in comparison to
group C (2.56±0.79 mmol.l-1; p<0.05), however in group A (3.10±1.06 mmol.l-1) without significant
differences (p>0.05). No significant differences in creatinekinase, urea, total proteins, albumin and
glucose were detected. In conclusion, this study observed to better understanding of energy, enzymatic
and nitrogenous profile.
Key words: biochemical parameters; aspartat aminotransferase; cholesterol; blood; dairy cows
Introduction
Blood tests from individual animals are routinely used to diagnose disease problems in dairy
cattle. Veterinarians, producers and nutrition consultants are similar interested in extracting pertinent
information relative to herd nutrition and health status from blood tests (Van Saun, 2007).
Determination of indicators of the metabolic profile in course of the breeding season helps to diagnose
the metabolic problems of the animals (Verheyen et al., 2007). The metabolic profile test indicates the
balance of some metabolic pathways, and together with animal, diet and body condition score
assessment, is a useful tool for nutritional evaluation in dairy herds (Van Saun and Wustenberg 1997,
Whitaker 2000). A number of factors are responsible for individual and herd variation in blood
metabolite concentrations, thus confounding interpretation. In addition, the cow has an exquisite
system of checks and balances that maintain normal physiologic functions within a wide array of
dietary and environment insults. More recent research has better characterized metabolic dynamics
around the time of calving and their relationship with high prevalence of metabolic and infectious
disease problems. This, coupled with a series of factors including improved diagnostic tests, increasing
herd size and recognition of transition cow health impact on herd performance, have revived interest in
new
testing
protocols
to
better
assess
herd
periparturient
disease
risk
(Van Saun, 2007).
86
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Material and methods
Fifteen dairy cows from selected agricultural farm were divided into three groups:
group A - 3-4 weeks after calving (the beginning of lactation), group B - 3-4 months after calving (the
middle of lactation) and group C - 2-3 weeks before calving (the dry period). Blood samples for
biochemical analysis were taken from vena jugularis 2 hours after morning feeding. The blood
plasma was separated from whole blood by the centrifugation at 3000 rpm for 30 minutes and samples
were stored at – 18 °C. Selected biochemical parameters of energy profile: glucose (GLU), cholesterol
(CHOL) and of enzymatic profile: aspartate aminotransferase (AST), creatinkinase (CK) and of
nitrogenous profile: urea, total proteins (TP), albumins (ALB) in blood plasma were analyzed by
using semi–automated clinical chemistry analyzer Microlab 300 (VilatScientific, Dieren, Vilat
Scientific, The Netherlands) (Filipejová and Kováĉik, 2009). Significant differences among groups of
dairy cows were evaluated by the Scheffe´s – test by using SAS statistical programme. Differences
among the groups at p<0.05, p<0.01 using test ANOVA one way were considered as significant.
Results and discussion
The findings of many authors (El-Azab et al., 1993; Balakrishnan and Balagopal, 1994) suggest
that normal blood levels of various biochemical constituent are necessary for normal function of
various systems of body including reproductive system. Changes in various biochemical constituents
have been blamed for reproductive failures. Thus, serum biochemical profile might be a potential aid
in characterizing these problems (Ahmad et al., 2004). In the metabolic profile test reference values
are defined as mean values and ranges of standard deviation. Thus, values from blood analysis are
compared with the population average or ranges of reference values (Herdt, 2000). Our results of
concentrations of biochemical parameters in blood plasma of dairy cows are shown in the table 1.
Table 1 Concentration of AST, creatinkinase, urea, total proteins, albumin, glucose, and cholesterol of
dairy cows in blood plasma
Parameter
x
Minimum Maximum
S.D.
CV (%)
AST (μkat.l-1)
1.36a
1.04
1.58
0.20
14.95
-1
CK (mmol.l )
2.40
1.30
3.68
0.87
36.22
Urea (mmol.l-1)
4.88
4.30
6.30
0.83
16.92
-1
TP (g.l )
78.80
70.00
85.00
5.97
7.58
-1
A
ALB (g.l )
32.80
25.00
38.00
5.54
16.89
GLU(mmol.l-1)
3.95
3.58
4.32
0.28
7.16
-1
CHOL (mmol.l )
3.10
1.30
4.00
1.06
34.06
AST (μkat.l-1)
1.54
2.57
0.45
23.10
1.93 a, b, A
-1
CK (mmol.l )
18.10
2.13
61.84
25.11
138.73
-1
Urea(mmol.l )
5.12
3.80
5.80
0.78
15.22
B
TP (g.l-1)
83.60
75.00
88.00
5.59
6.69
-1
ALB (g.l )
37.20
34.00
39.00
1.92
5.17
GLU(mmol.l-1)
3.96
3.60
4.12
0.22
5.45
-1
a
CHOL(mmol.l )
4.44
3.50
5.50
0.73
16.52
AST (μkat.l-1)
1.13 b, A
0.99
1.30
0.12
10.32
-1
CK (mmol.l )
6.70
1.71
23.74
9.54
142.28
Urea(mmol.l-1)
4.46
4.10
5.00
0.45
10.10
-1
C
TP (g.l )
82.60
82.00
84.00
0.89
1.08
ALB (g.l-1)
35.60
33.00
38.00
1.82
5.10
-1
GLU(mmol.l )
3.95
3.52
4.47
0.37
9.29
CHOL(mmol.l-1)
2.56 a
1.60
3.70
0.79
30.71
A-beginning of lactation, B-middle of lactation, C-dry period, x-mean, S.D.-standard deviation,
CV-coefficient of variation, AST-aspartate aminotransferase, CK-creatinkinase, TP-total proteins,
ALB-albumin, GLU-glucose, CHOL-cholesterol, signifficant differences among the groups (p<0.05) presented
as equal letters (a-a, b-b), signifficant differences among the groups (p<0.01) presented as equal letters (A-A)
87
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
The liver plays a key role in the metabolic adaptation, through coordination and interconversion
of nutrients to support pregnancy and lactation (Seifert and Englard, 1994; Reynolds et al., 2003).
Concerning the enzymatic profile, AST (aspartate aminotransferase) is cell enzyme, which is occurs
like cytoplasmatic and mitochondrial isoenzyme. The most occurrence of AST is in hepatocytes, bone
muscle and myocard in dairy cows. Determining AST activity in dairy cows is most often connected
with fatty liver syndrome (Cebra et al., 1997). Furthermore, activity of AST is higher like ALT (alanin
aminotransferase) in liver, likewise AST has higher diagnostic importance for ruminants. Between fat
content in liver and AST activity in blood plasma is significant correlative relationship.
In our observation, we detected significant differences of AST concentration in group A
(1.36±0.20 μkat.l-1; p<0.05), group B (1.93±0.45 μkat.l-1; p<0.01) and following group C (1.13±0.12
μkat.l-1; p<0.01) (Table 1). According to Pechová, et al. (2003) reference range of AST is 0.72-1.41
μkat.l-1. AST activity increased in blood plasma with fatty liver (Pechová et al., 2003). Increased AST
activity in the serum is a sensitive marker of liver damage, even if the damage is of a subclinical
nature (Meyer and Harvey, 1998). Consequently, without significant differences among the groups
ranged content of creatinkinase concentration in group A (2.40±0.87 mmol.l-1) was the lowest in
comparison to group C (6.70±9.54 mmol.l-1) and the highest concentration was in group B
(18.10±25.11 mmol.l-1), in all groups concentration of creatinkinase was increased, which can cause
myopathy, stress load, myodystrofy (Slanina, et al. 1992). Creatinkinase is released from muscle when
it is catabolized or injured (Van Saun, 2004a, b).
Also parameters of energy profile were measured. The concentration of glucose in group A
(3.95±0.28 mmol.l-1) was similar to concentration group B (3.96±0.22 mmol.l-1), likewise to group C
(3.95±0.37 mmol.l-1), all detected values were in reference range (2.20–4.10 mmol.l-1) similar to
Slanina et al. (1992). The results indicated no significant (p>0.05) differences among the groups. In
addition, the cholesterol concentration was significantly higher in group B (4.44±0.73 mmol.l-1;
p<0.05) in comparison to group C (2.56±0.79 mmol.l-1; p<0.05), however in group A (3.10±1.06
mmol.l-1) without significant differences (p>0.05). The cholesterol concentration in blood plasma is
characteristic its content in feeding dose, when increased values of cholesterol are detected by feeding
supplemental fat, moreover synthetic possibility of liver, because liver is only one organ, which is able
to cholesterol synthesis (Pechová et al., 2003).
Metabolism of nitrogenous parameters is influence by worse liver damage, when decreased
metabolic function of liver occurs by decreased protein synthesis, mainly albumins. Moreover,
decreased urea synthesis, which displays increased ammonia concentration. In addition, the urea
concentration in group B (5.12±0.78 mmol.l-1) was highest, followed by A (4.88±0.83 mmol.l-1) and
the lowest in group C (4.46±0.45 mmol.l-1). Urea is an important source of protein synthesis in
ruminants through the urea cycle (Herdt, 2000; Engelking, 2004). Urea in ruminants is synthesized in
the liver from 2 sources: nitrogen from the deamination of endogenous amino acids and ammonia
absorbed from the rumen (Herdt, 2002). The concentration of urea in blood and milk is affected not
only by dietary intake of crude protein digestible in the rumen but also by balance between energy and
protein in the diet (Hoffman and Steinhofel 1990). Increasing the intake of digestible crude protein or
digestible crude protein/MJ of metabolizable energy increases the urea content in blood and milk
(Grings et al. 1991). Total protein and albumin reflect availability of amino acids and their
concentration decline in the face of protein deficiency. However, this occurs over a period of time.
Albumin has a relatively short half-life and can reflect protein deficiency problems over a period of a
month or two. Albumin was found to be associated with postpartum disease and can be used to predict
disease risk in close-up and fresh periods (Van Saun, 2004a, b). The total protein concentration in
group A (78.80±5.97 g.l-1) was lowest, followed by group C (82.60±0.89 g.l-1) and highest in group B
(83.60±5.59 g.l-1). According to Pechová (2003) reference range of total proteins in blood plasma
should be 60 - 80 g.l-1, which implies, group B and C were increased in comparison to Pechová
reference range. However, albumin concentration in group A(32.80±5.54 g.l-1), group B (37.20±1.92
g.l-1) and group C (35.60±1.82g.l-1) were similar in results, in spite of that in Pechova (2003) reference
range, which is 30 – 42 g.l-1. The differences were no significant (p>0.05). Serum albumin
concentrations ≤ 32.5 g.l-1 in close-up dry cows resulted in a three-fold greater risk for postpartum
disease. In spite of concerns about variables confounding albumin interpretation, it seems to be a good
88
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
disease risk indicator, possibly reflecting availability of amino acids from the labile protein pool (Van
Saun, 2007).
Conclusion
In conclusion, deficiency in dairy cow‟s nutrition may influence many biochemical and
physiological processes. In our observation, some significant differences in blood plasma of enzymatic
and energy profile of dairy cows were found. We detected significant differences of AST
concentration in group A (p<0.05), group B (p<0.01) and following group C (p<0.01). The cholesterol
concentration was significantly higher in group B (p<0.05) in comparison to group C (p<0.05),
however in group A without significant differences (p>0.05). We did not observe any significant
differences in creatinkinase, urea, total proteins, albumin and glucose. All detected parameters were in
reference values besides creatinkinase. This study observed to better understanding of energy,
enzymatic and nitrogenous profile.
Acknowledgment
This study was supported by the grant KEGA 101-001SPU-4/2010 (Ministry of Education, Slovak
Republic).
References
AHMAD, I. - LODHI, L.A. - QURESHI, Z.I. - YOUNIS, M. 2004. Studies on blood glucose, total
proteins, urea and cholesterol levels in cyclic, non-cyclic and endometritic crossbred cows.
In Pakistan Veterinary Journal, vol. 24, 2004, no. 2, pp. 92-94.
BALAKRISHNAN, V. - BALAGOPAL, R. 1994. Serum calcium, phosphorous, magnesium, copper
and zinc levels in regular breeding buffaloes. In Indian Veterinary Journal, vol.71, 1994, pp. 23-25.
CEBRA, C.K. - GERRY, F.B. - GETZY, D.M. - FETTMAN, M.J. 1997. Hepatic lipidosis in
anorectic, lactating holstein cattle: retrospective study of serum biochemical abnormalities.
In Journal of Veterinary Internal Medicine, vol. 4, 1997, pp. 231-237.
ENGELKING, L.R. 2004. Nonprotein derivatives of amino acids Textbook of Veterinary
Physiological Chemistry. Jackson, Wyoming: Teton NewMedia, 2004, pp. 66–71.
EL-AZAB, M.A. - BADR, A. - SHAWKI EL-SADAWY,G. - BORKAT, T.M. 1993. Some
biochemical changes in relation to postpartum ovarian activity in dairy cows. In Indian Journal of
Animal Science, vol. 63, 1993, no. 12, pp. 1244-1247.
FILIPEJOVÁ, T. - KOVÁĈIK, J. 2009. Evaluation of selected biochemical parameters in blood
plasma, urine and milk of dairy cows during the lactation period. In Slovak Journal of Animal
Science, vol. 42, 2009, no. 1, pp. 8 -12. ISSN 1337-9984.
GRINGS, E.E. - ROFFLER, R.E. - DEITEHOFF, D.P. 1991. Response of dairy cows in early
lactation to additions of cottonseed meal in alfalfa-based diets. In Journal of Dairy Science,
vol. 74, 1991, pp. 2580-2587.
HERDT, T.H. 2000. Variability characteristics and test selection in herd level nutritional and
metabolic profile testing. In Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice,
vol. 16, 2000, pp. 387-403.
HERDT, T. 2002. Gastrointestinal physiology and metabolism. Cunningham J.G. Textbook of
Veterinary Physiology. 3rd ed. Philadelphia, In Elsevier Science, 2002, pp.222–322.
HOFFMAN, M. - STEINHOFEL, O.1990. Possibilites and restriction in using milk urea
concentrations as markers of energy and protein balance. In Veterinary Medicin., vol. 45, 1990, pp.
223-227.
MEYER, D.J. - HARVEY, J.W. 1998. Evaluation of hepatobiliary system and skeletal Musile and
lipid disorders. In Veterinary Laboratory Medicine. Interpretation and Diagnosis. (Meyer, D. J., J. W.
Harvey, Eds.) 2nd ed., W.B. Saunders company Philadelphia, London, Toronto, Montreal, Sydney,
Tokyo. 1998. pp. 157-187.
PECHOVÁ, A. - DVOŘÁK, R. - PAVLATA, L. 2003. Diagnostika a výskyt hepatopatií u dojnic. In
Zdravotní problematika přeţvýkavců. Produkĉní a metabolické choroby skotu. Sborník referátù z
odborného semináře, Brno, 2003, s. 80.
89
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
REYNOLDS, C.K. - AIKMAN, P.C. - LUPOLI, B.- HUMPHRIES, D.J.- BEEVER, D.E. 2003.
Splanchnic metabolism of dairy cows during the transition from late gestation through early
lactation.In Journal of Dairy Science, vol. 86, 2003, pp. 1201–1217.
SEIFERT, S.- ENGLARD, S. 1994. Energy metabolism. In The Liver, Biology and Pathobiology.3rd
ed. ARIS, I.M., BOYER, J.L., FAUSTO, N., JAKOBY, W.B., SCHACHTER, D.A., SHAFRITZ,
D.A. Raven Press Ltd., New York, pp. 323–364.
SLANINA, Ľ.- BESEDA, I. - HLINKA, D.- ILLEK, J. - KOVÁĈ, G. - KROUPOVÁ,V. LEHOCKÝ, J. - MICHNA, A.- ROSSOW, N. - SOKOL, J. - VAJDA, V. 1992. Metabolický profil
hovädzieho dobytka vo vzťahu k zdraviu a produkcii. 1992, ŃVS SR, Bratislava, 2 vyd., 115 s. ISBN
80-7148-001- 0.
VAN SAUN, R.J. - WUSTEMBERG, M. 1997. Metabolic profiling to evaluate nutritional and disease
status. In Bovine Practice, vol. 31, 1997, pp. 37-42.
VAN SAUN, R.J. 2004a. Health status and time relative to calving effects on blood metabolite
concentrations, In Proc 23rd World Buiatrics Congress ,Quebec, Canada, 2004a, p. 87.
VAN SAUN, R.J. 2004b. Metabolic profiling and health risk in transition cows. In Proc Am Assoc
Bov Pract, vol. 37, 2004b, pp.212-213.
VAN SAUN, R.J. 2007. Metabolic profiling of transition cows: Can we predict impending problems?
In Hindsgavl Slot, Danske Kvægfagdyrlægers Forenings Årsmøde, 2007, Faneblad 1, pp.1-8.
VERHEYEN, A.J.N. - MAES, D.G.D. - MATEUSEN, B. - DEPREZ, P. - JANSSENS, G.P.J. - DE
LANGE, L. - COUNOTTE, G. 2007. Serum biochemical reference values for gestating and lactating
sows. In Veterinary Journal, vol. 174, 2007, pp. 92-98.
WHITAKER, D.A. 2000. Use and interpretation of metabolic profiles. In Andrews A H (ed). The
health of dairy cattle. Blackwell Science, Oxford, UK, 2000, pp. 89-93.
Contact address
Ing. Terézia Filipejová
Slovak University of Agriculture, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Department of Animal
Physiology, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovak Republic
 ++421-37-641 4288
 [email protected]
90
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
NUTRIČNÁ KVALITA CEREÁLIÍ, PSEUDOCEREÁLIÍ A STRUKOVINY
Z HĽADISKA CELIAKÁLNYCH AGENS
NUTRITIVE QUALITY OF CEREALS, PSEUDOCEREALS AND LEGUMINOUS
FROM THE POINT OF VIEW COELIAC AGENS
GÁLOVÁ Zdenka, POLÓNIOVÁ Zuzana, CHŇAPEK Milan, KEČKÉŃOVÁ Monika,
PÁLENČÁROVÁ Eva
Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Tr. A. Hlinku 2,
949 76 Nitra, Slovenská republika
1
Abstract
Coeliac disease is an inflammatory disorder of small intestine triggered by the ingestion of wheat, rye,
barley and possibly oat products. The study deals with the selection of suitable varieties of cereals,
pseudocereals and leguminous from the point of view of non-gluten diet. Nutritive and technological
aspects were investigated using several biochemical methods such as the content of proteins,
fractionation of proteins and immunochemical method Elisa. Results showed, that globulins are the
dominant storage protein fraction in several varieties of pseudocereals and chickpea which introduce
them among nutritive valued protein sources in people and animal nutrition. Elisa analysis
acknowledged inappropriateness of cereals (wheat, barley, oat) for patients with coeliac disease.
Content of gluten in pseudocereals and leguminous was less than 0,02%, therethorough they are
suitable for preparing of non-gluten free food according to Slovak Technical Standards as well.
Considering introduced investigations we can point out that amaranth, buckwheat and chickpea are
suitable for production of foodstuff for patients with coeliac disease.
Key words: coeliac disease, cereals, pseudocereals, leguminous, proteins, Elisa kit
Úvod
Obilniny spolu so strukovinami majú ćalekosiahly dopad na výņivovú bilanciu ľudstva, sú
významné najmä vćaka svojej relatívne nízkej cene a vysokému obsahu sacharidov, bielkovín,
kvalitných tukov, minerálov a vitamínov. Najvýznamnejńou „chlebovou“ obilninou je pńenica letná
(Triticum aestivum L.), ktorej bielkoviny významne ovplyvņujú vlastnosti finálneho produktu
(Muchová, 2001; Gálová et al., 2006). K dobrej pekárenskej hodnote prispievajú prolamínové
a glutelínové frakcie zásobných bielkovín, ktoré pri pńenici vytvárajú lepok, avńak tieto komponenty
zrna v niektorých cereáliách tvoria významnú skupinu alergénov, ktorých konzumácia spôsobuje
senzitívnym jedincom zdravotné ťaņkosti a vyvolávajú ochorenie - celiakiu. Presný priebeh a príĉina
ochorenia nie sú známe, ale predpokladá sa, ņe gliadíny pńenice, sekalíny raņe, hordeíny jaĉmeņa
a aveníny ovsa spúńťajú kaskádu zápalových reakcií, ktoré následne vedú k malabsorbcii a pońkodeniu
malej intestinálnej sliznice tenkého ĉreva. Ľudia postihnutí touto chorobou musia po celý ņivot
dodrņiavať prísnu bezlepkovú diétu.
Cieľom práce bola biochemická analýza 3 druhov obilnín (pńenica, jaĉmeņ, ovos), 2 druhov
pseudoobilnín (pohánka, láskavec) a jedného druhu strukoviny (cícer) z hľadiska moņnosti ich
vyuņitia ako suroviny pre prípravu bezlepkových potravín.
Materiál a metodika
V práci bol pouņitý rastlinný materiál získaný z Génovej banky semenných druhov SR SCPV
VÖRV v Pieńťanoch. Analyzovaná bola pńenica letná forma ozimná (Triticum aestivum L. - odroda
Petrana a Klea), ovos jarný (Avena sativa L. - odroda Detvan a Izák), jaĉmeņ jarný (Hordeum vulgare
L.- odroda Kompakt a SK 5451), pohánka obyĉajná (Fagopyrum esculentum Moench. - línia Pyra
a FAG 120/82), láskavec (Amaranthus L. - línia 29 USA a Metylcatyl), cícer baraní (Cicer arietinum
L. - línia AUS 480 a Punjáb).
V celozrnom ńrote vzoriek bol stanovený obsahu celkového dusíka podľa Kjeldahla (Michalík
et al., 2006), výpoĉet hrubého proteínu (% N x koeficient), frakcionácia bielkovinového komplexu
91
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
ICC metódou podľa Michalíka (2002), elektroforetická separácia zásobných bielkovín pomocou
metódy ISTA SDS-PAGE (Wrigley, 1992) a immunochemická analýza gliadínov metódou ELISA
(RIDASCREEN®).
Výsledky a diskusia
Vo vńeobecnosti sa celiakia povaņuje za metabolické ochorenie, ktoré je spôsobené príjmom
potravín obsahujúcich prolamíny obilného zrna ako sú gliadíny pńenice, hordeíny jaĉmeņa, sekalíny
raņe, prípadne aveníny ovsa. Celiakálne aktívne prolamíny sú rozdeľované do viacerých subfrakcií,
priĉom najväĉńie patofyziologické procesy iniciujú predovńetkým alfa - gliadíny. Jedinou moņnou
terapiou je okamņité vylúĉenie gluténu z potravy a prísne dodrņiavanie bezlepkovej diéty. V snahe
o rozńírenie spektra potravín ľudí odkázaných na tento typ lieĉby, sa v súĉasnom období venuje veľká
pozornosť vyuņitiu pseudocereálií v racionálnej výņive ako ĉiastoĉná náhrada chlebového obilia,
kećņe neobsahujú prolamínové frakcie bielkovín (Gálová et al., 2006; Michalík et al., 2006;
Palenĉárová et al., 2008).
V nadväznosti na uvedené sa analyzovalo ńesť rastlinných druhov, ktoré by potenciálne mohli
byť vyuņívané pre potreby prípravy bezlepkových potravín pre jedincov trpiacich na celiakiu.
Tabuľka 1 Obsah bielkovín a frakĉná skladba bielkovinového komplexu
v analyzovaných plodinách
Druh/genotyp
Pńenica/Petrana
Frakcie bielkovín [%]
Alb+Glo
Pro
Glu
Zvyńok
24,65
37,30
30,97
7,03
Pro+Glu
[%]
68,27
HP [%]
11,35
Pńenica/Klea
25,33
35,91
31,24
7,52
67,15
10,24
Ovos/Detvan
27,99
16,27
46,88
8,02
63,15
13,08
Ovos/Izák
20,02
17,65
51,16
10,34
68,81
9,81
Jačmeň/SK 5451
29,77
26,28
33,33
10,02
59,61
8,35
Jačmeň/Kompakt
27,79
33,90
30,03
7,79
63,93
10,26
Pohánka/FAG 120/82
51,36
2,90
14,38
30,51
17,28
9,93
Pohánka/Pyra
45,04
3,03
15,03
35,00
18,06
10,10
Láskavec/29 USA
Láskavec/
Metelcatyl
Cícer/AVG 480
52,85
2,29
27,14
17,16
29,43
11,20
53,71
2,73
26,42
16,46
29,15
11,67
70,41
2,01
13,15
12,52
15,16
13,45
Cícer/Punjáb 91
Priemer
Smerodajná
odchýlka
Maximum
Minimum
Variačný koeficient
[%]
68,15
41,42
1,97
15,19
15,15
27,91
13,18
14,63
17,12
43,10
12,79
11,02
17,71
14,67
12,38
9,15
27,05
1,53
70,41
20,02
37,30
1,97
51,16
13,15
35,00
7,03
68,81
15,16
13,45
8,35
42,74
96,60
44,38
62,58
140,98
13,88
Vysvetlivky: Alb - albumíny, Glo - globulíny, Pro - prolamíny, Glu – glutelíny, HP – hrubé
bielkoviny
Obsah bielkovín je dôleņitým kvalitatívnym ukazovateľom, ktorý urĉuje smer vyuņitia danej
plodiny. Z výsledkov uvedených v tabuľke 1 vyplývajú znaĉné rozdiely v obsahu bielkovín
pri jednotlivých genotypoch, ktoré varírujú od 8,35 % (jaĉmeņ SK 5451) - 13,45 % (cícer AVG 480).
V analyzovaných vzorkách bol priemerný obsah bielkovín vo vzostupnom trende jaĉmeņ (9,31 %),
92
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
pohánka (10,02 %), pńenica (10,80 %), láskavec (11,44 %), ovos (11,45 %), cícer (13,13 %), z ĉoho
vyplýva, ņe v pseudocereáliách bol zaznamenaný porovnateľný obsah bielkovín s konvenĉnými
obilninami. Najvyńńí priemerný obsah bielkovín bol zistený v cícery (13,13%), ĉím sa potvrdila
významná vlastnosť strukovín, ņe sa vyznaĉujú vyńńím obsahom bielkovín, ĉo potvrdzujú aj výsledky
Petra et al. (2003), Palenĉárovej a Gálovej (2009) a ćalńích. Gáborĉík (1994) zaraćuje cícer medzi
strukoviny s niņńím obsahom bielkovín, ktorých percentuálne zastúpenie sa pohybuje do 20 %, ĉo je
v zhode aj s prezentovanými výsledkami.
Podľa Michalíka et al. (2006), Prohaskovej a Dvořáĉka (2008) a ćalńích komponentná skladba
bielkovín je tvorená cytoplazmatickými a zásobnými bielkovinami, ktoré výrazne ovplyvņujú smer
vyuņitia danej plodiny. Z výsledkov (tab.1) vyplýva, ņe zastúpenie cytoplazmatických bielkovín, ktoré
sa vyznaĉujú vysokým obsahom esenciálnych aminokyselín, a tým dobrou nutriĉnou kvalitou, sa
pohyboval v analyzovaných vzorkách v rozmedzí 20,02 - 70,41 %, priĉom najvyńńie zastúpenie bolo
detegované v cíceri (69,28 %), láskavci (53,28 %) a v pohánke (48,2%), ĉo predurĉuje ich vyuņitie
v racionálnej výņive. V konvenĉných obilninách bolo zastúpenie albumínov a globulínov výrazne
niņńie a to v priemere v jaĉmeni 28,78 %, v pńenici 24,99 % a v ovse 24 %. Z uvedeného vyplýva, ņe
najvyńńiu nutriĉnú hodnotu mal cícer, potom láskavec, pohánka, ĉo je v súlade s výsledkami
Moudrého et al. (2005), Michalíka et al. (2006), Palenĉárovej a Gálovej (2009) a ćalńích.
Z pekárskeho hľadiska je veľmi dôleņité vysoké zastúpenie zásobných bielkovín, pretoņe tvoria
lepok, ktorý sa vyznaĉuje vysokoelastickými vlastnosťami, teda hlavnou mierou urĉuje technologickú
akosť zrna a je dôleņitý na prípravu kysnutého chleba a peĉiva (Muchová, 2001). Michalík et al.
(2006) uvádza, ņe z nutriĉného hľadiska okrem nízkeho a nevyrovnaného zastúpenia esenciálnych
aminokyselín, k ćalńím negatívam gluténových bielkovín patrí aj prítomnosť alfa - gliadínov, ktoré
spôsobujú celiakálne ochorenie.
Z hodnôt zaznamenaných v tabuľke 1 vyplýva, ņe vyńńie mnoņstvo zásobných bielkovín bolo
zistené v klasických obilninách (v pńenici 67,71 %, v jaĉmeni 61,77 %, v ovsi 65,98 %) v porovnaní
s pseudocereáliami. Veľmi dôleņité je zistenie, ņe pseudocereálie majú výrazne niņńí percentuálny
podiel prolamínových bielkovín, vćaka ĉomu môņu byť vyuņité pre prípravu bezlepkových potravín.
Percentuálny podiel prolamínových bielkovín sa v sledovanom súbore pohyboval v rozsahu 1,97 37,30 %, priĉom vysoká hodnota variaĉného koeficientu (96,60 %) je dôsledkom znaĉne odlińného
podielu prolamínov v analyzovaných genotypoch. Láskavec v priemere obsahoval 2,51 % prolamínov
a pohánka 2,97 %, ĉo je porovnateľné s výsledkami Palenĉárovej et al. (2008). Aj obidva genotypy
cícera vykazovali veľmi priaznivé hodnoty zásobných bielkovín z hľadiska prípravy bezgluténových
potravín.
Podľa Michalíka et al. (2006) k obilninám, ktorých lepok vyvoláva u senzitívnych jedincoch
alergickú reakciu patria pńenica, jaĉmeņ a raņ, ĉo bolo potvrdené aj v tejto práci. Neustále
diskutovanou obilninou z hľadiska vyuņitia pre potreby celiatikov ostáva ovos napriek tomu, ņe
aveníny ovsa neobsahujú alergénne epitopy, nie vńetci pacienti ovos tolerujú. Predpokladá sa, ņe
výrobky z ovsa sú väĉńinou kvôli agrotechnickým postupom a technologickému spracovaniu takmer
vņdy kontaminované jaĉmeņom, a teda nevhodné pre bezlepkovú diétu.
Analýzy frakĉnej skladby bielkovín poukázali na rozdiely v zastúpení jednotlivých
bielkovinových komponentov v porovnaní s klasickými obilninami, avńak na detegovanie prítomnosti
celiakálne aktívnych bielkovín je najpreukaznejńia imunochemická metóda. Enzýmová
imunoabsorbentná analýza je metóda identifikácie biologicky aktívnej látky zaloņená na vytvorení
ńpecifického komplexu antigén - protilátka. Test je zaloņený na interakcii ńpecifických protilátok proti
gliadínovým bielkovinám s gliadínmi vzorky.
Weiser, Koehler (2008) uvádzajú, ņe Komisia Codex Alimentarius Svetovej zdravotníckej
organizácie a Organizácie pre výņivu a poľnohospodárstvo OSN vytvorili pravidlá pre bezgluténové
potraviny. Podľa kódexu noriem editovaných v marci 2006 je maximálny obsah gluténu 20 mg . kg-1
(0,2 %) pre prirodzene bezlepkové potraviny a maximálne zastúpenie 200 mg . kg-1 (0,02 %) gluténu
pre potraviny oznaĉené ako bezlepkové. Takisto Vestník MP SR (2004), ktorý je platný v Slovenskej
republike udáva limitnú hranicu pre obsah lepkových bielkovín a to 200 mg . kg -1.
93
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 2 Kvantitatívne zastúpenie gliadínu a gluténu v analyzovaných vzorkách
5,84
Gliadín [mg.
kg-1]
29216,80
Glutén
[mg. kg-1]
58433,60
1,66
3,31
16560,80
33121,60
Ovos/Detvan
0,01
0,02
77,70
155,40
Ovos/Izák
0,02
0,04
209,10
418,20
Jačmeň/SK 5451
3,01
6,02
30094,00
60188,00
Jačmeň/Kompakt
3,36
6,71
33552,40
67104,80
Pohánka/FAG 120/82
0,01
0,01
6,67
13,33
Pohánka/Pyra
0,01
0,01
94,75
189,49
Láskavec/29 USA
0,01
0,02
77,65
155,29
Láskavec/Metelcatyl
0,01
0,02
77,39
154,79
Cícer/AVG 480
0,01
0,02
77,03
154,07
Cícer/Punjáb 91
0,01
0,01
64,15
128,30
Gliadín [%]
Glutén [%]
Pńenica/Petrana
2,92
Pńenica/Klea
Druh/genotyp
Z výsledkov vyplýva (tab.2), ņe v pńenici bola prekroĉená limitná hodnota pre bezlepkové
potraviny o viac ako 228 – krát, v genotypoch jaĉmeņa o viac ako 318 – krát. Ovos sa ukázal ako
sporná potravina pre celiatikov. ELISA testom bolo zistené, ņe obsah celiakálne aktívnych bielkovín
v naņkách pohánky, láskavca a cícera bol pod limitnou hranicou. Uvedené potvrdzujú výsledky, ktoré
publikovali viacerí autori ako Petr et al. (2003), Gálová et al., (2006), Michalík et al. (2006) a ćalńí,
ktorí detegovali obsah celiakálných agens pod limitnú hodnotu vo vzorkách viacerých pseudocereálií
a odporuĉili túto skupinu plodín ako surovinu pre rozńírenie spektra bezlepkových výrobkov.
Záver
Medzi cereálie, ktorých glutén vyvoláva u senzitívnych jedincov alergickú reakciu patrí pńenica,
jaĉmeņ, raņ a ovos. Celoņivotné vylúĉenie gluténu zo stravy môņe prináńať urĉité komplikácie pri
výbere potravín z obmedzeného mnoņstva výrobkov urĉených pre celiatikov. Z dôvodu potreby
rozńírenia spektra jedál bez obsahu lepku, sa v práci analyzovali genotypy rôznych plodín z hľadiska
vybraných biochemických ukazovateľov.
Zo získaných výsledkov vyplýva, ņe konvenĉné obilniny ako pńenica a jaĉmeņ sú
charakteristické vysokým zastúpením zásobných bielkovín determinujúcich dobrú technologickú
kvalitu, na druhej strane vńak vykazujú vysokú koncentráciu celiakálne aktívnych agens. Analýzou
komponentnej skladby bielkovinového komplexu ako aj ELISA testom sa potvrdil nízky obsah
gluténu (pod 0,02 %) v pohánke, láskavci a cíceri, v dôsledku ĉoho celiatici môņu konzumovať tieto
druhy pseudoobilnín a strukovinu a výrobky z nich pripravené.
Poďakovanie
Táto práca bola rieńená v rámci grantovej výskumnej úlohy VEGA ĉ. 1/0471/09 „Genetické
a molekulárne markery kvality cereálií a pseudocereálií“. Kolektív autorov ćakuje Génovej banke
semenných druhov SR SCPV VÖRV v Pieńťanoch za poskytnutie vzoriek.
Literatúra
GÁBORĈÍK, N. Cícer vo vegeratiánskej kuchyni. Vrútky : Vega, 1994. 43 s. ISBN 80-85578-25-5.
94
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
GÁLOVÁ, Z. – MICHALÍK, I. – CHŅAPEK, M. – BALÁŅOVÁ, Ņ. Bielkovinové determinanty
celiakálneho ochorenia. In Biologická bezpeĉnosť a agropotravinárstvo ´06 : zborník referátov. Nitra :
SPU, 2006. ISBN 80-89240-00-3. s. 27-36.
MICHALÍK, I., 2002. Unifikovaná metóda diskontinuálnej frakcionácie bielkovinového komplexu
zrna obilnín. In Agriculture, ĉ. 48, 2002, s. 333-341
MICHALÍK, I., 2006. Výņivná a technologická kvalita rastlinných produktov a ich potravinárske
vyuņitie. In Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, vedecká monografia, 2006, s. 198
MOUDRÝ, J. – KALINOVÁ, J. – PETR, J. – MICHALOVÁ, A. Pohanka a proso. Praha : Östav
zemědělských a potravinářských informací, 2005. 206 s. ISBN 80-7271-162-8.
MUCHOVÁ, Z. Faktory ovplyvņujúce technologickú kvalitu pńenice a jej potravinárske vyuņitie.
Nitra : SPU, 2001. 112 s. ISBN 80-7137-932-9.
PALENĈÁROVÁ, E. – GÁLOVÁ, Z. – OSLOVIĈOVÁ, V. Bielkovinová charakteristika cereálií
a pseudocereálií a ich vyuņitie pri bezlepkovej diéte. In Protein 2008 : sborník příspěvků V. roĉníku
medzinárodní konference. Zlín : Univerzita Tomáńe Bati, 2008. ISBN 978-80-7318-706-4. s. 137-140.
PALENĈÁROVÁ, E. – GÁLOVÁ, Z. Bielkovinové determinanty celiakálneho ochorenia. In Acta
fytotechnica et zootechnica. 2009, roĉ. 12, mimoriadne ĉíslo, s. 531-537, ISSN 1335-258X.
PETR, J. – MICHALÍK, I. – TLASKALOVÁ, H. – CAPOUCHOVÁ, I. – FAMĚRA, O. –
URMINSKÁ, D. – TUĈKOVÁ, L. – KNOBLOCHOVÁ, H. Extention of the spectra of plant products
for the diet in coeliac disease. In Czech Journal Food Sciences. roĉ. 21, 2003, ĉ. 2, s. 59-70, ISSN
1212-1800.
PROHÁSKOVÁ, A. – DVOŘÁĈEK, V. Effect of protein content, its fractions and HMW – Glu
allelic blocs on technological parameters of grains in selected winter wheat landraces. In Protein 2008
: sborník příspěvků V. roĉníku medzinárodní konference. Zlín : Univerzita Tomáńe Bati, 2008. ISBN
978-80-7318-706-4. s. 151-156.
VESTNÍK MP SR. Bezgluténové potaviny pre celiatikov. roĉ. XXXVI, 1. apríl 2004, ĉiastka 10, 1.
ĉasť.
WIESER, H. – KOEHLER, P. The biochemical basis of celiac disease. In Cereal Chemistry. 2008,
vol. 85, no. 1, pp. 1-13, ISSN 0009-0352.
WRIGLEY, C. W., 1992. Identification of cereal varieties by gel electrophoresis of the grain proteins.
In Seed Analysis, 1992, pp. 17 – 41.
Kontaktná adresa
prof. RNDr. Zdenka Gálová, CSc.
Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita,
Tr. Andreja Hlinku 2,
949 76 Nitra, Slovenská republika
 ++421-37-641 4596,
 [email protected]
95
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
PASTEURIZATION OF LIQUID EGG WITH MICROWAVE METHOD
GÉCZI Gábor
Department of Environmental and Service Engineering, Institute of Environmental System,
Faculty of Mechanical Engineering, Szent István University, Páter K. u. 1., Gödöllő, H-2103,
Hungary
Abstract
Pasteurization is applied in milk processing, beer production, canning industry technologies and in
several other fields where the aim of the treatment is to reduce the number of harmful microorganisms.
Pasteurization therefore leads to an improvement in the lifetime of products and better food safety.
Pasteurization is almost always a so-called critical control point (CCP) in quality management systems
and therefore has to be controlled, appropriately documented and regulated. This research proves that
microwave heat treatment is a good solution by economical and environmental aspects in addition to
meeting the above-mentioned requirements. An appropriate continuously operating microwave device
was set up to make possible the microwave pasteurization of liquid food products. This paper focuses
on introducing the results of our research on pasteurized liquid egg technology/production.
Key words: egg, microwave, pasteurization
Introduction
Previous research by our group has proved that microwave technology is an efficient method
for the pasteurization of liquid food products under laboratory circumstances. The research has been
dealing with setting up a microwave oven that is suitable for the pasteurization of small quantities of
products in households or small scale enterprises. The investigations have mainly focused on milk and
beer samples (Géczi et al., 2006a; Géczi et al., 2006b; Kovácsné et al., 2006; Sembery and Géczi,
2006). We will continue looking for products that have a production technology including
pasteurization therefore the process could be carried out in an electromagnetic field. Thus, our
research group has contacted Pasteur Tojásfeldolgozó Kft. in the town of Ádánd. The company has
been dealing with egg production and processing since 1998. Their product range includes surfacetreated eggs with sterilized eggshell, egg powder, boiled eggs, and the so-called pasteurized liquid egg.
Pasteurized liquid egg is a popular processed product recognized by large scale consumers. The
advantage of liquid egg is the fact that the products are delivered to consumers in a processed form
which means that the storage, sterilization and breaking of eggs do not require extra labour or
additional technological background. Pasteurized liquid egg is a safe form of food because bacteria in
the products are killed by a proper heat treatment. The quality and the taste of food products
containing liquid egg are not affected negatively by any external factors since preservatives are the
only type of additives that liquid egg is allowed to contain. The application of cooled liquid egg is
easy and is similar to the application of fresh eggs.
The application of liquid egg is very significant for both cold and hot food production. It is
widely popular in the baking industry and quite important for confectioneries. It is also applied in the
catering industry especially in units that offer breakfast. If the liquid egg product does not contain
preservatives, it is best before 3 days after the date of production. If it does then it is best before 9 days
after the production date. Liquid egg in terms of its ingredients can be liquid whole egg, liquid eggwhites or liquid egg-yolks. The first investigations of the opportunities for pasteurization by
microwave energy were carried out by applying liquid whole egg. 1 kg of liquid whole egg equals to
21 eggs. The energy content of 100 g of liquid whole egg is 150 kcal. The dry matter content of liquid
whole egg is minimum 23,5 percent and its fat content is minimum 9,8 percent.
The process of liquid egg production starts with the sorting of eggs. Only eggs that are unhurt
and free of rupture are used for production. After being sorted, eggs are sterilized, washed and dried.
After that eggs are broken open and the liquid is driven out. The pasteurization process is preceded by
homogenization and filtration and succeeded by packing and cooling. The temperature of
pasteurization and storage is 65°C and 0-4°C respectively.
96
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Material and Methods
The effect of the inhomogeneous electromagnetic field in the microwave field was levelled by
moving the product but not by a rotating plate – as it is usually done in microwave ovens – but by
moving liquid material in spirals in the field. It is not important how high the effect of the field on the
product is and where the product is affected in the field. The only important factor is the status it
leaves the field in.
In order to investigate it a traditional microwave oven was reconstructed. As the first step of the
experiment two 7 mm diameter holes were bored on the side of a traditional household microwave
oven (Whirpool AT 314 MW) 8 cm from each other in order to drive the liquid into and out of the
oven. The diameter and the distance of the holes were calculated so that the oven can operate safely.
Then a feeding pump (STENNER 85M5), a mass meter (XP-3000), a volume meter, a
stopwatch and a thermometer (ALMEMO 2590-9) were attached to the microwave oven (already
equipped with glass spiral insets). Figure 1 shows the draft of the microwave measuring circle that is
useful for the heating and the pasteurization of liquid food.
T2
5.
T1
3.
2.
1.
4.
6.
Figure 1 Draft of a cross-flow system for microwave heating.
1- Whirpool AT 314 microwave oven with spiral insets,
2- STENNER 85M5 feeding pump, 3- measure, 4- XP-3000 mass meter,
5- stopwatch, 6- ALMEMO 2590-9 thermometer
The microwave measuring circle shown in Figure 1 makes it possible to adjust the volume flow
Q (cm3/s) of the pump and to replace the spirals with other ones in the oven and therefore modify the
length lspiral (cm) of the spirals. Both the change in the volume flow and the length of the spirals make
it possible to modify the time tt (s) that the liquid spends in the cavity which obviously has an effect on
the rate of heating. The cross section A (cm2) of the spirals is constant, which means that the flow
velocity v (cm/s) of the liquid can be regulated by adjusting the volume flow of the feeding pump:
v
Q
A
(1)
There are levels 0-10 that can be adjusted on the pump therefore the volume flow is 0-3,33 cm3/s,
which means that in case of using spirals of a cross section of 0,5 cm then the flow velocity can be
adjusted between 0-16,98 cm/s. Knowing the flow velocity and the length of the spiral the time that
the product spends in the microwave field can also be determined.
97
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
tt 
l spirál
(2)
v
The length of some element of the spiral series is shown in Table 1. The table also shows the
volume of the liquid in the oven at a given time. A photo of few elements of the spirals can be seen in
Figure 2.
Table 1 Properties of the series of spirals
Number of spirals
lspiral [m]
Vspiral [cm3]
1
1,47
28,87
6
8,82
173,2
7
10,29
202,1
8
11,76
230,9
30
44,1
866,1
Figure 2 Some elements of the series of spirals
98
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Figure 3 Microwave measuring circle
Figure 4 Triple spiral
Results
The pasteurization of liquid egg could be implemented by a measuring circle shown in Figure 3
and by applying a triple spiral shown in Figure 4. The product spent almost 18 seconds in the
electromagnetic field while the volume flow was held at its maximum. The measuring circle was
suitable for providing a pasteurization temperature of 65 °C.
The continuously operating microwave device with the spiral can be used for the pasteurization
of liquid egg. Neither physical and microbiological, nor internal content examinations show any
differences between traditionally heated products and the products pasteurized in microwave method.
99
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
The most important factor for the pasteurization of liquid egg was to maintain the appropriate
temperature. To heat the product to 65°C is indispensable from microbiological and food safety
aspects. A higher temperature than 65°C would cause a change in the consistency of the product. In
case the material in the spiral pipes became solid it would stop flowing. Liquid egg starts to become
solid on 72-74°C and when it reaches 80°C it practically becomes scrambled.
Acknowledgements
This research is subsidized by the Bolyai János Scholarship Program of the Hungarian Academy of
Sciences.
References
GÉCZI, G. - SEMBERY, P. - KISS, J. - KOVÁCSNÉ, L. M. 2006. Folyékony élelmiszerek
mikrohullámú pasztňrözése. In VII. Nemzetközi Élelmiszertudományi Konferencia, Szeged,
Proceeding, p. 54-55. ISBN 963 482 676 8.
GÉCZI, G. - SEMBERY, P. - KISS, J. 2006. Microwave pasteurization for liquid food. In 3th
Conference Energy Efficiency and Agricultural Engineering, Rousse, Bulgaria 7-9 June 2006, p. 2632. ISSN 1311-9974.
KOVÁCSNÉ, L.M. - SEMBERY, P. - GÉCZI, G. 2006. Microwave Pasteurization. In Risk Factors of
Food Chain VI. International Scientific Conference, Nitra, 2006, p. 184-188. ISBN 80-8069-759-0.
SEMBERY, P. - GÉCZI, G. 2008. Microwave treatment of food. In Hungarian Agricultural Research
HU ISSN 1216-4526, Vol. 17, 2008, no.2-3, p. 12-16.
100
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
SLEDOVANIE MÄSOVEJ ÚŅITKOVOSTI A TVORBY TUKOVÉHO TKANIVA U
KURČIAT ROSS 308 VPLYVOM APLIKÁCIE PROBIOTICKÉHO PREPARÁTU V
ICH VÝŅIVE
MEAT PRODUCTION FOLLOWING AND THE DEVELOPMENT OF FAT TISSUE
AT ROSS 308 CHICKENS INFLUENCE OF PROBIOTIC PREPARATION
APPLICATIONS IN THEIR NUTRITION
HAŃČÍK Peter, MIHOK Michal, KAČÁNIOVÁ Miroslava, CAPCAROVÁ Marcela,
ARPÁŃOVÁ Henrieta, BENCZOVÁ Emília
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Nitra, Slovenská republika
Abstract
The aim of this work was to follow of probiotic preparation influence prepared on base of
Lactobacillus fermentum CCM 7158 with concentration 1.108 cfu.g -1. This preparation was
applied to water source of chickens Ross 308 on the basis parameters utility and fat
production in the carcass. In this experiment were 3 experimental groups: control group and
two experimental groups by 60 pieces of poultry chickens Ross 308. The fattening was during
42 days. The chickens of all groups were fattened with natural starter mixture KKZ HYD-01
from 22nd days of age till 42nd days of the chicken age (end of the fattening) with same
mixture ad libitum. Probiotic preparation was applied in a variety of 6.6 ml for 60 pieces for
one day till two weeks and after third week till the end of the fattening in variety of 3.7 ml for
60 pieces (1st group) and 3.3 ml for 60 pieces (2nd group) during all fattening. Control group
was without application of probiotic preparation. Higher slaughter weight (P≤0.01-0.001) was
at the experimental groups (2021.67 g - 1st 2122.67 g -2nd) as comparison with control group
(1998.17 g) at the end of the fattening. The weight of carcass was higher (P≤0.01-0.001) at
the experimental groups (1363.83 g -1st group, 1440.67 g - 2nd group) as comparison with
control group (1348.10 g). The highest abdominal fat accumulation in carcass was at 1st
group (2.25 %) and the lower in 2nd group (1.93 %) as comparison with control group (1.97
%) without statistical differences (P≥0.05) between groups. The part of gastric fat from
a carcass was 0.47 % (control group), 0.63 % in 1st experimental group and 0.66 in 2nd
experimental group. Statistical differences (P≤0.05) in a part of gastric fat were between
control and 2nd experimental group. The part of heart fat from a carcass was 0.040 % (1st
experimental group), 0.049 % (control) and 0.062 % (2nd experimental group) without
statistical differences between groups (P≥0.05). The highest part of internal fat from carcass
was detected at higher amount of probiotic preparation (2.93 % - 1st group), lower in 2nd
group (2.68 %) and the lowest was in control group (2.50 %) without statistical differences
between groups (P≥0.05). The base of results we can recommend the application of probiotic
culture L. fermentum CCM 7158 in a variety of 3.3 ml for 60 pieces for one day to water
source. After these applications were higher the basic parameters of meat utility, were lower
production of false abdominal fat. With this application we can increased positive economy
and the rentability of production poultry meat.
Key words: chickens, Ross 308, probiotic preparation, Lactobacillus fermentum, fat,
nutrition, water
Úvod
Nutriĉnú hodnotu mäsa moņno hodnotiť na základe parametrov ako je obsah a zloņenie
bielkovín, obsah aminokyselín, tuku, sacharidov, minerálnych látok a vitamínov. Z najdôleņitejńích
101
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
minerálnych látok sa v hydinovom mäse nachádzajú draslík (0,4 %), fosfor (0,2 %), sodík (0,09 %)
a iné (Lazar, 1990). Za hlavné akostné znaky hydinového mäsa povaņujeme jeho chemické zloņenie a
pomer svalov k tuku v jatoĉne opracovanom tele. Z hľadiska chemického zloņenia hydinového mäsa
boli zistené výrazné rozdiely, ktoré sú predovńetkým medzi bielym a ĉerveným svalovým tkanivom
(Matuńoviĉová, 1986). Steinhauser et al. (2000) konńtatujú, ņe z nutriĉného a technologického
aspektu je v hydinovom mäse najdôleņitejńí obsah bielkovín, ktorých je od 18 do 22 %. Ingr (1996)
zároveņ dodáva, ņe obsah bielkovín je variabilný a závisí od funkcie konkrétneho tkaniva.
Simeonovová (1999) zistila, ņe prsná svalovina obsahuje pribliņne 22 % bielkovín, zatiaľ ĉo stehenná
svalovina, ktorá obsahuje vyńńie mnoņstvo tuku, ich obsahuje pribliņne 17,20 %. Dôleņitú úlohu podľa
Pipeka (2000) v mäse zohráva aj tuk, ktorý je veľmi dôleņitý z hľadiska senzorických vlastností pre
konzumenta, nakoľko je zdrojom mnohých aromatických látok ovplyvņujúcich hlavne chuť. Klíma
(1996) zároveņ konńtatuje, ņe obsah tuku v mäse závisí od mnohých faktorov a to od druhu zvierat,
plemena, pohlavia, pôvodu anatómie svalov a pod. Hańĉík et al. (2005a) dodávajú, ņe intenzívna
selekcia a úĉinnosť kŕmnych zmesí pouņívaných vo výņive kurĉiat v ostatných desaťroĉiach skrátila
dobu výkrmu menej ako na polovicu, priĉom s intenzívnym rastom kurĉiat sa vńak zvyńuje ukladanie
tukových zásob, a to hlavne v bruńnej dutine vo forme abdominálneho tuku. Matuńoviĉová (1986)
zistila ńtatisticky významnú negatívnu koreláciu medzi obsahom tuku a bielkovín vo svaloch.
Simeonovová (1999) uvádza, ņe hydinové mäso sa skladá z veľkej ĉasti podkoņného tuku a bruńného
tuku uloņeného v bruńnej dutine a v oblasti ĉriev, ktorý prispieva najväĉńou mierou k celkovému
obsahu telesného tuku. Skřivan (2000) za hlavný dôvod nadmerného hromadenia bruńného tuku u
brojlerov povaņuje nerovnováhu medzi príjmom a spotrebou energie, priĉom zníņením spotreby
energie kurĉaťom mnoņstvo bruńného tuku klesá. Ingr (1995) vzhľadom k rôznej intenzite rastu
sliepok a kohútov zistil, ņe u sliepok sa tvorí viac tuku v porovnaní s kohútmi a kohúty rastú
intenzívnejńie v porovnaní
so sliepkami za rovnaké ĉasové obdobie výkrmu. Becker et al. (1979)
ńtudovali obsah bruńného tuku u kurĉiat vo veku 58 dní a a zistili, ņe u kohútov bolo niņńie zastúpenie
abdominálneho tuku (2,18 %) v porovnaní so sliepkami (2,82 %). Podobný trend platí aj pre tuk
v jatoĉne opracovanom tele (12,0 % u kohútov, 13,7 % u sliepok), ĉrevný tuk (47,6 % u kohútov,
56,2% u sliepok) a celkový obsah tuku (10,4 % u kohútov, 12,2 % u sliepok). Marek et al. (1988)
a Hrdinka et al. (1995) poukázali taktieņ na vyńńiu tvorbu abdominálneho tuku v tele sliepok ako
u kohútov. Ńkřivan a Tŧmová (1990) zistili, ņe rozdiel pri tvorbe tuku je aj z hľadiska pouņitej
hybridnej kombinácie kurĉiat, kde u hybrida Hybro bolo zvýńená tvorba tuku oproti kurĉatám Ross
308. V koneĉnom dôsledku Csuka (1988) a Hańĉík et al. (2005a) konńtatujú, ņe tukovému väzivu sa
pri ńľachtení hydiny nevenovala patriĉná pozornosť, a tak súĉasne s ostatnými vlastnosťami, ktoré
moņno povaņovať za pozitívne sa menili aj genetické dispozície pre zvýńenú tvorbu a ukladanie tuku
v organizme, a to ako bruńného tak aj celotelového. Tuk v tejto forme je neņiaduci pre konzumenta aj
spracovateľa hydiny, nakoľko sa stáva odpadovým produktom, ktorý spôsobuje problémy pri ĉistení,
opracovaní hydiny a umelo zvyńuje jatoĉnú výťaņnosť hydiny.
V nadväznosti na uvedené literárne zdroje a nové trendy vo výņive hydiny, t.j. zavádzanie
nových kŕmnych aditív a doplnkov za vyraćované ņivoĉíńne múĉky, antibiotické preparáty
a stimulátory rastu bolo cieľom náńho experimentu u výkrmových kurĉiat Ross 308 preveriť úĉinok
probiotického preparátu podávaného cez vodný zdroj v rôznom mnoņstve na dosahovanie základných
parametrov mäsovej úņitkovosti a tvorbu vnútorných tukov v jatoĉne opracovanom tele kurĉiat.
Materiál a metodika
Experiment sme rieńili skupinovým kŕmnym pokusom rozdeleným do 3 skupín (kontrolná a dve
pokusné skupiny) po 60 ks výkrmových kurĉiat (sliepok) hybridnej kombinácie Ross 308. Kurĉatá
boli odchovávané v klietkovej technológii v podmienkach experimentálnej prevádzky Katedry
hydinárstva a malých hospodárskych zvierat pri FAPZ SPU v Nitre. Dĺņka výkrmu kurĉiat bola 42
dní. Kurĉatá boli kŕmené sypkou ńtartérovou komerĉne vyrábanou KKZ HYD-01 do 21. dņa veku
a granulovanou rastovou KKZ HYD-02 od 22. do 42. dņa veku kurĉiat (koniec výkrmu) ad libitum
rovnakého zloņenia vo vńetkých sledovaných skupinách. V experimente sme pouņili ako doplnok vo
výņive kurĉiat v pokusných skupinách probiotický preparát aplikovaný cez vodný zdroj, ktorý bol
vytvorený na báze kmeņa Lactobacillus fermentum CCM 7158 s obsahom 1.108 KTJ v 1 g ņivého
média s potencujúcou zloņkou maldodextrínu a fruktooligosacharidu zapracovaných v probiotickom
prípravku v 1 %-nej koncentrácii. Dávkovanie probiotického preparátu v pokusných skupinách je
102
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
uvedené v tabuľke 1. Základné parametre úņitkovosti (ņivá hmotnosť, hmotnosť JOT) a percentuálny
podiel sledovaných tukov (abdominálny, srdcový, ņalúdkový a vnútorné tuky spolu) z JOT sliepok
Ross 308 sme zistili po základnej jatoĉnej rozrábke 30 ks z kaņdej skupiny uskutoĉnenej na Katedre
hodnotenia a spracovania ņivoĉíńnych produktov pri FBP SPU Nitra odobratím a zváņením prísluńnej
ĉasti na analytických váhach typu Kern EW s presnosťou váņenia na 0,001 g. Základné ńtatistické
charakteristiky experimentu (aritmetický priemer, smerodajná odchýlka, minimum, maximum,
koeficient variability) boli ńtatisticky spracované pomocou ńtatistického programu SAS verzie 8.2 a na
urĉenie preukaznosti rozdielov medzi sledovanými skupinami bola pouņitá analýza variancií
s následným Scheffeho testom.
Tabuľka 1 Denné dávkovanie pitnej vody a probiotika v pokusných skupinách
Týņdeň
Počet ks
Dávka pitnej
vody (l)
1
2
3
4
5
6
60
60
60
60
60
60
2,5
3,5
4,6
6,7
8,6
10,6
Dávkovanie probiotika (ml)
1. pokusná
2. pokusná
skupina
skupina
6,6
3,3
6,6
3,3
3,7
3,3
3,7
3,3
3,7
3,3
3,7
3,3
Výsledky a diskusia
Dosiahnuté hodnoty poráņkovej hmotnosti na konci výkrmu, hmotnosti JOT, percentuálny
podiel abdominálneho, ņalúdkového a srdcového tuku, resp. vnútorných tukov spolu z JOT sliepok
kurĉiat hybridnej kombinácie Ross 308 sú uvedené v tabuľkách 2 aņ 7.
Tabuľka 2 Poráņková hmotnosť kurĉiat (sliepok) Ross 308 na konci výkrmu (g)
Ukazovateľ
Skupina
x
s
Kontrolná
1998,17 34,82
1.Pokusná 2021,67 43,66
2.Pokusná 2122,17 44,89
Pozn.: P≥0,05-, P≤0,05+, P≤0,01++, P≤0,001+++
Poráņková
hmotnosť
minimum
maximum
v%
1970,00
1960,00
2064,00
2066,00
2078,00
2192,00
1,74
2,16
2,12
minimum
maximum
v%
1305,00
1315,00
1413,00
1409,00
1406,00
1490,00
2,83
2,75
2,14
Preukaznosť
medzi
skupinami
K:P1K:P2+++
P1:P2++
Tabuľka 3 Hmotnosť JOT kurĉiat (sliepok) Ross 308 (g)
Ukazovateľ
Skupina
x
s
Kontrolná
1348,10 38,19
1.Pokusná 1363,83 37,56
2.Pokusná 1440,67 30,82
Pozn.: P≥0,05-, P≤0,05+, P≤0,01++, P≤0,001+++
Poráņková
hmotnosť
Preukaznosť
medzi
skupinami
K:P1K:P2+++
P1:P2++
103
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 4 Podiel abdominálneho tuku z hmotnosti JOT kurĉiat (sliepok) Ross 308 (%)
Ukazovateľ
Skupina
x
s
Kontrolná
1,97
0,52
1.Pokusná
2,25
0,28
2.Pokusná
1,93
0,58
Pozn.: P≥0,05-, P≤0,05+, P≤0,01++, P≤0,001+++
Poráņková
hmotnosť
minimum
maximum
v%
1,32
1,94
1,03
2,47
2,62
2,81
26,09
12,42
30,20
Preukaznosť
medzi
skupinami
K:P1K:P2P1:P2-
Tabuľka 5 Podiel ņalúdkového tuku z hmotnosti JOT kurĉiat (sliepok) Ross 308 (%)
Ukazovateľ
Skupina
x
s
Kontrolná
0,47
0,12
1.Pokusná
0,63
0,17
2.Pokusná
0,66
0,13
+
++
Pozn.: P≥0,05 , P≤0,05 , P≤0,01 , P≤0,001+++
Poráņková
hmotnosť
minimum
maximum
v%
0,27
0,42
0,44
0,59
0,85
0,85
25,74
27,19
19,75
Preukaznosť
medzi
skupinami
K:P1K:P2P1:P2-
Tabuľka 6 Podiel srdcového tuku z hmotnosti JOT kurĉiat (sliepok) Ross 308 (%)
Ukazovateľ
Skupina
x
s
Kontrolná
0,049
0,01
1.Pokusná
0,040
0,017
2.Pokusná
0,062
0,028
Pozn.: P≥0,05-, P≤0,05+, P≤0,01++, P≤0,001+++,
Poráņková
hmotnosť
minimum
maximum
v%
0,037
0,022
0,016
0,064
0,059
0,091
20,89
42,58
45,56
Preukaznosť
medzi
skupinami
K:P1K:P2P1:P2-
Tabuľka 7 Podiel vnútorných tukov spolu z hmotnosti JOT kurĉiat (sliepok) Ross 308 (%)
Ukazovateľ
Skupina
x
s
Kontrolná
2,50
0,44
1.Pokusná
2,93
0,37
2.Pokusná
2,68
0,61
Pozn.: P≥0,05-, P≤0,05+, P≤0,01++, P≤0,001+++,
Poráņková
hmotnosť
minimum
maximum
v%
1,92
2,49
1,76
2,84
3,39
3,56
17,52
12,57
22,60
Preukaznosť
medzi
skupinami
K:P1K:P2P1:P2-
V experimente s hybridnou kombináciou Ross 308 bola vyńńia poráņková hmotnosť u sliepoĉiek
v oboch pokusných skupinách (2021,67 g - 1. PS, 2122,67 g - 2. PS) oproti kontrolnej, kde hodnota
bola na úrovni 1998,17 g, ĉo bolo menej o 23,50 a o 124,00 g. Z hľadiska ńtatistického sa medzi
skupinami dosiahli preukazné rozdiely v tomto ukazovateli v prospech 2. pokusnej skupiny oproti
kontrole ako aj oproti 1. pokusnej skupine (P≤0,01 a P≤0,001). Aplikovaný probiotický preparát
v pokusných skupinách cez vodný zdroj zohral
vo výņive kurĉiat Ross 308 pozitívnu úlohu
v pokusných skupinách, nakoľko sa zvýńila poráņková hmotnosť sliepoĉiek na konci výkrmového
obdobia (42 dní) oproti kontrolnej skupine. Poráņková hmotnosť kurĉiat Ross 308 po 42 dņoch
výkrmu sledovaného experimentu bola niņńia ako uvádza Rychlá a Řezníĉek (2000), resp. Benková
(2001), ktorých poráņková hmotnosť bola v priemere 2240,0 a 2083,5 g a podobne niņńia ako
uvádzajú Straková et al. (2002), ktorí zistili priemernú hmotnosť kurĉiat Ross 308 po 42 dņoch
výkrmu u sliepoĉiek 2360 g. Hodnoty poráņkovej hmotnosti preverovaného experimentu sú v súlade
s hodnotami Hańĉíka et al. (2007, 2010a), ktorí zistili u kurĉiat Ross 308 pri aplikácii probiotík a
propolisu v ich výņive poráņkovú hmotnosť 2014,25 g, resp. od 1938,40 g do 2012,20 g, priĉom
104
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
u sliepoĉiek zistili niņńie hodnoty ako v nami preverovanom experimente, a to od 1790,60 g
do
1867,40 g. Dôleņitým poznatkom náńho experimentu je, ņe podobne ako uvádzajú Kumprechtová et
al. (1999), Hańĉík et al. (2005a, 2009, 2010ab), Angeloviĉová et al. (2005), Shalmany et al. (2006) a
Seven et al. (2008) bol aj v nańom experimente zaznamenaný pozitívny trend zvýńenej poráņkovej
hmotnosti kurĉiat na konci výkrmu pri aplikácii probiotík a iných novozavádzaných doplnkov v ich
výņive.
Hmotnosť JOT bola u sliepoĉiek pokusných skupín vyńńia (1363,83 g - 1. PS, 1440,67 g - 2. PS)
oproti kontrolnej (1348,10 g) a ńtatisticky preukazné rozdiely (P≤0,01 a P≤0,001) boli podobné ako pri
hodnotení poráņkovej hmotnosti. Hmotnosť JOT kurĉiat Ross 308 bola v pokusných skupinách vyńńia
v porovnaní s výsledkami Horváthovej a Lagina (1985) u hybrida Slovgal (863,20 g) a taktieņ vyńńia
v porovnaní s Laginom (1989), ktorý zistil u hybridnej kombinácie Hybro hmotnosť JOT 1214,69 g.
Vyńńie hodnoty hmotnosti JOT u hybrida kurĉiat Ross 308 sme zistili aj v porovnaní s Hańĉíkom et al.
(2010a), ktorí aplikovali ako kŕmne aditívum propolis v kŕmnych zmesiach a dosiahli hmotnosť JOT
u sliepoĉiek 1334,40 g.
Nami zistené hodnoty hmotnosti JOT sú vyrovnané a mierne niņńie
v porovnaní s hodnotami, ktoré zistili vo svojich experimentoch u kurĉiat rôznych hybridných
kombinácii Simeonovová a Ingr (2000), Benková et al. (2002), Straková et al. (2002), Hańĉík et al.
(2005a,b), Angeloviĉová et al. (2005) a iní. Seven et al. (2008) zistili podobne ako v nańom
experimente zvýńenú hodnotu hmotnosti JOT (1376 g) bez rozdielu pohlavia v pokusných skupinách
pri aplikácii kŕmneho aditíva vo forme propolisu vo výņive kurĉiat Ross 308.
Vyhodnotením podielu jednotlivých tukov z JOT (tabuľka 3 aņ 7) sme zistili tendenciu vyńńieho
ukladania abdominálneho tuku (P≥0,05) v 1. pokusnej skupine (2,25 %), t.j.
pri aplikácii
vyńńej dávky preverovaného probiotického preparátu vo výņive sliepoĉiek
Ross 308 oproti
kontrole (1,97 %). Zaujímavým zistením bolo zníņenie podielu abdominálneho tuku z JOT
u sliepoĉiek Ross 308 v 2. pokusnej skupine (P≥0,05) pri niņńej dávke aplikovaného probiotika cez
vodný zdroj (1,93 %) oproti kontrole. Výsledky preverovaného experimentu nepotvrdzujú tendenciu
zvýńeného ukladania abdominálneho tuku pri aplikácii rôznych aditív vo výņive kurĉiat, vrátane
probiotických preparátov ako to popisujú vo svojej práci Hańĉík et al. (2005a). Dosiahnuté hodnoty
abdominálneho tuku z JOT kurĉiat Ross 308 sú v súlade s výsledkami Uhrína et al. (1993), Kříņkovej
et al. (1995), ktorí deklarujú ich úroveņ od 1,5 do 3 %, resp. s Horváthovou a Laginom (1985), ktorí
zistil u kurĉiat Slovgal 2,75 %-ný podiel výstelkového tuku z JOT. Niņńie hodnoty tvorby
abdominálneho tuku z JOT pod 1 % zistila vo svojich pokusoch Angeloviĉová (1997), ktorá ale pre
výkrm kurĉiat pouņila zníņenú úroveņ metabolizovateľnej energie v kŕmnych zmesiach.
Podiel ņalúdoĉného tuku z JOT v skupinách náńho experimentu bol od 0,47 % (kontrolná
skupina), vyńńí v 1. pokusnej skupine (0,63 %) a najvyńńí v 2. pokusnej skupine (0,66 %), v ktorej bol
aplikovaný probiotický preparát v mnoņstve 3 ml na celú skupinu a deņ cez vodný zdroj. Z hľadiska
dosiahnutých výsledkov môņeme skonńtatovať, ņe probiotický preparát aplikovaný v pokusných
skupinách cez vodný zdroj svojím úĉinkom zvýńil podiel ņalúdoĉného tuku v JOT kurĉiat Ross 308.
Hodnoty podielu ņalúdoĉného tuku z JOT v skupinách nami preverovaného experimentu (0,47
aņ 0,66 %) sú niņńie pri porovnaní s hodnotami 1,02 %, resp. výluĉne u sliepoĉiek s hodnotou 0,99 %
zistenými Horváthovou a Laginom (1985) a Laginom (1989). Hodnoty 0,47 aņ 0,66 % sú v súlade s
výsledkami Hańĉíka et al. (2007), ktorých podiel ņalúdoĉného tuku z JOT bol na úrovni od 0,59 do
0,69 %, ale v rozpore s tým, ņe menovaní autori zistili opaĉnú tendenciu, t.j. zniņovanie podielu
ņalúdoĉného tuku z JOT po aplikácii probiotického preparátu Enterococcus faecium s obsahom spór
2,0.1010 KTJ.g-1 vo výņive kurĉiat Ross 308. V rámci pokusu boli u tohto ukazovateľa dosiahnuté
ńtatisticky preukazné rozdiely (P≤0,05) len pri porovnaní kontrolnej a 2. pokusnej skupiny.
Ĉasť tuku okrem bruńného a ņalúdoĉného hodnotených v nańom experimente je lokalizovaná aj
na srdci, ktoré tvorí jednu z jedlých, t.j. poņívateľných ĉastí hydiny
pre kulinárske úĉely.
Podiel srdcového tuku z JOT bol od 0,040 % (1. pokusná skupina), mierne vyńńí v kontrolnej skupine
(0,049 %) a najvyńńí v 2. pokusnej skupine (0,062 %), ale bez ńtatisticky významných rozdielov
medzi skupinami (P≥0,05). Hodnoty podielu srdcového tuku z JOT v preverovanom pokuse u sliepok
výkrmových kurĉiat Ross 308 sú v súlade s hodnotami dosiahnutými Hańĉíkom et al. (2007), ktorí
taktieņ zistili jeho podiel z JOT
na úrovni od 0,04 do 0,06 %. Na rozdiel od vyńńie menovaných
autorov Hańĉíka et al. (2007) sme v pokusných skupinách pri aplikácii probiotika zaznamenali mierne
zvýńenie podielu srdcového tuku z JOT len pri 2. pokusnej skupine a v 1. pokusnej skupine sme
zaznamenali opaĉnú tendenciu, t.j. jeho mierne zníņenie v porovnaní s kontrolnou skupinou, v ktorej
105
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
nebol vo výņive pridávaný probiotický preparát Lactobacillus fermentum CCM 7158 s obsahom
1.108 KTJ v 1 g ņivého média s potencujúcou zloņkou maldodextrínu a fruktooligosacharidu cez
vodný zdroj.
Z hľadiska vyhodnotenia vnútorných tukov spolu (abdominálny + ņalúdkový + srdcový) sme
zistili ich najvyńńí podiel v JOT (2,93 %) pri vyńńej dávke probiotika (1. pokusná skupina) vo výņive
kurĉiat Ross 308 poĉas výkrmu, mierne niņńí v 2. pokusnej skupine (2,68 %) a najniņńí v kontrolnej
skupine (2,50 %), ale bez významných rozdielov medzi skupinami (P≥0,05). Tendencia mierneho
zvýńenia podielu vnútorných tukov v JOT kurĉiat Ross 308
po aplikácii probiotika vo výņive
kurĉiat Ross 308 náńho experimentu je v súlade s výsledkami Hańĉíka et al. (2005a,b, 2007, 2010a,b),
ktorí taktieņ po aplikácii rôznych probiotických preparátov vo výņive kurĉiat zistili ich zvýńenie oproti
kontrolnej skupine, ktorej probiotikum nebolo podávané. Zároveņ Hańĉík et al. (2005a,b, 2007) zistili
aj vyńńie ukladanie vnútorných tukov u sliepoĉiek oproti kohútom.
Záver
V experimente sme preverovali vplyv probiotického preparátu
vytvoreného na báze
Lactobacillus fermentum CCM 7158 s koncentráciou mikroorganizmov 1.108 KTJ.g-1 aplikovaného
cez vodný zdroj u sliepoĉke výkrmových kurĉiat Ross 308 na základné parametre mäsovej úņitkovosti
a tvorbu vnútorných tukov v ich jatoĉne opracovanom tele. Z výsledkov vyplýva, ņe poráņková
hmotnosť sliepok kurĉiat Ross 308 bola zvýńená (P≤0,01 a P≤0,001) na konci výkrmového obdobia,
t.j. vo veku 42 dní v oboch pokusných skupinách (+ 23,5 g 1. pokusná skupina, +124,00 g - 2.
pokusná skupina) oproti kontrole. Hmotnosť JOT dosiahla podobnú tendenciu ako poráņková
hmotnosť (P≤0,01 a P≤0,001), kde opäť najvyńńia hmotnosť JOT bola v 2. pokusnej skupine (1440,67
g), niņńia v 1. pokusnej skupine (1363,83 g) a najniņńia v kontrolnej skupine (1348,10 g), t.j.
v skupine bez aplikácie probiotika vo výņive kurĉiat Ross 308. Zvýńený podiel abdominálneho tuku
z JOT u kurĉiat Ross 308, ktorý sa v ostatných desaťroĉiach rapídne zvýńil a predstavuje ekonomickú
stratu a na druhej strane zhorńuje aj opracovanie kurĉiat, resp. zvyńuje mnoņstvo jatoĉného odpadu
a v koneĉnom dôsledku vplýva aj na jatoĉnú výťaņnosť, sa nepotvrdil pri zníņenom dávkovaní
probiotika cez vodný zdroj t.j. v mnoņstve 3,3 ml. 60 ks. deņ-1 poĉas výkrmu. Vyhodnotením podielu
vnútorných tukov spolu z JOT sme dosiahli tendenciu ich vyńńieho ukladania (P≥0,05) v pokusných
skupinách oproti kontrole, ale je nutné zdôrazniť, ņe srdcový a ņalúdoĉný tuk sú súĉasťou
poņívateľných drobov a tento produkt je priamo po kulinárskej úprave skonzumovaný ĉlovekom. Na
základe výsledkov experimentu u sliepok výkrmových kurĉiat Ross 308 tak
po zhodnotení
základných parametrov úņitkovosti ako aj vyhodnotenia jednotlivých vnútorných tukov, resp.
vnútorných tukov spolu z JOT bez a po aplikácii Lactobacillus fermentum CCM 7158 s koncentráciou
mikroorganizmov 1.108 KTJ.g-1 aplikovaného cez vodný zdroj môņeme konńtatovať, ņe je nutné
hľadať pri aplikácii rôznych probiotík jeho správne dávkovanie
vo výņive nielen výkrmových
kurĉiat, ale aj ostatných trhových druhov hydiny. V nańom prípade odporúĉame aplikáciu
preverovaného probiotika v dávke 3,3 ml pre 60 ks na deņ
cez vodný zdroj, t.j. pri niņńom
dávkovaní, kedy je moņné zvýńiť základné parametre mäsovej úņitkovosti kurĉiat (poráņková
hmotnosť, hmotnosť JOT), zníņiť tvorbu neņiaduceho abdominálneho tuku a v koneĉnom dôsledku
zvýńiť ekonomiku ako aj rentabilitu výroby hydinového mäsa.
Poďakovanie
Práca vznikla s podporou projektu VEGA 1/0360/09.
Zoznam pouņitej literatúry
ANGELOVIĈOVÁ, M. 1997. Vplyv nízkobielkovinových tukovaných kŕmnych zmesí na ņivú
hmotnosť a vybrané ukazovatele jatoĉnej kvality výkrmových kurĉiat. In Poľnohospodárstvo, roĉ. 43,
1997, ĉ.10, s. 764-771.
ANGELOVIĈOVÁ, M. - MELEN, M. - TURIANICA, I. - ANGELOVIĈ, M. 2005. Pouņitie
jódovaného oleja vo výņive výkrmových kurĉiat. In 6. Kabrtovy dietetické dny. Brno : FVU, 2005, s.
74-82.
BECKER, W. A. - SPENCER, J. V. - MIROSH, L. W. - VERSTRATE, J. A. 1979. Prediction of fat
and fat free live weight in broiler chickens using backskin fat, abdominal fat and live bodyweight. In
Poultry Science, roĉ. 58, 1979, s. 835-845.
106
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
BENKOVÁ, J. 2001.Analýza jatoĉnej kvality a nutriĉnej hodnoty genofondu importovaných kurĉiat
do SR v roku 2001 : správa za úĉelovú ĉinnosť. Nitra, VUŅV, SCHŃH Ivánka pri Dunaji, 2001, s. 116.
BENKOVÁ, J. - BAUNGARTNER, J. - LICHVÁR, I. 2002. Vzťah genotypu, pohlavia a výņivy
kurĉiat hybridnej kombinácie Hybro G. In Chov hydiny a malých hospodárskych zvierat v 3. tisícroĉí.
Nitra : SPU, 2002, s. 59-62. ISBN 80-8069-074-X.
CSUKA, J. 1988. K problematike pretuĉnenia brojlerov. In Hydina, Výskumný ústav hydinárstva, roĉ.
30, 1988, ĉ. 1-2, s. 33-38.
HAŃĈÍK, P. - ĈUBOŅ, J. - HORNIAKOVÁ, E. et al. 2005a. Vzťah medzi aplikáciou probiotického
preparátu a mnoņstvom abdominálneho tuku u výkrmových kurĉiat.
In Poľnohospodárstvo, roĉ.
51, 2005, ĉ. 11, s. 574-579.
HAŃĈÍK, P. - WEIS, J. - ĈUBOŅ, J. et al. 2005b. Vplyv probiotického preparátu v KKZ brojlerových
kurĉiat ROSS 308 na chemické zloņenie mäsa. In Acta fytotechnica et zootechnica, roĉ. 8, 2005, ĉ. 1,
s. 20-24
HAŃĈÍK, P. - BOBKO, M. - KAĈÁNIOVÁ, M. - ĈUBOŅ, J. - KULÍŃEK, V. - PAVLIĈOVÁ, S.
2007. Vplyv probiotického preparátu na tvorbu tuku v tele kurĉiat. In: VII. Celoslovenský seminár z
fyziológie ţivoĉíchov, SPU : VES Nitra, 2007 s. 85-91. ISBN 978-80-8069-886-7-0.
HAŃĈÍK, P. - KAĈÁNIOVÁ, M. - ĈUBOŅ, J. - BOBKO, M. - NOVÁKOVÁ, I. - VAVRIŃINOVÁ,
K. - ARPÁŃOVÁ, H. - MIHOK, M. 2009. Aplication of Lactobacillus fermentum and its effect on
chemical composition of ROSS PM3 chicken meat. In: Acta fytotechnica et zootechnica, roĉ. 12,
2009 mimoriadne ĉíslo, s. 197-205. ISSN 1335-258X.
HAŃĈÍK, P. - MELICH, M. - KAĈÁNIOVÁ, M. - PÁL, G. - MIHOK, M. - ĈUBOŅ, J. - MELLEN,
M. - VAVRIŃINOVÁ, K. 2010a. Vplyv aplikácie propolisu na mäsovú úņitkovosť kurĉiat Ross 308.
In Potravinárstvo, roĉ. 4, 2010, ĉ. 2, s. 29-34. ISSN 1338-0230.
HAŃĈÍK, P. - MIHOK, M. - KAĈÁNIOVÁ, M. - ĈUBOŅ, J. - BOBKO, M. - PRÍVARA, Ń.,
VAVRIŃINOVÁ, K. - ARPÁŃOVÁ, H. - KUNOVÁ, S. 2010b. Vplyv probiotického preparátu
s multikmeņovým zloņením na postmortálne zmeny v prsnej a stehennej svalovine kurĉiat Hybro. In
Potravinárstvo, roĉ. 4, 2010, mimoriadne ĉíslo, s.143-151. ISSN 1337-0960.
HORVÁTHOVÁ, V. - LAGIN, L. 1985. Technologická a nutriĉná hodnota brojlerových kurĉiat
hybrida Slovgal. In Ţivoĉíšna výroba, roĉ. LVIII, 1985, ĉ. 8, s. 761-768.
HRDINKA, Ĉ. - SKŘIVAN, M. - TŦMOVÁ, E. 1995. The effect of gender, genotype and the content
of methionine in feeding mixtures on fat accumulation in broiler chickens (in Czech). In Ţivoĉíšna
výroba, roĉ. 40, 1995, s. 489-495.
INGR, I. 1995. Jakost drŧbeņího masa a konzumních vajec. In Náš chov, roĉ. 55, 1995, ĉ. 12, s. 34.
INGR, I. 1996. Technologické vlastnosti masa a jejich postmortální vývoj. In Maso, roĉ. 7, 1996, ĉ. 5,
s. 6-10.
KLÍMA D. 1996. Animal fats. In Meat, 1996, ĉ. 6, s. 3-5.
KUMPRECHTOVÁ, D. - ZOBAĈ, P. - KUMPRECHT, I. 1999. Vliv kontinuálni aplikace vybraných
probiotických preparátŧ na úņitkovost kuřecích brojlerŧ a vyluĉovaní dusíka exkrementy. In Výroba
drůbeţiho masa. Brno : MZLU, 1999,
s. 71-74.
KŘÍŅKOVÁ, E. - ĈERMÁK, B. - KADLEC, J. - LÁD, F. 1995. Zhodnocení podílu jednotlivých
partií drŧbeņího masa po poráņce. In Aktuálni problémy zdraví, růstu a produkce drůbeţe, Scientific
Pedagogoc Publishing : Ĉeské Budějovice, 1995, s. 139-140. ISBN 80-85645-15-7.
LAGIN, L. 1989. Jatoĉná hodnota kurĉiat kombinácie Hybro. In Ţivoĉíšna výroba, roĉ. LXII, 1989, ĉ.
7, s. 655-662.
LAZAR, V. 1990. Poultry-rising (in Czech). VSŅ : Brno, 1990, 210 s.
MAREK, J. - SPLÍTEK, M. - JIŘÍK, J. 1988. The effect of live body weight and gender on the amount
of abdominal fat in hybrids Hybro (in Czech). In Ţivoĉíšna výroba, roĉ. 33, 1988, s. 555-559.
MATUŃOVIĈOVÁ, E. 1986. Technology of Poultry Production (in Slovak). Príroda : Bratislava,
1986, 393 s.
PIPEK, P. 2000. Kvalitní hovězí maso z technologického a spotřebitelského hlediska. In Maso, roĉ.
11, 2000, ĉ. 3, s. 18-22.
RYCHLÁ, J. - ŘEZNÍĈEK, M. 2000. Vyhodnocení výkrmu brojlerŧ v Rońtenicích. In Náš chov, roĉ.
LX, 2000, ĉ. 11, s. 35-36.
107
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
SEVEN, T. P. - SEVEN, I. - YILMAZ, M. - SIMSEK, G. Ü. 2008. The effects of Turkish propolis on
growth and carcass charasteristics in broilers under heat stress. In Anim. Feed Sci. and Technol., roĉ.
146, 2008, s. 137-148.
SHALMANY, S. K. - SHIVAZAD, M. 2006. The effect of diet propolis supplementation on Ross
broiler chicks performance. In Int. J. Poult. Sci., roĉ. 5, 2006, ĉ.1, s. 84-88.
SIMEONOVOVÁ, J. 1999. Technology of Poultry, Eggs and other Minor Animal Products (in
Czech). MZLU : Brno, 1999, 247 s. ISBN 80-7157-405-8.
SIMEONOVOVÁ, J. - INGR, I. 2000. Výkrm kohoutkŧ a slepiĉek do vyńńího věku a hmotnosti ve
vztahu k výtěņnosti masa a jateĉních ĉástí. In Maso, roĉ. 11, 2000, ĉ. 5, s. 13-16.
SKŘIVAN, M. 2000. Poultry Raising 2000 (in Czech). Agrospoj : Praha, 2000, 203 s.
SKŘIVAN, M. - TŦMOVÁ, E. 1990. Slaughter utility of 5 – to 8 weeks‟ male chickens Hybro, Ross
208 and Ross PM 3 (in Czech). In Ţivoĉíšna Výroba, roĉ. 35, 2000, s. 1049-1257.
STEINHAUSER, L., BEŅOVSKÝ, R., BYSTRICKÝ, P., CABADAJ, R., ĈERNÝ, H., DVOŘÁK, J.
2000. Produkce masa. Last : Brno, 2000, 464 s. ISBN 80-900260-70-9.
STRAKOVÁ, E. - SUCHÝ, P. - PAŅOUT, V. 2002. Efekt výkrmu brojlerových kuřat do vyńńího
věku a hmotnosti. In Technologické systémy v chovu drůbeţe. MZLU : Brno, 2002, s. 165-168. ISBN
80-7157-579-8.
UHRÍN, V. - HORVÁTHOVÁ, V. - HORNIAKOVÁ, E. et al. 1993. Kvalita hydinového mäsa. In
Acta zootechnica, Nitra : VŃP, 1993, 111 s. ISBN 80-7137-124-6.
108
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ZVYŃOVANIE ÚČINNOSTI PREBIOTIKA INULÍNU VYBRANÝMI
BIOAKTÍVNYMI POTRAVINOVÝMI KOMPONENTMI
EFFICIENCY IMPROVEMENT OF INULIN PREBIOTICS USING BIOACTIVE
FOOD COMPONENTS
HIJOVÁ E., CHMELÁROVÁ A., BOMBA A.
Ústav experimentálnej medicíny, Lekárska fakulta, Univerzita P. J .Šafárika, Košice, Slovenská
republika
Abstract
Prebiotics are defined as selectively fermented ingredients that allow specific changes, both in the
composition and/or activity in the gastrointestinal microbiota that confers benefits upon host wellbeing and health. The aim of the presented experiment was to investigated the effect of prebiotic by
itself and in combination with Hyppocastani extractum siccum, and Lini oleum virginale in
dimethylhydrazine induced colon cancer. Rats were fed with high fat diet supplemented by prebiotic
itself and in combination with Horse chestnut and flaxseed oil. Two weeks after beginning the diet
was applicated dimethylhydrazine injections in dose 20 mg/kg b.w., two times at week interval. The
activity of fecal bacterial enzymes, concentration of lipid parameters, bile acids and short chain fatty
acids were determined. Treatment with prebiotic and its combination with selected substances
significantly decreased activity of bacterial enzymes ß-galactosidase, ß-glucuronidase, and αglucosidase (p<0.001). Bile acids concentration was significantly decreased (p<0.01) excepting
combination of prebiotic with Horse chestnut. Self-applicated prebiotic decreased (p<0.001) lipids
parameters (total cholesterol and triacylglycerols), and enhanced short chain fatty acids production –
acetic acid, propionic acid and butyric acid. These results show that ingestion of prebiotics have
protective effect and may be the useful candidate agents for colon cancer prevention and treatment.
Applied selected bioactive food components supported effect of prebiotics.
Key words: colon cancer, prebiotic, flaxseed oil, Horse chestnut, rats
Úvod
Kombinácia probiotík so synergicky pôsobiacimi zloņkami prírodného pôvodu je z praktického
hľadiska najlepńím spôsobom pre zlepńovanie úĉinnosti probiotických prípravkov. Najĉastejńou je
kombinácia probiotík a prebiotík ako synbiotík alebo pouņitím viacero vhodných komponentov, ako
sú oligosacharidy, fytokomponenty, nutriĉné faktory, polynenasýtené mastné kyseliny, ĉím sa získajú
úĉinnejńie probiotické prípravky oznaĉené ako potencované probiotiká (Bomba a kol., 2002). Cieľom
náńho experimentu bolo zistiť moņnosti zvyńovania úĉinnosti prebiotika-inulínu vybranými
bioaktívnymi potravinovými komponentmi, a to suchým extraktom pagańtanu a ľanovým olejom vo
vzájomných kombináciach na experimentálnom modeli chemicky indukovanej karcinogenézy u
potkanov.
Materiál a metódy
Potkany kmeņa Wistar vo veku 6 mesiacov s priemernou ņivou hmotnosťou 372,57 ± 15,01g
boli chované v konvenĉných podmienkach Centrálneho zvieratníka LF UPJŃ, krmené vysokotukovou
diétou (Biofer, s r.o., SR) s obsahom tuku do 10 % na kg krmiva, napájané pitnou vodou ad libitum s
dennou kontrolou spotreby krmiva a vody. Experiment bol schválený Ńtátnou veterinárnou
a potravinovou správou SR v súlade s legislatívnymi ustanoveniami. Dĺņka experimentu bola 8
týņdņov, priĉom dva týņdne po jeho zaĉatí bol vńetkým zvieratám subkutánne aplikovaný
prokarcinogén dimethylhydrazín (N,N-Dimethylhydrazine, DMH, Merck, Nemecko) indukujúci
rakovinu kolónu u laboratórnych zvierat v dávke 20 mg.kg-1 ņivej hmotnosti, 2 krát s týņdenným
odstupom.
Zvieratá boli rozdelené do 5 skupín. Kontrolná skupina (KS), tzv. nelieĉená, bola skupina
zvierat, u ktorej sa kumulovali dva rizikové faktory vysokotuková diéta a karcinogenéza iniciovaná
109
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
DMH. Ćalńie ńtyri skupiny, tzv. lieĉené, tvorili tieto skupiny: experimentálna skupina 1 (ES1),
v ktorej bolo aplikované samotné prebiotikum-PRE, experimentálna skupina 2 (ES2=PRE+P), kde
k prebiotiku bol podávaný suchý extrakt pagańtanu-P, experimentálna skupina 3 (ES3=PRE+O),
v ktorej prebiotikum bolo doplnené o ľanový olej-O a experimentálna skupina 4 (ES4) ako
kombinácia vńetkých bioaktívnych potravinových komponentov (PRE+P+O).
Prebiotikum-inulín obohatený o oligofruktózu (BeneoSynergy 1, ORAFTI, Belgicko) bol
aplikovaný v dávke 2 % na kg vysokotukového krmiva potkanom v ES1 samostatne a v ES2, ES3,
ES4 v kombinácii. V podobnej dávke t.j. 2 % na kg vysokotukového krmiva bol aplikovaný ľanový
olej z firmy (Dr. Kulich Pharma, ĈR). Suchý extrakt pagańtanu (Aesculus hippocastanum L.,
Calendula, SR) bol pridávaný v dávke 1 % na kg vysokotukového krmiva. Po ukonĉení experimentu
bol v celkovej anestéze (Ketamín v dávke 100 mg.kg-1 + Xylazín 15 mg.kg-1 ņ. hm., i. p.) zvieratám
odobratý biologický materiál (vzorky obsahu kolónu a krv).
Odobraté ĉerstvé vzorky obsahu kolónu boli vyuņité na stanovenie enzýmovej aktivity
bakteriálnych enzýmov alfa-galaktozidáza (α-GAL), beta-galaktozidáza (ß-GAL), beta-glukuronidázy
(ß-GLUKUR), alfa-glukozidáza (α-GLU) a beta-glukozidáza (ß-GLU), API ZYM kitmi (firmy
BioMérieux, Francúzsko) podľa návodu výrobcu a vyjadrené ńkálou od 0 (negatívna reakcia) do 5
(maximálna aktivita). Hodnoty mastných kyselín s krátkym reťazcom vo vzorkách obsahu kolónu boli
analyzované plynovou chromatografiou Hewlett Packard (USA). Vzorky krvi získané punkciou zo
srdca boli centrifugované pri 2500 G.15 min.-1 a získané krvné sérum bolo pouņité pre stanovenie
koncentrácie ņlĉových kyselín komerĉným setom (Trinity Biotech, Írsko) a lipidových parametrov
setmi (Biolatest, ĈR). Studentov t-test a ANOVA boli pouņité pre stanovenie významnosti rozdielov
medzi kontrolnou a experimentálnymi skupinami.
Výsledky
V priebehu experimentu dońlo k ńtatisticky významnému zvýńeniu priemernej ņivej hmotnosti
zvierat z 372,57 ± 15,01g na zaĉiatku experimentu na 398,16 ± 33,19 g (p<0,05) na konci
experimentu, zatiaľ ĉo v kontrolnej skupine to bolo zvýńenie o 2,1 % v ES1 to bolo o 2,8 %, v ES2 o
0,8 %, v ES3 o 10,9 % a v ES 4 bolo zvýńenie hmotnosti o 17,2 %. Nárast hmotnosti koreloval so
spotrebou krmiva. Zmeny aktivity bakteriálnych enzýmov v kontrolnej skupine a v experimentálnych
skupinách sú zhrnuté v tabuľke ĉ. 1.
Tabuľka 1 Enzymatická aktivita bakteriálnych enzýmov v kontrolnej a v experimentálnych
skupinách
α-GAL
ß-GAL
ß-GLUKUR
α-GLU
ß-GLU
KS
2,00 ± 0,26
3,92 ± 0,80
4,25 ± 0,52
3,83 ± 0,68
2,08 ± 0,80
ES1
1,32 ± 0,42
1,92 ± 0,37***
0,83 ± 0,52***
1,83 ± 0,26***
1,83 ± 0,26
ES2 1,67 ± 0,26
2,00 ± 0,32***
0,72 ± 0,25***
1,92 ± 0,20***
1,52 ± 0,16
ES3 1,17 ± 0,37
1,70 ± 0,23***
2,18 ± 0,33***
1,22 ± 0,30***
1,35 ± 0,39*
ES4 1,75 ± 0,56
2,11 ± 0,55***
2,22 ± 0,56***
2,28 ± 0,34***
1,92 ± 0,46
Hladina významnosti: * p<0,05; *** p<0,001
KS = kontrolná skupina
ES1 = experimentálna skupina s prebiotikom (PRE)
ES2 = experimentálna skupina s prebiotikom a suchým extraktom pagańtanu (PRE + P)
ES3 – experimentálna skupina s prebiotikom a ľanovým olejom (PRE + O)
ES4 = experimentálna skupina kombinácia (PRE + P + O)
Aplikácia inulínu v ES1 signifikantne zníņila (p<0,001) aktivitu bakteriálnych enzýmov ß-GAL,
ß-GLUKUR a α-GLU v komparácii s kontrolnou skupinou. Tendencia zmien v aktivite bakteriálnych
enzýmov bola podobná aj v skupinách ES2, ES3 a ES4. S výnimkou experimentálnej skupiny ES2
s prebiotikom a suchým extraktom pagańtanu, kde koncentrácia ņlĉových kyselín poklesla
nesignifikantne, bolo zníņenie koncentrácie ņlĉových kyselín v ostaných skupinách ńtatisticky
signifikantné ES1, ES3 (p<0,01) a v ES4 (p<0,001), (tabuľka ĉ. 2). Koncentrácia celkového
cholesterolu a triacylglycerolov bola zníņená v ES1, ale v ostatných experimentálnych skupinách bol
110
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
pokles bez ńtatistickej významnosti (tabuľka ĉ. 2). Zmeny v koncentrácii mastných kyselín s krátkym
reťazcom sú sumarizované v tabuľke ĉ. 3.
Tabuľka 2 Zmeny lipidových parametrov a ņlĉových kyselín
Celkový cholesterol
Triacylglyceroly
(µmol/L)
(µmol/L)
KS
1,39 ± 0,22
1,05 ± 0,32
ES1
0,83 ± 0,19***
0,57 ± 0,23***
ES2
0,94 ± 0,16***
0,89 ± 0,68
ES3
1,05 ± 0,16
1,13 ± 0,46
ES4
1,14 ± 0,16
0,89 ± 0,54
Hladina významnosti: ** p<0,01; *** p<0,001
KS = kontrolná skupina
ES = experimentálna skupina
Skupiny
Ņlčové kyseliny
(µmol/L)
16,84 ± 6,33
11,72 ± 4,22**
13,56 ± 6,07
10,84 ± 3,19**
5,76 ± 2,66***
Tabuľka 3 Zmeny koncentrácie mastných kyselín s krátkym reťazcom v priebehu
experimentu
Octová kyselina
(mmol.100 ml-1)
KS
11,45 ± 1,98
ES1
11,76 ± 1,67
ES2
10,39 ± 1,97
ES3
9,57 ± 1,90
ES4
11,00 ± 1,88
Hladina významnosti: ** p<0,01
KS = kontrolná skupina
ES = experimentálna skupina
Skupiny
Propionová kyselina
(mmol.100 ml-1)
2,77 ± 0,35
2,76 ± 0,57
2,11 ± 0,56
2,55 ± 0,64
2,70 ± 0,39
Maslová kyselina
(mmol.100 ml-1)
2,41 ± 0,46
2,91 ± 0,62**
2,00 ± 0,47
2,03 ± 0,51
2,30 ± 0,42
Záver
Termín prebiotikum koncipovali Roberfroid a Gibson v roku 1995 (Gibson a Roberfroid, 1995).
Obaja boli zainteresovaní v príprave konceptu „funkĉné potraviny“, medzi ktoré patria aj prebiotiká.
Prebiotiká sú vo vńeobecnosti definované ako nestráviteľné potravinové zloņky, ktoré sú rezistentné
na úĉinok hydrolytických enzýmov v hornej ĉasti GIT, prechádzajú
do kolónu v nezmenenom stave a priaznivo ovplyvņujú mikroflóru hostiteľského organizmus
selektívnou stimuláciou rastu alebo aktivitu jedného alebo niekoľkých druhov zdraviu prospeńných
mikroorganizmov v hrubom ĉreve a súĉasne potláĉajú patogénne baktérie prítomné v mikroflóre.
V roku 2004 bola táto definícia upravená a dnes sú prebiotiká definované ako selektívne
fermentované ingrediencie (zloņky potravín), ktoré umoņņujú ńpecifické zmeny v zloņení a/
alebo aktivite mikroorganizmov v GIT, ktoré majú priaznivý vplyv na zdravie hostiteľa (Gibson a kol.,
2004).
Terminológie ako „funkĉné potraviny/nutraceutiká/potravinové doplnky“ sú pojmy, ktoré sú
ĉoraz ĉastejńie implementované v nańich slovníkoch. O ich potenciáli/benefite pri zmierņovaní
zdravotných problémov predovńetkym v gastrointestinálnom trakte sa neustále diskutuje. Koncept
funkĉných potravín bol vytvorený v roku 1980 v Japonsku a prvá kniha o funkĉných potravinách bola
vydaná v roku 2000 (Gibson a Williams, 2000).
Význam funkĉných potravín, nutraceutík, potravinových doplnkov z globálneho hľadiska si
uvedomujú aj predstavitelia EÖ (Coppens a kol., 2006). Investovalo sa veľa prostriedkov na
podporu projektov, ktoré majú dať presnejńie odpovede na otázky súvisiace so ńpecifickými úĉinkami
funkĉných potravín na jednotlivé skupiny obyvateľstva, na ich úĉinky na konkrétne ochorenia ĉi
funkĉné poruchy a pod.
K najĉastejńie pouņívaným prebiotikám patria:
111
X. Risk Factors of Food Chain












13-th – 14 -th September 2010
Fruktooligosacharidy (FOS) sú polyméry D-fruktózy spojené väzbou ß-2-1. Na konci
molekuly je väĉńinou pomocou α-1-2 väzby napojená glukóza. Molekuly so stupņom
polymerizácie väĉńím neņ 10 bývajú oznaĉené ako inulín. FOS sa vyrábajú enzymatickou
hydrolýzou inulínu. Oligofruktóza sú rozliĉné FOS zlúĉeniny formulované z inulínu.
Inulín (nie je FOS, je to oligosacharid obohatený o oligofruktózu, známy ako fruktan).
Izomalto-oligosacharidy (IMO, isomaltulóza, isomaltóza) sa skladajú z glukóz spojených do
reťazca (väĉńinou krátkeho, pozostávajúceho z 2-4 jednotiek α-1-6 glykozidovej väzby.
Galaktooligosacharidy (GOS), sú definované vzorcom Gluα1-4[ßGal1-6]n kde n=2-5.
Prítomné sú v ľudskom a kravskom mlieku. Galaktooligosacharidy vyrábané z laktózy
pomocou transgalaktozylázovej aktivity ß-galaktozidázy sa nazývajú transgalaktozylované
oligosacharidy alebo transgalaktooligosacharidy (trans GOS =TOS).
Mannanoligosacharidy (MOS) ktoré obsadením receptorov ĉrevnej steny znemoņnia adhézii
patogénnych mikroorganizmov ĉo vedie k ich vyplaveniu z gastrointestinálneho traktu.
Vyuņíva sa buć mannóza alebo zdrojom MOS sú buneĉné steny kvasinky Saccharomyces
cerevisae.
Xylooligosacharidy (XOS), obsahujú hlavne molekuly xylózy spojené ß-1-4 glykozidovými
väzbami.
Sójové oligosacharidy (rafinóza, stachyóza, verbaskóza) niekedy sú oznaĉované ako
oligosacharidy rafinózovej rady (RSO – raffinose series oligosaccharides), majú poĉetné
zastúpenie galaktózy.
Arabinoxylany patria medzi hemicelulózu (bezńkrobový polysacharid).
Laktosacharóza je trisacharid skladajúci sa z galaktózy, glukózy a fruktózy. Je produkovaný
cez enzymatickú reakciu ktorej výsledkom je sacharóza
Laktulóza je semisyntetický disacharid obsahujúci laktózu a fruktózu, ktorý vzniká
izomeráciou laktózy napr. tepelným ońetrením mlieka. Chemicky je to „4-O-ßgalactopyranosyl-D-fruktóza“.
Laktilol je disacharidový analóg odvodený od mlieĉneho cukru laktózy.
Laktóza je mlieĉny cukor zloņený z glukózy a galaktózy.
Prebiotiká sú produkty prevaņne prírodného charakteru nachádzajúce sa v rastlinách, ako sú
artiĉoky, ĉakanka, cibuľa, cesnak, ovocie, zelenina, strukoviny a podobne, ktoré ako aditíva sú
pridávané do potravinárskych produktov a doposiaľ vyuņívané prevaņne západnou populáciou.
Prebiotiká majú multifunkĉný charakter, sú vyuņívané ako prírodná náhrada tuku a cukru, na
úpravu textúry, chutnosti a jemnosti v potravinárskych komoditách, ako sú napr. mlieĉne produkty
(jogurty, syry, nápoje), mrazené dezerty, ovocné produkty, cereálne a extrudované výrobky, chlieb,
peĉivo, plnky, cukrovinky, ĉokoláda, diétne výrobky, výrobky z masla, ńalátové dressingy, mäsové
produkty, vrátane nápojových produktov.
Vńetky doterajńie komerĉné prebiotické produkty sú sacharidy, a to prevaņne oligosacharidy,
fruktooligosacharidy alebo niektoré polysacharidy, ktoré sú ĉiastoĉne alebo úplne rezistentné voĉi
úĉinkom tráviacich enzýmov hostiteľa. Nie sú absorbované alebo metabolizované v hornej ĉasti
tráviaceho traktu. Tak sú schopné dosiahnuť hrubé ĉrevo, kde môņu reagovať s mikrobiálnou flórou
a ĉrevnými bunkami, podporovať rast a metabolickú aktivitu probiotických a niektorých ĉrevných
baktérií a tým zvýńiť ich prospeńné úĉinky. Hovorí sa o tzv. bifidogénnom efekte.
Prebiotiká sú vyuņívané ako ńpecifické rastové substráty prospeńnými baktériami, napr.
lactobacilmi. Nie sú vyuņívané patogénmi, resp. potenciálnymi patogénmi. Indukujú enzymatický
systém prospeńných baktérií, ktorý ich fermentuje na organické mastné kyseliny s krátkym reťazcom
(SCFA) a produkty ako sú vodík, metán a CO2. Tým sa vytvárajú priaznivé podmienky pre
kolonizáciu tráviaceho traktu prospeńnými baktériami a naopak, rast neņiadúcej mikroflóry je
potlaĉený. Zvýńená produkcia SCFA ĉrevnou mikroflórou, ktorá vyuņíva tieto nestráviteľné
oligosacharidy môņe byť ochranou proti rozvoju kolorektálnej rakoviny (Augenlicht a kol. 2002).
Prebiotiká majú nízku energetickú hodnotu a zvyńujú objem stolice. Nadmerným uņívaním vzniká
nadbytok produktu ĉo sa prejavuje plynatosťou, nafukovaním, abdominálnymi krĉmi a laxatívnymi
úĉinkami (Gibson a Rastall, 2006).
112
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Prebiotiká reagujú s proteínovými receptormi prítomnými na povrchu mikrobiálnych buniek
alebo epiteliálnych buniek tráviaceho traktu a ovplyvņujú bakteriálnu adherenciu a imunomoduláciu.
Skúmané sú ćalńie pomocné úĉinky, ako je zvýńenie absorpcie niektorých minerálnych látok (Ca ++,
Mg++), inhibícia prekancerózy adenómu a karcinómu.
Ćalńím benefitom pouņívania prebiotík je ich schopnosť posilniť imunitný systém organizmu,
prispieť k zniņovaniu cholesterolu a triacylglyceridov v krvi ako jedného z hlavných rizikových
faktorov srdcovo-cievnych chorôb, stimulovať ĉrevnú peristaltiku a urýchliť prechod trávenej potravy.
Tým je stena ĉreva kratńie vystavená pôsobeniu prípadných ńkodlivých zloņiek potravy a splodín
látkovej premeny. Sú podpornými látkami proti obezite, majú vyuņitie pri redukĉných diétach. Viaņu
vodu, tým sa zväĉńuje objem poņitej potravy a vyvolávajú pocit sýtosti, stabilizujú hladinu krvného
cukru u diabetikov. Zvýńená aktivita bakteriálnych enzýmov je spojená so zvýńeným rizikom rozvoja
rakoviny. Sú to enzýmy produkované mikroflórou hrubého ĉreva zapojené v II fáze peĉeņovej
detoxikácie, poĉas ktorej dochádza ku konjugácii toxínov s kyselinou glukurónovou. Konjugované
toxíny sa peĉeņou vyluĉujú z organizmu. Aktivita enzýmov s toxickými vlastnosťami sa dá upraviť
zmenou, resp. doplnením stravy, napríklad o prebiotikum. Bola potvrdená antitumorová aktivita
prebiotík, ktorá môņe byť realizovaná buć priamo inhibíciou nádorových buniek, supresiou
baktérií
produkujúcich
ß-glukozidázu, ß-glukuronidázu, ktoré katalyzujú konverziu
prokarcinogénov
na proximálne karcinogény.
Výsledky nańej experimentálnej práce preukázali, ņe lieĉba prebiotikom u potkanov
s aplikovaným prokarcinogénom v kombinácii s vysokotukovou diétou mala preventívny úĉinok
preukázaný zníņením aktivity bakteriálnych enzýmov, zníņením koncentrácie cholesterolu,
triacylgylcerolov a ņlĉových kyselín a nárastom SCFA. Potenciovanie úĉinku prebiotiká vybranými
bioaktívnymi potravinovými komponentmi, a to suchým extraktom pagańtanu a ľanovým olejom,
preukázal podporný úĉinok na sledované parametre.
Nemoņno vylúĉiť, ņe práve zníņenie príjmu probiotík a prebiotík má negatívny dopad na nańe
zdravie a ņe zvýńenie príjmu týchto dôleņitých zloņiek potravy môņe významne ovplyvniť zdravie
kaņdého jedinca. Dietetika je stále odsúvaná na okraj záujmu a nepovaņuje sa za súĉasť lieĉby. Za
urĉitých okolností by mohla pacientovi pomôcť úprava dietetických návykov a erudované vysvetlenie
ońetrujúcim personálom. Prebiotiká poskytujú potenciál v prevencii a lieĉbe významných
gastrointestinálnych chorôb. Dôleņitým faktom, ktorý môņe tieto závery podporovať je, ņe vyńe 60 %
buniek imunitného systému sa nachádza v gastrointestinálnom trakte, a preto dostatoĉná výņiva
enterocytov z lúmenu ĉreva s primeraným príjmom probiotík a prebiotík dokáņe maximalizovať
imunitnú odpoveć organizmu a modulovať zápalovú reakciu, ĉi lokálnu alebo systémovú.
Tieto získané výsledky môņu byť pre nás podnetom a zdrojom nových informácii v snahe
doplniť nańe stravovanie. Je známe a ani oficiálna medicína o tom nepochybuje, ņe strava a zdravie sú
úzko späté a väĉńina ľudí význam zdravej výņivy podceņuje. Zdravá výņiva vńak môņe rozhodnúť
o nańom zdraví ĉi chorobe. Je na nás ĉo si vyberieme. Zdá sa, ņe prebiotiká môņu byť vhodný
doplnok výņivy. Ich vyuņitie sa zvýńi, ak sa stanú aditívami rôznych potravinárskych produktov.
Poďakovanie
Podporené projektom AV 4/0028/07 a grantom VEGA 1/0372/10.
Literatúra
AUGENLICHT, L.M. - MARIADASON, J.M. - WILSON, A. - ARANGO, D. - YANG, W. HEERDT, B.G. - VELCICH, A. 2002. Short chain fatty acids and colon cancer. In American Society
for Nutritional Sciences, vol. 132, 2002, p. 3804-3808.
BOMBA, A. - NEMCOVÁ, R. - MUDROŅOVÁ, D. - GUBA, P. 2002. The possibilities of
potentiating the efficacy of probiotics. In Trends Food Sci. Tech., vol. 13, 2002, p. 121-126.
COPPENS, P. - DASILVA, M.F. - PETTMAN, S. 2006. European regulation on nutraceuticals,
dietary supplements and functional foods: a framework based on safety. In Toxicology, vol. 221, 2006,
p. 59-74.
GIBSON, G.R. - RASTALL, R.A. 2006. Prebiotics: Development and Application. John Wiley &
Sons Ltd, West Sussex, 2006, 264 strán.
113
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
GIBSON, G.R. - PROBERT, H.M. - VAN LOO, J. - RASTALL, R.A. - ROBERFROID, M.B. 2004.
Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics. In Nutr. Res.
Rev., vol. 17, 2004, p.259-275.
GIBSON, G.R. - WILLIAMS, Ch. M. 2000. Functional foods - concept to product. Woodhead
Publishing Ltd., Woodhead 2000, 392 strán., ISBN 1855735032
GIBSON, G.R. - ROBERFROID, M.B. 1995. Dietary modulation of the human colonic microbiota:
Introducing the concept of prebiotics. In J. Nutr., vol. 125, 1995, p. 1401-1412.
114
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ANTIBIOTIC RESISTANCE OF ENTEROBACTERIACEAE GENERA ISOLATED
FROM UNPASTEURISED MILK
HLEBA Lukáń, KAČÁNIOVÁ Miroslava, POCHOP Jaroslav, KUNOVÁ Simona*
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Katedra mikrobiológie, Tr. Andreja Hlinku 2, 949 76
Nitra, Slovakia
* Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre,Katedra hygieny a bezpeĉnosti potravín, Tr. Andreja
Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
Abstract
The aim of this study was to determine antibiotic resistance of Enterobacteriaceae genera isolated
from milk from Slovakia. The cultivation was done on a selective agar for Enterobacteriaceae
(MacConkey). Antibiotic susceptibility testing was done on the Muller-Hinton agar with these
antibiotics: Ampicillin (AMP), Tetracycline (TE 30) and chloramphenicol (C 30). For identification of
strains of Enterobacteriaceae genera, we used ENTERO test 24. In our study, we determined that the
highest resistance of Enterobacteriaceae strains was to Tetracycline and Ampicillin (50 %). The
lowest resistance was to Chloramphenicol (10 %). The highest susceptibility was to Chloramphenicol
(90 %). The susceptibility to Tetracycline and Ampicillin was 50 %. From this genera, we identified
Serratia spp. which was resitant to Ampicillin and Tetracycline. Serratia plymuthica which was
resistant to Ampicillin. Raoultella terrigena, Klebsiella pneumonae, Enterobacter aerogenes which
were resistant to Chloramphenicol. The results show that the bacteria can transfer resistance genes and
their spread not only in vertical but also horizontal. Results also confirm that antibiotic resistance not
only through the digestive tract of animals but also in their final product such as milk. Milk is
therefore necessary to pasteurize, because pasteurization is good for inactive of coliforms bacteria.
Key words: antibiotic resistance, Enterobacteriaceae genera, unpasteurised milk
Introduction
Antibiotic resistance is significant health, social and economic problem at this time. Antibiotic
resistance of bacteria is biological risk, which it is increase morbidity and mortality of animal and
human (EFSA, 2008). The most technologies in the production and food processing reduced the
incidence of pathogens including resistant bacteria to antibiotics. Experimental monitoring confirmed
that the treatment of food technology based on damage to cell membranes and enzymes, may help to
generate and transfer of antibiotic resistance (Lado a Yousef, 2002; Kharazmi et al., 2002; Mc Mahon
et al., 2007). The health safety of foods, including milk, it is an integral part of consumers policy and
health (Bíreń, 2004). Milk is a suitable substrate for the growth of many pathogenic and toxicogenic
microorganisms which may be the cause of foodborne diseases that can endanger the health of the
consumers (Bobková, 2008). Coliforms bacteria can not survive during pasteurization. If coliforms
bacteria survive during pasteurization, it is indicate to the lack of pasteurization (Havlová, 1993).
In our study, we researched antibiotic resistance of Enterobacteriaceae genera isolated from
unpasteurized milk from Slovakia.
Material and methods
Antibiotic resistance study was done on Enterobacteriaceae genera isolated from milk of
Slovakia. The samples were taken from automat to fresh milk. The bacterial strains were isolated
from milk swab and collected with a kit containing the swab (Copan Inovation, Brescia) and the
transport in medium to laboratory. For cultivation of Enterobacteriaceae genera MacConkey agar was
used. The pure bacterial strains of Enterobacteriaceae genera were prepared by suspending of colonies
from agar plates and the suspension was adjusted to equal a 0.5 McFarland standard. Antibiotic
susceptibility testing was done on Muller-Hinton agar. The sensitivity of all strains of
Enterobacteriaceae genera was tested against: Ampicillin (AMP 10) 10 µg/disk, Tetracycline (TE 30)
30 µg/disk, and Chloramphenicol (C 30) 30 µg/disk. We used disk diffusion methods (according to
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The incubation of strains was done at the
115
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
temperature 37 °C per 24 hour. The interpretation of inhibition zones around the disk was according to
EUCAST 2010 European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (Table 1).
Table 1 Interpretation of inhibition zones for Enterobacteriaceae by EUCAST
Antibiotics
Ampicillin
Tetracycline
Chloramphenicol
Enterobacteriaceae
µg/disk
Susceptibility ≥
10
14
30
19
30
17
Resistance <
14
14
17
The inhibition zones were controlled with reference Escherischia coli ATCC 25922.
Identification of strains from Enterobacteriaceae genera was done by ENTERO test 24 (Pliva,
Lachema).
Results and discussion
We study antimicrobial drug resistance in commensal Eneterobacteriaceae genera, which are
considered a potentional reservoir of resistant bacteria genes in environment. This reservoirs of
resistant bacteria provide a potentional source for resistance gene transfer between bacteria as well as
an environment and food products. Therefore, identifying these reservoirs and mechanisms of
persistance will be a key to reducing the load of resistant bacteria in everywhere.
In our study, we determined that the highest resistance of Enterobacteriaceae strains was to
Tetracycline and Ampicillin (50 %). The lowest resistance was to Chloramphenicol (10 %). The
highest susceptibility was to Chloramphenicol (90 %). The susceptibility to Tetracycline and
Ampicillin was 50 %. The results can be show in Figure 1.
Figure 1 Antibiotic resistance profiles of Enterobacteriaceae genera isolated from milk
116
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Reported results Solomakos et al. (2009), which detected antibiotic resistant in the milk coming
from the Greek. Their results show higher resistance of E. coli to Ampicillin and Chloramphenicol.
Farzana et al. (2009) determined that in Indian milk resistance was 100 % to Chloramphenicol. The
similar results like Farzana et al. (2009) determined Dupont et al. (1978) in their work too. The
number of researchers, such as Lira et al. (2004), Picozzi et al. (2005), Caro et al. (2007), Ĉíņek et al.
(2007), which examined the antibiotic resistance of E. coli, respectively, Enterobacteriaceae genera
isolated from milk have argued that the results of antibiotic resistance vary from study to study like
our results.
In these samples isolated from milk, we identified following strains by ENTERO test 24:
Serratia plymuthica (100 %), which was resitant to Ampicillin. Serratia spp. (100 %) which was
multiresistant to Ampicillin and Tetracycline. Raoultella terrigena (82.79 %), Klebsiella pneumonae
(10.91 %) and Enterobacter aerogenes (6.13 %), which were resistant to Chloramphenicol. Identified
strains by ENTERO test 24 show Table 2.
Table 2 Identified resistant strains and percentage of identification by ENTERO test 24
Strains
Serratia spp.
Serratia plymuthica
Raoultella terrigena
Klebsiella pneumonae
Enterobacter aerogenes
Identification (%)
100
100
82.79
10.91
6.13
Resistance to
Ampicillin, Tetracycline
Ampicillin
Chloramphenicol
Chloramphenicol
Chloramphenicol
Conclusion
Use of antibiotics in livestock farming causes that more and more obligatory and facultative
pathogens are resistant to various antibiotics used commercially. Our experiment results show that
antibiotics were used in breeding or rearing were introduced into the external environment. Results
confirm that antibiotic resistance not only through the digestive tract of animals but also in their final
product such as milk. Unpasteurised milk contains coliforms bacteria. Milk is the end product, which
is also used in human food chain. If coliforms bacteria are resistant undesirable reproduce, may cause
consumers to infections and diseases, which are then difficult to treat. Milk is therefore necessary to
pasteurize, because pasteurization is good for inactive of coliforms bacteria.
Acknowledgement
This work has been supported by grant of VEGA 2/0012/08 and KEGA 430-014SPU-4/2010.
References
BÍREŃ, J. 2004. Aktuálna legislatíva v oblasti hygieny mlieka. In Mliekárstvo, vol. 35, 2004, no. 1, p.
33-35. ISSN 1210-3144.
BOBKOVÁ, A. - ZELEŅÁKOVÁ, L. - LOPAŃOVSKÝ, L. - PAVELKOVÁ, A. et al. 2008.
Hodnotenie mikrobiologicke kvality smotanových jogurtov. In Bezpeĉnosť a kontrola potravín:
zborník prác z medzinárodnej vedeckej konferencie I. diel. Nitra: Slovenská poľnohospodárska
univerzita, 2008, p. 33-37.
CARO, I. - MATEO, J. - GARCIA-ARMESTO, M. R. 2007. Phenotypical characteristics of Shigalike
toxin Escherichia coli isolated from sheep dairy products. In Lett. Appl. Microbiol. vol. 45, 2007 p.
295–300.
CLSI. 2004. CLSI/NCCLS M44S1 Zone Diameter Interpretive Standards and Corresponding Minimal
Inhibitory Concentration (MIC) Interpretive Breakpoints. Infomational Supplement, M44-S1, First
Edition, Clinical and Laboartory Standards Institute, Wayne, USA, 2006.
ĈÍŅEK, A. - DOLEJSKÁ, M. - NOVOTNÁ, R. - HAAS, D. - VYSKOĈIL, M. 2007. Survey of Shiga
toxigenic Escherichia coli O157 and drug-resistant coliform bacteria from in-line milk filters on dairy
farms in the Czech Republic. In J. Appl. Microbiol. vol. 104, 2007, p. 852–860.
117
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
DUPONT, H.L. - WEST, H. - EVANS, D.G. - OLARTE, J. - EVANS, D.J. 1978. Antimicrobial
susceptibility of enterotoxigenic Escherichia coli. In Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 4,
1978, p. 100-102.
EFSA. 2008. Foodborne antimicrobial resistance as a biological hazard. In Draft Scientific Opinion of
the Panel on Biological Hazards (Question No EFSA– Q-2007- 089). Draft endorsed on 6 March
2008.
EUCAST. 2010. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Eucast disk diffusion
test: breakpoint tables v1.1, April 27, 2010. Available on the internet: <
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_documents/EUCAST_bre
akpoints_v1.1.pdf>.
FARZANA, K. - AKHTAR, S. - JABEEN, F. 2009. Prevalence and antibiotic resistance of bacteria in
two ethnic milk based products, In Pak. J. Bot., vol. 41, 2009, no. 2, p. 935 – 943.
HAVLOVÁ, J. - JIĈINSKÁ, E. - HRABOVÁ, H. 1993. Mikrobiologické metódy v kontrole jakosti
mléka a mlékarenských výrobku. Praha: ÖZPI, 1993, 243 p. ISBN 80-85120-37-2.
KHARAZMI, Y. - HAMMES, W. P. - HERTELl, C. 2002. Construction of a marker rescue system in
Bacilus subtilis for detection of horizontal gene transfer in food. In Syst. Appl. Microbiol., vol. 25,
2002, no. 3, p.471-477.
LADO, B. - YOUSEF, A. 2002. Alternative foodpreservation technologies: efficacy a mechanisms. In
Microbes and Infection. vol. 4, 2002, no. 6, p. 433-440.
LIRA, W. M. - MACEDO, C. - MARIN, J. M. 2004. The incidence of Shiga toxin-producing
Escherichia coli in cattle with mastitis in Brazil. In J. Appl. Microbiol. vol. 97, 2004, p. 861–866.
MCMAHON, M. A. S. - BLAIR, I. S. - MOORE, J. E. - Mc DOWELL, D. A. 2007. The rate of
horizontal transmission of antibiotic resistence plasmids is increased in food preservation-stressed
bacteria. In J. Appl. Microbiol., vol. 10, 2007, no. 3, p. 1883- 1888.
PICOZZI, C. - FOSCHINO, R. - HEUVELINK, A. - BEUMER, R. 2005. Phenotypic and genotypic
characterization of sorbitol-negative or slow-fermenting (suspected O157) Escherichia coli isolated
from milk samples in Lombardy region. In Lett. Appl. Microbiol. vol. 40, 2005, p. 491–496.
SOLOMAKOS, N. - GOVARIS, A. - ANGELIDIS, A. S. - POURNARAS, S. - BURRIEL, A.R. KRITAS, S. K. - PAPAGEORGIOU, D. K. 2009. Occurrence, virulence genes and antibiotic
resistance of Escherchia coli O157 isolated from raw bovine, caprine and ovine milk in Greece. In
Food Microbiology, vol. 26, 2009, p. 865-871.
Contact address
Ing. Lukáń Hleba, Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská
poľnohospodárska univerzita, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
 [email protected]
118
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ANTIBIOTIC RESISTANCE OF UBIQUITOUS BACTERIAL CENOSE ISOLATED
FROM RECTAL SWABS OF CHICKEN
HLEBA Lukáń, KAČÁNIOVÁ Miroslava, POCHOP Jaroslav, NOVÁKOVÁ Ivana,
ANGELOVIČOVÁ Mária*, KUNOVÁ Simona*
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Katedra Mikrobiológie, Tr. Andreja Hlinku 2, 949 76
Nitra, Slovakia
*
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Katedra hygieny a bezpeĉnosti potravín, Tr.
Andreja Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
Abstract
The aim of this study was to identified antibiotic resistance of ubiquitous bacterial cenose isolated
from rectal swabs of chicken. The cultivation was done on a selective agars, for Enterobacteriaceae
genera we used MacConkey agar and for Enterococcus spp. we used Slanetz-Bartley agar. Antibiotic
susceptibility testing was done on the Muller-Hinton agar with this antibiotics: Streptomycin (S 10),
Tetracycline (TE 30) and Ampicillin (AMP). For identification of this microorganisms we used
ENTERO-test for Enterobacteriaceae genera and ENCOCCUS-test for Enterococcus spp. In this
study, we determine that the highest resistance in Enterococcus spp. was to Streptomycin (86.66 %).
The lowest resistance was to Tetracycline (46.66 %). We found Enterococcus faecium which resistant
to Ampicillin and Tetracycline and Enterococcus casseliflavus which was resistant to Ampicillin by
ENCOCCUS-test. In Enterobacteriaceae genera the highest resistance was to Tetracycline (80.00 %).
The lowest resistance in this genera was to Ampicillin (0.00 %). From this genera, we found
Enterobacter cloacae, Escherichia coli and Raoultella ornithinolytica which resistant to Streptomycin
and Tetracycline. The use of antibiotics in commercial livestock increases resistance of bacteria
against antibiotics. The results show that the bacteria can transfer resistance genes and their sporead
not only in vertical but also horizontal way. Monitoring of resistance bacteria, we can track the
presence of antibiotic use and choose the right antibiotic for treating diseases.
Key words: Antibiotic resistance, Enterobacteriaceae genera, Enterococcus spp., chicken
Introduction
Enterococcus are ubiquitous Gram-positive and Enterobacteriaceae genera bacteria are Gramnegative and that can be found in soil, food, and water while making up a significant portion of the
normal gut flora of humans and animals (Murray, 1990). As some other bacteria of the gut cenose,
Enterococcus spp. and Enterobacteriaceae are implicated in infectious diseases. They can cause
urinary tract, intra-abdominal and pelvic infections, bacteremia, wound and tissue infections, and
endocarditis (Kayser, 2003). The resistance of microorganisms to antibiotics is considered to be the
major international public health problem and involves the fields of both human and veterinary
medicine. It has been widely demonstrated that the use of antibiotics in animals can lead to the
selection of resistant strains that colonize the intestines and are subsequently excreted, which may lead
to contamination of the environment and of meats destined for human consumption (Nováková et.al.,
2009). Endogenous bacterial cenose may play an important role as acceptor and donor of transmissible
drug resistance genes (Davis, 1994; Sunde et.al., 1998). These microorganisms and their possible
resistance determinants may be transmitted to humans if these foods are improperly cooked or
otherwise mishandled (Bongers et.al., 1995; London et.al., 1994; Nijsten et.al., 1996).
The objective of our study was to determine and compare antibiotic resistance in ubiquitous
bacterial cenose isolated from rectal swabs of chicken. Also determine species of ubiquitous bacteria
from endogenous tract of chicken.
119
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Material and methods
Antibiotics resistance study was done on Enterococcus spp. and Enterobacteriaceae isolated
from rectal swabs of chicken. The bacterial strains were isolated from rectal swabs collected with a kit
containing the swab (Copan Inovation, Brescia) and the transport in medium to laboratory. For
cultivation of Enterococcus spp. Slanetz-Bartley agar (Biomark, Pune) and for Enterobacteriaceae
Mac Conkey agar (Biomark, Pune) was used. Cultivation of these microorganisms was done during 24
hours for Enterobacteriaceae and 48 hours for Enterococcus spp. at 37 ± 1°C. The pure colonies were
recultivation at the same conditions. The inoculum of Enterobacteriaceae and Enterococcus spp.
strains was prepared by suspending of colonies from agar plates and the suspension was adjusted to
equal a 0.5 McFarland standard. The sensitivity of all isolates was tested against: Streptomycin (S 10)
10µg/disk, Tetracycline (TE 30) 30 µg/disk and Ampicillin (AMP) 10µg/disk. We used disk diffusion
methods (according to CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI). The incubation of
strains with antibiotic disks was done on the Mueller-Hinton agar at the 37 ± 1°C. The interpretation
of inhibition zones around the disk was according to CLSI 2004 Performance standards for
antimicrobial susceptibility testing. The inhibition zones were controlled with reference strains
Escherichia coli ATCC 25922 and Enterococcus faecalis ATCC 29212. Identification of strains was
done by ENTEROtest 24 (Pliva, Lachema) and EN-COCCUStest (Pliva, Lachema).
Results and discussion
We studied antimicrobial drug resistance in commensal Enterobacteriaceae genera and
Enterococcus spp. strains, which are considered a potentional reservoir for resistance genes in farms
animal. On-farm reservoirs of resistant bacteria provide a potentional source for resistance gene
transfer between bacteria as well as an environment for dissemination to new animals, environments
and food products. Therefore, identifying these reservoirs and mechanisms of persistance will be a key
to reducing the load of resistant bacteria in everywhere.
In our study, we identified resistant Enterobacteriaceae genera and Enterococcus spp. strains to
antibiotics. Enterococcus spp. were the following results. The highest resistance was 86.66 % to S 10.
The lowest resistance was 46.66 % to TE 30. The highest susceptibility was 53.33 % to TE 30 and the
lowest susceptibility was 13.33 % to S 10. The other results are shown in figure 1.
Figure 1 Antibiotic resistance profile of Enteroccus spp. isolated from rectal swabs of
chicken
In this samples, we identified two strains, which were resistant to antibiotics we were used. We
found Enterococcus faecium and Enteroccus casseliflavus. Enterococcus faecium was resistant to
Ampicillin and Tetracycline. The similar results were A. Kasimoglu-Dogru et al. (2010) worth 39 %
of resistant Enterococcus faecium to Tetracycline. Enterococcus casseliflavus was resistant to
Ampicillin.
120
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Table 1 Identified resistance strains of Enterococcus spp. isolated from rectal swab of chicken
Strains
Enterococcus faecium
Enterococcus casseliflavus
Resistance to
Ampicillin, Tetracycline
Ampicillin
Enterobacteriaceae genera were the following results. The highest resistance was 80.00 % to TE
30. The lowest resistance was 0.00 % to AMP. The highest susceptibility was 100.00 % to AMP. The
lowest susceptibility was 6.66 % to TE 30. The intermediate resistance was 13.33 % to TE 30 only.
Different results achieved J.M. Miranda et al. (2007) in their work. Resistance to Ampicillin was 48.30
% and susceptibility was 35.00 %. The other results are shown in figure no.2.
Figure 2 Antibiotic resistance profile of Enterobacteriaceae genera isolated from rectal swabs
of chicken
In this samples, we identified three strains, which were resistant to antibiotics we were used. We
found Enterobacter cloacae, Escherischia coli and Raoultella ornithinolytica. J.M. Miranda et al.
(2007) in their work indicated the similar species like in our work. For example, Enterobacter spp. (11
%) and Escherischia spp. (5 %).
Enterobacter cloacae was resistant to Streptomycin and
Tetracycline. Escherischia coli was resistant to Streptomycin and Tetracycline. Raoultella
ornithinolytica was resistant to Streptomycin and Tetracycline too.
Table 2 Identified resistance strains of Enterobacteriaceae genera isolated from rectal swabs
of chicken
Strains
Enterobacter cloacae
Escherischia coli
Raoultella ornithinolytica
Resistance to
Streptomycin, Tetracycline
Streptomycin, Tetracycline
Streptomycin, Tetracycline
Conclusion
The use of antibiotics in commercial livestock increases resistance of bacteria against
antibiotics. We are create resistant strains, which causes the diseases. Such diseases are difficult to
treat. The results show that the bacteria can transfer resistance genes and their spread not only in
vertical but also horizontal. Monitoring of resistance bacteria, we can track the presence of antibiotic
use and choose the right antibiotic for treating diseases. Though, antibiotic resistance is very different
between strains and different from study to study.
121
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Acknowledgement
This work has been supported by grant of VEGA 2/0012/08 and KEGA 430-014SPU-4/2010.
References
BONGERS, J.H. - FRANSSEN, F. - ELBERS, A. R. W. - TIELEN, M. J. M. 1995. Antimicrobial
resistance of Escherichia coli isolates from the faecal flora of veterinarians with different professional
specialties. In Ve.t Q., vol. 17, 1995, p. 146–149.
CLSI. 2004. CLSI/NCCLS M44S1 Zone Diameter Interpretive Standards and Corresponding Minimal
Inhibitory Concentration (MIC) Interpretive Breakpoints. Infomational Supplement, M44-S1, First
Edition, Clinical and Laboartory Standards Institute, Wayne, USA, 2006.
DAVIES, J. 1994. Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes. In Science,
vol. 264, 1994, p. 375-382.
KASIMOGLU-DOGRU, A. - GENCAY, Y.E. - AYAZ, N.D. 2010. Prevalence and antibiotic
resistance profiles of Enterococcus species in chicken at slaughter level: absence of vanA and vanB
genes in E. faecalis and E. faecium. In Researche in Veterinary Science, 2010.
KAYSER, F.H. 2003. Safety of enterococci from the medical point of view. In International Journal
of Food Microbiology, vol. 88, 2003,p. 255–262.
LONDON, N. - NIJSTEN, R. - VAN DEN BOGAARD, A. - STOBBERINGH, E. 1994. Carriage of
antibiotic-resistant Escherichia coli by healthy volunteers during a 15-week period. In Infection, vol.
22, 1994, p. 187–92.
MIRANDA, J.M. - GUARDDON, M. - VÁSQUEZ, B.I., et al. 2008. Antimicrobial resistance in
Enterobacteriaceae strains isolated from organic chicken, conventional chicken and conventional
turkey meat: A comparative survey. In Food Control, vol. 19, 2008, p. 412 – 416
MURRAY, B.E. 1990. The life and times of Enterococcus. In Clinical Microbiology Reviews, vol. 3,
1990, p. 46-65.
NIJSTEN, R. - LONDON, N. - VAN DEN BOGAARD, A. - STOBBERINGH, E. 1996. Antibiotic
resistance among Escherichia coli isolated from faecal samples of pig farmers and pigs. In Journal of
Antimicrobial Chemotheraphy, vol. 37, 1996, p. 1131–1140.
NOVÁKOVÁ, I. - KAĈÁNIOVÁ, M. - HAŃĈÍK, P. - PAVLIĈOVÁ, S. - HLEBA, L. 2009. The
resistance to antibiotics in strains of E. coli and Enterococcus sp. isolated from rectal swabs of lambs
and calves. In Lucřari stiintifice Zootehnie si Biotehnologii, vol. 42, 2009, p. 322-326.
SUNDE, M. - FOSSUM, K. - SOLBERG, A. - SORUM, H. 1998. Antibiotic resistance in Escherichia
coli of the normal intestinal flora of swine. In Microbial Drug Resistant, vol. 4, 1998, p. 289-299.
Contact address
Ing. Lukáń Hleba, Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská
poľnohospodárska univerzita, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
 [email protected]
122
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ENVIRONMENTÁLNY STRES A JEHO VPLYV NA ŃTRUKTÚRU PEČENE
ZVIERAT
THE EFFECT OF ENVIRONMENTAL STRESS ON ANIMAL LIVER
HOLOVSKÁ Katarína jr., ALMÁŃIOVÁ Viera, CIGÁNKOVÁ Viera
Ústav histológie a embryológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, 041
81 Košice, Slovenská republika
Abstract
The civilization advances and growing environmental pollution bring the effect of various xenobiotics
on the functioning of the living organism. The liver is a multifunctional organ that plays an essential
role in detoxification. In the present study we investigated the effect of two xenobiotics on the
structure of the liver. The experimental animals were exposed to cadmium (Cd) and bendiocarb, and
liver injury was evaluated in hematoxylin-eosine stained sections. Each of the chemicals is
metabolized in a different manner. Cd-induced structural changes in the turkey‟s liver included focal
necrosis, hyperemia, and accumulation of inflammatory cells in the sinusoids. The rabbits were
exposed to bendiocarb, which caused congestion, inflammatory infiltration including granulocytes and
lymphocytes, which were scattered throughout the parenchyma. The hepatocytes contained lipid
droplets, which in some cells caused the change of the shape of nuclei.
Key words: liver, light microscopy, rabbit, turkey, xenobiotics
Úvod
Rozsiahle pouņívanie chemických látok v rastlinnej a ņivoĉíńnej výrobe prináńa okrem kladov aj
riziko akútnych alebo chronických intoxikácií zvierat. Prostredníctvom potravového reťazca
predstavujú tieto látky riziko aj pre zdravie ľudí. Do organizmu sa môņu dostať potravou, vodou alebo
vzduchom, ktoré sú nimi kontaminované. Kadmium (Cd) je toxický prvok, ktorý je prítomný v pôde,
vo vode a vo vzduchu. Jeho riziko je v tom, ņe sa v organizme kumuluje a vyluĉuje sa len veľmi
pomaly. Pôsobí na mnohé orgány, ale najviac sa koncentruje v obliĉkách a peĉeni (Massányi et al.,
2003; Kramárová et al., 2005).
Medzi kontaminanty ņivotného prostredia patria aj insekticídy. Bendiocarb (2,2 – dimetyl – 1,3
– benzodioxol – 4 –yl – N – metylkarbamát) je insekticíd karbamátovej rady, ktorý sa v nańich
podmienkach pouņíva na ochranu kukurice, cukrovej repy, kŕmnej repy, maku, zemiakov, okrasných
rastlín. Bendiocarb (resp.bendiokarbamát) podobne ako ostatné karbamáty, spôsobuje reverzibilnú
inhibíciu acetylcholínesterázy (AChE) (Bendiocarb, 1982).
Peĉeņ, orgán s vysokou metabolickou a detoxikaĉnou aktivitou, je ĉasto pońkodzovaná
chemickými látkami. Tieto látky ju môņu pońkodzovať priamo, alebo prostredníctvom ich
metabolitov, ktoré v niektorých prípadoch môņu byť toxickejńie, ako pôvodná chemická látka.
Vplyvom chemických látok ĉasto dochádza k zápalovému procesu v postihnutom orgáne. Zápal
peĉene je spojený so zvýńeným výskytom reaktívnych foriem kyslíka (ROS), ktoré sa uvoľņujú
z aktivovaných Kupfferových buniek (Malhi et al., 2006). Bunky imunitného systému uvoľņujú
cytokíny, chemokíny, ROS a iné látky, ktoré na jednej strane podporujú reparaĉné procesy v tkanive,
ale na druhej strane môņu zhorńiť pońkodenie orgánu (Schwabe a Brenner 2006).
Cieľom nańej práce bolo sledovať morfologické zmeny v peĉeni morky a králika po podaní
chemických látok - kadmia a bendiokarbamátu.
Materiál a metodika
1. Do pokusu s kadmiom bolo zaradených 18 moriek plemena BIG - 6 vo veku 35 dní. Zvieratá
boli kŕmené najprv kŕmnou zmesou HYD 14 a od 9. týņdņa ņivota HYD 15. Dva týņdne pred
skonĉením experimentu boli zvieratá kŕmené kŕmnou zmesou HYD 16. Po 30 dņovej aklimatizácií
boli zvieratá rozdelené do kontrolnej a experimentálnej skupiny (skupina Cd). Morkám bolo podávané
kadmium vo forme vodného roztoku CdCl2 (0,5 mg.kg-1 krmiva) po dobu 71 dní (Nać et al., 2008).
123
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
2. V experimente s bendiokarbamátom boli pouņité klinicky zdravé králiky, hybrid Hyla (1,5 –
3,5 kg ņ.h.) vo veku 50 dní. Kontrolná skupina bola kŕmená ńtandardnou diétou Norm - typ-0-10
(BIOFER r. ĉ. 7313/A). Experimentálnej skupine, kŕmenej rovnakou kŕmnou zmesou, bol per os
podávaný bendiokarbamát v dávke 5 mg/kg ņ. h./deņ poĉas 13 dní a v ćalńích dņoch rovnaká dávka
kaņdý druhý deņ. Experimentálne zvieratá (n = 5) boli usmrtené na 30. deņ experimentu. Pri
manipulácií a pokuse so zvieratami boli dodrņané zásady etiky .
Svetelná mikroskopia (SM)
Vzorky na svetelnú mikroskopiu z oboch experimentov boli fixované v 4% neutrálnom
formaldehyde a zaliate do parafínu. Histologické rezy 5 – 7 μm boli ofarbené hematoxylín – eozínom
(H – E), montované do Entelanu a fotografované svetelným mikroskopom Jenamed.
Výsledky a diskusia
Hepatocyty tvoria 70-80 % celkového objemu peĉene. Podieľajú sa na syntéze a skladovaní
proteínov, premene cukrov, syntéze cholesterolu atć. Majú rozhodujúcu funkciu pri detoxikácii a
exkrécii cudzorodých látok. Tie sú v peĉeni metabolizované a inaktivované rôznymi chemickými
procesmi. Niekedy pri týchto premenách môņu vznikať metabolity so silnejńím toxickým úĉinkom ako
mala pôvodná látka.
Morky: V kontrolnej skupine moriek bol parenchým peĉene tvorený sieťou krvných sínusoidov
a trámcami hepatocytov, ktoré tvorili dva rady buniek. Ńtyri aņ ńesť hepatocytov bolo usporiadaných
okolo centrálne uloņenej ņlĉovej kapiláry. Tieto hepatocyty mali pribliņne pyramídový tvar. Ich
rozńírená ĉasť - vaskulárny pól smeroval do perivaskulárneho priestoru a zúņená ĉasť - biliárny pól
tvoril stenu ņlĉovej kapiláry. Bunky mali okrúhle, euchromatické jadrá posunuté k vaskulárnemu pólu.
Perivaskulárne priestory boli ńiroké a nepravidelné.
Kadmium sa po absorbovaní v ĉrevách alebo pľúcach dostáva najmä do výdatne krvených
orgánov, ako sú peĉeņ a obliĉky. Kadmium, ktoré sa podávalo prepeliciam spôsobovalo ńtrukturálne
zmeny na epitelových bunkách ĉrevných klkov a krýpt duodena (Almáńiová et al., 2009), ako aj
v kanálikoch obliĉiek (Kimáková et al., 2005), reprodukĉných orgánoch (Lukaĉinová et al., 2008)
a centrálnom nervovom systéme (Petrovová et al., 2009). V nańich pokusoch sme sledovali jeho vplyv
na ńtruktúru peĉene. Pozorovali sme silnú hyperémiu parenchýmu, sprevádzanú zápalovým
infiltrátom, ktorý tvorili granulocyty a lymfocyty. Pozorovali sme aj drobné nekrotické loņiská so
zmenenými hepatocytmi. Bunky strácali svoj pôvodný tvar, boli zväĉńené, s centrálne uloņeným
jadrom.
Králiky: V kontrolnej skupine mal parenchým peĉene klasický morfologický obraz. Hepatocyty
boli usporiadané do trámcov, ktoré smerovali k vena centralis. Tieto trámce boli tvorené jedným
radom hepatocytov. Medzi trámcami boli krvné sínusoidy vystlané endotelovými bunkami. Jadrá
hepatocytov boli centrálne umiestnené, euchromatické, s výrazným jadierkom.
V experimentálnej skupine zvierat, ktorým sa podával bendiokarbamát po dobu tridsať dní, boli
pozorované zmeny v celom parenchýme peĉene. Krvné sínusoidy boli rozńírené s miernou
hyperémiou a s difúznym výskytom lymfocytov v krvných sinusoidoch. Postihnutý parenchým
obsahoval veľké mnoņstvo hepatocytov, ktoré obsahovali malé tukové kvapôĉky. V niektorých
hepatocytoch boli pozorované tukové kvapky, lokalizované v strede buniek. Spôsobovali zmenu tvaru
jadier, ktoré mali kosáĉikovitý vzhľad. Pozorovali sme aj dvojjadrové hepatocyty, ĉo svedĉí o
regenerácii postihnutého parenchýmu. Karbamáty sú rýchlo vyluĉované z tela a nekumulujú sa v
tkanivách cicavcov. Aj napriek ich rýchlemu vyluĉovaniu sme pozorovali výrazné zmeny v
parenchýme peĉene, ktoré mohli vzniknúť priamo úĉinkom bendiokarbamátu, alebo vplyvom jeho
metabolitov. Viacerí autori uvádzajú, ņe toxický úĉinok insekticídov, cyklických organických
zlúĉenín, spoĉíva vo zvýńenej tvorbe ROS (Danko et al., 2005; Munglang et al., 2009; Sobeková et al.,
2009). Kećņe bendiokarbamát a jeho metabolity majú heterocyklickú ńtruktúru, je predpoklad vzniku
ROS.
Záver
Cudzorodé látky spôsobovali morfologické zmeny v peĉeni zvierat a to buć priamo, alebo
nepriamo úĉinkom ich metabolitov. Nekrotické loņiská boli pozorované len u zvierat, ktorým sa
podávalo kadmium. V obidvoch prípadoch sme pozorovali hyperémiu so zápalovým infiltrátom
v krvných sínusoidoch. Zápal ktorý vyvolávajú, je spojený s uvoľņovaním cytokínov,
124
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
interleukínov, TNFα a i. Uvedené látky spôsobujú proliferáciu hepatocytov, stimulujú produkciu
superoxiddismutázy, ale taktieņ aktivujú neutrofily, ktoré uvoľņujú ROS. Uvoľnené cytokíny,
chemokíny a ROS na jednej strane podporujú reparaĉné procesy v peĉeni, ale pri ich dlhodobom
pôsobení dochádza k proliferácii spojivového tkaniva (Ramadori et al., 2008).
Literatúra
ALMÁŃIOVÁ, V. – HOLOVSKÁ, K. jr. – LENHARD, Ľ. - CIGÁNKOVÁ, V. 2009. Ńtruktúra a
ultrańtruktúra enterocytov japonskej prepelice po perorálnej aplikácii kadmia. Ĉrevná bariéra zvierat
a alternatívne metódy jej ovplyvňovania. 25. jún 2009, Końice : Univerzita veterinárskeho lekárstva, s.
4-5.
DANKO, J. – LEŃNÍK, F. – JENĈA, A. et al. 2005. Xenobiotiká vo vzťahu ku zdraviu. Końice :
Univerzita veterinárskeho lekárstva, ISBN 80-8077-015-8.
BENDIOCARB,
C.O.
Pesticide
residues
in
food:
1982
evaluations,
file:
//E:\Lymfatic\legath\carbamates\bendiocarb.htm
KIMÁKOVÁ, T. – KORÉNEKOVÁ, B. – BERNASOVSKÁ, K. – SKALICKÁ, M. – NAĆ, P. –
PORAĈOVÁ, J. 2005. Study of the protective effect of selenium on organism of Japanese quail after
experimental exposure to cadmium. In Slov. Vet. J., 2005, vol. 31, p. 32.
KRAMÁROVA, M. – MASSÁNYI, P. – JANĈOVÁ, A. – TOMAN, R. – SLAMEĈKA, J. –
TATARECH, F. – KOVÁĈIK, J. – GAŃPARÍK, J. – NAĆ, P. – SKALICKÁ, M. – KORÉNEKOVÁ,
B. – JURĈÍK, R. – ĈUBOŅ, J. - HAŃĈÍK, P. 2005. Concentration of cadmium in the liver and
kidneys of some wild and farm animals. In Bull. Vet. Pulawy, 2005a, vol. 49, no. 4, pp. 465-469.
LUKAĈINOVÁ, A. – BEŅAĈKOVÁ, R. – LOVASOVÁ, E. – RÁCZ, O. – NIŃTIAR, F. 2008.
Reproduction parameters in low dose chronic exposure with heavy metals in rats. In Polish J. Environ.
Studies., vol. 17, 2008, p. 911.
MASSÁNYI, P. – TATARUCH, F. – SLAMĈEKA, J. – TOMAN, R. - JURÍK, R. 2003.
Accumulation of Lead, Cadmium, and Mercury in Liver and Kidney of the Brown Hare in Relation to
the Season, Age, and Sex in the West Slovakia Lowland. In J. Environ. Sci. Health, vol. 38, 2003, no.
7, pp. 1299-1309.
MALHI, H. - GORES, G.J. – LEMASTERS, J. 2006. Apoptosis and necrosis in the liver: A tale of
two deaths? In Hepatology, vol. 43, 2006, no. 2, pp. 31-44.
MUNGLANG, M. – NAGAR, M. – PRAKASH, R. 2009. Liver in carbaryl treated rats –
a morphological and morphometric study. In J. Anat. Soc. India, vol. 58, 2009, pp. 6-9.
NAĆ, P. – SKALICKÁ, M. – KORÉNEKOVÁ, B. – PISTL, J. 2008. Eliminácia toxických úĉinkov
kadmia na produkĉné zdravie hydiny esenciálnymi chemickými prvkami. In Ekológia a veterinárna
medicína VII [Ecology and veterinary medicine]:collected papers from international scientific
conference. Końice : UVL, 2008, s. 110-114.
PETROVOVÁ, E. – SEDMERA, D. – LEŃNÍK, F. - LUPTÁKOVÁ , L. 2009. Bendiokarb effect on
liver and central nervous system in chick embryo. In J. Environ. Sci. Health, Part B Pesticides, Food
Contaminations and Agricultural Wastes, vol. 44, 2009, no. 4, pp. 383-388.
RAMADORI, G. – MORICONI, F. – MALIK, I. – DUDAS, J. 2008. Physiology and pathophysiology
of liver inflammation, damage and repair.
http://www.jpp.krakow.pl/journal/archive/0808_s1/articles/05_article.html
SOBEKOVÁ, A. – HOLOVSKÁ, K. – LENÁRTOVÁ, V. – FLEŃÁROVÁ, S. – JAVORSKÝ, P.
2009. The another toxic effect of carbamate insecticides. In Acta Biologica Hungarica, vol. 60, 2009,
no. 1, pp. 45-54.
SCHWABE, R.F. – BRENNER, D.A. 2006. Mechanisms of liver injury. I. TNF-α-induced liver
injury: role of IKK, JNK, and ROS pathways. In Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., vol. 290,
2006, pp. 583-859.
Kontaktná adresa
Östav histológie a embryológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, 041
81 Końice, Slovenská republika
 [email protected]
125
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
PESTICIDES IN CEREALS AND BABY FOOD AS A FOOD CHAIN RISK FACTOR
CHODKOWSKA Eliza M., JEDRAL Szczepan, ŚWIATEK Bernadetta, ZACHARA Alicja
Department of Food Chemistry and Toxicology, Faculty of Biology and Agriculture, Rzeszów
University, ul. Ćwiklińskiej 2, 35-601 Rzeszów, Poland
Abstract
Broadly-considered food safety became in recent period one of the main problems of modern societies
touching with its impact both developed, developing and underdeveloped countries. A considerable
increase of population implies the usage of synthetic chemicals in agricultural production, these are
aimed to fight against the pest and what follows, a improvement of food yield obtained. On the other
side, numerous investigation show a danger linked to many chemical compounds applied for plant
cultivation, and the consumer who are more and more conscious of that danger reveal more concern
about the way of production of food which they purchase. That is why both a control of individual
pesticides content in food and the informing of potential consumers about real risks are important.
This paper has been created to demonstrate the results of standard control of pesticides content in
cereals and baby food, and the results comprise five following years, from 2005 to 2009. The samples
of food underwent chromatographic analysis according to Polish standards and the investigation was
carried out in Rzeszow Epidemiological and Sanitary Station. The results were presented in a form of
tables which show the content of respective pesticides in samples investigated. The analysis conducted
show that, although the offence of maximum residue levels happens relatively rarely, in some samples
a detectable presence of pesticides was noticed. Owing to the fact, that the European Union directives
concerning maximum pesticides residue level in food nearly every year undergo corrections to
diminish acceptable concentration of those compounds, even a small content of a pesticide seems a
factor which could potentially discourage the customer and suggest a lower quality of a product.
Key words: pesticides, food contamination, food analysis, pesticides in food, regulations on pesticides
content in food, Rzeszów Epidemiological and Sanitary Station
Introduction
According to the Food and Agriculture Organization (FAO) of the United Nations pesticides are
defined as „any substance or mixture of substances intended for preventing, destroying or controlling
any pest, including vectors of human or animal disease, unwanted species of plants or animals causing
harm during or otherwise interfering with the production, processing, storage, transport or marketing
of food, agricultural commodities, wood and wood products or animal feedstuffs, or substances which
may be administered to animals for the control of insects, arachnids or other pests in or on their
bodies. The term includes substances intended for use as a plant growth regulator, defoliant, desiccant
or agent for thinning fruit or preventing the premature fall of fruit, and substances applied to crops
either before or after harvest to protect the commodity from deterioration during storage and transport
(Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2003).
The compounds which meet the conditions listed above apart from a positive impact on
agricultural production efficiency may influence negatively human health which may touch both food
producers and food consumers. Owing to this reason a permanent control of pesticides content in food
is practiced in most of developed and developing countries of the world. A standard food control
performed in Rzeszow Epidemiological and Sanitary Station enables to detect 28 commonly used
pesticides in food samples which undergo analysis and each year analytical procedures are enriched
with new methods permitting a detection of new chemical agents which could potentially be
introduced into alimentary products.
During last five years of standard food control several organochlorine pesticides have been
detected both in cereals and baby food: in cereals aldrin, chlorothalonil, dieldrin, HCH and heptachlor
were found, while some baby food samples contained chlordane, DDT, HCH and heptachlor. Aldrin
and one of the products of its degradation- dieldrin- insecticides introduced into agricultural industry
in the fifties of XX century may cause damages of liver, central nervous system, immune system as far
126
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
as disorders in functioning of endocrine system and mayhave adverse effects on embryos growth
(Stevenson et al., 2009). Then, chlorothalonil is included by U.S. Environmental Protection Agency
(U.S. EPA) into B1 group which comprises probable carcinogens, while International Agency for
Research on Cancers (IARC) included that pesticide into likely carcinogens belonging to 2B group
(Mozzachio et al., 2008). Another organochlorine pesticide, chlordane may cause damages of central
nervous system, circulatory system and gastrointestinal system (U.S. Environmental Protection
Agency, 1987), while in the eighties of XX century it was included to the list of potential carcinogens
(National Institute for Occupational Safety and Health, 1981-1986). DDT, currently being banned in
most of the countries of the world generates serious disorders in circulatory system and respiratory
system functioning, it has been also proven that it may be a reason for appearance of liver and bile
ducts cancers as far as of leukemia and multiple myeloma (Cocco et al., 1997).Then, HCH, according
to some research show an association with breast cancer occurrence in women population (Hoyer et
al., 1998) and it has been placed on U.S. EPA list as a probable carcinogen (http://www.epa.gov).
Another probable carcinogen according to U.S. EPA is heptachlor which additionally may have
adverse effects on skin, liver, connective tissue and embryos (U.S. Environmental Protection Agency,
1988).
In cereals which underwent investigation also pesticides belonging to carbamates group were
detected- they were aldicarb, methiocab and methomyl, while in baby food methomyl was found.
Aldicarb may have a negative impact on endocrine system and nervous system, because of its ability
to inhibit enzymes from cholinesterase group. Then, methiocarb may act negatively on reproductive
and nervous systems. Methomyl, similarly to two former pesticides blocks cholinesterases and as a
subsequence influences in an adverse way nervous system, also its negative inreactions in endocrine
and reproductive systems have been suggested (http://www.pesticideinfo.org).
Thiabendazole, which belongs to pesticides from benzimidazole group was detected both in
cereals and baby food which underwent investigation. U.S. EPA classifies thiabendazol as a
compound which can possibly show carcinogenic properties if the amounts introduced into organism
are high enough to influence the equilibrium of thyroid hormones excretion. Some sources suggest a
possibility of thiabendazole negative impact on reproductive system and embryos development
(http://www.pesticideinfo.org).
Imidacloprid belongs to chlorinated derivatives of nicotine. It was detected in baby food while
investigated, however it did not appear in cereals. Even if till now no negative impact of this pesticide
on nervous, endocrine and reproductive systems has been showed, and no connection between
exposition to imidacloprid and occurrence of embryos defects and cancers has been proven, several
investigations carried out on animals suggest a possibility of association of the pesticide intake and
increased cholesterol level in blood as far as disruption of liver functioning (Federal Register, 1995).
The monitoring of pesticides and their degradation products in foodstuff is supposed to serve the
estimation of the hazard level for a given population. Poland has participated in European system of
pesticides‟ monitoring in food since 2004 and the determination of those substances is being
performed as a part of food controlling system- the alimentary products present on the market cannot
contain more pesticide than the amount which equals maximum residue level of a pesticide. From 1st
September 2008 maximum residue levels of pesticides in food on Polish market undergo European
Community Commission Regulation no 149/2008 of 29th January 2008 (Official Journal of the
European Union, 2008) with later changes concerning maximum residue levels of enlisted pesticides
or newly introduced ones as far as European Community Commission Directive no 125/2006 which
establishes maximum residue levels in baby food (Official Journal of the European Union, 2006).
Maximum residue levels for twelve pesticides detected in cereals and baby food from 2005 till 2009 in
Rzeszów Sanitary and Epidemiological Station are shown in table 1:
127
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Table 1 Maximum residue level of chosen pesticides in rice, wheat and baby food, while aldicarb is
aldicarb, its sulfoxide and its sulfone combined expressed as aldicarb, chlordane is cis- and transchlordane combined, DDT is p,p‟-DDT, o,p‟-DDT, p,p‟-DDE and p,p‟-TDE combined expressed as
DDT, dieldrin is aldrin and dieldrin combined expressed as dieldrin, HCH is α-HCH and β-HCH
combined expressed as HCH, heptachlor is heptachlor and heptachlor epoxide combined expressed as
heptachlor, methomyl is methomyl and thiodicarb combined expressed as methomyl.
Pesticide:
Aldicarb
Azoxystrobin
Chlordane
Chlorothalonil
DDT
Dicofol
Dieldrin
HCH
Heptachlor
Imidacloprid
Methiocarb
Methomyl
Thiabendazole
Maximum residue level in sample [mg/kg]:
rice
wheat
children food
0.05
0.05
0.01
5.00
0.30
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.10
0.01
0.05
0.05
0.01
0.02
0.02
0.01
0.01
0.01
0.003
0.02
0.02
0.01
0.01
0.01
0.003
0.05
0.10
0.01
0.10
0.10
0.01
0.02
0.02
0.01
0.05
0.05
0.01
Till 1st September 2009 the Directive of Health Minister of 4 July 2007 concerning maximum
residue levels of pesticides which may contaminate alimentary products or their surface was valid in
Poland. For the analyzed cereals maximum residue levels of aldicarb, inorganic bromides,
chlorothalonil, DDT, dieldrin, HCH, heptachlor and thiabendazole was the same as in Regulation of
29th January 2009. Maximum residue levels of chlordane and methomyl were higher in comparison to
current Regulation, while acceptable content of imidacloprid in those products was not listed.
Maximum residue levels of all those pesticides in baby food covered the current Directive, that is the
maximum residue level for all pesticides listed was 0.01 mg/kg, apart from two pesticides which
according to the law should not be used in agricultural production intended for the production of baby
food: dieldrin and heptachlor for which the acceptable content was established as 0.003 mg/kg (Dz.U.
no 119/2007). The former Directive of Health Minister of 16th April 2004 imposed the same
maximum residue levels and the way of expressing the total amount of aldicarb, bromide ion,
chlordane, chlorothalonil, DDT, dieldrin, HCH, heptachlor, imidacloprid, methiocarb, methomyl and
thiabendazole, that is all pesticide being a subject of this paper (Dz.U. no 85/2004).
Materials and methods
The investigation was carried out in Rzeszów Sanitary and Epidemiological Station as a part of
a standard food control in the years 2005-2009. The purpose of analysis was to determine the
pesticides residues in cereal and baby food samples and referring them to the directive valid in a given
period. The total number of investigated cereal and baby food samples was 359, including 105
samples of rice, 55 samples of wheat and 199 samples of baby food, 71 of those samples were
analyzed in 2005, 76 in 2006, 75 in 2007, 70 in 2008 and 67 in 2009. The samples of wheat and baby
food were of Polish origin and rice was imported. Organochlorine pesticides in the samples
investigated: chlordane, chlorothalonil, DDT, dicofol, dieldrin, HCH and heptachlor were analyzed
according to Polish standards: PN-EN 12393-3: 2008 p.4 and PN-EN 12393-2: 2008 p.7 and former
standards PN-EN 12393-2: 2000 p.7 and PN-EN 12393-3: 2000 p.4 with the use of gas
chromatography with electron capture detector. Carbamate pesticides in the samples investigated:
aldicarb, methiocarb and methomyl were analyzed according to Polish standard: PN-EN 14185-1:
2004 with the use of high performance liquid chromatography with fluorescence detector. Benomyl
grup pesticides: imidacloprid and thiabendazole content was analyzed according to Polish standards
PB/HŻ-12, fourth edition of 05.09.2007 and PB/AI-16, third edition of 05.09.2007 and former
128
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
standards: PB/HŻ-12, second edition of 03.04.2006, PB/AI-16, second edition of 09.03.06, PB/HŻ-12,
first edition of 06.11.2003 and PB/AI-16, first edition of 06.11.2003 with the use of high performance
liquid chromatography with UV/VIS detector. Bromide ion content was analyzed according to Polish
standard PN-EN 13191-2:2002 with the use of gas chromatography with electron capture detector.
Results and conclusions
Table 2 Content of pesticides in samples investigated in years 2005-2009
Year of
investigation
2005
2006
2007
2008
2009
Type of sample
Number of
samples
% of samples
containing
pesticides (+
bromide ion)
% of samples
containing
pesticides (bromide ion)
rice
wheat
baby food
rice
wheat
baby food
rice
wheat
baby food
rice
wheat
baby food
rice
wheat
baby food
20
13
38
23
10
43
24
12
39
19
10
41
19
10
38
10.0
100.0
0.0
13.0
0.0
18.6
4.2
16.7
2.6
10.5
0.0
0.0
47.4
0.0
7.9
10.0
100.0
0.0
13.0
0.0
18.6
4.2
16.7
2.6
5.3
0.0
0.0
0.0
0.0
7.9
Table 3 Pesticides detected in cereals and baby food investigated in years 2005-2009
Pesticide:
Aldicarb
Azoxystrobin
Bromide ion
Chlordane
Chlorothalonil
DDT
Dicofol
Dieldrin
HCH
Heptachlor
Imidacloprid
Methiocarb
Methomyl
Thiabendazole
2005
0
0
0
0
0
0
0
3
2
1
0
11
0
2
Number of samples with pesticides in the years:
2006
2007
2008
2009
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
1
9
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
1
2
0
0
0
3
0
0
0
2
0
0
0
2
0
0
1
1
0
0
0
2
In total
1
1
10
1
1
1
2
3
5
4
2
13
1
4
Table 2 shows content of pesticides with and without taking into consideration bromide ion in
cereals and baby food with division into five years, from 2005 to 2009. Bromide ion was regarded
particularly because of its considerably higher maximum residue level in food, which is a result of its
relatively lower hazard, in comparison to other agents comprised in this paper; it is not enlisted in any
129
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
of the registers including carcinogenic substances, as far as substances causing disruptions of
endocrine and reproductive system functioning, the amounts possibly introduced with food can neither
cause any negative impact on embryo‟s development. It should be however mentioned that it is very
often a decomposition product of more hazardous compounds which are used in production and
processing of food. The analysis which has been carried out shows that pesticides content in rice
samples examined in 2005-2009 (excluding bromine ion) undergoes a gradual decrease, in 2005 and
2006 the percentage of samples contaminated detectably with pesticides equaled respectively 10 and
13% of all samples, in 2007 and 2008 it decreased to 4.2 and 5.5% samples, while in last year of
analysis- 2009 no pesticide content was detected in rice samples. However, the evaluation which takes
into consideration bromide ion demonstrates an increase of its content in rice which starts in 2008, in
2009 that kind of contamination was recognized in 47.4% of all samples. The above can be a
consequence of a necessity to introduce into the market new pesticides, which do not belong to the
groups of compounds which undergo restrictive controls and decompose forming bromide ion. Wheat
investigated during last two years (2008-2009) did not show any detectable content of pesticides,
which seems a big advance from 2005 when all the examined wheat samples were contaminated with
that kind of compounds and 2007 when 16.7% of the samples contained pesticides. Pesticide
contamination of baby food was undergoing remarkable fluctuations during five years, but a recent
increase of the contaminated samples amount seems particularly alarming, it equaled 7.9% in 2009.
Table 3 shows in detail pesticides occuring in the food samples which were investigated in given years
of control performing. It seems positive that during two last years none of analyzed samples did not
contain any of particularly dangerous organochlorine pesticides, contaminations contained in the
samples were: aldicarb, bromide ion, imidacloprid and methomyl. The presence of aldrin was noted
for the last time in 2005, while chlordane, DDT, dicofol and heptachlor were detected for the last time
in 2006 and chlorothalonil and HCH in 2007. During last three years of investigation in no samples
methiocarb- which is a hazardous pesticide from benomyl group- was detected. The analysis carried
out confirms that a standard food control plays a positive role in eliminating of contaminated products
from alimentary market, however owing to occurrence of new agents designed to protect crops a
continuous investigation aimed to determine their impact on humans and animals as far as fitting
maximum residue levels to the results of that investigation are important.
References
COCCO, P. - BLAIR, A. - CONGIA, P. - SABA, G. - ECCA, A. R. - PALMAS, C. 1997. Long-term
health effects on the occupational exposure to DDT. A preliminary report, In Ann. New York Acad.
Sci., vol. 837, 1997, pp. 246-256.
Commission Directive (EC) No 141/2006 of 22 December 2006, In Official Journal of the European
Union, 2006.
Commission Regulation (EC) No 149/2008 of 29 January amending Regulation (EC) No 396/2005 of
the European Parliament and of the Council by establishing Annexes II, III and IV setting maximum
residue levels for products covered by Annex I. In Official Journal of the European Union, 2008.
Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2003. International Code of Conduct on the
Distribution and Use of Pesticide, Rome 2003, p. 6.
HOYER, A. P. - GRANDJEAN, P. - JORGENSEN, T. - BROCK J. W. - HARTVIG, H. B. 1998.
Organochlorine exposure and risk of breast cancer, In The Lancet, vol. 352, 1998, pp. 1816-1820.
Imidacloprid; Pesticide Tolerances, In Federal Register, vol. 60 (128), pp. 34943-34945.
http://www.cdc.gov/niosh
http://www.epa.gov
http://www.pesticideinfo.org
MOZZACHIO, A. M. - RUSIECKI, J. A. - HOPPIN, J. A. - MAHAJAN, R. - PATEL, R. - BEANEFREEMAN, L. - ALAVANJA, M. C., 2008. Chlorothalonil exposure and cancer incidence among
pesticide applicator participants in the agricultural health study, In Environmental Research, vol. 108,
2008, pp. 400-403.
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 16 kwietnia 2004 r. w sprawie najwyższych dopuszczalnych
poziomów pozostałości chemicznych środków ochrony roślin, które mogą znajdować się w środkach
spożywczych lub na ich powierzchni (DzU No 85, poz. 801, 2004)
130
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 16 maja 2007 r. w sprawie najwyższych dopuszczalnych
poziomów pozostałości pestycydów, które mogą znajdować się w środkach spożywczych lub na ich
powierzchni (DzU No 119, poz. 817, 2007).
STEVENSON, D. E. - WALBORG JR, E. F. - NORTH WARNER, D. - SIELKEN JR, R. L. - ROSS,
C. E. - WRIGHT, A. S. - XU, Y. - KAMENDULIS, L. M. - KLAUNIG J. E. 1999. Monograph:
Reassessment of human cancer risk of aldrin/dieldrin, In Toxicology Letters, vol. 109, 1999, pp. 123186.
UNEP, 2001. Conference of Plenipotentiaries on the Stockholm Convention on Persistent Organic
Pollutants. UNEP/POP/Conf/2, May 2001.
131
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ACUTE EFFECT OF NICKEL ON FEMORAL BONE STRUCTURE OF
LABORATORY RATS
CHOVANCOVÁ H.1, MARTINIAKOVÁ M.1, OMELKA R.2, TOMAN R.3
1
Department of Zoology and Anthropology, Constantine the Philosopher University, 949 74 Nitra,
Slovakia
2
Department of Botany and Genetics, Constantine the Philosopher University, 949 74 Nitra, Slovakia
3
Department of Veterinary Sciences, Slovak University of Agriculture, 949 76 Nitra, Slovakia
Abstract
This study was carried out in order to investigate the acute effect of nickel on compact bone tissue of
laboratory rats. Experimental animals (5-month-old laboratory rats, Wistar breed) were randomly
divided into two groups each containing 10 individuals. In the first group rats were intraperitoneally
injected with a single dose of 15 mg NiCl2.kg-1 body weigh. The second group without Ni application
served as a control. All animals were sacrificed 48 hours after starting of the treatment period and both
femora were used for macroscopic and microscopic analyses. Our results have shown that acute
intoxication of nickel has no significant effect on femoral weight and femoral length in rats. Also, we
did not identify any demonstrable differences in qualitative histological characteristics of the femora
between analysed groups, except for a decreased number of primary and secondary osteons observed
in nickel treated animals. On the other hand, the histomorphometric evaluation of the experimental
rat‟s bone revealed a statistically significant increase in all variables (area, perimeter, maximum and
minimum diameter) of the primary osteons' vascular canals, Haversian canals and secondary osteons
(P<0,05). These results clearly demonstrate that intraperitoneal application of nickel at the dose used
in this study had no effect on macroscopic structure of rat‟s femora. On the contrary, it significantly
affected the morphological structure of compact bone tissue in exposed animals.
Key words: nickel, laboratory rats, femur, histology
Introduction
Nickel (Ni) and nickel compounds are widely used in industry. The high consumption of nickel
products inevitably leads to occupational and environmental pollution (Zhao et al., 2009). Natural
source of atmospheric nickel is derived from volcanic emissions and the weathering of rocks and soils,
and natural source of aqueous nickel include biological cycles and solubilization of nickel compounds
from soils (Kasprzak et al., 2003). Drinking water and food are the main sources of exposure for the
general population (Barceloux, 1999).
Nickel may be both an essential micronutrient and a toxicant (Chowdhury et al., 2008), often
considered as a contaminant (He et al., 2005). In animals, nickel deficiency has been associated with
depressed growth, reduced reproductive rates, and alterations in glucose and lipid metabolism. This
metal is also important for proper functioning of the immune system (Alexandrova et al., 2006). The
results of Wilson et al. (2001) indicate that adding 25mg/kg of dietary nickel to a poultry diet should
improve broiler bone strength characteristics and performance.
On the other hand, excessive nickel intake to organism causes formation of free radicals in
various tissues in both human and animals. Consequently, these reactive oxygen species lead to
various modifications to DNA bases, enhanced lipid peroxidation, and altered calcium and sulphydryl
homeostasis (Das et al., 2008). In addition, depletion of glutathione and other endogenous antioxidants
may also contribute significantly to the development of Ni-induced toxicity oxidative threat (Chen et
al., 2003). Nickel compounds are carcinogenic to human and are potent inducers of kidney and lung
tumors in experimental animals (Lee et al., 2001). Moreover, nickel toxicity has been found in various
organs and systems. Ni has multisystem impacts on human health following its exposure and major
target organs include liver, kidney, brain, lung and testes (Xie et al. 1996). In general, this element is a
known haematotoxic, immunotoxic, neurotoxic, genotoxic, reproductive toxic, pulmonary toxic,
nephrotoxic, hepatotoxic and carcinogenic agent (Das et al., 2008). Allergic skin reactions are also
common in individuals who are sensitive to nickel (Das and Buchner, 2007). Nickel also affects bone
132
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
metabolism (Wilson et al., 2001). Experimental studies aimed to nickel effect on bone tissue revealed
that deficiency, but simultaneously high concentration of this element in organism has adverse effect
on bone developmental (Nielsen et al., 1984). The results obtained by Wilson et al. (2001) have shown
that administration of nickel at the dose above 50 mg NiCl2 per kilogram of feed mixture caused a
decrease in bone diameter and cross-sectional area of radius in the broilers housed in floor pens.
According to Chen et al. (1999), Ni may have an oxidative effect on bone marrow. It was documented
in rabbits that after peroral nickel application a decreased size of primary osteons‟ vascular canals of
compact bone tissue was found (Martiniaková et al., 2009a). Similar studies have not been realized in
rats up to date.
The purpose of present study was to evaluate macroscopic and microscopic changes in compact
bone tissue of laboratory rats in association with nickel acute intoxication of adult individuals.
Materials and methods
Twenty clinically healthy 5 month-old Wistar rats (males) were involved in our experiment. The
animals (weighting 400-600g) were raised in the accredited experimental laboratory at the Slovak
University of Agricultural in Nitra. Of the total number of individuals, 10 rats (experimental groupEG) were injected intraperitoneally with a single dose of 15 mg NiCl2 per kilogram of body weight.
Other males (n=10) without nickel application served as a control (control group-CG). After 48 hours
from experimental nickel uptake, all animals were painless killed and both their femora were used for
macroscopic and microscopic analyses. We compared bone length, bone weight and histological
structure of the femora between experimental and control group. Values for macroscopic analysis were
expressed as mean ± standard deviation. The unpaired T-test was used to distinguish possible changes
in bone length and bone weight between analysed groups of rats.
For histological analysis, each right femur was sectioned at the midshaft of its diaphysis. The
obtained segments (approx. 0,5 cm) were macerated and degreased in accordance with the methodic of
Martiniaková et al. (2007). Later the bone samples were embedded in epoxy resin Biodur (Günter von
Hagens, Germany). Transverse thin sections (70-80 μm) were prepared with a sawing microtome
(Leitz 1600, Germany) and affixed to glass slides by Eukitt (Merck, Germany) as previously described
(Martiniaková et al., 2008). Histological specimens were examined by polarization microscope (PM2,
Kvant) at 225x. The qualitative histological characteristics of the compact bone tissue were
determined according to the internationally accepted classification systems of Enlow and Brown
(1956) and Ricqlés et al. (1991). The quantitative parameters were assessed using the Motic Images
Plus 2.0 ML computer software (Motic China Group Co., Ltd.) in all views of thin sections (anterior,
posterior, medial and lateral). We measured area, perimeter, and the minimum and maximum diameter
of primary osteons' vascular canals, Haversian canals and secondary osteons. The measured values
were expressed as mean ± standard deviation. The unpaired T-test was used to distinguish differences
in the quantitative histological characteristics of the compact bone between experimental and control
group.
Results and discussion
Macroscopic evaluation of analysed femora demonstrated no significant differences in bone
weight and bone length between experimental and control group (table 1). Similarly, Martiniaková et
al. (2009a) also did not find any demonstrable changes in these variables in rabbits perorally
administrated with nickel in comparison to control group. On the other hand, Oller et al. (2008)
mention an increase in relative and absolute weight of other organs (e.g. lungs, adrenal glands) of male
rats exposed to inhalation of powered metal nickel. Significant higher weight of pulmonary lobe has
also been observed in rats orally administrated nickel in the study by Cempel (2004).
Table 1 The results of macroscopic analysis of investigated femora in experimental and control group
of rats
rat‟s group
n
femoral length (cm)
femoral weight (g)
KG
20
4,02±0,11
1,13±0,15
EG
20
4,11±0,13
1,22±0,12
T-test
-
133
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
The femora of all studied animals had the following microstructure in common. Internal layer
surrounding the medullary cavity was formed by a zone of non-vascular bone tissue in all views
(anterior, posterior, medial and lateral) of thin sections. This type of the bone tissue was composed of
concentric lamellae with osteocytes. Vascular canals of primary and/or secondary osteons were absent.
In addition, there were also observed some areas of primary vascular radial bone tissue identified in
lateral, anterior and posterior views. This tissue created vascular canals (branching or unbranching)
radiating from marrow cavity. In anterior and posterior views, some primary and secondary osteons
were exceptionally found near endosteal surface. The occurrence of the osteons (primary and
secondary) was also identified in middle parts of compact bone. The isolated secondary osteons
formed a layer of irregular Haversian bone tissue in this part of bone. Finally, periosteal border of
analysed bones was again composed of non-vascular bone tissue, mainly in anterior and posterior
views. Our findings from the qualitative histological analysis correspond to the ones reported by other
authors (Enlow and Brown, 1958; Martiniaková et al. 2005; Reim et al., 2008; Martiniaková et al.,
2009b). We observed no significant differences in qualitative histological characteristics of compact
bone tissue between rats from experimental and control group. We have found only a decreased
number of primary and secondary osteons (near the periosteum and in middle parts of compact bone)
in Ni-exposed rats. This fact could indicate that bone remodeling (i.e., formation of new secondary
osteons) is reduced in this group of animals probably due to nickel accumulation in bones. The results
of the study of Mabilleau et al. (2007) have suggested that short-term exposure to nickel could down
regulate the release of pro-inflammatory markers, known to activate osteoclastic resorption, as well as
osteoclast precursors. Also nickel is known to induce severe osteoblast apoptosis and dysfunction. In
general, rats lack true Haversian intracortical bone remodeling under physiological conditions (Baron
et al., 1984). The newly formed remodeling units within compact bone originated according to Reim et
al. (2008) from the endocortical surface, from where they extended deeply into the underlying
compact bone. Therefore, nickel could influence the activity of cells of bone formation and bone
resorption in endocortical surface of compact bone.
With the quantitative histological characteristics, 713 vascular canals of primary osteons, 323
Haversian canals and 323 secondary osteons were measured in both groups. The results are
summarized in tables 2, 3 and 4. We have found that values of vascular canals of primary osteons,
Haversian canals and secondary osteons were higher in all parameters (area, perimeter, maximal and
minimal diameter) in Ni-exposed animals (P<0,05). Similarly, higher values of Haversian canals and
secondary osteons in compact bone tissue of rabbits orally exposed to nickel were found in the study
of Martiniaková et al. (2009a). The results obtained by Mabilleau et al. (2010) indicate that some
metal ions, such as Cr2+, Ni2+, Co2+ can be incorporated into the hydroxyapatite crystals during
mineralization and they could affect the crystal lattice parameters as well as the size of these bone
minerals. Likewise, Al-Asheh et al. (1999) have suggested that animal bone is able to adsorb copper
and nickel ions from their single aqueous solutions. Hydroxyapatite crystals, like a major mineral
component of bones, are aligned with their long axis parallel to the collagen fiber axis (Boskey, 2005),
creating concentric lamellae of secondary osteons. On the basis of this knowledge and the results of
Mabilleau et al. (2010) we suppose that increase of hydroxyapatite crystals could consequently cause
changes in the size of secondary osteons. Additionally, above mentioned authors have reported
decreased levels of calcium and phosphorus in bone mineral. Calcium was progressively substituted
by metal ions during the mineralization process. We suppose that disturbance of bone mineralization
with the following calcium realizing could lead to increased size of primary osteons' vascular canals
and Haversian canals in our experimental rats. The vascular (also Haversian) canal extension in rats
with intraperitoneal nickel administration can also be associated with better bone supply. In contrast,
alterations in the size of bone minerals (and subsequently secondary osteons) could signalize an
increased occurrence of bone fractures. It has been suggested that bones with a preponderance of
larger crystals have reduced resistance to load (Boskey, 2003).
134
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 2 Statistical analysis of primary osteons' vascular canal variables
group of
rats
KG
EG
T-test
P<0,05 (+)
n
area (μm2)
10
10
386,32±78,60
448,56±72,18
+
perimeter
(μm)
70,57±7,43
76,37±6,61
+
maximum diameter
(μm)
12,31±1,57
13,37±1,70
+
minimum diameter
(μm)
9,99±1,41
10,73±1,21
+
Table 3 Statistical analysis of Haversian canal variables
group of
rats
n
KG
10
EG
10
T-test
P<0,05 (+)
area
(μm2)
perimeter
(μm)
maximum diameter
(μm)
minimum diameter
(μm)
457,10±69,12
626,88±117,46
+
76,46±5,58
89,28±8,37
+
12,97±1,24
15,18±1,67
+
11,27±1,34
13,10±1,57
+
Table 4 Statistical analysis of secondary osteon variables
group
n
of rats
KG
10
EG
10
T-test
P<0,05 (+)
area
(μm2)
6392,40±1656,98
8359,29±1715,11
+
perimeter
(μm)
287,48±36,68
330,77±33,97
+
max. diameter
(μm)
50,97±7,30
59,53±7,09
+
min. diameter
(μm)
39,53±6,43
44,45±5,61
+
The measured values of primary osteons' vascular canals of rats from control group were higher
than those published by Martiniaková et al. (2009b) in 4-month-old rats. However, this fact is
influenced by different age of rats in both studies. According to classification of Rämsch and Zerndt
(1963), Gladuhsew (1964) we can conclude that secondary osteons of rats from control group disposed
short Haversian canals (12,12±1,29 μm).
Conclusion
The acute effect of nickel on morphological structure of femora in laboratory rats was
investigated. There were observed no significant changes in qualitative histological characteristics of
compact bone tissue between experimental and control group, except for a fewer number of primary
and secondary osteons near the periosteum and in middle parts of compact bone in Ni-exposed
animals. On the other hand, we found significant differences in the size of primary osteons' vascular
canals, Haversian canals and secondary osteons between both groups. The increase in parameters of
vascular canals of primary osteons and Haversian canals could indicate a positive effect of Ni on bone
vascularization. On the contrary, secondary osteon extension in individuals exposed to nickel could be
related to increased occurrence of bone fractures.
Our results point to the fact that despite nickel essentiality, acute intoxication by this metal at the
dose of 15 mg NiCl2.kg-1 body weight induces some changes in microstructure of femora in laboratory
rats.
Acknowledgements
This study was supported by the grant KEGA 3/7338/09 and UGA VII/15/2010.
References
AL-ASHEH, S. - BANAT, F. - MOHAI, F. 1999. Sorption of copper and nickel by spent anima bones.
In: Chemosphere, vol. 39, 1999, vol. 39, p. 2087-2096.
135
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ALEXANDROVA, R. - COSTISOR, O. - PATRON, L. 2006. Nickel. In: Exp. Pathol. Parasitol., vol.
9, 2006, p. 64-74.
BARCELOUX, D. G. 1999. Nickel. In: Clin. Toxicol., vol. 39, 1999, p. 239–258.
BARON, R. - TROSS, R. - VIGNERY, A. 1984. Evidence of sequential remodeling in rat trabecular
bone: Morphology, dynamic histomorphometry, and changes during skeletal maturation. In: Anat.
Rec., vol. 208, 1984, p. 137–145.
BOSKEY, A. L. 2003. Bone mineral crystal size. In: Osteoporos Int., vol. 14, 2003, p. 16–21.
BOSKEY, A. L. 2005. The organic and inorganic matrices. In: Hollinger, J. O., Einhorn, T. A., Doll,
B. A., Sfeir, C. 2005. Bone tissue engineering. Boca Raton: CRC Press, 2005, 91-123 p. ISBN 0-84931621-9.
CEMPEL, M. 2004. Effect of nickel(II) chloride on iron content in rat organs after oral administration.
In: Biol. Trace Elem. Res., vol. 102, 2004, p. 189–198.
DAS, K. K. - BUCHNER, V. 2007. Effect of nickel exposure on peripheral tissues: role of oxidative
stress in toxicity and possible protection by ascorbic acid. In: Rev. Environ. Health, vol. 22, 2007, p.
157-173.
DAS, K. K. - DAS, S. N. - DHUNDASI, S. A. 2008. Nickel, its adverse health effects & oxidative
stress. In: Indian J. Med. Res., vol. 128, 2008, p. 412-425.
ENLOW, D. H. - BROWN, S. O. 1956. A comparative histological study of fossil and recent bone
tissues. Part I. In: Texas J. Sci., vol. 8, 1956, p. 405-412.
ENLOW, D. H. - BROWN, S. O. 1958. A comparative histological study of fossil and recent bone
tissues. Part III. In: Texas J. Sci., vol. 10, 1958, p. 187-230.
GLADUHSEW, J. M. 1964. Problems of the histological investigation of the bone in forensic
medicine. In: Sudebnomed Exp., vol. 7, fasc. 2, 1964, p. 23-26.
HE, Z. L. - YANG, X. E. - STOFFELLA, P. J. 2005. Trace elements in agroecosystems and impacts
on the environment. In: J. Trace Elem. Med. Biol., vol. 19, 2005, p. 125-140.
CHEN, C. Y. - SHEU, J. Y. - LIN, T. H. 1999. Oxidative effects of nickel on bone marrow and blood
of rats. In: J. Toxicol. Environ. Health A, vol. 58, 1999, p. 475-483.
CHEN, C. Y. - WANG, Y. F. - LIN, Y. H. - YEN, S. F. 2003. Nickel-induced oxidative stress and
effect of antioxidants in human lymphocytes. In: Arch. Toxicol., vol. 77, 2003, p. 123–130.
CHOWDHURY, M. J. - BUCKING, C. - WOOD, C. M. 2008. Pre-exposure to waterborne nickel
downregulates gastrointestinal nickel uptake in rainbow trout: indirect evidence for nickel essentiality.
In: Environ. Sci. Technol., vol. 42, 2008, p. 1359-1364.
KASPRZAK, K. S. - SUNDERMAN, Jr F. W. - SALNIKOW, K. 2003. Nickel carcinogenesis. In:
Mutat. Res., vol. 533, 2003, p. 67-97.
LEE, S. H. - CHOI, J. G. - CHO, M. H. 2001. Apoptosis, bcl2 expression, and cell cycle analyses in
nickel (II)-treated normal rat kidney cells. In: J. Korean Med. Sci., vol. 16, 2001, p. 165-168.
MABILLEAU, G. - GILL, H. S. - SABOKBAR, A. 2007. Effect of nickel ions on osteoclastogenesis.
In: Bone, vol. 40, 2007, p. S278.
MABILLEAU, G. - FILMON, R. - PETROV, P. K. - BASLÉ, M. F. - SABOKBAR, A. CHAPPARD, D. 2010. Cobalt, chromium and nickel affect hydroxyapatite crystal growth in vitro. In:
Acta Biomaterialia, vol. 6, 2010, p. 1555-1560.
MARTINIAKOVÁ, M. - GROSSKOPF, B. - VONDRÁKOVÁ, M. - OMELKA, R. - FABIŃ, M.
2005. Observation of the microstructure of rat cortical bone tissue. In: Scripta medica, vol. 78, 2005,
p. 45-50.
MARTINIAKOVÁ, M. - GROSSKOPF, B. - OMELKA, R. - DAMMERS, K. - VONDRÁKOVÁ, M.
- BAUEROVÁ, M. 2007. Histological study of compact bone tissue in some mammals: a method for
species determination. In: Int. J. Osteoarch., vol. 17, 2007, p. 82-90.
MARTINIAKOVÁ, M. - OMELKA, R. - GROSSKOPF, B. - SIROTKIN, A. V. - CHRENEK, P.
2008. Sex-related variantion in compact bone microstructure of the femoral diaphysis in juvenile
rabbits. In: Acta Vet. Scand., vol. 50, 2008, p. 15.
MARTINIAKOVÁ, M. - OMELKA, R. - GROSSKOPF, B. - CHOVANCOVÁ, H. - MASSÁNYI, P.
- CHRENEK, P. 2009a. Effects of dietary supplementation of nickel and nickel-zinc on femoral bone
structure in rabbits. In: Acta Vet. Scand., vol. 51, 2009a, p. 52.
136
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
MARTINIAKOVÁ, M. - OMELKA, R. - GROSSKOPF, B. - MOKOŃOVÁ, Z. - TOMAN, R. 2009 b.
Histological analysis of compact bone tissue in adult laboratory rats. In: Slovak J. Anim. Sci., vol. 42
2009b, p. 56-59.
NIELSEN, F. H. - SHULER, T. R. - MCLEOD, T. G. - ZIMMERMAN, T. J. 1984. Nickel influences
iron metabolism through physiologic, pharmacologic, and toxicologic mechanism in rat. In: J. Nutr.,
vol. 114, 1984, p. 1280–1288.
OLLER, A. R. - KIRKPATRICK, D. T. - RADOVSKY, A. - BATES, H. K. 2008. Inhalation
carcinogenicity study with nickel metal powder in Wistar rats. In: Toxicol. Appl. Pharmacol., vol. 233,
2008, p. 262-275.
RÄMSCH, R. - ZERNDT, B. 1963. Vergleichende Untersuchungen der Haverrschen Kanäle zwischen
Menschen und Haustieren. In: Arch. Kriminol., vol. 131, 1963, p. 74–87.
REIM, N. S. - BREIG, B. - STAHR, K. - EBERLE, J. - HOEFLICH, A.. - WOLF, E. - ERBEN, R. G.
2008. Cortical bone loss in androgen-deficient aged male rats is mainly caused by increased
endocortical bone remodeling. In: J. Bone Miner. Res., vol. 23, 2008, p. 694-704.
RICQLÉS, A. J. DE - MEUNIER, F. J. - CASTANET, J. - FRANCILLON–VIEILLOT, H. 1991.
Comparative microstructure of bone. In: Hall, B. K. (ed.). Bone 3, Bone Matrix and Bone Specific
Products, Boca Raton: CRC Press, 1991, p. 1-78.
WILSON, J. H. - WILSON, E, J. - RUSZLER, P. L. 2001. Dietary nickel improves male broiler
(Gallus domesticus) bone strength. In: Biol. Trace Elem. Res., vol. 83, 2001, p. 239–249.
XIE, J. M. - FUNAKOSHI, T. - SHIMADA, H. - KOJIMA, S. 1996. Effects of chelating agents on
testicular toxicity in mice caused by the acute exposure to nickel. In: Toxicology, vol. 103, 1996, p.
147–155.
ZHAO, J. - SHI, X. - CASTRANOVA, V. - DING, M. 2009. Occupational toxicology of nickel and
nickel compounds. In: J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol., vol. 28, 2009, p. 177-208.
137
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
INFLUENCE OF THE HEAVY METALS ON THE PEDOFAUNA OF THE
SELECTED HABITATS IN THE NIEPOŁOMICE PRIMEVAL FOREST
ODDZIAŁYWANIE METALI CIĘŻKICH ZANIECZYSZCZAJĄCYCH GLEBĘ NA
PEDOFAUNĘ WYBRANYCH SIEDLISK W PUSZCZY NIEPOŁOMICKIEJ
CHRZAN Anna1, MARKO- WORŁOWSKA Maria1, ŁACIAK Tomasz2
1
Department of Ecology, Wildlife Research and Ecotourism,
Department of Vertebrate Zoology and Human Biology
1,2
Institute of Biology, Pedagogical University of Krakow, ul. Podbrzezie 3, 31-084 Krakow, Poland
2
Abstract
The diversity, density, the trophic structure and the biomass the pedofauna in 2 types forest in the
Niepołomice Primeval Forest distant about 20 km east of the Kraków centre and around 10 km
southeast from Nowa Huta district of Kraków was studied. The research of soil fauna was conducted
in older age classes (III – age from 41 to 60 years and in the age class with stand over 120 years) in the
summer and autumn periods of the 2009 vegetation season. The temperature, reaction (pH) and
humidity of the soil, sort of soil and humus, the content of the metals such as Pb, Cd, Ni, Cu and Zn in
the soil were defined as well. It was detected that the density and diversity of the groups of the
pedofauna analyzed are influenced by the humidity, pH, sort of humus and content of the organic
matter. The biggest density and diversity of the meso- and macrofauna were detected in the mixed
moist forest with humus sort mull. The pH of the analyzed soil from the studied forest ranged from pH
3,24- to pH 5,76. The smallest density of the pedofauna was detected in the alders forest in the
autumn. No clear impact of the studied metal content on pedofauna was found.
Keywords: pedofauna, soil, pH, density, diversity, heavy metal
Introduction
Processes occurring in the soil are essential to maintain the stability and productivity of land
ecosystems. The above statement concerns also forest ecosystems, because forest litter is a source of
most nutrients taken up by plants every year. Anthropogenic activity brings about essential changes in
the circulation of elements in the environment, which leads to the pollution by these elements of
individual environmental components. Particularly hazardous is the process of accumulation of
cationic trace elements of heavy metal groups [11]. Heavy metals in excessive amounts pose serious
risk to plants, animals and human beings. The presence of trace metals in the soil and plants is an
environmental indicator [8]. That is why there is a need to systematically monitor their content in
environmental components.
Soil heavy metal content is affected by the chemical composition of the parent rock, and local
and transboundary pollutants, transported and washed out with atmospheric precipitation [11]. Trace
elements systematically brought into the soil accumulate in its top layer, because they are bonded by
the soil sorption complex and only very slowly move into the depths of the soil profile. In forest litter
and in the soil environment, heavy metals demonstrate diverse mobility [5]. Lead is strongly bonded
by organic matter of soil top layer and only slightly migrates into the depth of the profile, copper is a
little more mobile, and zinc relatively easily moves into the depths of the soil. The total metal content
of forest litter is determined, beside the deposition rate, also by the humification conditions of the
vegetable material and the balance of metal accumulation and leaching processes [2,10,11].
This study has been undertaken with the aim to determine heavy metal content (Pb, Cd and Ni,
Zn and Cu) in the soil of selected habitats of the Niepołomice Forest and to establish their impact on
pedofauna of these habitats – their density, diversity and trophic structure.
Material and methods
In order to assess the metals toxicity for pedofauna, soil samples were taken from two habitat
types of the Niepołomice Forest, from mixed humid forest (MhF) and alder carr (Ald). The soil
138
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
samples were taken in older age classes (III – age from 41 to 60 years and in the age class with stand
over 120 years) in the summer and autumn periods of the 2009 vegetation season.
With the use of Morris square frame (25 cm by 25 cm) a series of samples was taken on the
selected localities. The frame was thrust into the soil on the depth of 10 cm. Each series consisted of
16 tests on the surface of around 1 m2. Pedofauna was scampered away by employing the dynamic
method in the modified Tullgren apparatus. After marking the select mesofauna its density and
diversity were analysed.
Soil moisture and its pH, its temperature as well as the content of Cd, Pb, Ni, Cu, Zn were
determined method FAAS.
Dry samples of the soil (2.5 g) were mineralised. For this purpose dry samples of the soil was
poured over 3 ml of 65% HNO3 and heated to the temperature of 120oC in during about 4 h. The
filtered liquid was poured into measure flasks and filled with distilled water to volume of 10 cm3. In
solutions of the soil prepared in this way the content of heavy metals on the spectrometer of atomic
absorption was marked (AAS firmy Cole-Parmer, BUCK 200A).
Results and discussion
The investigated sites varied in the soil or humus type, and the composition of forest stand and
ground cover (Table 1).
Table 1 Comparison of studied habitat types of the forest
MhF
sort of soil
Ald
Dystric gleysols, histic gleysols, humic
gleysols
Peat soils, umbric gleysols, mineral
histosols, humic gleysols and dystric
gleysols
sort of humus
Mor moder, typical moder, mull moder, Greasy or hystic mor, typical or hystic
mull
moder
the composition Pinus sp., Quercus robur L., Alnus
Alnus sp., Betula verrucosa Ehrh., Picea
of forest stand
glutinosa L., Betula verrucosa Ehrh.,
excelsa (Lam.) Lk., Pinus sp., Quercus
sp.
the composition Carex brizoides, Pteridium aquilinum, Urtica dioica, Galium palustre, Iris
ground cover
Rubus idaeus, Impatiens noli- tangere pseudoacorus, Stellaria media
MhF- mixed humid forest
Ald- alder carr
The analysis of the pH value showed that the studied soils had acidic pH, moreover, the pH
value in the mixed humid forest ranged from 3.51 to 3.85, and in the alder carr was much higher with
the value of 5.76 in the autumn (Table 2).
139
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 2 General characteristics of soil
Selected parameters
Soil pH
Area temperature oC
Soil temperature oC
Soil moisture %
I
3,51
(3,26- 3,77)
20,3
(19,95- 20,65)
15,82
(15,59-16,05)
52,5
(46,18- 58,83)
II
3,24
(3,13- 3,35)
21,45
(20,6- 22,3)
17,8
(16,6- 19,0)
35,52
(26,41- 44,64)
III
3,85
(3,8- 4,1)
9,5
(9.15- 9,85)
9,9
(9.8- 10,0)
44,97
(37,76- 52,19)
IV
5,76
(4,66- 6,87)
11,1
(10,0- 12,2)
10,25
(9.7- 10,8)
40,53
(29,78- 51,28)
I- MhF summer
II- Ald summer
III- MhF autumn
IV- Ald autumn
In this case the pH value could become a factor affecting a particular increase in the metal
mobility in the studied soils, because low pH value of the soil promotes heavy metal assimilation
(especially Pb and Cd) by soil organisms [7,13]. With a very strong fall in the pH value, the biological
activity of the soil decreases, which leads to the accumulation of thick layers of “raw” humus.
The moisture content of the MhF soil was ca. 10% higher than that of Ald on average, the highest
value of 52.5% was noted in the summer. It may be an element affecting the differences in the density,
biodiversity and biomass in the studied pedofauna group (Table 2, 3).
Table 3 Density, biomass and diversity the pedofauna at the studied sites
Parameters
II
III
IV
3004
(2112- 3896)
20
3528
(1696- 4048)
80
2540
(2216- 2864)
64
3,96
17,29
40,4
15
20
14
3
5
4
I
Density of pedofauna
4012
(sp.no.per m2)
(2408- 5016)
Density of Diptera larvae
280
(sp.no.per m2))
Biomass of Diptera larvae
54,78
(mg d.m.per m2)
Diversity (number of
13
taxonomic group,
number of family Diptera)
2
Differences in the Cd, Pb, Ni, Zn and Cu contents in both habitat types of the forest were
noticed. The concentration of metals in soil solutions highly increases with lowering the pH value of
the soil. In the MhF soil, where the pH value was very acidic (pH 3.51 – 3.85), the total cadmium,
lead, nickel, zinc and copper content was higher than in the alder carr soil (Table 4).
140
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 4 Content of heavy metals in forest soils – mean values
Metal
I
II
Cd
Zn
1,169
(1,1-1,3)
68,651
(63,8-76,4)
3,525
(3,1-3,8)
-
0,776
(0,6-1,1)
52,546
(48,2-62,1)
2,971
(2,2-4,6)
-
Cu
-
-
Pb
Ni
IV
III
1,316
(1,1-1,5)
40,58
(33,4- 45,9)
4,033
(3,8-4,2)
103,61
(95,07-112,15)
26
(11.02-48,48)
0,825
(0,7-0,9)
32,528
(25,8- 37,4)
4,033
(3,8-4,2)
89,44
(69,77- 116,57)
15,86
(14,08- 17,52)
The differences were also observed between the periods under study, more Pb was found both in
the MhF and Ald in the summer, whereas there was more Cd and Ni in autumn samples. It results
from the studies that the heavy metal concentrations did not exceed the limit values, except for
cadmium in the mixed humid forest, where the value slightly exceeded the standard set out for the soil,
i.e., 1 mg/kg (Table 4).
It should be pointed out that the accumulation of lead in forest litter is a long-lasting process,
hence the found lead concentrations may result from the total pollutant amounts from deposition
lasting many years. Many authors emphasise that lead accumulates in the humus layer of the soil
profile [1,3,4]. According to Cieśla et al. [4], a higher accumulation of lead in the studied forest soils
may be caused not only by the acidic pH, but also by a higher organic carbon content. The enrichment
of the top layers of the forest soils in Pb, Zn and Cu may prove their anthropogenic origin. Most
probably, this soil environmental condition is affected by the inflow of gaseous and particulate
pollutants transported by wind mainly from over the industrial conurbation.
Cadmium, nickel and lead belong to toxic elements, very strongly affecting the environment,
leading to the change of biological properties of the soil [6,9,12]. The results obtained do not indicate
any clear impact of the studied metals on the density, biodiversity of meso- and macrofauna, including
the Diptera larvae.
The analysed metal content in the studied habitats did not correlate with the abundance and the
biodiversity of the studied fauna. In the MhF soil, a higher concentration of Cd, Pb and Zn was found
and also here the highest (4012 individuals per sq m) density of the studied animals was noted. At the
same site, the highest density and biomass of Diptera larvae was observed in the summer.
The trophic structure of the macrofauna association was also studied (Table 5). A high fraction
of predators that more fully characterises the state of the soil habitat in MhF may prove its good
quality, despite high heavy metal content in the soil.
Table 5 Trophic structure of pedofauna
Trophic groups
Saprophags
Phitophags
Predators
Polyphags
I
34,51
8,33
55,36
1,78
II
59,37
12,5
22,73
5,15
III
38,66
20
35,99
5,33
IV
53,73
20,15
17,16
8,96
Conclusions
1. The heavy metal content did not exceed the standards set out for the soils of Poland (except
for cadmium).
2. No clear impact of the studied metal content on pedofauna was found.
3. The density and biodiversity of pedofauna was affected probably by other factors (soil
moisture content, organic matter content, humus type).
141
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
References
[1]. BASTA N.Y. - TABATABAI M.A.. 1992. Effect of cropping systems on adsorption of metals by
soils.I. Single-metal adsorption. In Soil. Sci., vol.153, 1992, no. 2, p. 108-114.
[2]. BERGVIST B. - FOLKESON L. - BERGGREN D. 1989. Fluxes of Cu, Pb, Cd, Cr and Ni in
temperate forest ecosystems. In Water, Air and Soil Pollution, vol. 47, 1989, p. 217–286.
[3]. BROŹEK S. - GRZYWNOWICZ I. - WOJCIECHOWICZ A. 2003. Metale ciężkie w skałach
macierzystych gleb leśnych. In Zesz. Prob. Post. Nauk Roln., vol. 493, 2003, cz.I, p. 53-63.
[4]. CIEŚLA W. - DĄBKOWSKA-NASKRĘT H. - BOROWSKA K. - MALCZYK P. - DŁUGOSZ J.
- JAWORSKA H. - KĘDZIA W. - ZALEWSKI W. 1994. Pierwiastki śladowe w glebach wybranych
obszarów Pomorza i Kujaw. In Zesz. Prob. Post. Nauk Roln., vol. 414, 1994, p. 63-70.
[5]. CZARNOWSKA K. 1996. Ogólna zawartość metali ciężkich w glebach płowych Wysoczyzny
Siedleckiej. In Zesz. Nauk SGGW-AR Warszawa. sec. Rolnictwo, vol. 16, 1996, p. 39-47.
[6]. DOSTATNI A.. - TROĆ M. - WOJTASIK A.- ŁĘCKI P. 2009. Zawartość metali ciężkich w
glebach leśnych obszaru międzyrzecza Warty i Noteci. In Ekologia i Technika, vol.XVII, 2009, no. 3,
p. 104- 108.
[7]. DZIADEK K. - WACŁAWEK W. 2005. Metale w środowisku. Cz. I. Metale ciężkie (Zn, Cu, Ni,
Pb, Cd) w środowisku glebowym. In Chem. Dydakt. Ekol. Metrol., vol. 10, 2005, no.1-2, p. 33-44.
[8]. EL-FALAKAY A.A. - ABOULROOS S.A. - LINDSAY W.I. 1991. Measurement of cadmium
activities in slightly acid to alkaline soils. In Soil. Sci. Soc. Am. J., vol. 55, 1991, p. 974-979.
[9]. GORLACH E. - GAMBUŚ F. 1991. Desorpcja i fitotoksyczność metali ciężkich zależnie od
właściwości gleby. In Rocz. Gleb., vol. XLII, 1991, no. 3-4, p. 207-214.
[10]. KABAŁA C. 1998. Pierwiastki śladowe w glebach Gór Izerskich. Zeszyty Naukowe AR we
Wrocławiu, In Rolnictwo LXXIII, vol. 347, 1998, p. 95–106.
[11]. KABATA-PENDIAS A. - PENDIAS H. 1999. Biogeochemia pierwiastków śladowych. Wyd.
Nauk. PWN. Warszawa. 1999.
[12]. SKWARYŁO-BEDNARZ B. 2006. Ogólna zawartość wybranych metali ciężkich w glebach
leśnych Roztoczańskiego Parku Narodowego (RPN). In Acta Agrophysica, vol. 8, 2006, no. 3, p. 727733.
[13]. WYSZKOWSKA J. - WYSZKOWSKI M. 2002. Effect of cadmium and magnesium on
microbiological activity in soil. In Polish. J. Environ., vol. 5, 2002, no.11, p. 585–591.
Contact address
Institute of Biology,
Pedagogical University of Krakow
ul.Podbrzezie 3, 31-084 Krakow, Poland
 [email protected] , [email protected], [email protected]
142
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
POULTRY PRODUCTS IN THE FOOD CHAIN AS A SOURCE OF CAROTENOIDS
JUNG Ivett, SZABÓ Csaba, KERTI Annamária, BÁRDOS László
Department of Animal Physiology and Health, Szent István University, Páter K. u. 1., 2100 Gödöllő,
Hungary
Abstract
Carotenoids are used in the animal husbandry for the desired coloration of poultry products. The egg
such a poultry product it‟s current as nutrient-dense food and reach in carotenoids. The egg yolk
carotenoids derived from hen‟s feed and deposited there so resulted a typically yellow coloration. The
animals are not able to synthesize these compounds so they obtain carotenoids from diets. Hens were
fed with two doses of lycopene 250 µg/kg and 500 µg/kg fodders in the first experiment. The control
group was given rice based carotenoid free fodder. 10-10 eggs were collected for four weeks. In the
second experiment Japanese quails were supplemented lycopene (Ly), lutein (Lu) and ß-carotene (BC)
400 µg added/kg/rice based carotene free fodder (Lu R, LyR, BCR) and commercial fodder respectively.
The yolk color and the skin color were characterized with CIELab method and the carotenoid profile
(Lycopene, ß-carotene, Luletin/zeaxanthin) concentrations were determined by HPLC respectively.
The lycopene supplementation resulted high CIELab a* values (Ly 5 19, Ly10 17.5) compared to Ly0
(5.2) (p<0,001). Our results shown that lycopene was accumulated in the egg yolk resulted intensive
color. Beside this an intensive coloration was found in skin too. The color capability of investigated
carotenoids was ranked Lu>Ly>BC.
Key words: egg, skin, coloration, carotenoid, poultry
Introduction
More the 600 carotenoids are responsible for yellow or reddish coloration of plants and animals.
Beside the coloration these molecules have special metabolic effects in plants and animals as well.
Carotenoids occur in the skin, ovary, liver and eyes, but the different types are distributed in a
characteristic way in the various tissues. Birds as all of animals metabolize carotenoids, acquire
carotenoids exclusively from the diet because they are unable to synthesize them de novo. For these
reason birds require carotenoids in their food. The oxygen containing carotenoids, the xanthophylls are
deposited into feather, skin, beak and egg yolk of birds. This feature of xanthophylls is used in the
animal husbandry for the desired coloration of poultry products (Perez-Vendrell et al. 2001).
Carotenoids have been shown in some studies to reduce the risk of degenerative diseases, so play role
in the prevention of the age-related macula degerenation, heart diseases, and certain cancers. Lycopene
is an acyclic hydrocarbon carotenoid which stains the tomato red. Lycopene has a lot of health benefit
as antioxidant, cell cycle modulator; it has hypocholesterolemic and anticarcinogenic activity
especially in prostate cancer (Giovannucci 2002, Heber and Lu 2002). This carotenoid is not a
common constituent of poultry fodder. The carotenoids can be appeared not only for animal feed, but
also for supplements, fortified foods in the market. The demand is growing for fortified foods and
functional foods. In the lipid matrix associated carotenoids have increased bioavailability. The egg
yolk is a matrix, in this can good dispersed the carotenoids and create optimal medium for carotenoid
absorption from the diet (Handelman 1999).
143
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Materials and methods
Experiment on laying hens
Hy-Line Brown hens were supplied with two doses of lycopene (group Ly 5 250, group Ly10 500
μg/kg fodder) by RedivivoTM (DSM) for four weeks. Layers consumed carotenoid free diet assigned
for controls (group Ly0). Every week was collected 10-10 eggs of groups during the experiment (4 w).
Experiment on Japanese quails
Three groups of juvenile Japanese quails were fed with 400 μg/kg fodder lycopene (Ly) lutein
(Lu) and beta carotene (BC) DSM nutritional products for four weeks respectively. The group of
control animals (C) was fed with commercial layer food. In other combination were fed with the same
supplementation mixed to carotenoid free food, and so the control group consumed rice based
carotenoid free food (R). At the end of experiment all birds were exterminated lege artis.
Analytical methods
The colors of egg yolk of laying hens and skin were characterized by CIELab values of handy
spectrometer (MicromatchsTM Plus, Sheen Ltd).
At the end of experiment all birds were exterminated lege artis. The skin was flenched from the
breast. Color intensity of the plain outer and inner surface of skin was measured. Skin color was
expressed in the CIELab dimensions of lightness (L*), redness (a*), and yellowness (b*).
The yolk and the liver carotenoid concentrations were determined by isocratic reverse-phase
HPLC. Lutein and zeaxanthin (Zx) are differing only in the position of one double bond in their
terminal ring. Their separation from each other under common HPLC condition is not possible
because of the very similar chemical structure of these oxycarotenoids (Sowell et al. 1994).
Results
Experiment on laying hens
Color intensity of yolk was measured by handy spectrometer and expressed in CIELab values.
The higher values by coordinate a* showed the red coloration therefore these were investigated by
examining of the egg yolks. The a* values in both lycopene supplemented groups was no significant
difference, but the lycopene supplementation resulted high CIELab a* values (Ly5 19, Ly10 17.5)
compared to Ly0 (5.2) (p<0,001). After the two week depletion phase the color intensity in both groups
lycopene supplemented groups increased and achieved the base values. The lycopene accumulation
into egg was 80-100 μg/yolk.
The total carotenoid analyses and objective color determination shown a significant difference
in both groups (Ly5 and Ly10) compared to L0 group.
25
CIELab (a*)
20
15
10
5
0
1
2
3
Ly0
4
Ly5
5
6
W
Ly10
Figure 1 Egg yolk colour values characterized by CIELab method
1-2 depletion phase; 2-6 Ly supplementation
144
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Experiment on Japanese quails
According to Perez-Vendrell and co-workers (2001) the CIELab coordinate b* measured in
breast skin was a good indicator of xanthophylls content in feed, whereas the a* coordinate measured
on the shank showed a linear relationship with the dietary cantaxanthin level. In our experiment we
found significant differences between the b* values. Among marigold xanthophylls the cantaxanthin
was not represented.
With this method, higher b* (and L* as well) was measured of inner skin surface than the outer
skin in breast. (Table 1. and Table2.) The highest b* values showed the group Lu and the lowest the
group BC. The coloration of breast skin ranked in Lu>Ly>C>BC in both surface. In the case of Lu
supplementation the values were significant (p<0.01). The b* values ranked similar in outer skin
surface (LuR>LyR>CR>CR) in the rice based carotenoid supplemented groups, but in inner skin
coloration changed to LuR>BCR>CR>RLyR. The Lu supplementation resulted significant higher b*
values in both surface of skin compered to other groups (p<0.01). The carotenoids concentrations of
liver were in accordance with the supplement of fodder. (Table 3)
Table 1 CIELab values of outer and inner skin surface in commercial layer feed based groups
Groups
C
BC
LU
LY
Mean
SD±
Mean
SD±
Mean
SD±
Mean
SD±
outer skin surface
L*
a*
b*
58.4
7.9
6.9
13.5
1.7
1.6
54,6
6,8
5.1
2.4
1.4
1.6
51.9
7,8
12.4
1.8
1.3
3.9
52.0
8,0
5.4
2.0
1.4
1.7
inner skin surface
L*
a*
b*
67.5
2.2
13.5
4.4
2.1
5.4
65.0
1.1
10.5
4.3
1.3
2.2
65.2
1,4
21.7
7.5
1.1
5.4
64.9
1.5
13.6
7.7
1.3
4.0
Table 2 CIELab values of outer and inner skin surface in carotenoid free based feed groups
Groups
CR
Mean
SD±
BCR
Mean
SD±
LUR
Mean
SD±
LYR
Mean
SD±
outer skin surface
L*
a*
b*
53.80
2.30
2.58
2.84
0.78
2.42
54.41
6.53
6.09
2.31
0.92
1.82
54.14
7.24
14.79
1.57
1.32
3.09
55.19
8.53
7.37
1.43
1.43
0.69
inner skin surface
L*
a*
b*
65.12 1.03 9.58
3.51 1.02 2.75
67.33 0.68 11.10
8.10 0.64 3.66
63.43 0.57 20.10
2.74 0.36 1.79
63.20 0.30 8.38
3.26 0.26 2.92
145
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Table 3 Carotenoid concentration (µg/g) of liver in the different supplemented groups (mean±SD)
Groups
C
BC
Lu
Ly
CR
BCR
LuR
LyR
Lu/Zx
lycopene
0.041±0.017
nd
0.025±0.009
nd
0.210±0.072
nd
0.027±0.030 0.020±0.014
nd
nd
0.005±0.002
nd
0.709±0.202
nd
nd
22.867±15.391
ßC
nd
0.442±0.330
0.105±0.119
0.233±0.184
nd
0,100±0.041
nd
nd
Discussion and Conclusion
The yellow-orange color of yolk is due to carotenoids, primarily xanthophylls with minor
amount of carotene (Smith and Perdue 1966). Carotenoid pigments give most of the bright red, yellow,
and orange colors well appreciated in the poultry industry. This coloration in the skin and feathers of
birds is the result of a trade-off between the storage of these pigments and their utilization.
Pigment technologists, especially poultry and fish nutritionists, are concerned with achieving
the often specific type and degree of coloration demanded by consumers of various products (notably
egg yolk, broiler skin and salmon flesh) Coloration involving carotenoids is controlled primarily
through pigment supplementation in the diet (Hudon 1994). Spectrophotometric measurement allow
for more objective and quantitative assessment of color while considering the range of avian visual
perception (Andersson and Prager 2006). The qualification of carotenoid-based skin coloration with
CIELab based method is a good seems to be a good method. According to our results the examination
depending b* values of skin could be placed the carotenoid in the following descending order
Lu>Ly>C>BC.
Eggs can be classified as a functional food. There are many definitions of functional foods. The
National Academy of Sciences‟ Food and Nutrition Board defined functional foods as "any food or
food ingredient that may provide a health benefit beyond the traditional nutrients it contains." (Thomas
and Earl 1994).
Eggs are the natural significant dietary source of lutein. For this reason this food is being
examined for its potential as a functional food (Hasler 2000). In our study the supplemented lycopene
accumulated into egg yolk: 80-100 μg/yolk. This fact is consistent with another investigation in which
a natural source of this pigment (dried tomato) result lycopene storage in egg yolk (Karadas et al.
2006). It‟s known from studies, that lycopene is more bioavailable from processed product, such as
tomato sauce, tomato paste than from fresh tomato (Gärtner et al. 1997, Unlu et al. 2007). Utilization
of lycopene dispersed in the biological matrix of egg yolk may be more efficient than plant origin.
This may be hypothesized because the utilization of lutein from enriched-eggs three times better than
from plant source (Chung et al. 2004). The serum lutein and zeaxanthin was increased by daily
consumption by one normal egg (Goodrow et al. 2006). The increased bioavailability of lutein and
zeaxanthin from egg yolk shown other studies (Wenzel et al. 2006, Goodrow et al. 2006). To the
enrichment of the yolk with lutein take at least 21 day during this time all eggs are enriched (Leeson
and Caston 2004).
Our results indicate that dietary Ly can be accumulated into hens‟ egg yolk resulting a desired
color. Lycopene has beneficial effects of health maintenance some of these: antioxidant, reduces the
malignant cell growth, inhibit the endogen synthesis of cholesterol. Taking into account the health
benefits the lycopene enriched egg may be a candidate for functional food. Beside the coloration of
yolk the Ly color the poultry skin as well.
References
ANDERSSON, S. - PRAGER, M. 2006. Quantifying colors. In: Hill, G.E., McGraw, K.J. (Eds.), Bird
Coloration. Mechanisms and Measurements, vol. 1. Cambridge: Harvard Univ. Press, 2006.
CHUNG, H-Y. - RASMUSSEN, H.M. - JOHNSON E.J. 2004. Lutein Bioavailability Is Higher from LuteinEnriched Eggs than from Supplements and Spinach in Men. In J. Nutr., vol. 134, 2004, p. 1887–1893.
146
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
GÄRTNER, C. - STAHL, W. - S IES, H. 1997. Lycopene is more bioavailable from tomato paste than from
fresh tomatoes Am J Clin Nutr.; vol. 66, l997, p. 116-22.
GIOVANNUCCI, E. - RIMM, E.B. - LIU, Y. - STAMPFER, M. J. - WILLETT, W. C. 2002. A
Prospective Study of Tomato Products, Lycopene, and Prostate Cancer Risk., JNCI., vol. 94, 2002, p.
391-398.
GOODROW, E.F. - WILSON, T.A. - CROCKER HOUDE, S. - VISHWANATHAN, R. - SCOLLIN P.A. HANDELMAN, G. - NICOLOSI R.J. 2006. Consumption of One Egg Per Day Increases Serum Lutein and
Zeaxanthin Concentrations in Older Adults without Altering Serum Lipid and Lipoprotein Cholesterol
Concentrations J. Nutr., vol. 136, 2006, p. 2519–2524.
HANDELMAN, G.J - NIGHTINGALE, Z.D. - LICHTENSTEIN, A.H. - SCHAEFER, E.J. - BLUMBERG, J.B
1999. Lutein and zeaxanthin concentrations in plasma after dietary supplementation with egg yolk Am
J Clin Nutr, vol. 70, 1999 p. 247–51.
HASLER C.M. 2000. The Changing Face of Functional Foods. J. Am. Coll. Nutr., vol. 19, 2000, p.
499S–506S
HEBER, D. - LU, Q-Y. 2002. Overview of Mechanisms of Action of Lycopene. Exper. Biol. Med., vol.
227, 200,. p. 920-923.
HUDON J. 1994. Biotechnological applications of research on animal pigmentation. Biotechnol. Adv.,
vol. 12, 1994, p. 49-69.
KARADAS, F., GRAMMENIDIS, E. ET AL. 2006. Effects of carotenoids from lucerne, marigold and
tomato on egg yolk pigmentation and carotenoid composition. Br. Poultry Sci., vol. 47, 2006, p. 561566.
LEESON, S. - CASTON, L. 2004. Enrichment of Eggs with Lutein Poultry Sci., vol. 83, 2004, p. 1709–
1712
PEREZ-VENDRELL, A. M. - HERNANDEZ, M. - LLAURADO, L. - SCHIERLE, J. - J BRUFAU, J.
2001. Influence of source and ratio of xanthophyll pigments on broiler chicken pigmentation and
performance. Poultry Sci., vol 80, 2004, p. 320-326.
SMITH, I. D. - PERDUE, H.S. 1966. Isolation and tentative identification of the carotenoid present in
chicken skin and egg yolk. Poultry Sci., vol. 45, 1966, p. 577–581.
SOWELL, A.L. - HUFF, D.L. - YEAGER, P.R. - CAUDILL, S.P. - GUNTER, E.W. 1994. Retinol, tocopherol, lutein/zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, lycopene, -carotene, trans-ß-carotene, and four retinyl
esters in serum determined simultaneously by reversed-phase HPLC with multiwavelength detection.
In Clin. Chem., vol. 40, 1994, p. 411-416.
THOMAS, P.R. - EARL, R. (Eds) 1994. Committee on Opportunities in the Nutrition and Food Sciences,
Institute of Medicine. Opportunities in the nutrition and food sciences: research challenges and the
next generation of investigators. Natl. Acad. Press., Washington, 1994, p. 109-120.
UNLU, N.Z. - BOHN, T. - FRANCIS, D.M. - NAGARAJA, H.N. - CLINTON, S.K. - SCHWARTZ, S.J. 2007.
Lycopene from heat-induced cis-isomer-rich tomato sauce is more bioavailable than from all-transrich tomato sauce in human subjects British Journal of Nutr., vol. 98, 2007, p. 140–146.
WENZEL, A.J. - GERWECK, C. - BARBATO, D. - NICOLOSI, R.J. - HANDELMAN, G.J. - CURRANCELENTANO J. 2006. A 12-Wk Egg Intervention Increases Serum Zeaxanthin and Macular Pigment
Optical Density in Women J. Nutr., vol. 136, 2006, p. 2568–2573.
Contact address
Jung Ivett
Department of Animal Physiology and Health, Szent István University, Páter K. u. 1. 2100 Gödöllň,
Hungary
 [email protected]
147
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
THE EFFECT OF NICKEL AND ZINC EXPERIMENTAL ADMINISTRATION ON
THE ENZYMATIC PROFILE OF RABBIT BLOOD
KALAFOVÁ Anna1, KOVÁČIK Jaroslav1, CAPCAROVÁ Marcela1, MASSÁNYI Peter1,
KOLESÁROVÁ Adriana1, CHRASTINOVÁ Ľubica2, LUKÁČ Norbert1,
SCHNEIDGENOVÁ Monika1, ČUPKA Peter1, JURČÍK Rastislav2
1
Slovak University of Agriculture in Nitra, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Department
of Animal Physiology, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovak Republic
2
Research Centre for Animal Production in Nitra, Slovakia, Hlohovecka 2, 951 41 Luţianky, Slovak
Republic
Abstract
The aim of this study was to determine the effect of trace elements – nickel and zinc on enzymatic
profile of rabbit blood. Adult animals (Californian, n=45) were divided into five groups (K, P1, P2,
P3, P4). Experimental rabbits (n=9 in each group) were fed ad libitum with different concentration of
nickel and/or combination with zinc. In first group (P1; n=9) animals were fed with granular feed
mixture with addition of 17.5 g NiCl2 per 100 kg of mixture and second group (P2; n=9) with 35 g
NiCl2 per 100 kg of mixture. In group P3 (n=9) animals were fed with mixture containing 17.5 g NiCl 2
and 30 g ZnCl2, and in group P4 (n=9) 35 g NiCl2 and 30 g ZnCl2 per 100 kg of mixture. The
experimental groups (P1, P2, P3, P4) were compared with control group (n=9). After 90 days a higher
average value of AST 0.25±0.08 μkat.l-1 in the P2 group when compared with control group was
found. In the control group higher content of ALP 2.50±2.02 μkat.l-1 in comparison with experimental
group was measured, but without significant difference. Significant reduction (P<0.05) of GGT level
between the control group 0.20±0.08 µkat.l-1 and group P2 0.16±0.07 µkat.l-1 was recorded. Creatinine
values were insignificantly higher in the experimental groups than those in the control group. The
average values of GLDH in experimental groups ranged from 0.14±0.06 µkat.l-1 to 0.15±0.07 µkat.l-1.
Higher average value of GLDH was found in the control group. The highest concentration of bilirubin
6.60±1.83 µmol.l-1 was detected in the P4 group.
Key words: nickel, zinc, AST, ALT, GGT, ALP, bilirubin, GLDH, creatinine, rabbit
Úvod
Medzi zdroje niklu v ņivotnom prostredí patrí výroba a spracovanie niklu a jeho produktov,
recyklácia produktov s obsahom niklu a odpad obsahujúci nikel. Zlúĉeniny niklu nájdené v pôde sa
nachádzajú v nerozpustných formách, ako sú sulfidy a silikáty a v rozpustných formách (Garrett,
2000). Nikel prítomný v ovzduńí pochádza z emisií z urĉitých priemyselných procesov a dymu zo
spaľovania uhlia a ropných produktov. Toxikokinetika zlúĉenín niklu závisí na ich rozpustnosti vo
vode a telových tekutinách. Nikel sulfid a chlorid niklu sú vysoko rozpustné vo vode (Gad, 2005). Z
antropogénnych zdrojov sa nikel dostáva do prostredia vo forme rozpustných zlúĉenín oxidov,
sulfidov, silikátov a v menńej miere ako kovový nikel. Najväĉńím zdrojom zlúĉenín niklu v ovzduńí je
spaľovanie fosílnych palív (Merian, 1984). Nikel je esenciálnym prvkom pre niekoľko druhov zvierat.
V pokusoch na zvieratách bolo dokázané, ņe nikel spôsobuje pokles telesnej hmotnosti, zníņenie
pôrodnosti a zmeny sérových lipidov a glukózy (Kalafová et al., 2008 a 2009). Zinok je nevyhnutný
stopový prvok a slúņi ako aktivátor pribliņne 300 enzýmov. Epidemiologické ńtúdie naznaĉujú, ņe
nedostatok zinku môņe byť spojený so zvýńeným rizikom rakoviny (Sahin et al., 2009). Mierny deficit
zinku spôsobuje chronické metabolické poruchy, ktoré vedú k imunodeficiencii, k tráviacim,
endokrinným, neurologickým poruchám, rakovine, predĉasnému starnutiu, degeneratívnym
ochoreniam (Cummings a Kovacic, 2009).
Materiál a metodika
V experimente bolo pouņitých 45 zvierat králika domáceho brojlerovej línie Kalifornský
(CVŅV, Luņianky) o hmotnosti 3,5 – 4,0 kg vo veku 4 mesiace, ktoré boli rozdelené do piatich skupín
(P1, P2, P3, P4, K). V prvej skupine (P1) zvieratá (n=9) dostávali nikel (NiCl2, Reachem, Slovensko)
v kŕmnej dávke 17,5 g NiCl2.100 kg-1 (KZ) po dobu 90 dní. V druhej skupine (P2) zvieratá (n=9)
148
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
dostávali dvojnásobnú dávku niklu v rovnakom ĉasovom období. V ćalńej skupine (P3) sme podávali
deviatim zvieratám nikel v dávke 17,5 g NiCl2.100 kg-1 KZ v kombinácii so zinkom v koncentrácii 30
g zinku (ZnCl2, Reachem, Slovensko) po dobu 90 dní. V poslednej pokusnej skupine (P4) zvieratá
(n=9) prijímali krmivo s prímesou niklu (35 g NiCl2.100 kg-1 KZ) a zinku (30 g ZnCl2.100 kg-1 KZ)
po dobu 90 dní. Na porovnanie výsledkov sme zostavili skupinu deviatich zvierat (K – kontrolná
skupina), ktorá prijímala rovnakú kŕmnu zmes (KKV1), ale bez pridania niklu a zinku. Vńetky zvieratá
boli umiestnené v klimatizovaných halách, v jednopodlaņných individuálnych kovových klietkach
typizovaných rozmerov. Voda a krmivo bola zvieratám k dispozícii ad libitum. Zvieratám bola
v pravidelných mesaĉných intervaloch odoberaná krv z vena auricularis centralis. Zo vzoriek krvi
bolo separované krvné sérum centrifugáciou pri otáĉkach 3000.min.-1 po dobu 30 minút. V krvnom
sére boli stanovené ukazovatele enzymatického profilu (AST, ALT, GGT, ALP, bilirubín, GLDH,
celkový kreatinín) pouņitím automatického klinického analyzátora Microlab 300 (Vital Scientific,
Holandsko). Na vykonanie ńtatistickej analýzy boli pouņité programy SAS a Sigma Plot 9.0 (Jandel, Corte
Madera, USA). Program ANOVA bol pouņitý na výpoĉet základných ńtatistických charakteristík a
zistenie významných rozdielov medzi skupinami (priemer a smerodajná odchýlka). Rozdiely boli
porovnávané a ńtatistickú významnosť sme stanovili na úrovni P<0,05.
Výsledky
Pri hodnotení enzymatického profilu (Graf 1) sme zaznamenali pri AST vyńńiu priemernú
hodnotu 0,25±0,08 µkat.l-1 v P2 skupine, v ostatných skupinách sa hodnoty pohybovali v rozmedzí od
0,22±0,07 µkat.l-1 do 0,24±0,10 µkat.l-1 (kontrolná skupina). Hodnota ALT 0,47±0,13 µkat.l-1
v kontrolnej skupine bola niņńia ako v skupine P4 0,51±0,19 µkat.l-1. V kontrolnej skupine bol obsah
ALP nesignifikantne vyńńí 2,50±2,02 µkat.l-1 ako v pokusných skupinách (2,03±1,29 – 2,26±1,83
µkat.l-1). Signifikantné zníņenie P<0,05 hladiny GGT sme zaznamenali medzi kontrolnou skupinou
0,20±0,08 µkat.l-1 a skupinou P2 0,16±0,07 µkat.l-1 s dvojnásobnou dávkou niklu. Vyńńiu hodnotu
GLDH 0,16±0,06 µkat.l-1 sme zistili v skupine kontrolnej, v pokusných skupinách sa priemerné
hodnoty pohybovali od 0,14±0,06 µkat.l-1 do 0,15±0,07 µkat.l-1.V skupinách P1 a P2 (16,95±15,43
µkat.l-1 a 15,08±13,96 µkat.l-1) s prídavkom samotného niklu pri celkovom kreatiníne boli hodnoty
nesignifikantne vyńńie v porovnaní s kontrolnou skupinou 12,24±9,39 µkat.l-1. Priemerná hodnota
bilirubínu v kontrolnej skupine bola 6,39±2,32 µmol.l-1, najvyńńia priemerná hodnota 6,60±1,83
µmol.l-1 bola zistená v skupine P4.
100
10
1
*
0,1
AST
ALT
GGT
K
ALP
P1
P2
bilirubín
P3
GLDH
CK/10
P4
Graf 1 Priemerné hodnoty enzymatického profilu (µkat.l-1, bilirubín - µmol.l-1 ) králikov
149
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Diskusia
V nańom pokuse hodnoty AST a ALT boli podobné vo vńetkých sledovaných skupinách
a zaznamenali sme nesignifikantné rozdiely. Sidhu et al. (2004a) u potkanov zistili v sére signifikantné
zvýńenie aktivity AST a ALT následkom pridania niklu. Súĉasne po pridaní zinku sa upravili zmeny
hladín AST a ALT. Zmeny AST aktivity a hodnoty triacylglycerolov po pridaní niklu indukujú
pońkodenie parenchýmu peĉene (Bersenyi et al. 2004). Sidhu et al. (2005) v práci zistili signifikantné
zvýńenie aktivity enzýmov ALP a ALT u potkanov vystavených úĉinku niklu. Zaujímavé je, ņe po
podaní zinku dońlo k úprave hladín týchto enzýmov k normálnym hodnotám. Capcarová et al. (2008)
nezistili signifikantné rozdiely ani u ALT a GLDH v sére u sliepok po pridaní niklu rovnako ako aj
Bersenyi et al. (2004) u potkanov. Mishra et al. (1990) pozorovali v obliĉkách zvýńenie aktivity GGT
po aplikácii niklu u potkanov a zníņenie aktivity v peĉeni. Nańe zistenia ukazujú signifikantne vyńńie
hladiny GGT v kontrolnej skupine v porovnaní so skupinou P2, ale aj táto hodnota bola v rámci
fyziologického rozpätia (Gillet, 1994). U králikov obliĉkové choroby nezvyńujú GGT v krvi, pretoņe
sa vyplavuje najmä moĉom. Jeho zvýńená hladina v krvi je spájaná najmä s hepatobiliárnymi
chorobami.
Záver
Nańe výsledky neukázali signifikantné rozdiely vo väĉńine sledovaných ukazovateľov
enzymatického profilu. Signifikantné zníņenie (P<0,05) sme zistili pri priemerných hladinách GGT
medzi kontrolnou skupinou a skupinou P2 s dvojnásobnou dávkou niklu. V krvnom sére sme zistili,
ņe priemerná hladina AST bola vyńńia v skupine P2 v porovnaní s kontrolnou skupinou. Pri
porovnávaní priemerných hladín ALP a GLDH sme zistili v kontrolnej skupine vyńńie priemerné
hodnoty v porovnaní s kontrolnou skupinou. Naopak pri porovnávaní priemerných hladín ALT
a kreatinínu boli zistené v kontrolnej skupine niņńie hodnoty v porovnaní s pokusnými skupinami.
Priemerná hladina bilirubínu bola najniņńia v pokusnej skupine P2 s prídavkom dvojnásobnej dávky
niklu.
Poďakovanie
Táto práca bola finanĉne podporovaná grantom APVV 0299-06 a APVV SK-PL-0007-09.
Pouņitá literatúra
BERSÉNYI, A. - FEKETE, G. Y. - SZILÁGYI, M. - BERTA, E. - ZÖLDÁG, L. - GLÁVITS, R.
2004. Effects of nickel supply on the fattening performance and several biochemical parameters of
broiler chickens and rabbits. In Acta Vet. Hungarica. vol. 52, 2004, no. 2, p. 185-197.
CAPCAROVÁ, M. - KOLESÁROVÁ, A. - ARPÁŃOVÁ, H. - MASSANYI, P. - LUKÁĈ N. KOVÁĈIK, J. - KALAFOVÁ, A. - SCHNEIDGENOVÁ M. 2008. Blood Biochemical Dynamics and
Correlations in LayingHens after Experimental Nickel Administration. In International Journal of
Poultry Science, vol.7,2008, no. 6, p. 538-547, ISSN 1682-8356.
CUMMINGS, J. E. - KOVACIC, J. P. 2009. The ubiquitous role of zinc in health and disease. In J Vet
Emerg Crit Care., vol.3, 2009, no.19,pp. 215-40.
GARRETT, R. G. 2000. Natural sources of metals to the environment. In J.A. Centeno, P. Collery, G.
Fernet, R.B. Finkelman, H. Gibb and J.-C. Etienne, Metal ions in biology and medicine 6, John Libbey
Eurotext, Paris: 2000, pp. 508–5
GILLET, C. S. 1994. Selescted drug dosages and clinical reference data. In The biology of the
Laboratory Rabbit, 2end edn.,1994, p.467 – 472.
KALAFOVÁ, A. - KOVÁĈIK, J. - CAPCAROVÁ, M. - LUKÁĈ, N. - CHRENEK, P. CHRASTINOVÁ, Ľ. - SCHNEIDGENOVÁ, M. - ĈUPKA, P. - JURĈÍK, R. - MASSÁNYI, P. 2008.
The effect of single nickel and combined nickel and zinc peroral administration on growth, total
protein and cholesterol concentrations in rabbit. In Slovak Journal of Animal Science, Nitra: Slovenské
centrum poľnohospodárskeho výskumu, vol. 41, 2008, no. 4, pp. 179-183, ISSN 1335-3683.
KALAFOVÁ, A. - MASSÁNYI, P. - CHRENEK, P. - KOVÁĈIK, J. - LUKÁĈ, N. CHRASTINOVÁ, Ľ. - SCHNEIDGENOVÁ, M. - ĈUPKA, P. - JURĈÍK, R. 2009. The effect of
single nickel and combined nickel and zinc peroral administration on selected mineral blood
parameters in female rabbits. In Potravinárstvo, vol. 3, 2009, no. 4, p.26-29, ISSN 1338-0230.
150
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
MERIAN, E. 1984. Introduction on environmental chemistry and global cycles of chromium, nickel,
cobalt, beryllium, arsenic, cadmium, and selenium, and their derivatives. In Toxicol. Environ. Chem.,
vol. 8, 1984, pp. 9–38.
MISHRA, M. - RODRIGUEZ. R.E. - KASPRZAK, K.S. 1990. Nickel induced lipid peroxidation in
the rat: Correlation with nickel effect on antioxidant defense systems. In Toxicol., vol. 64, 1990, p. 117.
SIDHU, P. - GARG, M. L. - DHAWAN, D. K. 2004a. Protective role of zinc in nickel induced
hepatotoxicity in rats. In Chemico-biological Interactions, vol. 150, 2004a, no. 2, p.199-209.
SIDHU, P. - GARG, M. L. - DHAWAN, D.K. 2004b. Protective role of zinc in nickel induced
hepatotoxicity in rats. In Chem. Biol. Interact., vol. 150, 2004a, no. 2, p. 199-209.
SIDHU, P. - GARG, M. L. - MORGENSTERN, P. - VOGT, J. - BUTZ, T. - DHAWAN, D. K.
2005. Ineffectiveness of nickel in augmenting the hepatotoxicity in protein deficient rats. In
Nutr. Hosp., vol. 20, 2005, no. 6, p. 378-385.
151
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
EGG YOLK OXYCAROTENOIDS OFFER PROTECTION AGAINST AMD
KERTI Annamária, KISS Zsuzsanna, LAKNER Hajnalka, BÁRDOS László
Department of Animal Physiology and Health, Faculty of Agriculture, Szent István University
Gödöllő, Hungary
Abstract
Age related macular degeneration (AMD) affects older adults that cause central vision loss because of
damage to the macula lutea of retina. The macula lutea contains oxycarotenoids (lutein and
zeaxanthin). These yellow dies protect the retina from harmful energy of light. Without this protection
oxidative stress within the retina is leading to a loss of central vision and develops the AMD. It has
been suggested that eating green leafy vegetables, which are rich in lutein and zeaxanthin, may
decrease the risk for age related macular degeneration. Beside the green vegetables the egg yolk
contains lutein and zeaxanthin in considerable amount and their bioavailability is higher than that from
vegetable sources. Survey was made in the eight most frequent egg supplier of the sole egg powder
producer planed to know the mean lutein/zeaxanthin concentration of eggs and egg yolk powder. The
mean weight of eggs was 60.3±1.0 g that means large (L) quality. The mean yolk colour score (by
yolk colour fan, DSM) was 11.2±0.42. In the case of weights three and in the case of yolk colour the
eggs one supplier were different from the means by ANOVA. The main carotenoid substances in the
samples of yolk and powder were lutein/zeaxanthin by HPLC analysis. The total carotenoid and
lutein/zeaxanthin concentrations were decreased in yolk powder compared to fresh egg yolk. It means
that some quantity of these oxygen susceptible molecules have damaged during the procedure of
pulverization.
Key words: egg yolk, carotenoids, AMD, HPLC
Introduction
Human and animal investigations have demonstrated that carotenoids are associated with a
number of health benefits. These benefits of carotenoids are: antioxidant activities, antitumor effects,
positive immunomodulations (Rao and Rao 2007). One of the most investigated roles of carotenoids is
the preventive and curative effects of two oxycarotenoids (lutein and zeaxanthin) for protection of the
macula from degeneration (Seddon et al. 1994). Age related macular degeneration (AMD) affects
older adults that cause central vision loss because of damage to the macula lutea of retina. The macula
lutea contains oxycarotenoids (lutein and zeaxanthin). These yellow dies protect the retina from
harmful energy of light. Without this protection oxidative stress within the retina is leading to a loss of
central vision and develops the AMD. AMD is an untreatable disease and occurs in “dry” and “wet”
forms. It is the major cause of blindness in people over age 50. There are a number of risk factors
which have been identified playing role in developing AMD, such as age, gender, genetics, smoking,
sunlight and last but not least nutrition. It is possible to control the environmental factors seem to be
linked to AMD. Consuming a well balanced diet with plenty of fresh fruits and vegetables containing
oxycarotenoids (lutein and zeaxanthin) and stopping smoking may all help to delay the progress of
AMD (Trumbo and Ellwood 2006). It has been suggested that eating green leafy vegetables, which are
rich in lutein and zeaxanthin, may decrease the risk for age related macular degeneration
(Sommerburg et al. 1998). Beside the green vegetables the egg yolk contains lutein and zeaxanthin in
considerable amount. The lutein bioavailability from egg is higher than that from vegetable sources
(Chung et al. 2004).
In the base of these finding an investigation was carried out to determine whether the egg yolk
powder as an endurable egg product can be offered as a permanent source of oxycarotenoids.
152
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Materials and methods
Samples
The sole industrial egg processing plant offers a range of boiled, powder and liquid egg products
in Hungary. The plant buys fresh eggs from different producers. Our samples were taken from eight
suppliers twenty from each. At the same time four different lots of egg yolk powder were taken too.
The eggs were weighed and after the breakage the colour of yolks were characterized by Yolk
Colour Fan (DSM). Aliquot volume from yolks were measured and suspended in 0.5 ml of 5 % (w/v)
ascorbic acid solution to prevent the oxidation during storage (-20C) until analysis. The egg yolk
powders were not frozen but stored in refrigerator (+4C) too.
Chemical analysis
Carotenoid, retinoid and tocopherol concentrations of egg yolks and yolk powders were
analyzed by HPLC techniques adapted and modified in our laboratory (Kerti and Bárdos 2006). The
procedure in brief: the samples were extracted with extraction mixture (hexane : acetone : ethanol :
toluol 10:7:6:7) and saponified in alcoholic potassium hydroxide at 56C for half an hour. The extract
got cold at room temperature in dark for one hour and was mixed with hexane and diluted to mark
with 10 % sodium sulfate. After the solution was placed in darkness for 1 hour again 400 µl of
supernatant was evaporated in N 2 stream. The residuum was dissolved in 100 µl of ethanol/dioxane
(1:1) and in 150 µl acetonitrile. The clear extract (20 µl) was injected into C18 Rocket Platinum
column (100A 3µ 53 mm x 7 mm)(Alltech, USA) which was connected to the HPLC system what
consisted of PU-980 pump and UV-2077 multichannel detector (Jasco, Japan). The mobile phase was
prepared of mixtures of acetonitrile : tetrahydrofuran : methanol : 1% ammonium-acetate
(684:220:68:28). The flow rate was 1 ml/min and the chromatograms were monitored at 290 nm for
tocopherol, at 325 nm for retinoids and at 450 nm for carotenoids. Identification of anilities based on
standards and the concentrations were calculated by Chrompass software (Jasco, Japan).
Statistical analysis
Simple comparison of means was made by paired t-test. For the comparison of sample means data to
collective mean one-way ANOVA with Dunnett‟s post test was performed using GraphPad Prism
version 5.0 for Windows.
Results
The mean weight of eggs was 60.3±1.0 g that means large (L) quality (Fig. 1.). The mean yolk
colour score (by yolk colour fan, DSM) was 11.2±0.42 (Fig. 2.). In the case of weights three and in the
case of yolk colour one supplier‟s eggs were different from the means by ANOVA. The main
carotenoid substances were lutein/zeaxanthin by HPLC analysis in the samples of yolk and powder.
The total carotenoid and lutein/zeaxanthin concentrations were decreased in yolk powder compared to
fresh egg yolk. Concentrations of total retinoids and tocopherol are not decreased in similar manner.
These substances were increased (Table 1).
153
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Table 1 Carotenoid, retinoid and tocopherol concentrations of raw egg yolk and powder1,2
Total
Lutein/Zeaxanthin Total retinoid3
Tocopherol
carotenoid
Egg yolk
31.9±20.8
12.0±7.9
5.1±0.9
8.8±4.9
Yolk powder
21.8±4.7**
10.3±2.2
15.4±1.0***
14.2±3.3***
1
values are expressed in µg g-1 means ± SD
asterisks indicate differences between values of lines (paired t-test): ** p <0.01, *** p < 0.001
3
retinol and retinyl esters
2
Figure 1 Egg weights of eight suppliers (I.-VIII., n=20) and mean1
1
Grey coloured columns indicate significant differences (p<0.05, ANOVA) compared to mean (red line)
Figure 2 Yolk colour scores of eight suppliers (I.-VIII., n=20) and mean1
1
Grey coloured column indicate significant difference (p<0.05, ANOVA) compared to mean (red line)
154
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Discussion
The basic egg samples (supplier I.-VIII.) in our investigations seemed to be homogeneous only
with few exceptions (Fig. 1. and 2.). The dry matter content of the freshly laid egg yolk varies from 50
to 52%. The yolk powder contains only about 2-5% water. These differences are reflected in the
retinoid and tocopherol concentrations in egg yolk and yolk powder in our results, respectively. The
concentrations of these vitamins (retinoids and tocopherol) are increased in the powders (Table 1.).
The concentrations of total carotenoids including lutein/zeaxanthin are not increased in similar
manner. It means that some quantity of these oxygen susceptible molecules have damaged during the
procedure of pulverization (Table 1.).
Dried and powdered egg yolk is excellent for cooking and baking in large scale in household
kitchens too. The dried egg yolk is pasteurized therefore it is very stable for long periods of time. The
cookery uses yolk powder because it creates a smooth texture of sauces and cakes. During storage the
yolk powder should keep in air tight sacks or containers away from moisture and heat and also keep
away from direct sunlight that will cause the oxidation of the lipids and lipid soluble materials (e.g.
vitamins).
Beside these cookery possibilities the egg yolk powder capable as an easy to use nutraceuticum.
It contains lutein/zeaxanthin in high amounts. Lutein and zeaxanthin are differing only in the position
of one double bond in their terminal ring. Their separation from each other under common HPLC
condition is not possible because of the very similar chemical structure of these oxycarotenoids
(Sowell et al. 1994).
For these reason these oxycarotenoids were mentioned together. Beside the similar structure
their similar occurrence and biological effects explain the joint mention. The lutein/zeaxanthin are
accumulates in macula lutea and protects the retina from harmful energy of light. The bioavailability
of lutein/zeaxanthin is very good from egg yolk. Egg yolk contains significantly less lutein than
spinach, but it is much more bioavailable source that consumption increases lutein concentrations in
the blood two-fold higher than spinach (Chung et al. 2004).
Some major factors are limiting the availability of xanthophylls including physical disposition in food
sources (food matrix), structure of the xanthophyll (oxycarotenoid) molecules, interaction of
xanthophylls with other nutrients (mainly dietary fat) and malnutrition (Castenmiller and West 1998).
Although the mechanism by which egg yolk increases lutein bioavailability is not yet known, it
is likely due to the fats (cholesterol and choline) found in egg yolk. Lutein, like other carotenoids, is
fat-soluble, so cannot be absorbed unless fat is also present.
A greater amount of fat is required for the optimal deesterification of lutein esters and
absorption of lutein. Thus, more than 3 g of fat was required for the sufficient solubilisation of lutein
diesters and/or secretion of esterases and lipases from the pancreas (Roodenburg et al. 2000). This fat
dependent absorption is especially can be realized for dried egg yolks because its total fat content is 56
% (w/w).
Hens fed a diet based on yellow corn over 20 carotenoids were detected in the yolk by HPLC.
Placing the hens on a white corn-soy based diet supplemented with lutein (20 micrograms/g diet), only
lutein and different lutein esters (monoester, diester, and 3'-oxolutein) were assumed new equilibrium
concentrations in the yolk. These data suggest an esterification and an oxidative pathway in laying
hens for the metabolism of oxycarotenoids (Schaeffer et al. 1988).
Small quantities of mono- and diester forms of lutein and zeaxanthin have been identified in
foods (Khachik et al. 1991).
Considering these facts the regular consumption of egg yolk powder offers protection against
AMD. The designer egg is well known on the market of functional foods.
The egg yolk powder can be easy designed during the processing. For example before the
pulverization such biological active material can be added which is not present in the raw egg (e.g.
ascorbic acid). Because of that the water content of raw egg yolk is about 50 % therefore one
teaspoonful of egg yolk powder and one teaspoonful of water results one egg yolk. That means that the
calculation of suitable bioactive amount and the dosage of egg powder is easy accomplishable.
155
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
References
CASTENMILLER, J.J.M. - WEST, C.E. 1998. Bioavailability and bioconversion of carotenoids. In Annu.
Rev. Nutr., vol. 18, 1998, p. 19–38.
CHUNG, H.-Y. - RASMUSSEN, H.M. - JOHNSON, E.J. 2004. Lutein bioavailability is higher from luteinenriched eggs than from supplements and spinach in men. In J. Nutr., vol. 134, 2004, p. 1887–1893.
KERTI, A. - BÁRDOS, L. 2006. Simultaneous determination of retinoids (retinol, retinyl palmitate),
carotenoids (lutein, zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, lycopene, ß-carotene) and vitamin E by rp-HPLC. In
Clin. Exper. Lab. Med., vol. 32, 2006, Abstract. p.106.
KHACHIK, F. - BEECHER, G.R. - GOLGI, M.B. 1991. Separation, identification, and quantification of
carotenoids in fruits, vegetables and human plasma by high performance liquid chromatography. In
Pure Appl. Chem., vol. 63, 1991, p.71–80.
RAO, A.V. - RAO, G.L. 2007. Carotenoids and human health. In Pharmacol. Res., vol. 55, 2007, p.
207-216.
ROODENBURG, A.J.C. - LEENEN, R. - VAN HET HOF, K.H. - WESTSTRATE, J.A. - TIJBURG, L.B.M.
2000. Amount of fat in the diet affects bioavailability of lutein esters but not of -carotene, ß-carotene
and vitamin E in humans. In Am. J. Clin. Nutr., vol. 71, 2000, p. 1187–1193.
SCHAEFFER, J.L. - TYCZKOWSKI, J.K. - PARKHURST, C.R. - HAMILTON, P.B. 1988. Carotenoid
composition of serum and egg yolks of hens fed diets varying in carotenoid composition. In Poult.
Sci., vol. 67, 1988, p. 608-614.
SEDDON, J.M. - AJANI, U.A. - SPERDUTO, R.D. - HILLER, R. - BLAIN, N. - BURTON, T.C. - FARBER,
M.D. - GRAGOUDOS, E.S. - HALLER, J. - MILLER, D.T. - YANNUZZI, L.A. - WILLETT, W. 1994. Dietary
carotenoids, vitamin A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration. In J. Am. Med.
Assoc., vol. 272, 1994, p. 1413–1420.
SOMMERBURG, O. - KEUNEN, J.E.E. - BIRD, A.C. - VAN KUIJK, F.J.G.M. 1998. Fruits and vegetables
that are sources for lutein and zeaxanthin: the macular pigment in human eyes. In Br. J. Ophthalmol.,
vol. 82, 1998, p. 907-910.
SOWELL, A.L. - HUFF, D.L. - YEAGER, P.R. - CAUDILL, S.P. - GUNTER, E.W. 1994. Retinol, tocopherol, lutein/zeaxanthin, ß-cryptoxanthin, lycopene, -carotene, trans-ß-carotene, and four retinyl
esters in serum determined simultaneously by reversed-phase HPLC with multiwavelength detection.
In Clin. Chem., vol. 40, 1994, p. 411-416.
TRUMBO, P.R. - ELLWOOD, K.C. - 2006. Lutein and zeaxanthin intakes and risk of age-related macular
degeneration and cataracts: an evaluation using the Food and Drug Administration's evidence-based
review system for health claims. In Am. J. Clin. Nutr., vol. 84, 2006, p. 971-974.
156
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
TOXIC AND BIOGENIC METALS IN HUMANS’ TEETH FROM MALOPOLSKA
DISTRICT
KILIAN K., GOC Z., STAWARZ R., FORMICKI G., OBRZUT M., CIĄGŁO A.,
KUCZKOWSKA – KUŹNIAR A.
Institute of Biology, Pedagogical University of Cracow, Department of Vertebrate Zoology and
Human Biology, ul. Podbrzezie 3, 31-045 Kraków, Poland
Abstract
The aim of the study was to investigate the concentrations of cadmium, lead, nickel, copper, zinc and
iron in humans‟ teeth relation with sex, age and smoking habits. Teeth were taken from 212 patients of
Dental Health Centre in Tuchów, Małopolska District- South Poland. Toxic and biogenic metals were
determined by flame atomic absorption spectrophotometry method (FAAS). The concentrations of
metals were expressed in micrograms per one gram of the dry mass. Statistical analysis was performed
using ANOVA Kruskal-Wallis and U Mann-Whitney test. Correlation coefficients between metals
were calculated by Spearman‟s correlation test. Statistically significant differences between age
groups in case of lead and nickel concentrations were found. Additionally, statistically significant
differences were detected between cadmium level in teeth of smoking and nonsmoking women. Our
results suggest that concentrations of other metals are independent of age, sex and smoking influence.
Moreover, we found positive correlation between toxic and biogenic metals. These observations
suggest that teeth are good bioindicators of toxic substances and can play role as a biomarkers,
because elements built-in their structure cannot return easily to body fluids.
Key words: teeth, trace elements, lead, cadmium
Introduction
Environmental pollution from heavy metals is matter of analysis in many countries. Heavy
metals, especially lead and cadmium have no known physiological functions and are toxic even in low
concentrations, they are mainly air and food contaminants which enter the body by inhalation and
ingestion. Another source of cadmium and lead is smoking, several studies showed that the levels of
this toxic metals in smokers are much higher than in nonsmokers (Frank et al., 1999). Lead has
carcinogenic and teratogenic properties. Lead accumulates mainly in bones and teeth but the amount
of lead released from teeth is non-essential (Elinder et al. 1988). Encephalitis, behavioral disorders
and inattention, reduced nerve conduction and IQ deficit are main neurotoxic effects of lead
(Fergusson 1990, USDHHS 1993). Cadmium can damage all types of body cells by damaging the cell
membrane. The main organs for Cd accumulation are kidneys and the liver. Cadmium can replace
essential elements of enzymes such as Zn because of this it can make enzyme biologically out of
order. Moreover, Pb and Cd accumulation can affect the concentration of essential metals such as Fe,
Zn, Cu and Ca (Nowak ,Chmielnicka, 2000).
The Malopolska province is one of the largest industrial and urbanized regions in Southern
Poland, it occupied third place nationally for sulfur dioxide emissions and second place for dust
emission. The main sources of dust and gaseous pollutants are steel-works, electric-power plant at
Skawina, chemical industries in Oświęcim and Alwernia, a refinery in Trzebinia and the Pb/Zn mine
and smelter in Bukowno near Olkusz (Gdula-Argasińska et al., 2004, Enivonment 2001)
Teeth are used as biological markers of exposure to environmental pollution because they are
easily available and they incorporate metals into the mineral phase of dental tissues. (Lee et al.,1999).
During the process of mineralization of tissue teeth have the ability to build into their structure many
chemical elements, both essential metals such as Cu, Zn, Fe, Mg, and Na as well as toxic ones ie. Pb
and Cd (Fischer, 2008). Because of this, teeth provide relatively stable subject of environmental
metals exposure.
The objectives of this study were to determine the mean concentration of essential (Cu, Zn, Fe),
xenobiotic (Cd, Pb) metals and investigate the factors affecting their levels in human deciduous and
permanent teeth.
157
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Material and methods
The study subjects were recruited from patients of Stomatology Health Centre in Tuchów,
Malopolska District in southern Poland. Among 212 volunteers were 97 women and 115 men in age 7
to 80 years old. Study subject were segregated into eight age groups: A (1-10 years old), B (11-19
years old), C (20-29 years old), D (30-39 years old), E (40-49 years old), F (50-59 years old), G (60-69
years old), H (70-80 years old). Additionally, each age group was divided in relation with sex and
smoking habits.
Teeth samples were soaked in 30% H2O2 for one minute, than washed in 10% hydrogen
peroxide and in demineralized water, to get rid of residues of tissues and blood. Next teeth samples
were dried at 105º C until dry mass was obtained. All dry material of each sample was weighted and
placed in a separate mineralization tubes and mixed with 2 cm3 of 65% HNO3 and heated at 120°C for
120 minutes in a thermostat- controlled digestion block, VELP Scientifica DK 20. After cooling the
samples were filled to the volume of 10 cm3 with demineralized water. Trace elements like iron,
copper, zinc and xenobiotics like cadmium, nickel and lead were measured by flame atomic absorption
spectrofotometry (FAAS). The concentrations of the elements were expressed in micrograms per one
gram of the dry mass.
Statistical analysis was performed using ANOVA Kruskal-Wallis and U Mann-Whitney test.
Correlation coefficients between metals were calculated by Spearman‟s correlation test.
Results
In our study 212 teeth samples were analyzed for the Zn, Fe, Cu, Cd and Pb concentration. All
analyzed metals were preset in each sample. Content of xenobiotic elements was diversified and
dependant on age and sex of volunteers as shown on fig. 1 and fig.2.
Figure 1 Mean concentrations of cadmium in teeth samples from different age groups (µg·g-1 dry
mass)
158
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Figure 2 Mean concentrations of lead in teeth samples from different age groups (µg·g -1 dry
mass)
Additionally, we study influence of smoking on cadmium and lead levels in men‟ and women‟
teeth. The differences between smoking women and men are insignificant. Mean concentration of
cadmium and lead is higher in teeth of nonsmoking women, contrary, smoking men have higher level
of this xenobiotic metals (fig.3).
Figure 3 Cd and Pb concentrations in teeth samples of men and women in relation with
smoking (µg·g-1 dry mass)
159
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 1 Tooth metal level according sex, age and smoking (µg·g -1 dry mass).
Sex
Male
Female
Age (years)
1–10
10–19
20–29
30–39
40–49
50–59
60–69
70–81
Smokers
Male
Female
Nonsmokers
Male
Female
Cu
Zn
Fe
3,76
4,66
432,72
556,30
27,31
36,21
6,00
4,39
3,43
3,42
4,34
4,20
4,00
3,92
18,96
920,69
31,15
30,41
1555,40
698,75
661,18
289,60
39,93
26,91
23,19
44,23
25,93
27,12
32,36
34,40
3,65
4,00
863,64
35,16
26,90
36,68
3,90
4,41
921,09
1306,11
26,06
31,47
In our study we also checked the influence of factors like sex, age and smoking on essential
elements in teeth samples. Obtained values are shown in tab.1. Generally, women have higher levels
of trace elements in teeth, but taking into account age and smoking we cannot see clear dependence of
these factors.
Statistical analysis were performed taking into account also metals concentrations in relation
with age and smoking habit. Results showed significant differences only in lead concentration in
relation with age both in groups of women (p=0.001) and men (p=0.000). While, taking into
consideration smoking addict we noticed statistical differences only in case of cadmium in women‟
teeth (p=0.016). Other metals did not show any significant changes. Additionally, we performed R
Spearman correlation analysis, which indicate strong positive relationships between Cd/Pb (p=0.000),
Cd/Fe (p=0.000), Cd/Cu (p=0.000), Cd/Zn (p=0.000), Pb/Fe (p=0.000), Pb/Cu (p=0.000) and Fe/Cu
(p=0.000).
Discussion
Our study points that human teeth involve both trace and xenobiotic metals such as Cu, Fe, Zn,
Cd and Pb. Heavy metals in teeth cannot be again let to body fluids, similarly as in case of bones
(Bayo et al.,2001). These features cause that teeth are stable tissues and can be biological markers of
exposure to environmental pollution (Nowak, Chmielnicka 2000). Statistical analysis did not show any
differences in cadmium concentration in relation with age and sex of patients what corresponding with
data presented by Almonary (2004), however there are some data points that cadmium concentration is
independent of sex, but decrease significantly according with age of children (Báez et al. 2004).
Cadmium concentration demonstrated significant differences between smoking and non-smoking
women but not in group of man. However, Malara et al. (2004,2006) points differences in cadmium
level in teeth of smoking and non-smoking men, but in another study of this authors on wisdom teeth
was no dependence between sex and cadmium level (Malara et al. 2005). This result confirms fact
that cigarette smoke is the main source of cadmium, what is in accordance with Alomary et al. 2006.
Sex and age did not have an influence on copper concentration, though in women‟ teeth was a
little bit higher level of this metal beside to men‟ teeth. This data are confirm by Szostek (1992) who
160
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
also points that higher accumulation of this metal is related with living in agricultural regions, where
are used artificial fertilizers. On the other hands Loska (2007) and Fischer et al. (2008) show
significant influence of industrial areas, type of tooth and sex on Cu concentration in deciduous teeth.
Taking into account lead we noted influence of sex on its concentration, this data are confirmed
by Alomary et al. (2006). Also we observed that level of Pb is age dependent, several previous studies
showed the same relationships, for example, Baranowska et al. (2004) found that age clearly
influenced the concentration of Pb, similarly as Nowak and Chmielnicka, (2000). Additionally, there
were insignificant differences in concentration of Pb between smoking and non-smoking groups, but
mean level of Pb was higher in smoking men‟ teeth, contrary, non-smoking women had higher
concentration of this metal. Also Malara (2004) notes higher Pb level in teeth of smokers, but these
results are insignificant too. Nowak, Chmielnicka (2000) confirmed dependence Pb level on age and
also on type of teeth. Szostek (1992) proved that living in industrial areas is connected with higher
concentration of Pb, what was proved on teeth from volunteers living in Cracow-the most urbanized
city in Malopolska district.
The concentration of iron did not depend on tested factors. However, Malara (2006) points that
higher level of Fe appears in teeth of people from polluted areas, additionally, he signalize that men
have lower level of Fe that women. In our study, differences connected with sex are not significant,
however, we observed slightly lower mean concentration of Fe in men‟ teeth. We obtained the most
diversify results in case of zinc, but these differences are statistically insignificant. Brockhaus (1988)
and Szostek (1992) point that higher concentration of Zn occurs in women‟ teeth, also in our result we
noticed slightly higher mean level of this metal, but this data were statistically insignificant, similar
observations were presented by Malata et al. (2005). We as well as Malara et al. (2004) did not
observed influence of smoking habits on Zn concentration in teeth, in spite of presence Zn in cigarette
smoke.
Additionally, the results of the R Spearman correlation analysis indicated strong positive
relationships between Cd/Pb (p=0.000), Cd/Fe (p=0.000), Cd/Cu (p=0.000), Cd/Zn (p=0.000), Pb/Fe
(p=0.000), Pb/Cu (p=0.000) and Fe/Cu (p=0.000). Some of them, especially with lead are confirmed
by other authors (Meyer Tvinnereim et al. 2000, Fischer etal. 2008, Bayo et al. 2001, Báez et al.
2004), but we cannot explain clearly these connections.
Conclusions
In our work we noticed significant dependence between lead concentration, sex and age of
volunteers, but we did not observe any relationships between cadmium and these factors. In regard to
smoking habits we did not observed its clear influence on concentration of analyzed metals. Metals
determination occurred that zinc is presented in highest level among all metals, while cooper is
presented in the lowest concentration. Analyses of metals in human teeth show various and sometimes
conflicting data. Our study occurs that human teeth can accumulate heavy metals and most of
independent from tested parameters like age, sex and smoking.
References
ALOMARY,A. - AL-MOMANI, I.F. - MASSADEH, A.M. 2006. Lead and cadmium in human teeth
from Jordan by atomic absorption spectrometry: Some factors influencing their concentrations. In
Science of The Total Environment, vol. 369, 2006, no. 1-3, p. 69-75.
BÁEZ, A. - BELMONT, R. - GARCÍA, R. - HERNÁNDEZ, C. J. 2004. Cadmium and lead levels in
deciduous teeth of children living in méxico city . In Rev. Int. Contam. Ambient., vol. 20, 2004, no. 3,
p. 109-115.
BARANOWSKA I, et al. 2004. X-ray fluorescence spectrometry in multielemental analysis of hair
and teeth. In Pol J Environ Stud, vol. 31, 2004, p. 639–46.
BAYO, J. - MORENO-GRAU, S. - MARTINEZ, M. - MORENO, J. - ANGOSTO, J.M. GUILLÉN PÉREZ, J. - GARCIA, M. J. - MORENO-CLAVEL, J. 2001.Environmental and
Physiological Factors Affecting Lead and Cadmium Levels in Deciduous Teeth. In Archives of
Environmental Contamination and Toxicolog, vol.. 41, no. 2, p. 247-254.
ELINDER, C.G. - GERHARDSSON, L. - OBERDOERSTER, G. 1988. Biological monitoring of
toxic metals-Overview. In: T.W. Clarkson, L. Friberg, G.J. Nordberg, P.R. Sager (Eds.) Biological
monitoring of toxic metals, New York: Plenum Press, 1988, pp. 18.
161
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Environment. 2001. Central Statistical Office, Warsaw, Poland.
FERGUSSON, J.E. 1990. The heavy elements: Chemistry, environmental impact and health effects.
Oxford, New York, Seoul, Tokyo: Pergamon Press, 2001, pp. 569-570.
FISCHER, A. - KWAPULIŃSKI, J. - WIECHULA, D. - FISCHER, T. - LOSKA, M. 2008. The
occurrence of copper in deciduous teeth of girls and boys living in Upper Silesian Industry Region
(Southern Poland) In Science of the total environment, vol. 389, 2008, p. 315 – 319.
FRANK, U. - HERBARTH, O. - LANGER, O. - STARK, H.J. - TREIDE, A. 1999. Lead levels in
deciduous teeth in relation to tooth type and tissue as well as to maternal behavior and selected
individual environmental parameters of children. In Environ Toxicol, vol. 14, 1999, no. 5, p. 439–54.
GDULA-ARGASIŃSKA, J. - APPLETONB, J. - SAWICKA-KAPUSTA, K. - SPENCE, B. 2004.
Further investigation of the heavy metal content of the teeth of the bank vole as an exposure indicator
of environmental pollution in Poland. In Environmental Pollution, vol. 131, 2004, no. 1, p. 71-79.
LEE, K.M. - APPLETON, J. - COOKE, M. - SAWICKA-KAPUSTA, K. - DAMEK, M. 1999.
Development of a method for the determination of heavy metals in calcified tissues by inductively
coupled plasma–mass spectrometry. In Fresenius J Anal Chem., vol. 364, 1999, no. 3, p. 245–248.
MALARA, P. 2006. Wpływ wybranych czynników na występowanie metali w korzeniach zębów.
Rozprawa habilitacyjna. Śląska Akademia Medyczna w Katowicach, 2006.
MALARA, P. - KWAPULIŃSKI, J. - DRUGACZ, J. - MALARA, B. 2005. Wpływ palenia
papierosów na charakter i występowanie kadmu i cynku w zatrzymanych zębach mądrości. In
Przegląd Lekarski, vol. 10, 2005, p.1072-1074.
MALARA, P. - KWAPULIŃSKI, J. - MALARA, B. 2004. Wpływ palenia papierosów na
równowagę kationową w zębach mężczyzn. In J. Elementol., vol. 9, 2004, no. 3, p. 413-420.
MEYER TVINNEREIM, H. - EIDE, R. - RIISE, T. 2000. Heavy metals in human primary teeth: some
factors influencing the metal concentrations. In The Science of the Total Environment, vol. 255, 2000,
p. 21-27.
NOWAK, B. - CHMIELNICKA, J. 2000. Relationship of lead and cadmium to essential elements in
hair, teeth, and nails of environmentally exposed people. In Ecotoxicol Environ Saf, vol. 46, 2000, p.
265–74.
SZOSTEK, K., 1992. Badania zawartości ołowiu kadmu miedzi i cynku w stałych zębach
mieszkańców Polski południowej. In Przegląd Antropologiczny, vol. 55, 1992, p. 105-111.
USDHHS (US Department of Health and Human Services). (1993). Toxicological profile for lead
(UPDATE). Prepared by Clement International Corporation Under contract No. 205-88-0608 for U.S.
Department of Health and Human Services, Public Health Service, Agency for Toxic Substances and
Disease Registry. ATSDR/TP-92/12. Atlanta, GA, 6.
Contact address
Katarzyna Kilian
Institute of Biology, Pedagogical University of Cracow, Department of Vertebrate Zoology and
Human Biology, ul. Podbrzezie 3, 31-045 Kraków, Poland
 [email protected]
162
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
SEASONAL VARIATIONS OF YOLK COLOUR AND IgY CONCENTRATION IN
NATURAL REARED HENS’ YOLK
KISS Zsuzsanna, BURAI Ibolya, BORDÁN Judit
Department of Animal Physiology and Health, Faculty of Agriculture, Szent István University,
Gödöllő, Hungary
Abstract
Besides a great number of vitamins and microelements, a specific antibody (IgY) can be accumulated
in egg yolk. The enrichment of vitamins and microelements in egg yolk can be achieved by the
addition of desired supplementary compounds to the feed, after this procedure an increased
concentration can be measured both in blood plasma and in egg yolk. If laying hens are immunized by
specific antigen, the quantity of accumulated antibodies in the egg yolk is arbitrary. In a natural
matrix, accumulated compounds in the eggs that contains IgY, works off with greater efficiency after
ingestion than in synthetic form. In our experiment Speckled Hungarian hens were rearing in a house
farm. The birds were kept on an approximately one hectare area of orchard, scratching on rich grass.
10 eggs were gathered on the last week of the first month of every season, measured the color of egg
yolks with Yolk Color Fan (Hoffman-La-Roche). The specific all-antibody (IgY) concentration of the
egg yolk was examined with direct ELISA method. Our aim was to determine the changes of color and
concentration of IgY in the egg yolk of natural reared laying hens. We concluded to the quantity of allIgY in the egg from the OD values of the ELISA examinations. Based on our results, it‟s clear that the
dim color of egg yolk at spring (10-10) was followed by a deep tone yellow. This tone (11-13)
remained smooth after spring. The all-IgY concentration in the egg yolk is also the smallest at spring,
but as summer comes, the values are four times higher. The concentration is almost the same at
autumn and winter.
Key words: antibody, chicken, egg, IgY, yolk
Introduction
Besides a great number of vitamins, macro- and microelements, specific antibody (IgY) can be
accumulated in the egg yolk (Akita, 1992). Enrichment of vitamins and microelements can be
achieved by addition of desired supplementary compounds to the feed of the hen, which can be
measured in greater concentration both in blood plasma and in egg yolk. If laying hens are immunized
by specific antigen (Tini, 2002) the quantity of accumulated antibodies in the egg yolk is arbitrary
(Klemperer, 1983). In a natural matrix, accumulated compounds in the eggs that contains IgY, works
off with greater efficiency after ingestion than in synthetic form.
The immunoglobulins are different in birds and in mammals. Leslie and Clem (1969) suggested
changing the name of the greatest fraction of bird serum to IgY from IgG. They explained the
distinction and naming with the distinct structure, (Chansarkar, 1998) characteristics (from mammals)
(for example the lack of anchor region, which causes the arms of the molecule to form a Y, the Hchain is longer or shorter, than in case of the IgG of mammals, the tier locations are missing from the
Fc-part), and location (great amounts can be found in the egg yolk; Szabó and Bárdos, 2002; Tuboly,
2002).
163
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Figure 1 The cartoon of mammal‟s and bird‟s immunoglobulin-molecule (Szabó et al., 1989)
IgY the main antibody type of the birds, continuously secreting from the blood of laying bird to
the ovary sporrans. The IgY represents the greatest proportion (70%) in the serum, among the
immunoglobulin. IgY concentration in the sporrans is almost constant, so the deposition is continuous
(Shade, 2005). Thus the great IgY content of the egg yolk is an important element of maternal
immunity (Shade, 1996). The embryo absorbs the IgY, secreted to the yolk and it is already partly
protected against infections in the first 2-3 weeks after hatching (Szabó and Bárdos, 2002).
Materials and methods
We gathered eggs of Speckled Hungarian hens, reared in a house farm, to examine the total-IgY
concentration of the eggs. The hens started their second cycle of laying, their laying was balanced,
(200-220) typical to this breed (Szalai, 2002). We have measured of yolk color by Yolk-Color-Fan
scale (Hoffman-La-Roche, Switzerland).
Hens were kept on 1 hectare of orchard from spring to autumn. This environment with orchard
and rich grass provided a very favorable mixture of feed for the animals. At winter, hens were given
nutrition for laying hens (Bábolna, Hungary), wheat and corn.
10 eggs were gathered on the last week of the first month of every season, measured the color
of egg yolks with Yolk Color Fan.
From the egg yolk we made a rarefaction with a ratio of 1:1 with common salt-tincture (0.75%)
and stored the samples on -20 °C until the ELISA examination. For the ELISA examination after the
homogenization of the stored samples, we made a rarefaction with a ratio of 1:1000, measured the
concentration of IgY and concluded to the IgY content of the eggs from the optical density (OD).
Results
The color of seasonally examined egg yolk samples changes only slightly, the dimmest tone is
at spring, as summer comes, the hens during scratching get natural food, which „colorizes” the egg
yolk (Figure 2.). The dark-yellow color, preferred by the consumers, could be seen at summer and
winter too. The color of the eggs of natural reared hens is balanced through the year, level 10-12 on
the color scale, when natural vegetation on the feeding grounds of hens starts to grow, it can be
observed on the color of the egg yolks. The egg yolk is dark yellow due to the excellent natural
carotenoid sources, such as rich grass and yellow flash fruits.
164
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
14
12
10
8
6
4
2
a
b
a
spring
summer
autumn
c
0
w inter
Figure 2 Changes in the color of egg yolk The letters mean significant differences at p<0.05
The concentration of IgY of the egg yolk shows Figure 3. The ELISA examination showed 0.5
OD in the spring samples, in the rest of the year there aren‟t much change: all-IgY concentration was
four times higher at summer than in spring and the antibody levels stayed here in the rest of the year.
OD
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
spring
summer
autumn
winter
Figure 3 Seasonal change of IgY concentration (mean±SD) in the eggs of Speckled Hungarian hens
Concentration of IgY is mainly effected by the quality of the feed. IgY concentration slightly
varies over some days whether we examine the blood serum or the egg‟s IgY concentration (Carlander
et al., 2001). The egg of natural reared hens, with well supported carotenoid sources, contains
balanced IgY, which has a good effect on the hatchability of eggs.
Discussion
Laying hens are highly efficient producers of polyclonal antibodies. These antibodies are
transported to the egg yolk in large quantities from the blood of laying hens. The total IgY
concentration in the egg yolk is important to protect the newly hatched chick against infections and it
is also an important factor for the production of yolk antibodies for the commercial purposes. A single
egg yolk contains approximately the same amount of IgY as 30 ml of blood (Carlander et al., 2001,
Lösch, 1986).
165
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
We have studied the IgY levels in egg yolk in natural reared Speckled Hungarian hens. Hens
were kept on 1 hectare of orchard from spring to autumn. This environment with different fruits and
rich grass provided a very favorable mixture of feed for the animals.
We found spring to summer, autumn and winter variability of IgY content. The ELISA
examination showed 0.5 OD in the spring samples, in the rest of the year there aren‟t much change:
total IgY was four times higher at summer, than in spring the antibody level stayed here in the rest, of
the year. The results are significant. At winter hens were given nutrition for laying hen‟s wheat and
corn.
The color of seasonally examined egg yolk samples changes only lightly, the dimmest tone is at
spring, as summer comes, the hens during scratching get fruits, grass which ”colorizes” the egg yolk.
The egg yolk is dark yellow and the high level IgY in yolk dependent on food, the excellent
natural carotenoid sources, such as rich grass and yellow flash fruits.
The food which contains more natural origin carotenoids have a result dimmer yellow yolk, and high
level IgY in egg yolk.
References
AKITA, E.M. - NAKAI, S. 1992. Immunglobulins from egg yolks: isolation and purification. In J.
Food Sci, vol. 57, 1992, p. 629-634.
CARLANDER D. - WILHELMSON, M. - LARSSON, A. 2001. Limited Day to Day Variation of IgY
levels in eggs from individual Laying hens. In Food and Agricultural Immunology, vol. 13, 2001, no
2, p. 87-92.
CHANSARKAR, N.L. 1998. Studies on structural stability of hen‟s egg yolk immunglobulin (IgY).
PhD Thesis: University of British Columbia (Canada). 1998.
KLEMPERER, F. 1983. Über natürliche Immunität und ihre Verwertung für die
Immunisierungstherapie. In Arch. Exp. Pathol. Pharmakol., vol. 31, 1983, p. 356-382.
LENGYEL, L. - SZABÓ M. - KISS ZS. - BÁRDOS L. 2001. Utilization of antioxidants from natural
and synthetic matrices. Annual Symposium of the European Academy of Nutritional Sciences,
Budapest, 2001. Táplálkozás-Allergia-Diéta 2001. 6. évf. 3-4 sz. p.19.
LESLIE, G.A. - CLEM L.W. 1969. Phylogeny of immunglobulin structure and function III.
Immunglobulins of chicken. In J.Exp.Med., vol. 130, 1969, no.6, p. 1337-1352.
LÖSCH, U. - SCHRANNER, I. - WANKE, I. - JÜGENS, L. 1986. The chicken egg, an antibody
source. In J. Vet. Med. B., vol. 33, 1986, p. 609-619.
SCHADE, R. - HLINAK, A. 1996. Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects. Altex.,
vol. 13, 1996, no.1, p. 5-9.
SCHADE, R. - HENKLEIN, P. - HLINAK, A. 1997. Egy yolk antibody: state of the art and
advantageous use in the life sciences. In Animal Alternatives, Welfare and Ethics 1997. p. 973-981.
SCHADE, R. et al. 2005. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in
production and use in research and human and veterinary medicine. Atla., vol. 33, 2005, p. 129-154.
SZABÓ, CS. - BÁRDOS, L. - LOSONCZY, S. - KARCHESZ, K. 1998. Isolation of Antibodies from
Chicken and Quail Eggs. Presented at INABIS '98 - 5th Internet World Congress on Biomedical
Sciences
at
McMaster
University,
Canada,
Dec
7-16th.
Available
at
URL
http://www.mcmaster.ca/inabis98/immunology/szabo0509/two.html
SZABÓ, M. - BÁRDOS, L. 2002. Tojástermelés ellenanyag-termelés céljából. In A Baromfi. vol. 3,
2002, p. 54-56.
SZALAI, I. 2002. Régi Magyar baromfifajták. Mezňgazda Kiadó 2002. Budapest
TINI, M. et al. 2002. Generation and application of chicken egg yolk antibodies. In Com. Biochem.
Physiol. A.,vol. 131, 2002, p. 569-574.
TUBOLY, Z. 2002. A baromfi immunrendszere. In A Baromfi., vol. 1, 2002, p. 50-57.
Contact address
Kiss Zsuzsanna
Department of Animal Physiology and Health, Szent István University, Páter K. u. 1. 2100 Gödöllň,
Hungary
 Kiss.Zsuzsanna@ mkk.szie.hu
166
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ANALIZA WŁAŚCIWOŚCI CYDRÓW WYPRODUKOWANYCH NATURALNYM
SPOSOBEM
ANALYSIS OF THE PROPERTIES OF CIDERS PRODUCED BY NATURAL
METHOD
KLUZ M.1, GRABEK-LEJKO D.1, DŻUGAN M.2, PASTERNAKIEWICZ A.2, KISAŁA J.2,
KAPUSTA I.3,MROZEK T.3
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii, 2Katedra Chemii i Toksykologii Żywności, 3Katedra
Przetwórstwa Produktów Pochodzenia Roślinnego, Uniwersytet Rzeszowski, Wydział Biologiczno –
Rolniczy, ul. M. Ćwiklińskiej 2, 35-601 Rzeszów, Polska
1
Abstract
The aim of this work was to asses antioxidant activity, level of sugar and alcohol and to assess the
consumer ciders produced naturally. For the production of apple cider fermented grape used for wine
yeast strains of noble breed Sauternes and Sherry. Measurement of sugar content was determined
using the refractometric method. Determination of ethanol is made using a chemical method of
reducing effects of alcohol in relation to potassium dichromate in the highly acidic environment.
Excess of no reduced dichromate was determined by indirect titration iodimetry. Evaluation of
antioxidant activity using by fluorescence method was made using a PHOTOCHEM. The
measurement was carried out using reagents prepared by the producer. The PHOTOCHEM gives the
value of antioxidant per nmol of ascorbic acid. The samples showed a similar antioxidant content in
ciders, and differences between ciders with yeasts Sherry and Sauternes were minor and amounted to
0.128 - 0.143 nmol ascorbic acid. The level of alcohol in the cider test ranged from 3,38 to 4,66 %.
When assessing the consumer received higher ratings ciders fermented with the participation of yeast
Sherry than Sauternes. Cider apples have high levels of phenolics - antioxidants linked to protection
against stroke, heart disease and cancer. In addition, cider include of many minerals, vitamins and has
a refreshing and alkalizing properties, which also confirmed at the conducted by our research team.
Wprowadzenie
Cydr (ang. Cider) w Polsce popularnie znany jako jabłecznik, jest to napój alkoholowy otrzymywany
w wyniku pełnej lub częściowej fermentacji świeżych jabłek, bądź też soków jabłkowych,
ewentualnie z dodatkiem wody i cukru. Potocznie często uważany jest za swego rodzaju piwo, ze
względu na podobny sposób produkcji i zawartość alkoholu w granicach 1,2- 8,5%, jednak właściwsze
wydaje się zakwalifikowanie cydrów do wyrobów winiarskich[2]. Na skalę handlową produkcja cydru
rozpowszechniła się w całej Europie Zachodniej, szczególnie we Francji, Belgii, Niemczech,
Szwajcarii i krajach skandynawskich. Polska jest znaczącym producentem jabłek oraz soków
jabłkowych, przez co posiada szczególne predyspozycje do rozwoju produkcji tego trunku.
Do produkcji cydrów stosowane są jabłka o stosunkowo wysokiej zawartości garbników, o smaku
słodko-cierpkim i cierpko-kwaśnym. Sok przeznaczony do produkcji cydru powinien zawierać ok.
15% cukrów, 0,2% tanin i 0,3-0,5% kwasów. W celach kupażowych stosuję się dodatek innych
soków, najczęściej gruszkowych[1]. Produkuje się cydry zarówno gazowane, z dodatkiem dwutlenku
węgla, jak i musujące, które są naturalnie nasycone CO2 w procesie fermentacji. Produkcja na skalę
przemysłową przebiega w następujących etapach:
- mycie, rozdrabnianie i tłoczenie owoców
- sulfitacja moszczu (dawka SO2 zależna od pH moszczu)
- fermentacja przez 3-6 tygodni w temperaturze nie przekraczającej 22 ºC
- dekantacja i odwirowanie drożdży
- leżakowanie przez 1-3 miesięcy w temperaturze 10 ºC.
Cydry są też produkowane w warunkach domowych, przy zastosowaniu prostych metod i narzędzi.
Istnieje szereg receptur, według których w gospodarstwie domowym możemy otrzymać popularny
jabłecznik[1].
167
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Cel
Celem pracy było określenie takich parametrów jak: zawartość cukru, zawartość alkoholu, zawartość
antyoksydantów oraz poddanie wyprodukowanych cydrów ocenie konsumenckiej.
Materiały i metody
Napój przygotowano według jednego z naturalnych przepisów na cydr. Jest to tzw. „cydr na sposób
angielski”, produkowany z dodatkiem cukru, cytryny i imbiru.
Do przygotowania jednej porcji zużyto: 5 kg jabłek; 10 l wody; 1 kg cukru; 5 cytryn ;2 g imbiru wg.
przepisu:
„Dojrzałe dorodne winno-kwaskowate jabłka wymyć, pokroić (wraz ze skórką i gniazdem nasiennym
lecz bez ogonków) na ćwiartki i zmiksować na miazgę, wlać ją do dużego garnka kamiennego i dolać
ok. 3 l zimnej wody, po czym odstawić naczynie przykryte gazą na 7 dni. W czasie fermentacji
mieszać miazgę rano i wieczorem. Po tym czasie przecedzić płyn przez gazę, a resztę miazgi odcisnąć,
zmieszać z cukrem, otartą skórką z cytryn i sokiem wyciśniętym z tych cytryn oraz dodać mielony
imbir. Całość dopełnić wodą do 10 l i przelać do butli lekko zakorkowanej na 24 godz. Po tym czasie
cydr przesączyć, rozlać do butelek zamykanych na zakrętkę metalową.”[1].
Według w/w przepisu przygotowano cztery partie cydru. Fermentację dwóch z nich przeprowadzono
wykorzystując szczepy szlachetnych drożdży winiarskich rasy Sherry, a kolejne dwa z zastosowaniem
drożdży rasy Sauternes.
W trakcie fermentacji dokonano pomiaru zawartości cukru i alkoholu. Zawartość cukru oznaczono w
pierwszym, siódmym, ósmym i czternastym dniu, a analizy dokonano przy wykorzystaniu metody
refraktometrycznej[5].
Oceny zawartości etanolu dokonano dwukrotnie w ósmym i czternastym dniu fermentacji. Oznaczenia
dokonano metodą chemiczną wykorzystującą działanie redukujące alkoholu w stosunku do
dichromianu potasu w silnie kwaśnym środowisku. Nadmiar niezredukowanego dichromianu
określano metodą jodometrycznego miareczkowania pośredniego[6].
Oceny zawartości antyoksydantów rozpuszczalnych w wodzie dokonano metodą fluorescencji z
wykorzystaniem aparatu PHOTOCHEM. Pomiar przeprowadzono wykorzystując gotowe odczynniki
dostarczone przez producenta. Aparat podaje wartość przeciwutleniającą w przeliczeniu na nmole
kwasu askorbinowego[3,4].
Gotowy cydr był również poddany ocenie konsumenckiej w której udział wzięło 15 osób. W skali 5
punktowej oceniano zapach, przejrzystość, kolor, i alkohol. Podobnie oceniano smaki jakie
wyczuwalne były w trakcie konsumpcji, a więc smak gorzki, kwaśny, słodki i ostry. Pytano także czy
smak napoju zależy od jego klarowności[7,8].
Wyniki
Zawartość cukru i alkoholu
zawartość cukru [%]
Zawartość cukru jest odwrotnie proporcjonalna do zawartości alkoholu, co jest wynikiem słabego
przefermentowania. Zmiany poziomu cukru wynikają z przefermentowania, a także z dosładzania
napojów w 7 dniu. Bezpośrednio po nastawieniu cydrów najwyższą zawartością cukru odznaczały się
napoje fermentowane przez szczepy drożdży Sherry. Po czternastu dniach natomiast, relatywnie
więcej cukru zawierały cydry fermentowane drożdżami Sauternes. Zawartość alkoholu w napojach
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Sherry1
Sherry2
Sauternes1
Sauternes2
Dzień 1
Dzień7
Dzień 8
Dzień14
168
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
z drożdżami Sherry zarówno w 8 jak i 14 dniu fermentacji była wyższa aniżeli w tych z drożdżami
Sauternes. Napoje po 14 dniach fermentacji zawierały pomiędzy 3,38, a 4,66 % alkoholu.
Rys. 1. Zawartość cukru w badanych cydrach.
5
alkohol [%]
4
Sherry 1
3
Sherry 2
Sauternes 1
2
Sauternes 2
1
0
Dzień 8
Dzień14
Rys. 2. Poziom zawartości alkoholu w badanych próbach.
Zawartość antyoksydantów
Badane próbki cydrów wykazały się zbliżoną zawartością antyoksydantów, a różnice pomiędzy
cydrami fermentowanymi przez szczepy drożdży Sherry i Sauternes były nieznaczne.
Tab. 1. Zawartość antyoksydantów w badanych próbkach cydru w przeliczeniu na kw. askorbinowy
[nmol].
Badana próbka cydru
Sherry1
Sherry2
Sauternes1
Sauternes2
Zawartość kw. askorbinowego [nmol]
0,128
0,135
0,140
0,143
Ocena konsumencka
Podczas oceny konsumenckiej wyższe oceny otrzymały cydry fermentowane przy udziale drożdży
Sherry aniżeli Sauternes. Cydry fermentowane przez drożdże Sherry oceniono wyżej ze względu na
zapach i zawartość alkoholu, natomiast Sauternes otrzymały wysokie oceny ze względu na kolor i
przejrzystość.
169
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
5
4
zapach
przejrzystość
3
kolor
alkohol
2
1
Próbka 1- Sauternes 2
Próbka 2- Sauternes 1
Próbka 3- Sherry 1
Próbka 4- Sherry 2
Rys. 3. Cechy badanych cydrów wg. konsumentów.
5
4,5
4
3,5
gorzki
3
słodki
kwaśny
2,5
ostry
2
1,5
1
Próbka 1- Sauternes 2
Próbka 2- Sauternes 1
Próbka 3- Sherry 1
Próbka 4- Sherry 2
Rys. 4. Ocena smaku badanych cydrów.
W pytaniach otwartych konsumenci wymieniali jako składniki napoju: imbir, chili, paprykę ostrą.
Równocześnie zdecydowana większość deklaruje, że smak napoju nie zależy od jego klarowności.
170
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Podsumowanie
Cydry są jednym z najbardziej popularnych winnych napojów alkoholowych, które powstają w
wyniku fermentacji moszczu jabłkowego. Podczas przeprowadzonego procesu produkcji udało nam
się wyprodukować cztery partie cydru i określić ich właściwości chemiczne oraz przeprowadzić ocenę
konsumencką. Cydr zawiera duże ilości polifenoli, przeciwutleniaczy zapobiegających udarom,
chorobom serca oraz nowotworom. Poza tym cydr jest źródłem wielu minerałów, witamin oraz ma
właściwości orzeźwiające i alkalizujące, co również potwierdziło się w przeprowadzonych przez nasz
zespół badaniach.
Literatura
1. Nowicki T. Z. 2002. Domowe piwa, cydry, wina, nalewki, likiery, kremy. Galion, Gdynia.
2. Bonin S. Wzorek W. Pawluczuk M. 2008. Badania nad produkcją cydrów z możliwością
zastosowania metody ciągłej. Przemysł fermentacyjny i owocowo warzywny nr 10.S34-35
3. Vinson, J.A., Hao, Y., Su, X., & Zubik, L. (1998) J. Agri.
Food Chem. 46, 3630-3634
4. Cuvelier, M. E., Richard, H., & Berset, C. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56, 324-325.
5. Krełowska-Kułas Maria, Badanie jakości produktów spożywczych, PWE, Warszawa 1993
6. Małecka Maria (red.), Wybrane metody analizy żywności, Wydawnictwo Akademii
Ekonomicznej w Poznaniu, Poznań, 2003.
7.
8.
Baryłko-Pikielna N.: "Zarys analizy sensorycznej żywności", WNT, Warszawa 1975.
Gawęcka J., Jędryka T.: "Analiza sensoryczna. Wybrane metody i przykłady zastosowań",
Akademia Ekonomiczna w Poznaniu, Poznań 2001.
171
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
VPLYV NIKLU A ZINKU NA VÝSKYT ABNORMÁLNYCH FORIEM SPERMIÍ
KRÁLIKOV V PODMIENKACH IN VITRO
THE INFLUENCE OF NICKEL AND ZINC ON THE OCCURRENCE OF
ABNORMAL FORMS OF RABBIT SPERMS IN VIVO
KŇAŅICKÁ Zuzana 1, TVRDÁ Eva 1, LUKÁČ Norbert 1, MASSÁNYI Peter 1, KALAFOVÁ
Anna 1, SCHNEIDGENOVÁ Monika 1, ONDRUŃKA Ľubomír 2
1
Department of Animal Physiology, Slovak University of Agriculture, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra,
Slovak Republic
2
Institute of Small Farm Animals, Slovak Agricultural Research Centre, Nitra, Slovak Republic
Abstract
The aim of this study was to determine the influence of per oral administration of various doses of
nickel and zinc in rabbits. We studied the incidence of pathological spermatozoa based on a long-term
per oral administration of these elements in feed dose. We used 20 male rabbit ejeculates (New
Zealand white – SCPV Nitra). The animals were divided to five groups (P1, P2, P3, P4, K). Different
concentrations of nickel (17,5g NiCl2.100 kgPֿ1, 30g NiCl2.100 kgPֿ1, 35g NiCl2.100 kgPֿ1) and zinc
(30g ZnCl2.100 kg P-1) were given to the experimental groups in feed doses for 90 days. The ejaculates
were processed using the method according to Hancock. After the evaluation of microscopic
preparations we found out a significant incidence of abnormal spermatozoa in the group P4 (13,29%),
where the highest proportion of nickel and zinc was administered orally. The high significant
difference (P<0,001) between control and P4 group was found in malformations: head separated from
flagellum, knob twisted flagellum and broken flagellum. The lowest incidence of pathological changes
in all sperm parts were found in the group P3 11,48%. The total percentage of sperm malformations
incidence in the groups P1 and P2 (6,94% a 7,94%) was very similar. The smallest percentage change
was found in the control group (K) 3,72%. The most frequent abnormalities from the total number of
pathological spermatozoa were: head separated from flagellum, knob twisted flagellum, flagellum ball
and broken flagellum. Our results claim negative effects of per oral administration nickel and zinc on
the qualitative rabbit sperms parameters. The protective effect of zinc was not confirmed.
Key words: nickel, zinc, rabbit, pathological spermatozoa
Úvod
Z vývojového aspektu samĉie pohlavné bunky prekonávajú poĉas spermatogenézy celý rad
zmien. Tieto zmeny sú prirodzeným odpadom v podobe rozliĉných malformácií (Gamĉík et al., 1992).
V poslednom období sa výrazne zintenzívnilo ńtúdium ultrańtruktúry spermií, vzhľadom na hlbńie
vysvetlenie moņných príĉin týchto patologických zmien, ktoré spôsobujú imobilitu a následne aj
zníņenú fertilitu spermií. V súĉasnosti môņeme definovať mnohé charakteristické zmeny
v ultrańtruktúre spermií.
Samotný reprodukĉný proces samcov ako zloņitý biologický systém je zraniteľný rozliĉnými
environmentálnymi, fyzikálnymi ako aj chemickými faktormi (Massányi et al., 1999). V súĉasnosti
poznáme mnoho agensov, ktoré priamo i nepriamo ovplyvņujú reprodukĉné schopnosti
hospodárskych zvierat (Gamĉík et al., 1992). Kumuláciou viacerých toxických a nepriaznivých
ĉiniteľov dochádza k potencii negatívnych úĉinkov, ĉo zároveņ prispieva k mnohým subfertilnym
a infertilnym stavom (Massányi, 1991). Kvalitatívne aj kvantitatívne vlastnosti ejakulátu výrazne
ovplyvņujú aj exogénne a endogénne ĉinitele. Na ich vplyve majú výrazný podiel aj ťaņké kovy, resp.
stopové rizikové prvky, ktoré zasahujú do najcitlivejńích orgánových systémov, resp. pohlavného
systému (Lukáĉ et al., 2007). Z tohto hľadiska nańa experimentálna práca skúmala dlhodobé úĉinky
exogénnych vplyvov, ako sú ťaņké kovy (nikel, zinok) na vývoj samĉích pohlavných buniek. Cieľom
nańej predkladanej práce bolo sledovanie vplyvu perorálne podávaného niklu a zinku v rôznych
dávkach na výskyt abnormálnych foriem králiĉích spermií, a tieņ zistiť zastúpenie jednotlivých
172
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
malformovaných spermií. Dôraz sme kládli predovńetkým na ńtruktúry, ktoré majú priamy vzťah
k mechanizmu pohybu samĉej pohlavnej bunky, a to buć na hlaviĉku alebo na biĉík spermie.
Materiál a metodika
Východiskovým materiálom pre nańu laboratórnu analýzu boli králiĉie ejakuláty samcov
plemena Novozélandský biely (n═20) odchovaných na SCPV v Nitre vo veku 5. – 8. mesiacov.
Ejakuláty sme odoberali pomocou umelej vagíny zahriatej na teplotu 50 ºC. Jedna ejakulaĉná dávka
mala objem 0,5-1,0 ml a hustota spermií bola v priemere 500 mil/l-1. Zvieratá boli rozdelené do piatich
skupín (P1, P2, P3, P4, K). V kaņdej skupine boli 4 zvieratá chované v kovových klietkach pri
svetelnom reņime (14 h svetlo) s neobmedzeným prístupom k vode. Zvieratá boli poĉas 90 dní (ad
libitum) kŕmené kŕmnou zmesou (KKV1), do ktorej sa v rôznych dávkach pridával nikel (vo forme
NiCl2, Reachem) a zinok (vo forme ZnCl2, Reachem) (tabuľka 1). Na porovnávanie výsledkov bola
zostavená kontrolná skupina (K), ktorá prijímala rovnakú kŕmnu zmes, ale bez pridania niklu a zinku.
Patologické zmeny na spermiách sme zisťovali pomocou morfologickej analýzy, ktorá spoĉívala
v príprave a pozorovaní mikroskopických náterov. Preparáty sme nechali usuńiť na ohrievacej doske
(38ºC) a následne fixovali Hancockovým roztokom v zloņení formalín 125,0 ml, NaCl 10,0 g,
NaHCO3 0,5 g a aquae fontis ad 1000,0 ml po dobu 30 minút. Fixované preparáty sa následne farbili
metódou podľa Hancocka (metóda farbenia akrozómu, Giemsa). Ide o monochromatickú metódu,
ktorá je vhodná na sledovanie abnormalít akrozómu, ale aj ostatných anomálií spermií. Veľmi dobre
nám zvýrazņuje akrozóm, diferencuje ho od ekvatoriálneho segmentu a pars posterior a zároveņ
zvýrazņuje bazálne granuly. Farbiaci roztok pozostával z roztoku Giemsa-Romanovski (8,0 ml),
Sorensonovho fosfátového pufra (ph 7,0) a z destilovanej vody (70,0 ml). Potom sa preparáty nechali
usuńiť a následne posudzovali na optickom mikroskope Olympus BX 51 (Tokyo, Japan) pri 1500
násobnom zväĉńení. Poĉet hodnotených spermií v jednej vzorke bolo 1000. Patologicky zmenené
spermie sme zaraćovali do klasifikaĉnej tabuľky beņne pouņívanej na hodnotenie spermií
v plemenných chovoch. Zo ńkály patologických foriem spermií sme detailnejńie analyzovali zmeny na
hlaviĉke (akrozomálne a tvarové zmeny), hlaviĉka bez biĉíka a zmeny na biĉíku spermie (kľuĉkovité
stoĉenie biĉíka, zvinutie biĉíka, torzo biĉíka, zlomený biĉík a retencia cytoplazmatickej kvapky).
Dosiahnuté výsledky boli spracované poĉítaĉovým ńtatistickým programom GraphPad Prism 3.02
(GraphPad Software Incorporated, San Diego California USA). Rozdiely medzi skupinami sme
otestovali jednofaktorovou analýzou rozptylu pomocou Dunnettovho testu.
Tabuľka 1
SKUPINA
K
P1
P2
P3
P4
Zloņenie kŕmnych dávok – podávané králikom in vivo
ZLOŅENIE
rovnaká kŕmna zmes (KKV1) bez pridania zinku a niklu
17,5g NiCl2.100 kgPֿ1 (Reachem) kŕmnej zmesi
30g NiCl2.100 kgPֿ1(Reachem) kŕmnej zmesi
17,5g NiCl2.100 kgPֿ1 a 30g ZnCl2.100 kg P-1(Reachem) kŕmnej zmesi
35g NiCl2.100 kgPֿ1 a 30g ZnCl2.100 kg P-1(Reachem) kŕmnej zmesi
Výsledky
Zastúpenie malformovaných spermií pri jednotlivých kŕmnych dávkach
Po zapísaní zmien do klasifikaĉnej tabuľky sme spoĉítali súĉty jednotlivých zmien
patologických spermií. Celkovo sme vyhodnotili 51000 spermií v kontrolných i v pokusných
skupinách, priĉom sme zaznamenali celkový výskyt malformovaných spermií 4260 t.j. 8,35% (tabuľka
2). V jednotlivých pokusných skupinách ako aj kontrolnej sa zistilo, ņe najviac abnormálnych spermií
vzhľadom k poĉtu vyhodnotených preparátov bolo v skupine P4 13,29%, kde sa perorálne podávalo
najvyńńie mnoņstvo zinku a niklu. O nieĉo menńí poĉet malformovaných zmien zo vńetkých ĉastí
spermií sme zaznamenali v P3 skupine 11,48%, kde bola podávaná kombinácia niklu 17,5g NiCl 2.100
kgPֿ1 a zinku v koncentrácii 30g ZnCl2.100 kg P-1 kŕmnej zmesi, ktoré boli taktieņ podávané
perorálne. Celkový percentuálny výskyt malformovaných spermií v skupinách P1 a P2 bol veľmi
podobný (6,94% a 7,94%). Najmenńie percento zmien bolo v kontrolnej skupine 3,72%. Ani v jednej
zo sledovaných skupín nepresahoval percentuálny výskyt vńetkých anomálnych spermií 20%, ĉo je
hraniĉné kritérium pre vyuņitie ejakulátov na insemináciu.
173
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 2 Percentá malformovaných spermií pri jednotlivých kŕmnych dávkach
POČET SPERMIÍ
hodnotených
malformovaných
11000
409
9000
625
14000
1112
8000
918
9000
1196
51000
4260
SKUPINA
K
P1
P2
P3
P4
Spolu
PERCENTO ZMIEN
3,72%
6,94%
7,94%
11,47%
13,29%
8,35%
Výskyt patologických spermií v sledovaných skupinách vo vzťahu k celkovému počtu hodnotených
spermií
Pri porovnaní jednotlivých abnormalít spermií v sledovaných skupinách sme zistili, ņe v P1
skupine bol celkový percentuálny výskyt vńetkých morfologicky zmenených spermií 6,94%. Z toho
percentuálne najĉastejńie sa vyskytujúce malformácie spermií boli hlaviĉka bez biĉíka (Hbb), resp.
dezintegrácia spermií 1,83% a kľuĉkovité stoĉenie biĉíka (Kľs) 1,80%. Najmenej sa vyskytli chyby
ako veľká hlaviĉka (VH) 0,01%, retencia cytoplazmatickej kvapky (Ret) 0,03% a torzo (Trz) 0,09%.
Pri P2 skupine sme pozorovali o nieĉo vyńńie zastúpenie morfologicky zmenených spermií, a to 7,94%
v porovnaní s predchádzajúcou skupinou P1. Z tejto hodnoty malo najväĉńie zastúpenie hlaviĉka bez
biĉíka 2,54%. Ćalńou poĉetnou zmenou v tejto skupine bolo zlomenie biĉíka spermie (Zlm), jeho
hodnota dosahovala 1,85%. Relatívne ĉastou zmenou bolo aj kľuĉkovité stoĉenie biĉíka 1,61%. Menej
výrazné zmeny boli napríklad torzo 0,01%, veľká hlaviĉka 0,02% a retencia cytoplazmatickej kvapky
0,07%. V P3 skupine sme zistili, ņe celkový poĉet vńetkých morfologicky zmenených typoch spermií
bol 11,48%. V tejto skupiny sme zaznamenali najvyńńiu hodnotu abnormálnych zmien pri zvinutí
biĉíka spermie (Zvn) 3,08%. Výraznou zmenou bolo aj kľuĉkovité stoĉenie biĉíka 3,04%. Relatívne
vysoký poĉet bol zaznamenaný aj u morfologických zmien hlaviĉka bez biĉíka 2,48%, ako aj zlomenie
biĉíka 2,10%. Najmenńie zastúpenie mali torzo 0,01% , veľká hlaviĉka 0,06% a retencia 0,09%. Pri P4
skupine sme pozorovali vyńńie zastúpenie morfologicky zmenených spermií ako v predchádzajúcich
skupinách, a to 13,29%. Z tohto celkového mnoņstva malformovaných spermií malo najväĉńie
zastúpenie hlaviĉka bez biĉíka 3,80% a kľuĉkovité stoĉenie 3,57%. Vyńńie hodnoty boli takisto zistené
u zlomených spermií 2,60% a zvinutých biĉíkoch spermií 2,27%. Najniņńie hodnoty morfologických
zmien bolo u retencie 0,01%, torza 0,02%, veľkej hlaviĉky spermie 0,03%.
V jednotlivých pokusných skupinách sa zistilo nasledovné poradie výskytu patologicky
zmenených spermií. Najĉastejńie abnormálne formy boli hlaviĉka bez biĉíka, kľuĉkovité stoĉenie,
zvinutie a zlomenie biĉíka. Zo ńkály patologických foriem spermií sme v pokusných skupinách
najmenej zaznamenali torzo biĉíka, retenciu cytoplazmatickej kvapky a veľkú hlaviĉku. Najmenej
patologických spermií bolo v kontrolnej skupine 3,72%. Vysoko preukazný rozdiel (P<0,001) medzi
kontrolnou a P4 skupinou bol stanovený v malformáciách: hlaviĉka bez biĉíka, kľuĉkovité stoĉenie
biĉíka a zlomený biĉík spermie. V tomto pokuse sa nám nepodarila potvrdiť hypotéza, ņe zvýńením
dávky zinku perorálnym spôsobom dochádza u králikov k protektívnej ochrane spermií.
Tabuľka 3 Výskyt jednotlivých foriem abnormálnych spermií v sledovaných skupinách vo vzťahu
k celkovému poĉtu sledovaných spermií
Patologické zmeny %
AKR
VH
MH
Hbb
Kľs
Trz
Zlm
Zvn
Ret
Spolu
K
0,13
0,01
0,09
1,71
1,01
0,01
0,68
0,70
0,00
3,72
P1
0,21
0,01
0,28
1,83
1,80
0,09
1,32
1,37
0,03
6,94
P2
0,27
0,02
0,49
2,54
1,61
0,01
1,85
1,08
0,07
7,94
P3
0,29
0,06
0,34
2,48
3,04
0,01
2,10
3,08
0,09
11,48
P4
0,40
0,03
0,59
3,80
3,57
0,02
2,60
2,27
0,01
13,29
AKR – akrozomálna ĉasť hlaviĉky spermie, VH – veľká hlaviĉka spermie, MH – malá hlaviĉka spermie, Hbb – hlaviĉka
spermie bez biĉíka, Kľs – kľuĉkovité stoĉenie biĉíka, Trz – torzo biĉíka, Zlm – zlomenie biĉíka spermie, Zvn – zvinutie
biĉíka spermie, Ret – retencia cytoplazmatickej kvapky
174
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Diskusia
Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, ņe percentuálny výskyt abnormálnych spermií sa
pohyboval vo vńetkých skupinách v rozmedzí od 3,72% (K) aņ po 13,29% (P4). Podľa Gamĉíka et al.
(1992) za normálnych okolností nesmie ejakulát samcov obsahovať viac ako 20% patologicky
zmenených spermií. Za fyziologický výskyt moņno pokladať 5-10% zmien. Teratoidné a primárne
zmeny hlaviĉky spermie nemajú presahovať 5% a malformácie akrozómu 10%. Podľa nańich
výsledkov zistených hodnotením mikroskopických náterov ejakulátov moņno zaradiť sledovaných
králikov do kvalitnej skupiny a to preto, ņe priemerné percento patologických spermií dosiahlo poĉas
celého sledovaného obdobia v kontrolnej skupine hodnotu 3,72%, priĉom nedochádzalo k jeho
zvýńeniu.
Po pridávaní roztoku ťaņkých kovov vo forme NiCl2 králikom do krmiva v rôznych dávkach
poĉas 90 dní sme pozorovali malformované zmeny na spermiách králikov. V prvých dvoch skupinách
sme zaznamenali nárast patologických spermií v porovnaní s kontrolou (K) 3,72% na 6,94% skupine
P1. V druhej skupine (P2), kde bolo pouņité skoro dvojnásobné mnoņstvo NiCl2 sme pozorovali
zvýńenie malformovaných zmien na spermiách na hodnotu 7,94%. Pandey et al. (1999) zistili po
perorálnom podávaní niklu okrem histologických zmien semenníka a prisemenníka aj poruchy vývoja
spermií. Vyńńí výskyt niklu v ejakuláte zároveņ pozitívne koreloval s vyńńím výskytom oddeleného
biĉíka spermií (Massányi et al., 2007). V nańom prípade sa poĉet hlaviĉiek bez biĉíka pohyboval
z celkového zastúpenia morfologických zmien pri P1 skupine 1,83% a pri P2 skupine 2,54%. Öĉinok
niklu na spermie sledovali aj Pandey a Srivastava (2000), ktorí zisťovali pohyblivosť spermií
a morfologické zmeny, ĉo sú hlavné ukazovatele fertility samcov. Zistili, ņe perorálne podávanie niklu
vo forme (NiSO4) spôsobuje pokles motility ako aj zníņenie koncentrácie spermií. Obdobný trend
zaznamenali aj pri sledovaní výskytu abnormálnych spermií, ktorý bol asi ńesťkrát vyńńí ako v
kontrolnej skupine. Nańe výsledky poukazujú nato, ņe pri podávaní niklu 17,5g NiCl2.100 kgPֿ1 spolu
so zinkom
v koncentrácii 30g ZnCl2.100 kg P-1 kŕmnej zmesi sa najĉastejńie z anomálií spermií
vyskytovala hlaviĉka bez biĉíkov 3,80%. Táto malformácia spermie spôsobuje úplnú neplodnosť.
Z morfologických zmien, ktoré postihovali biĉíky spermií boli najĉastejńie kľuĉkovité stoĉenia biĉíka
3,57%, zlomenie biĉíka 2,60% a zvinutie biĉíka 2,27%, ktoré taktieņ prispievajú k zvýńenej
neplodnosti samcov.
Pri synergickom efekte zinku sa nám zvýńil percentuálny podiel abnormálnych spermií aņ na
3,57%. Protektívny efekt zinku sa nám nepotvrdil. V nańej práci retencia cytoplazmatickej kvapky,
ktorej vznik mal byť indukovaný perorálnym podávaním niklu a zinku bol nevýrazný na spermiách.
Percentá patologických zmien sa pohybovali od 0,00% po 0,09%. Podľa Pandey et al. (1999) uņ
niņńie dávky indukujú pońkodenosť DNA v teste alebo apoptózu epididymálnych spermií. Misra et al.
(1990) a Rajeshkumar et al. (2002) taktieņ zistili negatívny vplyv chloridu nikelnatého na spermie,
priĉom dokázali zvýńené percentuálne zastúpenie abnormalít hlaviĉky spermií, ĉo sa dáva do súvisu s
pońkodením nukleárnej DNA. Ciganková et al. (1997) zistili pozitívny úĉinok parenterálne podaného
zinku, ktorý priaznivo pôsobil na akrozómové a cytoplazmové membrány spermií spracovaných na
inseminaĉné dávky hlbokým zmrazením. Aplikácia zinku nespôsobila zvýńenie poĉtu malformácii nad
povolenú normu. Môņeme skonńtatovať, ņe v nańich pozorovaniach nedońlo ani v jednom prípade
k zvýńeniu výskytu malformácií zmenených spermií nad povolenú normu. Cigánková et al. (1997)
zistila po zámerne vyvolanej hyperzinkémii kancov malformaĉné zmeny spermií pouņitím
elektrónovej mikroskopie, ĉo predstavuje aj ĉiastoĉne výsledky nańej ńtúdie, kde práve v pokusnej
skupine P4 dońlo k najväĉńiemu zastúpeniu abnormalít ĉi uņ hlaviĉiek, resp. biĉíkov spermií. Lukáĉ et
al. (2007) zistil vysoko preukazný rozdiel inseminaĉných dávok králikov medzi celkovým
percentuálnym zastúpením patologických spermií a koncentráciou zinku v inseminaĉnej dávke. Na
základe týchto výsledkov a nańich záverov môņeme konńtatovať, ņe zinok vo vyńńích koncentráciách
môņe vyvolať zvýńený výskyt morfologicky zmenených spermií. Nepriamo môņeme potvrdiť aj
závery z nańich pokusov, kde sme zistili výrazné zastúpenie pońkodenosti biĉíkov spermií králikov,
ktoré boli kŕmené rôznymi dávkami niklu.
Záver
Z vyplývajúcich výsledkov nańej analýzy môņeme konńtatovať negatívny vplyv perorálne
podávanému niklu ako aj zinku na kvalitatívne vlastnosti králiĉích spermií. Nepotvrdil sa nám vńak
175
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
protektívny úĉinok zinku. Pri zvýńenom prieniku niklu a zinku do krmiva a následne dlhodobé
skrmovanie tohto kombinovaného krmiva môņe spôsobovať zvieratám poruchy plodnosti.
Poďakovanie
Práca vznikla za finanĉnej podpory grantových projektov KEGA 101-001SPU-4/2010,
1/0696/08 a APVV SK-HU-0005-08.
VEGA
Literatúra
CIGÁNKOVÁ, V. – MESÁROŃ, P. – BÍREŃ, J. – ĈERNOTA, S.- TOMAJKOVÁ, E. 1997. Vplyv
zinku na morfológiu a preņívateľnosť hlbokozmrazeného semena býkov. In Slov. vet. ĉas., 1997, ĉ. 22,
s. 266-269.
GAMĈÍK, P. – KOZUMOLÍK, J. – MESÁROŃ, P. – SCHVARC, F. – VLĈEK, Z. – ZIBRÍN, M.
1992. Andrológia a inseminácia hospodárskych zvierat. Bratislava : Príroda, 1992. 299 s. ISBN 80-0700540-4.
LUKÁĈ, N. et al., 2007. Stopové prvky a kvalita spermií. Nitra : SPU, 2007, 118 s. ISBN 978-808069-904-0.
MASSÁNYI, L. 1991. Funkĉná morfológia spermie. Bratislava: Veda, SAV, 1991, 194 s. ISBN 80224-0149-8.
MASSÁNYI, P. - CIGÁNKOVÁ, V. - FABIŃ, M. - KOVÁĈIK, J. - MASSÁNYIOVÁ, K. TOMAN, R. 1999. Reprodukĉná toxikológia. Nitra : Slovenská poľnohospodárska univerzita, 1999.
147 s. ISBN 80-7137-641-8.
MASSÁNYI, P. – LUKÁĈ, N. – ZEMANOVÁ, N. – MAKAREVICH, A. – CHRENEK, P. –
FORGACS, ZS. – SOMOSY, Z. – CIGÁNKOVÁ, V. – TOMAN, R. – LAZOR, P. 2007. Effect of
nickel administration in vivo on the testicular structurein mice. In Acta Veterinaria (Brno), 2007,
accepted.
MISRA, M.- RODRIGUEZ, R.E. – KASPRZAK, K. S. 1990. Nickel induced lipid peroxidation in the
rat: Correlation with nickel effect on antioxidant defense system. In Toxikology, vol. 64, 1990, pp. 117.
PANDEY, R. – KUMAR, R. – SINGH, S.P. – SAXENA, D.K. – SRIVASTAVA, S.P. 1999. Male
reproductive effect of nickel sulphate in mice. In Biometals., vol. 12, 1999, pp. 339-346.
PANDEY, R. – SKRIVASTAVA, S.P. 2000. Spermatotoxic Effects of Nickel in Mice. In Bull.
Environ. Contam. Toxicol. 2000, no. 64, pp. 161-167.
RAJESHKUMAR, T. – DORESWAMY, K. – SHIRILATHA, B. – MURALIDHARA, K. 2002.
Oxidative stress associated DNA damage in testis of mice: induction of abnormal sperms and effect on
fertility. In Mutat. Res., 2002, no. 513, pp. 103-111.
Kontaktná adresa
Ing. Zuzana Kņaņická
Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Science, Slovak University of
Agriculture in Nitra, Tr. A. Hlinku 2, SK 949 76 Nitra, Slovak Republic
 ++421-37-641 4288,
 [email protected]
176
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
ŃTRUKTURÁLNE ZMENY SEMENNÍKOV KRÁLIKOV CHOVANÝCH V
PROSTREDÍ S VYSOKOU TEPLOTOU
STRUCTURAL CHANGES OF RABBIT TESTES KEPT AT HIGH
TEMPERATURES
KOLESÁROVÁ Anna1, LUKÁČ Norbert1, MASSÁNYI Peter1, PARKÁNYI Vladimír2,
ONDRUŃKA Ľubomír2, JURČÍK Rastislav2, SLAMEČKA Jaroslav st.2
Katedra fyziológie ţivoĉíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská
poľnohospodárska univerzita, Tr.A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovenská republika
2
Centrum výskumu ţivoĉíšnej výroby, Nitra, Slovenská republika
1
Abstract
The aim of this work was to analyse histological and potential changes in the rabbit testes tissue.
Animals in the experiment were bred at high temperature 36±1 ºC and experimental group – E; (6
animals) was compared to control group - C (4 animals) at optimal temperature 18-22 °C. After 26
days all animals were slaughtered. The experimental high ambient temperature markedly influenced
testes´ structure of the animals. Diameter of seminiferous tubule was significantly lower in the
experimental group of young and adult rabbits (P<0,001) when compared with control groups.
Similarly, the height of seminiferous epithelium showed highly significant (P<0,001) decrease in
average values in both experimental groups of the animals. The evaluation of lumen diameter was
found in both experimental groups in decreased values, but only in the group of young rabbits was
confirmed statistically significant difference (P<0,01) between E-and C-groups. The study found a
statistically significant negative effect of high ambient temperature of 36°C applied for 26 days and 12
hours a day under the basic structure of seminiferous tissue which may significantly alter the
spermatogenesis and thus ultimately the ability of male fertility.
Key words: hyperthermia, testes, rabbit, histology
Úvod
Semenník je komplexný orgán. Má endokrinnú a exokrinnú funkciu a vyvíja sa v ņom veľa
odlińných typov buniek. Tieto bunky sú veľmi citlivé na zmeny v prostredí semenníka. Hoci je to
orgán schopný znaĉnej adaptability k zmenám prostredia, aj tak jeho funkcie ovplyvņuje mnoho
faktorov. K týmto vplyvom môņeme zaradiť vplyv hormónov, sezóny, výņivy, teploty prostredia,
zmeny, ktoré ovplyvņujú krvenie semenníka, ņiarenie a rôzne chemické látky (Gamĉík et al., 1990;
Bíreń et al., 1993; Bíreńová et al., 1994; Massányi et al., 1997). Öĉinky tepla na semenníky môņu byť
priame na konkrétne typy buniek v semenníkoch, ale aj nepriame úĉinky vyplývajúce z bunkových
zmien vyskytujúcich sa v semenníku spôsobené zahrievaním (Setchell, 1998). Veľa autorov sa
domnieva, ņe dôsledky tepla sú plne reverzibilné, teraz existujú dôkazy dlhodobých úĉinkov a to buć
po lokálnom zahrievaní, alebo doĉasne indukovanom kryptorchizme. Tieto dlhodobé úĉinky sa zdajú
byť odlińné od tých, ktoré sa prejavia po oņarovaní a môņu viesť k zlyhaniu funkcie Sertoliho buniek.
Z histologických ńtúdii sa dońlo k záveru, ņe spermatocyty v pachyténnom ńtádiu meiotického delenia
a skoré spermatidy patria medzi bunky semenníkov, ktoré sú najcitlivejńie na teplo (Setchell, 1998).
Tieto nálezy boli potvrdené pomocou prietokovej cytometrie a konfokálnej mikroskopie izolovaných
semenotvorných kanálikov zo semenníkov kryptorchidných ńkreĉkov (Vigodner et al., 2003). Aj keć
tieto bunky neboli zniĉené, je dôkaz o tom, ņe niektoré z nich dokonĉili vývoj, ale objavili sa ako
spermie s pońkodenou DNA (Karabinus et al., 1997, Banks et al., 2005).
V nańej práci sme morfometricky charakterizovali základné ńtruktúry semenníkov
(semenotvorné kanáliky, lúmen semenotvorných kanálikov a výńku epitelu) králikov vystavených
hypertermii (36°C) po dobu 26 dní. Zistené údaje sme vyhodnotili v rámci jednotlivých
experimentálnych a kontrolných skupín.
177
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Materiál a metodika
Do výskumu boli zaradené mäsové línie králikov M 91 (materská albinotická línia) a P 91
(otcovská akromalistická línia), na ktorých sa sledoval vplyv vysokej teploty prostredia (Centrum
výskumu ņivoĉíńnej výroby Nitra).
Celkovo bolo do experimentu zaradených 10 jedincov, z toho 6 mláćat a 4 dospelé zvieratá,
ktoré boli rozdelené do dvoch základných skupín. Prvú skupinu tvorili kontrolné jedince (K-skupina),
kde boli zaradené 2 dospelé zvieratá a 2 mláćatá, ktoré boli chované pri fyziologicky optimálnej
teplote, 18±2 ºC v priebehu 26 dní. Druhú, pokusnú skupinu (P-skupina) tvorili 2 dospelé zvieratá a 4
mláćatá, chované pri teplote nad fyziologické optimum, 36±1 ºC. Kontrolné aj pokusné zvieratá boli
ustajnené v samostatných chovných klietkach s ad libidným príjmom krmiva a vody. Krmivo tvorila
kompletná kŕmna zmes pre králikov (KKD – 0/10). Hypertermická teplota pôsobila 12 hodín (od 6. do
18. hod.). Po poráņke sa odobrali excízie semenníkov, ktoré sa fixovali v 10% formalíne, následne sa
odvodnili vzostupným radom alkoholov (70%, 80%, 96%, 100%), presýtili benzénom a zaliali do
parafínu. Zaliate bloĉky sa následne narezali na sánkovom mikrotóme a sériové rezy hrubé 7-10 µm,
poukladané na podloņných sklíĉkach, boli farbené hematoxylínom a eozínom podľa vypracovanej
metodiky (Vacek, 1974). Na optickom mikroskope s fotozariadením Olympus CX41, (Olympus,
Japan) sme zhotovili mikrofotografie pri konńtantnom zväĉńení a pouņitím programu pre analýzu
obrazu MeasureIT (Olympus, Japan) sme kvantifikovali základné morfometrické kritériá jednotlivých
preparátov. Z kaņdej vzorky (spolu 10) sme analyzovali minimálne tri histologické rezy a na nich
aspoņ ńesť rozliĉných zorných polí. Na získaných preparátoch sme sledovali: priemer semenotvorných
kanálikov (K), priemer lúmenu semenotvorných kanálikov (L) a výńku epitelu semenotvorných
kanálikov (E). Sledované ńtruktúry sme analyzovali v mikrometroch (m). Získané hodnoty
morfometrických analýz sme ńtatisticky vyhodnotili. Vypoĉítali sme základné ńtatisticko-variaĉné
parametre a rozdiely medzi skupinami otestovali Bonferroniho testom.
Výsledky a diskusia
Po anatomickej pitve a odobratí semenníkov sme na semenníkoch nezistili ņiadne patologické
odchýlky od fyziologickej stavby. Semenníky mali charakteristickú ruņovú farbu, boli obalené
v tunica albuginea bez pońkodenia. Na reze bol charakteristicky belavý parenchým v ktorom boli
pravidelne odstupujúce k zadnému okraju lúĉovito idúce priehradky (septula testis), ktoré rozdeľovali
semenník na lalôĉiky semenníka (lobuli testis). Parenchým nevykazoval známky edému, hyperémie
ani iných patologických zmien. Na histologickom preparáte mali semenotvorné kanáliky typický
ovoidný tvar. Kaņdý semenotvorný kanálik pozostával zo semenotvorného epitelu leņiaceho na
bazálnej membráne pozostávajúceho z podporných bazálne uloņených Sertoliho buniek a jednotlivých
vývojových ńtádií spermatogenézy. V centre kanálikov sa nachádza lúmen. Medzi semenotvornými
kanálikmi sme sledovali interstícium s krvnými cievami a Leydigovými bunkami.
Na základe hodnôt zistených pri hodnotení priemeru semenotvorných kanálikov sme stanovili
výrazný vplyv teploty na zmenńenie priemeru semenotvorného kanálika pokusných zvierat (180,1 µm
resp. 119,6 µm) v porovnaní s kontrolnou skupinou (215,6 µm resp. 159,3 µm) v kategórii dospelých
aj pokusných jedincov (Tabuľka 1, Graf 1, 2). Potvrdila sa ńtatisticky vysoká preukaznosť (P<0,001)
medzi P a K – skupinami dospelých aj mladých jedincov. Barlett a Sharpe (1987) skúmali úĉinok
zvýńenej teploty na semenníky potkana. Gonády týchto zvierat vystavili teplote 43C a po 15
minútach pôsobenia, zistili len mierne pońkodenie semenotvorných kanálikov a 20% zníņenie
hmotnosti semenníkov. Autori zistili, ņe zvýńením teploty dochádza k vývinu mnohojadrových
obrovských buniek, ktoré vznikajú pravdepodobne fúziou pońkodených spermatíd. Pozorovali sa aj
veľké vakuoly v epiteli mnohých kanálikov. Rôzne stupne pońkodenia semenotvorných kanálikov
zistil Bowler (1972), ktorý vystavoval semenníky potkanov teplote 43,5C niekoľkokrát
s prestávkami. Percento ťaņko pońkodených kanálikov sa zvyńovalo po kaņdom ćalńom vystavení
zvýńenej teplote. Cigánková et al. (2003) v tkanive semenníkov u kancov s hypozinkémiou zistili
výrazné zmeny v semenotvorných kanálikoch, ktoré svedĉia o poruchách spermatogenézy. Bunky
semenotvorného epitelu degenerovali a dońlo k ich deplécii. Niektoré semenotvorné kanáliky boli
pońkodené viac, iné menej. Semenotvorné kanáliky boli scvrknuté a v interstíciu sa nachádzali voľné
priestory.
178
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Podobne, aj zistené hodnoty výńky semenotvorného epitelu vykazovali vysoko preukazný
(P<0,001) pokles v obidvoch pokusných skupinách zvierat. Priemernú hodnotu v P -skupine dospelých
králikov sme namerali 50,22 m a v K -skupine 67,27 m. U mláćat v P –skupine 33,81 m oproti
51,01 m v K – skupine. Autori Toman a Massányi (1996) kvantitatívnou analýzou zistili zmenńenie
objemu semenotvorného epitelu a lúmenu kanálikov po podaní kadmia a zvýńenie objemu väziva.
Lúmen semenotvorných kanálikov bol úplne, alebo ĉiastoĉne vyplnený nezrelými spermiami.
Pri hodnotení jeho priemeru sme zistili v obidvoch P – skupinách pokles hodnôt. V skupine dospelých
králikov bol tento pokles (medzi P a K – skupinami) ńtatisticky nepreukazný, ale ńtatistická
preukaznosť (P<0,01) sa nám potvrdila v skupine mláćat. V tejto istej skupine dońlo aj k rozńíreniu
intersticiálneho priestoru.
Tabuľka 1 Kvantitatívne vyhodnotenie základných ńtruktúr semenníkov králikov
Table 1 Quantitative evaluation of basic structures of the rabbit testes
n
priemer
SD
CV%
medián
minimum
maximum
n
priemer
SD
CV%
medián
minimum
maximum
n
priemer
SD
CV%
medián
minimum
maximum
K/D
P/D
K/M
Priemer semenotvorných kanálikov (µm)
52
55
63
215,6
180,1 a
159,3
36,92
35,13
32,51
17,12
19,51
20,41
212,6
176,9
156,2
161,4
126,9
106,9
293,4
266,2
257,7
Priemer lúmenu semenotvorných kanálikov (µm)
52
55
63
85,16
76,71
61,80
25,30
30,82
16,66
29,70
40,17
26,96
81,57
71,01
60,07
43,81
27,64
37,44
144,9
146,6
149,3
Výńka semenotvorného epitelu (µm)
233
205
217
67,27
50,22 a
51,01
10,85
7,29
13,20
16,13
14,51
25,88
66,42
49,68
49,32
39,57
28,20
27,07
114,8
75,66
89,32
P/M
150
119,6 a
22,09
18,47
117,5
73,02
168,7
150
55,59 b
13,46
24,21
54,11
31,28
103,6
480
33,81 a
8,53
25,23
32,65
16,25
70,17
K – kontrola, P – pokus, D – dospelé jedince, M – mláćatá, a - P<0,001, b - P<0,01, c - P<0,05
179
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
160
250
140
a
200
a
120
100
150
80
b
60
100
a
50
a
40
20
0
0
K/K
Graf 1
P/K
K/L
P/L
K/E
P/E
K/K
P/K
K/L
P/L
K/E
P/E
Graf 2
K - kontrola, P - pokus, K – kanáliky, L - lúmen, E – epitel, a - P<0,001, b - P<0,01
Graf 1 Priemerné mikromorfometrické hodnoty základných ńtruktúr semeníkov dospelých králikov v
experimentálnej a kontrolnej skupine
Graf 2 Priemerné mikromorfometrické hodnoty základných ńtruktúr semeníkov mláćat králikov
v experimentálnej a kontrolnej skupine
Záver
Na histologických preparátoch semenníkov získaných od pokusných zvierat sme sledovali
vplyv vysokej teploty chovného prostredia (36±1 ºC) na základné mikromorfometrické parametre
semenníkov (semenotvorné kanáliky, lúmen semenotvorných kanálikov a výńku epitelu) v komparácii
s histologickými vzorkami semenníkov králikov chovaných v ńtandardných podmienkach (kontrolná
skupina).
Z výsledkov nańej práce vyplývajú nasledovné zistenia:
- výrazný pokles priemeru semenotvorných kanálikov v P-skupinách dospelých zvierat aj mláćat
vystavených teplote prostredia 36°C poĉas 26 dní. Potvrdila sa ńtatisticky vysoká preukaznosť
(P<0,001) medzi P a K– skupinami dospelých aj mladých jedincov,
- výńka semenotvorného epitelu pokusných zvierat bola preukazne niņńia (P<0,001) ako
v kontrolnej skupine,
- priemer lúmenu v obidvoch pokusných skupinách bol menńí v porovnaní s kontrolnou skupinou.
V skupine mláćat pokusných zvierat bol tento parameter ńtatisticky preukazný (P<0,01)
v porovnaní s preparátmi v kontrolnej skupine.
Bunky semenníka sú veľmi citlivé na zmeny teploty chovného prostredia ako to moņno konńtatovať aj
na základe nańich zistení. Na základe tejto ńtúdie sa zistil ńtatisticky významný negatívny vplyv
vysokej teploty prostredia 36°C, pôsobiacej poĉas 26 dní a 12 hodinovom dennom reņime na základné
ńtruktúry semenotvorného tkaniva, ĉo môņe výrazne alterovať spermatogenézu a tým v koneĉnom
dôsledku fertilizaĉnú schopnosť samcov.
Poďakovanie
Práca bola finanĉne podporená projektmi KEGA 101-001SPU-4/2010 a VEGA 1/0696/08.
Literatúra
BANKS, S. - KING, S.A. - IRVINE, D.S. - SAUNDERS, P.T.K. 2005. Impact of a mild scrotal heat
stress on DNA integrity in murine spermatozoa. In Reproduction, vol. 129, 2005, pp.505-514.
BARLETT, J.M.S. – SHARPE, R.M. 1987. Effect of local heating of the rat testis on the levels in
intersticial fluid of a putative paracrine regulator of the Leydig cells and its relationship to changes in
Sertoli cell secretory function. In J. Reprod. Fert., vol. 80, 1987, pp. 279-287.
BÍREŃ, J. - VRZGULA, L. - KONRÁD, V. 1993. Spontane und experimentalle kupfer- intoxikationen
bei schafen. In Klinik and Pathologie. Tierärztl. Umschau, vol. 48, 1993, pp. 661- 669.
BÍREŃOVÁ, M. - NAĆ, P. - BÍREŃ, J. - ROSIVAL, P. 1994. Dynamika tvorby ńpecifických protilátok
u oviec poĉas príjmu priemyselného substrátu z hlinikárne. In Vet. Med.- Czech, vol. 39, 1994, no. 2-
180
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
3, pp. 67-74.
BOWLER, K. 1972. The effect of repeated applications of heat on spermatogenesis in the rat : A
histological study. In J. Reprod. Fert., vol. 28, 1972, pp. 325-333.
CIGÁNKOVÁ, V. – MESÁROŃ, P. – BÍREŃ, J. – TOMAJKOVÁ, E. 2003. Ńtrukturálne zmeny
v semenníkoch pri deficite zinku. In Zborník vedeckých prác z 3. medzinárodnej vedeckej konferencie
„RIZIKOVÉ FAKTORY POTRAVOVÉHO REŤAZCA“ 3. december 2003, s.16-17, ISBN 80-8069282-3.
GAMĈÍK, P. - BÍREŃ, J. - VRZGULA, L. - MESÁROŃ, P. 1990. Effect of experimental intoxication
with copper from industrial emission on reproductive ability in rams. In Reprod. Dom. Anim., vol. 25,
1990, pp. 235-241.
JEGOU, B. - PEAKE, R.A. - IRBY, D.C. - DE KRETSER, D.M. 1984. Effects of the induction of
experimental cryptorchidism and subsequent orchidopexy on testicular function in immature rats. In
Biol. Reprod., vol. 30, 1984, pp. 179-187.
KARABINUS, D.S. - VOGLER, C.J. - SAACKE, R.G. - EVENSON, D.P. 1997. Chromatin structural
changes in sperm after scrotal insulation of Holstein bulls. In J. Androl., vol. 18, 1997, pp.549-555.
MASSÁNYI, P. - LUKÁĈ, N. - HLUCHÝ, S. - SLAMEĈKA, J. - JURĈÍK, R. 1997. Histological and
morphometric study of reproductive organs. In SLAMEĈKA, J. – HELL, P. – JURĈÍK, R.: Brown
hare in the westslovak lowland. In Acta Sc. Nat. Brno, vol. 31, 1997, no. 3-4, pp. 60-66.
SETCHELL, B.P. 1998. Heat and the testis. In Jurnal of Reproduction and Fertility, vol. 114, 1998,
pp.179-194.
TOMAN, R. - MASSÁNYI, P. 1996. Cadmium in selected organs of fallow - deer (Dama dama)
sheep (Ovis aries), brown hare (Lepus europaeus) and rabbit (Oryctolagus cuniculus) in Slovakia. In
J. Environ. Sci. Health, A31, 1996, vol. 5, pp. 1043-1051.
VIGODNER, M. - LEWIN, L.M. - SCHOCHAT, L. - OSCHRY, I. - LOTAN, G. - KLEEN, B. GOLAN, R. 2003. Evaluation of damage to the testicular cells of golden hamsters caused by
experimental cryptorchidism using flow cytometry and confocal microscopy. In Int. J. Androl., vol.
26, 2003, pp.84-90.
Kontaktná adresa
Ing. Anna Kolesárová
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, FAPZ, KVĽ, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra,
Slovenská republika
 [email protected]
181
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
NUTRIČNÉ A SENZORICKÉ HODNOTENIE MASÄ ZABITÝCH A STRELENÝCH
KRÁLIKOV DIVÝCH
NUTRITIONAL AND SENSORY EVALUATION OF MEAT KILLED AND SHOT
WILD RABBITS
KORÉNEKOVÁ B., POPELKA P., MARCINČÁK S., MAČANGA J.,
Katedra hygieny a technológie potravín, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského
73, 041 81 Košice, Slovenská republika
Abstract
Meat of wild rabbits, killed by bleeding (n=4) and shot rabbits, killed by hunters (n=4) were compared
in this study from nutrition and sensory point of view. The samples of muscles were taken from
shoulder, thigh and scapula and they were used for nutrition analysis, content of water, dry mass, fat
and nitrogen substances. Meat and meat broth were evaluated using sensory analysis in all rabbits on
the 1 th 7 th and 14th day after killing. Results shown higher content of dry matter (P0.05) and fat
(P0.01) in killed than shot wild rabbits. Higher water (P0.05) and nitrogen substances (P0.01)
were observed in shot than killed rabbits. Sensory evaluation of meat and meat broth of killed wild
rabbits was higher than in shot wild rabbits and decreased consquently with day of experiment.
Significant differences (P≤0.05) in sensory quality of killed and broth rabbits were observed in broth
of meat also at the end of experiment.
Key words: meat, rabbit, sensory analysis
Úvod
Králiĉie mäso sa vyznaĉuje vlastnosťami, pre ktoré sa oprávnene zaraćuje medzi
najhodnotnejńie mäsá z dietetického a z nutriĉného hľadiska. Mäso je ńťavnaté, má mäkkú
konzistenciu a sladkastú chuť. Mäso králikov je veľmi dobre stráviteľné, má nízky obsah cholesterolu
a intermuskulárneho tuku, priĉom v tuku prevládajú nenasýtené mastné kyseliny. Bohaté je na
proteíny a jeho aminokyseliny sú vysokej biologickej hodnoty (Bielanski a Zajac, 2000). Celkovým
obsahom bielkovín sa králiĉie mäso vyrovná teľaciemu a hydinovému mäsu. Patrí teda medzi mäsá s
najvyńńím obsahom týchto cenných ņivín, s nízkym podielom neplnohodnotných bielkovín, ako sú
kolagén a elastín. Pri priemernom obsahu 21% bielkovín sa udáva priemerný obsah spojivového
tkaniva asi 4,5% (Kalafová et al., 2008). Pojem kvalita mäsa zahŕņa veľa charakteristík, priĉom
najdôleņitejńie sú nutriĉné vlastnosti, ako je primeraný pomer bioaktívnych zloņiek, proteínov, lipidov
a ich esenciálnych podjednotiek a senzorické vlastnosti, ako sú krehkosť, chuť, vôņa a farba (Zotte,
2002). Kvalita mäsa závisí od biochemických pochodov, ktoré v ņom prebiehajú po zabití zvieraťa, ale
aj od welfare zvierat, ĉi stresu poĉas manipulácie pred zabitím, ktoré môņu ovplyvniť vybrané
metabolické parametre (Sopková, 2002; Poráĉová et al., 2007).
Cieľom práce bolo nutriĉné a senzorické hodnotenie mäsa zabitých a strelených králikov
divých.
Materiál a metodika
V rámci experimentu boli z farmového chovu získané 4 kusy králikov divých (Oryctolagus
cuniculus) vo veku 1 roka, ktoré boli zabité klasickým vykrvením. Okrem toho boli poĉas poľovaĉky
zastrelené králiky divé v poĉte 4 kusy. Usmrtené králiky boli po vychladení uskladnené v chladniĉke
pri teplote 4 °C. Z králikov boli odobraté vzorky chrbtovej svaloviny, stehennej svaloviny a z oblasti
lopatky. Na 1. deņ po zabití králikov bol stanovený obsah vody, suńiny, tuku a dusíkatých látok podľa
Laboratórnych vyńetrovacích metód mäsa a mäsových výrobkov (Popelka et al., 2009). Celkové
senzorické posúdenie mäsa strelených a zabitých králikov sa vykonalo pouņitím objektívnych a
relevantných metód senzorickej analýzy, ktorá sa vyuņíva v Ńpecializovanom senzorickom laboratóriu
Inńtitútu vzdelávania veterinárnych lekárov v Końiciach. Pouņitá metóda zahŕņala súhrne hodnotenie
182
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
nasledovných znakov: vôņa, chuť, ńťavnatosť, jemnosť a krehkosť mäsa. Kaņdá z týchto vlastností
bola hodnotená 5-bodovou stupnicou mäsa v mäse a mäsovom vývare vzoriek na 1., 7. a 14. deņ po
usmrtení. Maximálny poĉet bodov pridelených za celkové senzorické hodnotenie bolo 20 bodov.
Výsledky nutriĉného a senzorického hodnotenia mäsa králikov divých boli ńtatisticky spracované
pouņitím programu Microsoft Excel 7,0. Vypoĉítané boli základné ńtatistické charakteristiky, ako sú
aritmetický priemer, smerodajná odchýlka, maximum a následne na urĉenie preukaznosti rozdielov
medzi skupinami králikov bol pouņitý Studentov t- test.
Výsledky a diskusia
Ńtatisticky významne niņńie hodnoty suńiny (P≤0,05) boli pozorované v prípade zabitých
králikov v oblasti stehna a chrbta (26,55% a 26,04%) ako vo svalovine v oblasti lopatky (31,30%).
V prípade strelených králikov boli hodnoty suńiny v oblasti lopatky (28,54%) opäť vyńńie, neņ vo
svalovine stehna a chrbta (26,25% a 26,49%), ale nie aņ v takom rozsahu, ako v prípade zabitých
králikov (Tabuľka 1).
Tabuľka 1 Porovnanie % suńiny vo svalovinách králika divého získaného zabitím a zastrelením
Mäso
Lopatka Stehno Chrbát Lopatka Stehno
A
A
A
B
B
31,30
26,55* 26,04*
28,54
26,25
priemer
2,20
1,45
0,86
5,22
1,96
SD
34,10
28,26
26,89
34,78
29,13
X max
A – zabité králiky, B – zastrelené králiky
*ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05
Chrbát
B
26,49
0,68
27,45
Na druhej strane ńtatisticky významne vyńńí obsah vody bol pozorovaný v prípade zabitých
králikov v oblasti stehna a chrbta (P≤0,05) ako v oblasti lopatky. V prípade strelených králikov boli
tieto hodnoty mierne vyńńie vo svalovine stehna a chrbta ako lopatky (Tabuľka 2). Výsledky náńho
experimentu poukázali na niņńí priemerný obsah vody u zabitých králikov (68,70% – 73,97%) a
strelených králikov (71,46% – 73,75%) v porovnaní s priemernými hodnotami obsahu vody (75,52%)
zistenými u zajacov poľných (Korimová et al., 2003).
Ńtatisticky významne niņńie hodnoty tuku boli pozorované v prípade zabitých králikov v oblasti
stehna a chrbta (P≤0,01) ako vo svalovine oblasti lopatky. V prípade strelených králikov bol obsah
tuku výrazne niņńí ako u zabitých králikov a klesal v poradí lopatka, stehno, chrbát (Tabuľka 3). Nańe
výsledky boli vyńńie, s výnimkou svaloviny chrbta zastrelených králikov (1,76%) neņ priemerný
obsah tuku (2,83%), ktorý vo svalovine zajaca uvádza Korimová et al. (2003).
Tabuľka 2 Porovnanie % vody vo svalovinách králika divého získaného zabitím a zastrelením
Mäso
Lopatka Stehno Chrbát Lopatka
A
A
A
B
68,70
73,49* 73,97*
71,46
priemer
2,21
1,43
0,86
5,22
SD
70,89
75,16
75,16
76,37
X max
A – zabité králiky, B – zastrelené králiky
Stehno
B
73,75
1,96
75,21
Chrbát
B
73,51
0,68
74,13
*ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05
Obsah a zloņenie tukov, ako aj produkty ich metabolizmu ovplyvņujú aromatické a chuťove
vlastnosti mäsa (Mottram, 1998). Vo vńeobecnosti zverina má veľmi nízky obsah tuku. Tuk zveri
obsahuje veľké mnoņstvo nenasýtených mastných kyselín a ich oxidácia môņe byť jedným z hlavných
zdrojov látok, ktoré sa zúĉastņujú na tvorbe chuti (Daszkiewicz et al., 2009).
183
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Tabuľka 3 Porovnanie % tuku vo svalovinách králika divého získaného zabitím a zastrelením
Mäso
Lopatka Stehno Chrbát Lopatka Stehno
A
A
A
B
B
11,43
3,08** 3,16**
6,01
3,40
priemer
2,87
1,16
0,79
4,62
2,98
SD
15,00
4,38
3,97
11,10
7,76
X max
A – zabité králiky, B – zastrelené králiky
*ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,01
Chrbát
B
1,76
1,59
4,07
Ńtatisticky významne vyńńie hodnoty dusíkatých látok boli pozorované v prípade zabitých
králikov v oblasti stehna (P≤0,05) a chrbta (P≤0,01) ako v oblasti lopatky. V prípade strelených
králikov boli zistené podobne vyńńie hodnoty v oblasti stehna a chrbta neņ v oblasti lopatky. Tieto
hodnoty boli celkovo vyńńie ako u zabitých králikov (Tabuľka 4). Celkove obsah dusíkatých látok
u zabitých králikoch divých (19,95% – 22,47%) a strelených králikoch divých (20,70% – 22,59%) bol
vyńńí neņ priemerný obsah (17,52%), vo svalovine zajaca (Korimová et al., 2003).
Získané výsledky experimentu boli porovnávané s inými autormi, ktorí zaznamenali
nasledovné údaje. Ghosh a Mandal, (2008) zaznamenali vysoký obsah celkových proteínov 20,2%
a nízky obsah tuku 7,90% v porovnaní s hydinou (20,0 a 11,2%), mäsom ońípaných (11,9 a 45,0%)
alebo oviec (15,7 a 14,0%). Na druhej strane, Meineri et al. (2010) pozorovali mierne vyńńí obsah
celkových proteínov 22,09% a tukov
9,3%, priĉom obsah vody bol zaznamenaný u králikov
69,85%.
Tabuľka 4 Porovnanie % dusíkatých látok vo svalovinách králika divého získaného zabitím
a zastrelením
Mäso
Lopatka Stehno Chrbát Lopatka Stehno Chrbát
A
A
A
B
B
B
19,95
21,40*
22,47**
20,70
22,47
22,59
priemer
0,89
0,48
0,98
2,02
1,97
1,33
SD
21,12
21,99
23,75
22,40
24,37
24,11
X max
A – zabité králiky, B – zastrelené králiky
*ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05; P0,01
Pri hodnotení senzorickej kvality mäsa králikov divých bol pozorovaný ńtatisticky významný
pokles (P≤0,05) v prípade zabitých králikov aņ na 14. deņ v porovnaní s 1. dņom pokusu (Tabuľka 5).
Na základe senzorického posúdenia chuti a vône, môņeme konńtatovať mierne zvýńenie bodového
hodnotenia chuti králikov na 7. deņ pokusu, kým v prípade vôni, bol pozorovaný naopak pokles v
bodovom hodnotení. V prípade strelených králikov bol zistený ńtatisticky významný pokles
senzorickej kvality (P≤0,01) uņ na
7. deņ pokusu podobne ako aj na 14. deņ pokusu (P≤0,05).
Hodnotením celkovej senzorickej kvality mäsa králikov divých sme zaznamenali najvyńńí poĉet bodov
na 1. deņ po zabití zvierat. Tieto hodnoty postupne klesali na 7. a 14. deņ. Zaznamenaná bola vtedy
najniņńia senzorická kvalita mäsa králikov. V prípade senzorického posúdenia chuti sme pozorovali
postupný pokles bodového hodnotenia chuti králikov, kým vôņa bola posudzovaná rovnako na 1. a 7.
deņ experimentu. Pri celkovom hodnotení senzorickej kvality mäsa králikov, boli zabité králiky
hodnotené vņdy vyńńie ako zastrelené králiky poĉas celého experimentu.
Charakteristická chuť zveriny súvisí nielen s výņivou zveri, s chemický zloņením zveriny, ale aj
ńpecifickými podmienkami lovu. Na kvalitu mäsa králikov a zajacov vo veľmi znaĉnej miere vplýva aj
spôsob usmrtenia, resp. zabitia zvieraťa a s tým spojená následná hygiena pri opracovaní ako aj
samotnej preprave a uskladnení tiel (Nagy et al., 2009).
184
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Tabuľka 5 Vyhodnotenie 5 bodového posúdenia mäsa králika divého získaného zabitím a zastrelením
Mäso
1. deň 7. deň 14. deň 1. deň 7. deň 14. deň
A
A
A
B
B
B
18
15,40
13,80*
15,60
14,40**
12,40*
priemer
2,00
2,07
2,16
2,07
0,89
2,19
SD
20
18
17
17
15
16
X max
A – zabité králiky, B – zastrelené králiky
*ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05; P0,01
Senzorická kvalita mäsového vývaru zabitých králikov divých bola rovnaká na 1. a 7. deņ
pokusu. Ńtatisticky významný pokles (P≤0,001) bol pozorovaný aņ na 14. deņ experimentu (Tabuľka
6). Zo senzorických charakteristík, bola chuť hodnotená rovnako na 1. a 7. deņ experimentu, kým pri
hodnotení vône bol uņ pozorovaný na 7. deņ v bodovom hodnotení pokles. V prípade strelených
králikov bol zistený pokles senzorickej kvality uņ na 7. deņ experimentu, ktorý bol na 14. deņ pokusu
signifikantný (P≤0,01). Bodové hodnotenie chuti a vône králikov klesalo s dņom experimentu, priĉom
celkovo tieto hodnoty boli niņńie ako u zabitých králikov. Ńtatisticky významný rozdiel (P≤0,05)
medzi senzorickou kvalitou vývaru zabitých a strelených králikov divých sme zaznamenali iba na 14.
deņ experimentu.
Intenzita chuti a arómy zveriny je niekedy viac ovplyvnená spôsobom a dĺņkou skladovania ako
ńpecifickým chemickým zloņením (Wiklund et al., 2000). Poĉas skladovania zveriny dochádza
v priebehu zrenia k vzniku kyseliny mlieĉnej, ktorá spolu s produktmi metabolizmu energeticky
bohatých fosfátov prispievajú k typickej aróme a chuti mäsa (Winkelmayer et al., 2005). Metabolické
produkty látkovej premeny pri procese zrenia mäsa zostávajú vo svalovine a podieľajú sa na
formovaní senzorických vlastností mäsa (Ĉuboņ et al., 2004).
Tabuľka 6 Vyhodnotenie 5 bodového posúdenia mäsového vývaru králika divého získaného zabitím
a zastrelením
Mäso
1. deň 7. deň
14. deň
1. deň 7. deň 14. deň
A
A
A
B
B
B
10,80
7,20*** 10,60
8,60
8,40**
priemer 10,80
1,09
1,64
0,45
1,14
1,67
0,83
SD
12
13
8
12
11
9
X max
A – zabité králiky, B – zastrelené králiky
*ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05 ;P0,001
Záver
Zo získaných výsledkov vyplýva, ņe u zabitých králikov divých získaných z farmového chovu
bol pozorovaný vyńńí obsah suńiny a tuku, kým u zastrelených králikov divých ņijúcich vo voľnej
prírode a zabitých poĉas poľovaĉky bol zaznamenaný vyńńí obsah vody a dusíkatých látok. Celkové
senzorické hodnotenie mäsa zabitých králikov bolo vyńńie ako u zastrelených králikov a v obidvoch
prípadoch postupne klesalo s dņom experimentu. Senzorická kvalita mäsového vývaru zabitých
králikov divých bola rovnaká na 1. a 7. deņ pokusu, kým u strelených králikov klesla uņ na 7. deņ
experimentu. Signifikantný rozdiel v hodnotení senzorickej kvality mäsového vývaru zabitých
a strelených králikov bol pozorovaný aņ na konci experimentu.
Poďakovanie
Spracovanie príspevku bolo podporené projektom: VEGA 1/0403/08.
Literatúra
BIELANSKI, P. - ZAJAC, J. 2000. Effect of genetic variation of growth rate and meat quality in
rabbits. In Proceedings of the 7th World Rabbit Congress, Valencia, Spain, 4 – 7. July 2000, pp. 561–
566.
185
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
COMBES, S. 2004. Nutritional value of rabbit meat, a review, In INRA Prod. Anim., vol. 17, 2004,
no. 5, pp. 373–383.
ĈUBOŅ, J. - HAŃĈÍK, P. - MOJTO, J. - KAĈÁNIOVÁ, M. - VAGAĈ, V. - KOŃŤÁLOVÁ, V. PAVLIĈOVÁ, S. 2004. Vplyv mlieĉnanu sodného na mikrobiologické, fyzikálne a a zmyslové
vlastnosti hovädzieho mäsa. In Acta Fytotechnica et Zootechnica, vol. 3, 2004, pp.62-66.
DASZKIEWICZ, T. - JANISZEWSKI, P. - WAJDA, S. 2009. Quality characteristics of meat from
wild red deer (Cervus elaphus L.) hinds and stags. In Journal of Muscle Foods, vol. 20, 2009, pp. 428448.
GHOSH, N. - MANDAL, L. 2008. Carcass and meat quality traits of rabbits (Oryctolagus cuniculus)
under warm – humid condition of West Bengal, In Livestock Research for Rural Development, India,
vol. 20, 2008, no. 9, pp. 1–7.
KALAFOVÁ, A. – MASSÁNYI, P. – LUKÁĈ, N. – CHRENEK, P. – MOJTO, J. –
CHRASTINOVÁ, Ľ.- CAPCAROVÁ, M. – SCHNEIDGENOVÁ, M. – KOVÁĈIK, J. – ĈUPKA, P.
2008. Obsah aminokyselín v mäse králikov po experimentálnom podaní niklu a zinku. In Dni výţivy
a veterinárnej techniky VIII, 9.-10. September, 2008, s. 14–18.
KORIMOVÁ, Ľ. - NAGY, J. - CABADAJ, R. - KORIM, P. - LACZKOVÁ, S. 2003. Chemické
zloņenie niektorých druhov zveriny. In Zborník z konferencie Hygiena Alimentorum XXIV, Ńtrbské
Pleso - Vysoké Tatry, 4.-6. Jún 2003, s. 175-176.
MEINERI, G. - CORNALE, P. - TASSONE, S. - PERETTI, P.G. 2010. Effects of Chia (Salvia
hispanica L.) seed supplementation on rabbit meat quality, oxidative stability and sensory traits, In
Italian Journal Animal Sciences, vol. 9, 2010, 10, pp. 45- 49.
MOTTRAM, D.S. 1998. Flavour formation in meat and meat products; a review. In Food Chemistry,
vol. 62, 1998, pp. 415–424.
NAGY, J. et al. 2009a. Hygiena mäsa, hydiny a zveriny. Ediĉné stredisko Univerzity veterinárskeho
lekárstva v Końiciach, 2009a, vyd.1, s.371. ISBN 978-80-8077-179-9.
POPELKA, P. - MÁTÉ, D. - TUREK, P. - BYSTRICKÝ, P. - PIPOVÁ, M. - DIĈÁKOVÁ, Z. MARCINĈÁK, S. 2009. Laboratórne vyšetrenie mäsa a mäsových výrobkov. Ediĉné stredisko UVL,
Końice, 2009, 156 s. ISBN 978-80-8077-160-7.
PORÁĈOVÁ, J. - ŃUTIAKOVÁ, I. - ZAHATŅANSKÁ, M. - BLAŃĈÁKOVÁ, M. - TAYLOROVÁ,
B. 2007. Vplyv welfare na vybrané metabolické parametre hovädzieho dobytka, In Ochrana zvířat
a welfare, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, 2007, s.126–129.
SOPKOVÁ, D. - VÁRADY, J. - PÁSTOROVÁ, B. - STANÍKOVÁ, A. - KOŅÁROVÁ, I. 2002.
Stress and aminoacid values of poultry meat. In Folia Veterinaria, vol. 46, 2002, no. 2, pp. 53–54.
WIKLUND, E. - NILSSON, A. - AHMAN, B. 2000. Sensory meat quality, ultimate pH values, blood
metabolites and carcass parameters in reindeer (Rangifer tarandus tarandus L.) fed various diets. In
Rangifer, vol. 20, 2000, pp. 9–20.
WINKELMAYER, R. - LEBERSORGER, P. - ZEDKA, H.F. - FOREJTEK, P. - VODŅANSKÝ, M. VEĈEREK, V. - MALENA, M. - NAGY, J. - LAZAR, P. 2005. Hygiena zvěřiny. Středoevropský
institut ekologie zvěře Wien-Brno-Nitra, 2005, 168s.
ZOTTE, D.A. 2002. Perception of rabbit meat quality and major factors influencing the rabbit carcass
and meat quality. In Livestock Production Science, 2002, no.75, pp. 11–32.
Kontaktná adresa
MVDr. Beáta Koréneková, PhD.
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Końiciach, Komenského 73, 041 81 Końice,
Slovenská republika
 [email protected]
186
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
POROVNANIE HLADÍN KADMIA U STRELENÝCH A ZABITÝCH KRÁLIKOV
DIVÝCH
COMPARISION OF CADMIUM LEVELS IN SHOT AND KILLED WILD RABBITS
KORÉNEKOVÁ B.1, SKALICKÁ M.2, MAČANGA J.1
1
2
Katedra hygieny a technológie potravín, UVLF, Komenského 73, 041 81 Košice, Slovenská republika
Katedra výţivy, dietetiky a chovu zvierat, UVLF, Komenského 73, 041 81 Košice, Slovenská republika
Abstract
The aim of this study was to compare the levels of Cd in shot an killed rabbits. Rabbits (n=10) were
shot by hunters in the area of Eastern Slovakia. The farmed rabbits (n=10) were killed without
shooting. The samples of back and tigh muscles, livers, kidneys were analysed by using AAS method.
Significantly higher levels of Cd P0.05 were observed in thigh muscles of shot rabbits. The highest
levels of Cd were observed in the samples of kidneys of both groups. The levels of Cd were higher in
all samples of shot rabbits in comparison to killed rabits.
Key words: cadmium, rabbit, atomic absorption spectrophotometry
Úvod
Kadmium (Cd) je významný toxický prvok, ktorý patrí do skupiny chemických prvkov,
kontaminantov, ktorých výskyt je v ovzduńí, vodných zdrojoch a potravinách pravidelne
monitorovaný. Voľne ņijúca zver, medzi ktoré patrí aj králik divý (Oryctolagus cuniculus) citlivo
reaguje na stupeņ zaťaņenie ņivotného prostredia. Kovy, ako environmentálne polutanty pôsobia
svojim úĉinkom negatívne na zdravie králikov napr. zníņením aktivity enzýmov, ĉi zmenou
hematologických parametrov (Bersényi et al., 2003, Capcarová et al., 2010). Celkový úĉinok Cd sa
vńak prejaví obyĉajne aņ po dlhodobej expozícii zvierat, kde vyvoláva chronické intoxikácie
(Massányi et al., 2004; Cigánková et al., 2010).
Králik divý patrí do radu dvojitozubcov (Lagomorpha). Králiky sú príbuzné zajacom. Líńia sa
vńak od nich menńím telom, hlavou ako aj kratńími zadnými nohami. Králiĉie mäso je uznávané pre
jeho vysoké nutriĉné a dietetické vlastnosti. Mäso je chudé, má nízky obsah cholesterolu, a je bohaté
na proteíny a aminokyseliny, ktoré sú vysokej biologickej hodnoty (Bielanski et al., 2000). Králiĉie
mäso má nízky obsah sodíka a je bohaté na obsah draslíka, fosforu a horĉíka (Kalafová et al., 2008).
Cieľom práce bolo porovnanie hladín kadmia vo svalovine a vnútorných orgánoch strelených
a zabitých králikov divých.
Materiál a metodika
Z oblasti východného Slovenska bolo v rámci poľovaĉky strelených 10 kusov králikov divých.
Táto oblasť je zaťaņená vplyvom metalurgického priemyslu, z tohto dôvodu bol kladený dôraz na
obsah kadmia vo vzorkách biologického materiálu. Okrem toho sme z farmového chovu získali 10
kusov králikov vo veku 1 roka, ktoré boli usmrtené klasickým zabitím. Na analýzu Cd boli odobrané
vzorky chrbtovej svaloviny, stehennej svaloviny, peĉene a obliĉiek. Tieto vzorky boli mineralizované
v mikrovlnnej piecke MLS 1,200 MEGA (Milestone) pouņitím 5 ml HNO3 a 1 ml HCl na 1g vzorky.
Cd bolo analyzované grafitovým systémom pouņitím atómového absorpĉného spektrofotometra
(Unicam Solar, Model 939). Koncentrácia Cd bola udávaná na pôvodnú hmotu. Výsledky boli
ńtatisticky spracované pouņitím Studentovho t- testu (Microsoft Excel 7,0).
Výsledky a diskusia
V prvej skupine králikov získaných zastrelením sme zistili ńtatisticky významné vyńńie
hodnoty Cd v obliĉkách (P0,05) v porovnaní s hladinami Cd vo svalovinách a v peĉeni. Priemerné
hladiny Cd v chrbtovej a stehennej svalovine vykazovali minimálne rozdiely (Tabuľka 1). Myslek
a Kalisinska (2006) sledovali obsah Cd u zajacov poľných v oblastiach, ktoré boli vzdialené od
187
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
priameho pôsobenia priemyselného zneĉistenia. Hladiny Cd, hlavne v obliĉkách boli na hodnotách,
ktoré sa nachádzajú v priemyselne zasiahnutých oblastiach. Obsah Cd v obliĉkách bol vyńńí o 81%
u dospelých neņ u mladých jedincov.
Tabuľka 1 Hladiny kadmia u králika divého získaného zastrelením
Kadmium
Chrbtová
Stehenná
svalovina
svalovina
0,051
0,050*
X
0,053
0,030
Sd
0,157
0,114
X max
10
10
N
Pečeň
0,073
0,044
0,144
10
Obličky
0,328*
0,332
1,141
10
*Ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05
V druhej skupine králikov získaných zabitím sme zistili ńtatisticky významné vyńńie hodnoty
Cd v obliĉkách (P0,05) v porovnaní s hladinami Cd v chrbtovej a stehennej svalovine a v peĉeni
(Tabuľka 2). Priemerné hladiny Cd boli v chrbtovej svalovine vyńńie ako v stehennej svalovine.
Tabuľka 2 Hladiny kadmia u králika divého získaného zabitím
Kadmium
Chrbtová
Stehenná
svalovina
svalovina
0,031
0,022
X
0,037
0,018
Sd
0,105
0,062
X max
10
10
N
Pečeň
0,057
0,061
0,198
10
Obličky
0,294*
0,329
1,082
10
*Ńtatistická významnosť na hladine významnosti P0,05
Nańe výsledky Cd vo svalovine králikov boli vyńńie, neņ ako uvádza Ĉelechovská et al. (2008)
v svalovine zajacov v rokoch 2005 - 2007 v ĈR (0,002±0,001 mg.kg-1). Na druhej strane boli nańe
výsledky výrazne niņńie neņ aké uvádzajú v prípade vzoriek peĉeni zajacov (0,562±0,039 mg.kg-1).
Vyńńie hladiny Cd v nańich vzorkách obliĉiek králikov oproti iným sledovaným orgánom a
tkanivám potvrdili obliĉky ako cieľový orgán kumulácie Cd. Tieto zistenia sú v súlade s prácou, ktorú
uvádza Chan et al. (2004), kde autori zistili výrazne pozitívny vzťah medzi zvýńenou dávkou Cd
v kŕmnej dávke a výskytom Cd v obliĉkách králikov.
Porovnaním hladín Cd u zabitých a strelených králikov navzájom sme pozorovali ńtatisticky
významné zvýńenie hladín P0,05 v stehennej svalovine strelených králikov oproti králikom klasicky
zabitým. Získané výsledky sme porovnávali s prácou Kolesárová et al. (2008), ktorí uvádzajú
koncentrácie Cd u zajaca poľného (Lepus europaeus) ņijúceho v prírode v oblasti s rozvinutým
priemyslom. V porovnaní s nańimi výsledkami boli tieto hladiny Cd v obliĉkách - 1,570 mg.kg-1
a v peĉeni - 0,160 mg.kg-1 výrazne vyńńie.
V nańej práci sme zaznamenali vyńńie priemerné hladiny Cd u strelených králikov ņijúcich vo
voľnej prírode neņ u zabitých králikov chovaných na farme. Strela pouņitá na zabitie králikov
v minimálnej miere ovplyvnila hladiny kadmia. Výraznejńie zmeny vńak môņu byť zaznamenané
v prípade iných kovov, ako sú Pb a Ni, kde práve pouņitá strela môņe byť zdrojom kontaminácie
zveriny v mieste zásahu (Koréneková et al., 2008).
Záver
Hladiny Cd v orgánoch a tkanivách králikov zastrelených, ktoré ņili vo voľnej prírode odráņali
stupeņ zaťaņenia ņivotného prostredia priemyselnými polutantami. V prípade farmového chovu
králikov hladiny Cd boli ovplyvnené hlavne spôsobom výņivy.
Poďakovanie
Spracovanie príspevku bolo podporené projektom VEGA 1/0403/08.
Literatúra
188
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
BERSÉNYI – FEKETE, S.G. - SZŇCS, Z. - BERTA E. 2003. Effect of ingested heavy metals (Cd, Pb
and Hg) on haematology and serum biochemistry in rabbits, In Acta Veterinaria Hungarica, vol. 51,
2003, no. 3, pp. 297-304.
BIELANSKI, P. - ZAJAC , J. - FIJAL, J. 2000. Effect of genetic variation of growth rate and meat
quality in rabbits. In Proceedings of the 7th World Rabbit Congress, Valencia, Spain, July 2000, pp.
561-566.
CAPCÁROVÁ, M. - MASSÁNYI, P. - KOLESÁROVÁ, A. - ONDRUŃKA, L. 2009. Effect of
mercury on selected haematological parameters of rabbits in vitro, In Slov. J. Anim. Sci., vol. 42, 2009,
no. 1, pp. 3-7.
CIGÁNKOVÁ, V. - ALMÁŃIOVÁ, V. - HOLOVSKÁ, K. 2010. Morphological changes in Japanase
quail duodenal epithelium after chronic Cd exposure, In Polish J. of Env. Study, vol. 19, 2010, no. 2,
pp. 275-282.
ĈELECHOVSKÁ, O. - MALOTA, L. - ZÍMA, S. 2008. Entry of heavy metals into food chain: A 20year comparisom study in Northern Moravia, In Acta Vet. Brno, 2008, no. 77, pp. 645-652.
CHAN, D.Y. - FRY, N. - WAISBERG, M. - BLACK, W.D. - HALE, B.A. 2004. Accumulation of
dietary Cd in rabbit tissues and excretions: a comparison of lettuce amended with soluble Cd salt and
lettuce with plant-incorporated Cd. In J Toxicol Environ Health vol. 67, 2004, pp. 397-411.
KALAFOVÁ, A. – MASSÁNYI, P. – LUKÁĈ, N. – CHRENEK, P. – MOJTO, J. –
CHRASTINOVÁ, Ľ. - CAPCAROVÁ, M. – SCHNEIDGENOVÁ, M. – KOVÁĈIK, J. – ĈUPKA, P.
2008. Obsah aminokyselín v mäse králikov po experimentálnom podaní Ni a Zn. In Dni výţivy
a veterinárnej techniky VIII, Końice, September 2008, pp. 14-18.
KOLESÁROVÁ, A. - SLAMEĈKA, J. - JURĈÍK, R. - TATARUCH, F. - LUKÁĈ, N. - KOVÁĈIK,
J. - CAPCÁROVÁ, M. - VÁLENT, M. - MASSÁNYI, P. 2008. Environmental levels of Cd, Pn and
Hg in brown hares and teir relation to blood metabolic parametres, In J. Env. Sci. Helath, Part A, vol.
43, 2008, pp. 653-657.
KORÉNEKOVÁ, B. - SKALICKÁ, M. - KOŅÁROVÁ, I. - NAGY, J. - MÁTÉ, D. - NAĆ, P. 2008.
Comparison of cadmium, lead and nickel accumulation in liver, breast and leg muscles of shot and
killed pheasants, In Slov. J. Anim. Sci., vol. 41, 2008, no. 4, pp. 184-186.
MASSÁNYI, P. - TOMAN, R. - UHRÍN, V. - RENON, P. 2004. Distribution of Cd selected organs of
rabbits after an acute and chronic administration. In Ital. J. Food Sci., vol. 3, 2004, pp. 311-316.
MYSLEK, P. – KALISINSKA, E. 2006. Contents of selected heavy metals in the liver, kidneys and
abdominal muscle of the brown hare (Lepus europaeus Pallas, 1778) in Central Pomerania, In Polish
J. Vet. Sci.,vol. 9, 2006, pp. 31-41.
Kontaktná adresa
MVDr. Beáta Koréneková, PhD.
Katedra hygieny a technológie potravín, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského
73, 041 81 Końice, Slovenská republika
 [email protected]
189
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
VÝSLEDKY MONITORINGU VÝSKYTU REZÍDUÍ PESTICÍDOV V RÔZNYCH
KRAJINÁCH SVETA (PREHĽAD)
RESULTS OF MONITORING THE PESTICIDAL RESIDUA OCCURENCE IN
VARIOUS COUNTRIES OF WORLD (A REVIEW)
KOVALKOVIČOVÁ N.1, ŃUTIAKOVÁ I.2, PISTL J.1
1
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, 041 81 Košice, Slovenská republika
Prešovská univerzita, Ul. 17. Novembra 1, 081 16 Prešov, Slovenská republika
2
Abstract
Some pesticides are dangerous because of their acute toxicity, e.g. organophosphates, others because
of their long-term accumulation in non-target organisms, entrance into food chain that may impair
human and animal health. The aim of this literature review is to present recent results of pesticide
residue monitoring in various countries.
Key words: pesticide residue, health, monitoring
Úvod
Dneńná kaņdá technicky vyspelá spoloĉnosť je charakterizovaná vysokým stupņom vyuņitia
chemických látok v priemysle, poľnohospodárstve a kaņdodennom ņivote. Z organických látok, ktoré
sa do ņivotného prostredia dostávajú vedome, najväĉńí podiel predstavujú prípravky na ochranu rastlín
– pesticídy, pouņívané na niĉenie cieľových ńkodcov, ochorení, na boj proti burinám a v mnohých
prípadoch predstavujú jedinú uspokojivú metódu, ktorá zniņuje straty úrody, zvyńuje výnosy, pomáha
zlepńovať kvalitu produktov a zvyńovať produktivitu práce (Ecobichon, 2000; Kalamarakis a
Markellou, 2007). Podľa údajov OECD (2006) bola ich spotreba v Slovenskej republike v roku 2006
0,16 t na km2 poľnohospodárskej pôdy.
Problémom je rozsiahla kontaminácia ņivotného prostredia týmito látkami, hlavne, ak nie sú
dodrņané zásady ich správnej aplikácie. Podľa Sivaramakrishnana (2009) pesticídy, ťaņké kovy,
surfaktanty a ftaláty predstavujú v súĉasnosti najväĉńie nebezpeĉenstvo pre ĉloveka, zvieratá a ņivotné
prostredie. Odhaduje sa, ņe ĉlovek a zvieratá sú denne exponovaní viac ako 1 000 pesticídom v
dôsledku ich rozsiahleho pouņitia, ako aj perzistencie v rôznych zloņkách ņivotného prostredia. Nie sú
to vńak látky, ktoré by sme mohli jednoznaĉne oznaĉiť za prostriedky bez najmenńích úĉinkov na
zdravie, a to i napriek údajom výrobcov a mnohokrát aj tvrdeniam v odbornej literatúre o ich úplnej
alebo aspoņ dostatoĉnej neńkodnosti. Výsledkom rozsiahleho pouņívania pesticídov je napríklad
existencia perzistentných organických polutantov (POPs), ktoré môņu spôsobiť otravy necieľových
druhov organizmov a zvýńiť zdravotné riziko u ľudí, a to naruńením ich endokrinného systému,
indukciou nádorov, infertilitou a mutagénnymi úĉinkami. U profesionálne exponovaných ľudí
rozsiahle pouņívanie pesticídov vedie k akútnym alebo dlhodobým zdravotným problémom (U.S.
EPA, 2006).
Kumulácia pesticídov u necieľových organizmov
Mnohé pesticídne látky sa hromadia v orgánoch a tkanivách exponovaných organizmov a v
niektorých prípadoch dochádza i k potencovaniu neņiaduceho úĉinku súĉasným pôsobením
niekoľkých pesticídnych prostriedkov. Vhodný manaņment rizika v tomto prípade závisí od znalostí o
absorpii, biotransformácii, distribúcii a exkrécii týchto látok v organizme.
Pesticídy na základe ich biotransformácie v ņivých organizmoch vo vńeobecnosti moņno rozdeliť do
troch hlavných tried: látky rýchlo metabolizované a exkretované; zlúĉeniny s detegovateľnou
kumuláciou; zlúĉeniny s vysokou kumuláciou (Tab. 1; Kan a Meijer, 2007). Rýchlo metabolizované
pesticídy sú detegované u zvierat poĉas alebo krátko po expozícii. Riziko rezíduí v produktoch
ņivoĉíńneho pôvodu pre ĉloveka je preto povaņované za minimálne a nie je potrebný ńpeciálny
manaņment rizika. Na strane druhej i v tomto prípade existujú potenciálne riziká pre zdravie zvierat, a
to v závislosti od toxikologického profilu zlúĉeniny a hladiny expozície. Zlúĉeniny s detegovateľnou
190
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
kumuláciou je moņné stanoviť poĉas niekoľkých týņdņov po expozícii zvierat. Manaņment rizika pre
tieto látky spoĉíva v pravidelných kontrolách zloņiek krmiva a potravín z tých oblastí sveta, kde sa
tieto zlúĉeniny eńte stále pouņívajú. Obmedzené pouņitie týchto pesticídov vo väĉńine krajín Európy
a USA zniņuje riziko, ktoré môņu predstavovať pre zdravie ĉloveka a zvierat. Zlúĉeniny s vysokou
kumuláciou je moņné detegovať v produktoch ņivoĉíńneho pôvodu aj niekoľko týņdņov alebo
mesiacov po expozícii zvierat (Kan a Meijer, 2007). Pouņitie väĉńiny týchto látok nie je v súĉasnosti
v Európe a USA povolené. Najvýznamnejńím predstaviteľom z tejto skupiny je v minulosti pouņívané
DDT.
Tabuľka 1 Príklady pesticídnych látok zaradených do troch hlavných tried podľa ich kumulácie
v organizme zvierat (Kan a Meijer, 2007)
Rýchlo metabolizované
Pesticídy
chlópyrifos (metyl)
2,4-D
Deltametrín
Diazinon
Endosulfan
Metoxychlór
Zlúčeniny s detegovateľnou
kumuláciou
Chlordan
α-HCH
γ-HCH (lindan)
Zlúčeniny
s vysokou kumuláciou
DDT/DDE
dieldrín/aldrín
endrín
HCB
β-HCH
heptachlór (epoxid)
Výsledky monitoringu rezíduí DDT
DDT bolo objavené v r. 1939 a rýchlo sa stalo najpouņívanejńím insekticídom vo svete. Avńak
v 60.-tych rokoch sa zistilo, ņe ovplyvņuje reprodukĉné schopnosti mnohých vtákov ņiviacich sa
rybami, ĉo predstavuje obrovskú hrozbu pre biodiverzitu. Problematike biologickej magnifikácie DDT
sa venuje Rachel Carson vo svojej knihe Silent Spring, ktorá vyńla v r. 1962 a vyvolala záujem ńirńej
verejnosti o pesticídy a kontamináciu ņivotného prostredia a prispela tieņ v r. 1972 k zákazu
pouņívania DDT asi v 86 krajinách sveta, no aj dnes sa eńte aplikuje v niektorých rozvojových
krajinách na ochranu pred maláriou a ćalńími tropickými ochoreniami prenáńanými komármi a inými
druhmi hmyzu. Expozícia DDT je teda stále rozsiahla.
DDT je extrémne perzistentné v ņivotnom prostredí a u ľudí má mnoņstvo neņiaducich úĉinkov,
napríklad vedie ku skráteniu periódy laktácie (Gladen a Rogan, 1995), v in vitro ńtúdiách sa
zaznamenáva jeho estrogénna aktivita (Chen a kol., 1997) a metabolit DDE pôsobí ako antagonista
androgénu (Kelce a kol., 1995). U vtákov ovplyvņuje hrúbku ńkrupiny vajec, hladinu hormónov
a vyvoláva zmeny v metabolizme vápnika, môņe viesť ku dramatickým poklesom u mnohých
populácií zvierat (Beard, 2006). Behrooz a kol. (2009a) zaznamenali vyńńie hladiny DDT a ćalńích
chlórorganických látok v perí mäsoņravých ako u bylinoņravých druhov vtákov, avńak tieto hladiny
boli niņńie ako hladiny, pri ktorých dochádza k ovplyvneniu reprodukcie. U viacerých druhov zvierat
bol potvrdený toxický úĉinok DDT na nervový systém (Eriksson a Talts, 2000; Daniel a kol., 2002;
Colosio a kol., 2003) a supresia alebo indukcia imunitnej odpovede (Daniel a kol., 2002; Udoji a kol.,
2010).
Historicky významným producentom chlórorganických pesticídov je Ĉína. Monitorovanie
vzoriek vzduchu odhalilo prítomnosť technického DDT, chlordanu, hexachlórbenzénu a endosulfanu
v 37 ĉínskych mestách (Liu a kol., 2009).
V dôsledku pomalej eliminácie z organizmu je moņné detegovať rezíduá DDT a jeho metabolitu
DDE v sére a tukovom tkanive u veľkej ĉasti populácie vo vyspelých krajinách (Herrero-Mercado
a kol., 2010; Ociepa-Zawal a kol., 2010; Grimalt a kol., 2010). V rozvojových krajinách, kde sa DDT
pouņíva aj dnes na niĉenie vektorov ochorení, ho v nadlimitnom mnoņstve denne mliekom prijímajú
dojĉatá, napríklad v Mexiku je exponovaných aņ 6% detí (Torres-Arreola a kol., 1999). Na strane
druhej, Krauthacker a kol. (2009) uvádzajú, ņe v Chorvátsku v r. 2002–2003 boli koncentrácie
chlórorganických pesticídov v humánnom mlieku do 332 ng.g-1 mlieĉneho tuku, prípadne boli niņńie
ako je detekĉný limit. Henny a kol. (2009) zaznamenali výrazné zníņenie koncentrácie metabolitu
p,p´-DDE v plazme Peregrine sokolov v ńtáte Texas. Kým v r. 1978–1979 bola stanovená
koncentrácia 0,879 μg.g-1, v r. 2004 predstavovala uņ iba 0,013 μg.g-1.
191
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Monitoring pesticídov v rôznych potravinových komoditách odhalil prítomnosť DDT i dnes.
Napríklad, Sun a kol. (2006) sledovali výskyt rezíduí 91 pesticídov zo 4 hlavných skupín v produktoch
z rýb v Taiwane v r. 2001–2003. Detegovaných bolo 6 pesticídov (DDT, dieldrín, chlórpyrifos,
fenitrotion, fention a protion) zo skupiny chlórorganických a organofosforových pesticídov, ich
hodnoty vńak nepresahovali hodnoty ADI (Acceptable Daily Intake). Nízke hladiny chlórorganických
pesticídov v mäse rýb, ktoré nepredstavujú zdravotné riziko, boli zaznamenané aj v Turecku
(Kalyoncu a kol., 2009). Battu a kol. (2005) vyńetrovali potraviny v Indii a zistili, ņe hladiny DDT boli
nízke a porovnateľné s vyspelými krajinami. Na strane druhej odhalili prítomnosť rezíduí lindanu v
mlieku. Leng a kol. (2009) zistili závislosť hladiny lindanu a DDT v humánnom mlieku od mnoņstva
skonzumovaných rýb. Aj Behrooz a kol. (2009b) v Iráne zaznamenali signifikantné rozdiely
v hladinách DDT v mlieku matiek, ktoré jedli ryby ĉastejńie oproti matkách, ktoré ich jedli iba raz
týņdenne.
Výsledky monitoringu rezíduí iných pesticídov
Sexton a kol. (2006) zaznamenali výskyt 50 environmentálnych kontaminantov (11 prchavých
organických látok, 2 ťaņkých kovov – olova a ortute, 11 chlórorganických pesticídov a 30 kongenérov
polychlórovaných bifenylov) a ich metabolitov v krvi 43 detí vo veku 3–6 rokov v Minneapolise. The
Pesticide Action Network UK (2006) uvádza výsledky monitoringu rezíduí v ĉerstvej zelenine a ovocí,
ktoré boli podávané ńkolákom vo Veľkej Británii. Prieskum odhalil prítomnosť rezíduí aņ u 98%
vzoriek, napríklad 2,4-D, chlórpyrifosu, cypermetrínu, fentionu, imazalilu, malationu, parationu
a tiabendazolu. Mnohé z týchto sledovaných chemikálií sú moņnými karcinogénmi a neurotoxikantmi.
V Amerike Katz a kol. (2009) zaznamenali v ĉerstvej zelenine a ovocí zvýńené hladiny metamidofosu.
Mansour a kol. (2009) porovnali výskyt rezíduí chlórorganických a organofosforových pesticídov
v uhorkách v Egypte, ktoré boli vypestované v skleníkoch a na farmách s konvenĉným a organickým
poľnohospodárstvom. Najvyńńie koncentrácie rezíduí boli v uhorkách zo skleníkov (1,016 mg.kg-1),
niņńie u uhoriek pochádzajúcich z organického poľnohospodárstva (0,442 mg.kg-1) a najniņńie
u uhoriek pestovaných na konvenĉných farmách (0,415 mg.kg-1). Prítomnosť rezíduí pesticídov
v ĉerstvej zelenine a ovocí bola stanovená aj v Taliansku. V r. 2003–2006 bol denný príjem rezíduí
pesticídov v zelenine niņńí ako stanovené limity ADI, no v ovocí bol príjem rezíduí ometoatu vyńńí
ako ADI a pre dicofol veľmi blízko ku povolenému limitu (Girotti a kol., 2009). Gazzotti a kol. (2009)
monitorovali prítomnosť organofosforových insekticídov v surovom mlieku v Taliansku, priĉom
pribliņne 4,4% z 298 vzoriek obsahovali stopové mnoņstvá rezíduí, hlavne chlórpyrifosu. Nag
a Raikwar (2010) zaznamenali výskyt rezíduí chlórorganických pesticídov v krmive.
Naeher a kol. (2009) venovali pozornosť moņnej expozícii detí pyretroidným insekticídom
prítomným v ńampónoch proti vńiam.
Pesticídy, spolu s jedovatými rastlinami, mykotoxínmi, kovmi a priemyselnými kontaminantmi
(hlavne dioxínmi), patria dnes u hospodárskych zvierat a hydiny k najĉastejńím zdrojom otráv v 5
krajinách Európskej únie – Belgicku, Francúzsku, Grécku, Taliansku a Ńpanielsku (Guitart a kol.,
2010). Vonesh a Kraus (2009) a Relyea (2009) zaznamenali vplyv kontaminácie vôd pesticídmi na
druhové zloņenie spoloĉenstva pozostávajúceho zo zooplanktónu, fytoplanktónu, perifytónu
a obojņivelníkov. Gibbs a kol. (2009) poukázali na pokles poĉtu vzácnych druhov ņivoĉíchov
v oblastiach Kanady ońetrených pesticídmi.
Vplyv globálneho otepľovania na výskyt rezíduí v rastlinách
Správne pouņívanie pesticídov je dôleņité nielen z hľadiska zdravia konzumenta, ale aj
z hľadiska fyziológie rastlín, nakoľko pesticídy u nich zasahujú do priebehu rôznych biochemických
procesov (Moszczynska a kol., 2009). V súĉasnosti sa sleduje vplyv globálneho otepľovania na
distribúciu a toxicitu chemických polutantov, ako aj výskyt rezíduí pesticídov v rastlinách (Noyes
a kol., 2009; Boxall a kol., 2009; Miraglia a kol., 2009). Vo vńeobecnosti zvýńená teplota zvyńuje
toxickosť kontaminantov a koncentráciu ozónu v troposfére, pravdepodobne tieņ aj rýchlosť
degradácie chemických látok, priĉom je moņný vznik oveľa toxickejńích metabolitov a naruńenie
homeostázy. Zníņená precipitácia v niektorých oblastiach zase môņe zvýńiť odparovanie pesticídov do
atmosféry a zneĉistenie vzduchu v priemyselných oblastiach s následným negatívnym úĉinkom na
zdravie, priĉom tento vplyv môņe byť eńte umocnený zvyńovaním teploty. Na druhej strane oblasti so
192
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
zvýńenou precipitáciou majú niņńie hladiny zneĉistenia ovzduńia, ale zvýńený odtok pesticídov.
Navyńe zvýńenie intenzity a frekvencie búrok v spojení s klimatickými zmenami môņe viesť ku
rozsiahlejńej kontaminácii vôd, zmeny v salinite ovplyvņovať vodné ņivoĉíchy a v niektorých
prípadoch zvyńovať toxickosť kontaminantov (Noyes a kol., 2009). Podľa Boxalla a kol. (2009) vo
vńeobecnosti moņno konńtatovať, ņe klimatické zmeny zvyńujú expozíciu ņivých organizmov rôznym
druhom kontaminantov. U necieľových organizmov môņu vznikať akútne alebo chronické otravy,
alebo dochádzať k rôznym pońkodeniam, ako je zníņenie plodnosti, patologické zmeny na potomstve,
karcinogénne pôsobenie a pod. (Pereira a kol., 2009; Çok a kol., 2009).
V súĉasnosti sú dostupné základné metódy na redukciu toxického a ekotoxikologického
nebezpeĉenstva a na modelovanie úĉinkov látok chronicky penetrujúcich do ņivotného prostredia.
Problematika pesticídov sa tak stáva jednou z prvoradých otázok súĉasnej ochrany zdravia.
Poďakovanie
Táto práca bola podporovaná VEGA Grantom ĉ. 1/0545/08 a Národným referenĉným laboratóriom
pre pesticídy pri UVLF v Końiciach.
Literatúra
BATTU R.S. - SINGH, B. - KANG, B.K. - JOIA, B.S. 2005. In Ecotoxicol. Environ. Saf., vol. 62,
2005, no. 1, p. 132–139.
BEARD, J. 2006. In Sci. Total Environ., vol. 355, 2006, no. 1-3, p. 78–89.
BEHROOZ, R.D. - ESMAILI-SARI, A. - GHASEMPOURI, S.M. - BAHRAMIFAR, N. - COVACI,
A.2009a. In Inter., vol. 35, 2009a, no. 2, p. 285–290.
BEHROOZ, R.D. - SARI, A.E. - BAHRAMIFAR, N. - GHASEMPOURI, S.M. 2009b In
Chemosphere, vol. 74, 2009b, no. 7, p. 931–937.
BOXALL, A.B.A. - HARDY, A. - BEULKE, S. - BOUCARD, T. - BURGIN, L. FALLOUN, P.D. - HAYGARTH, P.M. - HUTCHINSON, T. - KOVATS, R.S. LEONARDI, G. - LEVY, L.S. - NICHOLS, G. - PARSONS, S.A. - POTTS, L. - STONE, D.
- TOPP, E. - TURLEY, D.B. - WALSH, K. - WELLINGTON, E.M.H. - WILLIAMS, R.J.
2009. In Environ. Health Perspect., vol. 117, 2009, no. 4, p. 508–514.
ÇOK, I. - DURMAZ, T.C. - DURMAZ, E. - SATIROGLU, M.H. - KABUKCU, C. 2009. In Environ.
Monitor. Assess., 2009 (v tlaĉi).
COLOSIO, C. - TIRANAMI, M. - MARONI, M. 2003. In Neurotoxicol., vol. 24, 2003, p. 577–591.
DANIEL, V. - HUBER, W. - BAUER, K. - SUESAL, C. - CONRADT, C. - OPELZ, G. 2002. In
Arch. Environ. Health, vol. 57, 2002, no. 6, p. 541–547.
ECOBICHON, D.J. 2000. In Neurotoxicol., vol. 21, 2000, no. 1–2, p. 211–218.
ERIKSSON, P. - TALTS, U. 2000. In Neurotoxicol., vol. 21, 2000, no. 1–2, p. 37–47.
GAZZOTTI, T. - STICCA, P. - ZIRONI, E. - LUGOBONI, B. - SERRAINO, A. - PAGLIUCA, G.
2009. In Bull. Environ. Contam. Toxicol., vol. 82, 2009, no. 2, p. 251–254.
GIBBS, K.E. - MACKEY, R.L. - CURRIE, D.J. 2009. In Diversity Distrib., vol. 15, 2009, no. 2, p.
242–253.
GIROTTI, S. - FERRI, E.N. - ERRANI, E. 2009. In J. Environ. Sci. Health - Part B, vol. 44, 2009,
no. 2, p. 130–136.
GLADEN, B.C. - ROGAN, W.J. 1995. In Am. J. Pub. Health, vol. 85, 1995, no. 4, p. 504–508.
GRIMALT, J.O. - CARRIZO, D. - GARÍ, M. - FONT-RIBERA, L. - RIBAS-FITO, N. - TORRENT,
M. - SUNYER, J. 2010. In Environ. Res., vol. 110, 2010, no. 3, p. 244–250.
GUITART, R. - CROUBELS, S. - CALONI, F. - SACHANA, M. - DAVANZO, F. VANDENBROUCKE, V. - BERNY, P. 2010. In Vet. J., 2010 (v tlaĉi).
HENNY, C.J. - YATES, M.A. - SEEGAR, W.S. 2009. In J. Raptor Res., vol. 43, 2009, no. 1, p. 37–
42.
HERRERO-MERCADO, M. - WALISZEWSKI, S.M. - VALENCIA-QUINTANA, R. - CABA, M. HERNÁNDEZ-CHALATE, F. - GARCÍA-AGUILAR, E. - VILLALBA, R. 2010. In Bull. Environ.
Contam. Toxicol., 2010 (v tlaĉi).
CHEN, C.W. - HURD, C. - VOROJEIKINA, D.P. - ARNOLD S.F. - NOTILES, A.C. 1997.
In Biochem. Pharmacol., vol. 53, 1997, no. 8, p. 1161–1172.
193
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
KALAMARAKIS, A.E. - MARKELLOU, E. 2007. In J. Pest. Sci., vol. 32, 2007, no. 1, p. 1–
9.
KALYONCU, L. - AGCA, I. - AKTUMSEK, A. 2009. In Chemosphere, vol. 74, 2009, no. 7, p.
885–889.
KAN, C.A. - MEIJER, G.A.L. 2007. In Anim. Feed Sci. Technol., vol. 133, 2007, no. 1–2, p. 84–108.
KATZ, J.M. - WINTER, C.K. 2009.In Food Chem. Toxicol., vol. 47, 2009, no. 2, p. 335–338.
KELCE, W.R. - STONE, C.R. - LAWS, S.C. - GRAY, L.E. - KEMPPAINEN, J.A. - WILSON, E.M.
1975. In Nature, vol. 375, 1995, no. 6532, p. 581–585.
KRAUTHACKER, B. - VOTAVA-RAIĆ, A. - HERCEG ROMANOVIĈ, S. - TJEŃIĆ-DRINKOVIĆ,
D. - TJEŃIĆ-DRINKOVIĆ, D. - REINER, E. 2009. In Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2009 (v
tlaĉi).
LENG, J.-H. - KAYAMA, F. - WANG, P.-Y. - NAKAMURA, M. - NAKATA, T. - WANG, Y. 2009.
In Chemosphere, vol. 75, 2009, no. 5, p. 634–639.
LIU, X. - ZHANG, G. - LI, J. - YU, L.-L. - XU, Y. - LI, X.-D. - KOBARA, Y. - JONES, K.C. 2009.In
Environ. Sci. Technol., vol. 43, 2009, no. 5, p.1316–1321.
MANSOUR, S.A. - BELAL, M.H. - ABOU-ARAB, A.A.K. - GAD, M.F. 2009. In Chemosphere, vol.
75, 2009, no. 5, p. 601–609.
MIRAGLIA, M. - MARVIN, H.J.P. - KLETTER, G.A. - BATTILANI, P. - BRERA, C. - CONI, E. CUBADDA, F. - CROCI, L. - DE SANTIS, B. - DEKKERS, S. - FILIPPI, L. - HUTJES, R.W.A. NOORDAM, M.Y. - PISANTE, M. - PIVA, G. - PRANDINI, A. - TOTI, L. - VAN DEN BORN, G.J.
- VESPERMANN, A. 2009. In Food Chem. Toxicol., vol. 47, 2009, no. 5, p. 1009–1021.
MOSZCZYNSKA, A. - VASILIADIS, S. - ZANETTI, M. 2009. TrAC-Trends in Analytical
Chemistry, vol. 28, 2009, no. 2, p. 135–140.
NAETHER, L.P. - BARR, D.B. - RITHMIRE, N. - EDWARDS, J. - HOLMES, A.K. - NEEDHAM,
L.L. - RUBIN, C.S. 2009. In Environ. Inter., vol. 35, 2009, no. 2, p. 358–362.
NAG, S.K. - RAIKWAR, M.K. 2010. In Environ Monit Assess., 2010 (v tlaĉi).
NOYES, P.D. - MCELWEE, M.K. - MILLER, H.D. - CLARK, B.W. - VAN TIEM, L.A. WALCOTT, K.C. - ERWIN, K.N. - LEVIN, E.D. 2009. In Environ. Inter., 2009 (v tlaĉi).
OCIEPA-ZAWAL, M. - RUBIS, B. - WAWRZYNCZAK, D. - WACHOWIAK, R. - TRZECIAK,
W.H. 2010. In J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng., vol. 45, 2010, no. 3, p.
305–312.
OECD in Figures 2006–2007. OECD Observer 2006/Supplement 1. www.oecd.org. ISBN 92-6402263-5.
PEREIRA, J.L. - ANTUNES, S.C. - CASTRO, B.B. - MARQUES, C.R.. - GONCALVES, A.M.M. GONCALVES, F. - PEREIRA, R. 2009. In Ecotoxicol., vol. 18, 2009, no. 4, p. 455–463.
REYLEA, R.A. 2009. In Oecologia, vol. 159, 2009, no. 2, p. 363–376.
SEXTON, K. - ADAGATE, J.L. - FREDRICKSON, A.L. - RYAN, A.D. - NEEDHAM, L.L. ASHLEY, D.L. 2006. In Environ. Health Perspect., vol. 114, 2006, no. 3, p. 453–459.
SIVARAMAKRISHNAN, C.N. 2009. In Colourage, vol. 56, 2009, no. 3, p. 54–57.
SUN, F. - WONG, S.S. - LI, G.C. - CHEN, S.N. 2006. In Chemosphere, vol. 62, 2006, no. 4, p. 674–
680.
The Pesticide Action Network UK: School children being exposed to hazardous pesticides.
http://www.pan-uk.org/press/school_children.html.
TORRES-ARREOLA, L. - LOPEZ-CARRILLO, L. - TORRES-SANCHEZ, L. - CEBRIAN, M. RUEDA, C. - REYES, R. - LOPEZ-CERVANTES, M. 1999. In Arch. Environ. Health, vol. 54, 1999,
no.2, p. 124–129.
UDOJI, F. - MARTIN, T. - ETHERTON, R. - WHALEM, M.M. 2010. In J. Immunotoxicol., 2010 (v
tlaĉi).
U.S. EPA. What is a Pesticide? www.epa.gov/, 2006.
VONESH, J.R. - KRAUS, J.M. 2009. In Oecologia, vol. 160, 2009, no. 2, p. 379–385.
Kontaktná adresa:
Nora Kovalkoviĉová, Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, 041 81 Końice,
Slovenská republika
194
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
:+421915984988; fax:+421552981199
 [email protected]
Irena Ńutiaková, Katedra biológie, Fakulta humanitných a prírodných vied, Preńovská Univerzita, Ul.
17. novembra 1, 081 16 Preńov, Slovenská republika
+42151-7570600; fax: +42151-772554
 [email protected]
195
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
STANOVENIE PRÍTOMNOSTI REZÍDUÍ LASALOCIDU V TKANIVÁCH
BROJLEROVÝCH KURČIAT
DETECTION OF LASALOCIDE RESIDUES IN BROILER CHICKEN TISSUES
KOŅÁROVÁ I., MAČANGA J., ŃIMKOVÁ J., MAĎAROVÁ M., SÝKOROVÁ GOFFOVÁ
Z., LEVKUT M. ml., MAJOR P.
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie, Komenského 73, 041 81 Košice, Slovenská republika
Abstract
The present paper deals with the detection of the presence of lasalocid residues in the tissues of broiler
chickens after its oral administration up to day 5 of the withdrawal period. The residues were detected
by the screening test for antibiotic residues (STAR) with the test strain Bacillus stearothermophilus
var. calidolactis ATCC 10149. The samples were considered positive if they exhibited an inhibition
zone 4 mm and more. The STAR detected the presence of lasalocid residues in all examined chicken
tissues. The largest inhibition zones were observed in the liver followed by the heart, kidneys, skin,
fat, gizzard and, finally, the thigh muscle and the beast muscle. On the last day of the withdrawal
period, the liver, heart, kidneys, skin and fat were still positive.
Key words: lasalocid, residues, tissues of broiler chickens, detection, STAR
Úvod
Lasalocid je polyéterové ionofórové kokcidiostatikum schválené nariadením Európskeho
parlamentu a Rady (ES) ĉ. 1831/2003 ako kŕmna doplnková látka urĉená na pouņívanie vo výņive
zvierat. Kokcidiostatiká sú látky urĉené na niĉenie alebo brzdenie rastu prvokov a vzhľadom k tomuto
fenoménu sa podávajú zdravým zvieratám poĉas ņivotného cyklu na prevenciu kokcidiózy.
Podávanie kokcidiostatík významne prispieva k ochrane zdravia zvierat a starostlivosti o zvieratá.
Kokcidióza postihuje predovńetkým hydinu, pernatú zver a králiky (Goldová et al., 2000; Goldová et
al., 2001; Goldová, 2002; Koņárová et al., 2002a; Koņárová et al., 2009a). Bez kokcidiostatík by bola
výroba produktov ņivoĉíńneho pôvodu váņne ekonomicky ohrozená a spotrebitelia by tak stratili
prístup k mäsu z hydiny, moriakov a králika domáceho vyrábaných podľa prísnych noriem Európskej
únie
(EÖ)
v
oblasti
bezpeĉnosti
a prosperity
(http://ec.
europa.eu/food/
food/animalnutrition/feedadditives/docs/ReportCoccs-2332008SK.pdf ).
Výsledkom pouņívania kokcidiostatík vo výņive zvierat je moņná prítomnosť rezíduí týchto
látok v potravinách. Ak obsah rezíduí akejkoľvek doplnkovej látky v potravinách zo zvierat kŕmených
prísluńnou doplnkovou látkou by mohol mať ńkodlivý úĉinok na ľudské zdravie, nariadenie (ES) ĉ.
1831/2003 musí obsahovať maximálne limity rezíduí (MRLs) pre úĉinnú látku alebo pre jej metabolity
v prísluńných potravinových matriciach. Ak maximálny limit rezíduí (MRL) pre prísluńnú látku bol uņ
v pravidlách spoloĉenstva ustanovený nariadením Rady (EHS) ĉ. 2377/90 alebo nariadením Komisie
(EÖ) ĉ. 37/2010, uvedený MLR sa uplatņuje aj na rezíduá úĉinnej látky alebo jej metabolitov
pochádzajúcich z pouņívania danej látky ako kŕmnej doplnkovej látky.
Lasalocid sodný sa ako kokcidiostatikum povoľuje nariadením Komisie (ES) ĉ. 1455/2004 na
pouņitie pre kurĉatá urĉené na výkrm alebo odchov a nariadením Komisie (ES) ĉ. 2430/1999
pre morky v dávke od 75 – 125 mg úĉinnej látky na 1 kg krmiva pri dodrņaní ochrannej lehoty
najmenej 5 dní pred zabitím. V prípade predmetnej látky sa MRL zaviedol nariadením Rady (EHS) ĉ.
2377/90 a je stanovený v cieľových tkanivách hydiny nasledovne: 0,020 mg.kg-1 svalovina, 0,100
mg.kg-1 koņa a tuk, 0,100 mg.kg-1 peĉeņ, 0,050 mg.kg-1 obliĉky a 0,150 mg.kg-1 vajcia.
MRLs sú referenĉnými hodnotami pre kontrolu rezíduí farmakologicky úĉinných látok v potravinách
ņivoĉíńneho pôvodu. Kontrola rezíduí farmakologicky úĉinných látok vrátane kokcidiostatík
v potravinách ņivoĉíńneho pôvodu je legislatívne ońetrená smernicou Rady 96/23/ES a jej
vykonávacím predpisom, rozhodnutím Komisie 2002/657/ES, ktorým sa ustanovuje jednotný
a efektívny systém kontroly rezíduí pozostávajúci z prvotného screeningu rezíduí (stanovenie
prítomnosti) a jednoznaĉnej konfirmácie rezíduí (identifikácia a kvantitatívne stanovenie).
196
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Na stanovenie prítomnosti rezíduí farmakologicky úĉinných látok v potravinách ņivoĉíńneho
pôvodu sa pouņívajú ńirokospektrálne mikrobiologické screeningové testy zaloņené na inhibícii rastu
(obmedzenie metabolickej aktivity) testovacieho kmeņa. Jednou z metód validovanou na úĉely úradnej
kontroly rezíduí je screeningový test na stanovenie rezíduí antibiotík (STAR), ktorý pouņitím piatich
testovacích kmeņov umoņņuje skupinovú identifikáciu antibiotík vo vyńetrovaných vzorkách. Jedným
z testovacích kmeņov metódy STAR je aj testovací kmeņ Bacillus stearothermophilus var. calidolactis
ATCC 10149, ktorý na základe výsledkov nańich doterajńích ńtúdií (Koņárová a Máté, 2000; Koņárová
et al., 2002b; Koņárová, 2006) vykazuje najvyńńiu citlivosť na polyéterové ionofórové kokcidiostatiká
a môņe byť pouņitý na úĉely kontroly rezíduí kokcidiostatík v potravinových matriciach na
poņadovanej úrovni.
Prezentovaná práca sa zaoberá stanovením prítomnosti rezíduí lasalocidu v tkanivách brojlerových
kurĉiat metódou STAR s testovacím kmeņom Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ATCC
10149 poĉas 5-dņovej ochrannej lehoty.
Materiál a metodika
V experimente bolo pouņitých 80 brojlerových kurĉiat (hybrid Ross 308, Animex Grupa
Surowcowa Sp. z o.o., Bialystok, PL) umiestnených v schválenom pokusnom zariadení (Östav
patologickej anatómie UVLF v Końiciach /SK P 52004/) od 1. do 42. dņa veku. Zvieratá boli náhodne
rozdelené do dvoch skupín, experimentálnej a kontrolnej, s poĉtom zvierat v kaņdej skupine po 40 ks.
Zvieratá mali voľný prístup k vode a krmivu. Postup kŕmenia bol nasledovný: a) experimentálnej
skupine zvierat bola od 1. do 18. dņa veku podávaná kŕmna zmes na výkrm brojlerov HYD 01
ńtartérová, od 19. do 35. dņa veku kŕmna zmes na výkrm brojlerov HYD 02 rastová a od 36. do 42.
dņa veku (ochranná lehota) kŕmna zmes na výkrm brojlerov HYD 03 finálna. Kŕmne zmesi boli
zakúpené od spoloĉnosti TAJBA, a.s., α SK 100133 (Ĉaņa, SK). Kokcidiostatiká boli do kŕmnych
zmesí zapracované nasledovne: HYD 01 – Robenidín hydrochlorid (Cycostat 66 G /6,6 % premix/,
Alpharma BVBA, Belgicko) v dávke 33 mg úĉinnej látky.kg-1 krmiva a HYD 02 – Lasalocid A sodný
(Avatec 150 G /15 % premix/, Alpharma BVBA, Belgicko/ v dávke 100 mg úĉinnej látky.kg-1 krmiva,
b) postup kŕmenia zvierat v kontrolnej skupine bol zhodný s postupom kŕmenia zvierat zaradených do
experimentálnej skupiny. Zvieratám vńak neboli podávané kokcidiostatiká z dôvodu získania
negatívnych vzoriek. Poĉas jednotlivých dní stanovenej ochrannej lehoty boli zvieratá v poĉte 2 ks z
kaņdej skupiny postupne zabíjané a tkanivá (prsná svalovina, stehenná svalovina, ņalúdok, peĉeņ,
srdce, obliĉky, koņa, tuk) vyńetrované na prítomnosť, resp. neprítomnosť rezíduí lasalocidu úradne
schválenou metódou STAR s testovacím kmeņom Bacillus stearothermophilus var. calidolactis ATCC
10149 (CH 12.19., 2006). Za pozitívny výsledok sa povaņovalo vytvorenie ĉírej pravidelnej zóny
okolo vyńetrovaných vzoriek o minimálnej veľkosti 4 mm pre mäso a orgány. Experiment bol
schválený ŃVPS SR pod ĉíslom rozhodnutia 1859/09-221/3.
Výsledky a diskusia
Výsledky prítomnosti rezíduí lasalocidu v tkanivách brojlerových kurĉiat sú prezentované
v tabuľke 1. Veľkosť inhibiĉných zón (mm) bola meraná od okraja matrice po vonkajńí okraj zóny
inhibície digitálnym posuvným meradlom fy. Mitutoyo (Japonsko). Pre výpoĉet priemerov veľkostí
inhibiĉných zón a odchýlok hodnôt od priemeru (smerodajná odchýlka /SD/) bol pouņitý program
Microsoft Office Excel 2003. Tuĉne zvýraznené ĉíslice predstavujú pozitívne výsledky.
197
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tabuľka 1 Priemerné veľkosti inhibiĉných zón (mm ± SD) detegované pri vyńetrovaní tkanív
brojlerových kurĉiat metódou STAR s testovacím kmeņom Bacillus stearothermophilus var.
calidolactis ATCC 10149
Deň ochrannej lehoty
Matrica
0
1
2
3
4
5
6
Stehno
4,15 ± 1,24
4,39 ± 1,15
4,45 ± 1,33
3,46 ± 1,10
1,96 ± 0,55
3,22 ± 0,70
3,26 ± 0,66
Prsia
2,67 ± 0,73
2,64 ± 1,23
3,27 ± 1,04
2,83 ± 0,68
0,71 ± 0,28
2,99 ± 0,57
1,99 ± 0,66
Ņalúdok
4,54 ± 0,18
4,31 ± 2,04
3,96 ± 1,46
3,43 ± 0,62
2,08 ± 0,46
3,00 ± 0,57
3,23 ± 0,32
Pečeň
10,27 ± 0,30
9,95 ± 1,29
10,19 ± 0,71
9,23 ± 0,50
7,99 ± 0,68
8,73 ± 0,91
6,34 ± 1,07
Srdce
7,03 ± 0,93
8,66 ± 1,17
8,59 ± 1,12
5,90 ± 0,55
5,80 ± 2,80
6,26 ± 0,51
6,43 ± 0,09
Obličky
7,64 ± 0,23
8,27 ± 0,72
7,60 ± 1,19
7,85 ± 0,91
7,57 ± 0,95
5,87 ± 2,14
4,66 ± 0,71
Koņa
5,10 ± 0,89
4,75 ± 0,61
4,25 ± 0,97
4,62 ± 2,04
3,95 ± 0,72
3,79 ± 0,64
3,60 ± 0,44
Tuk
4,80 ± 1,12
2,91 ± 1,46
3,65 ± 0,41
3,85 ± 1,35
4,29 ± 0,57
3,48 ± 0,60
3,16 ± 0,66
Výsledky prezentované v tabuľke 1 poukazujú na prítomnosť rezíduí lasalocidu v tkanivách
brojlerových kurĉiat inhibíciou rastu testovacieho kmeņa s následnou tvorbou inhibiĉných zón.
Veľkosť inhibiĉných zón závisí od koncentrácie a typu antibakteriálnej látky prítomnej v skúńanej
vzorke, ale aj moņnej prítomnosti prirodzene sa vyskytujúcich inhibítorov v jednotlivých
potravinových matriciach. Kećņe testovací kmeņ Bacillus stearothermophilus var. calidolactis je
vysoko citlivý na látky prirodzene sa vyskytujúce v niektorých ņivoĉíńnych matriciach, metóda STAR
pri tomto testovacom kmeni povaņuje za pozitívny výsledok inhibiĉnú zónu o minimálnej veľkosti 4
mm.
Nariadenie Komisie (ES) ĉ. 1455/2004 stanovuje pre lasalocid ochrannú lehotu v trvaní
minimálne 5 dní pred zabitím. Ochranná lehota predstavuje dobu medzi posledným podaním
prísluńného veterinárneho lieku zvieratám za zvyĉajných podmienok pouņívania a výrobou potravín z
takýchto zvierat, aby sa zabezpeĉilo, ņe takéto potraviny neobsahujú rezíduá v mnoņstvách
prekraĉujúcich MRLs (Smernica 2001/82/ES Európskeho parlamentu a Rady). Prítomnosť rezíduí
lasalocidu v tkanivách brojlerových kurĉiat bola stanovovaná poĉas celého obdobia ochrannej lehoty.
Predmetom záujmu vńak bol aj tzv. 0-tý deņ (posledný deņ podávania lasalocidu) a 6-ty deņ (deņ po
uplynutí stanovenej ochrannej lehoty).
Pri vyńetrovaní tkanív brojlerových kurĉiat boli zaznamenané pozitívne výsledky v peĉeni,
srdci, obliĉkách, koņi a tuku poĉas celého obdobia stanovenej ochrannej lehoty. Ņalúdok a stehenná
svalovina boli pozitívne do tretieho dņa ochrannej lehoty a prsná svalovina brojlerových kurĉiat bola
vyhodnotená ako negatívna na prítomnosť rezíduí lasalocidu s výnimkou 2-ho dņa stanovenej
ochrannej lehoty. Veľkosť inhibiĉných zón vo vyńetrovaných matriciach klesala v poradí peĉeņ, srdce,
obliĉky, koņa, tuk, ņalúdok a stehenná a prsná svalovina. V siedmy deņ vyńetrovania (deņ po uplynutí
stanovenej ochrannej lehoty /6. deņ/) boli zistené pozitívne výsledky eńte v peĉeni, srdci, obliĉkách
a koņi. Vzorky tkanív brojlerových kurĉiat z kontrolnej skupiny boli vyhodnotené ako negatívne na
prítomnosť rezíduí lasalocidu.
Grafické znázornenie porovnania priemerných veľkostí inhibiĉných zón okolo vyńetrovaných
tkanív brojlerových kurĉiat poĉas celého sledovaného obdobia je prezentované v Grafe 1. Zaujímavé
na tom vńak je, ņe pri vyńetrovaní tkanív brojlerových kurĉiat sme nezaznamenali plynulý pokles
veľkostí inhibiĉných zón naznaĉujúci postupné zniņovanie hladín lasalocidu vo vyńetrovaných
matriciach. Obdobné výsledky sme zaznamenali aj v nańich predchádzajúcich ńtúdiách pri stanovení
prítomnosti rezíduí maduramycínu v tkanivách brojlerových kurĉiat a maduramycínu a
narazín/nikarbazínu v tkanivách brojlerových kurĉiat a baņantov (Koņárová et al., 2008; Koņárová et
al., 2009b).
198
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Veľkosť inhibičnej zóny (mm)
12,00
10,00
Stehno
Prsia
Ņalúdok
Peĉeņ
Srdce
Obliĉky
Koņa
Tuk
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
0
1
2
3
4
5
6
Deň ochrannej lehoty
Graf 1 Porovnanie priemerných veľkostí inhibičných zón
produkovaných rezíduami lasalocidu v tkanivách brojlerových
kurčiat
Vzorky s veľkosťou inhibiĉnej zóny väĉńou ako 4 mm sú podľa metódy STAR povaņované za
obsahujúce rezíduá antibakteriálnych látok. Prítomnosť rezíduí v produktoch ņivoĉíńneho pôvodu
ovplyvņuje zdravie obyvateľstva. Kećņe dosiahnuté výsledky poukazujú na prítomnosť rezíduí
lasalocidu v tkanivách brojlerových kurĉiat aj po piatich dņoch stanovenej ochrannej lehoty
s výnimkou prsnej a stehennej svaloviny a ņalúdka, 5-dņová ochranná lehota nie je pravdepodobne
dostatoĉná na odstránenie zdravotných rizík vyplývajúcich z moņnej prítomnosti rezíduí lasalocidu
v tkanivách brojlerových kurĉiat.
Skríningové metódy sa v detekcii rezíduí pouņívajú na roztriedenie veľkého poĉtu vzoriek
podľa potenciálne nezhodných výsledkov na pozitívne a negatívne. Výsledok stanovený
screeningovou metódou musí byť potvrdený konfirmaĉnou metódou, pouņitím ktorej sa látka
jednoznaĉne identifikuje a kvantifikuje na prísluńnej úrovni (Rozhodnutie Komisie 2002/657/ES).
Výsledky preukazujúce, ņe bol prekroĉený MRL musia viesť k tomu, ņe telá zabitých zvierat alebo ich
produkty sa vyhlásia za nevhodné pre ľudskú spotrebu (Smernica Rady 96/23/ES). Nami dosiahnuté
výsledky poukazujú na skutoĉnosť, ņe tkanivá brojlerových kurĉiat (peĉeņ, srdce, obliĉky, koņa a tuk)
sú po uplynutí stanovenej 5-dņovej ochrannej lehoty povaņované za obsahujúce rezíduá lasalocidu. Ak
by sa prísluńnou konfirmaĉnou metódou potvrdila prítomnosť rezíduí lasalocidu v tkanivách
brojlerových kurĉiat v koncentráciách prevyńujúcich stanovené MRLs, uvedené tkanivá by sa
jednoznaĉne posúdili ako nepoņívateľné pre ľudskú spotrebu.
Záver
Prítomnosť kokcidiostatík v krmive môņe mať za následok prítomnosť rezíduí týchto látok v
potravinových matriciach. Avatec 150 G je komerĉne vyrábaný kokcidiostatický prípravok obsahujúci
15 % úĉinnej látky lasalocid A sodný. Podávanie lasalocidu brojlerovým kurĉatám vo fáze
maximálneho rastu v dávke 75 – 125 mg úĉinnej látky na 1 kg krmiva chráni zvieratá pred
prepuknutím kokcidiózy, ale pri nedodrņaní stanovenej ochrannej lehoty nezabezpeĉuje ochranu
zdravia ľudí v súvislosti s výskytom rezíduí. Ochranná lehota musí byť dostatoĉná na odstránenie
zdravotných rizík vyplývajúcich z rezíduí.
Screeningový test na stanovenie rezíduí antibiotík je metódou schválenou na úĉely prvotnej kontroly
a predbeņnej identifikácie rezíduí antibiotík a sulfónamidov v potravinách a surovinách ņivoĉíńneho
pôvodu. Metóda STAR nie je zatiaľ validovaná pre kokcidiostatiká, ale ako ńirokospektrálny
screeningový test môņe zachytávať rezíduá aj zatiaľ nedeklarovaných antibakteriálnych látok alebo ich
skupín.
Lasalocid je polyéterové ionofórové antibiotikum a z testovacích kmeņov metódy STAR
najvyńńiu citlivosť na ionofórové kokcidiostatiká vrátane lasalocidu vykazuje testovací kmeņ Bacillus
199
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
stearothermophilus var. calidolactis ATCC 10149. Uvedený testovací kmeņ bol pouņitý na prvotné
stanovenie rezíduí lasalocidu v tkanivách brojlerových kurĉiat. Tkanivá brojlerových kurĉiat boli
s výnimkou prsnej a stehennej svaloviny a ņalúdka pozitívne na prítomnosť rezíduí lasalocidu nielen
na piaty deņ ochrannej lehoty, ale eńte aj v tzv. ńiesty deņ, t.j. deņ po ukonĉení stanovenej ochrannej
lehoty. V záujme ochrany zdravia ľudí si vńak dosiahnuté výsledky vyņadujú potvrdene prísluńnou
konfirmaĉnou metódou, ktorá by nám umoņnila relevantne zhodnotiť dostatoĉnosť doby ochrannej
lehoty potrebnej na zabezpeĉenie poklesu rezíduí lasalocidu vo vńetkých ņivoĉíńnych matriciach
brojlerových kurĉiat na úroveņ stanovených MRLs a posúdiť poņívateľnosť týchto produktov pre
ľudskú spotrebu.
Poďakovanie
Spracovanie príspevku bolo podporené grantmi VEGA MŃ SR ĉ. 1/0658/09 a ĉ. 1/0144/10.
Literatúra
GOLDOVÁ, M. - PISTL, J. - LETKOVÁ, V. - CSIZSMÁROVÁ, G. - REVAJOVÁ, V. LOÓSZOVÁ, A. - LEVKUT, M., 2000. Cellular immunological responses of pheasant during
endogenous development of Eimeria colchici. In Parasitology International, vol. 49, 2000, pp. 47154.
GOLDOVÁ, M. - REVAJOVÁ, V. - PISTL, J. - LETKOVÁ, V. - LEVKUT, M. - WAGSHAL, E. CSIZSMÁROVÁ, G. - LOÓSZOVÁ, A. 2001. Eimeria colchici and immunocompetent cells in
specific and non-specific hosts. In Acta Parasitologica, vol. 46, 2001, no. 1, pp. 39-44.
GOLDOVÁ, M., 2002. Kokcidióza hydiny. In Slovenský veterinársky ĉasopis, vol. 6, 2002, s. 30-32.
http://ec.europa.eu/food/food/animalnutrition/feedadditives/docs/Report-Coccs-233-2008-SK.pdf
(2008-05-20).
CH 12.19, 2006. Screeningový test na stanovenie rezíduí antibiotík s pouņitím bakteriálnych kmeņov
(STAR). In Zoznam úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív. Vestník MP SR, 38,
13, s. 68-81.
KOŅÁROVÁ, I. - MÁTÉ, D. 2000. Evaluation of the sensitivity of individual test organisms to
residual concentrations of selected types of anticoccidial drugs. In Bull. Vet. Inst. Pulawy, vol. 44,
2000, no. 2, pp.187-192.
KOŅÁROVÁ, I. - MÁTÉ, D. - SOPKOVÁ, D. 2002a. The prevention and control of coccidiosis in
poultry rearing. In Folia Veterinaria, vol. 46, 2002, no. 4, pp. 203–206.
KOŅÁROVÁ, I. - MÁTÉ, D. - CABADAJ, R. - RÓŻAŃSKA, H. - HUSSEIN, K. - LACIAKOVÁ, A.
2002b. An evaluation of the microbiological diffusion methods as a tool for screening monensin
residues in the tissues of broiler chickens. In Folia Veterinaria, vol. 46, 2002, no. 1, pp. 27-33.
KOŅÁROVÁ, I. 2006. Porovnávacia ńtúdia detekĉnej citlivosti mikrobiálnych inhibiĉných testov na
antikokcidiká. In Zborník z medzinárodnej konferencie „Rizikové faktory potravového reťazca VI.“,
Nitra : SPU, 12. 10. 2006, s. 189-193. ISBN 80-8069-760-4.
KOŅÁROVÁ, I. - SÝKOROVÁ GOFFOVÁ, Z. - MÁTÉ, D. 2008. Detection of maduramycin
residues in the tissues of broiler chicken by using the Premi®Test and the STAR. In Slovak J. Anim.
Sci., vol. 41, 2008, p. 206.
KOŅÁROVÁ, I. - SOKOL, J. - GOLIAN, J. - MÁTÉ, D. 2009a. História vývoja právnych predpisov
pre antikokcidiká. In Zborník prác z. medzinárodnej vedeckej konferencie „Bezpeĉnosť a kontrola
potravín“. Nitra : SPU, 1. – 2. 4. 2009, s. 66-70. ISBN 978-80-552-0193-1.
KOŅÁROVÁ, I. - MAĈANGA, J. - GOLDOVÁ, M. - MAJOR, P. - KORÉNEKOVÁ, B., 2009b.
Komparatívna ńtúdia stanovenia prítomnosti rezíduí vybraných kokcidiostatík v tkanivách kurĉiat
a baņantov. In Potravinárstvo, vol. 3, 2009, no. 2, s. 40-44.
NARIADENIE KOMISIE (ES) ĉ. 2430/1999 zo 16. novembra 1999 o povolení urĉitých doplnkových
látok v krmivách patriacich do skupiny kokcidiostatík a iných lieĉivých látok, ktorých povolenie je
viazané na osobu zodpovednú za ich uvádzanie do obehu. In Úradný vestník Európskej únie L 296, 17.
11. 1999, s. 93-101.
NARIADENIE (ES) ĉ. 1831/2003 EURÓPSKEHO PARLAMENTU A RADY Z 22. septembra 2003
o doplnkových látkach urĉených na pouņívanie vo výņive zvierat. In Úradný vestník Európskej únie L
268, 18. 10. 2003, s. 29-43.
200
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
NARIADENIE KOMISIE (ES) ĉ. 1455/2004 zo 16. augusta 2004 o povolení doplnkovej látky do
krmív „Avatec 15 %“ patriacej do skupiny kokcidiostatiká a iné lieĉivé látky na desať rokov. In
Úradný vestník Európskej únie L 269, 17. 8. 2004, s. 14-16.
NARIADENIE KOMISIE (EÖ) ĉ. 37/2010 z 22. decembra 2009 o farmakologicky úĉinných látkach
a ich klasifikácii, pokiaľ ide o maximálne limity rezíduí v potravinách ņivoĉíńneho pôvodu. In Úradný
vestník Európskej únie L 15, 20. 1. 2010, s. 1-72.
NARIADENIE RADY (EHS) ĉ. 2377/90 z 26. júna 1990, ktorým sa stanovuje postup Spoloĉenstva na
urĉenie maximálnych limitov rezíduí veterinárnych lieĉiv v potravinách ņivoĉíńneho pôvodu. In
Úradný vestník Európskej únie L 224, 18. 8. 1990, s. 1-9.
ROZHODNUTIE KOMISIE 2002/657/ES z 12. augusta 2002, ktorým sa implementuje smernica
Rady 96/23/EHS, ktorá sa týka uplatņovania analytických metód a interpretácie výsledkov. In Úradný
vestník Európskej únie L 221, 17. 8. 2002, s. 8-36.
SMERNICA RADY (ES) ĉ. 96/23 z 29. apríla 1996 o opatreniach na monitorovanie urĉitých látok a
ich rezíduí v ņivých zvieratách a ņivoĉíńnych produktoch a o zruńení smerníc 85/358/EHS a
86/469/EHS a rozhodnutí 89/187/EHS a 91/664/EHS. In Úradný vestník Európskej únie L 125, 23. 5.
1996, s. 10-32.
SMERNICA 2001/82/ES EURÓPSKEHO PARLAMENTU A RADY zo 6. novembra 2001, ktorým
sa ustanovuje Zákonník spoloĉenstva o veterinárnych liekoch. In Úradný vestník Európskej únie L
311, 28. 11. 2001, s. 1-66.
Kontaktná adresa
doc. MVDr. Ivona Koņárová, PhD.
Univerzita veterinárskeho lekárstva a farmácie v Końiciach, Katedra hygieny a technológie potravín,
Östav hygieny a technológie mäsa, Komenského 73, 041 81 Końice, Slovenská republika
 [email protected]
201
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
THE CONTENT OF Hg, Cd AND Pb IN HONEY AND WAX SAMPLES
ORGINATING FROM POLAND AND RUSSIA
KUCZKOWSKA-KUŹNIAR A1., CIĄGŁO A1., KUŹNIAR T2., FORMICKI G1., STAWARZ
R1., ZAMACHOWSKI W1.
1
Department of Vertebrate Zoology and Human Biology, Pedagogical University of Cracow,
ul. Podbrzezie 3, 31-054 Krakow, Poland
2
Department of Agricultural Environmental Protection, University of Agriculture in Krakow,
Al. Mickiewicza 21, 31-120 Krakow, Poland
Abstract
Honey and its products are used as practical bioindicators of environment contamination by toxic
metals. Metals, such as mercury (Hg), cadmium (Cd) and lead (Pb) may be transferred by bees to their
products. This research were focused on assessment of Hg, Cd and Pb concentrations in honey and
wax samples from Poland and Russia. We have also estimated differences between contents of these
metals in different kinds of honeys and waxes. The material came from Podkarpacie province (Poland)
and Baszkiria region (Russia). The content of Hg was estimated with cold vapour atomic absorption
spectrophotometer (CVAAS), The Cd and Pb contents were measured with flame atomic absorption
spectrophotometer (FAAS). The higher averages contents of metals were found in honey and wax
from Russia. Moreover the high contents of Hg, Cd and Pb were found in wax samples both from
Poland and Russia.
Key words: toxic metals, cadmium, lead, mercury, honey, wax, Apis mellifera
Introduction
Ecological investigations show increase of different chemical compounds concentration in the
air, water and soil what in consequence leads to increase of toxic metals content in bee's products
(Kowalak 1991). The environmental pollution by toxic metals began to grow very fast. The main
sources of metal compounds are power generating plants, the motor transport, as well as widespread
use of chemical compounds in agriculture (Michalik 2009). Considerable limitation or elimination of
threats to natural environment is one of the important features of sedate agriculture (Kisała, Dżugan
2009). Mercury is a metal occurring commonly in nature. It is accumulated in soil, plants, animal and
human organisms. Hg is exceptionally dangerous poison due to its large ability of evaporation and
diffusion. Organic compounds of mercury show very high toxicity (Kowalak 1991, Segadea 2003,
Boeing 1999, Horne 1996). Cadmium is a metal with no positive role in the organism. It disturbs
calcium metabolism in organism, causes kidney diseases and also disturbances in blood circulation.
Cadmium dispersions in environment is related to intensive urbanisation (Kowalak 1991). Lead is
ubiquitous element and therefore always present in our life. The compounds of Pb easily penetrate to
human and animal organisms by respiratory and alimentary systems and also through the body
surface. Among the main sources of Pb to human organisms are food and dust. Lead easily penetrates
through placenta to fetus organism (Kowalak 1991; Piotrowski 2006).
Honey and other bee's products are used as bioindicators in many regions of the world. Toxic
metals move across bee organism to bee's products (Podgórski 2004, Porrini 2003). The use of honey
in environmental monitoring is not a new idea. In 1935 Svoboda affirmed that bee could deliver
valuable data on the industry influence on environment. 25 years later Svoboda with collaborators,
conducted monitoring with the use of honey, announced that radioactivity related to strontium 90
grows in environment (Celli 2003).
202
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Material and methods
The research were focused on an assessment of Hg, Cd and Pb concentrations in honey and wax
samples from Poland and Russia. We have also estimated differences between the contents of heavy
metals in different types of honeys and waxes. The material came from Podkarpacie province (Poland)
and Baszkiria region (Russia). Ten samples of linden honey, 10 samples of honeydew honey, 10
samples of multifloral honey as well as 10 samples of wax from Poland were collected. Ten samples
of multifloral honey and 10 samples of wild bee multifloral honey as well as 10 samples of wax and
10 samples of wild bee wax were collected from Russia. The research was conducted in July 2007.
The contents of Hg were estimated with cold vapour atomic absorption spectrophotometer (CVAAS),
contents of Cd and Pb were measured with flame atomic absorption spectrophotometer (FAAS).
Obtained data were subjected to statistical analysis using Shapiro Wilk, Kruskal-Wallis and U Mann
Whitney tests.
Results
All the studied samples of honey and wax contained mercury, cadmium and lead. Tables 1 and
2 show average content of Hg, Cd and Pb (µg.g-1 wet mass±SD) in honey and wax samples from
Poland and Russia.
Table 1 The average content of Hg, Cd and Pb in honey samples from Poland and Russia (µg.g-1
w.m.±SD)
State
Samples
Average content of metals
Hg
Cd
Pb
linden honey
0,0294±0,0082
0,00920,0159
0,01610,0031
0,0315±0,0166
Poland honeydew honey
0,00320,0005
0,01790,0066
multiflorous honey
0,0077±0,0002
0,00220,0005
0,01530,0008
multiflorous honey
0,0690±0,0108
0,00300,0007
0,01540,0048
Russia
multiflorous wild bees honey 0,00150,0013
0,1616±0,0203
0,03720,0163
Table 2 The average content of Hg, Cd and Pb in wax samples from Poland and Russia (µg.g-1
w.m.±SD)
State
Samples
Average contents of metals
Hg
Cd
Pb
0,0162±0,0016
0,0772±0,0102
Poland
wax
0,00450,0003
0,0996±0,0061
0,0891±0,0416
wax
0,01830,0065
Russia
0,0535±0,0054
0,1144±0,0359
wild bee wax
0,00500,0010
The highest content of Hg was estimated in linden honey from Poland (0,0092 µg.g-1 w.m.), and
the lowest average content of this metal was noted in wild bee honey from Russia (0,0015 µg.g-1
w.m.). A comparison of samples of honey from Poland and Russia revealed statistically insignificant
differences. In wax, the highest content of mercury was found in samples from Russia (0,0183 µg.g-1
w.m.), and the lowest in wax from Poland (0,0045 µg.g-1 w.m.). These differences were statistically
significant (p=0,023). Moreover there were no statistically significant differences between the
concentrations of this metal in wax and wild bees wax from Russia.
The highest mean content of cadmium was noted in samples of wild bee honey from Russia
(0,0372 µg.g-1 w.m.). The lowest concentration of this element was noted in multifloral honey from
Poland (0,0154 µg.g-1 w.m.). Statistically significant differences occurred between contents of
cadmium in all the tested honey samples from Russia (p=0,035). Similarly, the lowest mean content of
Cd was detected in wax from Poland (0,163 µg.g-1 w.m.), and the highest mean concentration of this
metal was noted in samples of wax from Russia (0,0996 µg.g-1 w.m.). These differences were
statistically significant (p=0,022). On the other hand, there were no statistically significant differences
between mean cadmium contents in wax and wild bees wax from Russia.
The highest average concentration of lead was noted in wild bee honey from Russia (0.1617
µg.g-1 w.m.), the lowest average concentration of this element was detected in multifloral honey from
Poland (0,0077 µg.g-1 w.m.). Statistically significant differences between mean lead contents in
203
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
samples of multifloral honey from Poland and Russia (p=0,004); multifloral honey from Poland and
wild bee honey from Russia (p=0,000); linden honey from Poland and wild bee honey from Russia
(p=0,025); honeydew honey from Poland and wild bee honey from Russia (p=0,039) were detected.
The lowest mean content of lead was found in wax from Poland (0,0773 µg.g -1 w.m.). The highest
mean concentration of this metal was noted in wild bees wax from Russia (0,1144 µg.g-1 w.m.). No
statistically significant differences were observed between mean lead contents of lead in samples of
wax from Poland and Russia and between wax and wild bee wax from Russia.
Discussion
Many scientists revealed the presence of toxic metals in water, air, soil, plants, animal
organisms and in their products (Nakagawa 1998, Nakagawa 1995). Insects, including beneficial
insects such as bees are particularly vulnerable to the effects of Hg, Cd and Pb. Apis meliphera shows
large activity in the surrounding of the hive. The range of its penetration is relatively low (2-3 km).
Hence, an increased concentration of toxic metals in the environment may result in their increased
content in bees and also in the products of their origin.
Taking into consideration properties and common usage of honey, this product is constantly
monitored to determine its purity (EU 2001/110/EC). In our research we found that the contents of Hg
and Cd in honey samples from Poland and Russia were significantly lower than the contents of Pb and
did not exceed standards for the contents of these metals in this product (Fakhimzadeh, Lodenius,
2000). Statistical analysis on the content of metals in honey samples show smaller fluctuations of the
content of Hg and Cd among samples than of the Pb content. This may indicate a different mechanism
of transport of these elements through the body of bees to bee products (Simkiss and Taylor, 2001)
and is probably related to local contamination of the environment (Bodak 1997; Kisala 2009; Celli
2003). Podgórski (2004), Accorti (1990), Bornus (1975) and Gajewka (1984) in their studies showed
that heavy metals contents in bee products coming from industrialized areas are several times greater
than in the material originating from uncontaminated areas.
Other scientific reports indicate that metal contents in honey may depend on honey type due to
its hygroscopic properties (Bibi et al., 2008). Research conducted by Kisała (2009) and Accorti (1990)
showed that the honeydew honey is characterized by a greater possibility of accumulation of toxic
metals. Our studies indicate that linden honey contains the highest amount of Pb, slightly lower
content of lead was found in honeydew honey, and the lowest in multifloral honey. By contrast, in
multifloral wild bee honey higher concentration of Pb was noted. However, the results for Hg and Cd
contents in different types of honey are not as clear as in the case of Pb. Statistically significant
differences between the mean contents of Hg and Cd were recorded in multifloral honey samples
coming from different places, what indicate a possible relationships between the contents of toxic
metals in honey and in the surrounding environment (Bornus 1986).
In addition, Fredes and Montenegro (2006) indicated that the chemical composition of honey is
affected not only by the concentration of toxic substances, but also by their volatility being the result
of such factors as the source elements, the density of flowers, season of year or rain. These parameters
could also play a role in contamination of the material tested in our studies. All tested samples were
collected in the same month and year, nonetheless we cannot indicate a specific factors, which
influenced on the honey and wax composition. Honey from Polish hives had greater viscosity and was
more concentrated than the honey coming from Russia. Also the texture of ordinary and wild bee
honey was different.
Another bee product, commonly used for monitoring of toxic metals pollution is a wax. Our
research showed that the wax accumulates significantly higher amounts of Hg, Cd and Pb than honey.
This effect may be associated with different chemical composition and hygroscopic properties of these
products. In addition, many researchers point out that the honey in contrast to other bee products is
characterized by greater variability (Fredes and Montenegro in 2006, Fakhimzadeh and Lodenius
2000). In our study we found differences mainly in the content of Hg, Cd and Pb between the waxes
from the Polish and Russian hives, which also may indicate a direct effect of contamination of
environment. Higher content of toxic metals in waxes than in honey was also reported by Żarski
(2005). In order to determine the environmental status on the basis of bee products, it is necessary to
take into consideration general, regional and local conditions (Krasowicz 2008).
204
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
Conclusions
1. Contamination of different types of bee products with Hg, Cd and Pb may be related to the
pollution of the environment, chemical composition and hygroscopic properties of the bee
products.
2. Higher contents of Hg, Cd and Pb were found in wax than in honey; it may be associated with
the chemical composition of these products.
References
ACCORTI, M. - GUARCINI, R. - MODI, G. - PRESANO ODDO, L. 1990. Urban pollution and
honey bee. In Apicultura, vol. 6, 1990, p. 43 – 55.
BIBI, S. - HUSAIN, S. Z. - MALIK, R. N. 2008. Pollen analysis and heavy metals detection in honey
samples from seven selected countries. In Pak. J. Bot., vol. 40, 2008, no. 2, p. 507 – 516.
BODAK, E. - DOBRZAŃSKI, Z. 1997. Ekotoksykologiczne problemy chowu zwierząt w rejonach
skażeń metalami ciężkimi. Cuprum, Wrocław – Rudna, 1997, p. 78 – 79.
BOEING, D. 1999. Ecological effects, transport, and fate of mercury: a general review. In
Chemosphere, vol. 40, 1999, p. 1335 – 1351.
BORNUS, L. 1975. Poisoning of honey bees by lead in the industrial area. XXVI-th International
Apicultural Congress of Apimondia. Grenoble-France. 8-14 September 1986, p. 410 – 411.
BORNUS, L. 1986. Miód pszczeli – od producenta do konsumenta. PWRiL Poznań, 1975
CELLI, G. - MACCAGNANI, B. 2003. Honey bees as bioindicators of environmenal pollution. In
Bulletin of Insectology, vol. 56, 2003, no. 1, p. 137 – 139.
EU 2001/110/EC
FAKHIMZADEH, K. - LODENIUS, M. 2000. Heavy metals in finnish honey, pollen and honey bees.
In Apiacta, vol. 35, 2000, no. 2, p. 85 – 95.
FREDES, C. - MONTENEGRO, G. 2006. Heavy metals and other trace elements contents in Chilean
honey. In Cien. Inv. Agr., vol. 33, 2006, no. 1, p. 50 – 58.
GAJEWSKA, R. - NABRZYSKI, M. - GAJEK, O.1984. Zawartość metali śladowych w miodzie
pszczelim. In Bromat. Chem. Toksykol., vol. 17, 1984, no. 3, p. 259 – 260.
HORNE, P. - WILLIAMS, P. 1996. Sampling and analysis of Merkury species in effluent gases
derived from waste incineration. In Waste Management, vol. 16, 1996, no. 7, p. 579 – 586.
KISALA, J. - DŅUGAN, M. 2009. Wpływ stanu środowiska i sposobu utrzymania pszczół na jakość
miodu. In Polskie Towarzystwo Gleboznawcze, oddział w Rzeszowie, Zeszyty Naukowe, zeszyt 11,
2009, p. 115 – 120.
KOWALAK, A. 1991. Metale śmierci, Centrum Edukacji Ekologicznej Wsi, 1991.
KRASOWICZ, S. 2008. Relacje człowiek-środowisko w aspekcie zrównoważonego rozwoju. In
Problemy Inżynierii Rolniczej, vol. 1, 2008, p. 21 – 27.
MICHALIK, P. 2009. Niska emisja- świadomość zagrożeń z niej wynikających wśród różnych grup
społecznych na przykładzie rolników z powiatu Płockiego i Sierpeckiego. In Ochrona Środowiska i
Zasobów Naturalnych, vol. 40, 2009, p. 617 – 622.
NAKAGAWA, R. 1995. Studies on the levels in atmospheric concentrations of mercury in Japan. In
Chemosphere, vol. 31, 1995, no. 2, p. 2669 – 2676.
NAKAGAWA, R. - YUMITA, Y. 1988. Hange and behavior of residual mercury in paddy soils and
rice of Japan. In Chemosphere, vol. 37, 1988, no. 8, p. 1483 – 1487.
PIOTROWSKI J. 2006. Podstawy Toksykologi. Warszawa: Wydawnictwo Naukowo Techniczne,
2006.
PODGÓRSKI, W. - KANONIUK, D. 2004. Miód jako wskaźnik zawartości metali ciężkich w
środowisku. In Sectioee XXII., vol. 48, 2004, p. 359 – 365.
PORRINI, C. - SABATINI, A. - GIROTTI, S. - GHINI, S. - MADRZYCKI, P. - GRILLENZONI, F. BORTOLOTTI, L. - GATTAVECCHIA, E. - CELLI, G. 2003. Honey bees and bee products as
monitors of the environmental contamination. In Apiacta, vol. 38, 2003, p. 63 – 70.
SEGADEA, S. - TYSOMB, J. 2003. Determination of inorganic mercury and total mercury in
biological and environmental samples by flow injection-cold vapor-atomic absorption spectrometry
using sodium borohydride as the sole reducing agent. In Spectrochimica Acta Part B., vol. 58, 2003, p.
797 – 807.
205
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
SIMKISS, K. - TAYLOR, M. G. 2001. Trace element speciation at cell membranes: aqueous, solid
and lipid phase effects. In Journal of Environmental Monitoring, vol. 3, 2001, p. 15 – 21.
ŻARSKI, T. - VALKA, J. - DEBSKI, B. - ŻARSKA, H. - MAJDECKA, T. - ARKUSZEWSKA, A.
2005. Porównanie zanieczyszczenia rtęcią produktów pszczelich w wybranych rejonach Polski i
Słowacji w aspekcie zagrożeń dla konsumentów. In Chemia i Inżynieria Ekologiczna, vol. 12, 2005,
no. 8, p. 871 – 875.
Contact addresses
A. Kuczkowska-Kużniar
Department of Vertebrate Zoology and Human Biology, Pedagogical University of Cracow, ul.
Podbrzezie 3, 31-054 Krakow, Poland
 [email protected]
A. Ciągło
Department of Agricultural Environmental Protection, University of Agriculture in Krakow, Al.
Mickiewicza 21, 31-120 Krakow, Poland
 [email protected]
206
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
EVALUATION POSSIBILITY USE OF SELECTED FOODSTUFFS IN THE
BREEDING OF ENTOMOPATHOGENIC FUNGUS OF ISARIA FUMOSOROSEA
KUŹNIAR T1., PARTYKA A1., ROPEK D1., KUCZKOWSKA-KUŹNIAR A2., CIĄGŁO A2.,
STAWARZ R2.
1
Department of Agricultural Environmental Protection, University of Agriculture in Krakow,
Al. Mickiewicza 21, 31-120 Krakow, Poland
2
Department of Vertebrate Zoology and Human Biology, Pedagogical University of Cracow, ul.
Podbrzezie 3, 31-054 Krakow, Poland
Abstract
The aim of this study was evaluation of the potential possibility use of foodstuffs to the breeding of
entomopathogenic fungus of Isaria fumosorosea. As a breeding medium culture uses natural and
industrial foodstuffs. These products are combined with agar. Possibility of using different breeding
medium cultures is important for obtaining spores of entomopathogenic fungus, to assess their
pathogenicity and ability to germinating. The effectiveness of tested breeding medium cultures was
compared to the base standard Sabouraud Dextrose Agar (SDA). The results indicate that is possible
of using milk products for the breeding of fungus. On this medium culture about 5-fold more spores
than on the standard medium culture (SDA) were obtained. Similar results for the medium, which was
36% cream and broth where obtained, respectively two- and three-fold more spores than on the control
medium culture. Rice medium culture and coffee creamer medium culture gave two-fold less spores
than the standard medium.
Key words: Isaria fumosorosea, fungi, breeding medium culture
Introduction
Entomopathogenic fungi are an important element contribute to reducing of the number of
many crop pests (Kanzok and Jacobs-Lorena 2006) and can be used in biological action against these
insects. According to Malinowski (2009) entomopathogenic fungi used in practice reduced the
development and number of many harmful organisms in the mid-19th century. Currently, scientists
work on methods for mass production of entomopathogenic fungus using artificial medium culture.
Moreover, in recent years the possibility of breeding of entomopathogenic fungus using different
medium cultures of natural origin is evaluated. Scientists searching cheap and readily available
medium culture for production entomopathogenic fungus evaluate the possibility of their breeding on
medium cultures such as liquid and solid products from agricultural, cereal‟s seeds, waste from
processing of fruit and vegetables (Sahayaraj and Namasivayam, 2008; Jenkins et al. 1998).
In this experiment assessment of the possibility of breeding of entomopathogenic
fungus of Isaria fumosorosea on selected medium cultures of foodstuffs was done.
Material and methods
The experiment was performed in the laboratory of the Department of Agricultural
Environmental Protection of Agricultural University in Krakow. We used entomopathogenic fungus of
Isaria fumosorosea, strain AP 112, originating from the University of Podlasie in Siedlce professor
Tkaczuk collection. As medium cultures for breeding of entomopathogenic fungus foodstuffs such as
cow milk (36% cream), coffee creamers (in powder form), decoction of rice, and broth were used. As
the grounds were used in a liquid form, they were cemented with agar. Medium cultures were
autoclaved for 20 minutes at 121C, and 0.1 MPa. Medium cultures were poured into sterile Petri
dishes (diameter 90 mm), 20 ml each after cooling. The suspension of entomopathogenic fungus
spores of Isaria fumosorosea (in concentration 10 7.ml-1) were inoculated in the central part of the
medium culture. To inoculation 20 l per dish of suspension was used. The experiment was performed
in 4 replications. The inoculated grounds were stored at 22C for 21 days. After the breeding period
the following parameters were assessed: number of spores per gram of medium culture used for
breeding, the ability to germinate and pathogenicity of the spores for insect test. As insect test
207
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tenebrio Molitor L test was performed. The obtained results were statistically analyzed using
Statistica (Statsoft) program.
Results
For the first 10 days linear growth of the entomopathogenic fungus on the test medium cultures
was recorded (Fig. 1). On drinking milk and cream fungi rose much faster than on the standard
medium culture (SDA). After 10 days breeding of mycelium their diameter on standard medium
culture was the lowest among all the tested medium cultures.
Some medium cultures used in experiment were more effective in the production of spores of
the entomopathogenic fungus of Isaria fumosorosea than the standard Sabouraud Dextrose Agar
ground (Fig. 2). On the medium culture, which was drinking milk, five-fold more spores were
obtained than on the standard medium culture (SDA). Similarly, in case of the medium culture with
the cream and broth, respectively three- and two-fold more spores than the standard medium culture
(SDA) were received. Other medium cultures used in the experiment for breeding, such as coffee
creamers (in powder form) and decoction of rice, showed a much weaker production of spores of
Isaria fumorosea than the standard medium culture (SDA).
Also the ability to germination of the fungus spores of Isaria fumosorosea was assesed (Fig. 3).
The results indicate the high ability for germination of spores obtained from all medium cultures,
except for spores obtained from medium cultures such as coffee creamers, broth and decoction of rice,
where their ability to germination was significantly lower than in other cases. Pathogenicity of the
fungus spores Isaria fumosorosea produced on the test medium cultures, relative to the insect test was
also assessed (Fig. 4). The results indicate the similar activity of spores obtained from all tested
medium cultures, except for spores obtained from the medium culture, which was a coffee creamers.
Spores derived from this medium culture needed 7 days to kill 50% of test insects, while the spores
obtained from the other medium cultures needed from 4 to 5 days.
Linear increment [mm]
80,0
70,0
Sabouard Dextrose Agar
60,0
Drink milk
50,0
36% cream
40,0
Btorh broth
30,0
Coffee creamer
20,0
Decoction rice
10,0
0,0
After 7 days
After 10 days
Time
.
Number of spores
[109/g medium culture ]
Figure 1 The growth rate of mycelium Isaria fumosorosea on medium cultures containing foodstuffs
5,00
b
4,00
3,00
c
d
2,00
1,00
a*
e
e
Coffee
creamer
Decoction
rice
0,00
Sabouard
Dextrose
Agar
Drink milk
36% cream
Btorh broth
Type of medium culture
*The values appointed the same letters, do not differ betw een them on level of significance p indeed = 0,05
Figure 2 The effectiveness of breeding of entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea on selected
medium cultures derived from foodstuffs
208
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Germination [%]
a
a*
100,0
a
ab
80,0
ab
b
60,0
40,0
20,0
0,0
Sabouard
Dextrose
Agar
Drink milk
36% cream
Btorh broth
Coffee
creamer
Decoction
rice
Type of medium culture
*The values appointed the same letters, do not differ betw een them on level of significance p indeed = 0,05
LT50 [number of days]
Figure 3 Germination of spores Isaria fumosorosea breeding on a medium cultures from foodstuffs
8
7
6
5
4
3
2
1
0
b
a
a*
a
Sabouard
Dextrose Agar
Drink milk
a
36% cream
Btorh broth
a
Coffee
creamer
Decoction rice
Type of medium culture
*The values appointed the same letters, do not differ betw een them on level of significance p indeed = 0,05
Figure 4 Comparison of pathogenicity of spores Isaria fumosorosea breeding on a medium cultures
from foodstuffs to the test insect T. molitor L
Discussion
The results obtained in this experiment indicate that there is possibility to use of selected
foodstuffs to the breeding of entomopathogenic fungus and obtain their spores which have a high
potential in the fight against harmful insects. Research reports indicate that the entomopathogenic
fungus may be grown on different medium cultures of natural origin. Babu et al. (2008), PosadaFlórez (2008), Wyss et al. (2001) indicated the possibility of the use as breeding medium of cereal‟s
seeds such as rice, corn or wheat. Researchers indicate that the fragmentation of these seeds can give
better results in the production of spores. Derakhshan et al. (2008) proved in their experiments the
possibility of using to the breeding of the entomopathogenic fungi not only solid but also liquid
medium cultures and the possibility of using biphasic liquid and solid medium cultures. Molasses
yeast broth allowed to obtain the 8.33•108 spores of the fungus Verticillium lecani per ml of medium
culture. The solid medium cultures in the form of crop seeds allowed to obtain 1.97•10 9 spores per g
medium culture used for breeding. The liquid and solid medium cultures using at the same time during
the breeding fungus allowed to obtain 2.28•109 spores per g breeding medium culture used. The
capacity of germination of spores obtained here is also very high and fluctuated between 89.5 and
91.5%. In our experiment the most fungus spores Isaria fumosorosea were obtained from breeding on
drinking milk (4.17•109 spores per g of medium culture used for breeding). The ability of spores to
germinate was very high and amounted to 98% of spores. Dalla Santa et al. (2005) in their
experiments to the breeding of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana applied residues
agricultural-industrial. This allowed to obtain up to 1.07 x 1010 spores per g medium culture used for
breeding.
For the breeding of the entomopathogenic fungus many different medium cultures of different
origins may be applied. Medium cultures used in this experiment showed the usefulness of selfpropagation of the species of entomopathogenic fungus Isaria fumosorosea. Spores obtained during
experiments showed a high capacity for germination, and high pathogenicity against insects.
209
X. Risk Factors of Food Chain
13-th – 14 -th September 2010
References
BABU, J.C.S. - VENKATACHALAPATHY, M.C. - ANITHA, C.N. 2008. Evaluation of locally
available substrates for mass multiplicationof entomopathogenic fungi, Metarhizium anisopliae
(Metch.) Soroki. In Journal of Biopesticides, vol. 2008, no. 2, p. 146 – 147.
DALLA SANTA, H.S. - DALLA SANTA, O.R. - BRAND, D. - VANDENBERGHE, L. - SOCCOL,
C.R. 2005. Spore production of Beauveria bassiana from agro-industrial residues. In Brazilian
Archives of Biology and Technology, 2005, vol.48, 2005, p. 51-60.
DERAKHSHAN, A. - RABINDRA, R.J. - RAMANUJAM, B. - RAHIMI, M. 2008. Evaluation of
different media and methots of cultivation on the production and viability of entomopathogenic fungi,
Verticillium lecani (Zimm.) Viegas. In Pakistan Journal of Biological Sciences, vol. 11, 2008, no. 11,
p. 1506-1509.
GORYZYCA, A. 2007. Wpływ środków biosept 33 SL i Bioczos BRna wybrane grzyby owadobójcze
in vitro. In Progress in Plant Protection / Postępy w Ochronie Roślin, vol. 47, 2007, no. 4, p. 142-144.
JENKINS, N.E. - HEVIEFO, G. - LANGERALD, J. - CHERRY, A.J. - LOMER, C.J. 1998.
Development of mass production technologyfor aerial conidia for use as mycopesticides. In Biocontrol
News and Information, vol. 19, 1998, no 1., p. 21-31.
KARTHIKEYAN, A. - SHANTHI, V. - NAGASATHYA, A. 2008. Effect of Different Media and pH
on the Growth of Beauveria bassiana and Its Parasitism on Leaf eating Caterpillars. In Research
Journal of Agriculture and Biological Sciences, vol. 4, 2008, no. 2, p. 117-119.
KANZOK, S.M. - JACOBS-LORENA, M. 2006. Entomopathogenic fungi as biological insecticides to
control malaria. In Trends in Parasitology, vol.22, 2006, no.2., p.49-51.
MALINOWSKI, H. 2009. Entomopatogeniczne grzybyjako insektycydy w ochronie lasu. In Progress
in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin, vol. 49, 2009, no. 2, p. 865-873.
POSADA-FLÓREZ, P.J. 2008. Production of Beauveria bassiana fungal spores on rice to control the
coffee berry borer, Hypothenemus hampei, in Colombia. In Journal of Insect Science, vol. 8, 2008, no.
41, p. 1-13.
SAHAYARAJ, K. - NAMASIVAYAM, S.K.R. 2008. Mass production of entomopathogenic fungi
using agricultural products and by products. In African Journal of Biotechnology, vol. 7, 2008, no. 12,
p. 1907-1910.
WYSS, G.S. - CHARUDATTAN, R. - DeVALERIO, J.T. 2001. Evaluation of Agar and Grain Media
for Mass Production of Conidia of Dactylaria higginsii. In Plant Disease, vol. 85, 2001, no. 11, p.
1165-1170.
210
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
VPLYV DLHODOBEJ EXPOZÍCIE KADMIOM NA FYZIOLOGICKÉ,
REPRODUKČNÉ A ANTIOXIDAČNÉ PARAMETRE U POTKANOV
THE EFFECT OF LONG-LASTING CADMIUM EXPOSURE ON
PHYSIOLOGICAL, REPRODUCTIVE AND ANTIOXIDANT PARAMETERS IN
RATS
LOVÁSOVÁ E., CIMBOLÁKOVÁ I., NOVÁKOVÁ J.
Ústav patologickej fyziológie LF UPJŠ, 040 66 Košice, Slovenská republika
Abstract
The selected physiological, reproductive and antioxidant parameters after chronic (whole life)
cadmium exposure were investigated in rats. Forty adult Wistar albino rats (20 females and 20
males, at the age 4 weeks at the beginning of study) and their offsprings (up to the age of 28 days)
were used in experiment. Group Cd (10 pairs and their offsprings) received water with cadmium
chloride dihydrate (CdCl2.2H2O) in concentration 20 µmol/l. Group C (control - 10 pairs and their
offsprings) received clear drinking water. In the both groups selected physiological parameters: the
percentage of survived rats, the average lifespan, reproductive parameters: number of litters, total
number of newborns (assigned in the birth day), number of newborns per litter and number of
weanlings (raised youngs that reached the 28th day of life) and antioxidant parameters: superoxide
dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPX), catalase (CAT), total antioxidant status (TAS)
were examined. After 156 weeks we found out decreased lifespan in Cd-treated group and
decreased percentage of survived rats. From reproductive parameters, there was decreased number
of litters, number of newborns, number of weanlings and percentage of weanlings from all
newborns in the Cd group. The most surprising finding was increased number of newborns per litter
in the Cd group compared to the control group. The antioxidant enzymes (SOD, GPX, CAT)
activities were significantly decreased in the Cd group. On the other hand TAS was significantly
increased in the Cd group. The results showed some differences among Cd group and control group
in selected physiological, reproductive and antioxidant parameters. These changes may be a part of
an adaptive process of organism to changed environmental conditions. Supported by grant
1/0387/10 of the Ministry of Education of the Slovak Republic and the Slovak Academy of
Sciences.
Key words: cadmium, rat, reproduction, antioxidant enzymes
Úvod
Otázky vplyvu ņivotného prostredia na ĉloveka sú ĉoraz viac v popredí záujmu
biomedicínskeho výskumu. Populaĉná explózia, urbanizácia, rýchly rozmach priemyslu a techniky,
intenzifikácia poľnohospodárstva a pod., vyvolávajú celý rad neņiadúcich úĉinkov.
Ťaņké kovy tvoria jednu z najnebezpeĉnejńích skupín biologicky významných ńkodlivín.
Neschopnosť degradovať sa prírodnými procesmi pôsobením minerálnych a biologických pochodov
spôsobuje, ņe sa tieto kovy hromadia (geo-, bio-, ekokumulácia). Priamo alebo cez potravinové
reťazce potom môņu spôsobovať akútne alebo chronické intoxikácie (Massányi et al., 1995;
Dianovský a Ńiviková, 1998, Cigánková et al., 2010). Öĉinok ťaņkých kovov sa prejaví obyĉajne po
dlhodobej expozícii, vyvolávajúc chronické intoxikácie (Massányi et al., 2004; Nać et al., 2005),
vrátane porúch reprodukcie a postihnutia reprodukĉných funkcií (Paksy et al., 1996; Lukáĉ et al.,
2007; Nać et al., 2007). Vplyv ťaņkých kovov na rôzne fyziologické a biochemické parametre bol
v odbornej literatúre v celku podrobne analyzovaný pre akútne intoxikácie. Pomerne málo údajov je
211
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
k dispozícii pre chronické, najmä celoņivotné podmienky (Sutou et al., 1980; Paksy et al., 1996). Ĉo
sa týka chronickej expozície veľmi nízkymi dávkami ťaņkých kovov a multigeneraĉných ńtúdií
intoxikácie rôznymi kovmi, takmer nie sú v literatúre zmienky (Lukaĉínová et al., 2009).
Hlavným cieľom ńtúdia bolo sledovanie vybraných fyziologických, reprodukĉných
a antioxidaĉných parametrov vo vzťahu ku chronickej (celoņivotnej) expozícii potkanov kmeņa
Wistar veľmi nízkymi dávkami kadmia.
Materiál a metodika
Do pokusu bolo zaradených 40 potkanov kmeņa Wistar (20 samcov, 20 samiĉiek) vo veku 4
týņdne, priemernej hmotnosti 120 ± 19 g a ich narodené mláćatá do veku 28 dní (po 28. dni boli
preradené do iného pokusu). Potkany boli drņané v klietkach po pároch (1samec a 1 samiĉka)
s voľným prístupom k vode a potrave a v svetelnom reņime 12 h svetlo – 12 h tma. Zvieratá boli
náhodne rozdelené do 2 skupín (po 10 samíc a 10 samcov, 1 párik v kaņdej klietke). Prvá skupina
(C, n = 20) prijímala ĉistú vodu – kontrolná skupina. Druhá skupina (Cd, n = 20) dostávala vodu
s obsahom CdCl2.2H2O
v koncentrácii 20 µmol/l (t.j. 2,0 mg kadmia/l pitnej vody,
zodpovedajúcemu 200 násobku MPK vo vode). U oboch skupín sme sledovali nasledujúce
fyziologické parametre: percento preņívajúcich jedincov, priemernú dĺņku ņivota, reprodukĉné
parametre: poĉet vrhov, poĉet narodených mláćat, poĉet narodených mláćat na jeden vrh, poĉet
odstavĉiat a percento odstavĉiat z celkového poĉtu mláćat. Z biochemických ukazovateľov sme
sledovali zmeny aktivít antioxidaĉných enzýmov ĉervených krviniek superoxiddismutáza - SOD
(Suttle, 1986; Duzguner a Kaya, 2007), glutatiónperoxidáza - GPX (Paglia a Valentine, 1967),
kataláza – KAT (Aebi, 1984) a celkovej antioxidaĉnej kapacity plazmy – TAS (Miller et al., 1993).
Na stanovenie SOD, GPX a TAS sme pouņili komerĉné kity firmy RANDOX (RANDOX
laboratories, Veľká Británia). Pokus bol ukonĉený na 156 týņdeņ.
Výsledky sú udávané ako priemerná hodnota a smerodajná odchýlka (xSD). Pre stanovenie
významnosti rozdielov biochemických ukazovateľov bol pouņitý nepárový t-test. Za ńtatisticky
významnú sa povaņuje hladina významnosti 5% (P0,05).
Experimenty boli vykonané na pracovisku Centrálny zvieratník LF UPJŃ, ktoré má
akreditáciu na chov laboratórnych zvierat a na vykonávanie pokusov na zvieratách v súlade
s prísluńnými legislatívnymi ustanoveniami. Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŃ ako
aj ŃVPS SR Ĉ.k. Ro-7879/04-220/3. Práca je súĉasťou projektu VEGA 1/0387/10.
Výsledky a diskusia
Výsledky sú zhrnuté v tabuľkách 1 a 2 a na obrázku 1.
Tabuľka 1 Fyziologické a reprodukĉné ukazovatele po 156 týņdņoch pokusu
skupina
C
Cd
% preņívajúcich jedincov
90
75
priemerná dĺņka ņivota [d]
1119 ± 93
1073 ± 143
poĉet vrhov
98
90
narodené mláćatá
754
706, P<0,05
narodené mláćatá na 1vrh
7,69
7,84
poĉet odstavĉiat
686
606, P<0,05
% odstavĉiat
90,3
82,3, P<0,05
Na základe chronického pokusu expozície potkanov kmeņa Wistar subtoxickými dávkami
kadmia v pitnej vode sa nám podarilo získať zaujímavé poznatky a v nie poslednom rade aj
212
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
ucelenejńí pohľad na budúce smerovanie experimentálnych snáh v tejto oblasti pre ćalńie ńtúdium
problému.
V skupine suplementovanej kadmiom sme zistili trend zníņenej doby ņivota. Poĉet vrhov bol
aņ do 52. týņdņa pokusu vyrovnaný a aņ potom zaĉal v skupine Cd klesať. V skupine Cd bol niņńí
aj poĉet narodených mláćat (P<0,05), poĉet odstavĉiat, aj percento odstavĉiat z celkového poĉtu
mláćat (P<0,05). Prekvapujúci bol zvýńený poĉet mláćat na jeden vrh v skupine potkanov
prijímajúcich kadmium.
Tabuľka 2 Antioxidaĉné parametre po 156 týņdņoch pokusu
skup.
SOD
GPX
KAT
[U.mg-1 proteínu]
[nmol.mg-1 proteínu]
[mmol.mg-1 proteínu]
15,7 ± 0,6
4,3 ±0,05
C
Cd
24,1 ±1,9
14,8 ± 1,0
1,61 ± 0,6
1,22 ±0,5
1,22 ± 0,14
1,48 ±0,405
30
GPX [nmol/mg proteínu]
SOD [U/mg proteínu]
18
15
12
9
p < 0,001
6
25
20
p < 0,05
15
10
3
5
0
0
C
Cd
C
2,1
2,4
Cd
p < 0,05
1,8
2
p < 0,05
1,5
TAS [mmol/l]
KAT [mmol/mg proteínu]
TAS
[mmol.l-1]
1,6
1,2
0,8
1,2
0,9
0,6
0,4
0,3
0
0
C
Cd
C
Obrázok 1 Zmeny antioxidaĉných parametrov po expozícii kadmiom
213
Cd
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Z antioxidaĉných parametrov sme v skupine Cd sledovali signifikantné zníņenie aktivity
intracelulárnych antioxidaĉných enzýmov (SOD, GPX, KAT). Naopak TAS, ako súhrnný
ukazovateľ aktivity extracelulárnych antioxidantov, sa v Cd skupine ńtatisticky významne zvýńila.
Na základe získaných výsledkov môņeme konńtatovať, ņe oxidaĉný stres pravdepodobne
zohráva významnú úlohu v patogenéze pońkodenia kadmiom. Ńtúdium zmien týchto parametrov
preto poskytuje dobré východisko pre posúdeniu závaņnosti expozície zvierat týmto ťaņkým kovom
v dlhodobej perspektíve. Bude vńak nutné rozńíriť vyńetrovanie parametrov antioxidaĉnej ochrany
na vńetky ĉasové etapy (zistiť dynamiku vývoja) nielen na zaĉiatok a koniec experimentu
Predloņený model sa ukazuje byť vhodným pre ńtúdium chronickej, resp. multigeneraĉnej
toxicity ťaņkých kovov. Imituje prirodzený spôsob moņnej populaĉnej expozície.
Vzhľadom ku skvalitneniu a zvýńeniu interpretaĉnej hodnoty výsledkov bude potrebné do
súboru vyńetrovaných parametrov zaradiť stanovenie ťaņkých kovov v tkanivách. Aby sme mohli
nami získané výsledky interpretovať s náleņitou zodpovednosťou, bude potrebné v ćalńom ńtúdiu
pokraĉovať a doplniť sortiment sledovaných parametrov o nové biochemické, imunologické
a genetické ukazovatele, najmä na potvrdenie presného mechanizmu a úlohy reaktívnych foriem
kyslíka pri chronickej intoxikácii ťaņkými kovmi (Sato a Kondoh, 2002).
Poďakovanie
Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŃ ako aj ŃVPS SR Ĉ.k. Ro-7879/04-220/3. Práca
je súĉasťou projektu VEGA 1/0387/10.
Literatúra
AEBI H. 1984. Catalase. In L Packer (Ed) Methods in Enzymology, Academic Press, Orlando, vol.
105, 1984, pp. 121-126.
CIGÁNKOVÁ, V. – ALMÁŃIOVÁ, V. –HOLOVSKÁ, K. 2010. Morphological changes in
Japanese quail duodenal epithelium after chronic cadmium exposure. In Polish J. Environ .Stud.,
vol. 19, 2010, no. 10, pp. 275-282.
DIANOVSKÝ, J. – ŃIVIKOVÁ, K. 1998. Sister chromatid exchanges in sheep peripheral
lymphocytes after in vitro exposure to metal-containing emission. In Acta Vet Brno, vol. 67, 1998,
pp. 183-188.
DUZGUNER, V. – KAYA, S. 2007. Effect of zinc on the lipid peroxidation and the antioxidant
defense systems of the alloxan-induced-diabetic rabbits. In Free Radic Biol Med, vol. 42, 2007, pp.
1481-1486.
LUKÁĈ, N. – MASSÁNYI, P. – ZAKRZEWSKI, M. – TOMAN, R. – CIGÁNKOVÁ, V. –
STAWARZ, R. 2007. Cobalt induced alterations in hamster testes in vivo. In J. Environ. Sci.
Health A, vol. 42, 2007, pp. 389-392.
LUKAĈÍNOVÁ, A. - RÁCZ , O. – NIŃTIAR, F. 2009. Effect of lifetime low-dose exposure with
heavy metals on selected physiological and biochemical parameters. In Potravinárstvo, vol. 3,
2009, no. 3, pp. 43-48.
MASSÁNYI, P. – TOMAN, R. – VALENT, M. – ĈUPKA, P. 1995. Evaluation of selected
parameters of a metabolic profile and levels of cadmium in reproductive organs of rabbits after an
experimental administration. In Acta Physiol.Hung., vol. 83, 1995, pp. 267-273.
MASSÁNYI, P. – TOMAN, R. – UHRÍN, V. – RENON, P. Distribution of cadmium in selected
organs of rabbits after an acute and chronic administration. In Ital J. Food Sci., vol. 3, 2004, pp.
311-316.
MILLER, N.J. - RICE-EVANS, C. – DAVIES, M.J. – GOPINATHAN, V. – MILNER, A. 1993. A
novel method for measuring capacity and its application to monitoring the antioxidant status in
premature neonates. In Clin. Sci., vol. 84, 1993, pp. 07-412.
214
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
NAĆ, P. – SKALICKÁ, M. – KORÉNEKOVÁ, B. – PISTL, J. – CIGÁNKOVÁ, V. 2005. Vplyv
expozície vyńńích dávok kadmia v interakci so zinkom na zdravie moriek a zdravotnú nezádnosť
produktov. In Rizikové faktory potravového reťazca, Nitra, 2005, pp.248-251.
NAĆ, P. – MASSÁNYI, P. – SKALICKÁ, M. – KORÉNEKOVÁ, B. – CIGÁNKOVÁ, V. –
ALMÁŃIOVÁ, V. 2007. The effect of kadmium in combination with zinc and selenium on ovaria
structure in Japanese quails. In J. Environ. Sci. Health A, vol. 42, 2007, pp. 2017-2022.
PAGLIA, D.E. - VALENTINE ,W.N. 1967. Studies on quantitative and qualitative characterization
of erythrocyte glutathione peroxidase. In Journal Lab. Clin. Med., vol. 70, 1967, pp. 158-169.
PAKSY, K. – VARGA, B. – LAZAR, P. 1996. Effect of cadmium on female fertility, pregnancy
and postnatal development in the rat. In Acta Physiol. Hung., vol. 84, 1996, pp. 119-130.
SATO, M. – KONDOH, M. 2002. Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of
heavy metals and oxygen free radicals. In J. Exp. Med., Tohoku, vol. 196, 2002, pp. 9-22.
SOTOU, S. – YAMAMOTO, K. – SENDOTA, H. – SUGIYAMA, M. 1980. Toxicity, fertility,
teratogenicity, and dominant lethal tests in rats administered cadmium subchronically. II. Fertility,
teratogenicity, and dominant lethal tests. In Ecotoxicol Environ. Saf., vol. 4, 1980, pp. 51-56.
SUTTLE, N.F. 1986. Copper deficiency in ruminants: recent developments. In Vet. Res., vol. 119,
1986, pp. 519-522.
Kontaktná adresa
MVDr. Eva Lovásová, PhD.,
Östav patologickej fyziológie LF UPJŃ, Tr. SNP 1 , 040 66 Końice, Slovenská republika
 [email protected]
215
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
IN VITRO ÚČINOK OLOVA NA POHYBLIVOSŤ SPERMIÍ KRÁLIKA
IN VITRO EFFECT OF LEAD ON RABBIT SPERMATOZOA MOTILITY
MARETTA Mário, KROČKOVÁ Jiřina, MASSÁNYI Peter, SLIVKOVÁ Jana
Katedra fyziológie ţivoĉíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Tr. A. Hlinku, 949 76 Nitra,
Slovenská republika
Abstact
Lead is an environmental risk factor having various toxic effects both in animals and in human.
Target of this study was to determine concentrations of lead effecting spermatozoa motility in vitro.
The experiment data suggest dose– and time–dependent decrease of spermatozoa motility,
progressive motility as well as beat cross frequency. Results of this study clearly confirm negative
effect of lead on spermatozoa motility parameters and subsequently possible negative reproductive
alterations in environmentally polluted ares.
Key words: lead, toxicity, spermatozoa, motility, CASA
Úvod
Jedným z ekologických fenoménov dneńnej doby je skutoĉnosť, ņe ĉlovek musí koexistovať s
nadmerným mnoņstvom chemických látok poĉas celého ņivota. Priemyselná ĉinnosť, energetika,
doprava ale aj poľnohospodárska produkcia sú trvalým zdrojom cudzorodých látok, ako sú ťaņké
kovy, ktoré sa dostávajú do ņivotného prostredia a do potravového reťazca. Olovo je jeden z
najznámejńích a najrozńírenejńích toxických kovov, ktorý uņ pri relatívne nízkych koncentráciách
nepriaznivo ovplyvņuje ĉinnosť buniek, orgánov a tým aj celého organizmu. Beņne sa vyskytuje v
ņivotnom prostredí – vo vode, v pôde, v prachu a v dovezených produktoch vyrobených z olova
(Papanikolaou et al., 2005). Predpokladá sa, ņe v oblastiach doteraz nekontaminovaných ľudskou
ĉinnosťou by nemala koncentrácia olova v ovzduńí presiahnuť 1 ng.m-3 (Toman a Massányi, 2004).
Do organizmu sa olovo môņe dostať cez gastrointestinálny trakt a respiraĉný aparát. Vstup cez koņu
je nepatrný. Absorbcia anorganického olova cez ĉrevo predstavuje asi 1-2 %. Organické zlúĉeniny
olova (tetrametylolovo, tetraetylolovo) sa pre svoju rozpustnosť v lipidických látkach resorbujú
takmer stopercentne (Kováĉik et al., 2000). Ńtúdie zvierat konńtatujú, ņe olovo a ćalńie ťaņké kovy
postihujú reprodukĉné funkcie zvierat a ľudí. Za posledných 50 rokov sa sleduje pokles hustoty
spermií v populácii po celom svete, hlave v USA a v Európe. Fakty uvádzajúce koncentrácie kovov
sa prevaņne týkajú ejakulátu ľudí (Sorensen et al., 1999). Spermie – samĉie pohlavné bunky,
vznikajú v semenotvornom kanáliku semenníka, procesom ktorý nazývame spermatogenéza (Lukáĉ
et al., 2007). Základné úlohy spermie pri oplodnení sú: aktívne vyhľadať vajíĉko, preniknúť do
neho a priniesť genetický materiál od otca. Splniť tieto úlohy umoņņuje morfologické zloņenie
spermie – aktívny pohyb zabezpeĉuje biĉík, na penetrácii sa zúĉastņuje akrozóm, genetické
informácie sú uloņené v jadrovej hmote – kondenzovanej nukleoplazme. Ak sa poruńí jedna z
týchto funkcií, k oplodneniu nedôjde (Massányi, 1991). Aktivita spermií sa vyjadruje ich pohybom.
Za normálny fyziologický pohyb sa povaņuje postupný pohyb sepermií dopredu za hlaviĉkou. Za
nefyziologické formy pohybu povaņujeme: nepohyblivosť, pohyb okolo hlaviĉky, pohyb do kruhu,
retrográdny pohyb, trhavý pohyb, kolísavý a oscilaĉný pohyb (kmitanie biĉíka na mieste, obĉasné
kolísanie celej spermie) (Věņník, 2004). Cieľom nańej ńtúdie bolo sledovať vplyv rôznych
koncentrácií olova (PbNO3 a PbCl2) na vybrané CASA parametre spermií králika v rôznych
ĉasových intervaloch.
216
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Materiál a metodika
Odber ejakulátu sa realizoval od samcov králika domáceho (n=20) z chovu CVŅV v Nitre.
Zmieńaním ejakulátov od jednotlivých samcov sa zhotovila heterospermická dávka. Pre udrņiavanie
teploty, ktorú mal ejkaulát bezprostredne po ejakulácii, sa dávka udrņiavala v termoske
z polystyrénu vystlanej vatovými tampónmi. Po spracovaní boli vzorky udrņiavané v laboratóriu pri
teplote 20OC.
Olovo (PbCl2, Sigma Chemicals, USA) bolo následne riedené fyziologickým roztokom z pôvodnej
koncentrácie 1,5 mg.100 ml-1 (Tabuľka 1). Vzorky sme udrņiavali v skúmavkách a kultivovali in
vitro 240 minút (ĉas 0, 30, 60, 120, 180 a 240).
Tabuľka 1 Schéma experimentu
Skupina
KF
5F
4F
3F
2F
1F
Ejakulát (μl)
60
60
60
60
60
60
PbCl2 (μl)
0
100
200
300
400
500
Fyziologický roztok (μl)
500
400
300
200
100
0
Na hodnotenie pohyblivosti spermií sme pouņili CASA (Computer – Assisted Sperm Analysis –
analýza pohyblivosti spermií poĉítaĉovou technikou) systém SpermVision (Minitüb, Tiefenbach,
SRN) s mikroskopom Olympus BX 51 (Olympus, Japonsko).
Kaņdú vzorku sme umiestnili do poĉítacej komôrky Makler Counting Chamber s hĺbkou 10 µm
(Sefi–Medical Instruments, SRN) a následne umiestnili do zorného poľa. V kaņdej vzorke sme
sledovali nasledovné parametre – percento pohyblivých spermií (%), percento progresívne
pohyblivých spermií (%) a BCF (beat cross frequency) – frekvencia kríņových úderov (Hz)
[frekvencia pri ktorej VCL kriņuje VAP]. V rámci kaņdého merania systém CASA vyhodnotil
parametre pohyblivosti z minimálne 8 polí komôrky Makler Counting Chamber (Massányi et al.,
2009).
Ńtatisticky bol výstup z CASA systému vo forme tabuľky Microsoft Excel spracovaný programom
SAS System, priĉom v rámci analýzy rozptylu sme pouņili F–test a Scheffeho test.
Výsledky
Pohyblivosť spermií kultivovaných v experimente sa pohybovala od 86,22 do 80,66%
a najniņńia hodnota bola zistená v pokusnej skupine s najvyńńou koncentráciou olova. Uņ po 30
minútach kultivácie sa prejavil negatívny úĉinok olova a pohyblivosť spermií preukazne poklesla
v skupinách s najvyńńou koncentráciou olova (2F a 1F). Podobná tendencia bola zistená aj po 60
minútach, avńak s dĺņkou kultivácie sa preukazný inhibiĉný úĉinok olova na pohyblivosť spermií
dostavil aj v skupine 3F.
Progresívna pohyblivosť spermií prejavila dávkovo závislý pokles a na konci pokusu bola
progresívna pohyblivosť spermií v skupine 1F len 23,99±19,04%, zatiaľ ĉo v kontrolnej skupine
71,92±12,43% (p<0,001).
Frekvencia kríņových úderov spermií sa na zaĉiatku pokusu pohybovala v rozpätí 25,75 (3F)
– 30,82 (KF) Hz s preukazne niņńími hodnotami v pokusných skupinách. Po 30 a 60 minútach
kultivácie sme preukazné rozdiely nezistili, ale s postupnou kultiváciou sme zistili preukazný
pokles tohto parametru po 120 minútach (skupina 1F, p<0,01), 180 minútach (skupina 1F, p<0,001;
skupina 2F, p<0,01) a aj po 240 minútach kultivácie (skupina 1F a 2F, p<0,001; skupina 3F,
217
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
p<0,01). Dosiahnuté výsledky jasne dokazujú dávkovo závislú inhibíciu pohyblivosti spermií
spôsobenú olovom.
100
80
60
40
20
0
0
30
KF
60
5F
4F
120
3F
2F
180
240
1F
Graf 1 Pohyblivosť spermií (%) v jednotlivých skupinách a ĉasových obdobiach
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
30
60
KF
5F
120
4F
3F
2F
180
240
1F
Graf 2 Progresívna pohyblivosť spermií (%) v jednotlivých skupinách a ĉasových obdobiach
218
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
35
30
25
20
15
10
5
0
0
30
60
KF
5F
120
4F
3F
2F
180
240
1F
Graf 3 Frekvencia kríņových úderov spermií (Hz) v jednotlivých skupinách a ĉasových obdobiach
Diskusia
Pohyblivosť spermií na zaĉiatku náńho experimentu bola v kontrolnej skupine znaĉne vysoká
a najniņńia bola po prídavku najvyńńej koncetrácie olova. Uņ po 30 minútach pohyblivosť spermií
preukazne poklesla v skupinách s najvyńńou koncentráciou olova. Podobná tendencia bola zistená aj
po dlhńej inkubácii s olovom. Moorman et al. (1998) pozorovali úĉinok rôznych hladín olova v krvi
na reprodukciu králikov. Zistili, ņe so zvyńujúcou sa hladinou olova v krvi sa zniņuje koncentrácia
spermií v ejakuláte, objem ejakulátu, percento pohyblivých spermií, rýchlosť pohybu spermií a tieņ
sa mení morfológia spermií.
Z výsledkov merania vyplýva, ņe prítomnosť olova zniņuje progresívnu pohyblivosť spermií
priamoúmerne so zvyńovaním jeho koncentrácie a dĺņky inkubácie v porovnaní s kontrolnou
skupinou, kde sme zaznamenali len mierny pokles. Meraním frekvencie kríņových úderov spermií
sme pozorovali preukazný pokles po pridaní olova uņ na zaĉiatku experimentu. K výraznejńiemu
poklesu v porovnaní s kontrolnou skupinou dońlo aņ po dlhńej inkubácii s najvyńńími
koncentráciami olova. Podobne Foote (1999) uvádza, ņe Cd2+ a Pb2+ inhibujú progresívnu
pohyblivosť a kapacitáciu spermií. Young et al. (2005) uvádzajú, ņe tieto dva kovy pri nízkych
koncentráciách zabraņujú vývoju progresívnej pohyblivosti spermií. Inhibícia progresívnej
pohyblivosti ovplyvnená olovom je závislá od ĉasu a koncentrácie olova. Autori uvádzajú pokles
progresívnej pohyblivosti z 30 % na 5 % za 60 min pri koncentrácii olova 25 μmol.dm-3.
Konńtatujú, ņe olovo svojou schopnosťou zabrániť ńirokému zakriveniu kmitajúceho biĉíka
charakteristického pre hyperaktiváciu, môņe ovplyvniť fertilizáciu. Khan et al. (2009) sledovali
zvýńené hladiny olova v ejakuláte a v krvi 53 muņov pracujúcich denne s olovom v Indii. U muņov
pozorovali zníņenie hustoty ejakulátu, mnoņstva pohyblivých a ņivých spermií, zníņenie percenta a
poĉtu progresívne pohyblivých spermií a redukciu celkovej antioxidaĉnej kapacity semennej
plazmy. Tieņ pozorovali signifikantné zvýńenie výskytu malformácií hlaviĉiek a biĉíkov spermií.
Autori konńtatujú, ņe vystavenie olovu môņe signifikantne zníņiť kvalitu ejakulátu a teda plodnosť
muņov. Taktieņ Telisman et al. (2000) pozorovali vplyv olova na ukazovatele fertility muņov
pracujúcich s olovom v Chorvátsku. U 149 muņov zistili zníņenie hustoty spermií v ejakuláte,
pokles poĉtu celkových, pohyblivých a ņivých spermií tieņ zníņenie percenta a mnoņstva
progresívne pohyblivých spermií a inhibíciu sekreĉnej ĉinnosti prostaty. V ejakulátoch bol tieņ
zvýńený výskyt patologických spermií. Podobne v Taiwane Kuo et al. (1997) porovnávali kvalitu
219
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
ejakulátu piatich muņov pracujúcich v továrni na výrobu olovnatých batérií s kvalitou ejakulátu
ôsmych muņov nevystavených olovu na pracovisku. Aurori pozorovali vyńńie koncentrácie olova v
krvi a v ejakuláte pracovníkov vystavených olovu v porovnaní s kontrolnou skupinou. Akokoľvek,
rozdiely v mnoņstve a v pohyblivosti spermií neboli signifikantné. Autori na záver konńtatujú, ņe
dlhodobé vystavenie olovu môņe mať nepriaznivé úĉinky na reprodukciu.
V nańich predońlých ńtúdiách sme zisťovali obsah olova v ejakuláte viacerých druhov zvierat
a muņov. V ejakuláte býkov, bola priemerná hodnota 0,32 mg.kg-1 (Massányi et al., 2000), ņrebcov
0,05 mg.kg-1 (Massányi et al., 2004), lińiakov 0,08 mg.kg-1 (Massányi et al., 2005), baranov 0,35
mg.kg-1, kancov 0,02 mg.kg-1 (Massányi et al., 2003), králikov 0,09 mg.kg-1 (Lukáĉ et al., 2009) a
muņov 1,49 mg.kg-1 (Massányi et al., 2009). Najvyńńia koncentrácia olova bola nameraná
v ejakuláte muņov. Bonde et al. (2002) uvádzajú, ņe toxicita anorganických zlúĉenín olova pri jeho
súĉasných hladinách v prostredí Európy nepriaznivo ovplyvņuje koncentráciu spermií v ejakuláte.
Xu et al. (2003) zistili, ņe u muņov olovo nespôsobuje zmeny kvality spermií ak jeho koncentrácia v
semennej plazme je pod 10 μg.l-1. Vo Fínsku Saaranen et al. (1987) merali koncentrácie olova v
ejakuláte muņov s rôznou fertilitou. Autori pozorovali veľmi nízke hladiny olova. Avńak zistili
signifikantne vyńńie koncentrácie olova neplodných muņov (3,6 μg.l-1) v porovnaní s plodnými
muņmi (1,7 μg.l-1).
Nańe výsledky jasne poukazujú na toxické úĉiny olova súvisiace so zniņovaním plodnosti
samcov najmä pri jeho vysokých koncentráciách spojených s dlhodobým vystavením tomuto kovu.
Literatúra
BONDE, J.P. – JOFFE, M. – APOSTOLI, P. et al. 2002. Sperm count and chromatin structure in
men exposed to inorganic lead: lowest adverse effect levels. In J Occup Environ Med, roĉ. 59,
2002, s. 234-242.
FOOTE, R.H. 1999. Fertility of rabbit sperm exposed in vitro to cadmium and lead. In Reprod
Toxicol, roĉ. 13, 1999, no. 6, pp. 443-449.
KHAN, I.M. – MAHDI, A.A. – AHMAD, I. et al. 2009. Increased seminal plasma lead levels
adversely affect semen function in painters exposed to lead containing paint. In Biol Reprod, vol.
81, 2009, pp. 642.
KUO, H.W. – WANG, C.S. – LAI, J.S. 1997. Semen quality in workers with long-term lead
exposure: a preliminary study in Taiwan. In Sci Total Environ, vol. 204, 1997, no. 3, pp. 289-329.
LUKÁĈ, N. – BULLA, J. – CIGÁNKOVÁ, V. et al. 2007. Stopové prvky a kvalita spermií. 1. vyd.
Nitra: SPU, 2007, s. 118. ISBN 978-80-8069-904-8.
LUKÁĈ, N. – MASSÁNYI, P. – KROĈKOVÁ, J. et al. 2009. Relationship between trace element
concentrations and spermatozoa quality in rabbit semen. In Slovak J Anim Sci, vol. 42, 2009, no. 1,
pp. 46-50.
MASSÁNYI, L. 1991. Funkĉná morfológia spermie. Bratislava: Veda, 1991, s. 188. ISBN 80-2240149-8.
MASSÁNYI, P. - LUKÁĈ, N. - STAWARZ, R. et al. 2009. Environmental concentration of
cadmium in rabbit semen and detection of the effect on spermatozoa motility in vitro. In World
Appl Sci J, vol.5, 2009, pp. 21-31.
MASSÁNYI, P. – SLIVKOVÁ, J. – KROĈKOVÁ, J. et al. 2009. In International Conference on
Emerging Technologies in Environmental Science and Engineering, October 26-28, 2009, Aligarh
Muslim University, Aligarh, India.
MASSÁNYI, P. – TRANDŅÍK, J. – LUKÁĈ, N. et al. 2000. The contamination of bovine semen
with cadmium, copper, lead and zinc and its relation to the quality of spermatozoa used for
insemination. In Folia Veterinaria, vol. 44, 2000, no. 3, pp. 150-153.
MASSÁNYI, P. – TRANDŅÍK, J. – NAĆ, P. et al. 2003. Seminal concentrations of trace elements
in various animals and their correlations. In Asian J Androl, 2003, no. 2, pp. 101-104.
220
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
MASSÁNYI, P. – TRANDŅÍK, J. – NAĆ, P. et al. 2004. Semen concentration of trace elements in
stallions and relation to the spermatozoa quality. In Trace Elements and Electrolytes, vol. 21, 2004,
no. 4, pp. 229-231.
MASSÁNYI, P. – TRANDŅÍK, J. – NAĆ, P. 2005. Seminal concentration of trace elements in fox
and relationships to spermatozoa quality. In J Environ Sci Health, 2005, A40, 1097-1105.
MOORMAN, W.J. – SKAGGS, S.R. – CLARK, J.C. et al. 1998. Male reproductive effects of lead,
including species extrapolation for the rabbit model. In Reprod Toxicol, vol. 12, 1998, no. 3, pp.
333-46.
PAPANIKOLAOU, N.C. – HATZIDAKI, E.G. – BELIVANIS, S. 2005. Lead toxicity update. A
brief review. In Med Sci Monit, vol. 10, 2005, no. 11, pp. 329-36.
SAARANEN, M. – SUISTOMAA, U. – KANTOLA, M. et al. 1987. Lead, magnesium, selenium
and zinc in human seminal fluid: comparisson with semen parameters and fertility. In Human
Reprod, vol. 2, 1987, no. 6, pp. 475-479.
SORENSEN, M.B. – BERGDAHL, I.A. – HJOLLUND, N.I. et al. 1999. Zinc, magnesium and
calcium in human seminal fluid: relation to other semen parameters and fertility. In Mol Human
Reprod, vol. 5, 1999, no. 4, pp. 331-7.
TELISMAN, S. – CVITKOVIĈ, P. – JURASOVIĈ, J. et al. 2000. Semen quality and reproductive
endocrine function in relation to biomarkers of lead, cadmium, zinc and copper in men. In Environ
Health Perspect, vol. 108, 2000, no. 1, pp. 45-53.
TOMAN, R. – MASSÁNYI, P. 2004. Vplyv olova, zinku a niklu na reprodukciu samcov. In
Slovenský chov, 2004, no. 2, pp. 38-39.
TOMAN, R. - MASSÁNYI, P. - DUCSAY, L. et al. 2000. Ťaņké kovy v krmivách a potravinách. In
KOVÁĈIK et al.: Rizikové faktory potravového reťazca. Nitra: SPU, 2000, s. 23-36. ISBN 80-7137796-1.
VĚŅNÍK, Z. 2004. Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy. Brno:
VÖVeL, 2004. s. 197 s. ISBN 80-86895-01-7.
XU, D.X. – SHEN, H.M. – ZHU, Q.X et al. 2003. The association among semen quality, oxidative
DNA damage in human spermatozoa and concentration of cadmium, lead and selenium in seminal
plasma. In Mut Res Genet Toxicol Environ Mutagenesis, vol. 534, 2003, pp. 155-163.
YOUNG, R.J. – BODT, B.A. – HEITKAMP, D.H. 2005. Action of metallic ions on the precocious
development by rabbit sperm of motion patterns that are characteristic of hyperactivated motility. In
Mol. Reprod Devel, vol. 41, 2005, no. 2, pp. 239-248.
Kontaktná adresa
Ing. Jiřina Kroĉková, PhD.
Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Science, Slovak University
of Agriculture in Nitra, Tr. A. Hlinku 2, SK 949 76 Nitra, Slovak Republic
[email protected]
221
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
TOPSOIL, SOIL MACROFAUNA AND SCOTS PINE BARK AS INDICATORS OF
ENVIRONMENTAL POLLUTION
MARKO-WORŁOWSkA Maria, WĄTOR Gabriela1, KOZIK Ryszard2, ŁACIAK Tomasz3,
CHRZAN Anna1
Pedagogical University of Cracow, Institute of Biology, ul. Podbrzezie 3, 31-054 Kraków,
Poland
1
Department of Ecology, Wildlife Research and Ecotourism
2
Department of Botany
3
Department of Vertebrate Zoology and Human Biology
1, 2 ,3
Abstract
The impact of the Aluminium-works, Power plant and other emitters on environmental pollution
was evaluated by determining chosen heavy metals and acid reaction (pH) in the pine bark, in
topsoil and in soil macrofauna predators. The pollutants were examined at localities situated around
450-700m (Locality I) and around 1900-2500m (Locality II) away from industrial emitters. It was
detected that at localities analyzed the bark was characterized by considerably higher acidity (pH
3.34 – 3.98 at locality I and pH 3,37 – 4,47 at locality II) than the topsoil of the pines analyzed (pH
4,01 - 5,03 at locality I and 6,86 – 8,76 at locality II). Higher content of Pb and Ni was noted in
topsoil and the highest of Pb, Cd, Ni content in macrofauna predators. The lowest density and
diversity of macrofauna were detected at the locality I, where the concentration of heavy metals was
lower than at locality II, however the topsoil moisture in locality I was very low.
Key words: pollutions, Pb, Cd , Ni, topsoil, soil macrofauna predators, pine bark, pH
Introduction
In evaluation of pollutions of the environment the biological methods with the use of the
organisms reacting to the changes of surroundings chemical content are used more and more
frequently. The numerical feature of the changes discussed can be measured with the use of
accumulative indicators as biomonitors. The results of these researches can provide important
information on condition of the environment as well as of environmental processes (Wolterbeek,
2003; Smodiń et al., 2004; Conti and Cecchetti, 2001). In the presented paper the bark pine,
superficial layer of the soil - topsoil (to 10cm deep) from pine‟s surroundings, and soil macrofauna
living there were used as the accumulative indicators. The pollutions of the surrounding of trees are
partly accumulated in their bark. Because of this fact chemical analysis of necrotic bark not only
enables evaluation of actual layer of the accumulation of the elements and polluting compounds, but
also evaluation of the course of the process in the previous years. It is therefore an example of
retrospective technique (Namiesnik, 2003). Locally, the kind and amount of the pollutions imission
depends on climate conditions, wind force and direction, intensity and kind of rainfall, temperature
and atmospheric pressure (Kłos et al., 2008). Adjacent trees are supposed to demonstrate the similar
degree of the accumulation of pollutions and may be used consequently to determine the extent of
the pollutants. Similarly the results of the bark of model trees analysis taken on surfaces on different
distance from source emission can illustrate the problem of spreading of pollutions (Fabiszewski et
al., 1987; Morselli et al., 2003). In case of the accumulation of dusts that are the carriers of heavy
metals (mainly Pb, Zn, Cd and Ni) in tree barks, the metals remain almost inactive and are
mechanically absorbed. When high concentration of acidifying compounds and rainfall are present
222
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
simultaneously, the growth of bioaccumulation of easier soluble ionic forms of the metals can be
noticed (Morselli et al., 2003; Janĉová et al., 2006).
The soil is fundamental and essential counterpart of all terrestrial ecosystems and as a sink of
natural and anthropogenic pollutants promotes the quality of other environment components.
Quality of soil and soil processes has basic importance for maintenance of terrestrial ecosystems
productivity. Microflora and pedofauna play a fundamental role in functioning of these ecosystems.
Pedofauna, through nutrition, mobility and interactions with the microflora, stimulates its
ontogenesis and is important in the regulation of chemical content, soil structure, and the rate of
organic matter decomposition (Marko-Worłowska et al., 2009a).
The soil because of its filtering and buffering functions protects ecosystems from excessive
transfer of traces elements and facilitates decomposition of toxic elements. However, these qualities
can be disturbed when the emission of toxic pollutions causing the disturbance of balance of
biochemical functioning of soil is too high. Heavy metals and the acidifying compounds are one of
the most durable and toxic contaminations of the soil environment. Most of the metals – for
example lead, cadmium, nickel and mercury are potentially toxic for living organisms. Toxicity of
the heavy metals depends on their concentrations, chemical forms and the species of the particular
organisms. They are accumulated mainly in topsoil, from which via plants they reach subsequent
links of trophic chain causing at the same time mutagenic and carcinogenic changes in living
organisms (Stawarz, 2009; Kolesarova et al., 2008).The predator level in the trophic chain, acting in
a way an integrator of all physical, chemical and biological qualities of habitat and characterizing in
more complete way of condition of soil habitat. The content of the heavy metals in the soil depends
on environmental conditions and anthropogenic pollutions. One of the most developing trends in the
evaluation of the functioning of soil subsystem is the use of pedofauna indicators, especially of
meso and macrofauna (Marko-Worłowska et al., 2009a; Gworek, 2008).
The influence of pollutions on soil acidity, on bark of pine and on accumulation of Pb, Cd
and Ni in topsoil, in pine bark and in soil macrofauna predators at localities situated in different
distance from the emitors was analyzed. The purpose of conducted researches is to determine the
areas of the highest concentration of pollutions in small industrial town Skawina and evaluate the
influence of these pollutions on soil macrofauna, and consequently on functioning of discussed
localities soil subsystem.
Materials and methods
Characteristic of area analyzed
The area examined is situated in Skawina – a city situated around 8 km on the southern west
from the centre of Krakow. The terrain of Skawina is heavily industrialized and densely populated.
The southern and western part of Skawina has clearly industrial character (Aluminium-works,
Power plant and other) [Locality 1 (I) – located close to the industrial works (450m from
Aluminium-works and 700m from Power plant], whereas the south-eastern part strictly service and
residential [Locality 2 (II) – situated farther (1900m from Aluminium-works and 2500m from
Power plant)]. These localities are 2km a way from each other. The localities of taking of the
samples were marked in Figure 1.
Samples collection and analysis
The samples were taken in spring 2010. In the researches the bark of Scot pine (Pinus
sylvestris L.), the most common tree constituting 70% of all trees in Polish forests, was used. The
pine bark is characterized by a high porosity and therefore there an access to its external layer is
facile. For the evaluation of the contamination level the physicochemical features of the topsoil,
such as pH reaction of its water extract and possibility of the heavy metals absorption were used.
223
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
The analyzed material consisted of the specimen of Scots pine growing at the edge of the small
forests, situated near a Aluminium-works, Power plant [Locality I], and near Health Care Provider
[Locality II] in the centre of Skawina. At each locality the bark to 3mm thick from the trunk of four
trees at high of around 1,5m from the soil, four at east side of each tree and four at west side were
taken. The trees analyzed, from 2 m to 4 m distant from each other, have similar breast height
diameter of a tree (35cm to 40 cm) and similar age (around 25 years).
The detection of the bark toxicity was conducted by evaluating its reaction (pH), and marking Pb,
Cd and Ni content. For the purpose of pH detection the bark samples, the mechanical pollutions
were cleaned up with the use of a brush. Afterwards, the samples were dried in the temperature of
65 degrees for 3 hours, grinded down in a mortar and milled to the powder in a percussion grinder.
Before each grinding down the container of the grinder was washed with distilled water and dried.
The 1g of powdered bark from each sample was weighed and poured with 5 ml of distilled water.
After 48 hours the pH reaction was measured with the use of pH-meter of ELMETRON CPC-401
type.
The topsoil (before trees) reaction was examined on place with pH-meter - WTW pH 330,
thrust into the soil on the depth of. With the use of Morris square frame (25cm by 25cm) a series of
samples was taken at the selected localities. The frame was thrust into the soil on the depth of 10cm.
In each particular locality a series consisted of 4 tests on the surface of 0.25m 2. Pedofauna was
scampered away by employing the dynamic method in the modified Tullgren apparatus. The
separated individuals were preserved in 70% ethanol until determination which was conducted to
the level of family and order. After marking macrofauna, its number, density diversity and trophic
relations were analyzed.
Chemical analyses of the heavy metals in topsoil, pine bark and in macrofauna was conducted
by mapping the content of general forms of Cd, Pb, Ni, determined owing to the method FAAS.
Dry samples of the topsoil, of the bark and of the macrofauna (1g each) were mineralized. For this
purpose dry samples of the soil and the pine bark was poured over 3 cm3of 65 % HNO3, heated to
the temperature of 110oC and left for 4 hours. The filtered liquid was poured into measuring flasks
and filled with distilled water. In solutions of the soil and bark prepared in this way the content of
heavy metals was determined by atomic absorption spectrometer (AAS – Cole-Parmer, BUCK
200A).
Statistical Analysis
As variances showed no normal distribution (Shapiro-Wilk test, p>0.05), we used non
parametric sign test (for dependent variables) and Mann – Whitney test (for independent variables).
The correlations between metal concentrations, pH, number and diversity of macrofauna and
localities were calculated using the Pearson correlation coefficient. Statistical significance was
defined at p<0.05. All the analyses were performed using STATISTICA 9.0 computer program.
Results and Discussions
The relation between acid reaction in the bark, topsoil and distance from industrial emitters of
environment pollutants was noticed (Table 1). They are statistically significant (Table 5). The
reaction (pH value) of the bark at localities examined indicated its high and fluctuated from pH
3.48 to 3.94 at east side of pine trunk and pH 3.34 to 3.98 at west side at locality (I) near the
industrial works. In locality (II) at the centre city acidity of bark was slightly lower (Table 1). At
locality at the centre of city slightly higher acidity at east side of bark was noted, what suggests the
winds blowing from Power plant and Aluminium-works side. The pH value of topsoil near pines
was considerably higher and amounts was from 5.45 to 5,91 in locality I and 6,86 to 8,76 in locality
II (Table 1). Correlation (r Pearson) between pine bark pH and topsoil pH was noticed (Table 2, 3).
224
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
The differences between the bark and topsoil pH values were statistically significant (Table 4, 5).
On locality II pH of topsoil situated nearer traffic road indicated slightly acid reaction (pH 6,056,98), whereas those situated around 10-12m from it slightly alkaline (pH 7,60-8,86). The result
indicates the influence of automobile exhaust on topsoil situated nearest to the road. At the same
time it was found that the bark reflected the levels of air pollution NOx, HC, RCHO, SO2, better than
the soil. The soil, due to its high cumulative ability and filtering, buffering functions, neutralizes
acidifying compounds. It is therefore suggested that the bark can be used as an indicator of air
pollution by these pollutants. Regarding its filtering and buffering functions, the soil is not a useful
indicator of air pollution by above mentioned compounds. However, as proved by statistically
significant difference between bark pH and topsoil pH (Table 4, 5), the soil should be used in
monitoring research which compares results from different research material.
The relation between heavy metals contents in the bark and distance from industrial emitters
of pollutants was noticed (Figure 2, 3, 4). In the bark at locality I was detected Pb that was around
two times higher than in the bark at locality II. The similar relations concerned Cd content in the
bark. In contrast, the content of Ni at locality near industrial emitters was the highest in bark at east
side. However, in relation to the soil only the content of lead was two times higher at locality I. The
Cd content in soil at both localities was the same, whereas Ni content was around 1,5 times higher
at locality at the city center (Figure 2, 3, 4). The researches indicate that the soil is better
accumulator of Pb and Ni and therefore it is better accumulative indicator for these heavy metals
that necrotic pine bark. The similar conclusions concerning the bark as better indicator of pollutions
by acidifying compounds and the soil as better accumulative indicator for many heavy metals were
drawn by (Marko- Worłowska et al., 2009b).
Statistical study of the results of line correlation analysis, illustrating the connection between
metals concentration, pH reaction in the bark and the topsoil, as well connection between metals
concentration, pH reaction, topsoil moisture, macrofaune number, diversity in topsoil in the
samples (Table 2, 3).
In the researches presented whole number evaluation of lead, cadmium and nickel can
correspond the number of forms soluble in water, that are phyto and zoo-soluble, because the
highest concentration of these metals was detected in the bodies of soil macrofauna predators
(Figure 2, 3, 4). Many taxons among macrofauna constitute the predator level in the trophic chain,
acting in a way an integrator of all physical, chemical and biological qualities of habitat and
characterizing in more complete way of condition of soil habitat. For the level of predators the
highest concentration of toxic pollutants is available.The highest content of heavy metals in bodies
of macrofauna predators was detected in the researches (Figure 2, 3, 4). At locality II situated at the
city centre the moisture of topsoil was the smallest and the pH was the highest. At the same time the
lowest content of Pb in topsoil and in soil macrofauna predators. (Table 1, Figura 2). The high pH
value (alkaline reaction) reduces mobility of many heavy metals and therefore limits penetration of
these contaminations to the organisms, and consequently into the circulation of organic matter.
Despite of this fact density and diversity macrofauna was considerably lower here that at locality
near industrial emitters (Table 1). In this case the main factor limiting the number and diversity of
macrofauna jest the moisture of topsoil.
In spite of the fact that the applied method does not provide absolute values of atmospheric
pollution, it indicates its spatial diversity and, with the use of pedofauna, allows evaluating the
influence of pollutants on the organisms. The use of different bio-indicators (here forest topsoil,
pine bark, and macrofauna) proved to be suitable for monitoring atmospheric pollutions of
acidifying components and heavy metal deposition.
225
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Conclusions
The results confirm greater effect of pollutions (Pb, Cd, Ni and acidifying gases in the bark as
well as Pb in topsoil) on the environment near industrial emitters than situated around 2km from
them. Therefore, the constant monitoring of these localities is necessary. The pine bark is better bioindicator of NOx, SO2 and volatile organic compounds (VOCs) pollutions than adjacent topsoil. The
soil, in spite of its detoxical qualities, constitutes the fragile element of the natural environment and
can be the indicator of many heavy metals pollutions influences on soil subsystem. The comparative
use of different indicators is crucial for the evaluation of contamination of the environment.
Acknowledgment
We would like to express our sincere thank to Magdalena Worłowska for language correction of
work.
References
CONTI, M.E., CECCHETTI, G. 2004. Biological monitoring: lichens as bioindicators of air
pollution assessment - a review. In Environ. Pollut., vol. 114, 2001, p. 471- 492.
FABISZEWSKI, J., BREJ, T., BIELECKI, K. 1987. Plant reactions as indicators of air pollution in
the vicinity of a copper smelter. In Acta Soc. Bot. Pol., vol. 56, 1987, no 2, p. 353-363.
GWOREK, B., TABAK, A., PIERŚCIENIAK, M., MACIASZEK, D., WILK, M. 2008. Chosen the
animals species as coefficients of changes in environment. In Ochrona Środowiska i Zasobów
Naturalnych, vol. 37, 2008, p. 114-125.
JANĈOVÁ, A., STAWARZ, R., FORMICKI, G., BALÁŅ, I., MARTINIAKOVÁ, M.,
DRÁBEKOVÁ, J. 2006. Koncentrácia vápnika, medi, horĉíka a zinku v obliĉkách a peĉeni Sorex
araneus.In Rizikové faktory potravového reťazca. Intern. Scien. Conference, Risk factors of food
Chain, Nitra,VI. 2006. Proceed. Book, p. 132-135.
KLOS, A., RAJFUR,, M., WACLAWEK, M., WACLAWEK, W. 2008. Accumulation of microand macroelements in mosses and lichens. In Ecol. Chem. Eng. S, vol. 15, 2008, no. 3, p. 397- 423.
KOLESAROVA, A.; SLAMECKA, J., JURCIK, R., TATARUCH, F., LUKAC, N., KOVACIK, J.,
CAPCAROVA, M., VALENT, M., MASSANYI, P. 2008. Environmental levels of cadmium, lead
and mercury in brown hares and their relation to blood metabolic parameters. In Journ. of
Environm. Sc. and Health A. Toxic/Hazardous Substances and the Environmental Engineering, vol.
43, 2008, p. 653-657.
MARKO-WORLOWSKA, M., CHRZAN, A., ŁACIAK, T., KOZIK, R. 2009a. Meso- and
macrofauna of the soil as the bio-indicators of the meadow soil polluted by heavy metals. In
Proceed. of the 2nd Interrn. Conf. on Environmental Management, Engineering, Planning and
Economics (CEMEPE) & SECOTOX Conference, 2009a, p. 55- 59.
MARKO – WORLOWSKA, M., CHRZAN, A., ŁACIAK, T. 2009b. Wpływ zanieczyszczeń
komunikacyjnych na odczyn i zawartość metali ciężkich w glebie i korze sosny zwyczajnej Pinus
sylvestris L. In: Zagrożenia biotopów przekształconych przez człowieka. Biotop. 2009b, p. 193-200.
MORSELLI, L., OLIVIERI, P., BRUSORI, B., PASSARINI, F. 2003. Soluble and insoluble
fractions of heavy metals in wet and dry atmospheric depositions in Bologna, Italy. In Environ.
Pollut., vol. 124, 2003, p. 457–469.
NAMIESNIK, J. 2003. Trendy w analityce i monitoringu środowiskowym. In: Namieśnik J.,
Chrzanowski W.W., Szpinek P., (ed.) . Nowe horyzonty i wyzwania w analityce i monitoringu
środowiskowym. CEEAM, Politech. Gdańska, Gdańsk 2003, p. 1- 32
SMODIŃ, B., PIGNATA, M.L., SAIKI, M., CORTÉS, E., BANGFA, N., MARKERT, B.,
NYARKO, B., ARUNACHALAM, J., GARTY, J., VUTCHKOV, M., WOLTERBEEK, H.Th.,
STEINNES, E., FREITAS, M.C., LUCACIU, A., FRONTASYEVA M. 2004. Validation and
226
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Application of Plants as Biomonitors of Trace Element Atmospheric Pollution - A Co-Ordinated
Effort in 14 Countries. In J. Atmos. Chem., vol. 49, 2004, p. 3-13.
STAWARZ, R. Trace elements and heavy metals in animals and humans. Selected aspects of their
content and distribution. Kraków: Vyd. Nauk. UP. 2009.
WOLTERBEEK, B. 2003. Biomonitoring of trace element air pollution: principles, possibilities and
perspectives. In Proc. Int. Workshop in Biomonitoring of atmospheric pollution (with emphasis on
trace elements) - Bio-MAP II, 28 August - 3 September 2000, IAEA-TECDOC-1338, 2003, p. 87104.
Contact address
Maria Marko-Worłowska, Department of Ecology, Wildlife Research and Ecotourism, Institute of
Biology, Pedagogical University of Cracow, ul. Podbrzezie 3, 31-054 Kraków, Poland
 +48 603396415; Fax: +48 126626682
 [email protected]
Tables and figures
Figure 1 Localities of samples taking [Locality 1 (I), locality 2 (II)]
227
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
70
Pb
bark East
60
mg/kg
50
bark West
40
30
topsoil
20
macrofaune
predators
10
0
locality I
locality II
Figure 2 Content of lead in the pine bark and topsoil
8
Cd
7
bark East
6
bark West
mg/kg
5
4
topsoil
3
2
macrofaune
predators
1
0
locality I
locality II
Figure 3 Content of cadmium in the pine bark and topsoil
228
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
14
Ni
bark East
12
mg/kg
10
bark West
8
6
topsoil
4
2
macrofaune
predators
0
locality I
locality II
Figure 4 Content of nickel in the pine bark and topsoil
Table 1 pH value, topsoil moisture and density, diversity of macrofaune at the studied localities
Cardinal
directions
Locality I
Locality II
3,65
(3,48 – 3,94)
3,59
(3,34 – 3,78)
4,4
(4,01 -5,03)
23,22
(20,13-34,46)
3.90
(3,64 - 4,47)
3,85
(3,37 - 4,10)
7,40
(6,86 – 8,76)
8,29
5.25-11,52
Number macrofaune [0.25m2]
82
36
Diversity (number of
taxonomic group)
16
11
East
Pin bark pH
West
Topsoil pH
Topsoil moisture [%]
229
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 2 Correlation (r Pearson) between pine bark pH, topsoil pH, topsoil moisture, macrofauna
diversity, heavy metals concentration in pine bark and topsoil. Locality I
pH
pH pine pH pine Pb in bark Pb in
topsoil bark East bark West East
topsoil
-0,75
-0,65
pH topsoil
pH pine bark
East
Pb in pine bark
East
Pb in topsoil - 0,56
Ni in
topsoil
macrofaune
topsoil moisture [%] diversity
0,76
0,67
0.73
0,53
Cd in topsoil
0,75
Number
macrofauna
*differences statistically significant at p<0.05
0,52
0,51
0,72
Table 3 Correlation (r Pearson) between pine bark pH, topsoil pH, topsoil moisture, macrofauna
diversity, heavy metals concentration in pine bark and topsoil. Locality II
pH
pH
Pb
Pb in
topsoil
pH
pine pine
in
pine
Pb in
Ni in
macrofaune
moisture
topsoil bark bark bark bark topsoil topsoil
diversity
[%]
East West East West
pH topsoil
0,71
0,77
pH pine
0,66
bark East
pH pine
bark West
0,60
Pb in pine
bark East
0,85 0,60
Pb in pine
0,73
bark West
0,70
Cd in pine
0,75 0,64
bark East
0,73
Cd in pine
0,50
bark West
0,48
Pb in topsoil
0,62
0,58
Cd in
0,56
0,66
0,54
0,61
0,81
topsoil
Ni in topsoil
0,74
Number
0,78
macrofauna
*differences statistically significant at p<0.05
230
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 4 Statistical significance of selected parameters in locality I
Pine bark Pine
bark
Topsoil
East
West
pH
Pine bark E
0,000022*
Pine bark W
0,000022*
0,044171*
Topsoil
Pb
Topsoil
0,000022*
Pine bark E
0,000022*
0,358795
Cd
Topsoil
0,000022*
Pine bark E
0,000022*
0,358795
Ni
Topsoil
0,000022*
*differences statistically significant at p<0.05
0,000022*
Table 5 Statistical significance of selected parameters in locality II
Pine bark Pine
bark
Topsoil
East
West
pH
Pine bark E
0,000177*
Pine bark W
0,502335
0,823063
Topsoil
0,000177*
Pb
Topsoil
0,000022*
Pine bark E
Cd
Topsoil
Pine bark E
0,000022*
0,066457
0,422678
Ni
Topsoil
0,000022*
Pine bark E
*differences statistically significant at p<0.05
0,000022*
0,148915
231
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 6 Statistical significance of selected parameters in localities studies
Pine bark Pine
bark
Topsoil
East
West
pH
Pine bark E
0,000375*
Pine bark W
Topsoil
0,000222*
0*
Pb
Topsoil
0,00357*
Pine bark E
0,000008*
Pine bark W
0,000001*
Cd
Topsoil
0,881731
Pine bark E
0*
Pine bark W
0*
Ni
Topsoil
0,000022*
Pine bark E
Pine bark W
Topsoil
moisture
0,000001*
0,014913*
0*
232
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 7 Diversity, density, trophic groups of macrofauna N/0.25m2
Trophic
Locality I
Locality
Systematic group
ggroup
III
Enchytraeidae
S
30
3
Geophilus
P
9
11
Lithobius
P
4
12
Staphylinidae larvae
P
4
15
Staphylinidae imagines
P
13
19
Carabidae larvae
P
6
12
Carabidae imagines
P
1 1
Elateridae larvae
Ph
6
12
Hymenoptera
P
7
19
Formicidae
Diptera imagines
3
13
Dpetera larvae:
Scatopsidae
S
1
Psychodidae
S
1
Empididae
P
4
Total macrofauna
82
136
S - Saprophags,
D - Predators,
F - Phitophags,
233
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
HEAVY METAL CONTENT IN BONES AND FEMORAL BONE STRUCTURE OF
BANK VOLE (MYODES GLAREOLUS) AND COMMON VOLE (MICROTUS
ARVALIS) FROM POLLUTED BIOTOPES IN SLOVAKIA
MARTINIAKOVÁ M.1, OMELKA R.2, JANČOVÁ, A. 1, STAWARZ R.3, FORMICKI G. 3
1
Department of Zoology and Anthropology, Constantine the Philosopher University, 949 74 Nitra,
Slovak Republic
2
Department of Botany and Genetics, Constantine the Philosopher University, 949 74 Nitra, Slovak
Republic
3
Institute of Biology, Krakow Pedagogical University, 31 054 Krakow, Poland
Abstract
The concentrations of selected heavy metals in the femora and femoral bone structure of bank vole
(Myodes glareolus) and common vole (Microtus arvalis) from different polluted biotopes in
Slovakia (Kolíņany and Nováky) were investigated in the present study. Length, weight and
histological structure of vole bones have also been analysed. We observed higher concentrations of
Pb, Fe, Cu and Zn in the bones of both species from Kolíņany site. Significant differences were
observed for concentration of Fe in bank vole and common vole (P<0.05) and for concentration of
Zn (P<0.05) in common vole. The animals from the area of Nováky had higher concentrations of
Cd and Ni in their bones; however, the differences were not significant. The measured values for
bone length and bone weight were higher in both species from Nováky locality (P<0.05). We did
not identify demonstrable changes in qualitative histological characteristics of the femora between
the voles (Myodes glareolus and Microtus arvalis separately) from different biotopes. Also, no
statistically significant differences for all the measured variables of primary osteons‟ vascular
canals were observed. Our results demonstrate slightly elevated accumulation of some heavy metals
in the bones of both species from Kolíņany locality and thus give an evidence of a contamination of
the environment.
Key words: heavy metals, bone, bank vole, common vole, histology, atomic absorption
spectrophotometry
Introduction
The bank vole (Clethrionomys (=Myodes) glareolus) is a small microtine rodent that is
common throughout Europe and it is one of the most common woodland rodents in Slovakia. Seeds,
fruits and green vegetation constitute about 44% of their food, insects, earthworms and other
invertebrates between 9 and 23%, depending on the season, and in winter they add tree bark to their
food (Zemanek 1972; Gdula-Argasinska et al. 2004). This species has been used to monitor
environmental pollution from a variety of technogenic sources up to date (Milton et al. 2003;
Topolska et al. 2004). The common vole (Microtus arvalis) is the species, that drows attention of
cytogeneticists for many years and nowadays it is one of the most karyologically studied free-living
mammals in Europe (Topashka-Ancheva et al. 2003; Gileva et al. 2005). These voles feed mainly
on leaves, stems and roots of grasses and other plants, and seem to preferentially feed on plants with
high nitrogen content (Macdonald and Tattersall 2001).
Our study has been realized in order to contribute to better evaluation of environmental
contamination in two different biotopes in Slovakia. Since bone can serve as a good biomarker of
long-term metal accumulation, we analysed concentrations of selected heavy metals in the femora
234
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
of two rodent species – bank vole and common vole. Rodents are ideal for monitoring
environmental pollution as well as for evaluating the exposure risk for people living in
contaminated areas. Therefore, the aim of this study was to analyse concentrations of selected heavy
metals (Pb, Cd, Fe, Ni, Cu and Zn) in the femora of Myodes glareolus and Microtus arvalis trapped
at different biotopes of a low hill level in Slovakia (Kolíņany and Nováky). Bone length, bone
weight and histological structure of vole bones have also been investigated.
Materials and methods
The individuals of bank vole (Myodes glareolus, n=24) and common vole (Microtus arvalis,
n=15) were obtained by means of the standard teriological methods and procedures from wood
ecosystems (Janĉová et al. 2006) in early spring 2007. The voles were trapped near the coal power
station Nováky (Prievidza district, Slovakia) which is considered to be a strongly polluted region
and near the water pond in Kolíņany (Nitra district, Slovakia) which is located approximately 100
km far from the town Nováky and it is considered to be a relatively polluted region. These two
biotopes are separated by the Tribeĉ mountains. All animals (males) used in the experiment were
adult (4-5 months old), in good physical condition, without pathological-anatomical changes. We
compared fourteen individuals of bank vole from Kolíņany area and ten from Nováky area; eight
individuals of common vole from Kolíņany locality and seven from Nováky locality. Our research
has been focused on 78 femora taken from the adult voles. We compared bone length, bone weight
and histological structure of the femora between the animals from different types of environment.
Values for macroscopical analysis were expressed as mean ± standard deviation. The unpaired Ttest was used to distinguish possible changes in bone length and bone weight between examined
small mammals.
The concentrations of selected heavy metals (Pb, Cd, Ni, Fe, Cu and Zn) were determined in
left femora of investigated mammals (n=39) with the method of atomic absorption
spectrophotometry (Perkin Elmer 4100 ZL) in a graphite furnace (Stawarz et al. 2003). The tissue
samples were kept at -18° C until analysis. In the laboratory the samples were dried at 105ºC until
dry mass was obtained. Then, the bones were weighed (minimum 2 g) and digested in concentrated
nitric acid at 90º C for 10 hours. Before the analysis, the samples were diluted to 25 ml with
distilled water. All metal concentrations were expressed on a dry weight basis in mg.kg-1. From the
final data, basic statistical characteristics were calculated (mean, standard deviation, minimum,
maximum, median). Since the distribution of observed levels of heavy metals was normal according
to Shapiro-Wilk test, the parametric T-test was used for group comparisions with Statistica 7.0
programme.
For histological analysis, each right femur (n=39) was sectioned at the midshaft of its
diaphysis. In total, 39 transversal sections of the femur diaphysis were cut. The bone rings were
washed in running water for five days to remove soft tissues in bone marrow. The bones were then
defatted in a mixed solution of chloroform and methanol for seven days and bleached in 2% H 2O2
solution for one day (Martiniaková et al. 2005). After dehydrating through graded alcohols
(Martiniaková et al. 2006), obtained samples were embedded in epoxy resin Biodur (Günter von
Hagens, Germany). Transverse thin sections (70-80 μm) were prepared with a sawing microtome
(Leitz 1600, Germany), mounted on glass slides with Eukitt (Merck, Germany) and examined by
light microscope (Jenaval, Germany) at 225x. The qualitative histological characteristics of
compact bone microstructure were determined according to Enlow and Brown‟s (1956) and Ricqlés
et al.‟s (1991) classification systems; the quantitative ones were assessed using the computer
software Scion Image (Scion Corporation, Maryland, US) in anterior, posterior, medial and lateral
views of thin section(s). We measured area, perimeter, and the minimum and maximum diameter of
primary osteons‟ vascular canals. The ones were outlined using the software Scion Image on a
235
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
microphotograph at a magnification of 225x. The measured values (for Myodes glareolus n=135,
for Microtus arvalis n=95) were expressed as mean ± standard deviation. The unpaired T-test was
used to distinguish differences in the quantitative histological characteristics of compact bone
between investigated voles.
Results and discussion
Concentrations of selected heavy metals (Pb, Cd, Fe, Ni, Cu and Zn) in the femora of
Myodes glareolus from different types of polluted environment are listed in Table 1. Higher
concentrations of Pb, Fe, Cu and Zn were detected in the bones of bank vole from the area of
Kolíņany. Significant difference was observed only for concentration of Fe (P<0.05). On the other
hand, concentrations of Cd and Ni were higher in the femora of individuals from the area of the
power station Nováky; however, these differences were not significant in statistics. Similarly, we
observed higher concentrations of Pb, Fe, Cu and Zn in the bones of Microtus arvalis from
Kolíņany area (Table 2). Significant differences were detected for Fe and Zn concentrations
(P<0.05). Concentrations of Cd and Ni were also higher in individuals from the area of the power
station Nováky; however, these differences were not significant. Our results demonstrate slightly
elevated accumulation of some heavy metals in the bones of Myodes glareolus and Microtus arvalis
from Kolíņany locality and thus give an evidence of a contamination of the environment. Similar
results have also been observed in the femora of Apodemus flavicollis and Apodemus sylvaticus
trapped at the same biotopes (Martiniaková et al., 2010). These results can be explained by
intensive agricultural production and subsequent contamination of soil, water and food, by road
traffic pollution, and also by various factories (industrial zones) nearby Nitra City. Especially
intensive agricultural production and the use of chemicals are characteristic for the whole region of
Nitra. It is generally known that an application of agricultural chemicals can lead to a higher
accumulation of specific elements including Fe and Zn into the soil. Also, near the capture locality,
there is traffic of high frequency which is also considered to be a significant source of heavy metals,
which have a potential ability to be transported by the air flow at large distance. There is also a
possibility of fallout of dust transported in the air from big industrial regions such as Bratislava,
Vienna, Budapest, or factories nearby the Nitra region. This hypothesis may be supported by studies
indicating the possibility of the long range transportation of heavy metals (Coggins et al. 2006).
Table 1 The concentrations of selected heavy metals in the femora of Myodes glareolus from
different polluted biotopes in Slovakia.
locality
Pb
Cd
Ni
Fe
Cu
Zn
(mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1)
Kolíņany
x
20.46
4.01
9.52
212.99
4.16
188.55
sd
13.17
1.88
2.80
52.27
2.10
21.61
min
9.26
1.08
6.75
140.58
1.87
154.68
max
39.74
7.74
13.92
293.09
6.39
219.42
med
18.87
3.13
8.46
172.53
4.04
151.46
*
Nováky
x
20.13
4.61
9.82
138.98
3.78
176.07
sd
9.51
1.13
1.89
10.15
0.74
11.20
min
14.08
3.71
7.93
128.19
3.20
164.21
max
31.09
5.88
11.69
140.42
4.61
186.14
med
19.84
3.76
8.17
138.17
3.81
174.14
x – mean, sd – standard deviation, min – minimum, max – maximum, med – median, P<0.05 (*)
236
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 2 The concentrations of selected heavy metals in the femora of Microtus arvalis from
Kolíņany and Nováky biotopes.
locality
Pb
Cd
Ni
Fe
Cu
Zn
(mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1) (mg.kg-1)
Kolíņany
x
20.41
2.76
6.84
159.27
3.31
138.52
sd
9.53
0.93
0.94
37.84
1.01
14.21
min
13.58
1.98
6.37
103.63
2.24
104.56
max
31.17
3.87
7.96
194.82
4.49
170.64
med
21.19
3.04
7.05
168.42
3.42
144.98
Nováky
x
20.23
2.84
7.29
113.57*
3.05
129.45*
sd
8.98
1.11
1.14
26.85
0.87
10.12
min
12.88
1.78
6.34
94.56
2.23
113.63
max
29.34
4.05
8.69
144.23
4.66
147.37
med
20.43
2.96
7.53
121.05
3.12
134.26
x – mean, sd – standard deviation, min – minimum, max – maximum, med – median, P<0.05 (*)
The measured values for bone weight and bone length were higher in bank vole and common
vole from Nováky locality. The differences were statistically significant (Table 3). Since all
individuals were adult and of the same sex, came from similar biotopes, we speculate this fact could
be indicated by a growth stimulating effect of some heavy metals. Some investigations based on the
experimental exposures of individuals to risk elements have brought an evidence of associations
between body (bone) length and body (bone) weight and increased intake of Pb, Zn or Cd.
According to Osweiler et al. (1985), lead affects the metabolically active growth centres of long
bones in young animals, so it has a positive effect on bone growth. The supplementation with zinc
results in stimulation of skeletal growth and maturation (Moser-Veillon 1995). Also, it has been
demonstrated that long-term accumulation of cadmium leads to decrease of body weight and weight
of some digestive organs in rats and rabbits (Toman et al. 1995; Toman et al. 2002). Our results
could be explained by the above noted findings only partially because femoral length and femoral
weight were higher in Myodes glareolus and Microtus arvalis with higher concentration of Cd but
not those of Pb and Zn. However, it is known that low levels of the elements taken up from the
natural environment may have somewhat different effect on the bone structure than exposures in
artificial conditions. These differences may be related to the differences in food quality and
availability, the level of toxic elements in the ground, or differences in locomotive activity.
According to the study by Velickovic (2007) the black-striped mice (Apodemus agrarius, rodents)
trapped at the contaminated site in Serbia had a reduced body size and poorer body condition in
comparison with the mice caught in unpolluted reference site. Reduced body size means that an
individual disposes also a reduced bone size. We have observed lower values for bone length and
bone weight in bank voles and common voles from Kolíņany area with higher content of Pb, Fe, Cu
and Zn in the femora.
237
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Table 3 The results of macroscopical analysis of investigated femora from bank vole and common
vole.
animal
locality
bone weight (g) bone length (cm)
x±sd
x±sd
Myodes glareolus Kolíņany 0.029±0.008
1.297±0.109
Nováky
0.042±0.007+
1.637±0.088+
Microtus arvalis Kolíņany 0.026±0.005
1.261±0.093
Nováky
0.037±0.008+
1.512±0.071+
x – mean, sd – standard deviation, P<0.05 (+)
Histological observation of thin sections through a shaft of femora from investigated voles
revealed an outer and inner non-vascular lamellar layer around a poorly developed reticular layer,
containing unorganized vascular canals. We have found only exceptionally several secondary
osteons in femoral bone microstructure of bank vole and common vole, showing that the
remodeling process of this rodent species is not as intensive when compared to non-rodent
mammals. In general, we did not identify demonstrable changes in qualitative histological
characteristics of the femora in Myodes glareolus and Microtus arvalis (separately) from different
biotopes. With the quantitative histological characteristics, 135 vascular canals of primary osteons
and 95 primary osteons‟ vascular canals were measured in bank vole and common vole,
respectively. The results are shown in Table 4. We have found that all measured values for the
vascular canals of primary osteons were higher in both species from the area of Nováky. On the
other hand, no statistically significant differences were observed. Our results allow for the
conclusion that environmental factors (including heavy metals in the environment) influence
macroscopic structure of the bones in Myodes glareolus and Microtus arvalis trapped at different
types of polluted environment in Slovakia. On the other hand, heavy metals did not affect compact
bone morphology. According to Havill (2003), bone microstructural morphology is also genetically
mediated and provides the direction for further exploration into this phenomenon. Beamer et al.
(2001) mention that environmental factors are important contributors to variability in bone
microstructure, but genetics plays a substantial role, with estimates of heritability ranging from 4093%.
Table 4 Measured values of vascular canals of primary osteons‟ variables in bank vole and
common vole from Kolíņany and Nováky areas.
animal
locality
area (μm2), x±sd
perimeter
max. diameter
min. diameter
(μm), x±sd
(μm), x±sd
(μm), x±sd
Myodes
Kolíņany
100.85±16.02
27.95±4.27
12.23±2.46
4.67±0.69
glareolus
Nováky
102.58±16.19
28.76±3.97
12.45±2.39
4.71±0.74
Microtus
Kolíņany
95.64±14.21
25.12±3.56
11.72±2.24
4.26±0.58
arvalis
Nováky
98.97±14.89
27.36±3.78
12.04±2.47
4.83±0.69
x – mean, sd – standard deviation
In conclusion, our contribution is a pilot study about relationship between femoral bone
structure and accumulation of some heavy metals in the bones of bank vole and common vole from
different types of polluted environment in Slovakia. Further research in this direction will need to
extend the number of analysed skeletal elements and to verify the results that were obtained from
our skeletal samples, especially in other species of small mammals.
238
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Acknowledgments
This study was supported by the grant KEGA 3/7338/09 (Ministry of Education, Slovak Republic).
References
BEAMER, W. G. - SHULTZ, K. L. - DONAHUE, L. R. - CHURCHILL, G. A. - SEN, S. WERGEDAL, J. R. - BAYLING, D. J. - ROSEN, C. J. 2001. Quantitative trait loci for femoral and
lumbar vertebral bone mineral density in C57BL/6J and C3H/HeJ inbred strains of mice. In J Bone
Miner Res, vol. 16, 2001, p.1195-1206.
COGGINS, A. M. - JENNINGS, S. G. - EBINGHAUS, R. 2006. Accumulation rates of the heavy
metals lead, mercury and cadmium in ombrotrophic peatlands in the west of Ireland. In Atmospheric
Environ, vol. 40, 2006, p. 260-278.
ENLOW, D. H. - BROWN, S. O. 1956. A comparative histological study of fossil and recent bone
tissues. Part I. In Texas J Sci, vol. 8, 1956, p. 405-412.
GDULA-ARGASINSKA, J. - APPLETON, J. - SAWICKA-KAPUSTA, K. - SPENCE, B. 2004.
Further investigation of the heavy metal content of the teeth of the bank vole as an exposure
indicator of environmental pollution in Poland. In Environ Pollut, vol. 131, 2004, p. 71-79.
GILEVA, E. A. - YALKOVSKAYA, L. E - POLYAVINA, O. V. - BOĽSHAKOV, V. N. 2005.
Common voles of the Microtus arvalis group in the Urals: genome instability and chromosomal
polymorphism. In Dokl Biol Sci, vol. 405, 2004, p. 458-460.
HAVILL, L. M. 2003. Osteon remodeling dynamics in Macaca mulatta: normal variation with
regard to age, sex and skeletal maturity. In Calcif Tissue Int, vol. 74, 2003, p. 95-102.
JANĈOVÁ, A. - MASSÁNYI, P. - NAĆ, P. - KORÉNEKOVÁ, B. - SKALICKÁ, M. DRÁBEKOVÁ, J. - BALÁŅ, I. 2006. Accumulation of heavy metals in selected organs of yellow
necked mouse (Apodemus flavicollis). In Ekol Bratislava, vol. 25, 2006, p. 19-26.
MACDONALD, D. W. - TATTERSALL, F. H. 2001. Britain’s mammals: the challenge for
conservation. People's Trust for Endangered Species, London, 2001.
MARTINIAKOVÁ, M. - GROSSKOPF, B. - VONDRÁKOVÁ, M. - OMELKA, R. - FABIŃ, M.
2005. Observation of the microstructure of rat cortical bone tissue. In Scripta Medica, vol. 78, 2005,
p. 45-50.
MARTINIAKOVÁ, M. - GROSSKOPF, B. - OMELKA, R. - VONDRÁKOVÁ, M. BAUEROVÁ, M. 2006. Differences among species in compact bone tissue microstructure of
mammalian skeleton: use of a discriminant function analysis for species identification. In J Forens
Sci, vol. 51, 2006, p. 1235-1239.
MARTINIAKOVÁ, M. - OMELKA, R. - JANĈOVÁ, A. - STAWARZ, R. - FORMICKI, G. 2010.
Heavy metal content in the femora of yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and wood
mouse (Apodemus sylvaticus) from different types of polluted environment in Slovakia. In Environ
Monit Assess (in press).
MILTON, A. - COOKE, J. A. - JOHNSON, M. S. 2003. Accumulation of lead, zinc, and cadmium
in a wild population of Clethrionomys glareolus from an abandoned lead mine. In Arch Environ
Contam Toxicol, vol. 44, 2003, p. 405-411.
MOSER-VEILLON, R. B. 1995. Zinc needs and homeostasis during lactation. In Analyst, vol. 120,
1995, p. 895-897.
OSWEILER, G. D. - CARSON, T. L. - BUCK, W. B. - VAN GELDER, G. A. 1985. Clinical and
diagnostic veterinary toxicology. Iowa: Kendall/Hunt Publishing Company, 1985.
RICQLÉS A. J. DE - MEUNIER, F. J. - CASTANET, J. - FRANCILLON-VIEILLOT, H. 1991.
Comparative microstructure of bone. In: Hall BK(ed) Bone 3, Bone matrix and bone specific
products, vol. 1. Boca Raton: CRC Press, 1991, pp. 1-78.
239
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
STAWARZ, R. - ZAKRZEWSKI, M. - MARENĈÍK, A. - HRAŃKA, Ń. 2003. Heavy metal
concentration in the toad Bufo Bufo from a region of Mochovce, Slovakia. In Ekol Bratislava, vol.
22, 2003, p. 292-297.
TOMAN, R. - MASSÁNYI, P. - KOVÁĈIK, J. 1999. Growth and reproductive ability of male
rabbits after cadmium intake from diet. In Folia Vet, vol. 43, 1999, p. 182-185.
TOMAN, R. - MASSÁNYI, P. - ĈUPKA, P. - LUKÁĈ, N. - DUCSAY, L. - KOLENKÁŃ, M. TURĈAN, J. - HAŃĈÍK, P. 2002. Changes in weight of some organs and weight of rats under the
influence of cadmium receiving in the diet from wean to sexual maturity (in slovak). In Risk factors
of the food chain: proceeding book. SPU: Nitra, 2002, p. 154-157.
TOPASHKA-ANCHEVA, M. - METCHEVA, R. - TEODOROVA, S. 2003. A comparative
analysis of the heavy metal loading of small mammals in different regions of Bulgaria II:
chromosomal aberrations and blood pathology. In Ecotoxicol Environ Saf, vol. 54, 2003, p. 188193.
TOPOLSKA, K. - SAWICKA-KAPUSTA, K. - CIESLIK, E. 2004. The effect of contamination of
the Krakow region on heavy metals content in the organs of bank voles (Cleithrionomys glareolus,
Schreber, 1780). In Pol J Environ Stud, vol. 13, 2004, p. 103-109.
VELICKOVIC, M. 2007. Measures of the developmental stability, body size and body condition in
the black-striped mouse (Apodemus agrarius) as indicators of a disturbed environment in northern
Serbia. In Belg J Zool, vol. 137, 2007, p. 147-156.
ZEMANEK, M. 1972. Food and feeding habits of rodents in a deciduous forest. In Acta Theriol,
vol. 23, 1972, p.315-325.
240
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
VPLYV FAKTOROV VONKAJŃIEHO PROSTREDIA NA IMUNITNÝ SYSTÉM
THE EFFECT OF ABIOTIC FACTORS ON THE IMMUNE SYSTEM
MARTINIAKOVÁ M.1, OMELKA R.2, MASSÁNYI P.3, LUKÁČ N.3
Katedra zoológie a antropológie, Univerzita Konštantína Filozofa v Nitre, 949 74 Nitra, Slovenská
republika
2
Katedra botaniky a genetiky, Univerzita Konštantína Filozofa v Nitre, 949 74 Nitra, Slovenská
republika
3
Katedra fyziológie ţivoĉíchov, Slovenská poľnohospodárska Univerzita, 949 02 Nitra, Sloveská
republika
1
Abstract
Immune systems of humans and animals can be influenced by many environmental factors. This
article summarizes basic information about the effects of various abiotic factors; environment of
animal keeping and welfare; working environment and human lifestyle; xenobiotics and traffic
pollutants on immune system. Most of these factors have a supresive effect on the whole immune
potential. As a consequence of this fact, there is observed an increased prevalence of various
infectious, autoimmune and allergic diseases in population.
Key words: immune system, abiotic factors, environment, human lifestyle, xenobiotics, heavy
metals
Úvod
Imunitný systém môņeme charakterizovať ako zloņitú sieť ńpecializovaných buniek, tkanív,
molekúl a ich vzájomných interakcií, ktoré vznikli poĉas fylogenetického vývoja organizmov.
U kaņdého jedinca udrņuje jednotu jeho vnútorného prostredia proti zmenám vznikajúcim po
prekonaní vývinových stupņov v embryogenéze, nádorovou transformáciou vlastných buniek,
starnutím, mutáciami alebo pôsobením faktorov vonkajńieho prostredia, ako sú infekĉné agensy
(parazity, patogénne mikróby, plesne, huby a vírusy), chemické látky (toxické xenobiotiká, vrátane
mnohých liekov), nepriaznivé fyzikálne vplyvy (ionizujúce ņiarenie, ultrazvuk, mikrovlny)
a psychosociálne vplyvy (Ferenĉík et al., 2004). Öroveņ schopnosti imunitného systému reagovať
na akýkoľvek signál je geneticky daná a v priebehu ņivota je modifikovaná pôsobením prostredia.
Väĉńina faktorov vonkajńieho prostredia má supresívny vplyv na celkový imunitný potenciál
(Tuĉek et al., 2006). V tomto ĉlánku sa zameriame na rôzne abiotické faktory, podmienky
hromadného chovu hospodárskych zvierat, pracovné prostredie a ņivotný ńtýl ĉloveka, xenobiotiká
a dopravné emisie, ktoré môņu negatívne ovplyvņovať imunitný systém.
Abiotické faktory a imunitný systém
Fyzikálne vplyvy vonkajńieho prostredia, ktoré svojimi odchýlkami od normálu ovplyvņujú
imunitný systém, majú väĉńinou charakter stresových podnetov. Imunitný systém na ne reaguje
podobne ako na stres (Krejĉí a Trebichavský, 2009).
Pokiaľ sa zameriame na vonkajńie prostredie a v ņom pôsobiace faktory globálne, zatiaľ nie
sú k dispozícii jednoznaĉné údaje, ktoré by objasnili moņný vplyv globálneho otepľovania
a meniacej sa ozónovej vrstvy na organizmus a jeho imunitný systém. Lepńie uņ bol preńtudovaný
vplyv klimatických pásiem, teploty a vlhkosti vzduchu ĉi lokálneho zneĉistenia vonkajńieho
prostredia (Petanová, 2007).
241
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Mierne zvýńenie teploty tela na 39 – 41˚ C má na imunitný systém a jeho aktivitu priaznivý
vplyv. Zvyńuje sa odolnosť voĉi bakteriálnym a vírusovým infekciám (dochádza k zvýńeniu
funkĉnej aktivity neutrofilných granulocytov, zvýńeniu hladín imunoglobulínov IgG, IgM a IgA)
a pri vyńńej teplote dochádza k inhibícii rastu nádorových buniek. Pri sledovaní osôb vystavených
niņńím teplotám (prípadne i v kombinácii so zvýńenou vlhkosťou vzduchu) bolo zistené, ņe
dochádza k zníņeniu obranyschopnosti organizmu voĉi infekĉnému agens, v laboratórnych nálezoch
boli dokumentované zníņené hladiny imunoglobulínov. So zniņujúcou sa teplotou klesá nielen
produkcia protilátok, ale zniņuje sa aj poĉet lymfocytov a dochádza k obmedzeniu fagocytárnych
funkcií (Ferenĉík et al., 1988). Vplyv nadmorskej výńky na imunitný systém je sprostredkovaný
predovńetkým parciálnym tlakom kyslíka vo vonkajńom prostredí. Mierna a krátka hypoxia
stimuluje fagocytárne funkcie, zatiaľ ĉo dlhodobá a výrazná hypoxia má na tieto funkcie inhibiĉný
vplyv. Pri posudzovaní vplyvu ņiarenia na imunitný systém bolo v rámci viditeľného svetla (400760 nm) zistené moņné ovplyvnenie niektorých imunologických parametrov v zmysle rytmicity
cirkadiálnej ĉi sezónnej. Cirkadiálne zmeny boli zistené v percentuálnom zastúpení T lymfocytov.
Neskorńie ńtúdie vńak tieto závery nepotvrdili, nakoľko zmeny jednotlivých lymfocytárnych
populácií v periférnej krvi môņu súvisieť len s redistribúciou buniek medzi cirkuláciou a tkanivami,
a nie so zníņením ich celkového poĉtu. Sezónne zmeny sa pozorujú v prípade koncentrácií
imunoglobulínov a v hodnotách cirkulujúcich imunokomplexov, najĉastejńie v súvislosti
s prebiehajúcimi poĉetnými vírusovými infekciami v období jari a jesene. Podrobnejńie bol
ńtudovaný vplyv UV ņiarenia (200-400 nm), ktorého zloņka UV-B má výraznejńí vplyv na imunitný
systém. UV ņiarenie zniņuje u ĉloveka reakcie neskorej precitlivenosti na vonkajńie pôsobenie
chemických látok na koņi, zvyńuje aktivitu CD8+ lymfocytov, zvyńuje aktivitu NK buniek. Podľa
zmien a skrátenia ņivotnosti bola stanovená rádiosenzitivita u jednotlivých typov buniek imunitného
systému, ktorá postupne klesá od makrofágov cez aktivované T lymfocyty aņ po B lymfocyty
(Petanová, 2007).
Hromadný chov hospodárskych zvierat a imunitný systém
Faktory vonkajńieho prostredia uplatņujúce sa v chovoch hospodárskych zvierat sú
predovńetkým faktormi negatívnymi. Vedú k poklesu úņitkovosti, ktorého príĉinou je okrem iného
i potlaĉenie niektorých imunitných funkcií. V tomto prípade ide o úĉinok dlhodobého stresu. Ten sa
prejavuje zníņením odolnosti zvierat, ktorá uľahĉuje prienik patogénnych mikroorganizmov a vznik
hromadných infekĉných ochorení. Znalosť vplyvu jednotlivých chovateľských a technologických
zásahov na útlm imunitných funkcií je vńak zatiaľ nedostatoĉná (Krejĉí a Trebichavský, 2009).
Pracovné prostredie a ņivotný ńtýl človeka
Sledovanie jednotlivých osôb viedlo k podrobnejńiemu poznaniu vplyvu pracovného
prostredia a ņivotného ńtýlu (vrátane výņivy, fajĉenia, uņívania liekov) na individuálnu imunitnú
odpoveć. So zvyńujúcim sa vekom stúpa riziko autoimunitných ochorení a malignít, ĉastým
nálezom pri laboratórnom vyńetrení je polyklonálna hyperimunoglobulinémia, ktorá je ale
spravádzaná zníņenou protilátkovou odpovećou na ńpecifické antigény. V bunkovej imunite
nachádzame zníņené hodnoty CD4+ lymfocytov a zníņenú reakciu T lymfocytov na mitogény a
niņńiu aktivitu NK buniek (Petanová, 2007).
Imunitná odpoveć sledovanej osoby je taktieņ ovplyvnená výņivou. Proteínová kalorická
malnutrícia je spojená pri dlhodobom trvaní s prejavmi imunodeficiencie v dôsledku zníņenia poĉtu
NK buniek, T lymfocytov a ich funkcií. V laboratórnych testoch je zníņená odpoveć buniek na
pôsobiace mitogény. Menej je ovplyvnená zloņka B lymfocytov a produkovaných imunoglobulínov
(ĉasté sú iba nízke hladiny sekreĉného IgA). Nachádzame taktieņ zníņenú aktivitu fagocytujúcich
buniek. Öloha esenciálnych mastných kyselín v potrave môņe byť výraznejńia, neņ sa pôvodne
predpokladalo. Ich potenciál ako zdroja a prekurzora eikosanoidov a predovńetkým prostaglandínov
242
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
E2 (ktorý má imunosupresivný potenciál) podobne ako moņné ovplyvnenie signalizaĉných dráh
nesaturovanými mastnými kyselinami, ozrejmuje ich imunomodulaĉný efekt (Hwang, 2000).
Esenciálne mastné kyseliny sú nevyhnutné pre rozvoj thýmusu, vývoj CD4+ lymfocytov, NK
buniek i makrofágov. Deficit vitamínov (A, B6, B12, C, E, kyselina listová) v potrave vedie
k zníņeniu fagocytózy, ńpecifickej imunity bunkovej i humorálnej. Zo stopových prvkov je pre
zachovanie imunitných funkcií potrebná dostatoĉná hladina najmä ņeleza, zinku a selénu; ich deficit
má negatívny vplyv na bunkami sprostredkovanú imunitnú odpoveć (Kviĉala, 2003).
Xenobiotiká a imunitný systém
Ńtúdiu vplyvu xenobiotík na imunitný systém sa v poslednej dobe venuje znaĉná pozornosť.
Medzi xenobiotiká patria rôzne cudzorodé látky, ako sú napr. priemyselné chemikálie v ņivotnom
prostredí a pracovnom procese, lieĉivá, ĉi produkty biotransformácie vyńńie zmienených látok.
Väĉńina xenobiotík sa v organizme metabolizuje za moņného vzniku neúĉinných detoxikaĉných
produktov alebo aj toxickejńích látok s mutagénnym, kancerogénnym, nefrogénnym
a imunotoxickým úĉinkom (Jakuńová a Dostál, 2008). Pre hodnotenie ich vplyvu na imunitný
systém je dôleņité zistenie moņnosti ich väzby ako hapténov na nosiĉ, zistenie ich imunotoxického
potenciálu pre ĉloveka a urĉenie miery rizika pre populáciu i jednotlivca (Petanová, 2007).
Celková odozva imunitného systému na xenobiotiká má spoĉiatku charakter
imunostimulácie, ktorá sa prejavuje zvýńenou aktivitou niektorých ukazovateľov. Pri
protrahovanom a intenzívnom pôsobení noxy alebo pri preťaņení kombinovanou záťaņou
kvalitatívne odlińnými podnetmi, môņe dôjsť aņ k vyĉerpaniu imunitného systému, prejavujúceho sa
poklesom jeho efektorových funkcií (King, 2000). Z environmentálnych ńkodlivín majú výrazný
imunosupresívny úĉinok mykotoxíny, polychlórované bifenyly, pesticídy, olovo a kadmium.
Nezanedbateľný podiel zo spektra xenobiotík tvoria xenohormóny, známe pod oznaĉením
endokrinné rozruńovaĉe, endokrinné disruptory (endocrine disrupters). Sú to najmä pesticídy,
chlórované uhľovodíky, ftaláty, obzvláńť perzistentné organické polutanty a ćalńie poĉetné
organické zlúĉeniny. Xenohormóny spôsobujú najmä rozvrat hormonálneho systému, ktorý je
v úzkom prepojení na imunitný a nervový systém (Jakuńová a Dostál, 2008).
Klinicky manifestné poruchy (zníņenie protiinfekĉnej imunity, rozvoj autoimunitného
ochorenia, rôzne typy prejavov hypersenzitivity) vznikajú aņ po prelomení rezistencie organizmu,
ktorá je individuálne odlińná a záleņí nielen na kapacite imunitného systému, ale i na hormonálnych
a regulaĉných vplyvoch a na celom komplexe psychosociálnych faktorov (Melenová a Demnerová,
2004; Tuĉek a et al., 2006).
Kovy a imunitný systém
Ťaņké kovy patria medzi základné skupiny zneĉisťujúcich látok, ktoré sa sledujú v rôznych
zloņkách ņivotného prostredia. Ide o pomerne rozsiahlu skupinu kontaminantov, ktoré sa vyznaĉujú
rozdielnymi vlastnosťami, úĉinkami i zdrojmi svojho pôvodu. Predmetom svetového monitoringu
sú prvky: Hg, Cd, Cr a Pb. Tieto sa vńeobecne povaņujú za najńkodlivejńie pre ľudí a zvieratá.
Veľmi ńkodlivé môņu byť aj niektoré ćalńie prvky, ktoré sú v malom mnoņstve v pôdach a
rastlinách potrebné, ak sa vńak nahromadia vo veľkom mnoņstve, môņu pôsobiť eńte toxickejńie ako
vyńńie uvedené prvky, sú to napr. Zn, As, Cu, Ni a ćalńie.
Podľa Nińtiara (2006) a Lukáĉa et al., (2009) predstavujú ťaņké kovy jednu
z najnebezpeĉnejńích ńkodlivín, nakoľko sa nedegradujú poĉas prírodných procesov; pôsobením
minerálnych a biologických procesov sa hromadia (tzv. geo-, bio- a ekoakumulácia) a priamo alebo
cez potravinové reťazce spôsobujú akútne alebo chronické intoxikácie ľudí a zvierat.
Príkladom imunotoxikologických prác bolo ńtúdium pôsobenia kovov na imunitný systém,
ktoré bolo sledované najmä z hľadiska ich moņného vplyvu na rozvoj autoimunitných reakcií.
Bigazii (1996) rozdelil tieto kovy do 3 skupín:
243
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
kovy so známou imunotoxickou aktivitou, ale bez jednoznaĉnej dokumentácie vzťahu
k autoimunite (arzén, berýlium, nikel, vanád, ņelezo)
2.
kovy schopné ovplyvniť imunitný systém a len ojedinele súvisiace s autoimunitnou reakciou
(zinok, meć, chróm, ņelezo, kadmium, platina, striebro)
3.
kovy spojené s autoimunitnou reakciou a rozvojom autoimunitného ochorenia (lítium, zlato,
ortuť)
Z ćalńích zmien niektorých parametrov imunitného systému vyvolaných pôsobením kovov
môņeme spomenúť napr. zmeny koncentrácii niektorých izotypov imunoglobulínov (zvýńenie IgM
po pôsobení arzénu, zvýńenie IgG a IgA vplyvom pôsobiaceho berýlia), zníņenie proliferaĉnej
schopnosti T lymfocytov (u buniek ovplyvnených olovom a ortuťou), zníņenie vńetkých imunitných
funkcií (pri výraznom zníņení ale i nadbytku zinku v organizme) (Petanová, 2007).
1.
Vplyv dopravných emisií na imunitný systém človeka
Hlavným faktorom ovplyvņujúcim imunitný systém v súvislosti s narastajúcou intenzitou
dopravy sú dopravné emisie. Tieto emisie zahŕņajú nielen samotné plynné emisie oxidov dusíka
(NOx), polycyklické aromatické uhľovodíky (PAU) a oxid uhoľnatý (CO), ale i tuhé ĉastice (PM –
particulate mater), „road dust“ (vznikajúci z opotrebovania pneumatík, brzdového obloņenia,
katalyzátorov, cestného povrchu) a emisie hluku. Tieto zloņky majú vplyv na zvýńenú chorobnosť
a zvýńenie frekvencie ochorení predovńetkým dýchacieho systému osôb exponovaných vyńńím
hodnotám dopravných emisií. Vyvolané ochorenia môņu byť nielen nealergickej povahy, ale ĉasto
taktieņ dochádza k zhorńeniu alergických ochorení a astmy vrátane moņnej exacerbácie
astmatického záchvatu (Krzyzanovski et al., 2005). Lokálny zápal a následný rozvoj systémovej
reakcie je predpokladaný na základe zistenej zvýńenej in vitro produkcie TNF-α a IL-1β
endoteliálnymi bunkami, ovplyvnenými emisiami vznikajúcimi pri spaľovaní v naftových
motoroch. Pôsobením zloņiek dopravných emisií dochádza k aktivácii slizniĉnej imunity, stimulácii
alveolárnych makrofágov a epiteliálnych buniek, k zvýńenej sekrécii interleukínov IL-1β, IL-6, IL-8
v mukóze ústnej dutiny po expozícii mestskému prachu. U sledovaných exponovaných osôb bolo
v bioptických vzorkách bronchiálnej mukózy zistené zvýńené zastúpenie neutrofilných leukocytov,
T lymfocytov CD4+ i CD8+. V rámci zvýńenia dopravných emisií dochádza i k rozvoju alergického
zápalu. Pri moņnej väzbe alergénu na pevné ĉastice dochádza k zmene jeho následnej depozície
v organizme, naviazané ĉastice majú ĉasto eńte adjuvantný efekt na vyvolanú imunitnú odpoveć
organizmu. Niektoré zloņky dopravných emisií sa podieľajú na modifikácii pôsobenia alergénu
zmenou napr. povrchu peľového zrna a tým dochádza následne k zmene alergickej reakcie na
pôvodný i novo vzniknutý alergén u senzibilizovaných osôb (Petanová, 2007).
Záver
Vnímavosť imunitného systému na rôzne faktory vonkajńieho prostredia závisí nielen od
vlastností uvedených faktorov, ale aj od komplexnej povahy imunitného systému a jeho spolupráce
s ostatnými systémami v organizme (najmä s nervovým a hormonálnym systémom). Väĉńina
faktorov vonkajńieho prostredia má supresívny vplyv na celkový imunitný potenciál. Dôsledkom
uvedenej skutoĉnosti je zvýńený výskyt rôznych infekĉných, autoimunitných i alergických ochorení
v populácii.
Poďakovanie
Práca bola podporená projektom MŃ SR KEGA 3/7338/09.
244
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Literatúra
BIGAZZI, P.E. 1996. Autoimunity induced by metals. In Chang, L. W. (eds.): Toxicology of metals.
CRC Lewis Publishers, Boca Raton, 1996, pp. 835-852.
FERENĈÍK, M. - FERENĈÍKOVÁ, J. - KOLESÁR, J. 1988. Vplyv fyzikálnych faktorov
prostredia na imunitné mechanizmy. In Imunita a ţivotní prostředí. Sborník referátů. 5. Kongres
ĉeskoslovenských imunologů, Plzeň, 5. – 9. 7. 1988, pp. 89-96.
FERENĈÍK, M. - ROVENSKÝ, J. - SHOENFELD, Y. - MAŤHA, V. 2004. Imunitný systém –
dobrý obranca, ale aj moţný diverzant. Slovak Academic Press, s.r.o., Bratislava, 2004, 273 s.
HWANG, D. 2000. Fatty acids and immune responses – a new perspective in searching for clues to
mechanism. In Annu. Rev. Nutr., vol. 20, 2000, pp. 431-456.
JAKUŃOVÁ, Ľ. - DOSTÁL, A. 2008. Xenobiotiká a ich podiel na etiopatogenéze niektorých
ochorení v detskom veku. In School and Health, vol. 21, 2008, pp. 259-261.
KING, J.C. 2000. Specific nutrient requirements: trace elements. In Gershwin, M. E., German, J.
B., Keen, C. L. (eds.): Nutrition and immunology: principles and practice. Humana Press, Totowa,
2000, pp. 65-74.
KREJĈÍ, J. - TREBICHAVSKÝ, I. 2009. Imunitní systém a prostředí. In Toman, M. (eds.):
Veterinární imunologie. Grada Publishing a. s., Praha, 2009, pp. 329-338.
KRZYZANOVSKI, M. - KUNA-DIBBERT, B. - SCHNEIDER, J. (eds.): Health effects of
transport-related air pollution. WHO Regional Office for Europe, Copenhagen, 2005, 195 p.
KVIĈALA, J. 2003. Zvýńení příjmu mikronutrientu selenu – utopie, fikce, prozřetelnost ĉi nutnost?
I. ĉást. Interní Med., vol. 6, 2003, pp. 295-300.
LUKÁĈ, N. - MASSÁNYI, P. - CAPCAROVÁ, M. - KOVÁĈIK, J. - MARTINIAKOVÁ, M.
2009. Vplyv toxických kovov na imunitný systém. In Potravinárstvo, vol. 3, 2009, pp. 35-38.
MELENOVÁ, I. - DEMNEROVÁ, K. 2004. Nové moņnosti odstraņování polutantŧ ze ņivotního
prostředí a vyuņití multifunkĉního permeabilního bariérového systému – multibariéry. In Chem.
Listy, vol. 98, 2004, pp. 908-915.
NIŃTIAR, F. 2006. Övod do imunopatológie. http://www.patfyz.medic.upjs.sk, 2006
PETANOVÁ, J. 2007. Vplyv prostředí na imunitní systém. In Med. Pro praxi, vol. 6, 2007, pp.
256-258.
TUĈEK, M. - BENCKO, V. - VOLNÝ, J. - PETANOVÁ, J. 2006. Příspěvek k odhadu zdravotních
rizik expozice výfukovým plynŧm u celníku na hraniĉních přechodech. In Ĉeské pracovní lékařství,
vol. 2, 2006, s. 72-79.
245
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
IN VITRO ŃTÚDIA O VPLYVE DEOXYNIVALENOLU NA SEKREČNÚ
AKTIVITU GRANULÓZNYCH BUNIEK OŃÍPANÝCH
IN VITRO STUDY OF THE EFFECT OF DEOXYNIVALENOL ON THE
SECRETORY ACTIVITY OF PORCINE OVARIAN GRANULOSA CELLS
MEDVEĎOVÁ Marína 1, KOLESÁROVÁ Adriana 1, CAPCAROVÁ Marcela 1, LABUDA
Roman 3, SIROTKIN Alexander V.2, KOVÁČIK Jaroslav 1, BULLA Jozef 1
1
Department of Animal Physiology, Faculty of Biotechnology and Food Sciences, Slovak University
of Agriculture, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovak Republic
2
Institute for Genetics and Reproduction of Farm Animals, Animal Production Research Centre
Nitra, Hlohovecká 2, 951 41 Luţianky, Slovak Republic
3
Romer Labs Division Holding GmbH, Technopark 1, 3430 Tulln, Austria
Abstract
Mycotoxins are considered secondary metabolic products of fungal origin. Trichothecenes, such as
deoxynivalenol (DON), are the major mycotoxins of Fusarium fungi. The effect of DON exposure
on female reproductive function was assessed in the porcine ovarian granulosa cells. The general
objective of this in vitro study was to examine changes in the secretory activity of porcine ovarian
granulosa cells after experimental DON administration. Concentrations of IGF–I and P4 were
determined by RIA. IGF–I release by granulosa cells was inhibited by DON addition at the dose
1000 ng.ml-1. Progesterone release by granulosa cells was increased at DON addition (1000 ng.ml 1
). In conclusion, this study provides novel evidence that DON is the potential regulator of secretory
activity of porcine ovarian granulosa cells.
Key words: Deoxynivalenol, IGF–I, progesterone, granulosa cell
Úvod
Mykotoxíny sú prírodné a veľmi stabilné toxíny, nízkomolekulárne sekundárne metabolity
húb, ktoré kontaminujú veľké mnoņstvá krmív a potravín na Slovensku (Labuda et al., 2005;
Tanĉinová a Labuda, 2009) a celom svete (Ranzenigo et al., 2008). Nachádzajú sa v rozliĉných
jedlách a nápojoch, zahŕņajúc potraviny rastlinného aj ņivoĉíńneho pôvodu. Najviac sú rozńírené v
obilninách (kukurica, pńenica, jaĉmeņ, raņ, ryņa a iné), bôbových zrnách (káva, kakao, sója a iné) a
sú nebezpeĉné pre zvieratá a ľudí. Tieto huby produkujú rôzne typy mykotoxínov, avńak nie vńetky
huby ich produkujú. Mykotoxíny sú povaņované za sekundárne metabolity, pretoņe nie sú potrebné
pre rast húb a sú produktom primárneho metabolického procesu. Obilie býva najĉastejńie
kontaminované rodmi Fusarium, skupinou plesní produkujúcou toxíny (Tiemann et al., 2003;
Giraud et al., 2010). Produkcia mykotoxínov rodmi Penicillium a Paecilomyces bola tieņ
zaznamenaná (Bíro et al., 2009). Mykotoxíny môņu byť toxické akútne a/alebo chronicky, ĉo závisí
od druhu toxínu a dávky. Po prijatí per os sú mykotoxíny rýchlo absorbované. Prechádzajú do krvi
a v tráviacom trakte sú absorbované pasívne, aktívne v obliĉkách (Marquardt a Frohlich, 1992),
peĉeni, svaloch, tukovom tkanive (Gareis a Scheuer, 2000) a reprodukĉnom tkanive (Ranzenigo et
al., 2008). Trichotecény, ako deoxynivalenol (DON), zearalenon (ZON) a ćalńie, sú hlavnými
mykotoxínami húb rodu Fusarium a sú spájané s nízkou úņitkovosťou a reprodukciou ońípaných
(Alm et al., 2002). Expozícia granulóznych buniek mykotoxínmi má za následok zmenenú
produkciu steroidných hormónov, ĉo môņe byť príĉinou poruńenia vývoja oocytov (Minervini et al.,
246
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
2001; Alm et al., 2002), ovulácie, reprodukĉných funkcií a gravidity (Alm et al., 2002).
Inzulínu podobný rastový faktor – I (IGF–I) je proinzulínu príbuzný multifunkĉný bázický
peptid ńtruktúrou podobný ľudskému proinzulínu (Vigań, 1993; Feige, 1998). IGF–I vplýva na rast
folikulov vajeĉníka (Kwintkiewicz a Giudice, 2009), vývoj, proliferáciu granulóznych buniek (Mao
et al., 2004), bunkovú diferenciáciu, steroidogenézu, dozrievanie vajíĉka (Kwintkiewicz a Giudice,
2009) a uvoľņovanie hormónov z vajeĉníkov (Sirotkin et al., 2008; Sirotkin et al., 2006). IGF
systém ovplyvņuje procesy steroidogenézy ońípaných a ĉloveka (Geisert et al., 2001).
Progesterón (P4) má dôleņitú úlohu pri reprodukĉných procesoch (Edqvist a Forsberg, 1997).
P4 je lokálny parakrinný alebo autokrinný faktor regulujúci luteálnu funkciu (Gregoraszczuk, 1994).
U cyklujúcich zvierat, v zaĉiatoĉnej fáze rastu folikulov je uvoľņované veľké mnoņstvo P 4
aktívnym ņltým telieskom do periférnej krvi (Mahajan, 2008). Je potrebný pre normálny cyklus
vajeĉníkov (Arnhold et al., 2009), pohlavné dospievanie (Kolesárová et al., 2008), ale aj vývoj
embrya (Arnhold et al., 2009).
Materiál a metodika
Príprava, spracovanie a kultivácia granulóznych buniek
Vajeĉníky získané pri zabití zvierat (n = 12) sme individuálne uskladnili v termoske s
fyziologickým roztokom pri izbovej teplote a spracovali maximálne do 6 hodín od zabitia zvierat.
Ovariálne granulózne bunky sme izolovali metódou aspirácie zo stredne veľkých folikulov (2 – 5
mm). Suspenziu granulóznych buniek sme odstrećovali (1500 ot.min-1, 10 minút) za úĉelom
oddelenia od folikulovej tekutiny s následným premývaním pomocou sterilného kultivaĉného média
DMEM/F12 1:1 (BioWhittaker™, Verviers, Belgicko) doplneného 10 % fetálnym teľacím sérom
(BioWhittaker™, Verviers, Belgicko) a antibiotikom – antimykotikom (Sigma, St. Louis, MO,
USA). Pomocou hemocytometra sme poĉítali bunky a upravili koncentráciu buniek na potrebnú
(106 buniek.ml-1 média). Bunkovú suspenziu riedenú kultivaĉným médiom sme kultivovali (37 oC, 5
% CO2) v kultivaĉných platniĉkách (1 ml.jamka -1). Pribliņne po 5 – 7 dņoch kultivácie, keć bunky
vytvorili na 75 % súvislú monovrstvu, sme médium nahradili ĉerstvým médiom s prítomným 5 %
fetálnym teľacím sérom bez antibiotika a bez (kontrola) alebo s (experimentálna skupina)
prídavkom mykotoxínu DON v dávke 1000 ng.ml-1. Po 24 –hodinovej kultivácii sme injekĉnou
striekaĉkou odobrali médium z kultivaĉných platniĉiek a uskladnili pri teplote –20 oC aņ do doby
analýzy.
Ria analýza
Koncentrácie IGF–I a P4 boli stanovené metódou RIA v 25 – 100 µl inkubaĉného média.
Tieto látky boli naviazané pouņitím RIA kitov (Immunotech SAS, Marseille Cedex, Francúzko)
podľa inńtrukcií výrobcu (Makarevich a Sirotkin, 1999). Vńetky RIA súpravy boli urĉené pre
pouņitie vzoriek kultivaĉného média.
Ńtatistická analýza
Analýzy látok v inkubaĉnom médiu boli vykonané duplicitne. Ńtatistické rozdiely medzi
kontrolnou (bez pôsobenia DON–u ) a MAX skupinou (vystavené pôsobeniu DON–u) boli
hodnotené t–testom pouņitím ńtatistického programu Sigma Plot 11.0 (Jandel, Corte Madera, USA).
Ödaje sú vyjadrené ako priemer ± S.E.M. Signifikantnosť rozdielov medzi kontrolnou
a experimentálnou skupinou bola urĉená na úrovni 0,05 (P<0,05).
Cieľom práce bolo preskúmať sekreĉnú ĉinnosť granulóznych buniek vajeĉníkov prasniĉiek
po experimentálnom podaní DON–u in vitro. Pre splnenie uvedeného cieľa sme sa v nańej práci
zamerali na uvoľnenie IGF-I a P4 granulóznymi bunkami.
247
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Výsledky
Uvoľnenie IGF–I granulóznymi bunkami
V súvislosti s uvoľnením IGF–I granulóznymi bunkami vajeĉníkov po experimentálnom
podaní dávky DON–u boli zaznamenané preukazné rozdiely medzi kontrolnou a experimentálnou
skupinou. Uvoľnenie IGF–I granulóznymi bunkami vajeĉníkov po experimentálnom podaní DON–
u v kontrolnej skupine bolo 12,45 ± 0,87 ng.ml-1. DON v skupine MAX v dávke 1000 ng.ml-1
signifikantne zniņoval (P<0,05) uvoľnenie IGF–I (0,90 ± 0,15 ng.ml-1) granulóznymi bunkami
(Tab. 1).
Tabuľka 1 Hodnoty v ng.ml-1 pri uvoľņovaní IGF–I z granulóznych buniek
skupina
ukazovateľ
Minimum
Maximum
Priemer
S.E.M.
Variaĉný koeficient (%)
Kontrola (ng·ml-1)
MAX (1000 ng·ml-1)
9,64
14,21
12,46
0,87
2,24
0,27
1,31
0,91
0,15
0,38
Uvoľnenie P4 granulóznymi bunkami
Po aplikácii DON–u sme medzi kontrolnou skupinou a experimentálnou skupinou
zaznamenali rozdiely pri uvoľņovaní progesterónu (Tab. 2). Uvoľņovanie P 4 granulóznymi
bunkami vajeĉníkov prasniĉiek bolo 8,30 ± 0,96 ng.ml-1 v kontrolnej skupine bez aplikácie DON–u.
Uvoľnenie steroidného hormónu P4 granulóznymi bunkami v experimentálnej skupine MAX
vykazuje preukazné rozdiely v porovnaní s kontrolnou skupinou. Mnoņstvo uvoľneného P 4, ktoré
bolo zaznamenané v skupine MAX bolo 13,09 ± 1,23 ng.ml-1.
Tabuľka 2 Hodnoty v ng.ml-1 pri uvoľņovaní P4 z granulóznych buniek
skupina
ukazovateľ
Minimum
Maximum
Priemer
S.E.M.
Variaĉný koeficient (%)
Kontrola (ng·ml-1)
MAX (1000 ng·ml-1)
5,02
12,14
8,30
0,97
2,48
10,71
14,86
13,09
1,24
5,30
Diskusia
Výsledky experimentálnej práce poukazujú na priamy vplyv DON–u na sekreĉnú ĉinnosť
granulóznych buniek vajeĉníkov ońípaných. Zistili sme, ņe izolované granulózne bunky vajeĉníkov
boli schopné preņiť v kultúre a uvoľņovať rastový hormón IGF–I a steroidný hormón P4. Tieto
údaje potvrdzujú predchádzajúce ńtúdie o vplyve toxických látok na bunkové procesy u ońípaných
(Kolesárová et al., 2010; Capcarová et al., 2009; Roychoudhury et al., 2009). Ćalńie ńtúdie
naznaĉujú zvyńovanie priepustnosti monovrstvy vplyvom DON–u (Van De Walle et al., 2010). Alm
et al. (2002) zistili najsilnejńí úĉinok DON–u na dozrievanie oocytov, kde zaznamenali výrazný
pokles podielu oocytov v metafáze II pri koncentrácii 1,88 μM. Ranzenigo et al. (2008) uvádzajú,
ņe kombinované pôsobenie DON–u a zearalenonu zvyńovalo proliferáciu granulóznych buniek.
248
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Výsledky nańej práce naznaĉujú, ņe aplikácia DON–u v dávke 1000 ng.ml-1 pouņitej
v experimente, inhibovala sekréciu IGF–I granulóznymi bunkami vajeĉníkov, ĉo je v súlade so
zisteniami Ranzenigo et al. (2008). Öĉinky DON–u vo vzťahu k uvoľņovaniu IGF–I ovariálnymi
granulóznymi bunkami boli naznaĉené v predchádzajúcej ńtúdii (Ranzenigo et al., 2008).
Nańe zistenia naznaĉujú, ņe uvoľnenie steroidneho hormónu P 4 z granulóznych buniek
prasniĉiek bolo preukazne zvýńené po pridaní DON–u v dávke 1000 ng.ml-1. Podobný úĉinok bol
pozorovaný v predchádzajúcich experimentoch u gravidných samíc na granulóznych bunkách
kultivovaných s ťaņkými kovmi. Stimulácia uvoľņovania P4 bola zaznamenaná v skupine
s najvyńńou dávkou pouņitou v experimente, ĉo predstavovalo 0,25 mg.ml-1 octanu olovnatého
(Kolesárová et al., 2010). Podľa Ranzenigo et al., (2008) vplyv DON–u bol závislý od pouņitých
koncentrácií pridaných do kultivaĉného média. Autori zistili zníņenú produkciu progesterónu
indukovanú folikulostimulaĉným hormónom spolu s IGF–I, vplyvom dávok 100 ng.ml-1 (0,337 µM)
a 1000 ng.ml-1 (0,37 µM) DON–u. Podobne Caloni et al. (2009) zaznamenali inhibíciu progesterónu
o 30 % pôsobením 1 ng.ml-1 T2 toxínu.
Záver
Na základe analýzy kultivovaných ovariálnych granulóznych buniek ońípaných metódou RIA,
sme zistili ņe DON ovplyvņoval uvoľnenie hormonálnych látok IGF–I a P4 granulóznymi bunkami
vajeĉníkov prasniĉiek. Pouņitá dávka DON–u inhibovala sekréciu IGF–I a stimulovala uvoľnenie P4
granulóznymi bunkami. Nańa ńtúdia naznaĉuje zapájanie sa mykotoxínu DON do sekreĉnej
schopnosti ovariálnych granulóznych buniek prasniĉiek.
Poďakovanie
Autori ĉlánku ćakujú firme Romer Labs Division Holding GmbH, Tulln, Rakúsko za poskytnutie
mykotoxínu DON a Kataríne Tóthovej a Ing. Ņofii Kuklovej za technickú asistenciu v laboratóriach
CVŅV Nitra. Táto práca bola finanĉne podporovaná APVV ĉ. 0299-06, a VEGA grantom ĉ.
1/0696/08 a ĉ. 1/0834/08.
Literatúra
ALM, H. - GREISING, T. - BRUSSOW, K.-P. - TORNER, H. - TIEMANN, U. 2002. The
influence of the mycotoxins deoxynivalenol and zearalenol on in vitro maturation of pig oocytes
and in vitro culture of pig zygotes. In Toxicol in Vitro, vol. 16, 2002, no. 6, p. 643-648.
ARNHOLD, I.J. - LOFRANO-PORTO, A. - LATRONICO, A.C. 2009. Inactivating mutations of
luteinizing hormone beta-subunit or luteinizing hormone receptor cause oligo-amenorrhea and
infertility in women. In Hormone Research, vol. 71, 2009, p. 75-82.
BÍRO, D. - JURÁĈEK, M. - KAĈÁNIOVÁ, M. - ŃIMKO, M. - GÁLIK, B. - MICHÁLKOVÁ, J. GYÖNGYOVÁ, E. Occurence of microscopic fungy and mycotoxins in conserved high moisture
corn from Slovakia. In Ann. Agric. Environ. Med., vol 16, pp. 227-232.
EDQVIST, L.E. - FORSBERG, M. Clinical Reproductive Endocrinology. b. m. : Academic Press,
1997. s. 589-599.
FEIGE, J.J. 1998. Growth factor control of adrenocortical function. In Journal of Endocrinology,
vol. 158, 1998, p. 7-19.
GAREIS, M. - SCHEUER, R. 2000. Ochratoxin A in meat and meat products. In Archiv für
Lebensmittelhygiene, vol. 51, 2000, pp. 102-104.
GEISERT, R.D. - CHAMBERLAIN, C.S. - VONNAHME, K.A. - MALAYER, J.R. - SPICER, L.J.
2001. Possible role of kallikrein in proteolysis of insulin-like growth factor binding proteins during
the oestrous cycle and early pregnancy in pig. In Reproduction, vol. 121, 2001, no. 5, p. 719-728.
249
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
GIRAUD, F. - PASQUALI, M. - EL JARROUDI, M. - VRANCKEN, C. - BROCHOT, C. COCCO, E. - HOFFMANN, L. - DELFOSSE, P. - BOHN, T. 2010. Fusarium head blight and
associated mycotoxin occurrence on winter wheat in Luxembourg in 2007/2008. In Food Addit.
Contam. Part A, Chem. Anal. Control Expo. Risk. Assess., vol. 26, 2010, p. 1-11.
GREGORASZCZUK, E. 1994. Is progesterone a modulator of luteal steroidogenesis in pig?
A tissue culture approach. In Folia Histochem. Cytobiol., vol. 32, 1994, p. 31-33.
KOLESAROVA, A. - SLAMECKA, J. - JURCIK, R. - TATARUCH, F. - LUKAC, N. KOVACIK, J. - CAPCAROVA, M. - VALENT, M. - MASSANYI, P. 2008. Environmental levels
of cadmium, lead and mercury in brown hares and their relation to blood metabolic parameters. In
Journal of environmental science and health, Part A Toxic/Hazardous Substances and
Environmental Engineering, vol. 43, 2008, p. 646-650.
KOLESAROVA, A. - SHUBHADEEP, R. - SLIVKOVA, J. - SIROTKIN, A.V. - CAPCAROVA,
M. - MASSANYI, P. 2010. In vitro study on the effect of lead and mercury on porcine ovarian
granulosa cells. In Journal of environmental science and health, Part A – Toxic/Hazardous
Substances and Environmental Engineering, vol. 45, 2010, no. 3, p 320-331.
KWINTKIEWICZ, J. - GIUDICE, L.C. 2009. The interplay of insulin-like growth factors,
gonadotropins, and endocrine disruptors in ovarian follicular development and function. In
Seminars in Reproductive Medicine, vol. 27, 2009, p. 43-51.
LABUDA, R. - PARICH, A. - VEKIRU, E. - TANCINOVA, D. 2005. Incidence of fuminosins,
moniliformin and Fusarium species in poultry feed mixtures from Slovakia. In Ann. Agric. Environ.
Med., vol 12, 2005, no. 1, p. 81-86.
MAHAJAN, D.K. 2008. Pig Model to Study Dynamics of Steroids During Ovarian Follicular
Growth and Maturation. In Sourcebook of Models for Biomedical Research, 2008, pp. 425-436.
ISBN 978-1-58829-933-8.
MAO, J. - SMITH, M.F. - RUCKER, E.B. - WU, G.M. - MCCAULEY, T.C. - CANTLEY, T.C. PRATHER, R.S. - DIDION, B.A. - DAY, B.N. 2004. Effect of epidermal growth factor and insulinlike growth factor I on porcine preantral follicular growth, antrum formation, and stimulation of
granulosal cell proliferation and suppression of apoptosis in vitro. In J. Anim. Sci., vol. 82, 2004, p.
1967-1975.
MAREŃOVÁ, D. 1996. Fyziologie rozmnoņování a těhotenství : Reprodukĉný systém ņeny. In
MARQUARDT, R.R. - FROHLICH, A.A. 1992. A review of recent advances in understanding
ochratoxicosis. In Journal of Animal Science, vol. 70, 1992, p. 3968-3988.
MINERVINI, F. - DELL'AQUILA, M.E. - MARITATO, F. - MINOIA, P. - VISCONTI, A. 2001.
Toxic effects of the mycotoxin zearalenone and its derivatives on in vitro maturation of bovine
oocytes and 17 β-estradiol levels in mural granulosa cell cultures. In Toxicol in vitro, vol. 15, 2001,
p. 489-495.
SIROTKIN, A.V. - GROSSMANN, R. - MARÍA-PEON, M.T. - ROA, J. - TENA-SEMPERE, M. KLEIN, S., 2006. Novel expression and functional role of ghrelin in chicken ovary. In Molecular
and Cellular Endocrinology p. 257-258, p. 15-25.
SIROTKIN, A.V. - BENCO, A. - TANDLMAJEROVA, A. - VASICEK, D. - KOTWICA, J. DARLAK, K. - VALENZUELA, F. 2008. Transcription factor p53 can regulate proliferation,
apoptosis and secretory activity of luteinizing porcine ovarian granulosa cell cultured with and
without ghrelin and FSH. In Reproduction, vol. 136, 2008, p. 611-618.
RANZENIGO, G. - CALONI, F. - CREMONESI, F. - AAD, P.Y. - SPICER, L.J. 2008. Effects of
Fusarium mycotoxins on steroid production by porcine granulosa cells. In Anim. Reprod. Sci., vol.
107, 2008, no. 1-2, p. 115-130.
TANCINOVA, D. - LABUDA, R. 2009. Fungi on wheat bran and their toxinogenity. In Ann. Agric.
Environ. Med., vol. 16, 2009, no. 2, p. 325-331.
TIEMANN, U. - TOMEK, W. - SCHNEIDER, F. - VANSELOW, J. 2003. Effects of the
250
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
mycotoxins alpha- and beta-zearalenol on regulation of progesterone synthesis in cultured granulosa
cells from porcine ovaries. In Reprod. Toxicol., vol. 17, 2003, no. 16, p. 673-681.
TROJAN, S. 1996. Lékařská fyziologie. 2. vyd. Praha : Grada Publishing, 1996, s. 320-325. ISBN
80-7169-311-1
VIGAŃ, M. 1993. Hypotalamo – hypofýzový systém : Adenohypofýzové hormóny. In KREZE, A. LANGER, P. - KLIMEŃ, I. - LICHARDUS, B.: Praktická endokrinológia, Bratislava : Slovak
Academic Press, 1993. s. 53-56. ISBN 80-85667-17-4
251
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
PORÓWNANIE ZAWARTOŚCI WYBRANYCH SKŁADNIKÓW OWOCÓW I
WARZYW Z UPRAW TRADYCYJNYCH I EKOLOGICZNYCH
COMPARISON OF CHOSEN COMPONENTS OF FRUITS AND VEGETABLES
FROM THE TRADITIONAL AND ECOLOGICAL CULTIVATION
PASTERNAKIEWICZ Anna *, KRÓL Wioleta *, DŅUGAN Małgorzata *, KLUZ Maciej
*Department of Chemistry and Food Toxicology, Rzeszów University, 2 Ćwiklińskiej St., 35-601
Rzeszów, Poland
**Department of Biotechnology and Microbiology, Rzeszów University, 2 Ćwiklińskiej St., 35-601
Rzeszów, Poland
Abstract
Vegetables and fruits make group of food products that should be consumed 3-5 times a day. They
are of low calories content, source of vitamins, mineral components and cellulose at the same time.
Out of all vitamins, presence of C vitamin is significant in fruits and vegetables. C vitamin
diminishes the oxidation stress, secures proper functioning of immunity system and participates in
collagen formation. However, in the fruits and vegetables, there can also be present some
substances which influence negatively on the organism, these are for example nitrates. The research
was done over the level of vitamin C together with remains of nitrates on chosen fruits and
vegetables from ecological and traditional cultivations. As a result, higher contamination of vitamin
C in fruits and vegetables from ecological cultivation was observed. For example, in potatoes from
conventional cultivation, the level of vitamin C was 28.1 mg/100 g, and from ecological one – 39,3
mg/100 g. In strawberries, these amounts were respectively 162.5 to 220 mg/100 g. As far as fruits
are concerned, the differences of the nitrate level in the tested group was not found. Contrary to the
vegetables, the amount of nitrates was much higher than in the case of the conventional cultivation.
The most significant difference was found in carrot: when its origin was from the traditional
cultivation, the level of nitrates was 531 mg/kg, whereas ecological cultivation pinpointed to 135
mg/kg.
Key words: vitamin C, nitrates, fruits, vegetables
Wstęp
Zasady prawidłowego żywienia zalecają spożywanie owoców i warzyw 3-5 razy dziennie.
Zawierają one bowiem witaminę C, kwas foliowy, niacynę, witaminę K oraz makroelementy (sód,
potas, wapń, magnez, fosfor, chlor, siarka) i mikroelementy (żelazo, miedź, cynk, mangan, kobalt
i inne. Wśród składników mineralnych zawartych w owocach i warzywach przeważają pierwiastki
zasadowe, dlatego też mają one działanie alkalizujące w organizmie. Błonnik zawarty w warzywach
i owocach może powodować obniżenie poziomu cholesterolu we krwi, a tym samym zmniejsza
ryzyko miażdżycy. Bardzo ważną funkcją błonnika jest również redukcja zaparć i ryzyka
nowotworów przewodu pokarmowego.
Dzięki dużej zawartości wody większość owoców i warzyw ma niską wartość energetyczną i
są często składowymi diet odchudzających, czy też pozwalających utrzymać prawidłową wagę
ciała. Ważnym walorem zachęcającym do spożywania owoców i warzyw jest ich smakowitość.
Aby jednak w pełni korzystać z korzyści płynących z jedzenia tych produktów, nie mogą one
zawierać w swym składzie substancji o niekorzystnym, czy wręcz toksycznym działaniu na
252
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
organizm człowieka. W owocach i warzywach mogą znajdować się pozostałości środków ochrony
roślin; w roku 2007 19,8% przebadanych w Polsce owoców i warzyw posiadało w swym składzie
pozostałości pestycydów (Raport, 2007). Powszechnymi zanieczyszczeniami żywności są również
azotany, w grupie warzyw największe ilości związków azotu znajdują się w marchwi, ogórkach,
korzeniu pietruszki, rzodkiewce, kapuście i sałacie. Są to rośliny o płytkim systemie korzeniowym,
którym czerpią wodę z najbardziej zanieczyszczonych, wierzchnich warstw gleby. Drzewa
owocowe o głębokim systemie korzeniowym rodzą owoce mniej zanieczyszczone niż warzywa.
Dobrym sposobem na ograniczenie pobierania wraz z pożywieniem szkodliwych substancji
może być spożywanie produktów żywnościowych wytwarzanych w systemie gospodarstwa
ekologicznego, tzn. takiego, w którym unika się stosowania nawozów sztucznych, pestycydów,
regulatorów wzrostu i dodatków do żywności.
Materiał i metody
Przebadano owoce (jabłka, wiśnie, truskawki, maliny) i warzywa (marchew, ziemniaki,
cebula, pomidory) pochodzące z upraw ekologicznych i tradycyjnych (takie same odmiany z
upraw).
Oznaczono zawartość witaminy C metodą miareczkową przy użyciu jako titranta 2,6dichlorofenoloindofenolu (PN-A-04019). Poziom azotanów (V) określano stosując
kolorymetryczną metodą krzywej wzorcowej z zastosowaniem roztworu kwasu salicylowego w
stężonym kwasie siarkowym (VI; PN- 92/A- 75112).
Analizy przeprowadzono bezpośrednio po zbiorach.
Wyniki i ich omówienie
Witamina C ma duże znaczenie w utrzymaniu odporności organizmu na zakażenia, zmniejsza
stres oksydacyjny, bierze udział w wytwarzaniu kolagenu. Kwas foliowy wpływa korzystnie na
funkcjonowanie układu krwiotwórczego i nerwowego, natomiast witamina K odpowiada za
prawidłową krzepliwość krwi.
Z przeprowadzonych analiz wynika, że zawartość witaminy C w owocach i warzywach
pochodzących u gospodarstw ekologicznych jest u takich samych odmian z upraw
konwencjonalnych (rys. 1 i 2). Największą różnicę w ilości witaminy C wśród badanych warzyw
stwierdzono dla ziemniaków (ok. 40%), zaś najmniejszą w marchwi (32%). W grupie owoców w
jabłkach ekologicznych zawartość witaminy C wynosiła 26,83 mg%, zaś w jabłkach pochodzących
upraw tradycyjnych 18,78 mg%, natomiast w truskawkach odpowiednio 220,0 mg% i 162,5 mg%.
Wyższą zawartość witaminy C w ziemniakach uprawianych ekologicznie i systemem
konwencjonalnym stwierdzono w wielu badaniach zagranicznych i polskich. Jest to ważne w Polsce
i innych krajach, gdzie ziemniaki stanowią istotny element diety. W innych niż ziemniaki
warzywach także stwierdzono wyższą zawartość witaminy C, gdy pochodziły one z upraw
ekologicznych. Obliczono, że jeśli przyjąć średnią zawartość witaminy C dla ziemniaków i różnych
warzyw konwencjonalnych jako 100 %, to w surowcach ekologicznych stwierdza się przeciętnie o
36,3 % więcej tej witaminy. Przy tym większe różnice wykazywane są dla warzyw liściastych
(sałata, kapusta), a mniejsze dla warzyw korzeniowych (ziemniaki, seler; Rembiałkowska, 2002).
253
13-th – 14 -th September 2010
mg/100g
X. Risk Factors of Food Chain
40
35
30
25
20
15
10
5
0
cebula-onion marchewcarrot
konwencjonalny-traditional
pomidortomato
ziemniakpotato
ekologiczny-ecological
Rys. 1 Zawartość witaminy C w warzywach z upraw ekologicznych i konwencjonalnych
Fig. 1 Contamination of witamin C in vegetables from ecological and traditional cultivations
250
mg/100g
200
150
100
50
0
jabłko-apple
malinaraspberry
konwencjonalny-traditional
truskawkastrawberry
wiśniacherry
ekologiczny-ecological
Rys. 2 Poziom witaminy C w owocach ekologicznych i konwencjonalnych
Fig. 2 The level of witamin C in friuts from ecological and traditional cultivations
Wprawdzie azotany (V) są związkami chemicznymi o stosunkowo małej toksyczności dla
ludzi i zwierząt, jednak w organizmie ulegają one przemianie do bardzo niebezpiecznych dla
zdrowia azotanów (III) - azotynów. Reakcja ta przebiega pod wpływem enzymu nitratazy,
wytwarzanego przez bakterie z grupy coli i innych, które wchodzą w skład mikroflory przewodu
pokarmowego lub występują w żywności. Nadmierne pobieranie z dietą azotanów (V) i ich
redukcja do azotanów (III) może doprowadzić do methemoglobinemii, czyli utleniania
dwuwartościowego żelaza hemoglobiny do formy trójwartościowej, nie mającej zdolności
odwracalnego wiązania tlenu. Azotyny reagują też z drugo- i trzeciorzędowymi aminami tworząc
nitrozoaminy, które mają udowodnione działanie rakotwórcze i mutagenne (Wojciechowska, 2004).
254
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Wiele danych świadczy o wyraźnie większej zawartości azotanów i azotynów
w ziemiopłodach uprawianych konwencjonalnie w porównaniu z ekologicznymi. Najczęściej
stwierdza się około dwukrotnie więcej azotanów w produktach konwencjonalnych.
Poziom azotanów (V) w owocach i warzywach pochodzących z upraw ekologicznych
i konwencjonalnych przedstawiają rys. 3 i tabela 1.
Tab. 1 Porównanie zawartości azotanów w owocach konwencjonalnych i ekologicznych
Comparision of nitrate contamination in fruits from traditional and ecological cultivation
Owoc-Fruit
Jabłko-Apple
Malina-Raspberry
Truskawka-Strawberry
Wiśnia-cherry
Poziom azotanów(V) [mg/ kg]
Nitrate(V) level
konwencjonalny
ekologiczny
-traditional
-ecological
29,0
25,0
12,2
11,9
8,5
8,6
14,4
14,4
600
500
mg/kg
400
300
200
100
0
cebula-onion marchewcarrot
konwencjonalny-traditional
pomidortomato
ziemniakpotato
ekologiczny-ecological
Rys. 3 Porównanie zawartości azotanów(V) w warzywach konwencjonalnych i ekologicznych
Fig. 3 Comparision of nitrate contamination in vegetables from traditional and ecological
cultivation
Przeprowadzone badania wykazały, że zawartość azotanów (V) była znacznie niższa
w płodach rolnych pozyskanych z gospodarstw ekologicznych, szczególnie w warzywach.
W marchwi pochodzącej z uprawy konwencjonalnej średnia zawartość azotanów (V)
wynosiła 533 mg/kg, podczas gdy w ekologicznych – około 134 mg/kg. Dla marchwi dopuszczalny
poziom azotanów (V) wynosi 400 mg/kg i w tym warzywie z gospodarstwa tradycyjnego był on
znacznie przekroczony. Podobnie dla ziemniaka, maksymalna zawartość może być do 200 mg/kg,
zaś w badanych ziemniakach z gospodarstw konwencjonalnych ilość azotanów (V) była 299 mg/kg,
natomiast z gospodarstw ekologicznych- 63 mg/kg
255
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Uzyskane wyniki były porównywalne z danymi przedstawionymi przez Tietze i in. (2007),
którzy podają, iż zawartość azotanów (V) jest 4- krotnie niższa dla ziemniaków i 2,5- krotnie niższa
w marchwi pochodzących z upraw ekologicznych.
W przypadku owoców różnice były porównywalne dla produktów z upraw konwencjonalnych i
ekologicznych (tab.1)
Niższe zawartości azotanów (V) w warzywach pochodzących z upraw ekologicznych są
konsekwencją ograniczeń w stosowaniu nawozów mineralnych. Dla owoców sposób nawożenia
gleby nie wpływał na poziom azotanów, gdyż system korzeniowy drzew jest znacznie bardziej
rozbudowany, dłuższy i potrzebne sole mineralne są czerpane z głębszych warstw (Krajewski i
Świątkowska, 2006).
Na podstawie uzyskanych w badaniach i dostępnych w literaturze danych można stwierdzić,
że metody ekologiczne pozwalają na ograniczenie pobierania azotanów do organizmu, a
równocześnie zwiększenie przyjmowania witaminy C.
Wnioski
Owoce i warzywa pochodzące z gospodarstw ekologicznych zawierały znacznie większe
ilości witaminy C w porównaniu z produktami z gospodarstw tradycyjnych.
Niższy poziom azotanów (V) w warzywach z upraw ekologicznych niż z tradycyjnych jest
konsekwencją zakazu stosowania nawozów mineralnych w rolnictwie ekologicznym.
Spożywanie owoców i warzyw pozyskanych z gospodarstw ekologicznych jest korzystne dla
poprawienia stanu zdrowia człowieka.
Literatura
KRAJEWSKI, K. - ŚWIATKOVSKA, M. 2006. Rolnictwo i produkty ekologiczne wspierane
działaniami promocyjnymi In Przemysł Spożywczy, vol. 12, 2006, s.6- 11.
PN-A-04019. Produkty spożywcze. Oznaczanie zawartości witaminy C.
PN- 92/A- 75112. Owoce, warzywa i ich przetwory. Oznaczanie zawartości azotanów i azotynów.
Raport z monitoringu najwyższych dopuszczalnych pozostałości pestycydów w żywności. Raport
Państwowej Inspekcji Sanitarnej za rok 2007.
REMBIALKOWSKA, E. 2002. Zdrowotna i sensoryczna jakość ziemniaków oraz wybranych
warzyw z gospodarstw ekologicznych. Wyd. SGGW Warszawa, 2002.
TIETZE, M. - BURGHARDT, A. - BRAGIEL, P. - MAC, J. 2007. Zawartość związków azotowych
w produktach spożywczych. In Annales UMCS Lublin, vol. XXV., 2007, no. 1, s. 71- 77.
WOJCIECHOWSKA, R. 2004. Akumulacja azotanów a jakość produktów ogrodniczych. In Zeszyty
Naukowe AR w Krakowie, vol. 6, 2004, s. 42-49.
256
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
ESTROGENIC AND ANTIESTROGENIC ACTIVITY OF TOMATO FRUITS
PINTO Barbara, SANFILIPPO Katy, CRISTOFANI Renza, REALI Daniela
Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia ed Epidemiologia,
University of Pisa, Via Roma, 55 – 56127 – Pisa, Italy
Abstract
The estrogenic/antiestrogenic activity of lipophilic (LE) and hydrophilic (HE) extracts of tomato
Solanum lycopersicum L., variety Micro Tom and Money maker, were analysed by an in vitro
yeast-based test which works via an estrogen receptor (ER)-dependent pathway (YES test). Extracts
were not estrogenic (maximum β-gal activity, ≤10% of E2) but exhibited antiestrogenic activity
depending on extract concentration as well as tomato cultivar. At the highest dose tested (1 mg/ml)
a 60% and 40% inhibition of E 2 activity was observed for the LE of Micro Tom and Money maker,
respectively. In general, the LE was more active than HE (p <0.05). A high cell proliferation in the
presence of the HE was observed. Our preliminary results indicate a marked antiestrogenic action of
tomato fruit extracts in vitro. The high activity expressed by the lipophilic fraction is in agreement
with data reported in the literature on the distribution of phytoestrogens such as flavonoids and
lycopene, in the tomato skin.
Key words: tomato fruit, estrogenic/anti-estrogenic activity, YES test
Introduction
Mediterranean diet has been associated in many epidemiological studies to a protective action
on human health and a reduction of the incidence of major chronic diseases (Martinez-Gonzalez et
al., 2009). The high consumption of plant-based food which characterizes the dietary pattern of the
Mediterranean regions, play an important role for the presence of several bioactive molecules with
antioxidant activity, including polyphenolic compounds (Carratù and Sanzini, 2005). Tomato, an
important component of the Mediterranean diet, has long been under consideration by the scientific
community for its high nutritional value and antioxidant and anticancer properties, attributable
primarily to the content in polyphenols, including flavonoids, carotenoids and vitamin C (Lenucci et
al., 2006, Helmja et al., 2007, Slimestad et al, 2008). Lycopene is the major carotenoid present in
tomatoes, accounting for more than 80% of the total tomato carotenoids, followed by α- and βcarotenes. It is present in high amount in tomato fruits and their processed products, and its intake
has been associated with decreased risk of chronic diseases including cancer and cardiovascular
diseases (CVD) (Dorgan et al., 1998). Flavonoids, are polyphenolic compounds that can exert
important biological functions, including the modulation of hormone metabolism (Lautraite et al.,
2002, Moon et al., 2006, Bouhlel et al., 2009). Such plant metabolites, called phytoestrogens, have
also been investigated for their preventive role in reducing the symptoms of menopause and
recently, in cancer prevention for their antiproliferative action (Han et al., 2002, D‟Incalci et al.,
2005, Indap et al., 2006, Ramos 2007). The mechanism by which they can affect the hormone
system partly depends on their ability to bind the human estrogen receptors (ERs) by imitating the
hormone action (agonistic activity) and/or blocking the receptors (antagonistic action) (Collins et al,
1997, Maggiolini et al., 2001, Turner et al., 2007). This contribution is part of a multidisciplinary
study aimed to assess the nutraceutical value and safety of tomato fruits, funded by the University
of Pisa (MICROSAFE). In this study, we preliminary evaluated the effect of variety on
estrogenic/antiestrogenic activity of fruits of two tomato Solanum lycopersicum L. cultivars (Micro
257
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Tom and Money maker) by an in vitro yeast-based system (YES test), mediated estrogen receptor
(ERα). The activity of lycopene, one of the most representative tomato constituents, was also
assessed.
Material and methods
Tomato samples and extracts preparation
Two varieties of tomato Solanum lycopersicum L. were analyzed. Micro Tom is a small
cultivar of tomato with red ripened fruits. For its rapid growth, and easy transformation it has been
also proposed as a model system for research in tomato (Meissner et al., 1997). Money maker is an
English variety bred for growing in greenhouses. Plants were grown in a greenhouse for 4 months,
watered and fertilized by a timer-controlled drop irrigation system.
For the preparation of the hydrophilic and lipophilic fractions, 3 g and 30 g of tomato fruit
were used from Micro Tom and Money maker, respectively. Extracts were prepared according to
the procedure described in Lavelli et al. (Lavelli et al., 2000 and 2001).
Estrogenic/antiestrogenic activity
Estrogenic/antiestrogenic activity of tomato samples was tested using the Saccharomyces
cerevisiae yeast strain (RMY326 ER-ERE) containing the human estrogen receptor α (hERα) and a
Xenopus laevis vitellogenin ERE sequence linked to a lacZ reporter gene encoding for the enzyme
β-galactosidase (Liu et al., 1999). The induction of transcription of the reporter gene by the complex
receptor-ligand was detected and quantified by spectrophotometry. The yeast method is described in
detail elsewhere (Pinto et al., 2004, Garritano et al., 2006).
Briefly, for estrogenic activity, yeast cultures were incubated overnight in the presence of 10
nM E2 (positive control), vehicle (negative control) and increasing concentrations of tomato extracts
alone. Estrogenicity is expressed as percent of the β-gal activity obtained with 17 β-estradiol (E2).
To test for antiestrogenic activity, cells were cotreated overnight in the presence of 1 nM 17estradiol and extracts. A yeast culture containing 1 nM E2 alone was used as a positive control. The
antagonistic activity, defined as the ability of the extracts to antagonize the binding of the natural
hormone to its receptor and to induce a dose-dependent decrease in β-gal expression, is expressed as
inhibition (%) of E2 activity induced by each sample.
The drug tamoxifen (4-OHT, Sigma Aldrich, Milan, Italy), which acts as an E2 antagonist in
yeast (Liu et al, 1999; Okamoto et al 2006) was used as a positive control of antiestrogenicity and
tested at a dose alone. Lycopene (L9879 Sigma-Aldrich, s.r.l. Milano), one of the most
representative carotenoids contained in tomato fruit, was tested from 10 -9 M to 10-4 M. Stock
solutions of E2, 4-OHT, and samples were prepared in DMSO (DMSO:H2O, 1:1 for HE samples)
and added to the yeast culture so that the concentration of solvent did not exceed 1% (v/v). Samples
were tested from 0.001to 1.0 mg/ml. The results are the mean of at least three independent
experiments ± SD.
Statistical analysis
Analysis of variance (ANOVA) was performed on SPSS 11.0 software (SPSS Inc., Chicago,
IL, USA), after the necessary transformations, and differences between means were determined by
appropriate test. Tukey B procedure was used for comparing means. Estrogenic/antiestrogenic
activity was measured by first order regression analysis, and each activity was considered
significant when it reached, at the maximum dose tested, at least a 20% increase or a 40% decrease,
respectively.
258
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Results and discussion
All the samples exhibited very low estrogenic activity. The LE of both tomato varieties
showed the highest estrogenic action (6.9% ± 0.4 or 10.3% ± 1.9 of E 2 for Micro Tom and Money
maker, respectively).
The antagonistic action of tomato fruit extracts is shown in Figure 1. Both LE (panel A) and
HE (panel B) significantly (p<0.0001) inhibited the activity of E2 in a dose-dependent manner. At
the highest concentrations tested (1 mg/ml), the LE of Micro Tom cultivar induced a 60% inhibition
of the activity induced by E2, while for Money maker a 40% decrease in the E2 activity was
observed.
For both varieties, the activity expressed by the LE was characterized by an exponential doseresponse relationship and, on the whole, it was higher than the activity induced by HE (p<0.05),
even though the effect was more evident for Micro Tom cultivar.
The higher inhibitory action induced by the LE could be in relation to the distribution of
compounds able to bind the ER, such as flavonoids and lycopene, in the tomato peel. In fact, the
main flavonoids of tomato, naringenin-calcone and rutin, (Slimestad et al., 2008) are mainly
contained (98%) in the skin (Stewart et al., 2000, Verhoeyen et al., 2002, Le Gall et al., 2003), and
therefore in the LE (Lavelli et al., 2001), as well as other compounds of a lipophilic nature (e.g.
carotenoids).
At the highest concentrations tested, a significant promotion of yeast cell proliferation was
observed, in particular for the HE (188% vs 141% growth compared to control for Micro Tom and
Money maker, respectively).
Micro Tom
Relative β-gal activity (%ofi 1 nM E2)
A
Money maker
100
80
60
40
20
0.0001
0.001
0.01
Concentration, mg/ml
259
0.1
1
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Relative β-gal activity (%ofi 1 nM E2)
Micro Tom
100
Money maker
4-OHT
B
80
60
40
20
0.000387
0.001
0.01
0.1
1
Concentration, mg/ml
Figure 1 Inhibitory effect of the lypophylic (LE) and hydrophilic (HE) extract of tomato fruits and
4-OHT on the β-gal activity induced by E2. The activity of the extracts is expressed as percent of
the activity induced by 1nM estradiol. Values represent the mean ± SD.
The agonistic/antagonistic activity of lycopene in the YES test is shown in Figure 2. In the
concentration range tested, lycopene was not estrogenic (maximum β-gal activity, 4.1% ± 1.5 of
E2). When cotreated with 1 nM E 2, this compound showed a dose-dependent inhibition of the
estrogenic activity of E2. At the highest dose tested (10-4 M, corresponding to 0.05 mg/ml of
lycopene), E2 activity was decreased of 47.7%. These results confirm the E 2-antagonistic effect of
lycopene in in vitro tests as reported in the literature (Fornelli et al., 2007, Hirsch et al., 2007).
260
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
antiestrogenicity
estrogenicity
Relative β-gal avtivity (% of 1nM E2)
100
80
60
40
20
0
1E-10
1E-09
-9
10
1E-08
-8
10
0.0000001
0.000001
-7
-6
10
10
0.00001
-5
10
0.0001
-4
10
0.001
Concentration, M
Figure 2 Estrogenic and antiestrogenic activity of lycopene in the YES assay
Conclusions
Tomato fruits, largely cultivated in Europe and worldwide, is actually consider a highly
valuable and nutritious food, due to its high content in antioxidant compounds and nutraceutical
molecules. Consumption of tomato and tomato products is thus being considered a nutritional
indicator of good dietary habits and healthy life style. Identification, quantitation, and biological
properties of tomato constituents in tomatoes and tomato-based products have been largely studied
in recent years, but nothing is known about the estrogen-like properties of this fruit. The main
contribution of this study is that extracts of tomato S. lycopersicum L. of two different varieties
show a low estrogenic activity but significantly inhibit estrogen action of E 2 in an in vitro ER-based
reporter gene assay. The inhibitory effect may vary depending on the dose, type of extract and
cultivar. It also confirm the inhibitory effect of lycopene in in vitro tests.
Finally, the relatively higher antiestrogenic activity observed for the lipophilic fraction of
Micro Tom variety seems to agree with data of the literature indicating that smaller tomato cultivars
have higher antioxidant activity, total phenolic content and flavonoid concentration than larger
varieties. This could be related to the higher surface/volume ratio of smaller cultivars (Toor et al.,
2005).
We believe that this short preliminary contribution may provide further interesting
information on the biological properties, namely the estrogenic and antiestrogenic activities of
tomato fruits, useful for more detailed studies on this important diet constituent.
Acknowledgment
This study is part of the Research Project “Beneficial soil microbes as tool for reducing chemical
inputs and improving food quality and safety” (MICROSAFE) supported by the University of Pisa.
Coordinator: Prof. Manuela Giovannetti, Dipartimento di Biologia delle Piante Agrarie, University
of Pisa.
261
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
References
BOUHLEL, I. - SKANDRANI, I. - NEFATTI, A. - VALENTI, K. - GHEDIRA, K. - MARIOTTE,
A.M. - HININGER-FAVIER, I. - LAPORTE, F. - DIJOUX-FRANCA, M.G. - CHEKIRGHEDIRA, L. 2009. Antigenotoxic and antioxidant activities of isorhamnetin 3-O
neohesperidoside from Acacia salicina. In Drug Chem. Toxicol., vol. 32, 2009, p. 258-267.
CARRATÙ, B. - SANZINI, E. 2005. Sostanze biologicamente attive presenti negli alimenti di
origine vegetale. In Ann. Ist. Super. Sanità, vol. 41, 2005, p. 7-16.
COLLINS, B.M. - MCLACHLAN, J.A. - ARNOLD, S.F. 1997. The estrogenic and antiestrogenic
activities of phytochemicals with the human receptor expressed in yeast. In Steroids, vol. 62, 1997,
p. 365-372.
D‟INCALCI, M. - STEWARD, W.P. - GESCHER, AJ. 2005. Use of cancer chemiopreventive
phytochemicals as antineoplastic agents. In Lancet Oncol., vol. 6, 2005, p. 899-904.
DORGAN, J.F. - SOWELL, A. - SWANSON, C.A. - POTISCHMAN, N. - MILLER, R. SCHUSSLER, N. - STEPHENSON, JR. H.E. 1998. Relationship of serum carotenoids, retinal, αtocopherol and selenium with breast cancer risk: results from a prospective study in Columbia,
Missouri (United States). In Cancer Causes Control, vol. 9, 1998, p. 89–97.
FORNELLI, F. - LEONE, A. - VERDESCA, I. - MINERVINI, F. - ZACHEO, G. 2007. The
influence of lycopene on the proliferation of human breast cell line (MCF-7). In Toxicology in vitro,
vol. 21, 2007, p. 217-223.
GARRITANO, S. - PINTO, B. - CALDERISI, M. - CIRILLO, T. - AMODIO-COCCHIERI, R. REALI, D. 2006. Estrogen-like activity of seafood related to environmental chemical contaminants.
In Environ. Health, 2006, p. 5-9.
HAN, D.H. - DENISON, M.S. - TACHIBANA, H. - YAMADA, K. 2002. Relation between
estrogen receptor-binding and estrogenic activities of environmental estrogens and suppression by
flavonoids. In Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 66, 2002, suppl. 7, p. 1479-1487.
HELMJA, K. - VAHER, M. - GORBATŃOVA, J. - KALJURAND, M. 2007. Characterization of
bioactive compounds contained in vegetables of the Solanaceae family by capillary
electrophoresis. In Proc. Estonian Acad. Sci. Chem., vol. 56, 2007, suppl. 4, p. 172–186.
HIRSCH, K. - ATZMON, A. - DANILENKO, M. - LEVY, J. - SHARONI, Y. 2007. Lycopene and
other carotenoids inhibit estrogenic activity of 17beta-estradiol and genistein in cancer cells. In
Breast Cancer Res. Treat., vol. 104, 2007 suppl.2, p. 221-230.
INDAP, M.A. - RADHIKA, S. - MOTIWALE, L. - RAO, K.V.K. 2006. Quercetin: antitumor
activity and pharmacological manipulations for increased therapeutic gains. In Indian J. Pharm.
Sci., vol. 68, 2006, p. 456-469.
LAUTRAITE, S. - MUSONDA, A.C. - DOEHMER, J. - EDWARDS, G.O. - CHIPMAN, J.K.
2002. Flavonoids inhibit genetic toxicity produced by carcinogens in cells expressing CYP1A2 and
CYP1A1 In Mutagenesis, vol. 17, 2002, p. 45-53.
LAVELLI, V. - PERI, C. - RIZZOLO, A. 2000. Antioxidant activity of tomato products as studied
by model reactions using xanthine oxidase, myeloperoxidase, and copper-induced lipid
peroxidation. In J. Agric. Food Chem., vol. 48, 2000, p. 1442-1448.
LAVELLI, V. - HIPPELI ,S. - DORNISCH, K. - PERI, C. - ELSTNER, E.F. 2001. Properties of
tomato powders as additives for food fortification and stabilization. In J. Agric. Food Chem., vol.
49, 2001, suppl. 4, p. 2037-2042.
LE GALL, G. - DUPONT, M.S. - MELLON, F.A. - DAVIS, A.L. - COLLINS, G.J. VERHOEYEN, M.E. - COLQUHOUN, I.J. 2003. Characterization and content of flavonoid
glycosides in genetically modified tomato (Lycopersicon esculentum) fruits. In J. Agric. Food
Chem., vol. 51, 2003, suppl. 9, p. 2438-2446.
262
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
LENUCCI, M.S. - CADINU, D. - TAURINO, M. - PIRO, G. - DALESSANDRO, G. 2006.
Antioxidant Composition in Cherry and High-Pigment Tomato Cultivars. In J. Agric. Food Chem.,
vol. 54, 2006, p. 2606-2613.
LIU, J.W. - JEANNIN, E. - PICARD, D. 1999. The anti-estrogen hydroxytamoxifen is a potent
antagonist in a novel yeast System. In Biol. Chem., vol. 380, 1999, p. 341-345.
MAGGIOLINI, M. - BONOFIGLIO, D. - MARSICO, S. - PANNO, M.L. - CENNI, B. - PICARD,
D. - ANDÕ, S. 2001. Estrogen receptor alpha mediates the proliferative but not the cytotoxic dosedependent effects of two major phytoestrogens on human breast cancer cells. In Mol. Pharmacol.,
vol. 60, 2001, p. 595-602.
MARTINEZ-GONZALEZ, M.A. - BES-RASTROLLO, M. - SERRA-MAJEM, L. - LAIRON, D. ESTRUCH, R. - TRICHOPOULOU, A. 2009. Mediterranean food pattern and the primary
prevention of chronic disease: recent developments. In Nutr. Rev., vol. 67, 2009, suppl. 1, p. 51115116.
MEISSNER, R. - JACOBSON, Y. - MELAMED, S. - LEVYATUV, S. - SHALEV, G. - ASHRI, A.
- ELKIND, Y. - LEVY, A.A. 1997. A new model system for tomato genetics. In The Plant Journal,
vol. 12, 1991, p. 1465–1472.
MOON, Y.J. - WANG, X. - MORRIS, M.E. 2006. Dietary flavonoids: Effects on xenobiotic and
carcinogen metabolism. In Toxicology in Vitro, vol. 20, 2006, p. 187–210.
OKAMOTO, Y. - SUZUKI, A. - UEDA, K. - ITO, C. - ITOIGAWA, M. - FURUKAWA, H. NISHIHARA, T. - KOJIMA, N. 2006. Anti-estrogenic activity of prenylated isoflavones from
Milletia pachycarpa: implications for pharmacophores and unique mechanisms. In J. Health Sci.,
vol. 52, 2006, p. 186-191.
PINTO, B. - PICARD, D. - REALI, D. 2004. A recombinant yeast strain as a short term bioassay to
assess estrogen-like activity of xenobiotics. In Ann. Ig., vol. 16, 2004, p. 579-585.
RAMOS, S. 2007. Effects of dietary flavonoids on apoptotic pathways related to cancer
chemoprevention. In J. Nutr. Biochem., vol. 18, 2007, p. 427-442.
SLIMESTAD, R. - FOSSEN, T. - VERHEUL, M.J. 2008. The flavonoids of tomatoes. In J. Agric.
Food Chem., vol. 56, 2008, suppl. 7, p. 2436-2441.
STEWART, A.J. - BOZONNET, S. - MULLEN, W. - JENKINS, G.I. - LEAN, M.E. - CROZIER,
A. 2000. Occurrence of flavonols in tomatoes and tomato-based products. In J. Agric. Food Chem.,
vol. 48, 2000, suppl. 7, p. 2663-2669.
TOOR, R.K. - LISTER, C.E. - SAVAGE, G.P. 2005. Antioxidant activities of New Zealand-grown
tomatoes. In Int. J. Food Sci.Nutr., vol. 56, 2005, suppl. 8, p. 597-605.
TURNER, J.V. - AGATONOVIC-KUSTRIN, S. - GLASS, B.D. 2007. Molecular Aspects of
Phytoestrogen Selective Binding at Estrogen Receptors. In J. Pharmaceutical Sci., vol. 96, 2007, p.
1879-1885.
VERHOEYEN, M.E. - BOVY, A. - COLLINS, G. - MUIR, S. - ROBINSON, S. - DEVOS, C.H.R.
- COLLIVER, S. 2002. Increasing antioxidant levels in tomatoes through modification of the
flavonoid biosynthetic pathway. In J. Experimental Bot., vol. 53, 2002, p. 2099-2106.
Contact address
Dr. Barbara Pinto, Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche, Infettivologia
ed Epidemiologia, University of Pisa, Via Roma, 55 – 56127 – Pisa:
 [email protected]
263
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
THE STEP ONE REAL-TIME PCR FOR DETECTION OF SALMONELLA SPP.,
SALMONELLA ENTERICA SER. TYPHIMURIUM AND ENTERITIDIS IN AXILLA
OF CHICKENS
POCHOP Jaroslav, KAČÁNIOVÁ Miroslava, HLEBA Lukáń, NOVÁKOVÁ Ivana,
KUNOVÁ Simona *
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Katedra Mikrobiológie, Katedra hygieny a
bezpeĉnosti potravín, Tr. Andreja Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
*
Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Katedra hygieny a bezpeĉnosti potravín, Tr.
Andreja Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
Abstract
The aim of this study was follow the contamination of axilla of live chickens with Salmonella spp.
by using the Step One real-time PCR. Detection of food-borne pathogens using conventional culture
techniques takes up to 5 days to get a result. This includes primary and secondary enrichment and
serological confirmation of colonies grown on agar plates. We used the PrepSEQ Rapid Spin
Sample Preparation Kit for isolation of DNA and MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit for
pursuance the real-time PCR (Applied Biosystems). The samples were obtained by taking swabs
from axilly of live chickens. In the investigated samples before incubation we could detect strain of
Salmonella spp. in three out of five swabs, as well as internal positive control (IPC), which was
positive in all samples. In the samples after 16 hours incubation we could detect strain of
Salmonella spp. in samples, as well as internal positive control (IPC), which was positive in all
samples. This Step One real-time PCR assay is extremely useful for any laboratory in possession of
a real time PCR. It is a fast, reproducible, simple, specific and sensitive way to detect nucleic acids,
which could be used in clinical diagnostic tests in the future.
Key words: Salmonella spp., real-time PCR, chicken axilla
Introduction
Salmonella is one of the most prevalent foodborne pathogens and infects over 160, 000
individuals in the EU annually, with an incidence rate of 35 cases per 100,000 (Anonymous, 2007).
Salmonella testing in the slaughter environment is important as intestinal pathogens are carried into
the abattoir in the bowels and on the skin of the animals (Wray, 2000).
Salmonellosis, caused by infection with bacteria from the genus Salmonella, is one of the
most common foodborne illnesses and is manifested by diarrhea, mild fever, nausea, and abdominal
pains, with the symptoms developing in 12–72 hours after consumption of contaminated food. In
extreme cases it can also lead to death (Abubakar et al., 2007).
Meat, including poultry, is one of the major sources of human Salmonella infection (Denny et
al., 2007; Foley et al., 2008), and therefore, efficient and rapid monitoring of Salmonella in the
poultry production chain is necessary (Carrique-Mas and Davies, 2008).
Classical microbiological methods for detection of foodborne bacteria involve the use of preenrichment and/or specific enrichment, followed by the isolation of the bacteria in solid media and a
final confirmation by biochemical and/or serological tests (Rodriguez-Lazaro et al., 2007).
Determining bacterial viability is a key issue for the application of food risk management;
thus a rational approach for detecting only viable bacterial cells by using molecular-based methods
is necessary. However, the PCR does not distinguish among viable and dead bacterial cells. DNA
264
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
from bacterial dead cells can serve as a template for the PCR many days after cell viability has been
lost (Allmann et al., 1995; Rodriguez-Lazaro et al., 2006a).
Material and Methods
The samples were obtained by taking swabs from axilla of live chickens. After the taking of
the samples, we were advanced as shown in the Scheme 1.
Scheme 1 Progress after taking the samples
Sample (swab from axilla of chicken)
TM
(PrepSEQ
Isolation of DNA
Incubation on SS agar
Rapid Spin Sample Preparation Kit) (Salmonella Shigella Agar, 37 °C, 16 h)
Isolation of DNA
(PrepSEQTM Rapid Spin Sample Preparation Kit)
Pursuance Real Time PCR
(MicroSEQ Salmonella spp. Detection Kit)
Bacterial strains and DNA extraction
As a pre-preparation step for the Step One real-time PCR, DNA extraction was performed
using DNA extraction method: PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit (Applied Biosystems).
General sample preparation protocol
Load 750 μl of sample onto the spin column and cap the column. Microcentrifuge for 3 min
at max speed. Aspirate, then discard the supernatant. Add 50 μl of Lysis Buffer to the pellet.
Resuspend by pipetting up and down, or vortex until the pellet is resuspended. Cap the tube, then
incubate at 95 °C for 10 min. Allow the sample to cool for 2 min at room temp. Microcentrifuge for
1 min at max speed. Add 250 μl of water. Microcentrifuge for 1 min at max speed. Proceed with
PCR, or store the tube at –20 °C.
MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit
We used 8-tube strips containing assay beads compatible with StepOne™ Systems. For 8tube strips with seven or fewer reactions, add additional empty tubes as needed so that each strip
contains a full set of 8 tubes. Add empty tubes as needed. Cap the tubes, sealing each tube with the
transparent optical strip caps provided in the kit. Cap the tubes with the strip caps using the
MicroAmp® 48-Well Base and the MicroAmp® Cap Installing Tool (Handle) to avoid collapsing,
bending, or misaligning the tubes. Confirm that the strips are straight and that each tube is in line
with the adjacent tube. Make sure reactions are thoroughly mixed. Make sure reagents are at the
bottom of the tubes. If available, spin down the tube contents at 2000 × g for 20 seconds using a
centrifuge with a plate adapter. Place the MicroAmp® Fast 48-Well Tray on the sample block of the
StepOne System. Load the 8-tube strips horizontally. For example, in Row C, load an 8-tube strip
across columns 1 through 8. A minimum of one 8-tube strip is recommended. It is not necessary to
balance the tube strips on the tray.
265
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Results and Discussion
In the investigated samples before incubation we could detect strain of Salmonella spp. in
three out of five samples (swabs), as well as internal positive control (IPC), which was positive in
all samples, as shown in Graph 1. The real-time PCR performed for 40 cycles of 32 minutes.
Graph 1 Process Real Time PCR
In the samples after 16 hours incubation we could detect strain of Salmonella spp. in samples,
as well as internal positive control (IPC), which was positive in all samples, as shown in Graph 2.
Graph 2 Process Real Time PCR
The multiplex real-time PCR developed in this study was the first to detected all Salmonella
spp. possibly related with meats and to differentiate simultaneously S. Typhimurium from S.
266
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
Enteritidis in meats. Previously, real-time PCR assays had been applied for Salmonella spp. and
other food-borne pathogens (Malorny et al., 2004; Rossmanith et al., 2006; Sails et al., 2003).
Although there has been a fall in the number of human Salmonella infections in Europe over
the past number of years (Anonymous, 2007), foodborne infection from Salmonella continues to
pose a great risk to public health. It is widely believed that pathogen reduction in animals, efficient
Quality Control Systems (e.g. HACCP principles and GHP) and Quality Assurance (QA) at all
stages of the food chain from „„farm to fork” is the most effective way to prevent the spread of
infection via food (Anonymous, 2003).
Possible biological contaminants such as blood and fats present on animal carcasses which
can cause PCR inhibition are also diluted. The bacterial cell pellet was washed in PBS prior to DNA
isolation to reduce the concentration of enrichment medium which may also cause PCR inhibition
(Rodriguez-Lazaro & Hernandez, 2006b).
Whereas most of the target genes used for PCR detection of foodborne pathogens encode
proteins involved in virulence and were identified as the result of many years of work involving
gene/protein structure–function studies, the progress in computational genomics has led the way to
more efficient and customized mining of genomes for species-specific nucleotide sequences.
Several software packages for such data mining have been developed based upon sequence
alignment (Lu et al., 2006; Yao et al., 2007).
Conclusion
This Step One real-time PCR assay is extremely useful for any laboratory in possession of
a real time PCR. It is a fast, reproducible, simple, specific and sensitive way to detect nucleic acids,
which could be used in clinical diagnostic tests in the future.
Acknowledgement
This work was funded by Grant Agency KEGA 430-014SPU-4/2010, VEGA 1/0372/09 and
APVV-VMSP-P-0057-09.
References
ABUBAKAR, I. - IRVINE, L. - ALDUS, C.F. - WYATT, G.M. - FORDHAM, R. - SCHELENZ,
S. - SHEPSTONE, L. - HOWE, A. - PECK, M. - HUNTER, P.R. 2007. A systematic review of the
clinical, public health and cost-effectiveness of rapid diagnostic tests for the detection and
identification of bacterial intestinal pathogens in faeces and food. In Health Technol. Assess. vol.
11, 2007, p. 1–216.
ALLMANN, M. - HOFELEIN, C. - KOPPEL, E. - LUTHY, J. - MEYER, R. - NIEDERHAUSER,
C. - WEGMULLER, B. - CANDRIAN, U. 1995. Polymerase chain reaction (PCR) for detection of
pathogenic microorganisms in bacteriological monitoring of dairy products. In Res. Microbiol. vol.
146, 1995, p. 85–97.
ANONYMOUS, 2003. Regulation (EC) 2160/2003 of the European Parliament and of the Council
of 17 November 2003 on the control of Salmonella and other specified food-borne zoonotic agents.
ANONYMOUS, 2007. The community summary report on trends and sources of zoonoses,
zoonotic agents, antimicrobial resistance and foodborne outbreaks in the European Union in 2006.
In The EFSA Journal, vol. 130, 2007, p. 1–352.
CARRIQUE-MAS, J.J. - DAVIES, R.H. 2008. Sampling and bacteriological detection of
Salmonella in poultry and poultry premises: a review. In Rev. Sci. Technol. vol. 27, 2008, p. 665–
677.
267
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
DENNY, J. - BOELAERT, F. - BORCK, B. - HEUER, O.E. - AMMON, A. - MAKELA, P. 2007.
Zoonotic infections in Europe: trends and figures a summary of the EFSA-ECDC annual report. In
Eur. Surveill. vol. 12, 2007, p. 3336.
FOLEY, S.L. - LYNNE, A.M. - NAYAK, R. 2008. Salmonella challenges: prevalence in swine and
poultry and potential pathogenicity of such isolates. In J. Anim. Sci. vol. 86, 2008, p. 149–162.
LU, G. - JIANG, L. - HELIKAR, R.M. - ROWLEY, T.W. - ZHANG, L. - CHEN, X. MORIYAMA, E.N. 2006. GenomeBlast: a web tool for small genome comparison. In BMC
Bioinformatics 7, 2006, p. 18.
MALORNY, B. - PACCASSONI, E. - FACH, P. - BUNGE, C. - MARTIN, A. - HELMUTH, R.
2004. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. In Appl. Environ. Microbiol.,
vol. 70, 2004, p. 7046-7052.
RODRIGUEZ-LAZARO, D. - HERNANDEZ, M. - D‟AGOSTINO, M. - COOK, N. 2006a.
Application of nucleic acid sequence based amplification (NASBA) for the detection of viable
foodborne pathogens: progress and challenges. In J. Rapid Methods Autom. Microbiol. vol. 14,
2006, p. 218–236.
RODRIGUEZ-LAZARO, D. - HERNANDEZ, M. 2006b. Molecular methodology in food
microbiology diagnostics: Trends and current challenges. In IUFoST: IUFoST World Congress.
2006, p. 1085–1099.
RODRIGUEZ-LAZARO, D. - LOMBARD, B. - SMITH, H. - RZEZUTKA, A. - D‟AGOSTINO,
M. - HELMUTH, R. - SCHROETER, A. - MALORNY, B. - MIKO, A. - GUERRA, B. DAVISON, J. - KOBILINSKY, A. - HERNÁNDEZ, M. - BERTHEAU, Y. - COOK, N. 2007.
Trends in analytical methodology in food safety and quality: monitoring microorganisms and
genetically modified organisms. In Trends Food Sci. Technol. vol. 18, 2007, p. 306–319.
ROSSMANITH, P. - KRASSNIG, M. - WAGNER, M. - HEIN, I. 2006. Detection of Listeria
monocytogenes in food using a combined enrichment/real-time PCR method targeting the prfA
gene. In Res. Microbiol., vol. 157, 2006, p. 763-771.
SAILS, A. D. - FOX, A. J. - BOLTON, F. J. - WAREING, D. R. - GREENWAY, D. L. 2003. A
real-time PCR assay for the detection of Campylobacter jejuni in foods after enrichment culture. In
Appl. Environ. Microbiol., vol. 69, 2003, p. 1383-1390.
WRAY, A. 2000. Salmonella in domestic animals. In CABI.
YAO, J. - LIN, H. - DODDAPANENI, H. - CIVEROLO, E.L. 2007. nWayComp: a genome-wide
sequence comparison tool for multiple strains/species of phylogenetically related microorganisms.
In Silico Biol. vol. 7, 2007, p. 195–200.
Contact address
Ing. Jaroslav Pochop
Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska
univerzita, Tr. A. Hlinku 2, 949 76 Nitra, Slovakia
 [email protected]
268
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
EFFECT OF GLYCEROL SUPPLEMENTATION ON BLOOD BIOCHEMICAL
PARAMETERS IN EWES
QOJA Abdulhadi, ŃTASTNÝ Pavel
Department of Veterinary Sciences, Faculty of Agrobiology and Food Resurces, Slovak University
of Agriculture, Trieda Andreja Hlinku 2, SK 94976, Nitra, Slovak Republic
Abstract
The study evaluated the effect of glycerol as energy supplement in nutrition of cross-bred ewes
(IDF X MERINO) in breeding season on some blood biochemical parameters. Forty eight ewes (5-7
years old, 62-75 kg body weight) were selected and divided randomly into 4 groups of 12 ewes each
in a completely randomized design. The animals of trial were fed on corn silage (0.5 kg\day\ewe),
meadow hay (0.8 kg\day\ewe) and alfalfa hay (0.4 kg\day\ewe). The treatments were: groups 1st, 2nd
and 3rd with150, 100 and 50 ml glycerol\ewe\day respectively that provided diluents with water (5
litter\ewe\day), and 4th group (control) without glycerol. Using of glycerol as energy supplement
effected significantly (P<0.05) on, ALP that increased in1st group for both stages of experiment and
urea that decreased in 2 nd and 1st groups of both stages (start and end) of breading season
respectively, while glycerol supply effected insignificantly (P<0.05) on ALT and AST that
increased in 1st group at the start of breading season for both enzymes. Total protein affected by
glycerol insignificantly (P<0.05) that recorded a higher values in 2 nd and 1st groups at the start and
the end of experiment respectively, whereas glucose decreased insignificantly (P<0.05) in2 nd and 1st
groups of respective stages (start and end) of breading season. While glycerol effected
insignificantly (P<0.05) on cholesterol and triglyceride that increased in, 3rd and 1st groups of two
stages of experiment for cholesterol, and 3rd group of both stages of breading season for
triglyceride. Generally, ALT, AST, total protein, cholesterol and triglyceride were increased and
ALP was decreased at the end of breading season (pregnancy period) groups comparison with
respective groups at the start of experiment. It could be concluded that using of glycerol as energy
supplement (30%) could changed biochemical profile in ewes that indicate to providing a good
nutrition, especially energy that is affected during pregnancy (at the end of breading season).
Keywords: Glycerol, nutrition, biochemical parameters, blood, ewes
Introduction
Glycerol is a chemical compound also commonly called glycerin or glycerine. It is a 10% byproduct of biodiesel production (via the transesterification of vegetable oils or animal fats). In
general, the oil or fat is mixed with an alcohol, usually methanol, and a catalysts process decreased
(often sodium hydroxide) that causes triglycerides to separate, forming methyl esters (biodiesel) and
crude glycerol. Crude glycerol is the principal co-product of biodiesel production (Ma and Hanna
1999; Gerpen 2005).Glycerol is also used as a sugar substitute. As a food additive, glycerol is also
known as E number E422. Crude glycerol is the principal co-product of biodiesel production
(Thompson and He 2006) and has been proposed as a potential beneficial energy source for pigs
(Lammers et al. 2008a) and poultry (Dozier et al. 2008; Lammers et al., 2008b). Crude glycerol
may play a role in the pig industry by supplying energy because it can realized more effective
price than competing energy ingredients; however, a shadow-pricing exercise is necessary to
ascertain whether glycerol can be economically included in current diets (Hansen et al., 2009). The
cost of glycerol made it less economically feasible as a treatment for ketosis compared with
propylene glycol. More recently, surplus production of glycerin (or glycerol) from biodiesel fuel
269
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
production has made various forms of glycerin an attractive glucogenic substrate for feeding
livestock (Chung et al., 2007). Wang et al. (2009) indicate that glycerol supplementation potentially
improves rumen fermentation with increased propionate production and feed digestibility in the
total digestive tract of beef cattle.
Although glycerin is generally recognized as safe for use in animal feed (FDA, 2006), but
there is little information available on glycerol feeding rates and production responses in sheep. The
objective of this experiment to determine the effect of glycerol as an energy supplement in nutrition
on some blood biochemical parameters in ewes.
Materials and methods
This experiment was carried out at the schools farm of Slovak University of Agriculture in
Nitra (SUA). 48 (IDF X MERINO) cross-bred ewes (5-7 years old) with a body weight range from
62-75 kg were assigned randomly into four equal groups (each group 12 ewes). In this experiment
we investigated the effect of Glycerol supplementation in nutrition on some blood biochemical
parameters of ewes in breeding season. The animals of trial were fed on corn silage (0.5
kg/day/ewe), meadow hay (0.8 kg/day/ewe) and alfalfa hay (0.4 kg/day/ewe). The treatments were:
groups 1st, 2nd and 3rd with 150 ml (30%), 100ml (20%) and 50 ml (10%) dry matter energy of
glycerol/ewe/day respectively that provided diluents with water (5 litter/ewe/day), and 4th group
(control) without glycerol. The level of energy that contents a feed ration by NRC, 2007 in
requirement for ewes was given one month before the breeding season (flushing) to each of animal
groups. Animals were maintained at ambient temperature and natural day length in covered. Feed
rations were offered to all animals once at 08:00h that was analyzed for net energy, crud protein,
crud fiber and dry mater in Department of Animal Nutrition in Agrobiology and Food Resources
Faculty at the Slovak University of Agriculture in Nitra (SUA) (Table 1).
Blood samples were collected by jugular venipuncture from 48 ewes at the start and at the
end of experiment (breeding season). Blood samples were centrifuged at 3000 x rpm for 30 min,
serum was separated and stored frozen at -18 oC for subsequent analysis. Serum parameters
including alkaline phosphatase (ALP), alanine transferase (ALT), aspartate transferase (AST), total
protein, urea, glucose, cholesterol and triglyceride were determined. The various serum constituents
were analyzed spectrophotometrically (SCHOTT Instrument, Uviline 9400) using commercial
reagent kits (Bio LA TEST ®,PLIVA-Lachema Diagnostika, Czech Republic) The data were
analyzed statistically by using analysis of variance (ANOVA).The statistical differences between
means were estimated by Duncan‟s Multiple Range Test. The computation was facilitated by
software SPSS 11.5 for Windows® (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Table 1 Analysis of feed ration compounds
Corn silage
Meadow hay
Alfalfa hay
Glycerol
Net energy-MJ
6.15
4.46
4.67
13
Crud protein g\kg
9.16
9.5
20.58
Crud fiber %
21.53
33.0
25.7
Dry matter %
33.29
75.01
84.38
------
--------
--------
Results and discussion
According the results there are significant (P<0.05) differences between groups for ALP. In
the 1st group (30% glycerol) was significantly (P<0.05) higher than other groups at the start and end
of experiment. Generally ALP affected by glycerol that decreased significantly (P<0.05) in the end
of experiment (pregnancy period) comparison with groups of the start of experiment respectively
270
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
(table 2). This result disagree with Caldeira et al. (1999) that found lower ALP serum activity in
group fed 30% of theoretical maintenance energy requirements in ewes and the most striking event
observed for this variable, and agree with Klebaniuk et al. (2009) study that observed a significantly
higher activity of ALP enzyme in cows fed the glucogenic additive (calcium propionate and
propylene glycol mixture in loose form),while Sandabe et al. (2004) mentioned the pregnancy did
not induce any change (P<0.05) in ALP enzyme in Sahel goats. Although Soch et al. (2008) was
found a higher mean values for ALP in pregnant cows for more than 140 days. This could be
indicating that during pregnancy, the liver is not stressed (Sandabe et al., 2004), and was probably
caused by lower tares in bone metabolism and in phosphorylation and dephosphorylation reaction
(Caldeira et al., 1999).
At the ALT results, there were insignificant (P<0.05) differences between groups at the two
stages (start and end) of experiment that recorded a higher values in; 1 st group (30% glycerol) at the
start of experiment and in 3 rd group (10% glycerol) at the end of experiment. The comparison
between two stages of experiment, the results showed ALT in all groups was higher at the end of
experiment (pregnancy period) than respective groups in the start of experiment (table 2). Ozdogan
et al.,(2006) was found no statistically significant among treatment groups for ALT activity when
used tallow and cotton seed oil in fattening bulls, Klebaniuk et al., (2009) observed the average of
ALT activity immediately postpartum was approximately 30% higher than in the dry-off period,
and it increased slightly until week 6 of lactation. Then the glucogenic supplement did not exert any
significant impact on the activity of ALT enzyme in cows. While Cenesiz et al., (2006) observed no
differences between groups were determined in activity of serum ALT when supplemented barley
with urea molasses mineral blocks in lambs. The reason, changes that occur in enzyme activity are
considered to be as an indicator of the health of an organism, and liver is the terminal controlling
organ of the metabolism. By measuring the metabolic activity of liver, determination of functional
events could be estimated , and ALT is the specific enzyme of liver which is increased in the
plasma by destruction of cell-membrane and cell necrose in acute liver diseases Cenesiz et al.
(2006).
AST increased insignificantly (P<0.05) in 1st group (30% glycerol) for both stages (start and
end) of experiment. At the end of experiment groups AST was higher when compared with
respective groups in the start of experiment (table 2). Hoedemaker et al., (2004) was found no
significant effect of propylene glycol on the activity of AST in dairy cows. While Mikula et al.,
(2008) observed the lowest AST activity in all experimental groups was observed with statistically
significant differences (P<0.05) in comparison to control group, and in all groups, mean activity of
AST increased from 3rd week before calving to day 14 of lactation and then decreased to day 70 d
lactation in dairy cows fed propylene glycol supplementation. Higher AST activities at the end of
experiment (pregnancy period) groups could possibly be explained to impairment in some muscle
and liver cells due to rapid gluconeogenesis associated with pregnancy, this enzyme was found to
be involved in gluconeogenesis (Krebs, 1966).
There were insignificant (P<0.05) differences between groups for total protein in two stages
of experiment that recorded a higher values in; 2nd group (20% glycerol) at the start of experiment
and 1st group (30% glycerol) at the end of experiment. Total protein concentrations were increased
in the end of experiment (pregnancy period) groups comparison with respective groups at the start
of experiment (table 3). This result agree with Ozdogan et al., (2006) that observed differences for
serum concentration of total protein among treatment groups was not statistically significant. While
Caldeira et al., (1999) found significant variations (P<0.05) during the period around the meal when
ewes were fed three levels of feed. Piccione et al., (2009) was observed serum total protein increase
significantly during pregnancy in ewes. Total protein rise can be interpreted by the facts that the
fetus synthesizes all its proteins from the mother, and absolute growth of the fetus increases
271
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
exponentially reaching a maximum, especially in muscles during late gestation (Jainudeen and
Hafez, 1994).
Urea results indicate significantly (P<0.05) differences between groups at the start and end of
experiment that recorded a lower values in; 2nd group (20% glycerol) at the start of experiment and
1st group (30% glycerol) at the end of experiment. While urea in 2nd, 3rd and 4th groups increased at
the end of experiment comparison with respective groups at the start of experiment, but in 1 st group
was decreased in the end of experiment comparison with the same group at the start of experiment
(table 3). Sandabe et al., (2004) was found pregnancy did not induce any changes in urea. Indicating
that, during pregnancy the kidney is not stressed. Chiofalo, (2000) observed the addition of 80 g
ewe/d of propylene glycol into the diet decreased plasma urea (P<0.01) and this finding could be
attributed to a higher gluconegenesis.
Glucose affected by glycerol insignificantly (P<0.05) that recorded a lower values in; 2 nd
group (20% glycerol) at the start of experiment and 1st group (30% glycerol) at the end of
experiment. While glucose concentration at the end of experiment was decreased in 1 st, 3rd and 4th
groups when compared with respective groups at the start of experiment (table 3). Bodarski et al.
(2005) was found glucose concentration lower in group fed glycerin in comparison to other groups
in dairy cows, DeFrain et al. (2004) that mentioned no differences were detected for prepartum
concentrations of glucose, then feeding glycerol tended to decrease postpartum concentration of
glucose plasma of dairy cows, Mikula et al. (2008) observed that the blood glucose concentration
prepartum and postpartum was not significantly affected by glycol supplementation in dairy cows,
Firat and Ozpinar (1996) recorded plasma glucose levels to be lower in pregnant than in nonpregnant sheep. Could be metabolic pathway of glycerin is more effective for ruminants, from rest
of glycerin or propionic acids the glucose could be formed in liver. This way of glycerin changes to
glucose could be a better for ketosis prophylactics (Remond et al.,1993).
Cholesterol results indicate insignificantly (P<0.05) differences between groups in both
stages (start and end) of the experiment, which increased in; 3 rd group (10% glycerol) at the start of
experiment and 1 st group (30% glycerol) at the end of experiment. Generally we observed
cholesterol rise in the end of experiment (pregnancy period) groups comparison with respective
groups at the start of experiment (table 3). Chiofalo et al. (2000) observed plasma total cholesterol
was lower in propylene glycol groups during the prepartum period in ewes. Mohamed and AbouZeina (2008) reported there were no significant (P<0.05) differences among different experimental
groups concerning total cholesterol in goats used sugar beet pulp in dietary supplementation.
Mikula et al. (2008) found the mean cholesterol concentration in blood was decreased before
parturition in dairy cows. While Balikci et al. (2007) was found increase (P<0.05) in serum
cholesterol during pregnancy in Akkaraman ewes. This increase during pregnancy period may be
due to insulin, which plays a direct role in adipose tissue metabolism during pregnancy and its
responsiveness is significantly reduced in ewes during late pregnancy (Jainudeen and Hafez, 1994;
Schlumbohm et al., 1997). The diminished responsiveness of the target tissue to insulin during late
pregnancy predisposes the ewes to increase of cholesterol concentration (Schlumbohm et al., 1997).
Triglyceride affected by glycerol insignificantly (P<0.05) that recorded a higher and lower
values in 3rd group (10%glycerol) and 2 nd group (20% glycerol) respectively at the both stages of
experiment. Whereas triglyceride concentration increases in the end of experiment groups when
compared with respective groups at the start of experiment (table 3). This results agree with several
author (Mohamed and Abou-Zeina, 2008; Mikula et al., 2008; Balikci et al., 2007), and disagree
with Piccione et al. (2009) study that found triglyceride level was decreased significantly during
gestation in ewes. This increase during pregnancy period may be due to insulin, which plays a direct
role in adipose tissue metabolism during pregnancy and its responsiveness is significantly reduced
in ewes during late pregnancy, and the diminished responsiveness of the target tissue to insulin
272
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
during late pregnancy predisposes the ewes to increase of triglyceride concentration (Schlumbohm
et al., 1997).
Conclusions
Glycerol using as energy supplement (30%) supply in diet of ewes during breading season
was associated with positive and negative effect on metabolic parameters in the both part as start
and as end (pregnancy period) of breading season that could explain the; increase of ALP
significantly (P<0.05) in both stages of breading season, increased each of ALT and AST
insignificantly (P<0.05) in two stages of breading season, increased each of total protein and
cholesterol insignificantly (P<0.05) and decreased both of urea and glucose insignificantly
(P<0.05) at the end of breading season. AST, ALT, total protein, cholesterol and triglyceride at the
end of breading season (pregnancy period) groups were higher than respective groups at the start of
experiment but ALP was lower in pregnancy period groups. The data imply that addition (30%)
glycerol to the diet should be delivered as a drench in ewes and fed as a component of transition
ewes diets especially during breading season to improvement metabolic properties.
References
BALICKI, E. - YILDIZ, A. F. - GURDOGAN, F. 2007. Blood metabolite concentrations during
pregnancy and postpartum in Akkaraman ewes. In Small Ruminant Research, vol. 67, 2007, p. 247251.
BODARSKI, R. - WERTELECKI, T. - BOMMER, F. - GOSIEWSKI, S. 2005. The changes of
metabolic status and lactation performance in dairy cows under feeding TMR with glycerin
(glycerol) supplement at periparturient period. In Electron. J. Pol. Agric. Univ., Anim. Husb., vol. 8,
2005, p. 4.
CALDEIRA, R. M. - ALMEIRA, M. A. - SANTOS, C. C. - VASQUES, M. I. - VAZ PORTUGAL,
A. 1999. Daily variation in blood enzymes and metabolites in ewes under three levels of feed
intake. In Can. J. Anim. Sci., vol. 79, 1999, p. 157–164.
CENESIZ, S. - ATAKISI, O. - OZCAN, A. - YUCERYURT, R. - UNAL, Y. 2006. Effect of feed
supplemented with urea Molasses Mineral Blocks on Activity of Serum AST, ALT and Level of
Total Protein, Glucose, Triglyceride, Total Lipids, Total Cholesterol in Lambs. In Kafkas Univ. Vet.
Fak. Derg., vol. 12, 2006, no.2, p. 137-140.
CHIOFALO, V. 2000. Effect of propylene glycol addition to the diet of dairy ewes on metabolic
profile, milk yield and quality. In Options Mediterraneennes, Series A, vol. 74, 2000, p.395-398.
CHUNG, Y.H. - RICO, D. E. - MARTINEZ, C. M. - CASSIDY, T. W. - NOIROT, V. - AMES, A.
- VARGA, G. A. 2007. Effects of Feeding Dry Glycerin to Early Postpartum Holstein Dairy Cows
on Lactational Performance and Metabolic Profiles. In J. Dairy Sci., vol. 90, 2007, p.5682–5691.
DE FRAIN, J.M. - HIPPEN, A.R. - KALSCHEUR, K.F. - JARDON, P.W. 2004. Feeding glycerol
to transition dairy cows: Effects on blood metabolites and lactation performance. In J. Dairy Sci.,
vol. 87, 2004, p. 4195-4206.
DOZIER, W. A. - KERR, B.J. - CORZO, M.T. - KIDD, T.E. - WEBER, K. - BREGENDAHL, K.
2008. Apparent metabolizable energy of glycerin for broiler chickens. In Poultry Science, vol. 87,
2008, p. 317–322.
FDA. 2006. Code of Federal Regulations, 21 CFR 582.1320, Title 21, Vol 6., 2006.
21CFR582.1320.((http://edocket.access.gpo.gov/cfr_2002/aprqtr/21cfr582.1320. htm)).
FIRAT, A. - OZPINAR, A. 1996. The study of changes in some blood parameters (glucose, urea,
bilirubin, AST) during and after pregnancy in association with nutritional conditions and litter size
in ewes. In Tr. J. Vet. Anim. Sci., vol. 20, 1996, no. 5, p. 387-393.
GERPEN, J.V. 2005. Biodiesel processing and production. In Fuel Processing Technology, vol. 86,
2005, p. 1097–1107. Doi: 10.1016/j.fuproc.2004.11.005.
273
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
HANSEN, S. F. - HERNANDEZ, A. - MULLAN, B. P. - MOORE, K. - TREZONA-MURRAY,
M. - KING, R. H. - PLUSKE, J. R. 2009. A chemical analysis of samples of crude glycerol from the
production of biodiesel in Australia, and the effects of feeding crude glycerol to growing-finishing
pigs on performance, plasma metabolites and meat quality at slaughter. In Animal Production
Science, vol. 49, 2009, p. 154–161.
HOEDEMAKER, M. - PRANGE, D. - ZERBE, H. - FRANK, J. - DAXENBERGER, A. - MEYER,
H.H.D. 2004. Peripartal propylene glycol supplementation and metabolism, animal health, fertility
and production in dairy cows. In J. Dairy Sci., vol. 87, 2004, p. 2136-2145.
JAINUDEEN, M. R. - HAFEZ, E.S.E. 1994. Gestation, prenatal physiology and parturition. In:
Hafez, E. S.E. (Ed.) Reproduction in Farm Animals. Philadelphia: Lea& Febiger, 1994, p. 247-283.
KLEBANIUK, R. - MATRAS, J. - KOWALCZUK, E. 2009. Blood metabolic profile parameters of
cows fed diet with glucogenic additive. In Medycyna Wet., vol. 65, 2009, no. 11, p. 765-770.
KREBS, H. A. 1966. Bovine Ketosis. In Vet.Res., vol. 78, 1966, p.187-192.
LAMMERS, P.J. - KERR, B.J. - HONEYMAN, M.S. - STADLER, K. - DOZIER, W. A. WEBER, T.E. - KIDD, M.T. - BREGENDAHL, K. 2008b. Nitrogen-corrected apparent
metabolizable energy value of crude glycerol for laying hens. In Poultry Science, vol. 87, 2008b, p.
104–107.
LAMMERS, P.J. - KERR, B.J. - WEBER, T.E. - DOZIER, W.A. - KIDD, M.T. - BREGENDAHL,
K. - HONEYMAN, M.S. 2008a. Digestible and metabolizable energy of crude glycerol for growing
pigs. In Journal of Animal Science, vol. 86, 2008a, p. 602–608.
MA, F. - HANNA, M.A. 1999. Biodiesel production: a review. In Bioresource. Technology, vol.
70, 1999, p. 1–15. Doi: 10.1016/S0960-8524(99)00025-5.
MIKULA, R. - NOWAK, W. - JASKOWSKI, J. A. - MACKOWIAK, P. - PRUSZYNSKA, E. WLODARES, J. 2008. Effects of propylene glycol supplementation on blood biochemical
parameters in dairy cows. In Bull Vet. Inst. Pulawy, vol. 52, 2008, p.461-466.
MOHAMED, M. I. - ABOU-ZEINA, A. A. 2008. Effect of Dietary Supplementation with
Biologically Treated Sugar Beet Pulp Performance and Organs Function in Goat Kids. In AmericanEurasian J. Agric. & Environ. Sci., vol. 4, 2008, no. 4, p. 410-416.
NRC. 2007. Nutrient Requirement of Small Ruminants. Washington D. C.: The national academies
press. ISBN 13:978-0-309-10213.
OZDOGAN, M. - MATIN, K. - KARGIN, F. - BIRINCOGLU, B. - ONENC, A. 2006. The Effects
of Diets Containing Tallow and Cotton Seed Oil on Liver and Serum in Fattening Bulls. In Pakistan
Journal of Nutrition, vol. 5, 2006, no. 5, p. 492-496.
PICCIONE, G. - CAOLA, G. - GIANNETTO, C. - GRASSO, F. - RUNZO, S. C. - ZUMBO, A. PENNISI, P. 2009. Selected biochemical serum parameters in ewes during pregnancy, postparturition, lactation and dry period. In Animal Science Papers and Reports, vol. 27, 2009, no. 4,
p.321-330.
REMOND, B. - SOUDAY, E. - JOUANY, J.P. 1993. In vitro and in vivo fermentation of glycerol
by rumen microbes. In Anim. Feed Sci. Technol., vol. 41, 1993, p. 121-132.
SANDABE, U.K. - MUSTAPHA, A.R. - SAMBO, E.Y. 2004. Effect of Pregnancy on Some
Biochemical Parameters in Sahel Goat in Semi-arid Zones. In Veterinary Research Communication,
vol. 28, 2004, p.279-285.
SCHLIMBOHN, C. - SPORLEDER, H.P. - GURTLER, H. - HARMEYER, J. 1997. The influence
of insulin on metabolism of glucose, free fatty acids and glycerolin normo- and hypocalcaemic
ewes during different reproductive states. In Deutsch. Tierarztl. Wochenschr., vol. 104, 1997, p.
359–365.
SOCH, M. - PISEK, L. - BROUCEK, J. - KROUPOVA, P. - SIHLAVA, M. - STASTNA, J. 2008.
Activity of Alkaline Phosphatase in Cattle Blood Plasma According to Stage of Pregnancy.In
Slovak J. Anim. Sci., vol. 41, 2008, no. 1, p. 39-41.
274
13-th – 14 -th September 2010
X. Risk Factors of Food Chain
THOMPSON, J.C. - HE, B.B. 2006. Characterization of crude glycerol from biodiesel production
from multiple feedstocks. In Applied Engineering in Agriculture, vol. 22, 2006, p.261–265.
WANG, C. - LIU, Q. - HUO, W. J. - YANG, W. Z. - DONG, K. H. - HUANG, Y. X. GUO, G. 2009. Effect of glycerol on rumen fermentation, urinary excretion of purine
derivative and feed digestibility in steers. In Livestock Science, vol. 121, 2009, p.15-20.
Contact address
Abdulhadi Qoja
Department of Veterinary Sciences, Faculty of Agrobiology and Food Resurces, Slovak University
of Agriculture, Trieda Andreja Hlinku 2, SK 94976, Nitra, Slovak Republic
 [email protected]
275
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
Table 2 Glycerol effect on serum enzymes
ALP (µkat.L-1)
ALT (units.L-1)
Mean ± Std.
Group
1
Group
2
Group
3
Group
4
Contro
l
ab
Mean ± Std.
Mean ± Std.
Start of
Exp.
End of
Exp.
Start of
Exp.
End of
Exp.
Start of
Exp.
1.826±0.60
5
b
1.219±0.46
3
a
1.579±0.66
2
ab
1.591±0.59
2
b
0.983±0.39
7
a
1.270±0.65
8
ab
22.267±5.53
6
24.265±8.03
0
79.057±8.333
83.465±11.42
5
21.408±4.67
5
21.485±5.56
1
71.350±10.88
6
74.219±11.11
7
21.887±3.88
6
24.413±5.04
5
72.852±10.18
9
73.291±12.84
1
1.305±0.57
7
a
1.178±0.39
9
ab
21.431±4.20
7
22.901±5.70
7
78.733±12.86
4
81.313±18.46
4
End of Exp.
Means values with different superscripts within a column differ significantly (P<0.05)
Table 3 Glycerol effect on blood biochemical properties
Total Protein
Urea
(g.L-1)
(mmol.L-1)
Glucose(mm
Mean ± Std.
Mean ± Std.
ol.L-1)
Mean ± Std.
Start
of
Exp.
End of
Exp.
Start
of
Exp.
End
of
Exp.
Start
of
Exp.
Grou
p1
67.518±
5.960
70.980±1
1.493
5.098±
1.034
a
4.941±
0.802
a
3.131±
0.621
Grou
p2
67.799±
6.562
72.880±9
.493
4.749±
1.034
a
4.964±
1.135
a
3.069±
0.602
Grou
p3
64.326±
5.148
64.614±1
1.035
4.952±
0.792
a
5.091±
1.461
a
3.272±
0.886
64.789±
5.730
70.237±9
.597
6.081±
1.394
b
6.522±
1.979
b
Grou
p4,
Cont
rol
ab
AST (units.L-1)
3.538±
0.764
Cholesterol(
mmol.L-1)
Mean ± Std.
Triglyceride(
mmol.L-1)
Mean ± Std.
End
of
Exp.
Start
of
Exp.
End
of
Exp.
Start
of
Exp.
End of
Exp.
3.040±
0.844
1.151±0
.273
1.982±0
.522
0.239±0
.080
0.256±0.
125
3.293±
0.633
1.145±0
.192
1.815±0
.478
0.222±0
.105
0.243±0.
132
3.089±
0.627
1.165±0
.220
1.973±0
.359
0.240±0
.104
0.262±0.
117
3.198±
0.536
1.137±0
.299
1.704±0
.364
0.235±0
.069
0.249±0.
111
Means values with different superscripts within a column differ significantly (P<0.05)
276
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
THEORETICAL ASPECTS OF USING BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVES
IN FEED SUPPLY OF POPULATION IN RUSSIA
RYAZANOVA O.A., PIROGOVA O.O.
Russian state university of trade and economics, Kemerovo, Russia
Annotation
The article deals in theoretical aspects of using biologically active additives in feed
supply of population in Russia.
Modern science of rational nutrition involves using not only energetic and plastic
components in feed supply but also diversified biologically active additives including minor
components necessary for the sustentation of normal vital activity and general state of the
population health which is one of the priority direction of the activity of any State. Thus an
optimum feed supply is the key factor causing active working capacity, life expectancy and
conservation of a gene pool of the nation.
Therefore the policy of the Government and the State Duma of Russian Federation,
Ministry of Health and Social Development, Federal Supervision Agency for Customer
Protection and Human Welfare, other ministries and departments, is referred to the solution of
the problems bound with the organization of healthy feed supply to the population of Russia. A
state policy in the field of a healthy food is understood as a complex of the actions directed to
the creation of conditions, various groups of the population satisfying requirement for a rational,
healthy food taking into account their traditions, habits and an economic situation, according to
the demands of a medical science [3].
In the social and economic conditions of Russia which have developed at present, the
formation of a state policy in the field of a healthy feed supply is not only actual, but also a vital
problem, as food inadequate to physiological requirements of an organism seems to be a
potential threat of national safety of the country today.
Irrational food is the determining factor influencing the state of health of the population
of the country. The consumption of animal fats, including inadequate consumption of
polynonsaturated fat acids, high-grade fibers of the animal origin, insufficient consumption of
the majority of vitamins, deficiency of some microelements and alimentary fibers can be
referred to as the main disturbances in nutriment. Nevertheless, despite some positive dynamics
in nutriment, the population health is characterized by series of negative tendencies: the
mortality from the chronic illnesses the development of which is bound to the food factor
remains higher than in the majority of the European countries and so forth.
These tendencies are substantially caused by a crisis state in manufacture and processing
of food staples and foodstuff, a problem of quality and safety of food staples and foodstuff,
insufficient level of consumption, deterioration of an economic state of a major part of the
country population, and, hence, low solvent demand [5].
At this conjuncture working out of government programs in the field of balanced
nutriment gets the special importance and urgency which main objective is conservation and
strengthening of population health, preventive maintenance of the diseases caused by a
deviation from eutrophy of children and adults. The realization of these programs will allow to
improve the structure of a feed supply essentially, to enlarge life expectancy and working
capacity of the population of Russia.
According to the Institute of Food of the Russian Academy of Medical Science, even the
most balanced and various diet of 2500 kcal lacks the majority of vitamins by 20-30 %. Thus
during an estimation of the vitamin status of the population of Russia (more than 63 thousand
persons took part in the study) it has been established that the former is characterized by the
277
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
deficiency of ascorbic acid (vitamin C) – 70-100 %; vitamins of B group (В1, В2, В6) – 20-30
%; folic acid – 40-80 %; deficiency of beta carotene makes 40-60 %. This affects negatively the
population health state: reduces physical and intellectual efficiency, resistance to various
diseases; strengthens negative influence of the adverse ecological conditions, harmful factors of
manufacture, nervously-emotional pressure and stress on an organism; raises a professional
traumatism, sensitivity of an organism to radiation impact; reduces duration of active work
capacity that finally leads to life expectancy reduction.
At the same time the shortage of macro- and micronutrients can lead to inability of
corresponding protective systems of an organism to response adequately the adverse influences
of environment which contributes to the occurrence of disorders in the functioning of an
organism and, therefore, to the development of many diseases. According to the statistics 70%
of the reasons of illness and early death rate are caused by an improper feeding and a way of
life, 15 % – by the state of medical aid and environmental conditions. An unbalanced food leads
to the occurrence of some diseases of digestive organs and cardiovascular system, illnesses of a
metabolism, oncologic, hematologic, etc., and their number due to nervous breakdowns and
every possible stress factors increases promptly[1, 5].
Due to the variety of causes it is difficult enough to reach the correction of feed supply
system of the country by a traditional way at the expense of the increase in volumes of output
and expansion of foodstuff assortment. Besides, the availability of the foodstuffs to the
population and its provision by food micronutrients are often not interconnected. Even in
conditions of sufficient food provision of the population both on assortment, and on quality and
quantity of food, and considering the decreasing energy needs of the person in the modern
urbanized society, it is impossible to satisfy the demand in the nutrients mentioned completely.
Thereupon one of ways to solve the problem of population feed supply optimization,
apart vitaminization of foodstuff (artificial enrichment of a diet with the essential substances),
including vitamin-mineral complexes, includes also peroral (from Lat. per os – through a
mouth) intake of food supplements (biologically active additives) to vary and make the food
ration richer.
Biologically active additives to food (food supplements) were included into modern
medicine and foodstuff technology processing not long ago. However, empiric and cultural
search of various natural components of plant, animal and mineral origin, and their use with
preventive and medical purposes has been known for a long time.
Practice in using medical and preventive properties of food dates, at least, to some
millennia back, however only on the boundary of 19th and 20th centuries popular wisdom found
the force of the scientific fact. Then, thanks to the development of chemistry, so-called
biologically active substances which cause medical and preventive properties of food were
extracted from various foodstuffs.
On the verge of 1970-80s the foundation to the vast new class of medical and preventive
agents was laid and those were called biologically active additives to food or food supplements.
The use of biologically active additives is the serious factor in the prevention of some,
first of all, alimentary-dependent diseases (from Lat. аlimentarius – food), caused by
insufficient or superfluous in comparison with physiological requirements of the person intake
of food substances into organism. Protein-energy insufficiency (an alimentary dystrophy,
malignant malnutrition, alimentary marasmus), vitamin insufficiency, the diseases caused by
shortage of some mineral substances (iron deficiency anemia, nontoxic hypothyroidism, etc.)
are of the greatest significance among them.
Biologically active additives in feed supply of the modern human allow to optimize
nutrition giving the latter medical and preventive hint because food supplements are used as an
additional source of food and biologically active substances; balance carbohydrate, fatty,
protein, vitamin and other kinds of a metabolism at various functional conditions; normalize and
improve functional condition of organs and human body systems, strengthening, toning up and
calming an organism. It makes possible to improve the quality of consumed food considerably
without changing or changing only slightly a habitual diet of a human.
278
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
Scientists all over the world including Russia recognize the efficiency of using
biologically active additives in food considering its importance and evident social orientation.
Thanks to joint efforts of authorities, scientists and experts in the given branch, state policy
concepts are developed and regional programs in the field of healthy food of the population are
produced on their basis. So, under the implementation of the ideas of «The State Policy
Conception in the field of a healthy food of the population of the Russian Federation», which
was prolonged by the Government of Russia for the period of 2010, the regional program «To
health through food» was worked out and is being successfully implemented now in the
Kemerovo region. And apart from the improvement of the system of feed supply to the
population at the expense of the increase in the volumes of products of a functional purpose, it
stipulates the assortment extension and the improvement of quality of biologically active
additives delivered in the region. And, in our opinion, the products of local manufacturers which
use ecologically safe natural raw materials of Western Siberia in their production, for example,
private limited liability company "Avalar" ("Эвалар", Altai) have a special value.
The next step in the realization of the Conception is the working out of the project «The
Bases of the Russian Federation policy in the field of healthy food of the population for 20062020». This project underlines the importance of the following points:
 fundamental scientific research in the field of nutrition, including modern approaches
(genomics, proteomics, metabolomics and the use of nanomaterials and
nanotechnologies);
 research and development work on creation of the newest "know-how" in foodstuff
processing with the use of modern biotechnological achievements;
 the development of agriculture and the increase in food resources, including the
production of protein;
 monitoring the condition of a feed supply at the federal level, including safety issues
and the estimation of risk involving the development of widespread alimentarydependent diseases, taking into account the peculiarities of nutriment in certain regions;
 deficiency of essential food substances liquidation;
 an increase in products of general and special purpose manufacture to supply various
groups of the population, first of all children of early, preschool and school age;
 the organization of a system to supply feed for the working population, collected groups
and elderly age groups, and also the system of medical and preventive nutrition
foundation;
 safety of food staple and foodstuff, including those produced with the use of
nanotechnologies;
 introduction of special training programs for the students of higher and professional
educational institutions, and also for the experts (physicians, biologists, experts of
agriculture, teachers, etc.) and for children visiting nursery schools and preschool
centres;
 carrying-out of educational programs on problems associated with healthy food as a
major component of a healthy way of life by all kinds of mass media;
 an increase in manufacture of products of mass consumption (bread, milk) enriched
with vitamins and mineral substances, containing reduced quantity of fat, for which
purpose legislative and statutory acts providing interest in manufacture of such
production should be accepted;
 an increase in consumption of fresh vegetables, fruit and berries, including wildgrowing, basically at the expense of their local processing [2, 6].
It goes without saying that it is essential to create corresponding economic and legal
conditions for manufacturing the demanded amounts of high-quality and safe food staple and
foodstuff to implement the given project successfully. This will provide the maximum
availability of healthy food to all the population groups. It is also important to promote actively
279
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
the principles of healthy nutriment informing the population through mass media, and also to
carry out constant monitoring of an actual feed supply and population health.
The Russian state policy of healthy food for the population determines also the strategy to
achieve the following priorities: forming legislative, regulatory and legal framework; price, tax
and customs regulation; provision of the newest scientific technologies in the field of advanced
food staple processing; strengthening of the state supervision for the quality and safety of
production at all stages of product distribution by Russian Federal Consumer Rights Protection
and Human Health Control Service; an increase in production of foodstuff of medical and
preventive purpose enriched with biologically active substances necessary for health, i.e.
foodstuff of general and special purpose for healthy and sick people, pregnant and feeding
mothers, adults, elderly people, people working in harmful conditions, military men and other
groups of population which are in the extreme conditions; forming professional and educational
programs in the field of healthy nutriment at different level and for various contingents;
supervision and control over an actual feed supply and population health, over the quality and
safety of food staple and foodstuff.
Thus, paying attention to the development of national policy in the field of a healthy
nutriment, the state underlines the importance of a question concerning the provision of a wellbalanced foodstuff to the population of the country. And only the co-ordinated work of
corresponding bodies and services will allow to work productively and effectively to solve the
tasks set.
Therefore realization of a state policy in the field of a healthy nutriment both at federal
and regional levels becomes the main method of solving a vital problem – health support of the
population, which predetermines vital potential of the nation substantially and affects social and
economic development of the country essentially. This is especially actual in the conditions of a
gradual recovery of the country from financial and economic crisis.
To provide successful realization of the above-stated project it is important to improve
standard, technical, legal (legislative) and methodical support in the sphere of trade circulation
of biologically active additives which is an integral part of a state policy in the field of healthy
nutriment. Today the circulation of biologically active additives on a commodity market of
national consumption including foodstuff and dietary supplement represents the developed form
of a commodity exchange.
Biologically active additives to food appeared in the internal commodity market of Russia
at the beginning of 90th whereas in the foreign market they emerged much earlier. Today BAA
are in stable demand among the population of the majority of industrialized countries of the
world. Mass use of BAA in these countries allows to lower the mordibity rate and to increase
average life expectancy of the population. Thus, for example, in Europe about 60% of the
population take BAA daily, in the USA – 80%, in Japan – 90% whereas in Russia biologically
active additives are used regularly only by 8% of the population which does not provide the
sufficient level of nutriment quality and is connected basically with insufficient knowledge of
consumers, and also with discredit of the idea of using BAA in clinical practice. [1, 7].
A positive tendency in dynamics of BAA consumption in Russia has appeared recently.
In this respect the supply from the manufacturers of biologically active additives extending the
assortment of their production is increasing constantly. Nowadays the abbreviation BAA has
become common in chemist's network, in specialized departments of shops, in advertising
sections of newspapers, magazines etc., i.e. this commodity group has adapted in Russia
successfully and found the market niche. The problem of protection of consumers from unfair
manufacturers and sellers increases proportionally to the growth of offers on the market. In this
connection in Russia the sphere of the BAA trade is under steadfast attention of Federal
Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare.
Thus, the use of biologically active additives as food supplements plays an important role
in the correction of a nutriment scheme among the population of Russia which in combination
with the intake of various kinds of products and informing of the population about the principles
of consumption will allow balancing the nutriment of a modern human. However, it is necessary
280
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
to remember that BAA are not medicines and have only preventive value fostering the treatment
but not replacing it.
Bibliography
1. Исаев В.А. О мерах по повышению значимости биологически активных добавок в
программах оздоровления населения // Нетрадиционные природные ресурсы,
инновационные технологии и продукты: Сборник научных трудов. – Выпуск 17. – М.:
РАЕН, 2007, с. 98-105.
2. Княжев В. Концепция здорового питания // Медицинский курьер. - 1998. - №5 (11). с. 19-20.
3. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. Актуальные задачи и приоритетные направления
государственной политики в области здорового питания населения России: Материалы к
Форуму
4. Позняковский В.М., Пищевые и биологически активные добавки [Текст]: А.Н.
Австриевских А.А. Вековцев. - Издание 2-ое, испр. и доп. - Москва-Кемерово:
Издательское объединение «Российские университеты», 2005. - 275 с.
5. Покровский, В.И. Политика здорового питания: Федеральный и региональный уровни
[Текст]: В.И. Покровский, Г.А. Романенко, В.А. Княжев, Н.Ф. Герасименко, Г.Г.
Онищенко, В.А. Тутельян, В.М. Позняковский. - Новосибирск: Сиб.унив.изд-во, 2002.344 с.
6. Реализация концепции государственной политики в области здорового питания
населения России. Материалы всероссийской научно-практического семинара / под общ.
ред. В.М. Позняковского, А.А. Вековцев, А.Н. Астриевских – Томск: Издательство НТЛ,
2000.
7. Тутельян В.А. Доклад «Питание и здоровье человека» // II Международный фестиваль
«Лекарства с прилавка», Конгресс «Здоровье без рецептов». – М.: ЦМТ, 1997.
281
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
ZASTOSOWANIE ZESTAWU ENZYMATYCZNEGO „ALKOTEST” DO
OZNACZANIA ETANOLU W WINACH OWOCOWYCH, NAPOJACH I
SOKACH
APPLICATION OF THE ENZYMATIC KIT "ALKOTEST" FOR ETHANOL
ASSAY IN FRUIT WINES, SOFT DRINKS AND JUICES
SIBIRNY Vladimir1, KAMIŃSKA-KISZKA Ewelina2, SIBIRNA Larysa1,
GONCHAR Mykhailo2,3
Wydział Biologiczno-Rolniczy Uniwersytetu Rzeszowskiego, ul. Ćwiklińskiej 2, 35-601
Rzeszów, Poland
2
Zamiejscowy Wydział Biotechnologii Uniwersytetu Rzeszowskiego, ul Sokołowska 26, 36-100
Kolbuszowa, Poland
3
Instytut Biologii Komórki Ukraińskiej Akademii Nauk we Lwowie, ul. Dragomanowa 14/16,
27005 Lwów, Ukraine
1
Abstract
There are presented results of the application of the enzymatic method based on alcohol oxidase
and horseradish peroxidase (AOP) for the determination of ethanol in fruit wines, soft drinks
and juices using a new analytical kit “Alkotest”. Experimental data confirm the usefulness of
the method for the determination of ethanol in the tested products. The method is significantly
cheaper compared with other enzymatic methods due to the low costs of the enzyme alcohol
oxydase (AO) obtained from the mutant strain of the methylotrofic yeast Hansenula
polymorpha C-105 (gcr1 catX) with impaired catabolic repression of AO synthesis and a defect
of catalase. The application of the "Multiple Addition test" and gas chromatography (GC)
confirmed that the results obtained by “Alcotest” are consistent with GC, and correlation
coefficients are 0.997 at p<0.0001 for red fruit wines and 0.998 at p<0.0001 for white fruit
wines.
Key words: alcohol, enzymatic assay, alcohol oxidase, fruit wine, fruit drinks, juices
Wprowadzenie
Testy na obecność etanolu, oznaczania jego zawartości są ważne przy kontroli procesów
fermentacji oraz w certyfikacji różnych napojów alkoholowych i bezalkoholowych. Istnieje
wiele różnych fizyko-chemicznych i chemicznych metod do oznaczania zawartości alkoholi
(Pavlishko et al., 2005). Najprostsze metody polegają na destylacji alkoholu, a następnie
densytometrycznej lub refraktometrycznej analizie destylatu (Helrich, 1990). Wadami tych
metod są czasochłonność, niska dokładność i trudność wykonania oznaczeń seryjnych.
Chemiczne metody oznaczania alkoholi polegają na reakcji utleniania etanolu dwuchromianem
potasu czy innym utleniaczem. Zawartość alkoholu oznacza się przez fotometryczny pomiar
stężenia roztworu utleniacza lub miareczkowanie dwuchromianu tiosiarczanem sodu. Zaletą
tych metod jest niski koszt analizy. W Polsce najpowszechniej stosuje się metody chemiczne
wg obowiązujących norm (PN-90 A-79120/04). Jednak prawie wszystkie takie metody są mało
czułe i mało specyficzne a ponadto nie mogą być stosowane w przypadku obecności w próbach
różnych alkoholi. Istnieje również szereg innych metod obejmujących chromatografię gazową,
chemo- i bio-sensorowe metody analizy alkoholi oraz metody enzymatyczne. Spośród nich
szczególnie przydatna jest chromatografia gazowo-cieczowa, która zapewnia wysoką czułość,
selektywność i możliwość jednoczesnej identyfikacji oraz ilościowego oznaczania różnych
substancji (Jain and Cravey, 1972). Wadami tej metody jest jednak kosztowny sprzęt i
konieczność zatrudnienia wykwalifikowanego personelu. Analogiczne wady posiada
282
X. Risk Factors of Food Chain
September 13-14, 2010
nowoczesna metoda rezonansu jądrowo-magnetycznego (NMR) oznaczania etanolu mimo, że
daje możliwość szybkiej identyfikacji (Helrich, 1990). Już przed 50 laty dla oznaczania
alkoholu etylowego zaproponowano metodę enzymatyczną polegającą na utlenieniu etanolu do
aldehydu octowego za pomocą dehydrogenazy alkoholowej (ADH) w obecności dinukleotydu
nikotynamidoadeninowego (NAD +), który można oznaczać spektrofotometrycznie. Metoda ta
jest wprawdzie selektywna, czuła i prosta w wykonaniu ale jest i kosztowna z powodu wysokiej
ceny enzymu i jego kofaktora NAD+.
Alternatywą dla dehydrogenazowej analizy etanolu jest wykorzystanie oksydazy
alkoholowej (AO) drożdży metylotroficznych. W odróżnieniu od dehydrogenazy alkoholowej,
AO zawiera ściśle związany z białkiem koenzym FAD, a reakcja, którą przeprowadza jest
nieodwracalna (Gonchar et al., 2001).
Reakcja utleniania alkoholu tlenem atmosferycznym do aldehydu octowego i nadtlenku
wodoru katalizowana przez oksydazę alkoholową jest podstawą metody enzymatycznej AOP
(oksydaza alkoholowa + peroksydaza chrzanowa).
oksydaza
CH3CH2OH + O2 →
CH3CHO + H2O2
Nadtlenek wodoru jest wykorzystywany późnej w reakcji katalizowanej przez drugi
enzym – peroksydazę chrzanową do utlenienia bezbarwnego chromogenu do związku
barwnego:
peroksydaza
SH2 + H2O2
→
chromogen
S + 2H2O
barwnik
Na tej właśnie reakcji oparte jest analityczne zastosowanie AO w zestawie do oznaczania
alkoholu zwanego „Alkotest”, który mierzy ilość wytworzonego nadtlenku wodoru. W tym
zestawie w przeciwieństwie do znanych analogów (na przykład 2,2-benzydynę, o-toluidynę, 5aminosalicylowy, 4-aminopirydynę i in.) jako chromogen wykorzystuję się nietoksyczny TMB3,3‟,5,5‟- tetrametylobenzydyna (Holland et al., 1974). TMB pod wpływem nadtlenku wodoru i
peroksydazy chrzanu przekształca się w barwnik oznaczany fotometrycznie. Zestaw analityczny
„Alkotest” został opracowany i opatentowany w Instytucie Biologii Komórki NAN Ukrainy
(Gonchar et al., 1996). W zaproponowanej modyfikacji w trakcie analizy z zastosowaniem
peroksydazy wykorzystywana jest zmniejszona 10-20 razy ilość chromogenu TMB, a reakcja
zatrzymywana jest przez dodawanie do mieszaniny reakcyjnej kwasu solnego o pH 1,4-2,1. W
porównaniu do innych metod ten wariant analizy posiada szereg zalet: zwiększenie czułości (7
krotne), dokładność analizy (Gonchar and Sybirny, 1991), zmniejszenie kosztów analizy
dlatego, że AO zestawu „Alkotest” jest izolowana ze zmutowanego szczepu drożdży
metylotroficznych Hansenula polymorpha C-105 (gcr1 catX). Mutant ten ma całkowicie
zablokowaną produkcje katalazy i jest zdolny do ciągłej syntezy oksydazy alkoholowej podczas
hodowli na podłożu mineralnym z glukozą (Davin et al., 1994).
Celem niniejszej pracy było badanie skuteczności modyfikowanego zestawu
analitycznego „Alkotest” w analizie ilościowej zawartości etanolu w winach i napojach
owocowych oraz sokach.
Materiały i metody badań
Do badań wykorzystano napoje owocowe i soki firm Tymbark, Cappy, Fortuna, Hortex,
wina owocowe Specjał, Cezar, Canelli, Waldwein, Nalewka Babuni, a także napoje
winopodobne Truskawkowa Beczka, Lipa Miodowa, Miód Pitny oraz piwo bezalkoholowe.
Oznaczanie zawartości etanolu w badanych próbach prowadzono z wykorzystaniem
zestawu analitycznego „Alkotest”, który składa się z takich podstawowych składników:
 Chromogen – sucha masa 3,3‟,5,5‟-tetrametylobenzydyny (TMB) ze składnikami buforu
fosforanowego.
283
X. Risk Factors of Food Chain



September 13-14, 2010
Enzymy – stabilizowana zawiesina oksydazy alkoholowej (AO) i peroksydazy
chrzanowej w siarczanie amonu.
Standard – wzorcowy roztwór etanolu o stężeniu 10 g/l.
0,8 M HCl – odczynnik stosowany do zatrzymywania reakcji.
Dla produkcji AO zestawu „Alkotest” wykorzystano szczep Hansenula polymorpha C-105
(gcr1 catX) – pozbawiony aktywności katalazy mutant drożdży metylotroficznych z uszkodzona
kataboliczną represją glukozową. AO izolowano z bezkomórkowego ekstraktu
H. polymorpha C-105 (gcr1 catX) przez strącanie siarczanem amonu w obecności 50 mM
buforu fosforanowego o pH 7,5 i 2,5 mM EDTA. Do ekstraktu dodawano siarczan amonu (do
70 % nasycenia). Mieszaninę zostawiano na 12 h przy 4˚C do całkowitego rozpuszczenia soli.
Osad białek oddzielano przez wirowanie (10 tys. ob./min, 4˚C, 15 min), przepłukiwano
dwukrotnie schłodzonym 2,84 M roztworem siarczanu amonu z 2,5 mM EDTA. Otrzymany
preparat enzymu zawieszano w minimalnej objętości tego roztworu i przechowywano przy -10
о
С.
Przebieg oznaczania prowadzono zgodnie z Gonchar i in. (Gonchar et al., 2001).
Aktywność AO oznaczano na podstawie ilości (µmole) nadtlenku wodoru wytwarzanego
w ciągu 1 min w przeliczeniu na 1 mg białka. Mieszanina reakcyjna zawierała 2,5 ml 0,3 mM odianizydyny w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7,5, 0,2 ml peroksydazy chrzanowej (1
mg/ml), 0,15 ml ekstraktu bezkomórkowego rozcieńczonego 100-krotnie. Mieszaninę
inkubowano 5 min w temperaturze 30˚C, następnie rozpoczęto reakcję dodawaniem 0,15 ml 0,2
M metanolu i inkubowano 20 min w temperaturze 30˚C. Reakcję zatrzymywano 0,8 M kwasem
solnym. Nadtlenek wodoru analizowano przez oznaczanie ilości barwnego produktu utleniania
o-dianizydyny w obecności peroksydazy spektrofotometrycznie przy 525 nm.
Rozcieńczenia analizowanych próbek (250×, 500×, 750×, 1000×, 1250× lub 1500×)
wykonano w zależności od oczekiwanej zawartości etanolu. Reakcje przeprowadzono w
reżymie czasowym. Do 100 μl każdego rozcieńczenia badanej próby dodawano 3,5 ml
mieszaniny chromogenu z enzymami w odstępach co 15 sek. Reakcję hamowano po 15 min
poprzez dodawanie 0,5 ml 0,8 M HCl do każdej próbki w tej samej kolejności i interwałach
czasowych. W każdej serii wykonano także próby ślepe (dodawanie wody zamiast próbki) i
próby wzorcowe (dodawanie standardowego roztworu etanolu zamiast próbki). Absorbancję
mierzono przy długości fali 450 nm wobec próby ślepej.
Oprócz standardowego oznaczania zawartości etanolu w próbkach metodą AOP z
wykorzystaniem zestawu „Alkotest” zastosowano także jej modyfikację „Multiple Addition
Test”. Metoda ta polega na dodawaniu do 100 μl badanego wina w rozcieńczeniu 500× rożnych
alikwot wzorcowego roztworu etanolu, wykorzystanego w przygotowaniu krzywej
kalibracyjnej, i następnym oznaczaniem alkoholu według opisanej wyższe metody.
Do porównania wyników uzyskanych z metody AOP w modyfikacji „Multiple Addition
Test” wykorzystano referencyjną metodę chromatografii gazowej (GC): Chromatograf LCM80, kolumna 200×0,3 cm; detektor: katarometr. Do flakonu penicylinowego z 0,5 ml 50 %
kwasu trójchlorooctowego (TCA) dodawano 0,5 ml badanej próbki. Flakon zamykano i
wstrząsano. Za pomocą strzykawki dodawano 0,3 ml 30 % azotynu sodu i po wymieszaniu 2 ml
fazy gazowej wprowadzano do chromatografu. Jako standard wewnętrzny użyto propanol. 2 ml
4 ‰ (g/l) propanolu zmieszano z 2 ml badanej próbki i 1 ml mieszaniny dodawano do flakonu
penicylinowego z 0,5 ml 50 % TCA. Po zamknięciu flakonu dodawano przez strzykawkę 0,3 ml
30% NaNO2. Po 1 min mieszania, 2 ml fazy gazowej wstrzykiwano do chromatografu. Krzywa
kalibracyjna została zbudowana z wykorzystaniem 1, 2, 3, 4 i 6 ‰ wodnego roztworu etanolu.
Stężenie etanolu oznaczano po wysokości pików azotynu etylu.
Wyniki i dyskusja
Wykorzystanie zestawu „Alkotest” w przeprowadzanych badaniach umożliwiło
przeanalizowanie zawartości alkoholu w polskich winach owocowych jak również w n