Nanočástice stříbra
biologické vlastnosti & aplikace
Aleš Panáček
Katedra fyzikální chemie
a
Regionální centrum pokročilých technologií a materiálů, Přírodovědecká fakulta
Univerzity Palackého v Olomouci
1
Obsah přednášky
A. Nanostříbro v komerčních produktech
• Využití biologických vlastností nanočástic Ag v běžném životě lidí
B. Nanostříbro na KFC
1. Co je za námi
• Antibakteriální aktivita
• Antifungální aktivita
• Cytotoxicita a ekotoxicita
2. Aktuální stav
• Závislost biologických vlastností na velikosti částic stříbra
3. Co nás čeká
• Studium biologických vlastností nanočástic stříbra in vivo
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
2
Nanostříbro v komerčních produktech kosmetika a textil
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
3
Nanostříbro v komerčních produktech
kosmetika a textil
OMEGA ALTERMED
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
ROZALIA
NANOTRADE
4
Nanostříbro v komerčních produktech
zdravotnické prostředky
1. Krytí Acticoat - antimikrobiotické s nanokrystalick.
stříbrem 10x10 cm/1 ks (305 Kč)
SMITH & NEPHEW CONSUMER
2. Kompres Atrauman Ag sterilní
10 x 10 cm 10 ks (828 Kč)
HARTMANN-RICO
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
5
Nanostříbro v komerčních produktech
omyly
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
6
Příprava nanočástic stříbra
Modifikovaný Tollensův proces
Ag+ + 2NH3
[Ag(NH3)2]+
NaOH, redukční látka
Ag0
AgNO3 - 10-3 moldm-3
Amoniak – 0,005 až 0,2 moldm-3
Redukční látka - 10-2 moldm-3 (sacharidy)
NaOH – pH 11 - 13
25 nm 200 nm 400 nm
Řízená příprava – změna koncentrace amoniaku a volba redukční látky
stříbrná elektroda : EAg= EoAg+(RT/F)·ln*Ag+]
Eo = +0,799 V
tvorba komplexu mění koncentraci volného Ag+: Ag+ + 2NH3 ↔ *Ag(NH3)2]+
K’=*Ag(NH3)2]+/{ [Ag++·*NH3]2 }
EAg= EoAg+(RT/F)·ln,*Ag(NH3)2++/K’·*NH3]2}
0,001 M Ag+
cukr
E = +0,625 V bez NH3
E = +0,380 V 0,01 M NH3
E = -0,150 V
Kvítek L., Prucek R. Panáček A. et al. J Mat Chem 15 (10), 1099-1105, 2005
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
7
Studium biologických vlastností nanočástic stříbra
Velikost částic 25 nm (0,005 mol dm-3 NH3 , redukce maltózou)
• Antibakteriální aktivita
gram-negativní a grampozitivní bakterie
TEM
UV-VIS
• Antifungální aktivita
Candida spp.
• Cytotoxicita
fibroblasty
• Toxicita
Paramecium caudatum
Drosophila melanogaster
Scenedesmus subspicatus
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
8
Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra –
studie první
Studium antibakteriální aktivity nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti
(25 nm – 50 nm)
Bakteriální kmeny
Diluční mikrometoda
Stanovení MIC
- 300 μL kultivačního bujónu
- 300 μL disperze stříbra
- bakteriální suspenze
- kultivace 24h, 36°C
Enterococcus faecalis CCM 4224
Staphylococcus aureus CCM 3953
Escherichia coli CCM 3954
Pseudomonas aeruginosa CCM 3955
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus epidermidis1
Staphylococcus epidermidis2
Staphylococcus aureus MRSA
Stanovení MBC
- přeočkování na krevní agar
- následná kultivace 24h, 36 °C
Enterococcus faecium (VRE)
Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive)
1)
2)
(methicillin-susceptible)
(methicillin-resistant)
Prof. M. Kolář a RNDr. R. Večeřová, Ústav mikrobiologie LF UP Olomouc
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
9
Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra –
studie první
Studium antibakteriální aktivity nanočástic stříbra v závislosti na jejich velikosti
(25 nm – 50 nm)
Minimální inhibiční koncentrace – MIC (mg/L)
Bakterie
1)
2)
Velikost nanočástic stříbra
AgNO3
25 nm
(Maltóza)
35 nm
(Laktóza)
44 nm
(Glukóza)
50 nm
(Galaktóza)
Enterococcus faecalis CCM 4224
1,69
6,75
54
-
-
Staphylococcus aureus CCM 3953
1,69
3,38
6.75
6.75
54.0
Escherichia coli CCM 3954
0,84
1,69
27.0
27.0
-
Pseudomonas aeruginosa CCM 3955
0,84
3,38
13.5
27.0
-
Pseudomonas aeruginosa
0,84
3,38
13.5
13.5
27.0
Staphylococcus epidermidis1
0,84
1,69
6.75
13.5
6.75
Staphylococcus epidermidis2
0,84
1,69
6.75
6.75
54.0
Staphylococcus aureus MRSA
0,84
3,38
27.0
27.0
54.0
Enterococcus faecium (VRE)
1,69
6,75
54.0
-
-
Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive)
1,69
6,75
54.0
27.0
-
(methicillin-susceptible)
(methicillin-resistant)
Panáček A., Kvítek L., Prucek R., Kolář M.: J Phys Chem B 110 (33), 16248-16253, 2006
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
10
Antibakteriální aktivita nanočástic stříbra –
studie druhá
Zvýšení antibakteriální aktivity nanočástic stříbra (25 nm) jejich
stabilizací
MIC (mg/L)
Bakterie
1)
2)
Stabilizované nanočástice Ag
AgNO3
Nestabilizované
nanočástice Ag
SDS
Tween 80
PVP 360
Enterococcus faecalis CCM 4224
1,69
6,75
3,38
6,75
6,75
Staphylococcus aureus CCM 3953
1,69
3,38
1,69
3,38
3,38
Escherichia coli CCM 3954
0,84
1,69
1,69
1,69
3,38
Pseudomonas aeruginosa CCM 3955
0,84
3,38
1,69
3,38
1,69
Pseudomonas aeruginosa
0,84
3,38
3,38
1,69
1,69
Staphylococcus epidermidis1
0,84
1,69
0,84
1,69
1,69
Staphylococcus epidermidis2
0,84
1,69
1,69
1,69
1,69
Staphylococcus aureus MRSA
0,84
3,38
1,69
3,38
1,69
Enterococcus faecium (VRE)
1,69
6,75
3,38
3,38
3,38
Klebsiella pneumoniae (ESBL-positive)
1,69
6,75
6,75
3,38
6,75
SDS – sodium dodecyl sulfate
Tween 80 - polyoxyethylene sorbitan monooleate
PVP 360 – polyvinylpyrrolidone (M.W.= 360000)
(methicillin-susceptible)
(methicillin-resistant)
Kvítek L., Panáček A., Soukupová J., Kolář M. et al.: J Phys Chem C, 5825-5834, 2008
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
11
Antifungální aktivita nanočástic stříbra
Stanovení MIC nanočástic stříbra s velikostí 25 nm
MIC (mg/L)
Candida spp.
C. albicans I
C. albicans II
C. parapsilois
C. tropicalis
Stabilizované nanočástice Ag
AgNO3
Nestabilizované
nanočástice Ag
SDS
Tween 80
PVP 360
0,42
0,42
0,052
0,1
0,1
0,42
1,69
0,84
0,21
1,69
0,84
0,1
0,84
0,42
0,21
0,84
0,42
0,21
0,84
0,42
Inhibice růstu kvasinky C. albicans
Panáček A., Kolář M., Večeřová R. et al.: Biomaterials 30, 6333-6340, 2009
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
12
Antifungální aktivita nanočástic stříbra
Srovnání antifungální aktivity nanočástic stříbra s běžnými antimykotiky
Amp – Amphotericin
Itra – Itrakonazol
Flu – Flukonazol
Vori – Vorikonazol
Casp - Caspofungin
Non-stabilised
Ag NPs
SDS
Tween
stabilised Ag NPs
Amp
Itra
Flu
Vori
Casp
Panáček A., Kolář M., Večeřová R. et al.: Biomaterials 30, 6333-6340, 2009
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
13
Cytotoxicita nanočástic stříbra
In vitro stanovení cytotoxicity nanočástic stříbra s velikostí 25 nm
 Fibroblasty - kožní buňky
 životnost buněk stanovena fluorescenční spektroskopií
Silver NPs
Ionic silver
Control
Fluorescence intensity
80
60
40
Nanočástice stříbra
LC50(24h) = 25 mg/L Ag
20
AgNO3
LC50(24h) = 1 mg/L Ag
0
0,06
0,25
0,7
2
5
15
30
60
Concentration of silver (mg/L)
Doc. V. Kryštof, LRR UP Olomouc
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
Panáček A., Kolář M., Večeřová R. et al.: Biomaterials 30, 6333-6340, 2009
14
Ekotoxicita nanočástic stříbra
Paramecium caudatum
Příprava koncentrované disperze nanoAg
Doc. M. Dittrich, Farmaceutická fakulta
UK, Hradec Králové
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
time of
concentratio
n
[hours]
concentration
of silver in the
dispersiona
[mg·L-1]
particle
size/
half-widt
hb
[nm]
Zeta
potential
[mV]
conductivit
y
[mScm-1]
pH
0
109.1
27/8
-37
1.23
11.5
4
116.3
31/13
-40
0.90
10.7
8
121.4
31/12
-38
0.80
10.1
12
125.2
32/13
-37
0.74
9.7
24
169.5
32/12
-38
0.65
8.8
36
235.7
31/11
-39
0.58
6.9
48
288.3
36/16
-38
0.52
6.8
60
375.3
35/15
-36
0.44
6.5
72
472.1
39/19
-34
0.42
6.5
84
718.1
40/21
-42
0.33
6.3
Kvítek L., Vaníčková M., Panáček A. et al. J Phys Chem C 113, 4296-4300, 2009
15
Ekotoxicita nanočástic stříbra
Paramecium caudatum
Testování toxicity nanočástic Ag
• LT50 a LC50 (1h)
• Nanočástice stříbra – LC50(1h) = 39 mg/L Ag
25 mg/L Ag- zcela netoxická konc.
• Stabilizované nanočástice – mírné zkrácení LT50
• AgNO3 – 0,4 mg/L Ag vedlo k okamžité smrti organismu
nano Ag
iontové Ag
nano Ag + Tween
Tvorba „puchýřů“ na buněčné stěně P. caudatum a její destrukce při
působení nanoAg o koncentraci 60 mg/L Ag
Kvítek L., Vaníčková M., Panáček A. et al. J Phys Chem C 113, 4296-4300, 2009
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
16
Ekotoxicita nanočástic stříbra
Scenedesmus subspicatus
• Spektrofotometrické stanovení úbytku chlorofylu a
• Nanočástice Ag (25 nm) – LC50 >60 mg/L Ag
•
AgNO3 – LC50 = 5 mg/L Ag
8
konc. chlorofylu a (mg/L)
7
Ag0
Ag+
6
kontrola
5
4
3
2
1
0
kontrola
0,3
1
3
9
30
60
koncentrace Ag (mg/L)
RNDr. P. Hašler, Katedra botaniky PřF UP
doc. P. Ilík, Katedra biofyziky PřF UP
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
17
Ekotoxicita nanočástic stříbra
Drosophila melanogaster
Příprava práškové disperze – vysoce koncentrovaný a stabilní systém (2,5 mg Ag na 1 g prášku)
1. krok – stabilizace 0,01% BSA a zkoncentrování disperze přes dialyzační membrány
2. krok – 5% mannitol, následně homogenizace
3. krok – mikroenkapsulace - sušení při 105°C ve sprejové sušárně za vzniku 3 μm mikročástic
Prášková disperze nanočástic Ag
Doc. M. Dittrich, Farmaceutická fakulta
UK, Hradec Králové
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
Panacek A. et al., Environmental Science&Technology, 45, 2011
18
Ekotoxicita nanočástic stříbra
Drosophila melanogaster
Akutní toxicita – závislost toxického účinku na dávce
nanoAg (25 nm) 10 mg/L až 100 mg/L v chovném mediu
- 10 mg/L Ag – bez akutního toxického účinku, mírné snížení pigmentace
- 20 mg/L Ag - LC50
- 60 mg/L Ag- LC100
Nedokončení
vývojového stadia
Dr. D. Šafářová, Katedra buněčné biologie a
genetiky, PřF UP Olomouc
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
Srovnání much kultivovaných na mediu s obsahem a bez obsahu
nanoAg (20 mg/L Ag)
Panacek A. et al., Environmental Science&Technology, 45, 2011
19
Ekotoxicita nanočástic stříbra
Drosophila melanogaster
Chronická toxicita – nanoAg (25 nm) 5 mg/L v chovném mediu
sledování počtu vylíhnutých jedinců v osmi generacích
• Pokles a následný růst počtu jedinců – ovlivnění reprodukce much a následná adaptace na přítomnost Ag
zkrácení doby vývojového cyklu ze 14 na 11 dní, menší velikost (hmotnost) much
• Snížení pigmentace – ovlivnění metabolismu biogenních aminů (dopamin, octopamin) potřebných pro
tvorbu melaninu
Panacek A. et al., Environmental Science&Technology, 45, 2011
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
20
Antimikrobiální aktivita a toxicita nanočástic stříbra v
porovnání s AgNO3
NanoAg
AgNO3
Antibakteriální aktivita
(MIC; 24h)
Antifungální aktivita
(MIC; 36h)
1 mg/L
1 mg/L
Cytotoxicita fibroblasty
(LC50; 24h)
25 mg/L
1 mg/L
>25 mg/L*
0,4 mg/L**
>60 mg/L
5 mg/L
P. caudatum
Toxicita
S. subspicatus
(LC50; 48h)
D. melanogaster
(LC50)
1 - 7 mg/L
20 mg/L
1 - 2 mg/L
-
*netoxická koncentrace
**koncentrace vedoucí k okamžité smrti
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
21
Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich
velikosti
Syntéza nanočástic Ag
• Tollens proces + polyakrylová kyselina (PAA, M.W. 100000), komplexuje ionty Ag+,
adsorpcí ovlivňuje povrch vznikajících nanočástic Ag
AgNO3 - 10-3 moldm-3
amoniak – 0,005 moldm-3
NaOH – pH 11,5
PAA – 6.10-10 až 1,5.10-7 moldm-3
Maltosa - 10-2 moldm-3
d (nm)
80
Bez PAA – 28 nm
70
6.10-10 mol/l – 36 nm
60
50
40
30
1,00E-11
5,00E-08
1,00E-07
1,50E-07
9,6.10-9 mol/l – 53 nm
1,5.10-7 mol/l – 77 nm
PAA (mol/L)
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
22
Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich
velikosti
Syntéza nanočástic Ag
1,6
1,6
0 (28 nm)
0 (28 nm)
1,4
1,4
6.10-10 (36 nm)
6.10-10 (36
1,2
1,2
1,2.10-9 (41 nm)
1,2.10-9 (41
2,4.10-9 (44 nm)
2,4.10-9 (44
1
1
4,8.10-9 (47 nm)
4,8.10-9 (47
0,8
9,6.10-9 (53 nm)
9,6.10-9 (53
0,6
1,9.10-8 (59 nm)
3,8.10-8 (64 nm)
1,9.10-8 (59
3,8.10-8 (64
0,4
7,6.10-8 (72 nm)
7,6.10-8 (72
1,5.10-7 (77 nm)
1,5.10-7 (77
0,8
0,6
0,4
0,2
Absorbance
Absorbance
• Tollens proces + polyakrylová kyselina (PAA, M.W. 100000), komplexuje ionty Ag+,
adsorpcí ovlivňuje povrch vznikajících nanočástic Ag
0,2
0
0
250 300 350 400 450
250500
300550
350600
400650
450700
500750
550800
600 650 700 750 800
vln. délka (nm)
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
vln. délka (nm)
23
Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich
velikosti
Syntéza nanočástic Ag
• Tollens proces + polyakrylová kyselina (PAA, M.W. 100000), komplexuje ionty Ag+,
adsorpcí ovlivňuje povrch vznikajících nanočástic Ag
50 nm
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
24
Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich
velikosti
Antibakteriální a antifungální aktivita
MIC (mg/L)
Bakterie/kvasinka
28 nm
(bez PAA)
36 nm
47 nm
64 nm
71 nm
77 nm
Staphylococcus aureus CCM
3953
3,38
6,75
27
54
54
-
Escherichia coli CCM 3954
1,69
6,75
13,5
27
-
-
Pseudomonas aeruginosa CCM
3955
3,38
6,75
27
54
54
-
C. albicans I
0,42
0,42
1,69
1,69
6,75
13,5
C. parapsilosis
1,69
3,38
3,38
6,75
13,5
13,5
C. tropicalis
0,84
1,69
1,69
3,38
6,75
13,5
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
25
Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich
velikosti
In vitro cytotoxicita
28 nm
77 nm
Velikost nanočástic
(nm)
24hod.-LC50
(mg/l)
MIC
(mg/l)
28
35
1-3
36
77
6,75
54
83
27-54
77
94
> 54mg
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
26
Biologická aktivita nanočástic stříbra v závislosti na jejich
velikosti
Ekotoxicita - Paramecium caudatum
LT50 (s)
4500
28 nm
4000
Nad 100 mg/l Ag mizí závislost
toxicity na velikosti nanočástic Ag
36 nm
3500
54 nm
3000
77 nm
2500
2000
1500
1000
500
0
25
50
75
100
125
150
175
200
koncentrace Ag (mg/L)
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
27
In vivo stanovení antimikrobní aktivity nanočástic Ag
• Nano Ag ve formě vodné disperze a masti
• Mast – ambiderman + koncentrát nanočástic Ag
• In vitro cytotoxicita na 3D kožních
modelech EpiSkin (http://www.skinethic.com/EPISKIN.asp)
• testování antimikrobní aktivity diskovou
metodou
Lidská kůže in vivo
25
0
400
50
Model lidské kůže EpiSkin in
vitro
doc. H. Kolářová, Ústav lékařské biofyziky LF UP
200
100
Staphylococcus aureus 3953
Staphylococcus epidermidis 879
Pseudomonas aeruginosa 532
Candida albicans II
• In vivo antimikrobní aktivita a toxicita
• vyvolání lokální infekce
• léčba nanostříbrem
doc. K. Urbánek, Ústav farmakologie LF UP
prof. M. Kolář, Ústav mikrobiologie LF UP
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
28
Poděkování
- přátelům a kolegům z KFC
- Libor Kvítek – vedoucí skupiny „Nanokovy“
- Robert Prucek
- kolegům z LF UP Olomouc
- Milan Kolář a Renata Večeřová, Ústav mikrobiologie LF UP Olomouc
- Karel Urbánek, Ústav farmakologie LF UP Olomouc
- Hana Kolářová a Kateřina Tománková, Ústav biofyziky LF UP Olomouc
- finanční podpora MŠMT, ESF a GAČR
CZ.1.05/2.1.00/03.0058
1M6198959201
MSM 6198959218, MSM 6198959203, MSM6198959223
GACR GAP304/10/1316
prof. M. Kolář, Ústav mikrobiologie LF UP
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
29
Poděkování
VÁM VŠEM ZA POZORNOST
Aleš Panáček, Nanosystémy 2011
30
Download

Nanočástice stříbra biologické vlastnosti & aplikace