Instrumentální metody biochemie a biofyziky
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Bezpečnost práce v laboratoři
Strategie izolace, příprava vzorků
Chromatografické metody
Elektromigrační metody
Imunochemické metody
Centrifugační metody
Spektroskopické metody
Hmotnostní spektroskopie
Zjišťování struktury látek
Bezpečnost práce v laboratoři
Obecné doporučení a zásady práce v laboratoři:
• Nošení ochranných pomůcek (laboratorní plášť, ochrana očí,
kontaktní čočky)
• V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit
• Experimentátor se musí seznámit s vlastnostmi látek, které používá
při své práci
• Je zakázáno pipetování ústy
• Během nebezpečných experimentů nepracujeme v laboratoři sami
• Neprovádíme nedovolené experimenty
• V laboratoři by se neměly bez dozoru pohybovat nepoučené osoby
Linec JKU 2010
Katedra organické chemie
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Autorizace není potřeba pokud množství manipulované látky nepřekročí 1 t za kalendářní rok
(§18 čl.2, zákon 157/1998 Sb)
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnost - Symboly, Autorizace, R (risk) a S (safety) věty
Bezpečnostní list (§23 zákona 356/2003 Sb.)
Příloha k vyhlášce č. 231/2004 Sb.
Podrobný obsah bezpečnostního listu
Na první straně bezpečnostního listu se uvede datum jeho vydání.
1. Identifikace látky nebo přípravku a výrobce nebo dovozce
2. Informace o složení přípravku
3. Údaje o nebezpečnosti látky nebo přípravku
4. Pokyny pro první pomoc
5. Opatření pro hasební zásah
6. Opatření v případě náhodného úniku látky nebo přípravku
7. Pokyny pro zacházení s látkou nebo přípravkem a skladování látky nebo přípravku
8. Omezování expozice látkou nebo přípravkem a ochrana osob
9. Informace o fyzikálních a chemických vlastnostech látky nebo přípravku
10. Informace o stabilitě a reaktivitě látky nebo přípravku
11. Informace o toxikologických vlastnostech látky nebo přípravku
12. Ekologické informace o látce nebo přípravku
13. Pokyny pro odstraňování látky nebo přípravku
14. Informace pro přepravu látky nebo přípravku
15. Informace o právních předpisech vztahujících se k látce nebo přípravku
16. Další informace vztahující se k látce nebo přípravku
http://www.eurochem.cz/index/toxi/231_a1.htm
Strategie izolace (biologických) látek
Strategie a plánování
Předem nutné znát
• k čemu bude izolovaná látka používána
• co je jejím nejvhodnějším zdrojem k izolaci
začít přípravu v knihovně nebo na internetu
izolace a přečištění biologické látky většinou není konečným cílem práce
• analytické účely - menšího množství látky
• strukturní studie - množství větší látky
výsledná cena produktu - faktor rychlosti x faktor ekonomický
zdroj - látka stabilní, ve velkém množství, bez vedlejších produktů
izolace látek z geneticky manipulovaných organizmů
Znalosti základních chemických a fyzikálních vlastností
Každá látka má svou jedinečnou kombinaci vlastností, kterou lze
využít k její izolaci a charakterizaci
Postup izolací
• desintegrace materiálu
• extrakce
• hrubá separace
• jemná separace
• zahuštění
• skladování
Kritéria výběru izolačních a purifikačních metod
Kapacita
množství vzorku, které lze zpracovat
Rozlišení
schopnost rozdělení látek s velmi podobnými vlastnostmi
Výtěžek
poměr množství izolované látky ve směsi před a po izolaci
Cena
finanční náročnost
Extrakce
Prvním krokem - příprava hrubého extraktu
• Extrakt látek vylučovaných do mimobuněčného prostoru
• K extrakci vnitrobuněčných látek - nutné buňky rozbít
Volba vhodného extrakčního roztoku
• pH (nejčastěji pH 7 – 8 s použitím pufrů jako je Tris nebo
fosfátový pufr)
• iontová síla (přidání anorganických solí)
• osmotický tlak (vyrovnání tlaku přidáním různých solí nebo
cukrů o koncentraci 0,2 – 0,4 M)
Dále mohou extrakční pufry obsahovat jiné
důležité látky:
• antioxidanty
• EDTA
• inhibitory enzymů
• enzymové substráty a kofaktory
• polyvinilpyrrolidone (PVP), hovězí serumalbumin (BSA)
• azid sodný
Desintegrace materiálu - homogenizace
• Živočišné buňky - plasmatická membrána, cytoskelet - relativně křehké
• Rostlinné buňky - buněčná stěna - dosti pevná, lze snadno narušit
• Gram pozitivní i Gram negativní baktérie - peptidoglykanová buněčná stěna
stěna Gram negativních bakterií - lipopolysacharidová vrstva
Desintegrace materiálu - homogenizace
• Mixování – mixéry, blendery
• Tření s abrazivy – válec s pístem, bead beater
• Rychlá dekomprese - French Press
• Ultrazvuk (sonikace)
• Opakované zmražení a rozmražení
• Použití enzymů – lysozym u baktérií, chitinasa u hub
• Osmotický šok
• Použití alkálií – látka je stabilní při vysokém pH
Desintegrace materiálu - mixéry
Desintegrace materiálu - dekomprese
Desintegrace materiálu - sonikátor
Srážení
metoda, která se nejčastěji používá k hrubému přečištění
a zahuštění biologických látek, hlavně proteinů.
Princip vysolování a hydratace bílkovin
Srážení solemi - vysolování, vsolování
(NH4)2SO4
Srážení organickými látkami, (aceton, PEG)
Ultrafiltrace
Ultrafiltrace se může použít nejenom k zahušťování nebo
filtraci vzorků, ale i k výměně pufrů nebo odstranění
detergentů.
NMWC (nominal molecular weight cut-off) pro proteiny
NCO (nucleotide cut-off) pro nukleové kyseliny
hodnota NMWC/NCO - o 20% menší než je velikost požadovaného proteinu
Membrány se musí skladovat ve roztoku, aby nedošlo k jejich vyschnutí a
popraskání. Do skladovacího roztoku je vhodné přidat látky zabraňující růstu
mikroorganismů jako např. 10% ethanol nebo 0,1% azid sodný.
OBRÁZKY ULTRAFILTRAČNÍ
MEMBRÁNY
A) Řez ultrafiltrační membránou. V horní části je tenká část ultrafiltrační
membrány, ve spodní části je vysoce propustný podpůrný nosič.
Elektonový mikroskop, zvětšení 650 x.
B) Schematické
částicemi.
znázornění
ultrafiltrační
membrány
s
filtrovanými
Ultrafiltrační zařízení
pod tlakem inertního plynu nebo pomocí centrifugační síly
Ultrafiltrace za
pomoci stlačeného
plynu.
Ultrafiltrace za pomoci
odstředivé síly.
Dialýza
roztok směsi - oddělen polopropustnou membránou od
čistého pufru
Dialýza
Velikost pórů je určena stejně jako u ultrafiltračních membrán hodnotou
NMWC.
dialyzační membrány - tvar střívka
Použitím dialyzační membrány lze vzorky i zahušťovat –
střívko se vzorkem se vloží do vysušeného práškového hydrofilního polymeru
(např. vysokomolekulární polyethylen glykol, plyvinilpyrolidon nebo třeba
Sephagex)
Detergenty
povrchově aktivní organické sloučeniny
skládají se z hydrofobní a hydrofilní části
Detergenty se mohou dělit podle i) náboje a charakteru části
hydrofilní a ii) chemické podstaty části hydrofobní.
Hydrofilní část
• Aniontové - negativně nabité karboxylové, sulfátové nebo
sulfonátové skupiny
• Kationtové - pozitivně nabité části nejčastěji kvartérně vázaný
dusík
• Amfolitické (Zwitteriontové) - nesou jak negativní tak pozitivní
náboj
• Neiontové - nenesou žádný náboj, přítomnost hydroxylových
skupin - cukry a polyoxyethyleny.
Hydrofobní část
• jednoduchý uhlovodíkový řetězec
• rozvětvený uhlovodíkový řetězec
• steroidní skupina
Fyzikálně-chemické
vlastnosti detergentů
• Kritická micelární koncentrace
(CMC) - koncentrace, při které se
začínají vytvářet micely detergentu
• Agregační číslo N - počet molekul
tvořících jednu micelu detergentu.
• Kritická micelární teplota (CMT) přechod mezi krystalickou a
micelární nebo monomerní fází
• Kraftův bod - průsečíkem křivky
CMC a CMT.
• Cloud point - teplota při které dochází k vytváření superagregátů
detergentů (typická pro polyethoxylované neiontové detergenty, např.
Triton)
Faktory ovlivňující účinek detergentů
Nejvýznamnějšími faktory ovlivňující účinek detergentů jsou:
• teplota
• pH
• iontová síla
• koncentrace detergentu
• přítomnost bivalentních iontů
• přítomnost nečistot
Použití detergentů v biochemickém výzkumu
• izolace integrálních membránových
proteinů
• rekonstituce membránových proteinů
• příprava liposonů
• všude tam, kde se pracuje
s membránovými proteiny
Mechanismus účinku detergentů
1. Při nízkých koncentracích detergentu
2. Zvyšující se poměr detergent : lipid
3. Vysoké koncentrace detergentu
Příklady odstranění nebo výměny detergentu
• Precipitace proteinu acetonem, toluenem, polyethylen glykolem.
• Precipitace detergentu výměnou iontů Na+ za K+ u dodecylsulfátu
sodného, precipitace detergentů na bázi karboxylové skupiny
bivalentními ionty.
• Chromatografické metody
• vazba detergentu nebo proteinu na kolonu za použití např.
Bio-Beads.
• Centrifugace v sacharozovém gradientu.
• Dialýza u detergentů s vyšší hodnotou CMC a menší velikostí micel.
Detergent může být také postupně odstraňován z dializačního pufru
pomocí adsorpce na chromatografické nosiče.
• Ultrafiltrace roztoků které jsou před ultrafiltrací zředěným pufrem tak,
aby koncentrace detergentu byla nižší než je jeho CMC
Princip tvorby bublin detergentem
Měření pH
Kyselost vodných roztoků je dána přítomností hydroxoniových iontů H3O+
a je úměrná koncentraci těchto iontů
H2O + H2O = H3O+ + OHSoučin koncentrací iontů (iontový součin vody)
Kv = [H3O+] [OH-]
v závislosti na teplotě je roven přibližně 1 . 10-14
koncentrace hydroxylových a hydroxonioných iontů je tedy
rovna
[H3O+] = [OH-] = 1 . 10-7
pH je v praxi definováno jako
pH = -log [H3O+]
pH vody je ~ 7
(Sorensen – Dánský biochemik)
Měření pH
pH se měří skleněnou elektrodou a referenční
elektrodou, které jsou obvykle spojené v jeden
kus skleněné nebo plastové pH elektrody
pH elektroda je tvořena
1) tuhou skleněnou membránou o tloušťce přibližně 5 μm
2) vnitřním elektrolytem nejčastěji 0,1 M HCl
3) elektrolytem referenční elektrody nejčastěji nasycený
roztok KCl
4) vnitřní argentchloriodovou Ag/AgCl nebo kalomelovou
Hg/Hg2Cl2 elektrodou
5) nevodivým tělem elektrody
6) referenční elektrodou nejčastěji stejného typu jako je
vnitřní elektroda
7) vodivým spojením mezi roztokem a referenční elektrodou
Měření pH
Měření pH
volt
metr
Na tenké skleněné stěně elektrody dochází k iontové výměně
Na+ a Li+ iontů ze skla za H+ ionty z roztoku a vzniká tak
elektrický potenciál na této skleněné membráně
2,303RT
V  Ekonst 
pH
F
Měření pH
 pH se v laboratoři měří pomocí pH metru jako rozdíl mezi
napětím standardu a měřeného rozroku
 Standardy jsou většinou komerční pufry o známém pH při dané
teplotě
 Může se jednat o:
• i) primární standardní roztoky podle normy NIST DIN 19266 o
hodnotě pH (25 oC) 4,005; 6,865; 7,413; 9,180 a 10,012 nebo
o
• ii) sekundární standardní roztoky u nichž je hodnota pH již
upravena a zkalibrována vzhledem k primárním standardům
pH (?)  pH S 
E(? S ) F
2,303RT
pHS - je hodnota pH standardu u něhož je přesně známa hodnota pH při určité
teplotě
NIST – National Institute of Standards and Technology
Měření pH
Kalibrace
• pH metr musí být zkalibrovaný – nutné znát typ pH
metru a formy kalibrace
• Kalibrační křivka 2 bodová – kalibruje se buď do
kysela nebo do zásadita a je tedy nutné pH metr vždy
překalibrovat
• Kalibrační křivka vícebodová – není nutná nová
kalibrace při přechodu z kyselé do zásadité oblasti
NIST – National Institute of Standards and Technology
Měření pH
Důležité vedlejší efekty, které mohou
nastat při měření pH
• Koncentrační efekt
Ovlivnění okolními ionty
• Teplotní efekt
závislost pH na teplotě
• Sodný efekt
interference sodných iontů v roztoku se sodnými ionty skla
Měření pH
Kompatibilita, výběr vhodné elektrody
• Vysoká telpota - Ag/AgCl elektrody
• Vysoké pH – elektrody ze speciálního skla odolného vysokému pH
• Měření emulzí – výběr správného vodivého spojení (junction)
• Interference chloridových iontů Ag/AgCl elektrod se vzorkem
• Interference rtuťnatých iontů kalomelových elektrod se vzorkem
• Vysoká koncentrace solí a iontová síla - výběr správného vodivého spojení
(junction)
• Tris pufry, sulfidy, proteiny, Br-, I- mohou tvořit komplexní sloučeniny s
Ag/AgCl elektrodami, které vedou k ucpání vodivého spojení
V těchto případech je nutné používat elektrodu kalomelovou
Nevýhody –
• kalomelové elektrody nemohou být použity při teplotách nad 80 oC
• tyto elektrody obsahují rtuť, tyto ionty mohou interagovat s měřeným
vzorkem a tak mohou nastat problémy s biokompatibilitou
Měření pH a pufry
Co je pufr?
Pufry jsou látky, které v roztoku tlumí změny pH po přidání kyseliny
nebo zásady.
Kyselé a zásadité pufrující roztoky
Nejčastěji se jedná o směsi slabých kyselin nebo zásad a jejich solí.
Silné kyseliny jsou plně disociované, potřebujeme takové prostředí, ve
kterém je dostatek iontů ale i dostatek nedisociované kyseliny.
Měření pH a pufry
Kyselé a zásadité pufrující roztoky
Nejčastěji se jedná o směsi slabých kyselin nebo zásad a jejich solí.
Jak pufry pracují?
Kyselina octová je slabá kyselina a její rovnováha je tudíž ne levé
straně reakce:
Přidáme-li sůl této kyseliny:
• zvýší se koncentrace těchto iontů v roztoku a rovnováha se posune
ještě dále do leva
Roztok bude mít tyto vlastnosti:
• více molekul nedisociované kyseliny
• více iontů kyseliny
Měření pH a pufry
Přidáme-li k této směsi kyselinu H+ ionty
H+ ionty budou reagovat s ionty kyseliny octové za vzniky nedisociované kyseliny
Z roztoku se odstraní přidane H+ ionty a pH se změní jen minimálně.
Přidáme-li k této směsi zásadu OH- ionty
Ionty OH- budou reagovat s nedisociovanou kyselinou za vzniku vody a iontů
kyseliny octové.
Z roztoku se odstraní nadbytečné OH- ionty. pH se změní pouze nepatrně.
Titrační křivka
Pokud do roztoku pufru přidáváme postupně zásadu, stoupá
pH podle závislosti, která se jmenuje titrační křivka.
Tato křivka má vodorovnou část v okolí pKa kyseliny, kde
má pufr největší pufrační kapacitu.
Titrační křivka pro acetátový pufr pKa 4.76
V případě vícesytné kyseliny, např. fosfátového pufru,
dochází k pufrování roztoku kolem všech pKa.
Pufrační kapacita
Množství přidané kyseliny nebo báze na jednotkovou změnu pH
β = ΔCb/ ΔpH
Maximální pufrační kapacita je v oblasti, kde se pH rovná pKa
Příklady pufrační kapacity některých pufrů
Příklad některých nejpoužívanějších pufrů v biochemickém výzkumu
Měření pH a pufry
Tabulka nejběžněji používaných Goodsových pufrů
(Zwitteriontové pufry)
Download

1hod Uvod strategie.pdf