Mikroskopie pro
biomedicínu
Vladislav Krzyžánek
Přístrojové vybavení (BioEM)
Rastrovací elektronové mikroskopy
• JSM6700F (JEOL)
• Magellan 400/L (FEI)
Příprava vzorků
• Naprašovačky, napařovačky, CPD,…
• Rozšíření Magellanu na kryo-REM (od léta-podzimu 2013)
Hlavní metodiky (BioEM)
Metodika
• Rastrovací elektronová mikroskopie (vzorek ve vakuu)
• Klasická REM
• Kryo-REM
Polymerové kapsle
• Kvantitativní REM
Sušení na vzduchu
• Příprava vzorků
• Klasické chemické metody
• Sušení vzorků
• Na vzduchu
• Použitím chemikálií s nízkým
povrchovým napětím
• Kritický bod
• Kryo-metody
• kryo-fixace
• mrazový lom, …
• Imunoznačení pro REM
Mrazové sušení
Kaučukové nanočástice (z Taraxacu)
SE
BSE
Imunounačení
Imunounačení
PLoS ONE 7 (2012) e41874
Charakterizace bakteriálních a kvasinkových biofilmů
Staphylococcus epidermidis
Candida parapsilosis
Candida parapsilosis
Kryo-fixace (LN2), mrazový lom,
kryo-SEM
Chemická fixace, sušení CPD,
klasický REM
Kryo-fixace (LN2), kryo-SEM
Staphylococcus epidermidis
C. albicans + S. epidermidis
Candida parapsilosis
Kombinace chemické fixace
a kryo-REMu
Kryo-příprava pro FIB-REM,
FIB REM
Bez fixace, sušení
na vzduchu,klasický REM
Netradiční techniky: kvantitativní zobrazování
Měření molekulární hmotnosti pomocí REM
• Cíl: Měření molekulární hmotnosti z „kvantitativního“ obrazu (bez použití
standardu)
• Typy hmotností:
mass-per-particle (MPP) of
globular structures
A soluble protein complex isolated from
insect cells
mass-per-area (MPA) of
sheet-like structures
HPI layer of Deinocossus radiodurans, a
naturally occurring 2D crystal
mass-per-length (MPL) of
filamentous structures
Tobacco mosaic virus (TMV)
Princip měření molekulární hmotnosti/tloušťky
Elektronový svazek
Objektivová apertura
A
Vzorek
3-5 nm amorfní uhlíková fólie
(v ideálním případě grafen)
Čítač
Prstencový detektor v temném
poli (Annular dark-field (ADF)
detector)
A
Faradayova klec
Princip měření molekulární hmotnosti/tloušťky
Elektronový svazek
Objektivová apertura
A
Monte Carlo simulace
Vzorek
3-5 nm amorfní uhlíková fólie
(v ideálním případě grafen)
Čítač
Prstencový detektor v temném
poli (Annular dark-field (ADF)
detector)
A
Faradayova klec
Protein
E0 = 30 keV
Filamenty: hmotnost na jednotku délky
• TMV (virus tabákové mosaiky)
• MPL = 131.5 kDa/nm
http://www.wikipedia.org
J. Struct. Biol. 165 (2009) 78
Aplikace: polymerové kapsle
polyanion
polycation
adsorption materials:
polycation
colloidal silica
(Ø~400 nm)
PAH
PEM film assembly
washing
core
removal
template
dissolving
(HF)
PDADMAC
polyanion
Na-PSS
Příprava kapslí: M. Schönhoff, Ústav
fyzikální chemie, WWU Münster
200 nm
Aplikace: polymerové kapsle
SE obraz kapslí vysušených metodou
mrazového sušení
polyanion
polycation
adsorption materials:
polycation
colloidal silica
(Ø~400 nm)
PAH
PEM film assembly
washing
core
removal
template
dissolving
(HF)
ADF obraz kapslí
vysušených
metodou
mrazového
sušení
200 nm
PDADMAC
polyanion
Na-PSS
Aplikace: polymerové kapsle
SE obraz kapslí vysušených metodou
mrazového sušení
polyanion
polycation
adsorption materials:
polycation
colloidal silica
(Ø~400 nm)
PAH
PEM film assembly
washing
core
removal
Normalizovaný
ADFobraz
obrazkapslí
kapslí
ADF
vysušených
vysušených
metodou
metodou
mrazového
mrazového
sušenía Monte
sušení
Carlo simulace pro
D=350nm, T=20nm
template
dissolving
(HF)
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
200 nm
0.1
0
PDADMAC
polyanion
Na-PSS
Děkuji za pozornost
Vladislav Krzyžánek
www.isibrno.cz/bioem
Download

Příprava vzorků - Ústav přístrojové techniky AV ČR