Implementace laboratorní
medicíny do systému
vzdělávání na Univerzitě
Palackého v Olomouci
reg. č.:
CZ.1.07/2.2.00/28.0088
Základy histochemie
a imunohistochemie
Metodické základy patologie
Histochemie
Histologická metoda, při které prokazujeme ve vzorku tkáně
pomocí chemické reakce přítomnost různých látek.
Histochemie
Průkazy anorganických iontů a sloučenin
Perlsova reakce
PAS reakce
Feulgenova reakce
Průkaz lipidů a sacharidů
Katalytická histochemie
Afinitní histochemie
Imunohistochemie
Lektinová histochemie
In situ hybridizace
Histochemie
Průkazy anorganických iontů a sloučenin
Diagnosticky významné je prokazování určitých látek
v těle ať už v případě soudního lékařství (zde např.
kvůli otravám – As, Pb, Hg, Ag) nebo v patologii kvůli
odchylkám od norem výskytu látek (Ca, Fe, Zn, Al).
Ca přebývá v těle v rozpustné, nerozpustné,
ionizované i neionizované formě. Prokazuje se např.
ionizovaný díky barvení HE modře v alkalické reakci
(pH > 9).
Fe3+ se prokazuje pomocí Perlsovy reakce (viz níže),
Fe2+ s modrým zbarvením pomocí Turnbull blue.
Zn jako součást inzulinu, či jako kofaktor mnohých
enzymů se prokazuje pomocí zinconu s modrým
výsledkem, dithizonem s červeným výsledkem.
Histochemie
Histochemie
Perlsova reakce
Perlsova reakce slouží k odlišení lipofuscinu, hematoidinu a hematinu, které jsou
Perls negativní. Tato reakce se používá k průkazu hemosiderinu. Hemosiderin je
zásobní forma železa, která je uložena ve formě depositů v buňkách zvaných
siderofágy. Siderofágy (makrofágy) jsou fagocytující buňky, které pohlcují
počkozené nebo staré erytrocyty. A právě reakcí mezi železnatými a železitými
ionty obsaženými v hemosiderinu a žlutou krevní solí v erytrocytech vzniká
modrá sraženina tzv. Berlínská modř.
Klinická aplikace:
– diagnóza u pacientů s chorobami, při kterých se nadměrně ukládá železo
(např. hemochromatóza)
Metodika barvení
– řez tkání je inkubován ve směsi ferokyanidu draselného a kyseliny
chlorovodíková
– výsledek: nerozpustné tmavě modré precipitáty ferokyanidu železitého
Složení barvícího roztoku: ferokyanid draselný, destilovaná voda, kyselina
chlorovodíková (2%).
Řezy se umístí na 30 minut do barvícího roztoku při teplotě 60°C. Poté jsou řezy
vyjmuty z barvícího roztoku a dobarveny jádrovou červení nebo hematoxylinem.
Histochemie
Slezina: Perlsova reakce (M. Špaček)
Histochemie
Histochemie anorganických látek
Průkaz vápníku dle Kossy
dusičnan stříbrný + Ca+ světlo černé sraženiny
využití: hyperkalcémie poškození parenchymu orgánů (ledviny)
Histochemie
Ionty
• Vápník
– např. depozita ionizovaného vápníku lze barvit
hematoxylinem modře
• Zinek
– v molekule insulinu
– lze barvit zinconem(modře) či dithizonem(červeně)
Histochemie
Cukry
• Cukry jsou prokazovány PAS reakcí (periodic acid-Schiff)
ta je založena na oxidaci kyselinou jodistou→aldehydové
skupiny ty potom reagují se Schiffovým reagens (jako ve
Feulgenově reakci)
→výsledkem je sloučenina mající červeno-fialovou barvu
PAS-pozitivnílátky:
– polysacharidy (glykogen)
– glykosaminoglykany /mukopolysacharidy/ (hyaluronová kys.,
chondroitinsulfát)
– proteoglykany
– glykoproteiny (thyreoglobulin, kolagen)
– glykolipidy (lipofuscin)
Klinická aplikace:
– biopsie od pacientůs různými střádavými chorobami
(glykogenózy, mukopolysacharidózy)
Histochemie
PAS reakce
PAS (Periodic Acid Schiff) reakce je založena na oxidační reakci
kyseliny jodisté (HIO4) na 1,2-glykolové skupiny, které jsou přítomné
na glukózových zbytcích. Vznikají aldehydové skupiny, které reagují s
činidlem (Schiffovým reagens) za vzniku nové komplexní sloučeniny,
která má purpurovou barvu.
Struktury které lze touto metodou detekovat, označujeme jako PAS
pozitivní (př. glykogen v játrech)
Metodika barvení
Složení Schiffova reagens
pararosanilin
absolutní alkohol
destilovaná voda
pyrosiřičitan sodný
koncentrovaná kyselina chlorovodíková
dithioničitan sodný
Tkáňový řez se oxiduje v 1% kyselině jodisté po dobu 10 minut. Poté
je vyjmut opláchnut ve vodě a následuje barvení Schiffovým reagens
po dobu 10-ti minut. Nakonec se řez opláchne v destilované vodě
a dobarví hematoxylinem (10 minut).
Bestův karmín se používá jako metoda průkazu glykogenu v místě
s příliš vysokou koncentrací, kde PAS metoda není přehledná.
Histochemie
Tlusté střevo: PAS (M. Špaček)
Histochemie
Tlusté střevo: PAS (M. Špaček)
Histochemie
Histochemie
RNA
Organely obsahující RNA se barví bazickými barvivy tj. např.:
toluidinovou modří, metylenovou modří
RNA však není jedinou bazofilní látkou ve tkáních, proto je
nezbytné kontrolní preparát inkubovat s ribonukleázou
DNA - Feulgenova reakce
Jedná se o reakci, která prokazuje přítomnost DNA. Spočívá
v hydrolýze DNA pomocí kyseliny chlorovodíkové, kde se
v tomto procesu odštěpí purinové báze od monosacharidu
a odhalí se tak aldehydové skupiny na deoxyribóze. Poté,
podobně jako u průkazu polysacharidů, reagují aldehydové
skupiny s Schiffovým reagens za vzniku nerozpustné červené
sraženiny.
Metoda se používá například v patologii
diagnostice, kde se určuje polyploidie buněk.
v
nádorové
Histochemie
Průkaz lipidů
Lipidy se prokazují na zmražených řezech ponořených do
alkoholů s roztokem barviva. Tím bývá často Sudan III a IV
(červené) a Sudanová čerň (černé), dále olejová červeň
nebo nilská modř (rozlišení kyselých a neutrálních lipidů).
Vždy se musí tuky zachovat ve tkáni. Jako fixační
prostředek používáme Bakerovu tekutinu (voda, formol,
chlorid vápenatý)-redukuje solubilitu nepolárních lipidů.
Fixace možná i oxidem osmičelým. Vznikají nerozpustné
černé sraženiny lipidů a oxidu osmičelého. Provést před
zpracováním tkání parafínovou technikou, protože tkáň
nesmí přijít do styku s organickými rozpouštědly (benzen,
xylen).
Průkaz fosfolipidů – barvíme luxolovou modří – metoda
vhodná pro znázornění myelinové pochvy nervových
vláken.
Histochemie
Katalytická histochemie
Základní princip: Enzym reaguje se substrátem, který přemění na
konečný produkt. Tento produkt je posléze přeměněn na barevnou
sloučeninu (vizualizační reakce).
Využívá se toho ke značení protilátek nebo hybridizačních sond
i k detekci metabolických procesů v buňce. Dopad do patologie
a soudního lékařství.
Při všech těchto postupech se musí zachovat 4 základní pravidla pro
uskutečnění katalytické histochemie:
Přesnost – při zachování morfologie sledovaných buněk či tkání
nesmí produkt difundovat a je vázán na strukturách s předpokládaným
výskytem enzymu.
Specifita – konečný produkt musí být výsledkem aktivity pouze
jednoho enzymu. Toto se ověřuje na kontrolních řezech bez substrátu,
kdy se nesmí objevit barevný produkt.
Reprodukovatelnost – pokus se může zopakovat bez významných
odchylek.
Validita – při manipulaci s tkání nesmí být enzym ztracen, jeho
distribuce a aktivita je zachovaná. Pro zachování funkcí enzymu
nesmí být preparát postfixován!
Histochemie
Katalytická histochemie
Enzymy jsou katalyzátory většiny biochemických reakcí
Užívá se zpravidla fixace zmražením
Princip:
– První reakce (histochemická): enzym+ substrát→reakční produkt
– Druhá reakce: vizualizace reakčního produktu
Vždy nutnost kontrolních řezů
Katalytická histochemie –vizualizační reakce
precipitace s kationty kovů
– vznik barevné nerozpustné soli Pb, Co
simultánní azokopulace
– produkt (naftol) se převede na azobarvivo
indigogenní reakce
– štěpení na indoxyl a jeho oxidace na indigo
tetrazoliová metoda
– redukce tetrazoliové soli na barevný formazan
spřažená peroxidázová reakce
– oxidace DAB
Histochemie
Katalytická histochemie -příklady
Gomoriho průkaz kyselé fosfatázy
– řez tkání+ substrát štěpený enzymem (např. glycerofosfát sodný)
– uvolnění fosfátových iontů
– jejich zachycení dusičnanem olovnatým
– výsledek: elektrodenzní precipitát
Peroxidáza
– tkáňové řezy jsou inkubovány v roztoku obsahujícím peroxid vodíku
a DAB (diaminoazobenzidin)
– DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován
– výsledek: nerozpustné černé (hnědé) elektrodenzní precipitáty
Klinická aplikace:
– diagnostika leukémií (detekce peroxidázové aktivity v krevních
buňkách)
Peroxidáza se rovněž užívá ke značení v imunohistochemii a ISH
Histochemie
Z. Lojda
Histochemie
Afinitní histochemie
Jeden z novějších postupů, který je stále více
využíván jak ve výzkumu, tak v diagnostice.
Umožňuje prokázat v cílové tkáni velmi nepatrná
množství látek.
Lze rozdělit:
1) Imunohistochemii (viz dále)
2) Lektinovou histochemii (viz dále)
3) Hybridizaci in situ (viz jiný seminář)
Histochemie
Lektinová histochemie
Lektiny jsou především rostlinné proteiny (glykoproteiny), kterých se využívá například k určování
krevních skupin, k mitogenní stimulaci lymfocytů či
normálních buněk. Váží se vysoce specificky na
sacharidové části makromolekul.
Imunohistochemie
Tento postup využívá základního principu interakce
antigen – protilátka, kdy protilátky přisedají afinitně na
cílový antigen, proti kterému byly vyprodukovány.
Monoklonální protilátky jsou produkovány hybridomy,
polyklonální protilátky různými živočišnými druhy.
Protilátky:
– sérové proteiny známé jako imunoglobuliny
– jsou vytvářeny plazmatickými buňkami
– v imunohistochemii nejčastěji používáme třídu IgG
Imunohistochemie
Protilátky musí být označené, aby došlo k vizualizaci
místa interakce a průkazu antigenů.
Využívá se dvou základních metod:
Přímá reakce – v tomto případě nasedají primární
protilátky, které jsou značené, na antigen. Označí
tak místo interakce, avšak nevýhodou je nízká
citlivost a nutnost použít zvýšené množství
protilátek.
Nepřímá reakce – zamezuje nevýhodám přímé
reakce, když primární protilátka přisedá na svůj
antigen a s použitím sekundární protilátky tyto
nasedají na protilátky primární. Sekundární
protilátky jsou značené a může jich na primární
přisednout mnohem více – tím se zvyšuje citlivost
detekovatelné reakce.
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Mezi markery (značky), které se používají k vizualizaci reakce, patří:
fluorochromy – pro zviditelnění reakce ve fluorescenčním mikroskopu
molekulární komplexy – např. ABC – často užívaný
komplex k amplifikaci signálu nepřímé metody
autoradiografie – protilátky nesou radioaktivní látky,
které vysílají záření na fotografickou emulzi
enzymy – využívá se katalytické histochemie;
protilátka nesoucí enzym přisedá na antigen a po
dodání substrátu jej enzym přemění na barevný
produkt.
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Monoklonální protilátky
•
•
•
•
Monoklonální protilátky jsou „klonované“ protilátky, které jsou všechny
zaměřené proti stejnému epitopu – jsou tedy mimořádně specifické
Aktivované B-buňky produkují směs protilátek zaměřených proti různým
epitopům
Aktivovaná B-buňka má jen omezenou životnost a sama se nemnoží
Jak můžeme selektovat jeden klon B-buněk a prodloužit buněčnou linii?
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Imunohistochemie
Fluorochromy
•
•
•
•
Fluorochromy jsou látky schopné absorpce záření ve formě UV či viditelného světla
tato absorpce zapříčiní excitaci elektronů v molekule barviva
při následném přechodu zpět na energeticky nižší hladinu dojde k emisi
záření o jiné vlnové délce
fluorochromy: FITC (fluoresceinisothiocyanát), rhodamine (TRITC), DAPI
atd.
Imunohistochemie
Fluochromy – FITC
Na+/K+ ATPáza v bazolaterálním labyrintu proximálních a distálních ledvinných
tubulů
Imunohistochemie
Kůže: Melanocyty a Langerhansovy buňky (M.Špaček)
Imunohistochemie
Pankreas: L. ostrůvky – insulin (M. Špaček)
Imunohistochemie
Pankreas: L. ostrůvky somatostatin v D buňkách (M. Špaček)
Imunohistochemie
Kyselý neurofilamentový protein v neuronech (M. Špaček)
Imunohistochemie
MUDr. M. Špaček
Download

Základy histochemie a imunohistochemie.