PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ
TEKNİĞİ
PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ
 Proteinler hücrelerde en fazla bulunan
makromoleküller olup; kuru ağırlığın yaklaşık
%50’sini teşkil etmektedirler.
Proteinlerin primer yapısı DNA molekülü
tarafından denetlenmektedir.
Hücre nükleusunda binlerce gen bulunmakta
ve bu genlerin ürünü olarak binlerce çeşit
protein meydana getirilmekte ve her bir
protein ise spesifik bir fonksiyon görmektedir.
PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ
 Fonksiyonu
ve biyolojik aktivitesi ne olursa olsun
bütün proteinler 20 standart amino asitten
meydana gelmiştir.
 Amino
asitlerin gerçek bir biyolojik aktivitesi
olmamasına
rağmen
polipeptid
zincirlerine
yapıtaşları olarak girdikten sonra oluşturdukları
proteinlerin bir kısmı enzim aktivitesine, bir kısmı
hormon aktivitesine, bir kısmı antikor aktivitesine,
diğer bir kısmı ise yapısal fonksiyon görmek üzere
özelleşmiştir.
PROTEİNLER VE ELEKTROFOREZ TEKNİĞİ
Proteinlerin saflaştırılmasında çok çeşitli
teknikler kullanılmaktadır. Bunlar:
Diyaliz, ultrafiltrasyon, jel filtrasyonu,
elektroforez,
iyon-değişim
kromatografisi, affinite kromatografisi ve
densite gradient santrifügasyon olarak
sıralanabilir.
Elektroforez
 Poliakrilamid ve diğer katkı maddeleri, cam tüpler içerisine
veya iki cam levha arasına konulur ve polimerize edilir.
 Cam tüplerin ve tabaka halindeki camın altı ve üstü bir
tampon çözelti ile temas ettirilir.
 Alt ve üstteki tampon çözeltiler içinde ise pozitif ve negatif
elektrotlar bulunur.
 Tüplerin üstünden ve iki cam levha arasındaki poliakrilamid
tabakanın üstünden protein çözeltisi ilave edilir.
Elektroforez

Pozitif ve negatif elektrotlar bir güç kaynağına bağlanır.

Devreden belirli sürede belirli amperdeki akım geçirilir.

Proteinler molekül ağırlıklarına ve taşıdıkları elektrik
yüklerine göre bu elektriki alanda hareket etmektedirler.

Sonunda protein molekülleri birbirinden ayrılmaktadır.

Protein boyaması yapıldıktan sonra protein bantları görünür
hale gelir.

Bu bantları keserek, jeli ezerek her banttaki proteini
oldukça saf halde elde etmek mümkündür.
Protein Miktar Tayini
Protein Belirlenmesi
 Örneklerin protein konsantrasyonları belirlenir.
Bu amaçla farklı metotlardan yararlanılır. Örneğin,
Bradford metodu, Lowry metodu, Kjeldahl metodu gibi.
 Protein miktarı örnekte belirlendikten sonra bu belirlenen
oranlara göre örnek hazırlanır.
 Hangi örnek analiz edilecekse o örnekten belli bir miktar
alınır. Daha sonra örnek tamponu içerisine ilave edilir.

Örnek tamponu:
-Tris base
6g
-SDS
2g
-Brom fenol mavisi
0.1 g
-Gliserol
10 ml
-----------------------------------1M HCl ile p H 6.8 ‘e ayarlanır. 5 ml beta merkapta etanol ilave edilir.Seviye 100
ml’ e tamamlanır.
SDS-poliakrilamid jel elektroforez çözeltileri ve hazırlanması
1) Akrilamid/Bis Stok Çözeltisi (% 30 T, % 2.67 C)
Akrilamid
29.2 g
N,N’-metilen-bis-akrilamid
0.8 g
Distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Filtre edilir ve renkli şişede +4C’de saklanır. Bu koşullarda 30
gün içinde kullanılmalıdır.
2) Ayrıştırma (Alt) Jel Stok Tamponu (1.5M Tris-HCl, pH:8.8)
Trizma base
18.165 g
Distile su
75.00 ml
HCl ile pH:8.8 ayarlanır.Distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Renkli şişede +4C’de saklanır.
3) Üst Jel Stok Tamponu (1 M Tris-HCl, pH:6.8)
Trizma base
12.11 g
Distile su
75.00 ml
HCl ile pH:6.8 ayarlanır.Distile su ile 100 mL’ye tamamlanır. Renkli şişede +4C’de saklanır.
4) SDS Stok Çözeltisi (% 10) : 10 g SDS 60 mL distile suda çözülüp, 100 mL’ye tamamlanır.
5) % 10 Amonyum Persülfat (APS) : 100 mg APS 1 mL distile suda çözülür.
6) 5x Elektrot (Yürütme) Tamponu (25 mM Tris, 192 mM Glisin)
Trizma base
15,1 g
Glisin
94,0 g
%10 SDS
50 ml
Distile su ile 1 litreye tamamlanır. +4C’de saklanır. Seyreltik çözelti elektroforetik yürütme için
kullanılır. Kullanılırken 5 katı seyreltilerek kullanılır.
•
7) Ayrıştırma Jeli (% 12) Hazırlanması ( pH:8.8) (10 ml lik)
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Akrilamid/bis stok çözeltisi (% 30 T, % 2.67 C)
4 mL
Distile su
3.3 mL
Ayrıştırma jel stok tamponu (1.5M Tris-HCl, pH:8.8)
2.50 mL
SDS Stok Çözeltisi (% 10)
0.1 mL
% 10 APS*
0.1 ml
TEMED
0.004 mL
*APS çözeltisi her zaman taze olarak hazırlanmalıdır.
Hazırlanan çözelti hemen çalkalanmalı ve elektroforez camları arasına dökülmelidir.
45 dakika beklenerek jelin polimerleşmesi beklenmeli daha sonra üst jel hazırlanarak
dökülmelidir.
8) Üst Jel % 5’lik Hazırlanması (pH 6.8) (5 ml’lik)
Akrilamid/bis stok çözeltisi (% 30 T, % 2.67 C)
0.83 mL
Distile su
3.4 mL
Ayrıştırma jel stok tamponu (1M Tris-HCl, pH:6.8)
0.63 mL
SDS Stok Çözeltisi (% 10)
0.05 mL
% 10 APS*
0.05 ml
TEMED
0.005 mL
•
•
•
•
•
•
•
SDS-PAJE ile farklı moleküler ağırlıklardaki proteinleri çözmek için
kullanılan akrilamidin yüzdesi
Farklı Molekül Ağırlık (Da)
Aralıkları
Kullanılan Akrilamid Yüzdesi (%)
200 000 – 60 000
5.0
120 000 – 30 000
7.5
75 000 – 18 000
10.0
60 000 –15 000
12.5
45 000 – 12 000
15.0
SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAJE)
Hazırlanan jel solüsyonu, 0.5 mm kalınlıkta
boşluk içeren 10x10 cm boyutundaki iki cam
plak arasına dökülür.
Üzerine 10 dişli tarak daldırılır.
Tarakla
açılan
kuyucuklara
standart
moleküler ağırlık çözeltisinden 15 L yüklenir.
Yürütme tamponu olarak tankın alt ve üst
kısmına SDS’li Tris-Glisin çözeltisi konulur.
SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAJE)
 Ayrıştırma ilk 30 dakika jel başına 10 mA, sonra
bromfenol mavisinin jelin tabanına yaklaşık 1 cm
kalıncaya kadar jel başına 25 mA sabit akımda
gerçekleştirilir.
 Yürütme işleminin bitiminde iki cam plak arasındaki jel
boyama çözeltisine alınır.
 Boya çözeltisi:
 0.25 g
Coomassie Brillant Blue R250
 90 ml
Methanol:H2O (1:1)
 10 ml
Glacial asetik asit
Jellerin Kurutulması ve Değerlendirilmesi
 Jeller, boyamadan sonra Destaining solüsyonuna konulurlar.
Destaining Solüsyonu:
-400 ml methanol
-100 ml asetik asit
-500 ml destile su
Fazla boyalarından arındırılan jeller saklanmak üzere kurutulur.
Kurutmada, selofan kağıdı kullanılır.
Jel, fleksiglas çerçeve üzerine yerleştirilen saf su ile ıslatılmış iki
selafon arasına hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirilir ve
kenarlarına metal kıskaçlar tutturulur.
Dolayısıyla jelin kuruması sırasında çatlaması ve parçalanması engellenir.
Jeller laboratuvar koşullarında kurutulur.
Daha sonra densitometreler yardımıyla görüntülenir veya fotoğrafları
çekilir.
Download

protein elektroforez