Biochemie
2. ročník
ANALÝZA VYBRANÝCH PARAMETRŮ LIPIDOVÉHO METABOLIZMU
Upozornění: Pro úspěšné absolvování praktického cvičení je nutné, aby každá pracovní skupina (2 studenti) měla
k dispozici kalkulačku. Praktické cvičení navazuje na přednášky: „Biosyntéza a degradace mastných kyselin“; „Metabolizmus
triacylglycerolů a fosfolipidů“; „Metabolizmus cholesterolu a lipoproteinů“ a na seminář věnovaný „Elektroforetickým
technikám“. K samotnému cvičení jsou z návodu potřebné strany 2-7.
1. LIPIDOVÝ METABOLIZMUS
Poruchy metabolizmu lipoproteinů patří mezi
nejčastěji se vyskytující nemoci. Přímá
souvislost
s rozvojem aterosklerózy
a
ischemické choroby srdeční dává do popředí
jejich značný klinický význam. Mezi základní
parametry popisující lipidový metabolizmus
patří celkový cholesterol, triacylglyceroly, LDL a
HDL cholesterol. V praktickém cvičení se
obeznámíme
s metodami
stanovení
jednotlivých analytů a ukážeme si, jak
elektroforetické metody přispívají ke stanovení
klinické diagnózy.
Kazuistika:
Muž, 38 let, přichází do ambulance praktického
lékaře k pravidelné preventivní prohlídce.
Pacient prodělal běžné dětské nemoci. Od 30.
roku života trpí arteriální hypertenzí.
Hospitalizace v minulosti 0. Úrazy hlavy a
zlomeniny 0. Bolesti na hrudi, závratě a
poruchy vědomí neguje. Žije s manželkou,
matka zemřela v 68 letech na cévní mozkovou
příhodu. Otec žije, diabetik II. typu. Sestra je
zdráva. Má dvě děti, obě zdravé. Pacient je
alergický na pyl, peří a roztoče. Kouří 10 cigaret
denně od 17 let. Kávu pije černou ráno a
odpoledne, večer jedno-dvě piva. Drogy neguje.
Nález na horních a dolních končetinách
odpovídá věku.
Trvalá medikace: losartan 50 mg denně.
Vzhledem na přítomné rizikové faktory
ischemické choroby srdeční bylo indikováno
biochemické vyšetření krve zaměřené na
analýzu parametrů lipidového metabolizmu
(Tab. 1).
Parametr
Koncentrace
Referenční mez
Proteiny
75 g/l
65 – 85 g/l
Glukóza
4,2 mmol/l
3,5 – 5,5 mmol/l
S-Na+
140 mmol/l
137 – 146 mmol/l
S-K+
4,0 mmol/l
3,8 – 5,0 mmol/l
S-Ca
2,35 mmol/l
2,25 – 2,75 mmol/l
S-Cl100 mmol/l
97 – 108 mmol/l
Cholesterol
7,9 mmol/l
3,1 – 5,2 mmol/l
LDL
6,6 mmol/l
2,2 – 4,5 mmol/l
HDL
0,9 mmol/l
1,1 – 1,4 mmol/l
TAG
2,0 mmol/l
0,68 – 1,69 mmol/l
Tab. 1: Výsledky biochemického vyšetření
Nález:
Pacient je při vědomí, plně orientován, aktivní.
Chůze normální. Kůže růžová bez eflorescencí,
prokrvení dolních končetin v normě. Počet
dechů: 16/min, tep 78/min, TK: 140/85, tělesná
teplota 36,7 °C. Výška: 186 cm, váha: 96 kg.
BMI: 27,8 kg/m2.
Status praesens:
Hlava a krk: bez patologického nálezu.
Hrudník: dýchaní sklípkové bez vedlejších
fenoménů. Akce srdeční pravidelná, ozvy
ohraničené, bez šelestů.
Břicho: bez patologického nálezu.
Výsledek laboratorního vyšetření potvrdil
diagnózu
smíšené
hyperlipoproteinémie.
Pacient byl opakovaně poučen, aby přestal
kouřit, změnil stravovací návyky a do životního
stylu zařadil více fyzické aktivity. Nasazen
atorvastatin v počáteční dávce 10 mg denně.
Kontrola a event. titrace dávky za 2 měsíce.
1/7
Biochemie
2. ročník
Klinické a patobiochemické aspekty hyperlipoproteinémie:
Znalost metabolizmu lipoproteinů je pro lékaře
nesmírně důležitá. Lipoproteiny hrají jednu
z centrálních rolí v rozvoji nejčastěji se
vyskytující neinfekční nemoci – aterosklerózy.
Ateroskleróza postihuje velké a střední tepny
cévního řečiště. V patogenezi nemoci hraje
významnou roli endoteliální dysfunkce, porucha
metabolizmu lipoproteinů a zánět. Rozvíjí se
tvorba aterosklerotického plátu (ateromu),
aktivace makrofágů a zánětlivá reakce. Aktivita
makrofágů může vést k narušení stability
ateromu a k akutní koronární příhodě.
Cholesterol a jeho estery jsou transportovány
v krevním řečišti ve formě komplexních částic,
tzv. lipoproteinů. Za aterogenní lipoproteiny
jsou považovány LDL, IDL a VLDL.
Lipoproteiny s vysokou hustotou (HDL)
zabezpečují centripetální transport cholesterolu
zpět do jater a jeho následné vylučování.
V patologii metabolizmu lipidů existuje řada
kritických momentů, které mohou vést ke
klinické manifestaci hyper- nebo hypolipoproteinémií: deficit LPL, kofaktorů, genetická
predispozice, diabetes, konzumace alkoholu,
hypothyreóza, hyperkortisolizmus, aplikace
exogenních estrogenů atd. Terapie hyperlipoproteinémie je závislá na typu poruchy.
Obecně přistupujeme k dietním opatřením,
která jsou u mnohých pacientů dostačující pro
udržení fyziologických hladin. V případě těžších
hyperlipoproteinémií volíme farmakologickou
léčbu. Na trhu existuje řada preparátů
ovlivňujících metabolizmus lipidů – inhibitory
syntézy cholesterolu (statiny: atorvastatin, fluvastatin), pryskyřice (cholestyramin) a fibráty
(klofibrát, fenofibrát, gemfibrozil). Uvedená
léčiva jsou zatížena řadou nežádoucích účinků,
proto je důležité vybrat individuálně vhodný
preparát na základě klinického nálezu a
zdravotního
stavu
pacienta.
2. PŘÍPRAVA VZORKU K ANALÝZE 1
Podle pokynů vyučujícího a pod dohledem laborantky proveďte odběr kapilární krve do mikrozkumavky
s EDTA. Aby stanovení mělo výpovědní hodnotu, doporučuje se 10-12 hodinové lačnění. Ovocná
šťáva, nebo káva k snídani nevadí. Při odběru používejte ochranné rukavice! Ze vzorku nesrážlivé krve
odeberte cca 100 µl do mikrozkumavky. Krev nechte 15 min srazit a centrifugujte 10 min při 4000 RPM.
Separovanou krevní plazmu převeďte do čisté mikrozkumavky. Pro úspěšné provedení následujících
experimentů byste měli mít k dispozici cca 30 µl plazmy.
2.1 Stanovení hladiny celkového cholesterolu
Metoda stanovující celkový cholesterol analyzuje podíl cholesterolu volného i esterifikovaného.
Stanovení je založeno na hydrolýze esterů cholesterolu cholesterolesterázou na volný cholesterol, který
reaguje s kyslíkem a cholesteroloxidázou za vzniku cholest-4-en-3-onu a peroxidu vodíku. Uvolněný
peroxid vodíku reaguje v přítomnosti peroxidázy s fenolem a 4-aminoantipyrinem za vzniku barevného
chinoniminu. Ten lze stanovit fotometricky proti blanku při 500 nm.
Do 3 zkumavek pipetujte roztoky podle níže uvedené tabulky:
Činidlo [ml]
Vzorek [ml]
Standard [ml]
Tab. 2
Blank [ml]
1,00
-
Standard [ml]
1,00
0,01
Vzorek [ml]
1,00
0,01
-
Uvedený postup přípravy vzorku je určen pro dobrovolníky, kteří budou chtít provést elektroforézu lipoproteinů ze vzorků
vlastní krve. Pro ostatní studenty budou k dispozici zásobní vzorky.
1
2/7
Biochemie
2. ročník
Směs důkladně promíchejte a inkubujte 5 min při 37 ºC. Absorbanci změřte do 60 min proti blanku.
Koncentrace celkového cholesterolu ve standardu je ……… mmol/l.
Koncentrace celkového cholesterolu v analyzovaném vzorku: ……… mmol/l
Výpočet:
2.2 Stanovení hladiny HDL cholesterolu
Princip stanovení HDL cholesterolu je podobný jako v případě stanovení celkového cholesterolu. Jelikož
nás zajímá pouze HDL frakce, využijeme pro stanovení kolorimetrickou metodu po předchozím
precipitačním odstranění ostatních komponent.2 První činidlo (R1) obsahuje fosfowolframan a hořečnaté
ionty, díky kterým VLDL a LDL frakce precipitují, zatímco HDL frakce je součástí supernatantu.
Cholesterolesteráza a cholesteroloxidáza obsažené ve druhém činidle (R2) pak reagují pouze s HDL.
Vznikající peroxid vodíku oxiduje v přítomnosti peroxidázy směs dichlorfenolsulfonátu s 4aminoantipyrinem a barevný komplex se stanoví fotometricky při 500 nm proti blanku.
Do zkumavky pipetujte roztoky podle níže uvedené tabulky:
Činidlo R1 [ml]
Vzorek [ml]
Tab. 3
0,25
0,10
Obsah zkumavky důkladně promíchejte a inkubujte 10 min při laboratorní teplotě. Poté centrifugujte 10
min při 4000 RPM. Na závěr do čisté zkumavky opatrně odeberte supernatant.
Do 3 zkumavek pipetujte roztoky podle níže uvedené tabulky:
Činidlo R2 [ml]
Dest. voda [ml]
Standard [ml]
Supernatant [ml]
Tab. 4
Blank [ml]
1,00
0,05
-
Standard [ml]
1,00
0,05
-
Vzorek [ml]
1,00
0,05
Obsah zkumavek důkladně promíchejte a směs inkubujte 10 min při 37 ºC. Absorbanci změřte do 30
min proti blanku. Koncentrace HDL ve standardu je ……… mmol/l.
Koncentrace HDL v analyzovaném vzorku: ……… mmol/l
Výpočet:
2.3 Stanovení hladiny triacylglycerolů
Princip stanovení triacylglycerolů v krevní plazmě je založen na hydrolýze triacylglycerolů lipázou.
Ekvivalentní množství uvolněného glycerolu dále reaguje s ATP a glycerolkinázou za vzniku glycerol-3V laboratorní praxi se využívá homogenní postup, při kterém odpadá centrifugace a maskuje se účinek cholesterolesterázy
na apolipoprotein B (polyetylenglykol, Mg2+, cyklodextrin). V následném kroku se stanoví HDL podobně jako celkový
cholesterol.
2
3/7
Biochemie
2. ročník
fosfátu. Glycerol-3-fosfát produkuje v reakci s kyslíkem a glycerolfosfátoxidázou dihydroxyacetonfosfát a
peroxid vodíku. Uvolněný peroxid oxiduje v přítomnosti peroxidázy směs 4-chlorfenolu s 4aminoantipyrinem na barevný chinonimin, který se stanoví fotometricky při 500 nm proti blanku.
Do 3 zkumavek pipetujte roztoky podle níže uvedené tabulky:
Činidlo [ml]
Vzorek [ml]
Standard [ml]
Tab. 5
Blank [ml]
1,00
-
Standard [ml]
1,00
0,01
Vzorek [ml]
1,00
0,01
-
Reakční směs důkladně promíchejte a inkubujte 5 min při 37 ºC. Absorbanci změřte do 60 min proti
blanku. Koncentrace TAG v standardu je ……… mmol/l.
Koncentrace TAG v analyzovaném vzorku: ……… mmol/l
Výpočet:
2.4 Stanovení hladiny LDL cholesterolu
Hladina LDL cholesterolu může být vypočítána podle Friedewaldovy rovnice:
TAG 

LDL  cholestero l   HDL 

2,2 

(neplatí pro TAG > 4,5 mmol/l)
Koncentrace LDL v analyzovaném vzorku: ……… mmol/l
Výpočet:
3. ELEKTROFORÉZA LIPOPROTEINŮ
Elektroforéza patří mezi elektromigrační separační techniky. Využívá rozdílné pohyblivosti částic v
stejnosměrném elektrickém poli. Pole se generuje vložením konstantního napětí na elektrody umístněné
v elektroforetické komoře. K eliminaci nežádoucích faktorů majících vliv na separaci (difuze atd.) se
vzorky nanáší na vhodný nosič. K separaci na základě rozdílného náboje se používá např. agaróza
nebo acetylcelulóza. Separace na polyakrylamidovém gelu poskytuje komplexnější obraz, je však pro
klinickou interpretaci náročnější. Kromě toho je akrylamid toxická látka, proto se s ní manipuluje velmi
opatrně. Pohyblivost proteinů závisí téměř výhradně na molekulové hmotnosti polypeptidových řetězců,
jelikož se jejich náboj sjednotí přídavkem dodecylsíranu sodného. Metoda je vhodná pro analýzu
makromolekulárních komplexů. V našem experimentu provedeme horizontální elektroforézu na
agarózovém gelu o pH 7,5.
4/7
Biochemie
2. ročník
3.1 Agarózový gel
 Gely dodávány výrobcem. Připravené k použití.
3.2 Příprava a aplikace vzorku
 Do jamky aplikátoru pipetujte 10 µl vzorku.
 Odlomte ochranný rámeček aplikátoru. Aplikátor se tak dostane do kontaktu s povrchem
gelu. Po 7,5 min aplikátor vyjměte.
3.3 Příprava a provedení elektroforézy
 Do elektroforetické komory nalijte elektroforetický pufr (pH 8,2).
 Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory a ujistěte se o správném uložení
gelu vzhledem k polaritě elektrod (polarita vyznačena na gelu). Uzavřete komoru víkem a
připojte ke zdroji proudu.
 Na elektroforetickém zdroji nastavte konstantní napětí 250 V (počáteční proud na gel 11 ±
2 mA). Vzorky separujte 70 min.
3.4 Ukončení elektroforézy
 Po proběhnutí elektroforézy vypněte zdroj a odstraňte víko.
 Gel opatrně vyjměte z elektroforetické desky a sušte horkým vzduchem při teplotě 80 °C po
dobu 15 min.
3.5 Barvení a odbarvování
 Usušený gel ponořte do barvícího roztoku (Sudanová čerň) přesně na 15 min.
 Poté gel odbarvěte přesně 5 min v odbarvovacím roztoku (30% propan-2-ol).
3.6 Promývání a sušení
 Gel ponořte na 1 min do promývacího roztoku (alkalický pufr pH 8,8; azid sodný).
 Rychle opláchněte destilovanou vodou a odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu
tenkým papírem a usušte.
3.7 Skenování
 Vyhodnocení proveďte denzitometricky.
4. INTERPRETACE ELEKTROFOREOGRAMU
V tabulce 6 jsou uvedeny základní frakce elektroforézy lipoproteinů:
Elektroforetická pohyblivost
Lipoprotein
Průměr molekuly [nm]

HDL
4-10
rychlé pre-
Lp(a)
25
pre-β
VLDL
25-70
β
LDL, IDL
19-23
žádná (zůstávají na startu)
chylomikrony
> 75
Tab. 6: Přehled lipoproteinů včetně jejich velikosti (vpravo) a elektroforetické pohyblivosti (vlevo)
5/7
Biochemie
2. ročník
4.1 Klasifikace podle Fredricksona
Klasifikace podle Fredricksona je historicky první klasifikací poruch lipoproteinového metabolizmu.
Fredrickson (1965)3 dělí hyperlipoproteinémie do 6 základních fenotypů s charakteristickými změnami
v lipoproteinovém spektru (Tab. 7). V současnosti se od této klasifikace upouští, protože neobjasňuje
vlastní příčinu choroby a je nahrazována modernějším přístupem využívajícím nové poznatky v
etiopatogenezi hyperlipoproteinémií. Nicméně dělení podle apolipoproteinů je méně názorné.
Lipoproteinový typ je však pouze aktuálním obrazem stavu lipidového a lipoproteinového metabolizmu.
Většina lipoproteinových typů může být způsobena několika genetickými poruchami a naopak některé
geneticky podmíněné hyperlipoproteinémie se mohou projevovat jedním nebo více lipoproteinovými
typy v závislosti na dietě nebo medikamentózní léčbě.
Fenotyp
I
IIa
IIb
III
IV
Lipoprotein
↑↑ chylomikrony
↑↑ β
↑ β a pre-β
hraniční β
↑↑ pre-β
V
↑↑ chylomikrony
a ↑ pre-β
Tab. 7: Dělení hyperlipoproteinémií podle Fredricksona
Obr. 1: Vlevo fyziologický elektroforetický nález (agaróza)4, vpravo denzitometrický záznam pacienta
Obr. 2: Elektroforetické nálezy v rutinní klinicko-biochemické analýze
3 Editorial:
A System for Phenotyping Hyperlipoproteinemia DONALD S. FREDRICKSON and ROBERT S. LEES Circulation.
1965;31:321-327, doi:10.1161/01.CIR.31.3.321
4 Kidney International (2001) 60, 520–532; doi:10.1046/j.1523-1755.2001.060002520.x
6/7
Biochemie
2. ročník
Diskuze:
1. Zamyslete se, jaké rizikové faktory má pacient a proč je ve zvýšeném riziku kardiovaskulárního
onemocnění.
2. Pokuste se vysvětlit, proč u pacientů s vysokou hladinou triacylglycerolů hrozí riziko akutní
pankreatitidy (využijte studijní materiály, internet apod.).
3. Pokuste se interpretovat patologické nálezy v přiložených elektroforetických záznamech.
4. Proč využíváme při elektroforéze stejnosměrný elektrický proud a jaký je význam použití
pufračních roztoků?
5. Zamyslete se nad odvozením Friedewaldovy rovnice pro výpočet hladiny LDL cholesterolu.
Závěr:
7/7
Download

Analýza vybraných parametrů lipidového metabolizmu