OTÁZKY MIKROBIOLOGIE vypracovali: použito výpisků z 2.LF (zdroj Votava), dále Bednář.
Šárka Bohoňková, Martina Panešová, Tereza Koňasová, Markéta Lorenzová, Dagmar Mocná, Petr
Grenar,, 3.LF2012
Obecná část
1. Struktura bakteriální buňky, spóry a sporulace, pouzdro a
glykokalyx
Anatomie bakteriální buňky
Velikost 1-3 mikrometry (spirochety 60, hemofily 0,2)
Tvar
1. koky – staphylococcus, streptococcus, neisseria
2. tyčinky – rovné, krátké, vlákna, robustní, větvící se, zakřivené, kyjovité, vřetenovité…
3. spirály – spirillum, helicobacter, borrelia, treponema, leptospira
Stavba
1. možno: bičíky, pili, fimbrie
2. možno glykokalyx
3. obvykle bakteriální (buněčná) stěna
4. cytoplasmatická membrána
a. transmembránový transport
b. nahrazení mitochondrie – respirační funkce
c. zakotvení rotoru bakteriálních bičíků
d. nepřítomnost cholesterolu, při nižších teplotách je vyšší podíl nenasycených
mastných kyselin
5. nukleoid
a. není jádro, není oddělen membránou, nemá stálý tvar
b. DNA dvoušrobovice uzavřená do superhelicity – fysiologická je negativní, tj. více
rozvolněná, negativní superhelicita je udržována enzymy topoizomerázami (I –
uvolňuje, II – za spotřeby ATP vytváří)
c. při dělení se DNA přichycuje na mesosom – vychlípeninu cyt. memb., rychlost dělení buňky je závislá na frekvenci iniciací replikací (nová může začít ještě během
jiné probíhající)
d. negativní regulace – vyředění inhibitoru replikace v rostoucím objemu buňky
e. při poškození DNA aktivován SOS regulační systém
f. opravy DNA – fotoreaktivace, vystřižení, složitější opravy
g. přítomny histonům podobné proteiny, katalytické a regulační prot. potřebné
k replikaci a transkripci
h. v klidové nerostoucí buňce je jen jeden chromozom, haploidní, 3500 genů, mRNA
neupravována – vysoká rychlost transkripce
i. RNA polymeráza + sigma faktor se váží na promotor, ten předchází operonu
j. konstitutivní genová exprese – různá afinita sigma faktoru k promotorům – různá
frekvence iniciace transkripce
6. plazmid
a. replikon v mimochromozomálním stavu, genetický endosymbiont
b. informace: degradace a oxidace toxických látek, resistence na antibiotika, těžké
kovy, produkce antibiotik, toxinů, tvorba restrikčních a modifikačních enzymů
c. počet kopií plasmidu v buňce 1-100 = plasmidové číslo
d. buňka není sama schopna plazmid vytvořit – může ho získat
i. konjugací přes fimbrie z jiné bakt.buňky – šíření rezistence na antibiotika,
horizontální přenos genetické informace
ii.
transdukcí – přes baktriofág
iii.
transformací – přechod volné DNA z prostředí do buňky (Griffithovy
pokusy, důkaz DNA jako nositele genetické informace)
e. plasmid má schopnost integrace do chromozomu
7. ribosomy
a. jiná stavba než u eukaryot – antibiotika působí jen na bakt. ribosomy – např. streptomycin, tetracyklin, chloramfenikol, erytromycin …
b. 30S (1 RNA, 21 molekul bílkovin) + 50S (2 RNA, 34 m bílkovin) = 70S
c. 60% ribozomů u jádra, 30% při okraji buňky
d. počet ribozomů je úměrný rychlosti růstu buňky (konstatní rychlost překladu asi 13
aminokyselin za sekundu)
e. v daném okamžiku přítomna v buňce 1 mRNA svého druhu (celkem 1000), krátká
doba života – několik minut – rychlá adaptační odpověď
f. 1 mRNA = asi 3 bílkoviny
g. transkripce a translace mohou probíhat zároveň
8. inkluzní tělíska, granula – glykogen, kapénky polybetahydroxymáselné kyseliny – specifická zásobní látka pro bakterie, polyfosfáty, lipidy, vakuoly – nadnášení vodních bakterií
9. možno spory
Buněčná stěna gram poz a gram neg bakterií
Rigidní struktura – udržuje tvar bakterie, ochranná funkce
V hypotonickém prostředí díky buněčné stěně bakterie odolává zvětšení objemu, v hypertonickém
podléhá bakterie plasmolýze (nasolování, nakládání do cukru)
Buněčná stěna se nevyskytuje u mykoplazmat
Přežívající bakterie bez buněčné stěny – L-formy – nejasná role v patogenezi, v této formě mohou
odolávat antibiotikům
Antibiotika beta-latamová, např. penicilin - blokují syntézu v obnově stěny – aniž by blokovaly
štěpení petidoglykanu – stěna zaniká – obnažené buňky nazývané sféroplasty či protoplasty
vystaveny osmotickému tlaku nebo imunitnímu systému, zničeny
Antibiotika beta-latamová působí jen na rostoucí buňku
Základní součástí – peptidoglykan
- výskyt pouze u prokaryot
- vrstvy polysacharidových řetězců
- N-acetylmuramová kys., N-acetylglukosamin - spojené navzájem beta-1-4 vazbami
- na karboxyl N-acetylmuramové kyseliny vázány 4 aminokyseliny
- aminokyseliny pospojované do sítě peptidovými můstky (vznikají transpeptidací –
transpeptidázy možno narušit antibiotiky – penicilinem, cefalosporiny)
Gramovo barvení
1. krystalová violeť – tmavomodré zbarvení buněk
2. Lugolův roztok (I) – v buňkách vzniká komplex violeti s jodem
3. 96%ethanol nebo aceton – gramnegativní bakterie se odbarví
4. safranin nebo karbolfuchsin – gramnegativní jsou dobarveny červeně
Grampozitivní – během barvení komplex krystalové violeti s jodem zůstane uvnitř buňky
- 20 nm
- mohutná vrstva peptidoglykanu
- pevnější peptidoglykanová síť - všechny zbytky kys. N-acetylmuramové spojeny peptidickými můstky
- kolmo k povrchu – kys. teichová – hlavní povrchový antigen, váží kationty
- po rozrušení bakteriální stěny tvoří protoplasty (okrouhlé útvary ohraničené cytopl.memb.
bez zbytku buněčné stěny)
- koky, bacily, klostridia, korynebakteria, listerie, aktinomycety, kvasinky
Acidorezistentní
- stavba buněčné stěny odpovídá grampozitivním bakteiím
- voskovité látky zabrání obarvení
- barvení za horka – pak vzdorují odbarvování
- Mycobacterium tuberculosis, nokardie, bakteriální spory
Gramnegativní – působením alkoholu se odbarví
- 10 - 15 nm
- mechanicky křehčí, chemicky odolnější
- zevní membrána – brání prostupu antibiotik, barviv, solí žluč.kys. …
o fosfolipidová dvojvrstva nebo jednovrstva
o proteiny - porinové trimery, receptory fágů, OmpA proteiny využívané při konjugaci
o lipoproteiny zajišťují pevnou vazbu na peptidoglykan
o lipopolysacharid (endotoxin) – výskyt jen u gramnegativních bakterií – do membrány zakotven lipidem A, vyčnívající polysacharidová část tvoří O antigen (somatický antigen) – protilátky působí dál od buňky
- periplasmatický prostor
o enzymy (např. beta laktamáza štěpící penicilin)
o jednovrstevný peptidoglykan (obsahuje kyselinu diaminopimelovou)
- mezi vnitřní a vnější membránou – adhezivní místa – komunikace mezi membránami
- po rozrušení bakteriální stěny tvoří sféroplasty (okrouhlé útvary ohraničené cytopl.memb.
se zbytky buněčné stěny)
Bakteriální pouzdro a ostatní povrchové struktury
-
extracelulární polymery (glykokalix)
o není u všech bakterií, tvorba ovlivňována okolním prostředím
o polysacharidový charakter (pneumokoky, klebsielly, hemofily...x bacillus anthracispolypeptidy)
o funkce
 adherence (fce adhesinů) - kolonizace hostitele, koagregace bakterií
 tvorba biofilmu
 vzdorování fagocytóze
 rezistence na antibiotika
o typy
 pouzdro
• jasně odděleno od okolí, lne pevně k buněčné stěně
• strukturální integrita (dobře kondenzovaný polymer)
• antigennní vlastnosti, faktor virulence a invazivity
 sliz – volně nasedající amorfní hmota
 S-vrstva – dlaždicovitý glykoprotein na povrchu b. stěny
o znázornění negativním barvením (tuš), mukózní vzhled kolonií
-
fimbrie (pili)
o krátká rigidní dutá vlákna, z proteinových podjednotek, křehká
o jen u G-, desítky až stovky
o fce adhezinů - schopnost kolonizace hostitele
o tvorba fimbrií často koordinována s tvorbou jiných nástrojů patogenity (toxiny)
o sex fimbrie
 širší a delší než obyčejná fimbrie
 kódováno tzv. fertilním plazmidem
 přenos DNA mezi bakteriemi (konjugace)
o curli
 shluky štíhlých a zprohýbaných vlákének
 na povrchu některých escherichií a salmonell
 vazba sérových bílkovin (sepse)
-
bičíky
o orgán pohybu, zdroj E- gradient protonů na membráně
o delší než celá b. - až 20 μm, tloušťka 20-30 nm
o 3 části - vlákno, háček a bazální část
 vlákno z flagelinu (duté, globulární bílkovina, druhově specifický)
 háček (kolénko) - zpevnění a připojení k bazálnímu tělísku, o 90°
 bazální tělísko - zakotvení prstenci do stěny (stator) a cytopl. membrány
(rotor), liší se u G+ a G- (rozdílná savba b. stěny)
o rozdělení bakterií podle bičíků
 monotricha - jeden na pólu - vibria
 lophotricha - svazek na jednom pólu – pseudomonas fluorescens
 amfitricha - svazky na obou pólech – spirillum minus
 peritricha - bičíky po celém povrchu – většina (proteus, escherichia)
o znázornění stříbřením, nepřímý průkaz detekcí pohybu
o axiální vlákna - stavba analogická s bičíkem, ale umístěna pod povrchem b., pohyb
spirochet
Bakteriální spora a sporulace
-
reakce některých G+ (Bacillus, Clostridium) na okolnosti nevhodné pro růst a množení - přetvoření fyziologicky aktivní a vegetativní b. na klidovou, vysoce odolnou sporu bez metabolismu
vysoce světlolomné v mikroskopu (málo vody), nepříjímají Gramovo barvení, barvení podobné
jako u acidorezistentních tyčinek
endospory - spory vznikající uvnitř b.
Streptomyces – tvorba přeměnou vícejaderných vláken
o
o
o
o
sporulace
replikace DNA
invaginace cytopl. membrány - b. rozdělena na 2 části
vznik endospory s dvojitou m. a sporangia (lysuje)
stavba spory
protoplast - genom, malé množství proteosyntetického aparátu, E
poskytuje glykolysa, cytochromy chybí, velké množství Ca a k.
dipikolinové
o náhrada vody vápníkem- kalciumdipikolinátové můstky
1. vnitřní cytoplazmatická membrána
2. vrstva peptidoglykanů
3. kortex - koncentrické vrstvy peptidoglyknů – odolnost
4. vnější membrána
5. plášť spory (bílkoviny bohaté na cystein, nerozpusné
ve vodě) - rezistence vůči UV a ionizujícímu záření
- příklady morfologie bakteriálních spor
o tvar
 oválné – často, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum
 kulaté – Clostridium tetani
o relativní velikost vzhledem k tloušťce b.
 spora bubřící tyčinku – C. botulinum, C. tetani
 spora nebubřící tyčinku – B. anthracis
o uložení
 terminální - C. tetani
 subterminální (paracentrální) uložení – C. botulinum
 centrální uložení – C. novyi
- klíčení (germinace) - 3 fáze
o aktivace spory (laboratoř – ohřátí s vodou, porucha pláště)
o klíčení (germinace) - přijímání vody, hydrolýza kortexu, ztráta rezistence, rozpad stabilizačních
bílkovin
o fáze diferenciační - tvorba nových bílkovin - vnik vegetativní b.
- odolnost
o C. tetani potřeba var 90 min. při 100°, C. botulinum – 5hod. var
o odolávání dezinfekčním prostředkům – etanol, fenol, povrchově aktivní látky
o sporocidní – ethylenoxid, beta-propiolakton, koncentrované louhy a kyseliny, při prodloužené
expozici i formaldehyd, chloramin, kyselina peroctová, autoklávování (20 min horké páry při
tlaku 2atm)
o v podobě spor mohou bakterie přežít i stovky let (Patočka oživil spory bakterií ze střevního obsahu mumifikovaných středověkých mrtvol v Klatovech)
2. Endotoxin, složení a biologické účinky
Obecné vlastnosti toxických bakteriálních proteinů
- toxicita - součást patogenity, schopnost mikroba poškozovat hostitele
-
u plísní, parazitů, nejčastěji u bakterií
termolabilní
dobrými imunogeny, aktivita blokována neutralizačními Ig
mohou být změněny v toxoidy (využívány k aktivní imunizaci)
způsob toxického působení charakteristický pro jednotlivé toxiny
exotoxiny - toxické bakteriální proteiny secernované do okolí producenta, G+
endotoxiny - součástí b. stěny, do okolí se uvolňuje až po rozpadu bakerie, G-, lipopoylsacharid
v zevní m. stěny u G- bakt.
- produkce kódována chromozomálně, na plasmidech nebo vázána na specifického bakteriofága
(difterický)
- produkce ovlivňována koncentrací iontů (Fe, Ca, Mg)
- dělení podle místa zásahu
o reakce s membránami eukaryotických b.- poškození b.- cytolytické b.
o proniknutí do b. po vazbě na specifický receptor, ovlivnění fyziologie b.
o
o
o
o
o
o
o
o
dělení podle cílových orgánů
neurotoxiny (butulotoxin, tetanospazmin)
enterotoxiny (choleragen, toxiny E. coli)
dermonekrotoxiny (difterický, stafylokokový alfa toxin)
cytotoxiny (Clostridium difficile)
kardiotoxiny (difterický, OL streptolysin)
kapilarotoxiny (B. anthracis)
hemolysiny, leukocidiny
toxiny s vlastností superantigenů (streptokokové pyrogenní, stafylokokový toxického šoku)
Význam endotoxinu
-
lipopolysacharidový komplex
do okolí se uvolňuje až po rozpadu bakt.
v zevní membráně G- bakterií
3 části
o lipid A - vlastní toxická část ukotvena v zevní membráně, toxická složka je tedy
uložena v m., může se projevit až po rozpadu bakterie
o střední polysacharidová část
o O-antigen - periferní konec, vyčnívá z povrchu mikroba
-
k uvolnění endotoxinem může dojít:
o po fagocytóze a intracelulární destrukci bakterie
o při rozpadu bakterií účinkem vlastních autolytických enzymů
o v důsledku cytolýzy komplementem
o účinkem membránově působících ATB
-
účinky endotoxinu
o pyrogen - zvýšení teploty - toxin stimuluje mononukleární fagocyty k produkci
endogenních pyrogenů (interleukin-1 a TNF) - vasodilatace
o aktivace komplementového systému (alternativní dráhu) - důsledkem je cytolýza b.
spojená s dalším uvolňováním toxinu
o aktivace makrofágů, neutrofilů, lymfocytů B - vznik lokální zánětlivé reakce, při
vyšších koncentracích - vznik endotoxického šoku
o poruchy srážlivosti
 aktivuje f.XII - spouští srážecí kaskádu
 ovlivňuje krevní destičky - uvolnění obsahu granul
 ovlivňuje neutrofily - uvolnění bílkovin stabilizující fibrinové sraženiny
 ovlivňuje endotelie
-
je nutno počítat s rizikem endotoxemie při sepsích vyvolaných G- bakt.
nízká hladina endotoxinu v organismu působí pozitivně (stimulace imunity)
ve velké koncentraci nastává riziko toxického šoku a DIC (často končí smrtí)
-
endotoxický šok - hypotenze, disseminovaná intravaskulární koagulopatie (DIC), vasodilatace, snížený výkon myokardu (poruchy oxidace)
3. Genetická informace bakterií, extrachromosomální genetická
informace a její přenos
Variabilita bakterií, bakteriální DNA a její změny (genetická informace, chromozom,
plasmidy, transpozony)
-
bakteriální genom- na chromosomu i extrachromosomálních elementech (plasmidech)
bakteriální chromozom
o haploidní
o 1 kruhová DNA sbalená do klubka
o o tři řády méně informace než lidský genom
o informace bez přerušení (bez intronů)
o promotor před kódující oblastí a vedoucí sekvence na začátku
 promotor - začátek genu, často jsou na něj vázány i regulační úseky
 operon - sekvence operátoru + určité skupiny polypeptidů
• operátor - váže se na něj represor nebo aktivátor a určuje kdy se gen
projeví
• jediným represorem často řízená syntéza několika genů
o ostrovy patogenity – geny kódující faktory virulence
o koncová sekvence a terminátor na konci
-
replikace
o probíhá oběma směry proti sobě, semikonzervativní
o DNA-polymerasa – řídí syntézu i opravy
o vedoucí řetězec - od 5 k 3 konci, syntéza kontinuálně
o zaostávající vlákno – syntéza Okazakiho fragmentů – spojovány ligasou
o trvá 40 minut
o enzymy: helikasy – rozplétání, topoisomerasy – uvolňuje napětí ve vznikající DNA,
gyrasy – odstranění nadbytečných závitů
-
exprese genu
o transkripce do RNA
 DNA-dependentní RNA-polymerasa
 nasedá na promotor sigma faktorem
o translace
 ribosomy menší a strukturálně odlišné od ribosomů eukaryot (antb. účinkují
selektivně jen na bakterie)
 velmi rychlá – ribosomy se připojují hned na ještě nehotovou mRNA
o kontrola genové exprese
 schopnost adaptovat se na změnu prostředí (vniknutí do hostitele)
 dvoustupňový proces - sensor > aktivátor / represor
-
mutace
o bodové, větší změny - delece, inverze, inzerce
o mnohé mutace vedou k přerušení metabolické dráhy - auxotrof (nevyroste na kultivačním médiu, kde chybí onen produkt)
o možnost vzniku výhodných znaků - schopnost odolat bakteriofágům, chemikáliím
či ATB
o mutace spontánní x indukované


-
analogy bází, alkylační činidla, interkalační agens
Amesův test mutagenity – čím více auxotrofních kmenů zpětně mutuje – tím
více jich na médiu vyroste – tím je médium mutagennější
plasmidy
o malé, cirkulární mlk DNA
o nezávislé na bakteriálním chromozomu, samostatná replikace
o nesou několik desítek genů, které nejsou pro bakterii nezbytné
o episomový plasmid - může existovat i integrovaný do chromosomu
o konjugativní plasmid - geny pro tvorbu pilů, během konjugace dokážou přenášet své
kopie do jiných bakterií
o příklady plasmidů:
o F-faktor - geny pro tvorbu sex-pili, připojení b. F+ k b. F-, E. coli, salmonely
o R-faktor - rezistentní faktor, geny pro enzymy rozkládající, modifikující ATB
 často součástí transpozonu - bakteriální kmen se může rychle stát nositelem
plasmidů mnohočetné rezistence
 často bývají konjugativní - šíření
o Col-plasmidy – produkce baktriocinů zabíjejících jiné bakterie
o plasmidy virulence - tvorba endotoxinu, kolonizačních faktorů
o metabolické plasmidy
-
rekombinace - přerušení a opětovné spojení DNA s výměnou jejích segmentů
o heterologní
 vnesení nových genů
 vzájemná výměna mezi párem homologních sekvencí DNA
 transpozony, integrony
o transpozony
 přesouvání uvnitř genomu i z plasmidu na chromosom
 „skákavé geny“
 přesunem tr. se mohou spouštět a vypínat určité geny
 od viru se liší tím, že postrádají reprodukční cyklus, od plazmidu neschopností samostatné replikace a existence mimo chromosom
 po včlenění - mutace, může nést stop-kodóny, terminační sekvence, promotory
 inzerční sekvence - nejjednodušší typ transpozonu, nese jen gen pro trasposasu a obráceně orientované sekvence na konci (inverted repeats)
 složené transpozony - alespoň jeden gen navíc oproti IS, (geny pro faktory
virulence, pro rezistenci na ATB)
o homologní - některé bakterie mění své vlastnosti přeskupením vlastních genů
 místní inverze
 genová konverze - gonokoky (Neisseria gonorrhoea)
• změna antigenního složení fimbrií, vznik nových sérotypů
• řada genů pro Ag, jen jeden je funkční a ostaní defektní - množení a
přeskupení genů → fční gen se stává defektní a nějaký z defektních
zase fční
-
mezibakteriální výměna genetické informace - konjugací, transformací, transdukcí
o konjugace - přenos genetické informace přímým stykem mezi b., většinou u G- bakterií, přenos jak plasmidových tak chromosomálních genů
 přenos faktorů virulence
 přenos R-faktorů, plasmidů obsahující geny rezistence na ATB
 konjugace F+ (donor) s F- (recipient) – vznikají 2 F+, přenáší se fertilní Ffaktor nesoucí geny pro konjugaci
 konjugace Hfr - F-faktor je epizomální, vysoká frekvence rekombinací,
přenos genů chromozomu
 konjugace F’ – přenáší se nejen F-faktor, ale i malý počet chromosomálních
genů, šíření genů v bakteriální populaci
o transformace - bakterie převezme část DNA jiné bakerie a včlení ji do svého chromosomu
 dárcovská DNA se váže na buněčný povrch, jedno vlákno je rozloženo,
druhé pomocí přenašeče do buňky
 schopnost má jen každá 1000. bakterie
 DNA z rozložených bakterií
 u grampozitivních vyžadována přítomnost kompetenčního faktoru
 běžně u hemofilů a neisserií
 přenášejí se geny pro virulenci, rezistenci
o transdukce - zprostředkování bakteriofágy, omylem zabalená část plasmidu nebo
chromozomu
 může se přenést jakákoliv část genomu
 přijatá bakteriální DNA se buď rozloží, integruje, nebo neintegruje
 fágová konverze - produkce toxinu díky fagovému genomu (záškrt. tox.)
4. Pasivní imunizace u infekčních stavů, příklady
(výcuc z Bednáře – doplnit?)
= aplikace specifických hyperimunních globulinů
- prevence a terapie virových nákaz v některých případech




varicela zooster (VZV Ig) – prevence a terapie nákazy u dětí s imunodeficitem
cytomegalovirus (Cytotect) – posttransplantačně
hepatitida B (HB Ig) – prevence u osob, u nichž došlo k vědomému ohrožení (poranění
kontaminovanou jehlou) nebo prevence perinatálního přenosu z nemocné matky na dítě
užívá se i běžný lidský Ig – proti některým nákazám (např. hepatitida A, spalničky) – díky
všeobecnému promoření nebo očkování populace
5. Aktivní imunizace, typy očkovacích látek
(výcuc z Bednáře – doplnit?)
= vznik specifické imunity aplikací živých nebo neživých očkovacích látek
- navození aktuální protektivní hladiny (chřipka)
- indukce paměťových buněk (klíšťovka)
- někdy indukce specifické buněčné imunity (spalničky, herpesviry…)
živé očkovací látky
- riziko generalizace, infekce plodu, neúčinnost pro interferenci s jinou právě probíhající
infekcí!!!
- avirulentní mutanty, aplikace do podkoží – snížení rizika




virus vakcinie – pravé neštovice (již eradikovány)
vakcína 17D proti žluté zimnici
Sabinova živá vakcína proti poliomyelitidě – p.o., očkování na jaře
vakcíny proti spalničkám, zarděnkám, příušnicím – trojkombinace (není interference)
neživé očkovací látky
- menší antigenní podnět – nutné opakované dávky
- 2 typy:
a) Celovirionové – víc imunogenní, ale i reaktogenní – NÚ: někdy projevy autoimunity
b) Subjednotkové – jen antigen – méně imunogenní, ale i míň reaktogenní
- často doplněny adjuvancii (zvýšení imunogenicity)






vzteklina – celovirionová, i postexpoziční vakcinace
Salkova neživá vakcína proti poliomyelitidě – celovirionová, parenterální, minimálně 3 dávky,
brání vzniku virémie, ale ne množení virů v GIT => očkovaní lidé zdrojem nákazy!
vakcíny proti arbovirům (proti Japonské encefalitidě B, klíšťové encefalitidě,…) –
celovirionové (výjimka: žlutá zimnice)
protichřipkové vakcíny – 60-70% účinnost ochrany, celovirionové i subjednotkové
vakcína proti hepatitidě A – dobře imunogenní, 2 dávky po 6 měsících, ne plošně
vakcína proti hepatitidě B – subjednotková (purifikovaný HBs antigen), imunogenní díky
agregaci, perorální aplikace, očkování profesionálně ohrožených skupin
6. Fyzikální metody sterilizace a desinfekce, chemické metody
sterilizace a desinfekce
-
Dezinfekce - ničení či zneškodňování patogenních mikroorganismů na neživých předmětech, ve
vnějším prostředí a v infekčním materiálu.
Sterilizace - zničení všech živých mikroorganismů, včetně vysoce rezistentních bakteriálních
spór
Kontrola sterilizace a dezinfekce - papírové indikátory nebo bioindikátory, stěry…
Antisepse
zneškodňování patogenních zárodků v prostředí živých tkání, v ranách, na sliznicích a na kůži
namířena hlavně proti mikrobům vyvolávajícím hnisání
není striktní požadavek na baktericidní účinek jako u dezinficiencií, stačí bakteriostatické působení
antiseptika musí splňovat požadavek nejedovatosti a dobré snášenlivosti živými tkáněmi. Na
rozdíl od dezinficiencií proto podléhají schválení jako každý jiný lék.
u antiseptik není nutná dobrá rozpustnost ve vodě.
Asepse
- souhrn opatření vedoucích ke stavu, kdy v prostředí je minimum mikroorganismů
asepse si klade za cíl zabránit přístupu mikroorganismů k živým tkáním při chirurgických operacích a to používáním sterilních nástrojů, obvazových látek, šicího materiálu, pryžových rukavic, přípravou operačního pole, dezinfekcí chirurgových rukou, používáním ústenek apod.
pojem asepse zahrnuje také laboratomí a výrobní metody, u nichž je snaha zabránit mikrobiální
kontaminaci např. u mikrobiologických laboratomích prací a při výrobě některých léků
FYZIKÁLNÍ METODY STERILIZACE
Vlhké teplo
1. Přerušovaná, frakcionovaná sterilizace je sterilizace varem (100°C) působícím po dobu
30 minut v 18-24 hod. intervalech tři dny po sobě. Sterilizovaná látka musí být v mezidobí
uložena při pokojové teplotě, aby termorezistentní spóry, které var přežily, mohly vyklíčit.
Následující var je pak ničí jako vegetativní formy bakterií.
2. Tyndalizace se používá ke sterilizaci termolabilních roztoků bílkovin, které koagulují již
při teplotě 60°C. Roztok se zahřívá ve vodní lázni při 56-58°C (resp. při 60-80°C) po 3060 minut 3 dny po sobě.
3. Sterilizace nasycenou vodní parou pod tlakem (v autoklávu) se provádí nejčastěji za přetlaku 100 kPa při teplotě 120°C po dobu 20-30 minut. Umožňuje zničit bezpečně všechny
formy mikroorganismů.
Suché teplo
méně účinné než pára pod tlakem, nižší koeficient vodivost, a proto probíhá při vyšší teplotě a po
delší expoziční dobu
1. Otevřený plamen
se používá při žíhání bakteriologické kličky, k likvidaci pokusných zvířat a některých
předmětů malé hmotnosti, např. kontaminovaných obvazů.
2. Horkovzdušná sterilizace
skla, porcelánu, kovů, se provádí v horkovzdušných sterilizátorech
Záření
1. Ultrafialové záření (UV)
o optimální baktericidní účinek je při vlnové délce kolem 254 nm, kdy je záření maximálně absorbováno nukleovými kyselinami
o zářiče se používají obvykle germicidní lampy
o sterilizaci vzduchu, ploch přímo vystavených paprskům - operačních sálů, aseptických boxů, piteven, apod.
o účinnost UV klesá se čtvercem vzdálenosti ozařovaného objektu, obvykle účinné na 30-50 cm
o nepenetruje předměty
2. Ionizující záření
o penetruje, ale nezahřívá sterilizovaný předmět a nemění vlastnosti většiny sterilizovaných látek
o zdrojem gama záření v praxi je obvykle radioaktivní kobalt (60CO)
o Gama záření se používá k průmyslové sterilizaci (obvazový materiál,plasty)
o Mezinárodně stanovená sterilizační dávka je 27 kGy.
Filtrace
1. Azbestové Seitzovy filtry - z azbestu a celulózy
2. Skleněné jenské filtry - z borosilikátového skla ve formě porézních destiček zatavených
v nálevkách, používají se opakovaně
3. Membránové ultrafiltry - z nitrocelulózy s různou velikostí pórů a průměru, filtrace se
provádí za použití negativního tlaku pomocí vývěvy
CHEMICKÉ PROSTŘEDKY DEZINFEKCE
- závislost na koncentraci a době působení (expozice)
- kritéria kvality dezinfekčních prostředků pro volbu jejich použití:
a. široké spektrum účinku, jen málo látek působí zároveň baktericidně, virocidně i fungicidně
b. při trvalém používání nevzniká rezistence
c. nejsou toxická
d. mají rychlý dezinfekční účinek
e. k dezinfikovanému předmětu jsou inertní
f. dezinfekční účinek je stálý za různých změn vnějších podmínek
Mechanismus účinku
Antimikrobní látky nejčastěji přímo poškozují strukturu mikroorganismů nebo narušují jejich
základní metabolické procesy, např.
- oxidací (sloučeniny chlóru, peroxidy, peroxid kyseliny)
- redukcí (aldehydy)
- hydrolýzou (kyseliny, louhy)
- dehydratací (alkoholy)
- koagulací bílkovin (alkoholy, fenoly)
- změnou perneability (detergenční látky)
Zásady a kyseliny: Silně anorganické kyseliny a zásady se pro své toxické a agresivní účinky
používají v praxi zřídka. Např. vápenné mléko, kyselina boritá, kyselina peroctová, persteril –
chemická sterilizace (32-36% roztok kyseliny peroctové s 10 % H2O2 a 1 % H2SO4)
Oxidační prostředky: peroxid vodíku, manganistan draselný
Sloučeniny halogenů: chlorové vápno, Chloramin B, Dikonit
Jód a jeho sloučeniny: jódová tinktura, jodofory, Jodonal B, Jodisol
Sloučeniny těžkých kovů: Hg, Cu, Sn, Ag (credéisace) - Famosept, Merfen, Merthiolát
Alkoholy: etanol (60% nejúčinnější), n-propanol, etylenoxid
Aldehydy: formaldehyd, formalin, glutaraldehyd
Fenolové deriváty: krezoly, Lysol, Orthosan BF 12
Povrchové aktivní látky: Ajatin, Septonex, Ophthalmo-Septonex
7. Strukturní typy antimikrobiálních látek. Mechanismy účinku
antimikrobiálních látek
Rozdělení ATB a chemoterapeutik podle mechanismu účinku
- Antimikrobiální látky
o antibiotika (přírodní původ – plísně, streptomycety)
o chemoterapeutika
- selektivně toxická pro mikroba – chemoterapeutický index – poměr mezi dávkou toxickou pro
hostitele a účinnou na mikroba (vyšší – nižší toxita pro makroorganismus)
- baktericidní látky – usmrcují mikroby, obvykle do 48 hodin
o beta-laktamy (penicilin, cefalosporiny)
o aminoglykosidy (streptomycin, gentamicin), polypeptidy (colistin), glykopeptidy (vankomycin),
ansamyciny (rifampicin)
o chemoterapeutika - co-trimoxazol, nitroimidazoly, chinolony (kys. oxolinová), některý antituberkulotika (isoniazid)
- bakteriostatické – reverzibilní zástava množení, efekt patrný za 3-4 dny
o tetracykliny, chloramfenikol, makrolidy (erytromycin), linkosamidy, antituberkulotika, antimykotika (fungistatická)
- MIC – minimální inhibiční koncentrace – k zabránění růstu
- MBC – minimální baktericidní koncentrace - nejnižší koncentrace látky, která během 24 hodin
usmrtí 99,9% původní populace
- efekt závisí na dávce (aminoglykósidy, metronidazol), nebo době (betalaktamy, glykopeptidy)
mechanismus účinku
1.
2.
blok syntézy buněčné stěny – baktericidní
beta-laktamy (peniciliny, cefalosporiny…)
glykopeptidy (konečná fáze syntézy stěny - vankomycin)
antituberkolitika (izoniazid)
inhibice syntézy NK – baktericidní, toxičtější
- chinolony - vazba na komplex DNA-gyrasa s DNA a zabránění replikace
- nitroimidazoly (rozrušení DNA)
- ansamyciny (interference s transkripcí) - rifampicin – zabraňuje syntéze mRNA polymerázy
3. poškození buněčných membrán – baktericidní, toxické
-
polypeptidy (kolistin, polymyxin B) - působí jako detergens > membrána ztrácí selektivní permeabilitu a integritu
- azolová antimykotika (amfotericin B) - antimykotikum, vazba na steroly hub a kvasinek > detergens, imidazoly (inhibice syntézy ergosterolu v membráně hub)
4. potlačení proteosyntézy
baktericidní aminoglykosidy, bakteriostatické tetracykliny – ireverzibilní vazba na 30S,
není tvorba iniciačního komplexu, tvorba nefunkčních bílkovin
makrolidy – vazba na 50S a zabránění posunu 70S k následujícímu kodonu, bakteriostatický v nižších koncentracích
linkosamidy – kompetují na 50S o vazebné místo
chloramfenikol – vazba na 50S a zabránění transpeptidace, bakteriostatický
5. antimetabolity – bakteriostatické
sulfoamidy – (blok syntézy kys. listové)
trimethoprim (inhibije vznik tetrahydrofolátu)
jejich kombinace co-trimoxazol baktericidní
spektrum účinku
1. úzké – antituberkulotika, spektinomycin (kapavka)
2. střední
a. penicilin (g+ mikroby, g- koky, g- spirálovité mikroby)
b. převážně na grampozitivní – penicilin, oxacilin, erythromycin, linkosamidy, glykopeptidy
c. gramnegativní – aminoglykosidy, cefalosporiny III. Generace, polypeptidy
3. širokospektré – tetracykliny, chloramfenikol, rifampicin, cotrimoxazol
8. Vyšetřování citlivosti na antimikrobiální látky, rezistence bakterií
na antimikrobiální látky
Vyšetřování citlivosti na antimikrobiální látky
Metody kvalitativní
- diskový difúzní test
- metoda jednoduchá, levná a spolehlivá
- difúze antibiotické látky z disku do agarové půdy (Mueller-Hintonův agar – nízký obsah látek
inhibujích atb)
- na MH agaru se netestují: neisseria, haemophilus (čokoládový agar – přidáno 5 % beraních
erytrocytů)
- se vytvoří koncentrační spád testovaného antibiotika
- půda musí být nalita do Petriho misky do výšky 4 mm, pH v rozmezí 7,2-7,4
- antibiotikum je aplikováno na naočkovanou půdu ve formě tzv. antibiotického disku
Metody kvantitativní
- diluční mikrometoda - varianta diluční metody v bujónu – očkování na mikrotitrační destičky
- Agarová diluční metoda slouží k hodnocení nových antimikrobních látek, je však ekonomicky
náročná a pracná.
- Cílem obou metod je stanovení:
o minimální inhibiční koncentrace (MIC) je taková nejnižší koncentrace (mg/l) testované látky,
která je schopna ještě potlačit růst daného mikroba
o minimální baktericidní koncentrace (MBC) - taková koncentrace antimikrobní látky, která
mikroba již usmrtí
Kombinované metody – Etest
- metoda, která kombinuje difúzní a diluční principy
- je to tedy stanovení minimální inhibiční koncentrace difúzní metodou
- jako médium používáme u většiny bakterií MH agar, při zvýšených nárocích půdu obohacujeme
- antibiotikum je napuštěno do plastového proužku, na proužku je stupnice, která udává stoupající (resp. klesající) koncentraci antibiotika, proužek se pokládá na médium
- test je jednoduchý, nevýhodou je jeho vysoká cena.
Rezistence bakterií na antibiotika
= znamená odolnost mikroorganizmů vůči působení antibiotika.
Rezistence primární odpovídá geneticky podmíněné necitlivosti bakterií na dané antibiotikum bez
ohledu na event. předchozí kontakt s antibiotikem (aminoglykosidy v monoterapii nepůsobí na
anaerobní infekce). Rezistence sekundární vzniká až v průběhu antibiotické terapie nebo následkem předchozího podávání antibiotika. V přítomnosti antibiotika se selektují rezistentní kmeny,
které se nacházejí v každé velké bakteriální populaci. Rychlost rozvoje sekundární rezistence závisí
na frekvenci mutací a na množství bakterií s určitým stupněm rezistence. Sekundární rezistence má
dva typy:
1.
penicilinový typ (multiple step mutation) vzniká po dlouhodobém podávání některých antibiotik – např. penicilinu, chloramfenikolu,bacitracinu.
2.
streptomycinový typ (one step mutation), s rychlým vznikem vysoce rezistentních
kmenů je znám u streptomycinu, erytromycinu, linkomycinu, rifampicinu.
Rezistence může být přenosná. Nejčastěji je zprostředkovaná plazmidy, má charakter sekundárního
typu a je častější u gramnegativů. Genetický materiál může být předáván z jednoho mikroorganizmu na druhý konjugací (spojením bakterií a translokací DNA) nebotransdukcí (DNA plazmidu je převzata do bakteriálního viru a je jím přenesena do další bakterie).
Obecné mechanizmy rezistence:
 omezená penetrace antibiotika do bakteriální buňky
 změna cílové struktury (receptoru)
 metabolické změny v bakteriální buňce, které zabrání účinku antibiotika na cílových strukturách
 enzymatická inhibice/inaktivace antibiotika
Tab. Přehled mechanizmů rezistence na nejčastěji používaná antibiotika
Antibiotikum
Beta-laktamová
Mechanizmy rezistence
produkce beta-laktamáz
snížení permeability buněčné stěny změna penicilin-vazebných proteinů
Aminoglykosidy a makroli-
snížená vazebnost na ribozómy
dy
Chloramfenikol
snížení permeability buněčné stěny produkce inaktivujících enzymů
snížení vazebnosti na cílové ribozómy
snížení permeability buněčné stěny zvýšení aktivity chloramfenikol-acetyltransferázy
Tetracykliny
snížený transport k ribozómům
aktivní buněčný eflux (vylučování antibiotika z buňky)
Chinolony
rezistence DNA-gyrázy
snížení permeability buněčné stěny aktivní buněčný eflux
Sulfonamidy, Trimetoprim
rezistence syntetázy kyseliny listové
rezistence reduktázy kyseliny dihydrolistové snížení permeability buněčné
stěny
Zkřížená rezistence znamená současnou necitlivost mikroorganizmů na antibiotika, která mají
podobnou chemickou strukturu a stejný mechanizmus účinku. Při oboustranně zkříženém
typu rezistence na jedno antibiotikum znamená rezistenci i na antibiotikum druhé (penicilin G a V
nebo tetracykliny navzájem). Při jednostranně zkříženém typu rezistence může být citlivost baktérií
vůči jednomu z antibiotik zachována (meticilin a penicilin G – stafylokoky rezistentní na penicilin
G nemusí být rezistentní na meticilin; meticilin-rezistentní stafylokoky jsou zcela určitě rezistentní
na penicilin G).
Mechanismy vzniku antibiotické rezistence
Podstata rezistence
- změna cílové mlk ATB - (MRSA), beta laktamy, makrolidy, linkosamidy
- zhoršení průniku do buňky – aminoglykosidy, tetraracykliny, chinolony
- aktivní eflux z buňky – aminoglykosidy, tetracykliny, chinolony
- inaktivace enzymy – aminoglkosidy, beta-laktamy
-
Globální příčiny růstu rezistence
- narůstající spotřeba (nejen humánní medicína)
používání ATB v neindikovaných případech a pro pocit „bezpečí“, vyžadování ATB některými
pacienty (rodiči)
nevhodná aplikace (dávka - poddávkování, dávkovací interval)
rizika spojená zejména s používáním některých skupin (fluorochinolony, některé makrolidy)
migrace, socioekonomické podmínky, cestování
používání antibiotik v zemědělství
Mechanismy vzniku rezistence
– mutace
– přenesení genu pro rezistenci plasmidem (promiskuitní plsmd - přenos mezi druhy)
– transpozony – genetický element integrující se do chromosomu nebo plastidu
9. Fyziologická bakteriální flóra lidského těla a její význam
IV-1. Normální flóra lidského těla
každý jedinec po narození postupně osídlen mikroorganismy ze zevního prostředí
normální flóra - bakterie a plísně, ne viry
povrch těla (kůže, sliznice GIT, urogenitálního a respiračního traktu) trvale kolonizován omezeným počtem druhů
o jednotlivé druhy jsou pro každou oblast charakteristické
o v této lokalitě se jako patogeny vůči hositeli nechovají
-
vzájemný kvantitativní vztah mezi druhy udržován v rovnováze a konstantní
o narušení rovnováhy
 změny zevní (chemické i fyzikální)
 změny vlastností hostitele (hormonální, stav imunity, léky)
o žádný z druhů normální flóry není primární patogen, ale v jiných lokalitách se může
jako podmíněný patogen uplatnit (popř. vyvolat i smrtelnou infekci)
-
flóra normální x flóra transientní (přechodná)
o krátkodobá kolonizace, bez patologických změn
o dlouhodobé přetrvání transientní flóry - svědčí o změně fyziologických poměrů
(Klebsiella pneumonie v nose, E. coli na tonsilách)
Normální flóra kůže
ovlivněno vlastnostmi kůže - vlhkost, umístění mazových a potních žlázek, kontaminace ze sousedních sliznic (nos, konečník)
hl. bakteriální druhy
o Sta. epidermidis
o Sta. hominis a ostatní koaguláza negativní stafylokoky
o Sta. aureus často na perineu a v nose (i sliznice)
o v místech s mazem (TAG) - bakterie s lipázou (lipofilní korynebakteria, anaerobní
propionibakterie, Acinetobacter...)
o největší osídlení v uzavřených oblastech (axila, mezi prsty nohou, perineum)
Respirační trakt
více ekosystémů s charakteristickou flórou - nosní průduch, orofarynx, tonsily, larynx, trachea a plíce
nosní dutina - Sta. epidermidis, koryneformní bakterie, Sta. aureus (10%)
farynx - ústní streptokoky, nepatogenní neisserie, výjimečně nevirulentní neopouzdřené fáze Str. pneumoniae, Neisseria meningitidis, H. influenzae
Zažívací trakt
množství bakterií v dutině ústní podobné jako v tlustém střevě (1011/g vlhké váhy)
zuby - zubní plak
o bakterie obklopeny extracelulárními polysacharidy s (-) nábojem, váží se elektrostaticky na Ca2+ zubní skloviny
o kyseliny vznikající bakteriálním metabolismem poškozují sklovinu- zubní kazy
o Str. mutans
o anaerobní flóra pod okraji zubní sliznice a v dentálních chobotech (Bacteroides,
Veilllonela, Aktinomycety, Bifidobakterie)
jícen, žaludek - žádný průkaz flóry (x Helicobacter), rychlá pasáž obsahu do
žaludku, HCl
-
střeva - osídlení se liší podle typu stravy a podle geografických oblastí
o množství bakterií ovlivněno aciditou žaludku, pohyblivostí střeva
o tenké střevo - spíše transientní flóra (ústní streptokoky, enterokoky, enterobakterie a laktobacily), rychlá peristaltika, žluč
o tlusté střevo - více než 400 druhů
 95% striktně anaerobní druhy - Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus a Clostridium
 enterobakterie - E. coli
 Cl. difficile - riziko při jejím přemnožení
Močové cesty
normálně je osídlena pouze sliznice přední části močové trubice (kontaminace
moči při běžném odběru)
Sta. epidermidis, Enterococcus faecalis, koryneformní tyčky, (E. coli, proteus)
Pohlavní systém
ženy
o zevní genitál - flóra podobná jako na kůži
o vagina - flóra ovlivněna hormonálně
 v dětství je flóra podobná té na kůži
 v pubertě osídlení laktobacily (fermentace glykogenu a snižování pH)
 občas Str. agalactiae
IV-2. Význam přirozené bakteriální mikroflóry
každý jedinec po narození postupně osídlen mikroorganismy ze zevního prostředí
normální flóra - bakterie a plísně, ne viry
povrch těla (kůže, sliznice GIT, urogenitálního a respiračního traktu) trvale kolonizován omezeným počtem druhů
o jednotlivé druhy jsou pro každou oblast charakteristické
o v této lokalitě se jako patogeny vůči hositeli nechovají
-
vzájemný kvantitativní vztah mezi druhy udržován v rovnováze a konstantní
o narušení rovnováhy
 změny zevní (chemické i fyzikální)
 změny vlastností hostitele (hormonální, stav imunity, léky)
o žádný z druhů normální flóry není primární patogen, ale v jiných lokalitách se může
jako podmíněný patogen uplatnit (popř. vyvolat i smrtelnou infekci)
-
flóra normální x flóra transientní (přechodná)
o krátkodobá kolonizace, bez patologických změn
o dlouhodobé přetrvání transientní flóry - svědčí o změně fyziologických poměrů
(Klebsiella pneumonie v nose, E. coli na tonsilách)
-
význam normální flóry
o ovlivňování imunokompetence hostitele
 uvolňování Ag a bakteriálních imunomodulátorů
 obtížný vývoj imunity u bezmikrobiálních jedinců
o ovlivňování fyziologických funkcí
 trávení (vstřebávání,peristaltika…)
 produkce vitaminů
o jiné mechanismy





-
-
obsazení buněčných receptorů
kompetice o živiny
změny prostředí pH
produkce bakteriocinů
vznik metabolických produktů inhibujících růst (k. mléčná)
větší riziko endogenní infekce než infekce z vnějšího prostředí u imunosupresí
v dnešní době častá porucha rovnováhy
o onemocnění (nádory, diabetes)
o podávání léků (ATB, cytostatika, imunosupresiva) - Cl. difficile
o operace, dlouhodobé zavádění umělohmotných katétrů - Sta. epidermidis
pak představuje i normální flóra velké riziko infekčních komplikací
omezení rizika dekontaminací a vyhubením flóry před rizikovými výkony
(transplantace, imunosuprese), následuje opětovná rekolonizace s využitím známých druhů
normální flóry s dobrými adherenčními vlastnostmi
10. Patogenita a virulence bakterií, příklady
Patogenní působení mikrobů, vztah hostitele a mikroba
Vztahy organismů
- symbióza - soužití dvou a více různých organismů
- endosymbióza x ektosymbióza
- symbiont - kterýkoliv mikroorganismus, který aspoň část života tráví s jiným organismem
- tři formy symbiózy
o komenzalismus - komenzálovi přináší užitek a hostiteli neškodí (normální střevní
flora)
o mutualismus - oba partneři mají prospěch (E. coli a produkce vit B a K, znesnadnění osídlení patogeny)
o parazitismus - organismus škodí hostiteli - přímo, nebo mu jen ubírá živiny - IC paraziti, ektoparazité (veš), endoparazité (tasemnice)
- parazit x saprofyt
o parazit jako organismus, který alespoň někdy vyžaduje jiný živý organismus
o saprofyt - mikrob nepotřebuje jiný organismus, jen neživé org. látky - patogenní saprofyt - Cl. botulinum, Histoplazma capsulatum
-
patogenita
o důsledek parazitismu
o schopnost druhu poškozovat a vyvolat onemocnění
o vlastnost u mikroorganismů poměrně vzácná
 schopnost proniknout do makroorganismu a udržet se v něm
 schopnost získávat živiny
 odolávat obranným mechanismům hostitele
o dynamický stav - patogen se snaží množit a hostitel se ho snaží zbavit
o tendence k vyrovnanosti vztahu, onemocnění by mělo být výjimkou - možná smrt
makroorganismu je často i konec patogenu (mnohdy ale příznaky onemocnění pomáhají šíření patogenu)
o patogenita - vlastnost druhová, týká se určitého druhu mikroba
o primární patogeny (obligátní) – schopnost vyvolat onemocnění u zdravých osob,
např. Str. pyogenes, Tr. pallidum, shigely, V. cholerae…
o oportunní patogeny (fakultativní) - při poškození obranných mechanismů, u
oslabených jedinců, po lékařských zákrocích (kanyla), např. E.coli (průjem kojenců)
-
virulence - vlastnost individuální, stupeň patogenity určitého kmene mikroba
o LD50 (50% letální dávka) – ke stanovení virulence
o Zesílení virulence – při opakovaném přenosu kmene na stejném druhu hostitele – nozokomiální nákazy
o atenuace - snižování virulence, z kmenů se sníženou virulencí (někdy i avirulencí)
se připravují očkovací látky
-
vztah mezi odolností hostitele a patogenitou mikroba
o hostitel - vnímavost  rezistence
o mikrob – primárně patogenní  oportunně pat.  nepatogenní
Faktory patogenity
o přenosnost
 závisí na
• počet mikrobů vylučovaných
• rezistence mikrobů
• infekční dávka (nízká u mycobacteria, shigel)
• chování hostitele (kašel, kýchání, průjem, změna chování)
 typy přenosu
• sliny (respirační, aerosol), fekálně orální cestou, pohlavně
• zvířecí vektor, zvířecí rezervoár
o toxicita - schopnost mikroba poškozovat hostitele
 poškození přímé
• buněčná smrt – vlivem toxinů, následkem intracelulárního množení,
mikrobiálně indukovanou apoptózou
• postižení metabolismu farmakologickým vlivem toxinů
• mechanické příčiny (paraziti, záškrt)
 poškození samotnou obrannou reakcí hostitele
o invazivita
 schopnost vstoupit
• adherence – viz I-09
• penetrace
o přímá – neporušenou kůží (leptospiry), drobné trhlinky
(stafylokoky, streptokoky), pokousání, bodnutí členovce, pomocí enzymů (clostridium perfringens)
o vynucenou fagocytózou – invaziny vážící se na integriny,
ruptura fagocytární vakuoly a vytlačení bakterie aktinovým
systémem buňky
 Ipa – shigely
 Internalin – listerie
o neznámý způsob – většina, např. meningokok



schopnost se množit - nejvýhodnější prostředí je intracelulární, v krevní
plazmě brání
o přítomnost antib. látek - lysozym, komplement…
o nedostatek volného železa
schopnost se šířit - průnik k cílovému orgánu
• lymfou – m.tuberculosis, t.pallidum, pyogenní koky, viry
• krví – s.typhi, generalizované infekce…
• per continuitatem – s.pyognes, c.perfringens, b.burgdorferi…
• podél nervů – viry herpes, vztekliny…
schopnost překonat obranné mechanismy hostitele
• rezistence ke komplementu - tvorba pouzdra, inhibitory aktivace
komplementu – kyselina sialová (gonokoky), produkce enzymů rozkládajících složky (C3 peptidázy) komplementu
• rezistence k fagocytóze - leukocidiny (stafylokoky), pouzdro (brání
přilnutí fagocytu), únik z fagozomu (ricketssie), zabránění fuze fagozomu s lysozymem (M. tuberculosis), inhibice chemotaxinů kyselinou
jantarovou, elastázou..
• interference s funkcí cytokinů
• únik před specifickou imunitou
o rychlé pomnožení – respirační viry, průjmy, malarie
o oklamání
 mimikry - antigenní sekvence shodné se sekvencí aminokyselin v hostitelském organismu, zkřížená reakce
mezi pyogenními streptokoky – vytváření protilátek u
disponovaných jedinců a myokardem (peptid srdečního svalu meromysin) – revmatická horečka, N. menigitidis
 změna Ag vlastností(N.gonorhoeae,chřipka,HIV)
 potlačení prezentace Ag (mykobakterie)
 skrývání mikroba (herpes simplex)
o potlačení imunitní reakce - produkce specifické proteásy
štěpící IgA (Haem. influenzae), invaze do imunitního systému
(HIV), tvorba superantigenů…
Infekce - několik definic
o přítomnost mikroorganismu u určitého hostitele
o průnik původce nákazy do organismu, množení uvnitř a nepříznivé působení na jeho
površích x kolonizace (osídlení nepatogenním nebo patogenním mikrobem bez chorobných příznaků)
o konflikt mezi mikrobem a jeho hostitelem (i bezpříznaková infekce)
-
průběh infekce
o ze strany mikroba - patogenita, virulence, infekční dávka
o ze strany makroorganismu
 stupeň nespecifické odolnosti – celková zdatnost, genetické faktory (odolnost
populace)
 specifická imunita – primární, sekundární reakce
 věk, výživa, způsob života
o další okolnosti – vliv prostředí (sezónní výkyvy – resp.inf. za sychravého počasí),
vstupní brána infekce (např. tularémie)
-
-
etapy infekce
o inkubační doba
o období prodromálních příznaků – nespecifické symptomy
o typický syndrom
o rekonvalescence – může dojít k relapsu
o recidiva – po uzdravení
formy infekce
o inaparentní, manifestní (subklinická - necharakteristická, abortivní - málo vyjádřená,
klinická)
o lokální (možno také fokální), systémové, generalizované
o akutní (dny), subakutní (měsíce), chronické (roky), fulminantní (prudké)
o bezpříznakové chronické infekce
 perzistentní – agens přítomno v infekční detekovatelné formě
 latentní – v těle v neinfekční formě
 hlavně viry, bakterie- Ric. prowazeki, Chl. trachomatis, Sal. typhi, M. tuberculosis
Adherence bakterií, mechanismy
- složka invazivity - schopnosti mikroba vstoupit do hostitele
- adherence - interakce mezi strukturami na povrchu bakterie (adheziny) a receptory na povrchu
eukaryotické b. (membránové glykoproteiny a glykolipidy)
o tkáňový tropismus bakterií, specifická vazba na určité struktury na povrchu b. (mlk CD4 na povrchu lymfocytů slouží jako receptor pro HIV)
o potřeba správná orientace (negativní náboje adhezinů i receptorů)
o znalost chem. struktury receptorů → možnost blokády pro bakterie
o adherence není charakteristická jen pro patogenní mikroby
-
adhesiny
 pili, fimbrie - speciální struktury na povrchu bakterie
 nefimbriální adhesiny - pomocí zvláštních bílkovin
- pili
o duté tyčinky z podjednotek bílkoviny pilin
o vazba na membránové glykoproteiny a glykolipidy
o velmi četné, na povrchu většinou rovnoměrně
o vysoká specifita, pro každý druh bakterie typická
o velmi křehé - neustálá tvorba nových fimbrií - faktor virulence - změna antigenního složení pilinu, únik před protilátkami IgA (protiadherenční)
o adherence manosasenzitivní a manosarezistentní (podle možnosti inhibice D-mannosou)
o E. coli (P-fimbrie - pyelonefritida), N. gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides, Vibrio, gonokoky
- nefimbriální adheziny
o protein F (váže fibronektin, Str. pyogenes)
o mohou působit též jako hemaglutininy (yersinie, bordately, mykoplasmata)
- tvorba biofilmu - mikrokolonie obalené ve vlastním glykokalyxu (ochrana před fagocyty, ATB,
protilátkami)
- fibronektin - v plazmě jako nespecifický opsonin, zprostředkuje vazbu bakterií k epiteliálním b.
(G+ na epitel ústní dutiny, nedostatek fibronektinu - patologická kolonizace G- koky)
11. Bakteriální exotoxiny, bakteriální superantigeny
Exotoxiny a jejich rozdělení podle mechanismu a místa účinku
-
exotoxiny - toxické bakt. proteiny, secernovány do okolí producenta
tvorba toxinu není pro růst a množení mikroba nezbytná, za jistých podmínek je ale užitečná
pro jeho přežití a šíření
geny často v plsamidech
rozdílná vnímavost b. dána přítomností receptorů
-
rozdělení toxinů podle mechanismu účinku
-
o
faktory průniku a šíření
 hydrolytické enzymy rozrušující mezibuněčnou hmotu
 hyaluronidáza, elastáza, DN-áza, streptokináza (fibrinolysin - průnik přes
fibrinové bariéry, rozpuštění krevních sraženin…)
o
cytolyziny - reakce s membránami eukaryotických b., které poškozuje, cytolysiny,
hemolysiny
 hydrolýza fosfolipidů fosfolipázami C a D - odnímají z fosfolipidů polární
skupiny - destabilizace membrány a lýza b.
• Clostridia perfringens - intravaskulární hemolýza při myonekróze,
intravaskulární koagulopatie
• beta hemolysin (sfingomelináza) S.aureus
 tvorba pórů v membráně - podlouhlé mlk. se včlení do membrány, vznik
kanálků, kudy proniká voda, neenzymatická povaha lýzy
• Staf. aureus - alfa-toxin
• Str. pyogenes - streptolysin (nepoškozuje neutrofily přímo, ale jejich
granula - hydrolasy z nich se vylijí do cytoplasmy)
• listeriolysin
o
toxiny ovlivňující fyziologii b.
 zvýšená produkce cAMP - vazba ADP-ribosy na regulační složky adenylcyklázy - zvýšená koncentrace cAMP působí sekreci Cl- a vody a zábranu
absorpce Na+ - únik tekutin, průjmy (cholerový toxin, termolabilní enterotoxin E. coli)
 pertusový toxin B.pertussis –ovlivnění hladiny cAMP v neutrofilech -omezení chemotaxe a pohyblivosti
o
zástava proteosyntézy a následný úhyn b.
 často dvě složky : A – toxická aktivita, B - vazba na buněčnou membránu
(specifický receptor) a pohlcení toxinu - endocytóza
 přenos adenosindifosfátribosylové skupiny z NAD na cílovou molekulu
(elongační faktor 2 –záškrtový toxin) – zástava proteosyntézy – smrt b.
o
neurotoxiny
 fungují jako peptidázy, účinkují v nervových synapsích na bílkoviny odpovědné za přenos neurotransmiterů
 tetanický toxin (tetanospasmin)
• Clostridium tetani se ve formě spor dostane do rány a vyklíčí,
• toxin proniká krví a lymfou do motorických neuronů
• ruší synaptický přenos na inhibičních neuronech → kontinuální stimulace excitačními transmitery
• svalové křeče (smrt na srdeční selhání)
 botulotoxin
• Clostridium botulinum
• nejúčinnější známý jed – letální dávka 10 ng
• klobásový jed, biologická zbraň, terapie spastických onemocnění,
kosmetologie
• nejedná se o infekci ale o intoxikaci
• působí na PNS - ze střevní sliznice krví k nervosvalovým ploténkám
• dva polypetidové řetězce – H vazba na neurony, L průnik do buňky –
blokáda malých synaptických vesikul obsahujícíchh acetylcholin –
neuromuskulární spojení – obrna svalů
• smrt na ochrnutí bránice
o
superantigeny (viz ot. I-8.)
Toxiny jako superantigeny
- superantigeny - pro aktivaci imunity nevyžadují zpracování antigen prezenujícími b.
- nespecifická polyklonální aktivace T buněk
- sekrece velkého množství cytokinů – šokové stavy
- schopny vázat se na receptory T-lymf. a na MHC II makrofágu
(u T-lymf. v oblasti V beta domény, u MHC II na beta2-doménu)
- imunomodulační účinek - po vazbě indukují celkovou obrannou reakci, aktivují obrovské
množství b. bez ohledu na antigenní specifitu
- polyklonální aktivace, cytotoxická aktivita, ↑ množsví CD4, CD8, B-lymf., makrofágů, NK b.,
uvolňování cytokinů)
- produkce velkého množství cytotoxinů, uhynutí mnoha imunitních b., zbytečná tvorba neprotekčních autoimunních protilátek
- zřejmě zodpovědné za vznik některých autoimunitních onemocnění
- zvyšují citilivost k endotoxinu (riziko při simultánní infekci G- bakterií)
- solubilní bakteriální antigeny
o enterotoxin a toxin toxického šoku Staph. aureus
o pyrogenní toxiny Str. pyogenes
o superantigeny mykoplazmat, pseudomonád
o enterotoxin Cl. perfringens
- antigeny vázané na buňku
o M protein Str. pyogenes
o komponenta M. tuberculosis
o Y. enterocolica
12. Zásady odběru klinických vzorků pro bakteriologické,
mykologické a parazitologické vyšetření
I. ODBĚROVÉ NÁDOBKY
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Krevní zkumavka (Wassermannova) - skleněná zkumavka s gumovou nebo korkovou zátkou. Musí být vždy sterilní. Zasílá se v ní krev, likvor, moč, punktáty, hnis, výplachy a jiný
tekutý materiál. Pro zasílání krve na serologické vyšetření se používají i speciálně vyráběné
zkumavky, které pomocí gelu oddělí sérum, v němž se potom hledají protilátky proti různým
původcům onemocnění (nepřímá diagnostika).
Tampon (výtěrka) - špejle s vatovým smotkem v dlouhé skleněné zkumavce, buď je suchá
nebo smočená. Komerčně vyráběné sady již obsahují v setu kromě této sterilní výtěrky i
zkumavku se speciální transportní půdou pro lepší přežití citlivých mikroorganismů, do které se pak použitý tampon zasune. Detoxikovaný tampon má vatovou část smočenou v aktivním uhlí (neutralizace toxických produktů při sterilizaci a lepší životaschopnost bakterií),
používá se stejně jako běžná výtěrka.
Laryngeální tampon - místo špejle je použit nerezavějící drátek zasazený v zátce. Při odběru se zahne do potřebného úhlu a potom se narovná zpět. Používá se pro výtěr hrtanu, nosohltanu a pro získání bronchiálního hlenu.
Rektální tampon - vatová část tamponu je smočena v dezoxycholátovém agaru a umožňuje
přežití střevních patogenů citlivých na vyschnutí (Shigella).
Petriho miska - skleněná nebo umělohmotná miska s víčkem. Vhodná pro zasílání sputa
nebo vzorky tkání. Při transportu se musí přelepit, aby se neotevřela.
Schüffnerova tyčinka - skleněná tyčinka na jednom konci rozšířená do kuličky se zdrsnělým
povrchem. Používá se k otěru análních řas při podezření na roupa dětského (na anální
řasy klade samička roupa vajíčka, která pomocí mikroskopu v nativním preparátu hledáme).
Nádobky na parazitologická vyšetření stolice - jsou z umělé hmoty s víčkem, uvnitř bývá
kousek špátle, kterým se odebere vzorek stolice (velikost lískového ořechu). Komerčně vyráběné nádobky mají přímo ve víčku vsazenou lopatičku).
Nádobky na vyšetření sputa na tuberkulózu (TBC) - nádobky z umělé hmoty s kónicky zúženým dnem, v nichž se sputum i zpracovává (sputničky).
Sterilní stříkačka s jehlou - lze ji použít k odběru tekutého materiálu (hnis, výpotky). Často
se využívá k odběru a transportu materiálu na anaerobní vyšetření.
II. TECHNIKA ODBĚRU HLAVNÍCH DRUHŮ MATERIÁLU
•
Výtěry z horních cest dýchacích se provádí ráno na lačno nebo 2-3 hodiny po posledním
jídle. Před odběrem se nesmí ani pít ani desinfikovat ústní dutinu (zkreslení mikrobiologických výsledků!). Odebírající se má chránit rouškou přes ústa a nos, stát poněkud stranou
(kapénky při kašli by mohly zasáhnout obličej). U dětí je vhodné fixovat hlavu.
Výtěr z nosní dutiny - většinou se na oba průduchy používá jeden tampon, pokud není stav rozdílný.
Zavádíme jej opatrně podél nosního septa do dolního průduchu zprvu rovnoběžně s nosní hranou asi
2-3 cm, pak stočíme do vodorovné polohy a suneme šroubovitě do průduchu do okamžiku odporu.
Výhodnější je odběr pod kontrolou nosního zrcátka.
Výtěr z mandlí - po stlačení kořene jazyka dřevěnou špachtlí zavádíme tampon tak, abychom se nedotkli sliznice dutiny ústní a stěr provádíme v místě zánětu, čepů, povlaků, záhybů apod. Podle klinického nálezu buď 1 nebo 2 tampony (označit je!). Tonsily pouze zduřelé a zarudlé stíráme za otáčení tamponu.
Výtěr z nosohltanu - provádí se laryngeálním tamponem. Před výtěrem ohneme drát v dolní čtvrtině (úhel 90-110°) a zavedeme po stlačení kořene jazyka za uvulu, otočíme směrem vzhůru a setřeme sliznici zadní stěny a hlavně klenby nosohltanu. Po odběru se drát vyrovná a zasune do zkumavky tak, aby se neotřel o vnitřní povrch skla.
Výtěr z hrtanu - provádí se laryngeálním tamponem. Drátek před odběrem ohýbáme do úhlu
tupého (100-140°), tampon obdobně zavedeme až za epiglotis. Pacient je tím podrážděn ke kašli
nebo se k němu vyzve, kapénky z laryngu, trachey a bronchů se zachytí na výtěrce (ta může být
smočena ve sterilní destilované vodě nebo fyziologickém roztoku).
•
Výtěr ze zevního zvukovodu provádíme opatrným šroubovitým pohybem tamponu na špejli.
•
Výtěr ze spojivkového vaku provádíme zvlhčeným tamponem na špejli po odchlípení víčka od bulbu. Odebírá se buď sekret nebo vzorek lézí.
•
Stěry z kožních a slizničních lézí provádíme pomocí zvlhčeného nebo suchého tamponu.
Krusty na hnisavých ranách, vředech musíme rozrušit sterilně (skalpel, jehla).
•
Výtěr z konečníku se většinou provádí rektálním tamponem (smočen v dezoxycholátovém
agaru). Vlastní odběr se provádí tak, že se pacient předkloní a rukama si roztahuje hýždě,
odebírající opatrně a šroubovitě zasune tampon do konečníku.
Výtěr z pochvy se provádí za pomoci sterilních gynekologických zrcadel (kombinace výtěr
a odběr sekretu). Odebírá se sekret ze zadní klenby poševní, z kanálu děložního čípku a obvykle se doplňuje výtěrem z uretry. Z každého místa se bere vzorků více, protože se zhotovuje i preparát nativní a barvený. Může se provádět i výplach pochvy sterilní tekutinou.
•
•
•
Odběr moče - před odběrem se důkladně omyje zevní genitál vodou a mýdlem a bez osušení odebíráme střední proud ranní moče do sterilní zkumavky (5-10 ml). Odběr cévkováním je rizikový vzhledem k zanesení infekce do močových cest. Vyšetření se provádí
kvalitativně i kvantitativně - hodnota od 105 bakterií v 1ml moči je patologická.
Odběr krve na hemokultivaci - u pacientů s příznaky sepse nebo u těch, kde předpokládáme, že bakterie přestoupili do krevního řečiště (bakteriémie) odebíráme vždy opakovaně
tzv. hemokulturu, plnou krev, kterou vyšetřujeme mikroskopicky a hlavně kultivačně. Nejčastěji se nyní využívají různé poloautomatické systémy. Kůži v místě odběru krve desinfikujeme alkoholem a potom jodovou tinkturou, vždy musíme zabránit kontaminaci hemokultury bakteriemi z kůže.Sterilní jehlou odebereme krev a další sterilní jehlou obsah stříkačky
přesuneme do speciální nádobky.
Do speciálních nádobek (zvlášť na aerobní a anaerobní vyšetření, odlišné pro děti a
dospělé), se asepticky odebere krev. Tyto nádobky se dají do speciálního automatu, kde se
kultivují až 5 dnů při 35°C, fotodetektor sleduje každých 10 minut hladinu
flourescence, která se při případném pomnožení mikroorganismů mění a pozitivní stav
(namnožené mikroorganismy) i zvukově ohlásí. Pozitivní vzorek se vyšetřuje
mikroskopicky, kultivačně, provede se identifikace a vyšetření na citlivost.
•
Odběr krve na serologické vyšetření - pro tato vyšetření se používá sérum, proto používáme sraženou krev (centrifugujeme) nebo odběr je již do specielních zkumavek, v nichž gel
oddělí sérum od ostatních krevních elementů.
•
Odběr mozkomíšního moku - likvoru - vzorek získáme lumbální punkcí za aseptických
podmínek, zároveň se sleduje vzhled likvoru a tlak, pod kterým vytéká (tyto údaje by měly
být zaznamenány v průvodce). Záchyt původce lze zvýšit odběrem přímo do tekuté kultivační půdy.
•
•
Odběr sputa - odebíráme nejlépe ranní sputum nalačno do Petriho misky nebo sputničky
(pacient sám zachytí při ranním kašli). Při podezření na TBC se odebírá do speciální odběrové nádoby.
Odběr hnisu, punktátu, exudátu, tkáňových excizí
IV. ODBĚR NA PARAZITOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ
•
•
Odběr stolice na parazitologické vyšetření - odebírá se po defekaci vzorek velikosti lískového ořechu do nádobky z umělé hmoty. Hledáme vývojová stádia parazitů či dospělce.
Při vyšetření na roupa dětského nevyšetřujeme stolici, ale stěr análních řas buď Schüffnerovou tyčinkou nebo lepicí páskou, ve zhotoveném nativním preparátu hledáme vajíčka roupů.
Odběr krve - dělá se buď tlustá kapka - odběr krve na mikroskopické vyšetření při podezření na krevní parazity (malárie) nebo krevní nátěr.
V. ODBĚR NA ANAEROBNÍ VYŠETŘENÍ
Anaerobní bakterie nesnáší přítomnost kyslíku v prostředí. Proto je třeba již zajistit odběr i transport
infekčního materiálu tak, aby s kyslíkem do styku nepřišel. Materiálem může být exudát, hnis, části
nekrotických tkání apod., odebírat bychom měli z hloubi ložiska. Tekutý materiál je vhodné odebírat do stříkačky, jejíž jehlu pak zapíchneme do zátky a transportujeme. Pevný matriál lze odebírat
nejlépe přímo do transportních médií pro anaeroby.
VI. ODBĚR NA VIROLOGICKÉ VYŠETŘENÍ
Kultivační virologické vyšetření je nákladné, technicky a časově náročné, využívá je především
infekční oddělení. Odběr materiálu ke kultivaci provádíme většinou do odběrového média (médium
obsahují ATB k potlačení bakteriální flóry). Transport musí být rychlý. Infekčním materiálem jsou
faryngeální výtěry, nosohltanový výplach, vzorek likvoru, vzorek stolice,.. (podle lokalizace infekce).
Serologické virologické vyšetření je méně náročné a časově rychlejší. Na vyšetření se zasílá krev ve
sterilní zkumavce s gumovou zátkou, lépe je zasílat párové vzorky (časový odstup 2-3 týdny)
13. Možnosti detekce a identifikace mikroorganizmů – přímý a
nepřímý průkaz původce (výcuc z Beneše)
Přímý průkaz: v odebraném materiálu jsou hledány známky přítomnosti infekčního agens. Lze
podle okolností provést mikroskopicky, kultivačně, imunologicky nebo geneticky.
Nevýhoda: neprokáže etiologie onemocnění (mikrob může být jen kontaminace)
1) Mikroskopie
- ukáže tvar a množství mikrobů ve vzorku, vzájemný vztah mikrobů a leukocytů,
mikrobů mezi sebou atd
- + rychlé, levné, jednoduché
- - náročné (nevhodné pro screening), vyžaduje zkušenost, dle morfologie lze určit jen
některé mikroorganismy
-
pro zvýraznění: barvení, mikroskopie v zástinu, fluorescenční barvení, příp.
elektronová mikroskopie
vyšetřuje se hnis, exsudáty, MMM, punktáty a vzorky z primárně sterilních lokalit
samostatně stačí při průkazu mikrobů typické morfologie: klostridia, TBC,
aktinomykóza, mykózy, parazitózy
2) Kultivace
- ukáže vlastnosti izolovaných agens, možná úplná identifikace; lze vyšetřit citlivost
na atb, agens možno uschovat na další zkoumání
- + jednoduché, levné
- - někdy pomalé (dle rychlosti růstu patogenů), průkaz jen živých mikrobů, riziko
laboratorní nákazy
- čisté kultury = klony mikrobů narostlé do milionů shodných buněk – lze prokázat
vlastnosti, které by při zkoumání jedné buňky nebyly detekovatelné
- důležitý správný odběr a transport, proti vyschnutí transportní půdy (např.
Amiesova-Stuartova, Caryho-Blairova), podobná teplota!
- pokud nelze vzorek zpracovat do 2 hodin, musí se zchladit na 5°C (výjimka jsou
hemokultury – nechají se při pokojové teplotě)
- záchyt některých mikrobů – speciální půdy
- obligátně IC patogeny možno izolovat na kuřecím zárodku nebo tkáňových kulturách
- zjištění citlivosti na atb – kvalitativní disková metoda (vznik inhibiční zóny),
kvantitativní: zjištění MIC – je přesnější
3) Průkaz specifického antigenu
- prokáže přítomnost mikroba (živého i mrtvého)
- + jednoduché, levné, rychlé
- - nelze využít pro mikroby s mnoha antigenními variantami
- latexaglutinace, imunochromatografický test (= clearview), imunoeseje (např.
ELISA)
4) Genetické metody
- prokáže mikroby živé i mrtvé
- + rychlé, vysoká senzitivita
- - drahé vybavení i vyšetření
- hybridizace DNA (nebo RNA) = genové sondy
- hybridizace s předchozí amplifikací PCR
- RT-PCR (reverse transkription PCR) – průkaz proteosyntézy (např. produkce
cytokinů v leukocytech)
- real-time PRC (qPCR) – měří koncentraci agens ve vzorku
- vyšetření pomocí restrikčních endonukleáz – selektivní štěpení v místě určité
kombinace nukleotidů
- sekvenace genů = určení pořadí bazí – nejpracnější, ale lze určit jakéhokoli mikroba
5) Chromatografie
- separace molekul podle jejich různé přilnavosti k podkladu
- detekce zejména produktů metabolismu
- možno prokázat např. různé anaeroby
6) Hmotnostní spektrometrie
- rozdělení látek podle rozdělení jejich iontů v elektrickém a magnetickém poli
- molekuly se ionizují a poté se separují podle náboje a hmotnosti
- výsledkem je graf ukazující zastoupení jednotlivých molekul ve vzorku
Nepřímý průkaz: v organizmu pacienta jsou hledány známky probíhající imunitní odpovědi proti
předpokládanému infekčnímu agens. Zpravidla jsou zde hledány protilátky proti půvoci (v
odebrané krvi - serologické vyšetření), někdy se místo toho prokazují imunní T-lymfocyty
(nejčastěji kožním testem - to již není rutinní mikrobiologické vyšetření).
Nevýhody:
- nelze použít u osob s poruchou imunity
- neprokáže infekce na sliznicích (není dos protilátek v krvi)
- nelze použít na začátku onemocnění, až po 2 týdnech (nevhodné na akutní infekce)
1) Průkaz specifických protilátek (sérologie)
- nejčastěji se stanovují třídy IgM a IgG
- sérologické testy – vizualizace specifické vazby mezi antigenem a protilátkou
- výsledek: kvalitativní nebo kvantitativní hodnocení
- + jednoduché, levné
- – různé nevýhody jednotlivých testů
- Precipitace – nejjednodušší a nejstarší metoda, používá se jen na orientační testy
(např. na syfilis – VDLR, RRR)
- Aglutinace – jednoduchá, levná, vyšší citlivost; na rozdíl od precipitace je antigen
korpuskulární – vazba způsobí shlukování a je lépe vidět; široce používaná metoda
- Neutralizační reakce – např. ASLO
- Komplementfixační reakce (KFR) – využívá schopnosti komplexu antigenprotilátka vázat na sebe komplement; citlivější, ale pracnější; lepší afinita IgM –
dg.akutních infekcí
- Metody se značenými antigeny nebo protilátkami – vysoká citlivost, snadné
provedení; nevýhoda je vyšší cena; umožňují průkaz jednotlivýc tříd protilátek (IgM,
IgA, IgG) => přesnější interpretace
 Imunofluorescenční testy (IFT)
 Radioimunoeseje (RIA)
 Enzymoimunoeseje (EIA) – např. ELISA
- Western blot – kombinuje ELISA s chromatografií, vysoká citlivost a specifičnost,
ale je drahá a pracná (slouží jen ke konfirmaci sporných výsledků)
2) Testy specifické buněčné imunity
- u infekcí, kde je protilátková odpověď nespolehlivá (nebo žádná) – např. TBC, lepra
- kožní testy – tuberkulinový test Mantoux II (vyš. pozdní citlivost proti antigenu) –
je málo spolehlivý (často falešně pozitivní i negativní)
- průkaz senzibilizace lymfocytů = QuantiFERON – zvýšená tvorba IFN u
senzibilizovaných lymfocytů
14. Kultivační vyšetření klinických vzorků
Množení bakteriální populace in vitro
o
o
o
-
nikdy
růst a množení bakterií - řada biochemických a fyzikálních procesů
růstový cyklus
růst buňky - koordinovaná tvorba makromlk a b. složek
tvorba septa
dělení buňky
generační doba – doba zdvojení – doba, zajakou se počet bakterií zdvojnásobí
dělení bakterií geometrickou řadou za ideálních podmínek, ve skutečnosti však
vyčerpání živin (resp. se nedostanou ke všem)
inhibice zplodinami svého metabolismu
stacionární kultura - klasické pěstování, inokolum b., po určité době vznik bakteriální kultury
o
o
-
- růstová křivka - počet živých buněk v závislosti na stáří kultury v logaritmické stupnici
o lag-fáze - prodleva v dělení na počátku, syntéza enzymů, zvětšování objemu, délka závisí na
stavu inokula (krátká pokud použity buňky z fáze růstu), počátek dělení s nestálou rychlostí
o logaritmická (exponenciální) fáze - konstantní rychlost dělení, závisí na druhu mikroba, teplotě, složení prostředí
 specifická růstová rychlost – růstová rychlost na jednotku biomasy
o stacionární fáze - téměř bez dělení, ↑ odpadních produktů, b. nepřibývají ani neubývají, délka
fáze závisí na druhu bakterií a charakteru prostředí
 x=Y.s
 x je koncentrace vytvoření biomasy, s koncetrace spotřebované živiny, Y růstový výtěžek
(informuje o fyziologii rostoucí b.)
o fáze odumírání - autolýza (neisserie nebo pneumokoky), indukce enzymů destruujících b.
stěnu, porušení rovnováhy mezi lytickým působením a syntézou stěny
 někdy rychlost konstantní (jediný nepříznivý faktor), většinou několik faktorů - kinetika
různá
 specifická rychlost hynutí - rychlost úbytku buněk přepočtená na jednu buňku
o
o
o
kontinuální kultivace - udržení v logaritmické fázi, přívod živin a odvad odpadu, v přístrojích
zvaných fermentory - k produkci ATB, přirozeně v GIT
v přirozených podmínkách se bakterie množí většinou pomaleji - omezený přívod živin, suboptimální teplota, působení ostatních mikrobů
množení v biofilmech ( x planktonický růst)
v praxi se růst bakterií sleduje buď měřením nárůstu b. hmoty
spektrofotometricky
počítáním b. (mikroskopicky v počítací komůrce)
kultivačně na zúženém kultivačním médiu na Petriho misce
Kultivace
- metoda přímého průkazu sloužící k izolaci čisté kultury
- optimální teplota 37°C v biologickém termostatu, zvlhčování opařováním vody
z mělkých nádob
- anaerobní – anaerostat – generátor plynů (vyvíjí se vodík, ten se slučuje s kyslíkem na vodu)
- druhy půd
1. přirozené (komplexní)
2. syntetické (definované)
Základní půdy
1. tekuté - pomnožovací půda, ve zkumavce (masový extrakt, NaCl), tekutina umožňuje lepší difúzi
živin, růst bakterií se projevuje zákalem, sedimentem, vločkami nebo blankou
2. pevné – ztužený bujonový základ + agar (směs polysacharidů z mořských řas)
Obohacené půdy - krevní agar – většina bakterií, možno sledovat hemolytické vlastnosti,
čokoládový agar - meningokoky
Selektivní půdy – živný základ + inhibitor růstu
Diagnostické půdy – živný základ + substrát, indikátor
Selektivně diagnostické půdy - Endova, MacConkeyho půda – G- (enterobakterie, pseudomanády)
Tekuté kultivační půdy - pomnožovací – příklady
•
•
•
•
Játrový bujón – nejběžnější - vývar z hovězího masa, pepton, NaCl, kostky jater
Anaerobní bujón - anaerobní bakterie. Půda obsahuje redukující substance, které snižují oxidoredukční potenciál půdy. Po naočkování se hladina zalévá parafinem
Šulova půda - tekutá půda pro záchyt bakterií rodu Mycobacterium
Selenit - tekutá půda pro selektivní pomnožení Salmonel
Tuhé kultivační půdy - příklady
• Masopeptonový agar (MPA) - obsahuje pouze výtažek z masa, pepton, sole a 2% agarovou
řasu. Je základem pro další půdy.
• Krevní agar (KA) - připravuje se přidáním 5-10% defibrinované zvířecí krve k MPA základu.
Je to nejvíce používaná půda, roste na ní většina bakterií. Na KA lze odečítat hemolýzu, pokud
bakterie tvoří tzv. hemolyziny. U úplné hemolýzy dochází k lýze krvinek v okolí kolonií, což se
projeví vznikem úplného projasnění. U neúplné hemolýzy není projasnění úplné. Viridace se
projevuje zeleným zbarvením půdy kolem kolonií (přeměna hemoglobinu na methemoglobin).
• Endova půda (Endoagar, EA) - je to selektivně diagnostická půda pro střevní bakterie (čeleď
Enterobacteriaceae). Kromě základu obsahuje laktózu. Indikátorem jejího kvašení je bazický
fuchsin odbarvený siřičitanem sodným. Je-li laktóza kvašena, mění se barva světle fialovočervená do temné fialové vlivem změny pH. Bakterie, které kvasí laktózu mají tmavě fialově zabarvené kolonie, bakterie, které nezkvašují mají kolonie růžové.
• XLD (agar) - je to půda pro záchyt patogenních střevních bakterií (Shigella, Salmonella).
Půda obsahuje opět laktózu. Laktóu kvasící bakterie jsou žluté, laktóza nekvasící mají kolonie
v barvě půdy. Dále lze rozpoznat tvorba H2S - černý střed kolonií.
• Sabouraudova půda - selektivní půda pro houby, obsahuje pepton, agar a cukry (glukozu nebo
maltozu), pH 5,0
• Fortnerova půda - pro záchyt anaerobů (obsahuje redukující substance)
• Löwenstein-Jensenova půda - pevná půda pro záchyt mykobakterií, půda je vylévána našikmo do zkumavek uzavíraných gumovou zátkou (udržení vlhkosti při dlouhodobé kultivaci). Obsahuje vejce, glycerin, škrob, malachitovou zeleň.
• Slanetz-Burtley agar (SB půda) - selektivně diagnostická půda pro bakterie rodu Enterococcus. Je chudá na živiny (Enterokoky jsou nenáročné oproti jiným bakteriím), kolonie enterokoků mají v masivním nárůstu fialovohnědou barvu.
• Wilson-Blairova půda - selektivní půda pro Salmonely (černě kovově lesklé kolonie s černým
okolím)
• Claubergova půda - diagnostická půda pro Corynebacterium diphtheriae (černé kolonie
s kovovým leskem)
• Čokoládový agar - obsahuje krev přidávanou do horkého agaru (80°C), slouží ke kultivaci náročných mikrobů (gonokoky)
Kultivační průkaz
Kultivační
média
- přirozená, umělá
- tekutá, pevná
- základní, diagnostická, selektivní
: peptonová voda - při pH = 8,2 > selektivní půda pro vibria
: masopeptonový bujón - pomnožovací půda
: Kaufmanova půda, selenitový bujón - selektivně pomnožovací půdy
Tekutá média
pro salmonelly
: Šulova půda - pro M. tuberculosis
> průkaz růstu - zákal, sediment, blanka
: krevní agar/KA/ - pro většinu kultivačně náročnějších bakterií
: čokoládový agar/ČA/ - pro neisserie, hemofily, helicobaktera
: NaCl agar - KA + 8%NaCl - pro stafylokoky
: MacConkey, Endo agar - pro G-tyče
: DC-agar - pro G-tyče; bakterie produkující H S rostou v černých koloniích
Tuhá média : Sabouradova půda - pro kvasinky
: Žluč-eskulinový agar - pro enterokoky
: Lôwenstein-Jensenova půda - pro mykobakteria
: Claubergova půda - pro korynebakteria
: Willson-Blairova půda - pro G-tyče; bakterie produkující H S rostou v
černých koloniích /Salmonelly/
: Mueller-Hintonův agar - pro testování citlivosti na antibiotika
2
2
Podmínky kultivace
o kyslík
 aerobní – kyslík akceptor elektronů - pseudomonas, bordetella, legionella, brucella, neisseria
 fakultativně anaerobní – většina, enterobakterie
 mikroaerofilní – streptococcus, spirochety
 kapnofilní – meningokoky, gonokoky
 anaerobní – klostridia, neporulující b.
o voda
 většina hygrofilní (x lyofilizace – sušení zmražených bakterií ve vakuu), k vyschnutí
odolnější G+ a acidorezistentní (stafylokoky a korynebakteria na kůži)
 xerofilní - stačí voda na povrchu částic (půda) - nokardie, aktinomycety, plísně
o teplota - minimální, optimální a maximální růstová teplota - teplotní rozmezí
 psychrofily- 0-20 °C
 psychrotolerantní - yersenie, listerie, salmonelly, S. aureus
 mesofily- 20-40 °C
 termofily- nad 40 °C
 hypertermofily – nad 80 °C
o hydrostatický tlak - hlubokomořské
o osmotický tlak - většinou hypotonické prostředí, ochrana stěnou
 hypertonické - plasmolysa (konzervace potravin)
 halofily - halotolerantní a obligátní (enterokoky, stafylokoky, Vibrio) nebo extrémní halofily
o pH
 neutrofily - většina
 alkalofily - Vibrio cholerae, alkalotolerantní – Proteus, enterokoky
 acidofily - laktobacily
o oxidoredukční potenciál
 aeroby - oxidované prostředí
 anaeroby - potřeba nízký potenciál
o záření – poškození ultrafialovým a ionizačním zářením
Postupy užívané při identifikaci bakterií
1. fenotypové
a. intuitivní – popis kolonií, růst na selektivně diagnostických půdách, mikroskopie
b. klasická biochemická identifikace
i. pestrá řada, když je substrát metabolizován, dojde k zbarvení
ii.
izolační plotna – biochemický klín – k dourčení enterobakterií
iii.
testy na určování stafylokoků a streptokoků
iv.
testy na určování korynebakterií
c. dichotomický klíč – série testů – postupné taxonomické zařazování
d. numerická biochemická identifikace – identifikačním softwarem vypočtené procento
podobnosti
2. genotypové – PCR, restrikční endonukleásová analýza
Příklady testů
Biochemické testy pestré řady
1. Průkaz katalázy - do zkumavky obsahující 3% peroxid vodíku přeneseme bakteriologickou kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku.
2. Průkaz oxidázy - provádíme pomocí filtračního papírku, který je napuštěný parafenylendiaminem a alfa-naftolem. Papírek přiložíme na kolonii, otočíme ho pinzetou a
v pozitivním případě pozorujeme zmodrání.
3. Průkaz plazmakoagulázy - rozlišujeme plazmakoagulázu volnou a vázanou. Volnou
koagulázu prokazujeme koagulací plazmy zkumavkovou metodou: ké králičí plazmě
přidáme kolonii a inkubujeme 4 hodiny při 37°C. Za pozitivní považujeme nález sražené
plazmy. Je třeba dbát na dodržení doby odečtu, protože některé kmeny produkují fibrinolyzin, který koagulát opět lyzuje a mohli bychom tak dostat falešně negativní reakci.
Vázanou koagulázu prokazujeme aglutinací plazmy sklíčkovou metodou. Na podložní
sklíčko kápneme suspenzi králičí plazmy a destilované vody, přidáme kolonii a v pozitivním případě během několika minut pozorujeme tvorbu aglutinátu.
4. Průkaz zkvašování cukrů - do zkumavek, které obsahují peptonovou vodu
s 1 % cukru /glukózu, sacharózu, laktózu, manitol, xylózu/ a bromthymolovou modř
jako indikátor, inokulujeme kolonii. V reakci se využívá změny pH při zkvašování cukrů. V pozitivním případě dochází k okyselení a tím k zežloutnutí půdy.
5. Průkaz ureázy - testujeme v pevné půdě s 2% močovinou a indikátor je zde fenolová
červeň. Pokud bakterie produkuje ureázu, dochází k rozkladu močoviny za vzniku amoniaku a alkalizace prostředí mění barvu indikátoru na červenou.
6. Tvorba indolu - indol vzniká z tryptofanu, který je součástí Hottingerova bujonu. Po
inkubaci je třeba půdu zakapat Ehrlichovým nebo Kovacsovým činidlem /paradimethylaminobenzaldehyd/. V pozitivním případě vznikne na rozhraní tekutin červený
prstenec.
7. Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testováním zkvašování cukrů. Používáme
tzv. plynovku, to je malá zkumavka umístěná dnem vzhůru většinou do zkumavky testující zkvašování glukózy. Pokud daný kmen produkuje plyn, hromadí se v plynovce jako
bublinka.
8. Tvorba sirovodíku - provádí se v tuhé půdě s 1% octanem olovnatým. V pozitivním
případě dojde k vyloučení sulfidu olova, což se projeví zčernáním půdy.
9. Redukce nitrátů na nitrity - používáme tuhou půdu s nitráty. Průkaz se provádí Grissovým činidlem. Červené zbarvení značí pozitivní výsledek reakce, negativní
výsledek /beze zněny/ musíme ověřit práškovým zinkem.
10. Průkaz dekarboxylázy l-lyzinu, l-ornitinu, l-argininu - provádí se v bujonu, který obsahuje příslušnou aminokyselinu, glukózu, pyridoxin a indikátor. Po naočkování musíme
vzorek převrstvit parafinovým olejem a po inkubaci pozorujeme v negativním případě
žluté zabarvení, pozitivitu ověříme zakapáním Nesslerovým činidlem za vzniku fialovo
mléčné sraženiny.
11. Simmons citrátový test - prokazujeme utilizaci uhlíku z citrátu sodného. Půda dále obsahuje jako indikátor bromthymolovou modř, v pozitivním případě zmodrá.
12. ONPG test /průkaz beta-galaktosidázy/ - slouží k průkazu opožděného zkvašování
laktózy. Stejně jako při testování zkvašování cukrů pozitivitu značí zežloutnutí.
Test k rozlišení bakterií v rámci rodu Staphylococcus
Plazmakoagulázový test - plazmakoaguláza je jednoduchý protein s enzymatickou aktivitou měnící
solubilní fibrinogen na pevný fibrin. Tvorba plazmakoagulázy je typická pro patogenní
Staphylococcus aureus
Princip: Do králičí plazmy naočkujeme zkoumaný kmen. Odečítáme po 18-24 hodinách spolu s + a
- kontrolami. Kmeny tvořící koagulázu změní tekutou plazmu v pevné koagulum. Existuje
nebezpečí falešných negativit, protože některé kmeny produkují i stafylokinázu (fibrinolyzin)
rozpouštějící fibrin. Proto jsou nutné kontroly!
Testy k rozlišení druhů v rámci rodu Streptococcus
Podle růstu na KA je můžeme dělit na
α hemolytické (viridující)
β hemolytické (úplná hemolýza v okolí kolonie)
γ hemolytické (bez změny okolí).
Identifikace α hemolytických (viridujících)
OPTOCHIN test - umožní odlišit viridující Streptococcus pneumoniae (patogen horních cest
dýchacích) od skupiny orálních (viridujících) streptokoků (většinou běžná flóra).
Princip: Optochin v disku difunduje do agaru a bakterie na něj citlivé (Str. pneumoniae) v této zóně
nerostou. Rezistentní bakterie (orální streptokoky) rostou až k disku).
Identifikace β hemolytických streptokoků
CAMP test - na KA s beraními erytrocyty zkřížíme linie zkoumaného β hemolytického
streptokoka a S. aurea. Jedná-li se o Str. agalactiae, vytváří tzv. CAMP faktor, který potencuje
hemolýzu S.aurea ovlivněnou C-sfingomyelinázou = β lyzin. V místě protknutí linií vzniká
projasnění ve tvaru mašličky (motýlek). Streptococcus pyogenes CAMP faktor netvoří a proto ve
zkřížených liniích projasnění nevznikne.
BACITRACIN test - princip je totožný jak u OPTOCHIN testu. Na koncentrace bacitracinu je
citlivý Str. pyogenes, který kolem disku s bacitracinem vytváří zónu inhibice růstu. Rezistentní je
Str. agalactiae, který roste až k disku nebo je jeho zóna inhibice velmi malá.
Nevýhodou těchto testů je jejich pracnost a zdlouhavost, výsledky se odečítají až druhý den!
PYR test - je to diagnostický test pro rychlé odlišení Str. pyogenes od ostatních β hemolytických
streptokoků na základě přítomnosti enzymu PYRazy (pyrolidonyl peptidáza), kterou produkuje až
98% kmenů Str. pyogenes. Výsledek reakce se odečítá do 2 minut!
Streptotest (různé druhy) - k rozlišování jednotlivých skupin streptokoků lze využít i serologické
metody. Pomocí latexové aglutince identifikujeme přímo specifický skupinový antigen - vysoce
specifický test. Kromě skupiny A a B přímo určuje i další skupiny.
Testy k rozlišení bakterií v rámci rodu Corynebacterium
odlišení Corynebacterium diphtheriae, původce záškrtu, od ostatních (C. ulcerans, Arcanobacterium
h…)
Růst na selektivních půdách - Tinsdal, Clauberg, KA s teluričitými solemi (pro záchyt
C.diphtheriae)
Difterické cukry - ve zkumavkách obsahujících různé cukry sledujeme jejich zkvašování a dle
výsledku můžeme určit druh bakterie. Zkrácená verze tohoto testu obsahuje jen zkumavky
s glukózou a sacharózou - slouží k rychlému vyhledání C.diphtheriae (C.ulcerans).
Průkaz difterického toxinu – serologický Elekův test
Reverzní (obrácený) CAMP test - některé hemolytické druhy Corynebacterií produkují Dsfingomyelinázu, která inhibuje hemolyzin Staphylococca aurea.
C. ulcerans
C. pseudotuberculosis
Arcanobacterium haemolyticum (dříve Corynebacterium)
Průkaz pyrazinamidázy - hlavní patogeni jsou pyrazinamidáza negativní
Sérotypizace
- určení antigenní struktury bakterií
- jednoduchou a rychlou metodu - sklíčkovou neboli zpětnou aglutinaci
- Na podložní sklíčko naneseme kapátkem známou protilátku a bakteriologickou kličkou uděláme
suspenzi s narostlou kulturou.
- V pozitivním případě dojde ke vzniku aglutinátu: sraženiny antigenu s protilátkou.
- Výsledkem je zjištění sérotypu bakterie. Dourčujeme tak např. některé druhy enterobakterií
nebo beta-hemolytické streptokoky a další
Fagotypizace
- kmen se podrobí účinku řady standardních bakteriofágů a zjišťuje se, které zabraly
15. Fyziologické vlastnosti a kultivace anaerobních bakterií
Dělení bakterií dle vztahu ke kyslíku
1. aerobní („striktně aerobní“) – vyžadují přítomnost vzdušného kyslíku v normální
koncentraci; kyslík potřebují k dýchání
2. fakultativně anaerobní – nevyžadují kyslík, ale nevadí jim a mohou ho využívat k dýchání
3. mikroaerofilní – vyžadují kyslík ve velmi nízké koncentraci, při jeho vyšších koncentracích
hynou; kyslík potřebují jako stavební prvek (ne k dýchání)
4. striktně anaerobní – kyslík nevyžadují a naopak jim škodí (je pro ně toxický i v nízkých
koncentracích)
Zjednodušené dělení pro klinickou praxi
1. aerobní bakterie – mohou žít na vzduchu (odpovídá kategoriím aerobní + fakultativně
aerobní)
2. anaerobní bakterie – na vzduchu hynou (odpovídá anaerobní + mikroaerofilní)
Pokus na znázornění: ve zkumavce rostou aeroby nahoře, fakultativní anaeroby všude,
mikroaerofily uprostřed a striktní anaeroby dole.
Fyziologické vlastnosti anaerobů
-
dělí se na 2 skupiny s odlišnými vlastnostmi a patogenezí
A. sporulující = klostridia
- onemocnění způsobeno toxinem
- charakteristický klinický obraz – možno odhadnout původce
- infekce častěji exogenní (ale i endogenní)
- infekce závažné, rychlé a často smrtelné
B. nesporulující – mnoho rodů
- onemocnění jsou si podobná a často je etiologické agens směsí několika druhů
- infekce velmi časté – obsaženy v 80% materiálu z gynekologie a chirurgie
- při odběru materiálu na kultivaci nutno zamezit přístupu vzduchu!
- infekce mohou být také závažné až smrtelné, ale mnohem pomalejší než u klostridií
-
anaerobní respirace – liší se od aerobní respirace jen konečným akceptorem elektronů
v dýchacím řetězci (nitrát, fumarát, sírany, CO2 = tzv. metanogenní bakterie)
kyslík má ze všech akceptorů nejkladnější oxidačně-redukční potenciál, proto jeho přítomnost
inhibuje anaerobní respiraci (elektrony jsou přednostně přesměrovány na kyslík)
Kultivace anaerobních bakterií
Diagnostika
- založena na klinických příznacích a potvrzena bakteriologickým vyšetřením
- hnis často odporně páchne (produkty anaerobů)
- lokalizace procesu: hnisavé procesy v břiše, ženském genitálu, hrudní empyémy, aspirační
pneumonie
Odběr materiálu
- nesmí přijít do kontaktu se vzduchem
- tampón s výtěrem do zkumavky naplněné CO2 (malé množství) nebo v injekční stříkačce
s jehlou zabodnutou do gumové zátky (větší množství)
Kultivace
– současně aerobně a anaerobně
– pomalejší růst – min. 48hod, actino až 6 dní
ANAER. = bez přístupu kyslíku
• zabráněním vniknutí kyslíku do média – tekuté půdy převrstvit parafínem
• nahrazení kyslíku jiným plynem – anaerostat, anaerobox
• vyvázáním kyslíku chemicky či biologicky
•
•
•
•
•
Fortnerova plotna: na polovině hermeticky uzavřené plotny Serratia marcescens,
spotřebovala O2
Vyvíječe plynu: chemikálie (kys. vinná) v sáčku, přidání vody vznikne vodík a CO2, vodík
se za přítomnosti paladiového (vanad) katalyzátoru sloučí s kyslíkem a vznikne voda
anaerostat: nádoba s hermeticky uzavřeným víkem, vloží se vyvíječ atmosféry
anaerobní box: skříň s rukávci a přechodovou komorou, směs N2, H2, CO2
půdy: se sníženým redox potenciálem
- tekuté – před použitím se povaří, vytěsní se kyslík = regenerace
- přidávají se redukční činidla: cystein, thiosloučeniny, glukosa
- VL agar, VL bujon, Wilkins, Schadler, thioglykolát, bujon Robertson – s kouskem
masa
16. Sérologické vyšetření, molekulárně genetické metody
v mikrobiologické rutinní diagnostice
Viz otázka 13., doplnění prezentace: http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/,
http://mikrobiologie.unas.cz
Nějaký další zdroj?
17. Interakce viru a buňky, cytopatogenní efekty virů, typy infekce
Interakce viru a buňky
- 2 vlastnosti buňky:
o vnímavost – určena přítomností vhodných receptorů, umožní napadení buňky virem
o permisivita – určena metabolickou výbavou buňky umožňující viru dokončit cyklus,
nepermisivní buňky => integrace viru do genomu a latentní infekce… pak může buňka dostat
signál a změnit permisivitu => aktivace nákazy
- v makroorganismu vnímavé jen některé buňky – určují tropismus virů
neobalené viry:
- rezistence k éteru a tukovým rozpouštědlům, odolné k vnějším vlivům
- přenos: přímým kontaktem nebo kontaminací
- nejsou inaktivovány pH žaludku, vylučují se stolicí, žijí dlouho venku
obalené viry:
- lipoproteinový obal = lipidová dvojvrstva od hostitele, vznik při pučení z hostitelské buňky (z
jaderné membrány, membrány ER, cytoplazmatické membrány)
- citlivé, ničeny nízkým pH
- přenos pouze přímo – kapénky, pohlavní styk
Cytopatogenní efekty virů = morfologické důsledky působení viru na buňku
- v extrému smrt buňky
- zpomalení metabolismu a dělení (např. rubeola – malformace plodu)
- bněčná hyperplazie (např. CMV)
- buněčná transformace (např. EBV)
- lýza buněčných membrán a vznik syncytia (paramyxoviry – glykoprotein F)
-
někdy jen funkční důsledky – např. virus vztekliny ovlivňuje vznik neurotransmiterů, virus
chřipky => zástava produkce surfaktantu => pneumonie, dále např. imunologické poruchy
Typy virové infekce
- evolučně výhodné jsou jen perzistentní nákazy – většinou lidské viry (naopak rychlé a smrtelné
onemocnění člověka způsobují zvířecí viry – např. vzteklina)
- průběh infekce v organismu:
1. vstup infekce: skrz kůži jen při porušení stratum corneum / osídlením sliznic (nejsou
rezistentní)
2. primární pomnožení viru (inkubace 2 až 5 dní) = respirační infekce atd. zůstává jen
na sliznicích
-
3. některé viry proniknou do submukózy a lymf. uzlin => šíření krví = primární
virémie (viry nelze izolovat z krve! – jsou rychle fagocytovány)
4. dál množení v endotelu, makrofázích, RES… až množství přesáhne kapacitu
fagocytárního systému => sekundární virémie (viry lze izolovat z krve) + zvýšená
teplota
5. => diseminace, systémová infekce a postižení cílových orgánů (inkubace delší: 14 až
21 dní)
(jsou i výjimky s odlišným průběhem – např. vzteklina: nevzniká virémie, šíří se podél
neuronů do CNS)
různé typy infekcí – podle toho, jak a kdy na virus reaguje imunitní systém
a) ihned => inaparentní infekce
b) při sekundární virémii => rychlý abortivní průběh onemocnění
c) někdy není schopen úplné likvidace => perzistentní infekce
18. Protivirové mechanismy nespecifické imunity
Nespecifické obranné mechanismy 1. linie
= účelné anatomické a funkční vybavení ohrožených orgánů
- hlen, řasinky, nízké pH žaludku, peristaltika atd.
- lysozym se v protivirové obraně neuplatňuje! (jen proti bakteriím)
- nespecifické inhibitory v sekretech a krvi => neutralizace virionů, shlukování a mechanické
odstraňování
- zvýšená teplota – zpomalí množení termosenzitivních virů
-
virulentní kmeny jsou termorezistentní, odolávají nízkému pH, vybaveny neuraminidázou (štěpí
vazbu inhibitorů a virionu, zkapalňuje hlen)
Prostředky nespecifické imunity 2. linie
= komplement, zánět, NK-buňky, fagocyty, IFN
- v protivirové obraně klíčové makrofágy, mikrofágy malý význam
- makrofágy někdy zcela nepermisivní, k většině virů ale nepermisivitu získají až po změnách,
co v nich pohlcený virus způsobí (mladé nezralé makrofágy jsou náchylné)
- interferony: inhibice množení virů, potlačení buněčné proliferace, modulace produkce
protilátek a buněčnou imunitu, stimulují zvýšenou expresi MHC, aktivují NK buňky a
makrofágy, potencují cytotoxický účinek Tc-lymfocytů atd.
- ligand CD40: přímý antivirový účinek – po virové infekci uvolňován a inhibuje replikaci viru
v okolních buňkách
19. Epidemiologicko-ekologická charakteristika mykóz
Základní pojmy




Mykózy = pravá infekční onemocnění, způsobená vřeckatými, imperfektními a vzácně
stopkovýtrusými houbami
Mykotoxikózy = stavy vyvolané metabolickými produkty hub
o Houbové intoxikace – způsobeny makromycetami, jednorázově
o Vlastní mykotoxikózy – způs. mikromycetami, chronické / akutní
Mykoalergózy = přecitlivělost, nejčastěji na spory
Mycetismy = reakce způsobené mechanickou přítomností houby ve tkáni
Mykózy - úvod
-
vzrůstá incidence – cestování, iatrogenně (atb., imunosuprese, …) ekologické podmínky
kosmopolitní, endemické, saprofytické („oportunní houby“)
eukaryota – rostlinné organismy => buněčná stěna z chitinu, glukanu nebo mananu
odlišné od bakterií: primárně rezistentní k atb!
makromycety X mikromycety (vláknité houby X kvasinky) – rozdělení dle velikosti, nic
společného se systematikou
houby dimorfní = mají plísňovou formu (saprofyt, 20°C) i kvasinkovou formu (parazit, 37°C)
Epidemiologicko-ekologická charakteristika mykóz
-
rozdělení na 6 tříd podle vzájemné adaptace houby a člověka (nejmenší saprofyti => paraziti =>
komensálové)
1. saprofyt, výjiimečně způsobuje onemocnění (např. aspergilóza)
2. hlavně saprofyt, ale v organismu parazit – způsobuje latentní nebo manifestní onemocnění,
není možný přímý přenos (např. histoplazmóza, kokcidioidomykóza)
3. hlavně saprofyt, v organismu parazit, je možný i přímý přenos z člověka na člověka (např.
sporotrichóza, geofilní dermatofyty)
4. parazit: houba adaptována na určitý živočišný druh, může nakazit člověka, ale přenos
z člověka na člověka málo; onemocnění akutní, prudké a dobře léčitelné – parazit člověku
cizí a není adaptován na jeho imunitní mechanismy (např. dermatofytózy)
5. parazit člověka, onemocnění mírné, chronické, obtížně léčitelné – houby adaptované na
člověka jako svého hostitele; šíření z člověka na člověka (antropofilní dermatofytózy)
6. nejvyšší vzájemná adaptace – komensalismus, nákaza často endogenní při oslabení
organismu, zdraví přenašeči mohou nakazit oslabené jedince (např. kvasinky, zejména
kandidózy)
-
oportunní infekce ze tříd 1 a 6, ale mechanismus vzniku se zásadně liší!
Imunita proti houbovým infekcím
- základní mechanismus nespecifické imunity: fagocytóza
- ze specifické obrany: imunita buněčného typu = založena na T-lymfocytech (naopak protilátky
mají diagnostický význam!!)
- imunodeficitní pacienti ohroženi hlavně kandidami, kryptokokem, primárními mykózami
Download

obecná mikrobiologie (.pdf)