CEA
ELISA test pro kvantitativní stanovení karcinoembryonického antigenu (CEA) v lidském séru
Obj. číslo : 52020 96 testů
kompletní souprava
Účel použití
Karcinoembryonický antigen (CEA) je glykoprotein s molekulární hmotností 180 kDa syntetizovaný během normálního vývoje plodu
v gastrointestinálním traktu a pankreasu a je vylučován do oběhového systému. U dospělých není syntéza CEA zcela redukována. U nekuřáků
může být zjištěn imunologickými metodami1 .
CEA je nejvíce používán jako ukazatel rakoviny gastrointestinálního traktu. Celkový CEA je primárně asociovaný s kolorektální rakovinou,
zvýšené hladiny CEA mohou způsobit i jiná nádorová onemocnění, včetně rakoviny prsu, plic, žaludku, vaječníků a jiných orgánů. Benigní stavy,
které způsobují vyšší než normální hladiny, zahrnují zápal plic, jater (cirrhosa) a gastrointestinálního traktu a benigní rakovinu 2,3. Silní kuřáci, jako
skupina, mají základní koncentraci CEA vyšší než je normální.
Kvantitativní stanovení CEA je používáno při monitorování pacientů s diagnostikovaným nádorovým onemocněním, u kterých byly pozorovány
zvýšené koncentrace CEA4 .
Princip
- sendvičová EIA Test CEA ELISA firmy HUMAN je založen na klasické sendvičové technice ELISA, využívající vysoké afinity systému biotin-streptavidin.
Streptavidinem byl potažen povrch mikrotitračních jamek. V prvním inkubačním kroku jsou vzorky, kalibrátory nebo kontroly a enzymový
konjugát (monoklonální protilátky proti CEA značené peroxidasou nebo biotinylované) smíchány za vzniku sendvičového komplexu, který je
vázán na povrch jamek interakcí biotinu s imobilizovaným streptavidinem. Na konci inkubace jsou přebytečný enzymový konjugát a nenavázaný
antigen vymyty. Je přidán substrát a vyvine se modré zbarvení, které se po zastavení reakce ukončovacím roztokem mění na žluté. Intenzita
zabarvení je přímo úměrná koncentraci CEA ve vzorku.
Absorbance kalibrátorů a vzorků je stanovena destičkovým ELISA spektrofotometrem (HUMAREADER). Koncentrace vzorku je interpolována
pomocí kalibrační křivky, která je stanovena z kalibrátorů o známé koncentraci CEA.
Obsah soupravy
[MIC]
[CAL]
[CON]
[WS]
[SA]
[SB]
[STOP]
12
Mikrotitrační destičky (v jednodestičkovém
držáku)
8-jamkové ulamovatelné řádky, potažené
streptavidinem
A - F Kalibrátory (bílé víčko)
6x2.0mlPřipraveno k použití, v lidském séru
CEA koncentrace: 0 (A), 5 (B), 10 (C), 25 (D),
50 (E), a 250 (F) ng/ml
13 ml Konjugát Protilátka-Enzym (bílé víčko)
pH 7.45
připraveno k použití, žluté
± 0.1
anti-CEA (myší) biotinylované a
anti-CEA (kozí) značené HRP
20 ml Promývací roztok (černé víčko)
Koncentrát pro asi 1000 ml
pH 8.8 ±
0.4
MOPSem pufrovaná sůl
5
mmol/l
Substrátová reagencie A (žluté víčko) pH 3.5
7.0 ml
± 0.1
3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)
1 g/l
Acetátový pufr
0.05 mol/l
7.0 ml
Substrátová reagencie B (modré víčko) pH
4.5 ± 0.1
Peroxid močoviny
0.8 g/l
Acetátový pufr
0.05 mol/l
7.5 ml Ukončovací roztok (červené víčko)
Kyselina sírová
Lepící páska
1
Konzervanty: Celková koncentrace <0,04%
0.5 mol/l
Bezpečnostní poznámky
Nepolykejte reagencie. Zabraňte potřísnění očí, kůže a sliznic. Se všemi vzorky a [CAL] zacházejte jako s materiálem potenciálně infekčním.
[CAL] byly kontrolovány na úrovni dárců na přítomnost protilátek proti HCV a HIV-1/2 a HBsAg s negativním výsledkem. Používejte ochranné
oblečení a jednorázové rukavice dle zásad správné laboratorní praxe.
Všechny materiály, kontaminované vzorky pacientů nebo [CAL], musí být inaktivovány schválenými postupy (autoklávování nebo chemické
ošetření) v souladu s příslušnými předpisy.
[STOP] dráždí oči, kůži a sliznice. Při kontaktu pečlivě omývejte velkým množstvím vody a konzultujte s lékařem.
Stabilita
Při skladování při teplotě 2 – 8°C jsou reagencie stabilní do data exspirace uvedeného na jednotlivých štítcích.
Po otevření musí být reagencie uloženy při teplotě 2 – 8°C a použity během 60 dnů (viz Poznámky).
[MIC]
- uzavřeno v hliníkovém obalu se sušidlem
- před otevřením musí mít pokojovou teplotu
- nepoužité: vraťte se sušidlem zpět do obalu a skladujte při 2-8 C. (viz poznámka)
Nedotýkejte se horního okraje ani vnitřku jamek prsty!
Příprava reagencií
Zahřejte před použitím všechny reagencie na pokojovou teplotu (15-25 C). Nepoužívané reagencie by měly být skladovány vždy při 2-8 C
Pracovní promývací roztok [WASH]
-slabý zákal, který se může objevit v koncentrátu [WS], se při ředění úplně rozpustí
-zřeďte [WS] tak, že vylijete obsah lahvičky do 1000 ml čerstvé deionizované vody ve vhodné nádobě. Několikrát lahvičku [WS] roztokem
[WASH] propláchněte.
Stabilita po zředění: 60 dní při 15 - 25 C.
Pracovní roztok substrátu [SUB]
- pro použití na delší časový úsek: připravte potřebné množství smícháním stejných dílů [SA] a [SB]. Používejte pouze čisté plastikové lahvičky
vypláchnuté neionizovanou vodou.
- pro použití během 30 dní: Slijte obsah lahviček [SA] a [SB] dohromady, promíchejte a skladujte při 2-8°C.
- se [SUB] zacházejte opatrně a zabraňte kontaminaci! Nepoužívejte, jestliže roztok vypadá modře.
- Skladujte chráněné před světlem.
- Stabilita: 30 dní při 2-8°C
Vzorky
Sérum
Nepoužívejte vysoce lipemické a hemolyzované vzorky.
Vzorky je možné skladovat při 2-8 C 5 dní nebo 30 dní při -20 C. Zmrazujte a rozmrazujte pouze jednou. Rozmražené vzorky musí být
homogenizovány. Odstraňte částice centrifugací nebo filtrací.
Pracovní postup
Dodržujte postup přesně!
Poznámky k postupu
P1: Nemíchejte složky s jinými čísly šarží. Nezaměňujte víčka lahviček (nebezpečí kontaminace). Nepoužívejte reagencie po jejich datu exspirace.
P2: Nepoužívejte reagencie, které mohou být kontaminovány nebo vypadají či páchnou jinak než je obvyklé.
P3: Zaznamenávejte pečlivě vzorky a kontroly do formuláře dodávaného s kitem
P4: [MIC] – vyberte požadovaný počet stripů (řádek) destičky a řádně upevněte v držáku.
P5: Nechte probíhat reakce kontrol, [CAL] a vzorků duplicitně (od každého dvě). Pipetujte kontroly a vzorky i [CAL] přímo na dno mikrojamek.
P6: Vždy přidávejte reagencie v tomtéž pořadí, abyste minimalizovali rozdíly v reakčním čase mezi jamkami. Toto je důležité pro
reprodukovatelné výsledky. Pipetování vzorků by nemělo překročit 10 minut. Jinak pipetujte kalibrační křivku v naznačených polohách v poločase
série. Jestli se používá více než jedna destička, opakujte dávce odpovídající (kalibrační) křivku pro každou destičku.
P7: Odstraňte vzduchové bubliny před inkubací a odečítání absorbance.
P8: [SUB] – inkubujte ve tmě. [SUB] iniciuje kinetickou reakci, která je zakončena přidáním [STOP].
P9: [MIC] – jemně kývejte s destičkou 20-30 sekund po každém pipetovacím kroku, abyste důkladně promíchali obsah jamek, aniž vylijete
roztoky. Je-li to možné, míchejte na automatické míchačce.
Promývací procedura
Promývací procedura je kritická. Nedostatečné promytí sníží přesnost nebo falešně zvýší absorbanci.
W1: Odstraňte lepící pásku, vylijte obsah jamek a přidejte [WASH] do každé jamky, po 30 sekundách navlhčování vylijte a opakujte promytí.
W2: V případě automatického promývání začněte s [WASH] a promyjte stripy 3x.. Ujistěte se, že promývač úplně plní všechny jamky a účinně
vylívá obsah po 30 sekundách (zbývající kapalina po vylití v jamce< 15ml).
W3: Po promytí odstraňte zbývající kapalinu buničinou s destičky obrácené vzhůru nohama.
Pipetovací schéma
Reagencie a vzorky musí mít před použitím pokojovou teplotu
Krok 1
Jamka [µl]
A1...D2
[CAL] A-F;
dvakrát
Vzorky, Kontroly; dvakrát
[CON]
E2...
Calibrators
Specimen
25
-100
-25
100
300
300
100
100
Promíchejte a přikryjte [MIC] lepící páskou.
Inkubujte 60 min při 20...25°C
Promyjte 3 x jak je popsáno (viz W1 - W3)
[WASH]
Krok 2
[SUB]
Inkubujte 15 min při 20...25°C (viz P8)
[STOP]
50
50
Opatrně promíchjte.
Změřte absorbanci at 450 nm hned, jakmile je to možné nebo
během 10 min. po skončení reakce, za použití referenční vlnové
délky 630-690 nm (je-li to možné).
Platnost testu
Výsledky testu jsou platné, jsou-li splněna následující kritéria:
1) Maximální absorbance (kalibrátor F) O.D. max. ≥ 1,5
2) Analyzuje se na 3 úrovních:
Koncentrace CEA
při 80 %O.D. max. = 200± 50 ng/ml
Koncentrace CEA
při 50 % O.D . max. = 100 ± 45 ng/ml
Koncentrace CEA
při 20 % O.D . max. = 25 ± 15 ng/ml
Výpočet
Kalibrační křivka se používá k odečtení koncentrace CEA v neznámých vzorcích.
Vyneste na milimetrový papír absorbance duplicitních kalibrátorů proti odpovídající koncentraci CEA v ng/ml (nepočítejte z dvojic
1.
průměrnou hodnotu a vyneste obě hodnoty absorbance).
2. Vytvořte regresní přímku.
3. Koncentraci CEA v neznámém vzorku (S) zjistíte tak, že od hodnoty průměrné absorbance vzorku na svislé ose vedete přímku až protne
křivku, tomuto bodu odpovídá na horizontální ose příslušná koncentrace (v ng/ml). Pro ilustraci viz obrázek.
Interpretace výsledků
CEA je již léta neznámějším a nejakceptovanějším příznakem nádoru. Může být detekován u řady nádorových onemocnění, ale má nízkou
klinickou citlivost a specifitu.
Pacienti s kolorektální rakovinou zvýšené hodnoty CEA nemusí vykazovat. Postup nebo ústup nemoci nemusí mít vždy za následek zvýšené
hladiny CEA. Kuřáci, ale také starší lidé vykazují vyšší rozsah základních hodnot než nekuřáci a mladší osoby.
CEA je důležitým příznakem pro metastáze. Vysoké hladiny mohou být očekávány u metastází v kostech, játrech, plicích a při vícečetných
metastázích.
Trvalé vysoké hladiny po léčbě obvykle indikují zbytkové maligní oblasti nebo metastázy. Stálé snižování je spojeno s příznivou prognózou.
Stanovení hodnoty CEA samotné není postačující pro stanovení rakoviny. Musí být použito ve spojení s jinými klinickými projevy a
diagnostickými parametry.
Očekávané hodnoty
Nekuřáci (90%)
Kuřáci
Hladina CEA (1)
< 5 ng/ml
< 10 ng/ml
Každá laboratoř by si měla stanovit své vlastní očekávané hodnoty vzhledem k používaným přístrojům, metodám odběru krve a testovacím
technikám užívaným v této laboratoři.
Parametry testu
Test CEA ELISA firmy HUMAN má citlivost cca 0,01 ng. To je ekvivalent koncentrace CEA 0,45 ng/ml vzorku.
Vzorky s koncentrací CEA nad 250 ng/ml musí být zředěny v poměru 1+9 normálním sérem (CEA < 5 ng/ml) a znovu analyzovány. Výsledek
násobte 10.
Analýza je standardizována v souladu s WHO 1 st I.R.P. pro CEA (73/601): 1 ng/ml = 0,011 IU/ml.
Poznámka
Výrobky jsou i po otevření stabilní do data expirace. Jejich kontaminace ovšem přímo souvisí s počtem otevření lahviček. Proto je z důvodu
bezpečnosti stanoven 60 denní limit pro používání po prvním použití.
Opatrná manipulace dle zásad správné laboratorní praxe (*) poskytuje možnost používat reagencie i po uplynutí 60 dnů. Reagencie musí vždy
splnit kritéria kontroly kvality!
(* To zahrnuje: Uzavírat lahvičky správnými zátkami a těsně je dotahovat / množství reagencií potřebné pro analýzu odebrat z velkých balení, mohou-li tyto reagencie
přijít do styku s kontaminujícími látkami (např. séry pacientů) / reagencie co nejdřív vracet do chladničky (2 – 8°C).
Literatura
1. Wild, D., The immunoassay Handbook, Stockton Press, 444 (1994)
2. Zamcheck, N., Adv Intern Med 19, 413 (1974)
3. Rayncao, G., Chu, T., JAMA 220, 381 (1972)
4. Begent, R., Ann Clin Biochem 21, 231-238 (1984)
Human Gesellschaft für Biochemica und Diagnostica mbH
Max -Planck -Ring 21 - D-65205 Wiesbaden - Germany
Telefon: +49 6122 9988 0 - Telefax: +49 6122 9988 100 - eMail: [email protected]
EL-CEA
INF 5202001 GB
06-2004-9
Download

Příbalový leták