SFZR
2014
1
5) Fyziologie rostlinných hormonů
auxinů: receptory a signální dráhy
SFZR
2
Ve 30. letech byl izolován auxin a bylo ukázáno, že stimuluje růst..
Úhel zakřivení je
úměrný množství
auxinu v bloku
a) Auxinový receptor TIR1
Akumulace auxinu ze
špiček koleoptile do
agarových bloků
b) Auxinový receptor ABP1
c) Kooperace receptorů TIR1 a ABP1
...a ukázal, že materiál
akumulovaný v
agarových blocích je
látka, která stimuluje
růst.
Tento experiment ukazující stimulaci
růstu auxinem byl použit jako základ
pro purifikaci auxinu.
Indole-3-acetic
acid, IAA
Estelle M et al. (2011) Auxin Signaling: From Synthesis to
Systems Biology; Cold Spring Harbor Laboratory
Redrawn from Went, F.W. (1935) Auxin, the plant growth-hormone. Bot. Rev. 1: 162-182.
SFZR
3
Auxiny – důležité rostlinné hormony zapojené v širokém spektru
růstových a vývojových procesů:
4
SFZR
a) Auxinový receptor TIR1
 embryogeneze
Intracelulární receptor TIR1 (Transport Inhibitor Response 1) u Arabidopsis
 prodlužování stonku
Kepinski and Leyser 2005
 apikální dominance
Dharmasiri et al. 2005
 foto- a gravitropismus
 tvorba laterálních kořenů
Jádro
Auxin se váže v jádře přímo k TIR1
Buněčná úroveň:
TIR1
 buněčné dělení
TIR1
 expanze buněk
2) Receptor zprostředkující transkripční
reakce k auxinu
 diferenciace buněk
A
5
SFZR
tir1-1 mutant u Arabidopsis:
A
1) První intracelulární auxinový receptor
SFZR
6
F-box – zprostředkuje transkripční reakce k auxinu
TIR1
wt
tir1
A
TIR1
A
A
tir1-1 – rezistentní k inhibitoru
polárního transportu auxinu (NPA)
tir1-1 – redukovaná tvorba
laterálních kořenů
TIR1
- 2,4-D
Jádro
Degradace
substrátu
 TIR1 obsahuje sérii leucinů a motif zvaný F-box
 F-box proteiny jsou zapojeny v procesech zprostředkovaných
ubiquitinací
+ 2,4-D
Reakce k auxinu závisí na modifikacích proteinů procesem ubiquitinace.
TIR1 funguje v ubiquitinační konjugační dráze, která směřuje proteiny k
proteolytické degradaci.
Vazba auxinu k TIR1 umožňuje vazbu substrátového proteinu ( = represoru transkripce
auxinem-indukovaných genů). To vede k degradaci substrátového proteinu a tak k uvolnění
exprese auxinem-indukovaných genů.
Auxin funguje jako „lepidlo“ umožňující spojení TIR1 se substrátem
A
TIR1
1
7
SFZR
Ubiquitinace - nezbytný regulační mechanizmus v rostlinných i živočišných
buňkách
Ub
Ub
Ubiquitin
Jádro
Ub
SFZR
8
COP1 funguje jako E3 ubiquitin ligáza – enzym zajišťující v buňce
degradaci proteinů (proteolýzu)
Proteolýza zprostředkovaná proteazomem vyžaduje protein ubiquitin.
Ub
26S Proteazom
E1
Ubiquitin-activující enzym
E2
Ubiquitin-conjugující enzym
Ubiquitinace – běžný mechanizmus degradace proteinů v organizmech
E1
A
F-box
Ub
E1
Ub
Ub
Ub
Ub
E2
F-box
ASK1
F-box E3 ubiquitin-ligázy
ubiquitin
RBX1
protein
ubiquitin
protein
Ubiquitin
CUL1
Cílový protein
26S
proteazom
E3 ubiquitin
ligáza
UPDATE 2012
Cílový protein je poly-ubiquitinován a směřován
do 26S proteazomu, kde je degradován.
Lau OS, Deng XW (2012) TIPS 17: 584-593
Nejnovější informace o funkci COP1 v rostlinách
SFZR
9
10
SFZR
Proteiny Aux/IAA jsou proteiny s velmi krátkou životností
Co je substrátovým proteinem?
Aux/IAA mají regulační funkci
Proteiny typu Aux/IAA – nukleární
proteiny, které potlačují auxinové
reakce. Arabidopsis – identifikováno
29 typů proteinů.
Aux/IAA
I
II
III
Aux/IAA jsou destabilizovány
za přítomnosti auxinu.
IV
Proteiny Aux/IAA mají proteindestabilizující doménu.
Fúzní Aux/IAA-GUS
protein ukazuje
jadernou akumulaci
11
SFZR
PS-IAA6
12
SFZR
Prostřednictvím domény degron se Aux/IAA váže k TIR1
Aux/IAA
I
II
III
IV
I
II
III
QVVGWPPVRSYRK
IV
Wild-type degron
Krátká aminokyselinová sekvence nazývaná degron – nutná
pro auxinem-indukovanou nestabilitu proteinu Aux/IAA
I
II
III
IV
QVVGWPLVRSYRK
Mutant degron
Změna v jedné aminokyselině v doméně degron vede k větší
stabilitě proteinu Aux/IAA => rezistence k auxinu
Mutace v doméně degron brání proteinu Aux/IAA ve vazbě k TIR1 a tím
brání v degradaci Aux/IAA => mutantní protein Aux/IAA je stabilnější.
2
13
SFZR
Transkripční faktory ARF (Auxin Response Factors) – proteiny
s krátkou životností; váží se k DNA sekvenci nazývanou AuxRE
(Auxin Response Element). ARF stimulují expresi auxinemindukovných genů.
Arabidopsis – 23 ARFs
ARF
DNAActivation /
binding repression
domain domain
III
14
SFZR
Proteiny Aux/IAA blokují transkripční faktory ARF
A
TIR1
Transkripční výsledek (aktivace či potlačení) závisí na koncentraci auxinu, a tím na
finální koncentraci transkripčních faktorů ARF a Aux/IAA v buňce a k jejich vzájemné
afinitě a afinitě k vazebnému místu na DNA.
IV
[Auxin]
Aux/IAA
I
II
III
ARF
[Aux/IAA]
IV
Transkripční výsledek
Vazba ARF k AuxREs
ARF
AuxRE
Auxin–responsivní gen
ARF homodimer
ARF Aux/IAA heterodimer
TGTCTC
15
SFZR
Ub
TIR1- zprostředkovaná
signalizace auxinu
Aktivace
genové
exprese
Potlačení
genové
exprese
16
SFZR
Ub Ub
Rozmanitost auxinových reakcí koreluje s rozmanitostí signálních
proteinů.
26S Proteasome
E1
A
– auxin
A
Ub
E1
Ub
TIR1
TIR1
– F-box podjednotka E3-ubiquitin
ligázy; auxinový receptor
Ub
Ub
Aux/IAA
Ub
E2
Auxin
ASK1
RBX1
– represor transkripce
auxinem-indukovaných genů
ARF
ARF
CUL1
– transkripční faktor (aktivátor
exprese genů)
A
TIR1
TIR1
Auxinem-indukované geny obsahují
AuxRE = auxin responsivní element
A
TIR1
A
A
A
A
A
A
A
Podobné mechanizmy pro F-box proteiny:
COP1 – CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOG. 1
COI – CORONATINE INSENSITVE 1
Transkripční
výsledek
2010 American Society of Plant Biologists
ARF
ARF
AuxRE
Auxin–inducible gene
Počet potenciálních interakcí
mezi ARFs a Aux/IAA proteiny je
veliký. Tím vzniká vysoký
potenciál (schopnost) přesně
kontrolovat expresi auxinemindukovaných genů v mnoha
kombinacích.
e.g. AUX/IAA,
SAUR, GH3, etc.
AuxRE
de-repression
ZTL – ZEITLUPE, etc.
Plant development
[Auxin]
17
SFZR
UPDATE 2012
18
SFZR
Auxinem indukované geny
Calderón Villalobos LIA et al. (2012) Nature Chemical Biology 8: 477-485
Rozmanitost auxinových reakcí je dále zvyšována různou afinitou
receptorů TIR1 a substrátových proteinů Aux/IAA k auxinu.
Primární (rané) geny – přímo aktivované TIR1/AFBs-Aux/IAA signalizací
Sekundární (pozdní) geny – kódují proteiny, které nejsou přímo zapojeny
v indukci primární auxinové reakce
6 typů receptorů typu TIR1: TIR1, AFB1, AFB2, AFB3, AFB4 a AFB5
29 typů proteinových substrátů Aux/IAA
Primární (rané) geny - indukce: minuty až hodiny; 3 funkce
Receptory TIR1/AFBs mají různou afinitu k
substrátům Aux/IAA, a to v závislosti na koncentraci
auxinu. Při různé koncentraci auxinů se tak k různým
receptorům TIR1/AFBs připojují různé substráty
Aux/IAA. Některé substráty Aux/IAA vyžadují
vysokou koncentraci auxinů k tomu, aby se připojili k
receptoru TIR1/AFBs.
6 typů
Komplex TIR1/AFBs-Aux/IAA se nazývá
co-receptorový systém. Afinita Aux/IAA
k auxinu je určující pro celkovou afinitu
systému.
Transkripce – rané geny kódují proteiny regulující expresi pozdních
genů
A
TIR1/
AFBs
Koncentrace auxinů
29 typů
Signalizace – rané geny jsou zapojeny v intercelulární komunikaci nebo
signalizace mezi buňkami
Konjugace/katabolismus auxinů – rané geny kódují proteiny zapojené
v eliminaci IAA buď konjugací nebo degradací
3
19
SFZR
SFZR
Primární geny pro růst a vývoj
AUX/IAA – exprese stimulovaná auxinem během 6 – 60 minut; vzniklý
protein žije asi 7 minut.
Signální dráha receptoru TIR1 – důležitá, ale ne jediná, dráha
pro funkci auxinu
Homology TIR1: AFB1, AFB2, AFB3, AFB4, AFB5 – stejná funkce jako TIR1
Avšak: 1) Čtyřnásobný mutant – stále funkční rostlina
Receptory TIR1 a AFB nejsou nepostradatelné
SAUR – exprese stimulovaná auxinem během 2 – 5 minut; exprese
nevyžaduje syntézu nových proteinů; geny neobsahují introny, kódují
velmi podobné peptidy neznámé funkce.
 Indukují expanzi buněk (SAUR19)
 Indukují dělení buněk (SAUR76)
20
Col-0
tir1 afb1 afb2 afb3
UPDATE 2013-2014
 Koordinují dělení a expanzi buněk (SAUR41)
GH3 – exprese stimulovaná auxinem během 5 minut; geny fungují v IAA
konjugaci; exprese GH3 odráží množství endogenního auxinu =>
syntetický promotor DR5.
Sekundární (pozdní) geny
Exprese stimulovaná auxinem během 2 – 4 hodin; často indukovány
i stresem
Dharmasiri et al. 2005b
2)
Auxin indukuje prodlužování buněk s lag fází 8-15 min => rychlá reakce vylučující zapojení TIR1, tedy transkripci
genů či syntézu proteinů
Auxin funguje prostřednictvím signální
dráhy s jiným receptorem
Receptor
ABP1
Steffens and Lüthen 2000
4
Download

5) Fyziologie rostlinných hormonů auxinů: receptory a signální dráhy