Imunochemické metody
na principu vazby antigenu a protilátky
ANTIGEN (Ag) – specifická látka (struktura) vyvolávající
imunitní reakci a schopná vazby na protilátku
PROTILÁTKA (Ab – antibody) – molekula bílkoviny vážící
specificky daný antigen
EPITOP – specifická část molekuly antigenu reagující a
vážící se na protilátku
HAPTEN – většinou nízkomolekulární látka schopna
vyvolat imunitní reakci tj. vazby na protilátku ale pouze po
vazbě na větší molekulu (většinou protein)
AGLUTINACE – srážení antigenu specifickou protilátkou
Antigeny
• částice – jiné buňky, baktérie, viry
• molekuly – individuální bílkoviny, směsi bílkovin (např.
krevního séra), části bílkovin – peptidy
• kusy tkání, orgánů, membrán
Ne všechny protilátky mohou reagovat se svým antigenem
Protilátky
• bílkoviny
• základní tvar molekuly - Y
• dva těžké a dva lehké řetězce
• disulfidické můstky
• variabilní část
• imunoglobulíny – pět tříd: IgA,
IgG, IgD, IgE, a IgM
Vazba antigenu a protilátky
• Nevazebné interakce
- vodíkové můstky
- iontové interakce
- van der Waalsovy síly
- dipol-dipol
• Interakce mezi antigenem a protilátkou závisí na
pH, iontové síle a přítomnosti dalších látek např.
detergentů, chaotropních činidel …
• Více protilátek reagujících s
jednou částicí
• Precipitace
Vizualizace
• Precipitace protilátky s antigenem
• Značená primární protilátka (reaguje s antigenem)
• Značená sekundární protilátka (váže se na primární
protilátku)
• Značený antigen
Značení protilátek (antigemnů)
•
•
•
•
enzymatická barevná reakce
fluorescence
chemilumiciscence
radioizotopové značení
Aglutinace - precipitace
• Přímé značení – značená primární protilátka
• Nepřímé značení – primární protilátka neznačena, značku
nese sekundární protilátka - druhově specifická vůči
primární protilátce
Značená primární protilátka
Značená sekundární protilátka
Příprava protilátek
Imunizace, očkování – odezva imunitního systému
na přítomnost antigenu
Hostitel - myši, králíci, kozy, prasata, koně
Adjuvantní látky
Jedna nebo více dávek antigenu
maximum IgM asi po týdnu, IgG asi po třech týdnech
Krevní sérum s protilátkou
odběr krve
• z ucha – malé množství, malé zvíře
• ze žíly – větší zvířata (více antiséra)
• vykrvení – zabití a získání veškeré krve
• sražení krve
• centrifugace – získání krevního séra
• izolace protilátek a jejich přečištění (srážení,
chromatografie
Imunodetekce
detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky
• Sérologické metody
• Imunoprecipitace
• ELISA
• Imunoblotování
Imunodetekce
Volně v roztoku - sérologické metody
• Detekce protilátek - pomocí precipitace s příslušným
antigenem (Salmonela, Listerie, ...)
• Detekce mikroorganismů pomocí předem připravených
protilátek (Salmonela, Streptokoky, Stafylokoky, ...)
• Detekce antigenů vylučovaných mikroorganismy pomocí
předem připravených protilátek (Streptokoky – zápal plic,
Haemophillus influenzae – meningitida, ...)
• Krevní skupiny – průkaz krevních skupin reakcí protilátek s
antigeny na červených krvinkách
Krevní skupiny
Na povrchu erytrocytů - červených krvinek se vyskytují
aglutinogeny – speciální antigeny určující krevní skupiny
Na jejich základě určujeme čtyři základní krevní skupiny:
A, B, AB a 0
V krvi se také vyskytují protilátky proti cizím krevním skupinám
(aglutinogenům)
Antigeny na povrchu erytrocytů - aglutinogeny A a B
(aglutinogen –aglutinace krve)
Skupina A – tvoří aglutinogen A
Skupina B – tvoří aglutinogen B
Skupina AB – tvoří oba aglutinogeny
Skupina 0 – netvoří ani jeden z aglutinogenů A a B (tvoří typ H,
prekurzor A a B)
Protilátky tvořené v krvi – aglutiny anti-A a anti-B
Skupina A – tvoří aglutinin anti-B
Skupina B – tvoří aglutinin anti-A
Skupina AB – netvoří žádný aglutinin
Skupina 0 – tvoří oba aglutininy anti-A i anti-B
Aglutinace – zjišťování krevní skupiny
Imunodetekce
Imunoprecipitace v gelech
• V agarózovém gelu
• Možnost použít více protilátek v jednom experimentu
• Možnost detekce více antigenů v jednom experimentu
• Kombinace s elektroforézou
• Kvantifikace
Reakce králičích protilátek proti lidskému séru s různými séry z:
člověka (Ho), krávy (Bo), koně (Eq), kočky (Fe), kozy (Cap), ovce
(Ov), mýši (Mu), psa (Ca), králíka (Ra), prasete (Su)
Kvantifikace antigenu
Kalibrační křivka
Protilátka je přítomna v
agarózovém gelu, do
jamek je přidáno známé
množství antigenu.
Imunoelektroforéza
Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém
gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku,
imunodifuzí a precipitací.
Imunoelektroforéza
Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém
gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku,
imunodifuzí a precipitací.
Rocket imunoelectroforéza
Kvantitativní metoda
Agarózový gel s příslušnou
protilátkou, pH přibližně 8.6 –
protilátky se nepohybují
Elektroforéza proteinů
(antigenů) o známé koncentraci
a neznámých vzorků
Imunodetekce
Metody ELISA
ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Barevná reakce protilátky a antigenu
Využívá vlastnosti biologických makromolekul pevně se
vázat na některé polymery (polystyrén ...)
ELISA metody lze dělit podle řady kritérií
• Stanovení antigenu (Přímá ELISA)
• Stanovení specifických protilátek (Nepřímá ELISA)
• Normální – vazba přímo na povrch jamky
• Sendvičová – vazba přes zprostředkovatele
Pevná fáze s navázaným antigenem
Pevná fáze s navázanou protilátkou
Vizualizace
• značená primární protilátka (reaguje s antigenem)
• značená sekundární protilátka (váže se na primární
protilátku)
• značený antigen
Značení
•
•
•
•
enzymatická barevná reakce
fluorescence
chemilumiciscence
radioizotopové značení
Western blotting
Imunologická detekce bílkovin separovaných pomocí ELFO
Přenos proteinů na membránu
• elektroforetický přenos
• pasivní přenos difuzí
Výběr membrány:
PVDF, nitrocelulosa,
radioaktivní a neradioaktivní detekce,
glykoproteiny, druhá detekce, screening
exprese
Vizualizace proteinů
• Přenesení proteinů
• Blokace volných vazebných míst na membráně
• Navázání primární specifické protilátky
• Navázání značené protilátky specifické proti
primární protilátce
Vizualizace sekundární protilátkou
• Barevná reakce
• Chemiluminiscence
• Fluorescence
• Radioaktivní detekce
Imunoafinitní preparace
• Využití specifické vazby antigenu a protilátky při jejich
izolaci a přečištění
• Izolace přímo z roztoku precipitací
• Izolace z roztoku pomocí antigenu nebo protilátky
navázané na specifické částice nebo molekuly (protein A,
magnetická separace)
• Imunoafinitní chromatografie
Směsný vzorek
před čištěním
Aplikace specifických Oddělení protilátek s
protilátek
navázaným antigenem
Využití vazby protilátky (nebo antigenu) na
částice se specifickým vazebným místem
Příklad využití částic při magnetické separaci
Magnetická částice s
navázanou protilátkou
Reakce protilátek s antigenem
Separace částic pomocí magnetu
Download

4hod Imunochemie.pdf