GC a HPLC jako nástroj řešení aktuálních
analytických problémů včetně rychlých a
multidimenzionálních technik
GC
2
Kapilární kolony
• 19. – 23.5. 1958 Sympozium v Amsterodamu
• M.J.E. Golay
• 2 chromatogramy dělení všech uhlovodíků C6
do 9 min., 45,7 m, ID. 0,25 µm, 50 000 teor. pater, 0,5 ml/min
• McWilliam – FID detektor
• D.H.Desty (BP) – první chromatograf pro kapilární kolony a FID
• dříve skleněné nebo z nerezové oceli
• dnes výhradně křemenné s polyimidem
• kapilára (5-150m)
• vnější stěna je pokryta polyimidovým filmem
• na vnitřní stěnu je navázána stacionární fáze
• kolona je charakterizována následujícími parametry
– typem fáze
– délkou kolony
(5-150m)
– ID (vnitřní průměr)
(0.10-0.75mm)
– tloušťka fáze df
(0.10-7.0µm)
3
Kapacita kapilárních kolon
Kategorie
Vnitřní průměr
Kapacita
Megabore
0,53 mm
100–250 ng
Wide bore
0,32 mm
50–125 ng
Narrow bore
0,25 mm
50–100 ng
Microbore
0,18–0,20 mm
25–50 ng
Pro šířku filmu 0,25 µ
Zdroj: D. Rood: A Practical Guide to the Care, Maintenance, and Troubleshooting
of Capillary Gas Chromatography Systems, 3rd Edition, Wiley, 1999
4
Rychlost GC separace
Typ GC analýzy
Doba separace
w1/2 píku
Konvenční
>10 min
>1 s
Rychlá
1–10 min
200–1000 ms
Velmi rychlá
0,1–1 min
30–200 ms
Ultra-rychlá
<0,1 min
5–30 ms
Zdroj: K. Maštovká, S.J. Lehotay (2003) J. Chromatogr. A 1000, 153–180
5
Srovnávací tabulka
Column ID
Sample
Capacity (ng)
He
[email protected]/sec.
H2
[email protected]/sec.
Theoretical
Plates/m
Effective
Plates/m
0.10mm
0.18mm
0.25mm
0.25m
0.32mm
0.32m
0.53mm
0.53m
5-10
10-20
50-100
0.1cc/
min.
0.2cc/
min.
8600
0.3cc/
min.
0.6cc/
min.
5300
0.7cc/
min.
1.4cc/
min.
3300
m
m
4001000500
2000
1.0cc/ 2.6cc/m
min.
in.
2.0cc/ 5.2cc/m
min.
in.
2700
1600
6700
3900
2500
2100
1200
6
uV
90e3
80e3
C
O
N
V.
70e3
72 min
60e3
50e3
40e3
9 10
30e3
20e3
1112
10e3
0e3
31.40
6.7
uV
6.8
6.9
7.0
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
38.55
8.3
min
90e3
80e3
F
A
S
T
16 min
70e3
60e3
50e3
40e3
30e3
20e3
10e3
0e3
6.65
6.7
uV
6.8
6.9
7.0
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
7.8
7.9
8.0
8.1
8.2
8.35
8.3
min
375000
350000
325000
300000
2.3 min
275000
250000
225000
200000
175000
150000
125000
100000
75000
50000
25000
0
1.225
1.250
1.275
1.300
1.325
1.350
1.375
1.400
1.425
min
U
L
T
R
A
F
A
S
7
T
Aplikace v plynové chromatografii
1.
Petrochemie
–
2.
Biochemie, farmacie, soudní chemie
–
3.
pitná,odpadní a povrchová voda, odpady, půdy
Sledování ovzduší
–
6.
FAME, barviva a vůně, pesticidy,….
Životní prostředí
–
5.
FAME, zbytková rozpouštědla, drogy, požářiště
Potraviny a nápoje
–
4.
plyn, ropa, produkty po rafinaci, bionafta
sledování vnitřních a venkovního ovzduší, kontrola emisí
Chemie
–
kontrola jednotlivých kroků syntéz
8
SUPELCO
9
Typy fází
• nevázané
• SP-... (Supelco Phase), SE-30, SE-54, DEX)
• vázané
SPB - Supelco Phase Bonded
Equity 1, 5, 1710
SLB- 5ms- Supelco Low Bleed
SUPELCOWAX 10
– Polyethyleneglykol
– tepelně stabilní do 280°C
• SLB-IL
•
•
•
•
10
Stacionární fáze
Nepolární
Chirální
Polární
Cyklodextrinové
deriváty
100 % dimethylpolysiloxan
(5 %-fenyl)methylpolysiloxan
(50 %-fenyl)methylpolysiloxan
Polyethylenglykol
(70 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan
(100 %-kyanopropylfenyl)methylsiloxan
11
Ox
yg
of a en co
nt
lc
and ohol s ai ni ng
,
k
l ac
a
ton etone nalyt
es ;
es
s
,
Al i p
a
in t
hal
h
oge cids,
hat
al d e f or m
ic a
and
nat
e
n
e
h
s
d
dc
om ydes,
rac ome a arom
em
p
a
r
oun
ate oma tic a
ds
tic
min
s
es t
es ;
Lac
e
rs ;
a
to
pol l i pha
epo nes a
a
tic
r
xid
es ; nd ar o
sty
m
Am
ren atic
i no
a
eo
x i de m i nes
ac i
d
;
s; a
Al i p
min
h
es ;
ena atic, o
fura
ntio
le
m e f eni c
ns
,
r
s
and
T er
ar o
pen
ma
es
tic
and
He
tero
t er t
i ar y
cyc
lic a
am
Xy l
i ne
m in
ene
s
e
s,
phe
s
nol m ent
ena s, su hols
,
ntio
b
me stitute cresol
r
d
s
ben s, sub
Ac i
ds,
z en
s
a
es, tituted
eth
er s l c oho
e
pox
ket , halo ls, am
i de
one
h
i
n
y
e
d
s
s,
ro
terp
,
ene positio carbo diols
,
n
s, t
n
erp al iso s, hy esters
d
i ne
m
er s r oc a ,
ol s
r
, si
me
lan bons,
t ha
es ,
mp
het
am
i ne
Supelco chirální kapilární GC
By Chemistry
CHIRALDEX TA
CHIRALDEX DP
CHIRALDEX PN
CHIRALDEX BP
CHIRALDEX DM
Supelco DEX 325
Supelco DEX 225
CHIRALDEX Bonded B-PM
CHIRALDEX PM
Supelco DEX 120
Supelco DEX 110
CHIRALDEX DA
CHIRALDEX PH
By Cyclodextrin
alpha-Cyclodextrin
beta-Cyclodextrin
gamma-Cyclodextrin
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
12
13
SUPELCO kolony pro analýzy životního prostředí, ovzduší
• 1984 - SPB-608
• nízké koncentrace pesticidů a herbicidů, ECD (US EPA 508, 608, 8080, 8081)
• 1985 - SP-2331
• polární kyanosilikonová fáze - dioxiny
• 1986 – VOCOL
• těkavé organické látky (US EPA 502.2, 524.2, 624, 8240, 8260, 8021)
• 1987 - Sup-Herb
• herbicidy dle US EPA metody 507
• 1995 SPB-624
• těkavé halogenované, nehalogenované a aromatické kontaminanty z vody – vyhovuje řadě US EPA metod
• 1997 - SPB-HAP
• nebezpečné látky znečišťující ovzduší
• 2003 - Equity 1, 5, 1710
14
SLB- 5ms
• SLB- 5ms je určena pro stopové analýzy
• Vývoj byl zaměřen na
• nový způsob deaktivace povrchu křemenné kapiláry
• nový typ polymeru
• Stabilní, nedochází k úniku stacionární fáze
• čistá MS spektra
• lepší poměr signál/šum
• nižší kontaminace MS detektoru
15
Únik stacionární fáze
Tradiční kolona - 5% fenyl
Me
O
Si
O
Si
Me
5%
95 %
n
Eliminace cyklotrisiloxanu (D3) za vysokých teplot nebo v katalytickém prostředí.
Další je eliminace oktametylcyklotetrasiloxan (D4).
Si
O
Si
Si
O
Si
O
Si
O
O
+
Si
O
Si
Si
O
O
D3
Si
Si
16
MS Spectrum - únik stacionární fáze
Abundance
Scan 4970 (24.623 min): 0715011.D
207
6500
6000
D3
5500
5000
4500
4000
3500
3000
D4
2500
2000
1500
73
281
1000
500
147
44
96
115
177
249
225
0
40
60
429
341
323
303
363 384 407
80 100120140160180200220240260280300320340360380400420
m/z-->
17
Únik stacionární fáze
Silphenylene-Siloxane Copolymer
O
Me
Me
Si
Si
Me
Me
Me
O
Si
Me
x
n
poly{poly[oxy(dimethylsilandiyl]oxy(dimethylsilandiyl)
(1,4-fenylen)(dimethylsilandiyl)}
18
SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech
a povrchových vodách
19
SLB-5ms - středně těkavé látky v pevných odpadech
a povrchových vodách
20
SUPELCO kolony pro petrochemické aplikace
Analýzy
uhlovodíků
Petrocol
Petrocol
Petrocol
Petrocol
DH 50.2
DH
DH150
DH Octyl
Analýzy
permanentních
plynů, lehkých
uhlovodíků atd.
SIMDIS
Carboxen-1006 PLOT Petrocol 2887
Carboxen 1010 PLOT Petrocol EX2887
Mol Sieve 5A PLOT SGE HT-5
Supel-Q PLOT
SPB-1 Sulfur
Analýzy
aromátů
TCEP
Misc.
SCOT
21
PLOT kolony - charakteristika
Carboxen 1006
Carbon Mole Sieve
Carboxen 1010 (7A)
Carbon Mole Sieve
Mol Sieve 5A
Zeolite
Supel-Q
Porus Polymer
Alumina sulfate
deaktivated Na 2SO4
Alumina Chloride
deaktivated KCl
715 m2/g
Sférické
Permanentní plyny
675 m2/g
Sférické
Permanentní plyny
325 m2/g
Nepravidelné
Permanentní plyny
705 m2/g
Sférické
Těkavé a středně
těkavé látky
C1-C12 Uhlovodíky
250-350 m2/g
Nepravidelné
250-350 m2/g
Nepravidelné
C1-C12 Uhlovodíky,
Freony
22
PLOT Alumina Sulfate a Chloride
Separace uhlovodíků C1 a C4. Kombinace upraveného povrchu a porózity umožňuje separaci methanu od
C2 uhlovodíků, acetylen po n-butanu, separuje se n-penten a 1,3 butadien. PLOT Alumina Chloride je
méně polární. separují se na ní např. i freony.
4
2
3
56
78
12
11
15
1314 16
17
1
0
4
2
10
20
30
Time (min)
78
3
56
9
10
11
12 13
14
1516
18
17
1
0
18
9 10
10
20
Sulfate Peak List (top)
1.
methane
2.
ethane
3.
ethylene
4.
propane
5.
cyclopropane
6.
propylene
7.
isobutane
8.
n-butane
9.
propadiene
10. acetylene
11. trans-2-butene
12. 1-butene
13. isobutylene
14. cis-2-butene
15. isopentane
16. n-pentane
17. 1,3-butadiene
18. propyne
Chloride Peak List
1. methane
2. ethane
3. ethylene
4. propane
5. cyclopropane
6. propylene
7. isobutane
8. acetylene
9. n-butane
10. propadiene
11. trans-2-butene
12. 1-butene
13. isobutylene
14. cis-2-butene
15. isopentane
16. n-pentane
17. propyne
18. 1,3-butadiene
30
Time (min)
18 analytů / 35°C (2.5 min.)-> 5°C/min.->150°C
23
Analýzy FAME
• Biochemie
• Analýza potravin
• Bionafta
24
SUPELCO kolony pro FAME
• kapilání
•
•
•
•
•
•
1983 - SP-2560
1987 - SP-2380
1990 - Omegawax 320
1991 - Omegawax 250
1995 - SPB-PUFA
2007 - Omegawax 100
25
GC Analysis of Plasma FAMEs on the SUPELCOWAX™ 10
10 m × 0.10 mm I.D., 0.10 µm
26
Omega 3 a 6 mastné kyseliny
• Analýzy obsahu trans a Omega 3 a 6 mastných kyselin v potravinách se staly
velice populární od té doby, kdy se obsah tzv. zdravých tuků musí uvádět na
obalech potravin.
• Rostoucí spotřeba Omega 3 mastných kyselin je spojována se snižováním
nebezpečí nemoci věnčitých tepen a zároveň se vyzdvihuje jejich význam při vývoji
dětského mozku.
• Analýzy jsou dlány podle AOAC Metody 991.39 nebo AOCS Metody Ce 1i-07 na
30 metrové koloně Supelcowax™ 10 nebo Omegawax™ za 30 až 40 minut.
• Nová kolona Omegawax™ 100 µm ID kapilární kolona tento čas významně
zkracuje.
27
FAMEs
• Mastné kyseliny se dělí GC, a to jako methylestery (FAME)
• Je třeba je derivatizovat.
• Volba vhodné kolony bude záviset na předpokládaných analytech.
• Nepolární kolony se používají pro separace nasycených a nenasycených
mastných kyselin.
• Kolony na bázi polyethyleneglycolů zase dělí podle délky uhlíkového řetězce či
podle stupně nenasycenosti kyselin.
• Pokud dělíme cis/trans izomery mastných kyselin včetně jejich polohových
izomerů, tak většinou používáme vysoce polární kyanosilikonovou fázi.
28
Omezení klasických metod
16:0
18:2
18:1
18:0
18:3
20
30
Tuk extrahovaný z margarinu
40
Time (min)
13t
6c
10t
6t 9t 11t 12t 7c
35.0
9c
10c 11c
50
Překryv píků 18:1
trans a cis isomerů
12c
13c
36.0
37.0
Time (min)
38.0
29
SPE Discovery Ag-Ion Supelco
• Stabilní stříbrná SPE fáze
• Při použití běžných organických rozpouštědel
nedochází k uniku stacionární fáze
• Stabilní barva
• Světlo nemá vliv na Ag-ION sorbent
• Dlouhá životnost
• Kapacita 750mg SPE tube – až 1 mg
celkových FAMEs
• Předseparace je vysoce reprodukovatelná
30
Mechanismus interakce
• Mastná kyselina – electron donor
• Stříbro - electron akceptor
O
• Cis-mastné kyseliny tvoří pevnější
komplex než trans
• Čím větší počet dvojných vazeb, tím
silnější interakce
OCH3
C4H8
SPE
Support
SO3 Ag+
C11H23
Charge-transfer complex
between Ag + and unsaturated
bond
31
Discovery Ag-Ion postup
32
Cis/Trans FAME - předseparace
33
Ag-ION SPE metoda pro cis/trans FAME separace
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kondicionace
4 ml aceton
Equilibrace
4 ml hexan
Vzorek1 ml (1mg/ml) FAMEs v hexanu, průtok 5mL/min
Eluce - frakce 1
6 ml hexan:aceton (96:4 v/v)
Eluce - frakce 2
4 ml hexan:aceton (90:10 v/v)
Eluce - frakce 3
4 ml aceton
Eluce - frakce 4
4 ml aceton:acetonitril (97:3)
Odpaření a rozpuštění v hexanu, GC
34
GC separace na SP2560 75m x 0.18 mm ID
Použití kratší GC kolony (SP2560, 75 m) a nosný plyn vodík – výrazné
zkrácení času analýzy.
Pec:
Inj.:
Det.:
Nosný plyn:
Nástřik:
Liner:
180oC, izotermální
220oC
FID, 220oC
vodík, 40 cm/sec při 180 oC
0.5 µL, 100:1 split
4 mm ID, split
35
Standardní směs FAMEs
Celkový obsah FAMEs je 1 mg/ml
Standard Mixture
14:0
6
18:1
18:0
16:0
8
18:2
10
12
14
18:3
16
18
20
Time (min)
SPE fraction1
6
18:1 t
8
10
Hexan: Aceton
96:4
12
14
16
18
20
Time (min)
18:1 c
SPE fraction 2
7.0
8.0
9.0
10.0
11.0
12.0
13.0
Time (min)
14.0
Hexan: Aceton
90:10
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
Aceton
SPE fraction 3
6
8
10
12
14
16
18
20
Time (min)
SPE fraction 4
Acetonitril
36
6
8
10
12
14
Time (min)
16
18
20
Výsledky analýzy FAMEs (% recovery)
Elution
1
2
6 ml
Hexan:aceton (96:4)
18:0
100
4 ml
Hexan:aceton (90:10)
3
4 ml Aceton
4
4 ml
Aceton:acetonitril (97:3)
TOTAL
18:1t
18:1c
98.1
0.4
1.90
99.60
18:2tt
18:2 c/t
18:2cc
18:3ttt
100
50
100
100
50
100
100
100
18:3
100
100
100
40
55
100
95
Izomer 18:3ccc lze eluovat 100% ACN
37
Analýza bramborových chipsů
• Rozemlít a extrahovat 4 x 4ml petroletheru
• Podpařit a rozpustit v toluenu
• Esterifikace 7% BF3/MeOH
• Po esterifikaci se re-extrahoje do hexanu a vysuší seNa2SO4
• Předseparace Ag-ION SPE 750mg/6 ml
38
Analýza bramborových chipsů
18:1
counts
Untreated extract
16:0
14:0
6
8
10
18:0
12
8
10
12
8
counts
counts
16
18
20
14
16
18
20
18:1 c
SPE Fraction 2
6
14
Time (min)
18:3
18:1 t
SPE Fraction 1
6
18:2
10
12
Time (min)
14
16
14
16
18
20
counts
SPE Fraction 3
6
8
10
12
Time (min)
18
20
39
Řepkový olej – analýza FAME
Řepkový olej je typickým reprezentantem rostlinných olejů. Obsahuje
nenasycené, mono a více nenasycené mastné kyseliny s dlouhým řetězcem.
Následující chromatogram ukazuje 6 minutovou analýzu nenasycených cis
FAME na koloně Omegawax 100 column.
40
Řepkový olej - FAME, Omegawax 100,
15 m x 0.10 mm I.D. x 0.10 µm
4
3
1
column:
oven:
inj:
det.:
carrier gas:
injection:
liner:
sample:
2.0
1. Myristic (C14:0)
2. Palmitic (C16:0)
3. Stearic (C18:0)
5. Linoleic (C18:2n6c)
6. Linolenic (C18:3n3)
7. Arachidic (C20:0)
8. cis-11-Eicosenoic (C20:1)
9. Behenic (C22:0)
10. Erucic (C22:1n9)
11. Lignoceric (C24:0)
6
2
1.0
5
10
7
9
11
8
3.0
Time (min)
4.0
5.0
Omegawax 100, 15 m x 0.10 mm I.D., 0.10 µm
140 °C, 40 °C/min. to 260 °C (2 min.)
250 °C
FID, 260 °C
H2, 55 cm/sec., constant
0.2 µL, 200:1 split
4 mm I.D., cup split
Rapeseed Oil FAME Mix
6.0
41
42
EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax
43
EN 14103 FAMEs v bionaftě, Omegawax
44
45
GC kolony s fází na bázi iontových kapalin
aniont
CF3
O=S=O
NO=S=O
anion
CF3
cation
N + N
linkage
cation
N + N
CF3
O=S=O
NO=S=O
CF3
1,9-bis(3-vinylimidazolium)nonan-bis(trifluormethansulfonamidát)
anorganické soli s teplotou tání nižší než pokojová teplota
málo těkavé, stabilní až do 380°C
určené pro analyty s širokým rozsahem polarit
46
Stacionární fáze, jejich polarita a tepelná stabilita
-Octyl
-1
-5
-20 -1701 -35
-50
280°C 350°C 360°C 300°C 280°C 300°C 310°C
NonPolar
0
Intermediate Polar
25
-225 PAG PEG
240°C 220°C 280°C
-2330 -2331 -2560
250°C 275°C 250°C
Polar
TCEP
145°C
Highly Polar
50
75
SLB-IL59
300°C
SLB-IL76 SLB-IL82
270°C
270°C
Extremely Polar
100
SLB-IL100 SLB-IL111
230°C
270°C
47
sigma-aldrich.com/il-gc
Stanovení polarity GC kolon s iontovými kapalinami
P (Polarity) = sum of the first 5 McReynolds Constants.
P.N. (Polarity Number) = Polarity (P) normalized to SLB-IL100 (set at 100).
•Prof. Luigi Mondello (University of Messina, Italy)
sigma-aldrich.com/il-gc
48
První publikace v 2010
49
SP-2560- 100 metrů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs
50
SLB-IL111- 100 meterů- C18:1 Cis/ Trans FAMEs
51
Omezení konvenční 1D-GC
• Nedostatečná separace/citlivost při stanovení analytů u komplexních vzorků…
• Složky aroma (např. aroma kávy: 600–700 sloučenin)
• Kontaminanty (PCB: 209 kongenerů, pesticidy)
• Chybná / nemožná identifikace analytů
• Nadhodnocení / podhodnocení výsledků
• Řešení
• „Nové“ detekční techniky
• Multidimensionální systém (heart-cut, kompletní dvourozměrná GC)
52
Kompletní dvourozměrná GC (GC×GC)
Dvě kolony s odlišnou selektivitou spojeny modulátorem
Injektor
Modulátor
Detektor
Primární kolona
Obvykle narrow bore (nepolární) kolona
(30 m × 0,25 mm × 0,25 µm)
Sekundární kolona
Obvykle microbore (polární) kolona
(1 m × 0,10 mm × 0,10 µm)
53
KOMPLETNÍ DVOUROZMĚRNÁ GC
• Modulátor přenáší v pravidelném intervalu část efluentu z 1. kolony
• Kryogenicky zaostřené části jsou přeneseny na 2. kolonu
• Rychlá separace na 2. koloně
Modulace
(kryogenní
zaostření)
Efluent z 1. kolony
Efluent z 2. kolony
54
TVORBA GC×
×GC CHROMATOGRAMU
1D chromatogram
(výstup z první kolony)
MODULACE
Základní 2D chromatogram
(výstup z druhé kolony)
TRANSFORMACE
2D chromatogramy
naskládané vedle sebe
VIZUALIZACE
Vrstevnicový půdorys 2D
chromatogramu
55
VÝHODY GC×
×GC vs. 1D-GC
• Zvýšení kapacity píků
• Zlepšení detekce
• Tvorba strukturovaných chromatogramů
56
VÝHODY GC×
×GC vs. 1D-GC
• Zvýšení kapacity píků (nc)
• Maximální počet chromatografických píků, které je možné uspořádat za sebou
do separačního prostoru (chromatogramu) → zvýšení separační účinnosti
1. Dimenze
2. Dimenze
Konvenční kapilární kolona
n = 1 000
nc(celk) =
nc(kolona 1) × nc(kolona 2)
GC×
×GC
(kolona druhé dimenze: n = 25)
n = 1 000 × 25 = 25 000
57
Zvýšení kapacity píků:
Separace cílového analytu od koextraktu
1D-GC
Dichlorvos
0,01 mg/kg v přečištěném extraktu jablek
Interference:
m/z 109 (kvantifikace)
m/z 79 (identifikace)
BEZ SHODY S KNIHOVNOU SPEKTER
58
Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173–186
Zvýšení kapacity píků:
Separace cílového analytu od koextraktu
Dichlorvos spolehlivě identifikován a kvantifikován
GC×GC
→ Výsledek zvýšené kapacity píků
5-hydroxymethyl2-furan-karbaldehyd
H it
1
2
3
4
5
N am e
P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 d ic h lo r o v in y l d im e th y l e s te r
P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l
d im e th y l e s te r
P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l
d im e th y l e s te r
P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l
d im e th y l e s te r
P h o s p h o ric a c id , 2 ,2 -d ic h lo ro v in y l
d im e th y l e s te r
R e v e rs e
CAS
940
6 2 -7 3 -7
729
6 2 -7 3 -7
707
6 2 -7 3 -7
704
6 2 -7 3 -7
700
6 2 -7 3 -7
Zdroj: J. Zrostlíková, J. Hajšlová, T. Čajka: J. Chromatogr. A 1019 (2003) 173–186
Separovaný
koextrakt
59
Strukturované chromatogramy
→ Separace podle polarity
Specifické interakce
• Doplňující se separační mechanismy na obou kolonách
• GCxGC chromatogramy vykazují uspořádanost (přítomnosti charakteristických
skupin)
Systém: nepolární × polární kolony
→Separace podle bodu varu
Tlak par (Těkavost)
60
Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME
polyethylenglycol
Systém: nepolární × polární kolony
5 % fenylmethylpolysiloxan
Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282–289
61
Těkavé látky extra panenského olivového oleje izolované pomocí HS-SPME
50 % fenylmethylpolysiloxan
Systém: polární × nepolární kolony
polyethylenglycol
Zdroj: T. Cajka, K. Riddellova, E. Klimankova, M. Cerna, F. Pudil, J. Hajslova, Food Chem. 121 (2010) 282–289
62
GC doplňky a nářadí
63
HPLC
64
Trendy v současné HPLC
• Rychlá chromatografie (UHPLC)
– Vysoké rozlišení
– Zvýšení separační účinnosti
– Snížení meze detekce
– Krátký čas separace
– Ekonomický provoz
– Ekologický provoz
65
Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors
ChromatographyOnline.com
66
Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors
ChromatographyOnline.com
67
Ascentis HPLC kolony
• Ascentis™ HPLC kolony jsou 4 generací SUPELCO HPLC kolon
• Zahrnují následující typy kolon:
• C18, C8, ES-CN, Si, Phenyl, RP-Amide,
• Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS detekcí.
• Discovery ® HPLC kolony jsou 3 generací SUPELCO HPLC kolon
• Zahrnují následující typy kolon:
• C18, HS C18, C8, Cyano, PEG, HS F5
• Discovery® BIO Wide Pore
• Discovery® Zr
• Rozměry od mikro (1.0 mm I.D.) do preparativní (21.2 mm I.D.), kompatibilní i s MS
detekcí.
68
Klasifikace podle možné chemické interakcea
Bonded Hydrophobic
Phase
H-Bonding
Dipolar
π-π
Stericb
Ionicb
C18
Very Strong
Weak
No
No
No
Moderate
C8
Strong
Weak
No
No
No
Weak
RPAmide
Strong
Strong
Acceptor
Moderate
No
Weak
Very weak
Phenyl
Strong
Weak
Acceptor
Weak
Strong
Donor
Strong
(Rigid)
Weak
F5 or
PFP
Moderate
Moderate
Acceptor
Strong
Strong
Acceptor
Strong
(Rigid)
Moderate
Cyano
Light to
Moderate
Weak
Acceptor
Strong
Weak
No
Moderate
a. Using Euerby2 variation of Snyder-Dolan-Carr Hydrophobic Subtraction Model3.
b. Steric and Ionic probe data are not very helpful in predicting or interpreting steroid
selectivity results; however, they are always underlying factors with silica bonded phases.
69
Discovery® BIO Wide Pore
• dokonale sférické, porézní částice
• velikost částic 3, 5, 10 µm
• velikost pórů 300Å
• specifický povrch 100 m2/g
• velikost porů je vhodná pro HPLC analýzy proteinů, polypeptidů a oligonucleotidů
• Vynikající pro analýzy hydrofobních molekul (MH > 500 Dalton)
• pro oblast proteomiky jsou v nabídce kolony
• křemenné kapiláry
• mikrobore kolony
70
Discovery® BIO Wide Pore
• Discovery® BIO C18
• fáze je vhodná pro analýzu peptidů
• RP fáze s největší hydrofobicitou
• Discovery® BIO C8
• středně hydrofobní fáze
• není používaná tak běžně jako C18 a C4
• Discovery® BIO C5
•
•
•
•
doporučovaná pro analýzu proteinů a peptidů
separační vlastnosti podobné jako u C4
ve srovnání s C4 má vyšší stabilitu
vynikající pro LC/MS analýzy - nekrvácí
71
Discovery® BIO PolyMA
• ionexy na bázi polymethakrylátových pryskyřic.Hydrofilní povrch
eliminuje adsorpci proteinů
– Discovery® BIO Poly-SCX je silný katex
s chemicky vázanou sulfopropylovou
skupinou
– Discovery® BIO Poly-WAX je slabý
anex s chemicky vázanou
diethylaminoethyl skupinou
Polymethakrylát, 5µm, 1000Å
Iontově výměnná kapacita (oba): 0,3meq/g
72
Discovery® Zr
• výhodou nosiče na bázi ZrO2 je chemická a tepelná stabilita
• kolony jsou stabilní v celém rozsahu pH 1-14 a při teplotách do 200°C
• retenční mechanismus je odlišný od silikagelových kolon (Lewisova teorie
kyselin a zásad)
• kolony jsou mechanicky stabilní a vysoce účinné
• dodávají se čtyři typy fází
73
Fáze Discovery® Zr
Zr-PBD
Zr-PS
Zr-Carbon
Zr-CarbonC18
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C C
C
74
Fyzikálně chemické vlastnosti oxidu zirkoničitého
• Atomy Zr ve strukturní mřížce mají charkter Lewisových kyselin.
#1 Zr atomy se chovají vlivem
přítomnosti prázdných elektonových
orbitalů jako Lewisovy kyseliny
(akceptor elektronového páru).
-O
#2
Lewisovy
báze
(např.
fosforečnany)
z
mobilní
fáze
interagují s povrchem stacionární
fáze.
O
P
O-
NH2+
..
R
O-
O
O
Zr
O
O
Zr
O
O
#3 Kladně nabité skupiny,
přítomné v molekulách
analytů jsou zachycovány
na povrchu sorbentu na
základě iontově
výměnných interakcí.
75
Přehled chirálních stacionárních fází pro HPLC
76
Hamilton
• www.sigmaaldrich.com/hamiltoncolumns
77
HPLC kolony vhodné pro separaci cukrů
• SUPELCOGEL Ca
• SUPELCOGEL C-610H
• SUPELCOGEL C-611
• SUPELCOGEL Ag2
• SUPELCOSIL LC-NH2
• apHera™ NH2
• column: apHera NH2, 15 cm × 4.6 mm I.D., 5 µm
• mobile phase: 20:80, water:acetonitrile
• flow rate: 1.0 mL/min
• temp.: 25 °C
• detector: ELSD, 45 °C, 3.5 psi nitrogen
• injection: 10 µL
• sample: 500 µg/mL in 30:70, water: acetonitrile
78
Tosoh Corp.
79
Co je HILIC?
• Chromatografie hydrofilních interakcí - HILIC (HydrophILic Interaction Chromatography or
Hydrophilic Interaction LIquid Chromatography) je jednou z verzí NPLC.
• Poprvé toto označení použil ve své publikaci roku 1990 Dr. Andrew Alpert (J. Chromatogr.
499 (1990) 177)
• Jedná se o kapalinovou chromatografii v módu, kde stacionární fáze je relativně polární a
mobilní fáze relativně nepolární.
• Mobilní fáze je složena z 60 - 95% organického rozpouštědla ve vodě nebo pufru.
• Používá se acetonitril, metanol nebo další s vodou mísitelná rozpouštědla
• Typické složení – 70-90% acetonitrilu v 10 mM octanu amonném
• Aqueous normal phase chromatography (ANP)je chromatografická technika, která přes změnu
složení mobilní fáze spojuje RPLC a NPLC.
• Povrch silikagelových nosiců je většinou tvořen primárními silanolovými skupinami (-Si-OH),
které mohou být dále modifikovány např. uhlovodíky s dlouhým řetězcem.
• Mobilní fáze v ANPC je složena z organických rozpouštědel metanol nebo acetonitril) s malým
obsahem vody. Mobilní fáze tedy obsahuje vodnou složku a zároveň i složku, která je méně
polární než stacionární fáze. Polární analyty jsou tedy silně zadržovány. S rostoucím
procentem vody v mobilní fázi jejich retence klesá.
• Skutečná ANP stacionární fáze musí být schopna pracovat v obou módech od 100% vodné až
po čistě organickou.
(.J. Pesek, M.T. Matsyka, J. Sep. Sci. 28 (18): 2437-2443).
80
Ascentis Si
NP – separace v tucích rozpustných vitamínů
1
4
3
1. alpha tocopherol (100 µg/mL) (E)
2. menadione (150 µg/mL) (K3)
3. gamma tocopherol (200 µg/mL) (E)
4. chlolecalciferol (100 µg/mL) (D)
0
2
2
4
6
Time (min)
column:
Ascentis Si, 15 cm x 4.6 mm I.D., 5 µ particles (581512-U)
mobile phase: A – Hexane, B – Ethylacetate
gradient:
time
%B
0
10
10
30
12
30
13
10
flow rate:
1.0 mL/min.
temp.:
30 °C
det.:
UV at 290 nm
8
10
12
81
Rychlé HPLC analýzy
82
Chromatografický trojúhelník
R S=
1
α −1
k'
N ⋅
⋅
4
α
1 + k'
Účinnost
Selektivita
Retence
Rychlost
tr= L (k’+1)
u
tr = retenční čas
• L = délka kolony
• k’ = retentenční factor
• u = rychlost průtoku mobilní fáze
Selektivita
Účinnost
83
Rozlišení
Účinnost
Retence
3.0
Selectivita
α
2.5
Faktor účinnosti
a)
b)
c)
Rychlost toku MF
Délka kolony
Průměr zrna, teplota, viskozita
Faktor kapacity
a)
b)
c)
Množství stacionární fáze v koloně
Změna stacionární fáze nebo MF
Teplota
Faktor selektivity
a)
b)
c)
Změna stacionární fáze
Změna MF
Rychlost toku MF
2.0
Rozlišení (R)
N . k´ . α-1
RS=
k´+1
α
4
N
1.5
1.0
k
0.5
0.0
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
0
5000
10000
15000
20000
0
5
10
15
20
Zhao, J.H. and P.W. Carr. Analytical
Chemistry, 1999. 71(14): p. 2623-2632
1.25
α
25000N
25 k
84
Zkrácení doby analýzy
tr = L (k’+1)
u
tr = retenční čas
• L = délka kolony
• k’ = retentenční factor
• u = rychlost průtoku mobilní fáze
Existují tři způsoby zkrácení retenčního času (tr) daného
analytu:
•Zkrácení délky kolony (L)
•Zmenšení hodnoty retenčního factoru (k’), a to:
–Změnou stacionární fáze
–Zvýšením teploty
• Zvýšení průtoku mobilní fáze
85
Možnosti zrychlení separací
•Zmenšit rozměry kolony
•Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze
•Zvýšit teplotu mobilní fáze
•Změnit profil gradientu
•Zmenšit velikost částic HPLC nosiče
86
Možnosti zrychlení separací
•Zmenšit rozměry kolony
•Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze
•Zvýšit teplotu mobilní fáze
•Změnit profil gradientu
•Zmenšit velikost částic HPLC nosiče
87
Vliv zkrácení kolony
1. Barbital
2. Phenobarbital
3. Butabarbital
4. Mephobarbital
5. Pentabarbital
6. Secobarbital
4
3
2 5
1
3
2
6
4
5
3
2
Discovery™ C18, 5µm particles
CH3OH:H2O (45:55)
1mL/min
20°C
UV, 214nm
3
2
1
Columns:
Mobile Phase:
Flow Rate:
Temp.:
Det.:
4
4
6
1
5
1
5
6
0
0
10
20
0
10
20
30
0
10
20
30
10
20
6
30
30
2cm x 4.6mm ID
5cm x 4.6mm ID
15cm x 4.6mm ID
25cm x 4.6mm ID
Time (min)
88
98-0348
Vliv zkrácení kolony
3
Columns:
Mobile Phase:
Flow Rate:
Temp.:
Det.:
4
5
2
Discovery C18, 5µm
CH3OH:H2O (45:55)
1mL/min
20°C
UV, 214nm
6
1
1. Barbital
2. Phenobarbital
3. Butabarbital
4. Mephobarbital
5. Pentabarbital
6. Secobarbital
3
2
4
1
5
6
2cm x 4.6mm ID
1.0
2.0
25cm x 4.6mm ID
0
10
20
Time (min)
30
89
Možnosti zrychlení separací
•Zmenšit rozměry kolony
•Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze
•Zvýšit teplotu mobilní fáze
•Změnit profil gradientu
•Zmenšit velikost částic HPLC nosiče
90
Vliv průtokové rychlosti
Columns: Discovery C18 column,
5.0cm x 4.6mm, 5µm particles
Mobile Phase: CH3OH:H2O (45:55)
Flow Rate: see figure
Temp.: 25°C
Det.: UV, 214nm
1. Barbital
2. Phenobarbital
3. Butabarbital
4. Mephobarbital
5. Pentabarbital
6. Secobarbital
1
2
1
1.0
2.0
3
2
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
4mL/min
4
1.0
2.0
3.0
4.0
1.0
2.0
3.0
4.0
1.0
2.0
3.0
4.0
Time (min)
5.0
6.0
5
7.0
5.0
6.0
7.0
5.0
6.0
7.0
3mL/min
2mL/min
1mL/min
91
Účinnost kolony při různých průtokových rychlostech
(porézní částice sorbentu)
Flow Rate
1.0mL/min
2.0mL/min
3.0mL/min
4.0mL/min
N (Barbital)
1766
1460
1250
997
N (Phenobarbital)
2556
1821
1461
1307
N (Butabarbital)
3169
2215
1766
1506
N (Mephobarbital)
3524
2383
1924
1569
N (Pentobarbital)
3829
2494
2029
1704
N (Secobarbital)
3947
2584
2113
1742
92
98-0357
Možnosti zrychlení separací
•Zmenšit rozměry kolony
•Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze
•Zvýšit teplotu mobilní fáze
•Změnit profil gradientu
•Zmenšit velikost částic HPLC nosiče
93
Vliv teploty
1
1. Clonazepam
2. Chlorazepate
3. Diazepam
Column: Discovery™ RP-Amide
5.0cm x 4.6mm, 5µm particles
Mobile Phase: ACN:H2O (30:70)
Flow Rate: 2.0mL/min
Temp.: see figure
Det.: UV, 254nm
1
1
2
2
3
3
2
1
3
1.0
2.0
2
3.0
4.0
5.0
6.0
4.0
5.0
6.0
20°C
3
1.0
98-0359
2.0
1.0
2.0
1.0
2.0
3.0
3.0
3.0
Time (min)
4.0
5.0
6.0
4.0
5.0
6.0
30°C
40°C
50°C
94
Možnosti zrychlení separací
•Zmenšit rozměry kolony
•Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze
•Zvýšit teplotu mobilní fáze
•Změnit profil gradientu
•Zmenšit velikost částic HPLC nosiče
95
Profil gradientu
Column:
4
Flow Rate:
Temp.:
Det.:
Elution:
3
1
4
Discovery RP-Amide
5.0cm x 4.6mm, 5µm particles
1mL/min
30°C
UV, 220nm
10:90 ACN, 0.1%TFA: H2O, 0.1%TFA
gradient to 90:10 ACN, 0.1%TFA:H2O,0.1%TFA
2
1
5
3
1. 1-hydroxy-7-azabenzotriazole
2. 4-methoxybenzene sulfonamide
3. Methyl-3-amino-2-thiophene-carboxylate
4. 4-aminobenzophenone
4
2
1
1
4
3
3
2
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
20%/min gradient
16%/min gradient
2
1.0
1.0
2.0
2.0
10%/min gradient
3.0
4.0
Time (min)
98-0361
5.0
6.0
7.0
6.67%/min gradient
96
Možnosti zrychlení separací
•Zmenšit rozměry kolony
•Zvýšit průtokovou rychlost mobilní fáze
•Zvýšit teplotu mobilní fáze
•Změnit profil gradientu
•Zmenšit velikost částic HPLC nosiče
97
Current Trends in HPLC Column Technology by Ron Majors
ChromatographyOnline.com
98
Účinnost versus velikost částic
Columns: All C18, All 150 x 4.6mm
Flow: 1.8mL/min
Detection: 254nm Temp: 30°C
Injection Vol: 5µ
µL
Analytes:
1. o-Xylene (0.04mg/mL
2. p-Xylene (0.01mg/mL
Nave = 36,000
60
60
60
60
Nave = 18,000
Nave = 12,000
40
40
sub-2µ
µm
40
40
Nave = 6,000
3-4µ
µm
5µ
µm
20
10µ
µm
0
2.0
3.0
20
20
20
0
0
0
2.0
3.0
2.0
3.0
2.0
99
3.0
16,000
16,000
35.00
14,000
30.00
12,000
Pressure (psi)
HETP (µm)
Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace
25.00
20.00
15.00
6,000
5.00
2,000
3
4
5
Mobile Phase Velocity (mm/sec)
1-2 mL/min
8,000
4,000
2
UHPLC
10,000
10.00
1
1.7 µm
3 µm
2
4
6
8
10
12
Mobile Phase Velocity (mm/sec)
*4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water
100
Povrchově porézní částice versus zcela porézní částice:
0.5 µ
2.7 µm
Difuzní vrstva
0.75 µ
1.7 µm
101
Fused-Core is a trademark of Advanced Materials Technology Inc.
Ascentis is a trademark of the Sigma-Aldrich Corp.
Ascentis Express Fused-Coretm specifikace
•
Sorbent:
vysoce čistý silikagel
– 1.7 µ neporézní jádro a 0.5 µ porézní vrstva jsou type B
•
•
•
•
•
•
•
Velikost částic:
Distribuce velikosti částic:
Velikost pórů:
Velikost povrchu:
pH rozsah:
Limitní tlak:
Nabídka stacionárních fází
•
LC-MS:
2.7 µ
2.7 +/- 0.16 µ (6% standardní odchylka*)
90 Å, 160 Å
150 m²/g (220-300 m²/g efektivní)
2 – 9 (minimálně)
600 barů (testováno na UHPLC)
C18, peptide ES C18, C8, F5 (RP nebo
HILIC), RP-Amide,Phenyl-Hexyl, HILIC (NP
nebo HILIC), ES-CN
vysoce kompatibilní
* Typický rozsah pro malé totálně porézní částice je 15-20% standardní odchylka.
102
Ascentis Express Fused-Coretm specifikace
Ascentis Express
Sterically
Protected
pH range
endcapping
C18
No
2-9
Yes
90
2.7
C8
No
2-9
Yes
90
2.7
RP-Amide
No
2-9
Yes
90
2.7
Phenyl-Hexyl
No
2-9
Yes
90
2.7
HILIC
No
90
2.7
Peptide ES-C18
Yes
1-8
No
160
2.7
F5
No
2-8
Yes
90
2.7
ES-Cyano
Yes
1-8
Yes
90
2.7
Live area
for full-page
graphic
2-8
No
Pore size
Angstroms
Particle size
microns
103
Předkolony
•
malý mrtvý objem
•
vhodné pro všechny přístroje
•
kompatibilní s vysokým tlakem
104
Distribuce částic
105
Výhody silikagelových častic s pevným jádrem
106
Výhody silikagelových částic s pevným jádrem
107
Zpětný tlak & účinnost a velikost častic
Effiiciency
30,000
1
N ∝
dp
25,000
20,000
15,000
10,000
5,000
Particle (µm)
0
bar
0
5
10
400
350
300
250
200
150
100
50
0
15
20
1
P∝ 2
dp
0
5
10
dp (µm)
15
20
psi
bar
N
1.8
5889
406
27,500
2.5
3089
213
20,000
3
2118
146
16,500
5
769
53
10,000
10
189
13
5,000
15
87
6
3,750
20
44
3
2,500
108
16,000
16,000
35.00
14,000
30.00
12,000
Pressure (psi)
HETP (µm)
Vysoké průtokové rychlosti, rychlé separace
25.00
20.00
15.00
1.7 µm
1-2 mL/min
10,000
8,000
2.7 µm FC
6,000
3 µm
4,000
10.00
5.00
2.7 µm Ascentis Express
1
2
3
4
5
Mobile Phase Velocity (mm/sec)
2,000
2
4
6
8
10
12
Mobile Phase Velocity (mm/sec)
*4.6 x 50 mm columns, 55/45 MeCN/Water
109
Ascentis Express UHPLC na klasických HPLC chromatografech
Zpětný tlak versus průtoková rychlost
Maximální
limit
450
400
Pressure drop (bar)
350
Limit tradičních HPLC
systemů
35°
60°
300
80°
250
200
N = >30,000
150
100
50
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4
Flow rate (mL/min)
Experimentá
Experimentální
lní zavislost celkové
celkového zpětn
zp tné
tného tlaku jako funkce průtokov
pr tokové
tokové rychlosti pro C18, 15 cm x 4.6 mm,
®
2.7 m Ascentis Express kolony přii různých
zných teplotá
teplotách.
ch. MF: 30:70 voda:acetonitril
110
Autor Prof. Luigi Mondello University of Messina
Převod metod
111
Rychlejší, účinnější a levnější analýza
*původní metoda je na koloně 4.6 x 250 mm, 5µ
4.6 x 50 mm, 2.7 µ
1 mL/min
2 µL inj
N(5) = 10600
Rs = 1.8
6,9 MPa
3 x 50 mm, 2.7 µ
0.43 mL/min
0.9 µL inj
N(5) = 10000
Rs = 1.8
6,6 MPa
2
Time (min)
Column:
Mobile Phase:
Temp:
Det:
19x úspora rozpouštědel
2.1 x 50 mm, 2.7 µ
0.21 mL/min
0.4 µL inj
N(5) = 8360
Rs = 1.6
6,5 MPa
0
8x úspora rozpouštědel
4
Ascentis Express C18
64:36, water : acetonitrile
35 °C
250 nm
Sample
1. Oxazepam
2. Alprazolam
3. Clonazepam
4. N-desmethyldiazepam
5. Diazepam
38x úspora rozpouštědel
112
Vliv zkrácení a zmenšení průměru kolony na úsporu
rozpouštědel
ID
L
(mm) (mm)
Rs
Doba
Průtok analýzy
mL/
(mL/min) (min) nástřik
Kolona
µ
Úspora
Ascentis C18
5
4.6
250
3.3
1
33
33
1x
Ascentis Express C18
2.7
4.6
75
3.0
1
6.2
6.2
5x
Ascentis Express C18
2.7
3
75
2.5
0.43
6.2
2.7
12x
Ascentis Express C18
2.7
2.1
75
2.5
0.21
6.2
1.3
25x
Ascentis Express C18
2.7
4.6
50
1.8
1
4.1
4.1
8x
Ascentis Express C18
2.7
3
50
1.8
0.43
4.1
1.8
19x
Ascentis Express C18
2.7
2.1
50
1.6
0.21
4.1
0.9
38x
113
Ascentis Express Fused Core™
• HPLC kolony s vysokou účinnosti a možnosti rychlé chromatografie jak na
běžných systémech tak na systémech UHPLC.
• Krátká difúzní dráha analytu v povrchově porézních částicích - užší a vyšší
píky než lze dosáhnout na porézních částicích – větší citlivost, vyšší účinnost.
• Tvar Deemterovy křivky ukazuje na možnosti měření při vyšších průtokových
rychlostech s vysokou účinností.
• Zpětný tlak na kolonách s povrchově porézním sorbentem je nižší něž na
kolonách s porézními časticemi sub-2µ – odpovídá přibližně 3 µ sorbentům.
114
USP aplikace
column: as listed
mobile phase: * Phosphate buffer
flow rate: 1.5 mL/min
temp.: 30 °C
det.: UV at 215 nm
injection: 5 µL
sample: 50 µg/mL in mobile
H3C
NH
OH
CH3
H3C
O
phase
CH3
OH
•*Phosphate buffer
H3C
Ibuprofen
Pseudoephedrine
• Combine 500 mL of potassium phosphate
monobasic 500 mg/L in water and 500 mL of
acetonitrile
• Adjust to pH 3.3 with phosphoric acid
115
Ibuprofen /Pseudoefedrin
Ascentis Express ES-Cyano
10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm
Ascentis ES-Cyano
10 cm x 4.6 mm, 3 µm
1.0
2.0
Time (min)
3.0
phase
length
Ascentis Express ES-Cyano
10
Discovery Cyano
25
Ascentis Express C18
10
Ascentis ES-Cyano
10
2.0
Time (min)
void rt (pseu) rt (ibu) resolution
0.64
0.56
1.87
28.3
2.15
2.27
3.05
6.1
0.55
0.54
3.57
41.4
0.65
0.85
3.11
25.4
2.0
Time (min)
3.0
plates
plates/m
(ibu)
k (ibu)
(ibu)
22479
1.9 224790
13066
0.4
52264
21281
5.5 212810
10460
3.8 104600
Ascentis Express C18
10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm
Discovery Cyano
25 cm x 4.6 mm, 5 µm
1.0
1.0
3.0
1.0
2.0
Time (min)
3.0
116
USP aplikace
column: as listed
mobile phase: 30:40:30, 20 mM sodium acetate (pH 4):methanol:acetonitrile
flow rate: 1.5 mL/min
temp.: 30 °C
det.: UV at 210 nm
injection: 5 µL
sample: 50 µg/mL in mobile phase
O
OH
O
H3C
H
N
NH
CH3
OH
Ritalin
Methylphenidate
Phenylephrine
117
Ritalin /Fenylefrin
phase
length
Ascentis Express ES-Cyano
10
Discovery Cyano
25
Ascentis Express C18
10
Ascentis ES-Cyano
10
plates
plates/m
void rt (phen) rt (ritalin) resolution (ritalin) k (ritalin) (ritalin)
0.64
0.77
0.92
5.62
15981
0.4 159810
2.15
2.49
2.64
2.05
19007
0.2
76028
0.55
0.55
0.63
3.08
9038
0.1
90380
0.65
1.13
1.46
6.08
9096
1.3
90960
Ascentis ES-Cyano
10 cm x 4.6 mm, 3 µm
Ascentis Express ES-Cyano
10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm
1.0
2.0
Time (min)
3.0
1.0
2.0
Time (min)
3.0
Discovery Cyano
25 cm x 4.6 mm, 5 µm
Ascentis Express C18
10 cm x 4.6 mm, 2.7 µm
1.0
2.0
Time (min)
3.0
1.0
2.0
Time (min)
3.0
118
Problém s nečistotami v mobilní fázi
119
Nečistoty, které na HPLC nejsou detegovatelné mohou být problém na UHPLC
LC-MS Ultra CHROMASOLV
• Rozpouštěla a aditiva do MF
Brand
Product
Name
Description
Pack size
Fluka
14261
Acetonitrile
LC-MS Ultra CHROMASOLV, ≥99.9%, tested for UHPLC-MS
1L, 2L
Fluka
14262
Methanol
LC-MS Ultra CHROMASOLV, ≥99.9%, tested for UHPLC-MS
1L, 2L
Fluka
14263
Water
LC-MS Ultra CHROMASOLV, tested for UHPLC-MS
1L, 2L
Fluka
14264
Trifluoroacetic acid
LC-MS Ultra eluent additive, ≥ 99.0% suitable for UHPLC-MS
1ML, 2ML
Fluka
14265
Formic acid
LC-MS Ultra eluent additive, ≥ 98% suitable for UHPLC-MS
1ML, 2ML
Fluka
14266
Ammonium formate
LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS
25G
Fluka
14267
Ammonium acetate
LC-MS Ultra eluent additive, suitable for UHPLC-MS
25G
120
LC-MS Ultra CHROMASOLV
• Rozpouštědla se testují na UHPLC
• Gradient UHPLC-UV, shodné vlastnosti mezi výrobními šaržemi
• Nízké pozadí a minimum nečistot jako jsou ftaláty a PEG.
• Testováno na UHPLC-MS TOF
• Testování v obou polaritách
• Obaly
• Bílé borosilikátové sklo
– Minimální výluh alkalických iontů
121
Identifikace nečistot v ESI+
Intens.
x104
1.2
LCMS Ultra UVMSpos_RD1_07_3218.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd
1.0
New LC-MS
ultra grade
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Intens.
x104
Gradient Grade BASF pos_RD1_03_3255.d: BPC 49.0000-1701.0000 +All MS, -Constant Bkgrnd
1.2
1.0
0.8
High quality
gradient grade
0.6
0.4
0.2
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Time [min]
Nežádoucí nečistoty v rozpouštědlech (plastifikátory, PEGy).
122
LC-MS Ultra CHROMASOLV
ESI+
ESI-
MS test v ESI+ a ESI-; 5ppb reserpinu a 20 ppb digoxinu; velmi nízký šum.
123
Borosilikátové skleněné láhve
Intens.
LCMS Ultra UVMSneg_RD1_01_3235.d: -MS, 3.0-9.1min #(270-809), -Constant Bkgrnd
800
600
LC MS Ultra
(v borosilikátové láhvi)
400
200
325.1941
698.9277
197.9713
451.3073
648.9335
532.9422
792.9043
847.8578
0
800
909.8569
1014.8415
Chrom Gradient Grade UVMSneg_RD1_04_3232.d: -MS, 3.0-9.0min #(270-807), -Constant Bkgrnd
248.9723
Klastry mravenčanu sodného
600
219.9947
Gradient grade quality
(v hnědé skleněné láhvi)
400
698.9393
200
384.9540
355.9741
520.9360
325.2004
648.9327
858.8914 906.8939
0
200
400
600
800
983.8583 1035.8551
1000
1200
m/z
124
• C18
• C8
• HILIC (Si)
• RP-Amide
• Phenyl-Hexyl
• Peptide ES C18
• F5
• ES-CN
Děkuji za pozornost
125
Download

Odběry vzorků a jejich příprava k analýze (PDF 11.5 - Sigma