hivebench
vumbio
P ROTOC OL
Práce s tkáňovými kulturami
http://www.hivebench.com/protocols/800
Created by vumbio (us er #263) the Thu 17 April 2014
POUŽ ÍVANÁ MÉDIA:
HT29: DMEM, 15% FBS, 1%P/S, 1% Na- pyruvát
Caco-2: EMEM, 20% FBS, 1% P/S, 1% L-glutamin
PASÁŽ OVÁNÍ: ADHERENTNÍ BUŇĚČNÉ LINIE
Veš kerou práci provádíme s terilním způs obem v laminárním boxu.
1. Z mis ek ods ajeme médium.
2. Opláchnout PBS bez iontů, na velkou mis ku cca 1ml, na malou mis ku cca 0,5ml a znovu ods át.
3. Na mis ky napipetovat tryps in (zás obní roztok je 10x - doředit roztokem 0,5M EDTA) a inkubovat ve 37 s tupních cca 3
minuty (dokud s e buňky neodlepí: kontrola pod mikros kopem).
4. Odlepené buňky rozs us pendovat v médiu. Objem zvolit podle počtu mis ek, které chceme vytvořit. Sus penzi
rozpipetovat do nových mis ek a případně doplnit médiem do objemu dané mis ky.
5. Poznámka: Některé buňky js ou citlivé na přítomnos t tryps inu. Tyto buňky odlepit trips inem, rozs upendovat v médiu
a s točit na 1000 rpm na 5 minut. Ods át médium s tryps inem a rozs us pendovat v čers tvém médiu a teprve
pipetovat na nové mis ky
ROZ MRAŽ OVÁNI BUNĚK:
Z amražené zkumavky opláchujeme pod s tudenou vodou, dokud nepovolí.
Sterilně je přepipetujeme (případně vyklepneme) do zkumavek a rozředíme přís luš ným s tudeným médiem. Pracujeme cop
nejrychleji.
Buňky s točíme na 1000 rpm po dobu 5 minut.
Ods ajeme médium s DMSO, buňky rozs us pendujeme v čis tém médiu a vys ejeme na mis ky.
Z AMRAŽ OVÁNÍ BUNĚK
Připravíme s i zamražovací roztok: 10% DMSO, 90% FBS. Roztok přefiltrujeme přes s terilní filtr.
Z mis ek ods ajeme médium, opláchneme PBS a odlepíme tryps inem. Buňky rozs us pendujeme v médiu a s točíme 5 minut
na 1000 rpm. Médium znovu ods ajeme.
Buňky rozs us pendujeme v zamražovacím roztoku a rozpipetujeme do zamražovacích zkumavek. Z kumavyk obalíme gázou a
uložíme do -80 °C. Pracujeme co nejrychleji.
Po dvou dnech zkumavky vybalíme a umís tíme do karbiček, případně do dus íku.
vumbio
Práce s tkáňovými kulturami
2014-10-10
1 of 1
Download

Export as PDF