EDITOVANJE RNK DEZAMINACIJOM ADENOZINA U INOZIN
1.
UKRATKO
O RAZLIČITIM TIPOVIMA EDITOVANJA
RNK
Editovanje RNK je ko-transkripcioni proces kojim se genomski kodirana infromaciju menja na nivou
RNK. Značajno doprinosi plastičnošću genoma kroz stvaranje većeg broja izoformi RNK i proteina od
jednog gena.
Editovanje prekursora iRNK, rRNK, tRNK i malih regulatornih RNK opisano je kod velikog
broja organizama, počev od bakterija do čoveka. Prvi primer editovanja RNK opisan je 1996. godine,
kada je otkriveno da kod iRNK preipisane sa mitohondrijskog gena coxII tripanozome dolazi do
post-transkripcione insercije uridina (U) voĎene vodičem RNK (eng. guide RNA, gRNA). Nakon toga,
otkriveni su drugi tipovi editovanja RNK, i postalo je jasno da je reč o fenomenu koji je široko
rasprostranjen u sva tri domena živih origanizama.
U transkriptima mitohondrijskih i hloroplastnih gena kod biljaka, široko je zastupljena konverzija
citidina (C) u U (editovanje C-u-U), a manje je česta konverzija U u C (editovanje U-u-C). Editovanje
C-u-U dešava se i u rRNK male subjedinice mitohondrijskih ribozoma Dictyostelium discoideum. Kod
ameboidne praživotinje Physarum polycephalum opisani su različiti tipovi editovanja mitohondrijskih
iRNK i rRNK: insercija većeg broja C, insercija dinukleotida CU, GU, UA, AA, UU i GC, kao i
delecija AAA. Insercija većeg broja guanozina (G) opisana je u iRNK prepisanoj sa negativnog lanca
RNK virusa.
Transportne RNK podležu različitim tipovima editovanja. Kod ameboidne praživotinje
Acanthamoeba castellanii opisano je editovanje 5'-kraja mitohondrijskih tRNK. Editovanje adenozina (A)
u inozin (I) (editovanje A-u-I) u tRNK, katalizovano familijom adenozin dezaminazama koje deluju
na tRNK (eng. adenosine deaminases acting on tRNA, ADATs), opisano je kod eukariota, ali i kod
bakterije Escherichia coli. ADAT1 edituje A37 (u blizini antikodona) u tRNKAla, dok heterodimeri
ADAT2-ADAT3 edituju A34 na kolebljivoj (eng. wobble) poziciji antikodona u odreĎenoj grupi molekula
tRNK.
Kod sisara su opisane dve vrste editovanja RNK dezaminacijom nukleotida. Prvi opisani tip bila
je dezaminacija C u U, katalizovana APOBEC1 citidin dezaminazom, na primeru iRNK prepisane sa
gena za apolipoprotein E (APOE). Editovanje C-u-U u APOE iRNK je tkivno specifično i dovodi do
promene kodona za glutamin u stop kodon, omogućavajući sintezu izoformi apolipoproteina B sa
različitim funkcijama u metabolizmu lipida. U ćelijama creva, nakon editovanja, sintetiše se kraća
izoforma (APOB48), koja učestvuje u transportu lipida unetih hranom do različitih tkiva. U ćelijama jetre
ne dolazi do editovanja i sintetiše se izoforma pune dužine (APOB100), koja učestvuje u transportu
endogeno sintetisanih triglicerida i holesterola.
Drugi tip editovanja RNK u ćelijama sisara je editovanje A-u-I u dvolančanim strukturama
RNK, katalizovano familijom adenozin dezaminaza koje deluju na RNK (eng. adenosine deaminases
acting on RNA, ADARs) (slike 1 i 2). Iako se originalno verovalo da je editovanje A-u-I redak dogaĎaj,
1
analize na nivou celog transkriptoma pokazale su da je ovaj proces široko rasprostranjen i veoma korišćen
kod sisara. Prisustvo I umesto A u kodirajućim ili nekodirajućim regionima pre-iRNK/iRNK utiče na
njihovu strukturu, stabilnost, lokalizaciju, translaciju i splajsovanje, čime značajno doprinosi
diverzifikaciji transkriptoma i proteoma. Editovanju A-u-I podležu i prekursori malih regulatornih RNK,
čime se može promeniti njihova obrada ili interakcija zrelih malih regulatornih RNK sa ciljnim
molekulima (na primer, interakcija miRNK sa ciljnom iRNK).
1.
1.1.
EDITOVANJA
ADENOZINA U INOZIN
Adenozin dezaminaze koje deluju na RNK (proteini ADAR)
Editovanje A-u-I podrazumeva hidrolitičku dezaminaciju A u I u dvolančanim strukturama RNK,
katalizovanu enzimima familije ADAR (slika 1). Inozin se u pogledu saprivanja baza ponaša kao G (slika
1). Enzimi ADAR su originalno identifikovani u jajnim ćelijama i embrionima Xenopus laevis, kada su
opisani kao proteini koji odmotavaju dvolančane RNK. Prvi otkriveni gen sisara je bio ADAR (ranije
označavan kao ADAR1) u genomu čoveka, u kome su zatim identifikovana jod dva gena, ADARB1 i
ADARB2 (ranije označavana kao ADAR2 i ADAR3, redom). Ortolozi ADAR gena su evoluciono očuvani
kod kičmenjaka, a samo nekoliko je identifikovano kod beskičmenjaka. Drosophila melanogaster ima
jedan gen označen kao dAdar, koji je sličan sa ADARB1, dok Cenorabditis elegans ima dva gena,
c.e.adar-1 i c.e.adar-2. U genomima biljaka i gljiva nisu identifikovani ADAR geni. Smatra se da su
ADAR geni tokom evolucije nastali od ADAT gena.
Slika 1. Dezaminacija adenozina u inozin. a) Adenozin se hidrolitičkom dezaminacijom prevodi u inozin. b)
Adenozin se bazno sparuje sa uridinom; c) Inozin se bazno sparuje sa citidinom.
Enzimi familije ADAR odlikuju se zajedničkim funkcionalnim domenima (slika 2). Poseduju dva
do tri vezivna domena za dvolančanu RNK (eng. dsRNA-binding domain, dsRBD), dužine oko 65
aminokiselina, pomoću kojih ostvaruju direktne kontakte i vezuju se za dvolančanu RNK. Na C-kraju
sadrže katalitički dezaminazni domen. Pretpostavlja se da se ciljni A iz unutrašnjosti dvolančane RNK
2
okreće (eng. base flipping) i smešta aktivni centar enzima. Protein ADAR na N-kraju sadrži dva
Z-DNK-vezivna domena, označena kao Zα and Zβ, od kojih samo Zα ima vezivni kapacitet. Njihove
funkcije nisu sasvim jasne. S obzirom da se struktura Z-DNK stabilizuje prolaznom negativnom
superspiralizacijom uzvodno od aktivne RNK polimeraze, smatra se da bi Zα domen mogao da vezuje
ADAR na mesto gde se odigrava transkripcija, što bi proteinu ADAR omogućilo da obavi editovanje pre
splajsovanja. Zα domen se vezuje i za dvolančane RNK koje imaju Z strukturu i podležu editovanju
A-u-I. Takve su virusne RNK tokom tranksripcije, što bi proteinu ADAR moglo omogućiti da ih efikasno
modifikuje. TakoĎe, smatra se da Zα domen specifično povećava afinitet ADAR za kratke dvolančane
RNK, kao što su male interferirajuće RNK (siRNK). ADARB2 na N-kraju poseduje domen bogat
argininom (R), koji vezuje jednolančanu RNK, ali njegova funkcija u ovom proteinu još nije poznata.
Manje zastupljena izoforma ADARB1, takoĎe, sadrži R domen.
Slika 2. Familija proteina ADAR. a) Članovi familije proteina ADAR kod čoveka (ADAR, ADARB1 i ADARB2,
sa označenom dužinom proteina i pozicijom njihovih gena na hromozomima), Drosophile melanogaster (dADAR) i
Cenorabditis elegans (c.e.ADA1 i c.e.ADA2). Svi proteini ADAR poseduju RNK-vezivne domene za dvolančanu
RNK (dsRBD) i katalitički dezaminazni domen. Protein ADAR čoveka poseduje Z-DNK vezivne domene (Zα i Zβ),
dok ADARB2 sardži vezivni domen za jednolančanu RNK bogat argininom (R). b) Alternativna obrada i izoforme
ADAR: ADARp150 se eksprimira sa interferon/dvolančana RNK inducibilnog promotora, a egzon E1A, koji sadrži
start kodon, splajsuje se sa egzonom E2. ADARp110 se eksprimira sa jednog od dva konstitutivna promotora, a
egzon E1B ili E1C slajsuju se sa egzonom E2 koji sadrži start kodon. c) Proteini ADAR pomoću dsRBD prepoznaju
svoje supstrate, dvolančane regione RNK, u okviru kojih katalitičkim domenom vrše dezaminaciju jednog ili većeg
broja A.
Geni ADAR i ADARB1 se eksprimiraju u mnogim tkivima, najviše u nervnom, dok se ADARB2
eksprimira samo u mozgu. Kao rezultat alternativnog korišćenja promotora i egzona gen ADAR kodira
dve proteinske izoforme: izoformu pune dužine (ADARp150 ili ADARL) i kraću izoformu okrnjenu na
N-kraju (ADARp110 ili ADARS) (slika 2). ADARp150 se transkribuje sa promotora inudukovanog
interferonom ili dvolančanom RNK, i pojačano se eksprimira nakon ćelijskog stresa ili virusne infekcije.
3
Druge dve ADAR iRNK prepisuju se sa dva konstitutivna promotora i alternativno se splajsuju
preskakanjem egzona sa start kodonom. Njihova translacija se inicira sa nizvodnog kodona za Met, usled
čega se sintetiše kraća izoforma ADARp110.
ADARp150 kruži izmeĎu nukleusa i citoplazme i uglavnom lokalizuje u citoplazmi, što je
verovatno uslovljeno lokalizacijom njegovih ciljnih molekula (na primer, virusnih RNK ili prekursora
siRNK). ADARp110 i ADARB1 lokalizuju u nukleusu. Akumuliraju u neukleolusu, verovatno, kroz
interakciju dsRBD sa dvolančanim regionima rRNK ili snoRNK. Imajući u vidu da nukleolus obavlja
funkciju mesta za čuvanje nekih proteina u cilju inhibicije njihove aktivnosti, pretpostavlja se da bi
ADARp110 i ADARB1 mogli da se čuvaju u nukleolusu, odakle bi se "pomerali" u nukleoplazmu kada
se pojave dvolančani RNK supstrati.
ADAR i ADARB1 su funkcionalno aktivni kao homodimeri, koji se formiraju nezavisno od
prisustva dvolančane RNK. Prilikom prepoznavanja supstrata, dsRBD u homodimerima funkcionišu
kooperativno. ADARB2 ne formira homodimere. Skoro sve reakcije editovanja A-u-I pripisuju se
aktivnostima enzima ADAR i ADARB1. Iako su funkcionalne osobine dezaminaznog domena očuvane
kod ADARB2, smatra se da je odsustvo njegove katalitičke aktivnosti upravo vezano za nemogućnost
homodimerizacije. Funkcija ADARB2 je još nepoznata. Smatra se da bi mogao delovati kao repesor
aktivnosti ADAR i ADARB1 vezujući se za njihove potencijalne supstrate bez mogućnosti da ih edituje,
ili da bi mogao formirati nefunkcionalne heterodimere sa ADAR i ADARB1.
Fenotipske promene opisane kod različitih model organizama sa mutacijama u genima za
ADARs, ukazuju da njihova inaktivacija ima značajne fiziološke posledice. D. melanogaster sa
homozigotnom delecijom dAdar ispoljava promene vezane za centralni nervni sistem, kao što su gubitak
koordinacije kretanja i neurodegeneracija zavisna od starosti. Sojevi C. elegans sa homozigotnom
delecijom oba gena za ADARs, c.e.adar-1 i c.e.adar-2, imaju poremećaj hemotaksije. Knockout miš za
Adar2 umire nekoliko nedelja nakon roĎenja. Karakterišu ga epileptički napadi, vezani za povećan influks
jona Ca2+ uzrokovanog needitovanim mestom Q/R u iRNK za GluR-B, usled čega dolazi do umiranja
neurona. Inaktivacija Adar1 kod miša je letalna tokom embrionalnog razvića, usled poremećene
eritropoeze i sveprisutne apoptoze.
1.2.
Specifičnost enzima ADAR za supstrat
Supstrati proteina ADAR su dvolančane strukture RNK sa kojima stupaju u interkaciju pomoću dsRBD.
U strukturni dvolančane RNK funkcionalne grupe koje nose informaciju o specifičnosti sekvence
smeštene se duboko u unutrašnjosti molekula, tako da proteini ADAR ne prepoznaju specifičnu sekvencu
dsRNK, već specifičnu strukturu dvolančane RNK.
Supstrati za proteine ADAR su intramolekulske i, reĎe, intermolekulske dvolanačne RNK duže
od 20 bp, što odgovra dvolančanoj zavojnici RNK sa dva okreta (slika 2). Efikasnost i determinante
specifičnosti proteina ADAR razlikuju se u zavisnosti od dužine i sekundarne strukture RNK. Visoka
efikasnost (i neselektivno) editovanje velikog broja A dešava se u perfektno ili skoro perfektno
komplementarnim dvolančanim RNK dužim od 100 bp, a njihova sekundarna struktura i stabilnost
diktiraju selekciju mesta editovanja (slike 3b i 7). Sam proces editovanja dovodi do destabilizacije
(odmotavanja) RNK supstrata, usled nemogućnosti sparivanja I sa U, i verovatno se odvija do trenutka
kada enzim više ne prepoznaje supstrat kao dvolančanu RNK. Suprotno, u kraćim dvolančanim
4
strukturama RNK dužine 30 do 70 bp ili u dužim, parcijalno komplementarnim dvolančanim RNK sa
pogrešno sparenim bazama, jednolančanim izbočinama i petljama specifično se edituje samo jedan ili
nekoliko A. Dezaminacija jednog ili nekoliko A u takvim supstratima menja njegovu strukturu i smanjuje
stabilnost ispod praga koji prepoznaju proteini ADAR. Editovanje specifičnog A u dvolančanim
strukturama RNK odreĎeno je strukturom, ali i sekvnecom RNK koja okružuje mesto editovanja i koje
prepoznaju dsRBD. TakoĎe, sam dezaminazni domen pokazuje preferenciju za editovanje u odreĎenom
kontekstu sekvence.
Neka mesta editovanja u dvolančanim strukturama RNK mogu biti supstrat za ADAR ili
ADARB1, dok su neka preferencijalni supstrat za ADAR ili ADARB1. Ovo ukazuje da se specifičnost za
supstrat može razlikovati izmeĎu funkcionalnih formi ADAR, verovatno usled različitog broja i
meĎusobne udaljenosti dsRBD, koji omogućavaju razlikovanje RNK različite strukture i stabilnosti.
Efekati dezaminacije A-u-I na nivou molekula RNK su: 1) promena informacionog potencijala
RNK, vezana za činjenicu da se I preferencijalno sparuje sa C, tako da ga mašinerije za translaciju i
splajsovanje interpretitraju kao G; 2) promena trodimenzionalne strukture i stabilnosti RNK stvaranjem ili
uklanjanjem jednolančanih izbočina, što se odražava na njenu interakciju sa raznim RNK-vezivnim
proteinima uključenim u svim koracima metabolizma iRNK. Editovanje A iz baznog para A-U dovodi do
formiranja pogrešnog baznog para I-U i destabilizacije strukture dvolančane RNK, dok reĎe editovanje A
iz pogrešnog baznog para A-C formira bazni par I-C i stabilniju dvolančanu RNK.
2.
TIPOVI
I EFIKASNOST EDITOVANJA
A-U-I
Dezaminacija jednog ili nekoliko tačno odreĎenih A označena je kao editovanje specifično za
mesto. Suspstrati za ovaj tip editovanja su pre-iRNK koje formiraju kratke dvolančane regione (30-70 bp)
nastale sparivanjem dela egzona i introna (eng. editing-site-complementary sequence, ECS), u okviru
kojih editovanju podležu uglavnom kodirajući delovi (slika 3a). Ovaj proces doprinosi diverzifikaciji
proteoma.
Inicjalno se smatralo da su supstrati za ADAR samo kodirajući regioni iRNK. Danas je poznato
da se svega oko pedesetak pre-iRNK edituje u kodirajućim regionima, dok se ogroman broj mesta
editovanja (oko 1,6 miliona!) nalazi u nekodirajućim regionima pre-iRNK. Naime, 2004. godine je
otkrivano da su najčešća mesta editovanja A-u-I duge (>100 bp), visoko-komplementarne dsRNK nastale
sparivanjem invertovanih ponovaka Alu ili LINE, smeštenih u intronima i netranslatirajućim regionima
pre-iRNK. U ovim dvolančanim strukturama RNK visoko-efikasno i neslektivno edituje se i do 50% A,
čime se značjano menja lokalna struktura i stabilnost iRNK. Ovaj tip editovanja poznat je pod nazivom
globalno hipereditovanje ili promiskuitetno editovanje. Proces značajno doprinosi diverzifikaciji
transkriptoma.
Od 2006. godine poznato je da postoje interakcije procesa editovanja A-u-I i RNK interferencije
(RNKi) zasnovane na editovanju prekursora malih regulatornih RNK i na nekim funkcijama proteina
ADAR nezavisnim od dezaminazne aktivnosti. Editovanju podležu specifični A u prekursorima
mikroRNK (miRNK), dok hipereditovanju podleže veliki broj A u prekursorima malih interferirajućih
RNK (siRNK). Proces je važan mehanizam regulacije malih nekodirajućih RNK.
5
Efikasnost editovanja transkripta odreĎene vrste kreće se u rasponu od 0 do 100% i zavisi od
vrste supstrata, faze razvića i sredinskih faktora. Ova osobina editovanja A-u-I dozvoljava istovremenu
ekspresiju editovanih i needitovanih produkata jednog gena u različitim odnosima. Kroz regulisanje
stepena editovanja odreĎene vrste transkripata, postiže se graduisano regulisanje funkcije njihovih
proteina, što značajno povećava plastičnost u funkcionisanju ćelije.
Slika 2. Tipovi editovanja A-u-I katalizovanih proteinima ADAR. a) Editovanje specifčno za mesto. b)
Hipereditovanje (promiskuitetno editovanje). c) Editovanje prekursora malih regulatornih RNK.
2.1.
Mesto-specifično editovanje i diverzifikacija proteoma
Mesto-specifično editovanje A-u-I u kodirajućim regionima menja informacioni potencijal pre-iRNK, jer
se I sparuje sa C, a ribozom i splajsozom ga interpretiraju kao G (slika 1). Posledice su promena značenja
kodona (rekodiranje) (slika 3a) ili mesta splajsovanja (slika 3b). Usled suspstitucije aminokiseline ili
novog dogaĎaja alternativnog splajsovanja stvaraju se proteinske izoforme, koje uglavnom obavljaju iste
funkcije, ali se meĎusobno razlikuju u stepenu funkcionalnosti.
6
2.1.1. Rekodiranje
Rekodiranju podleže oko pedesetak pre-iRNK kod sisara. One ukupno sadrže oko 300
visoko-konzervisanih A koji su supstrati za reletivno visok stepen precizno regulisanog editovanja sa
posledicama na funkcionalnost proteina. Većina takvih iRNK eksprimira se u centralnom nervnom
sistemu (CNS), a njihovi proteini, uglavnom, učestvuju u hemijskoj i električnoj neurotransmisiji ili
drugim sinaptičkim funkcijama.
Slika 3. Efekti editovanja A-u-I u trsanskriptima koji kodiraju proteine.: a) Promene kodona koje mogu nastati
usled editovanja A-u-I, zasnovane na interpretaciji I kao G od strane translacione mašinerije. Aminokiseline su
grupisane prema naelektrisanju i hidrofobnosti. b) Nastanak alternativno splajsovanih izoformi pomoću editovanja
RNK. Visokokonzervisana sekvenca GU u 5'-mestu splajsovanja može biti kreirana editovanjem (AUIU=GU),
kao i visokokonzervisana sekvenca AG u 3'-mestu splajsovanja (AAAI=AG). Slično, editovanje AG u 3'-mestu
splajsovanja (AG→IG = GG) može eliminsati ovo mesto.Savijena linija označava granice introna koji se iskraja u
odsustvu editovanja RNK. Isprekidane linije označavaju alternativno splajsovane forme nastale usled editovanja
RNK.
Primeri editovanih transkripata za receptore za neurotransmitere ili jonske kanale kod sisara su
receptori AMPA i GABAA, serotoninski receptor 2C (HTR2C), kanal za kalijum Kv1.1 i kanal za
kalcijum Cav1.3, na primer. Kod D. melanogaster je opisano editovanje transkripta za Na-kanale, a kod
lignje kanala za kalijum Kv1.1A. Poslednjih godina opisano je editovanje još nekih proteina koji se
specifično eksprimiraju u neuronima. MeĎu njima su triptofan hidroksilaza 2, odgovorna za sintezu
serotonima u mozgu, i RNK-vezivni proteini važni za post-transkripcionu regulaciju iRNK u neuronima
(HuB, HuD i NOVA1). Supstrati za editovanju A-u-I su i transkripti za proteine uključene u različite
korake reorganizacije aktina (CyFip2, filamin A i filamin B), koji su esencijalni za pokretljivost i
migraciju ćelija, a u neuronima i za formiranje dendritskih trnova i sinapsi. TakoĎe, transkripti nekih
proteina uključenih u proliferaciju ćelije podležu editovanju A-u-I. Pored ćelijskih transkripata supstrati
za editovanje A-u-I su i neki virusni transkripti (na primer, transkript gena za antigen hepatitis delta
virusa).
Rekodiranjem se stvaraju proteinske izoforme koje, za razliku od proteinskih izoformi nastalih
alternativnim splajsovanjem, skoro uvek obavljaju istu funkciju ali se meĎusobno fino razlikuju po
osobinama koje utiču na efikasnost obavljanja njihove funkcije. Tako, rekodiranje utiče na kintetiku
enzima (na primer, TPH2) ili jonskog kanala i receptora, asembliranje subjedinica i ekspresiju jonskog
kanala i receptora na površinu ćelije, afinitet vezivanja za RNK supstrat (na primer, Hu proteini),
stabilnost proteina (na primer, NOVA1) ili na interakciju sa partner proteinima (na primer, CyFip2,
7
filamin A i filamin B). Ako se ima u vidu precizna vremenska i prostorna regulacija editovanja i
efikasnost editovanja od 0 do 100%, onda postaje jasno da u odreĎenom trenutku u odreĎenoj ćeliji
istovremno funkcioniše veći broj proteinskih izoformi koje sa graduisanom efikasnošću obavljaju svoje
funkcije. Upravo ove osobine proces editovanja RNK čine možda i najmoćnijim procesom u pogledu
obzbeĎivanja izuzetne plastičnosti odgovora ćelije na stimuluse koje prima.
Značaj rekodiranja za funkcionalnost nekog proteina može se ilustrovati primerom editovanja
pre-iRNK za serotonincki receptor 2C (5-HT2CR). 5-HT2CR je protein sa sedam tansmembranskih
domena koji kupluje sa proteinom G. Njegovom aktivacijom inhibira se dopaminska i norepinefrinska
signalizacija u odreĎenim regionima mozga. Učestvuje u regulaciji raspoloženja, anksioznosti, ishrane i
reproduktivnog ponašanja.
5-HT2CR pre-iRNK edituje se na pet specifičnih mesta u egzonu 5, označenih kao mesta A, B, E,
C i D (slika 4b), što menja genomski kodirane aminokiseline Ile, Asn i Ile na pozicijama 156, 158 i 160,
redom (slika 4b). Kratka dvolančana RNK sa izbočinama i petljama, koja je supstrat za proteine ADAR,
formira se parcijalnim sparivanjem sekvence egzona 5 i nizvodne sekvence introna. Različite kombinacije
editovanja ovih pet mesta dovode do promene tri kodona (AUA za Ile, AAU za Asn i AUU za Ile) u
mogućih šest novih (slika 4b) i potencijalne ekspesije čak 24 izoforme receptora. Mesta A i B specifično
edituje ADAR, mesto D ADARB1, dok mesta C i E ne pokazuju specifičnost prema jednom ili drugom
enzimu.
Egzon 5 gena 5-HT2CR kodira drugu unutarćelijsku petlju koja je vžna za post-sinaptičku
signalizaciju jer predstavlja domen za kuplovanje sa G proteinom (slika 4b). Funkcionalnost izoformi se
graduisano razlikuje u pogledu kuplovanja sa G proteinom, afiniteta za serotonin i agoniste, konstitutivne
aktivnosti i ekspresije na površinu ćelije. Potpuno editovana izoforma 5-HT2CR (VGV) ima 20 puta manju
potencijaciju sa serotoninom, 5 puta smanjeno kuplovanje sa G proteinom i 6 puta manje efikasno vezuje
agoniste u poreĎenju sa needitovanom izoformom (INI). Dalje, potpuno editovana izoforma VGV ima
najmanju konstitutivnu aktivnost i potpuno se eksprimira na površini ćelije, needitovana izorma ima
najveću konstitutivnu ativnost, konstitutivno internalizuje i akumulira se u endozomima, dok se parcijalno
editovana VSV izoroma delimično eksprimira na površini ćelije, a delimično se akumulira u
endozomima.
Obrazac editovanja 5-HT2CR pre-iRNK moduliše njeno alternativno splajsovanje, čime se
kontroliše količina sinteze funkcionalnog 5-HT2CR. Intron 5 iskraja se korišćenjem jednog od tri
alternativna 5-mesta splajsovanja (GU1, GU2 i GU3). Mesto GU1 se nalazi u egzonu 5, GU2 na granici
egzon 5-intron 5 i GU3 u intronu 5. Samo korišćenje mesta GU2 daje zrelu iRNK koja kodira
funkcionalni protein pune dužine. Većina editovanih pre-iRNK splajsuje se korišćenjem ovog mesta
splajsovanja. Needitovana pre-iRNK, uglavnom, se splajsuje korišćejem mesta GU1, što rezultuje
izostankom sinteze proteina. Ukoliko je editovanje neefikasno, povećan nivo splajsovanja u mestu GU1
deluje kao kontrolni mehanizam za smanjenje nivoa sinteze needitovane izoforme INI, kako bi se
ograničio odgovor ćelije na serotonin.
Editovanjem 5-HT2CR iRNK moduliše se (generalno smanjuje) odgovor ćelije na nivo serotonina,
ali i sam nivo serotonina povratnom spregom utiče na nivo i obrazac editovanja 5-HT2CR iRNK, što
omogućava modulaciju serotoninske signalizacije i optimalan odgovor ćelije na signale koje prima.
8
AMPA receptor (L-α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolproprionat receptor) za glutamat,
koji je ujedno i jonski kanal za kalcijum, posreduje u brzoj ekscitatornoj transmisiji u neuronima CNS-a,
Sastoji se od četiri subjedinice, označene kao GluR-A, -B, -C i -D. Pre-iRNK za tri subjedinice sadrže po
osam A koji se edituju različitom efikasnošću, što predstavlja efikasan način finog regulisanja
glutamatergičnih sinapsi u odgovoru na sredinske stimuluse. Editovanje kodona za glutamin (Q) u kodon
za arginin (R) u egzonu 11 pre-iRNK za subjedinicu GluR-B je jedino za sada poznato mesto koje se
edituje sa efikasnošću od 100% i esencijalno je za preživljavanje. Katalizuje ga ADARB1. Kodon CAG
za Q menja se u kodon CIG, koji se intrpretira kao kodon za arginin (R), a mesto editovanja se označava
kao Q/R mesto (slika 4a). Aminokiseline Q ili R smeštene su u domenu petlje GluR-B koja je okrenuta
ka samom jonskom kanalu tako da se editovanjem bitno menja propustljivost receptora AMPA za jone
Ca2+: prisustvo R čini kanal nepropustljivim za Ca2+, dok prisustvo genomski kodiranog Q dozvoljava
influks Ca2+ u ćelije. Q/R mesto editovanja, takoĎe, utiče na unutarćelijski transport subjedinica i njihovo
asembliranje.
Slika 4. Supstitucije aminokiselina u proteinima usled editovanja A-u-I i modulacija korišćenja mesta
splajsovanja. a) AMPA receptor za glutamat, subjedinica GluR-B; b) receptor za sertonin 2C); c) modulacija
odabira alternativnog mesta splajsovanja editovanjem pre-iRNK za serotoninski receptor 2C.
9
2.1.2. Promena obrasca splajsovanja
Editovanje A-u-I može promeniti obrazac splajsovanja ciljnih molekula RNK jer ima potencijal da kreira
5-mesto splajsovanja, kreira ili eliminiše 3-mesto splajsovanja ili eliminiše mesto grananja (slika 3b).
TakoĎe, može uticati i na odabir jednog od alternativnih mesta splajsovanja.
Kod sisara ADARB1 edituje sopstveni transkript (auto-editovanje) kreirajući alternativno
3-mesto splajsovanja (AAAI=AG) (slika 5). Auto-editovanje rezultuje u uključivanju 47 nukleotida iz
intronske sekvence usled čega dolazi do promene faze okvira čitanja i posledično do smanjenjanja nivoa
ADARB1. Auto-regulacija splasovanja ADARB1 predstavlja mehanizam negativne povratne sprege kojim
se moduliše nivo proteina ADARB1.
Slika 5. Editovanje A-u-I menja obrazac splajsovanja ABARB1 pre-iRNK. ADARB1 kod sisara edituje
sopstvaenu pre-iRNK, kreirajući novo 3-mesto splajsovanja (crvena slova), što rezultuje uključivanjem 47
nukleotida introna, koje dovodi do promene faze okvira čitanja i smanjenja nivoa ADARB1.
Editovanje A-u-I može uticati na odabir mesta splajsovanja, kao što je pretodno opisano kod
alternativnog splajsovanja 5HT2CR pre-iRNK. Pretpostavlja se da se formiranjem strukture dvolančane
RNK u pre-iRNK mesto splajsovanja može učiniti nevidljivim za splajsozom. Ukoliko se u toj strukturi
nalazi ciljni A, sam proces editovanja destabilizuje dvolančanu RNK, što splajsozomu omogućava pristup
mestu splajsovanja.
2.2.
Globalno hipereditovanje i diverzifikacija transkriptoma
U poli-A frakciji RNK izolovanoj iz mozga pacova zapažen je veliki procenat zastupljenosti I, što se nije
moglo objasniti editovanjem A-u-I u kodirajućim regionima transkripata prepisanih sa nekoliko destina
gena za proteine. Ova nepodudarnost inicirala je bioinformatičko pretraživanje potencijalnih mesta
editovanja u kodirajućim i nekodirajućim regionima sekvenci EST (eng. expressed sequence tag).
Ovakvim pristupom identifikovan je mnogo veći broj mesta editovanja A-u-I od očekivanog, a najveće
iznenaĎenje je bilo da su skoro sva nova mesta editovanja u transkriptomu čoveka (oko 15 000 mesta u
oko 2 000 gena) identifikovana u nekodirajućim regionima pre-iRNK koji se sastoje od invertovanih
elemenata Alu (u 90% slučajeva) i LINE (slika 6a). Predikcija izvedena na osnovu bioinformatičkog
pretraživanja je ukazala da bi više od 85% pre-iRNK moglo da se edituje, i to u 90% slučajeva u
intronima, a ostatak u netranslatirajućim regionima. Sličnom strategijom pretraživanja koja je bila
ograničena na kodirajuće regione pre-iRNK, identifikovano je svega nekoliko potencijalnih mesta
editovanja. Savremenim analizama transkriptoma dubokim RNK sekvenciranjem identifikovno je čak 1,6
miliona mesta editovanja u nekodirajućim regionima pre-iRNK. Dakle, analizama na nivou celog
transkriptoma postalo je jasno da su najčešći supstrati za ADAR nekodirajuće sekvence
transkriptoma, i to dvolančane RNK formirane intramolekulaskim sparivanjem invertovanih elementa
Alu, a da je rekodiranje kao rezultat editovanja A-u-I mnogo reĎe.
10
Iako su elemenati Alu karakteristika genoma primata, utvrĎeno je da je hipereditovanje A-u-I
nekodirajućih ponovljenih elemenata u molekulima RNK široko rasprostranjen fenomen sa
različitom zastupljenošću kod različitih organizama. U genomima drugih organizama postoje drugi tipovi
elemenata SINE, za koje se smatra da imaju zajedničko poreklo sa elementima Alu. Editovanje elemenata
SINE u transkriptomu miša je reĎe u odnosu editovanje elemenata Alu barem za jedan red veličine i može
se objasniti njihovom manjom dužinom (150 bp, u odnosu na 300 bp za Alu), kao i manjim stepenom
meĎusobne homologije u odnosu na elemenate Alu. Skrining editovanja A-u-I u transkriptomu pacova,
kokoške i vinske mušice, potvrdilo je da su nekodirajuće ponovljene sekvence glavni supstrati za ADAR,
ali da je učestalost editovanja mnogo češća kod čoveka, pri čemu je 90% ovog povećanja vezano je za
editovanje elemnata Alu u Pol II transkriptima.
Dosadašnja istraživanja ukazuju da je globalno hipereditovanje važno za finu post-transkripcionoj
regulaciji ekspresije gena i da značajno doprinosi diverzifikaciji transkriptoma. Hipereditovanje
invertovanih elemenata Alu može promeniti mesta splajsovanja, a nekoliko ćelijskih procesa, vezanih za
specifično prepoznavanje i funkcionisanje molekula RNK obogaćenih inozinom, povezuje se sa
izmenjenim transportom, strukturom i stabilnošću iRNK.
Hipereditovanje privlači veliku pažnju kao mehanizam koji je bio važan za evoluciju kognitivnih
sposobnosti čoveka. Naime, iako je rekodiranje proteina slično kod čoveka i miša, ukupno editovanje je
35 puta zastupljenije kod čoveka usled hipereditovanja u ponovljenim sekvancama Alu. MeĎu samim
primatima, zastupljenost hipereditovanja Alu sekvenci se, takoĎe, povećavala tokom evolucije, tako da je
ovaj proces najzastupljeniji u mozgu ćoveka. Smatra se da je ekspanzija hiperdetivanja kod čoveka mogla
generisati molekulsku kompleksnost koja je predstavlja osnovu za razvoj kognitivnih sposobnosti čoveka.
2.2.1. Egzonizacija elemenata Alu
Izvestan broj gena čoveka sadrži alternativne egzone čije sekvence odgovaraju elementima Alu. Oni se
nazivaju Alu egzonima. Njihova mesta splajsovanja bi mogla nastajati editovanjem A-u-I dvolančane
RNK formirane sparivanjem inverotvanih elemenata Alu (slika 6b). Na primer, editovanje jedne takve
dvolančane strukture u genu NARF (nuclear prelamin A recognition factor), dovodi do stvaranja 3'-mesta
splajsovanja uzvodno od elementa Alu, i posledično do njegovog uključivanja u zrelu iRNK. Smatra se da
bi modulisanje alternativnog splajsovanja editovanjem A-u-I u dvolančanim RNK formiranim
sparivanjem inverotvanih elemenata Alu mogao biti široko rasprostranjen fenomen. Postoje mišljenja da
je egzonizacija elemanata Alu kontolisana editovanjem mogla biti glavna pokretačka snaga evolucije
CNS-a čoveka koja je omogućila oprobavanje različitih formi proteina sa novim funkcijama (bez
narušavanja funkcija postojećih proteina), od kojih su opstale one koje su davale selektivnu prednost.
2.2.2. Nukleusna retencija hipereditovanih transkripta
Afinitetnom hromatografijom u kojoj je korišćena sintetička RNK bogata inozinima izolovan je protein
p54nrb. Ovaj protein lokalizuje u nukleusu, gde obavlja veći broj funkcija: stupa u interakciju sa jednim
faktorom splajsovanja (PSF) i jednim proteinom nukleusnog matriksa (matrinom 3), jedan je od proteina
koji lokalizuje u nukleusnim parapegama i predstavlja protein koji "hvata" hipereditovane RNK polioma
virusa. Pretpostavljeno je da bi editovanje A-u-I moglo biti zadržati i ćelijske transkripte u nukleusu, i da
protein p54nrb i nukleusne parapege verovatno imaju ključnu ulogu u tom procesu. Dobro je proučen
11
primer nukleusne retencije hipereditovane iRNK za katjonski transporter aminokiselina 2 (mCat2), koji
ćeliju snabdeva prekursorima azotmonoksida (NO) (slika 6c).
Slika 6. Editovanje invertovanih ponovljenih elemenata Alu i LINE u nekodirajućim regionima transkripata i
potencijalni efekti na njihovu regulaciju ekspresije. a) Editovanje intramolekularnih dvolančanih RNK nastalih
sparivanjem invertovanih elemenata Alu i LINE; b) Modulisanje splajsovanja – egzonizacija Alu; c) Nuklearna
retencija Ctn RNK; d) Degradacija transkripta sa Tudor-SN. Objašnjenje u tekstu.
Gen mCat2 se skprimira se sa dva promotra dajući dve RNK koje nose identične okvire čitanja za
mCat2. Jedna od njih, mCat2 RNK, se nakon transkripcije eksportuje se u citoplazmu i translatira u
protein. Duži transkript, Ctn RNK, sadrži produženi 3’-UTR sa invertovanim ponovcima Alu koji su
supstrat za proteine ADAR. Hipereditovanu Ctn RNK vezuje protein p54nrb i ona biva zadržana u
nukleusnim parapegama. U uslovima stresa, signali koji se primaju odreĎenim receptorima na površini
12
ćelije, pokreću sečenje zarobljenih Ctn RNK i de novo poliadenilaciju na alternativnom mestu.
OsloboĎeni transkripti se eksportuju u citplazmu i translatiraju u katjonski transporter koji ćeliju snabdeva
prekursorima za NO. Opisana regulacija katjonskog transportera za rezultat ima povećanu proizvodnju
NO kao odgovor na stres.
Iako se smatra se da bi nukleusna retencija mogla da reguliše ekspresiju brojnih drugih gena čiji
se transkripti hiperedituju, opšta uloga hipereditovanja invertovanih ponovaka u nukleusnoj retenciji
transkripata je donekle dovedena u pitanje. Naime, pokazano je da se neke iRNK sa formiranim
dvolančanim strukturama RNK eksportuju u citoplazmu, asembliraju u polizome i efikasno translatiraju
nezavisno od statusa editovanja.
2.2.3. Degradacija hipereditovanih transkripta
U ćelijama sisara identifikovana je ribonukleaza koja specifično prepoznaje RNK koje sadrže inozine i
preferencijalno seče oba lanca dvolančane RNK sa većim brojem baznih parova I-U. Kao potencijalni
protein sa ovom funkcijom identifikovana je Tudor stafilokokusna nukleaza (Tudor-SN), koja obavlja
različite uloge u metabolizmu iRNK u ćelijama sisara, uključujući transkripciju, splajsovanje i
degradaciju. Smatra se da bi hipereditovanje invertovanih elemenata Alu i LINE moglo dovesti do
degradacije pre-iRNK katalizovane sa Tudor-SN, čime bi se kontrolisao nivo ekspresije gena koje nose
ponovljene sekvence Alu i LINE (slika 6d).
2.3.
Interakcije puteva editovanja RNK i RNK interferencije
Skoro paralelno sa otkrićem hipereditovanja ponovljenih elemenata Alu i LINE, otkriveno je postojanje
interakcije izmeĎu procesa editovanja A-u-I i puteva RNK interferancije (crosstalk between editor and
silencer). Editovanje A-u-I i RNK interferencija (RNKi) su procesi koji funkcionišu na ćelijskim ili
virusnim dvolančanim RNK, a njihovi ključni proteini (proteini ADAR, Drosha, DGCR8, Dicer i TRBP)
sadrže dsRBD. Ovi domeni ne prepoznaju specifične sekvence, već dvolančanu strukturu RNK, tako da
osnovu interakcije procesa editovanja A-u-I i RNKi predstavlja kompeticija za dvolančani RNK
supstrat. Modulaciju obrade i ekspresije malih regulatornih RNK proteini ADAR ostvaruju editovanjem
prekursora malih regulatornih RNK, dok se protein ADAR ostvaruje i dodatne funkacije u regulaciji
RNKi koje su nezavisne od njegove dezaminazne aktivnosti.
Znajući da mali regulatorni molekuli RNK regulišu veliki broj ciljnih iRNK, editovanje njihovih
dvolančanih prekursora ukazuje na novi mehanizam kojim proteini ADAR utiču na globalnu
ekspresiju gena.
2.3.1. Efekat editovanja A-u-I na put siRNK
RNKi može biti indukovana dugim dvolančanim molekulima RNK koji su supstrat za Dicer (slika 7).
Nastaju male interferirajuće (siRNK), koje pokreću endonukleolitičku degradaciju ciljnih RNK ili
epigenetičko utišavanje ciljnih sekvenci u genomau. Interakcije editovanja A-u-I i RNKi posredovane sa
siRNK ostvaruju se na dva načina. (1) Dvolančani prekursor siRNK može biti suspstrat za protein ADAR
i nakon editovanja postati otporniji na delovanje Dicera, čime se smanjuje količina stvorenih zrelih
siRNK. (2) Supresija siRNK sa ADARp150 ostvaruje se čvrstim vezivanjem ADARp150 za siRNK, što
smanjuje efektivnu koncentraciju siRNK. Ekekti oba mehanizma su smanjenje efikasnosti RNKi
posredovane sa siRNK.
13
Duge dvolančane RNK koje su supstart za Dicer predstavljaju i idealne supstrate za proteine
ADAR. U takvim molekulima RNK ADAR može nespecifično editovati više od 50% A (slika 7a).
UvoĎenje velikog broja pogrešnih baznih parova I-U menja strukturu dvolančane RNK, čineći je
"otpornijom" na delovanje Dicera. Rezultat je stvaranje nefunkcionalnih ili manjeg broja siRNK, i
posledično suprimiranje RNKi. Pored navedenog, editovana dvolančana RNK može postati supstrat za
TudorSN, usled čega se opet smanjuje produkcija siRNK
Slika 7. Efekti editovanja A-u-I na RNK interferenciju posredovanu sa siRNK. a) Duga dvolančana RNK, kao
što je na primer virusna RNK, efikasno se i nespecifično edituje sa ADAR, što vodi do inhibicije RNK interferencije
i degradacije editovane dvolančane RNK sa Tudor-SN. b) ADARp150 se čvrsto vezuje za male interferirajuće RNK
(siRNK), a da ih pri tome ne edituje. Na taj način smanjuje se efektivna koncentracija siRNK i efikasnost RNK
interferencije.
Potvrda ovog modela interakcije editovanja A-u-I i RNKi dobijena je reverzijom fenotipa
izmenjene hemotaksije (sposobnosti traženja ili izbegavanja odreĎene supstance) kod C. elegans. Soj C.
elegans sa homozigotnim delecijama gena adar-1 i adar-2 ispoljava defekte u hemotaksiji, a reverzija se
postiže kod onih jedinki koji imaju defektnu RNKi mašineriju. Ovi podaci ukazuju da je fenotip
izmenjene hemotaksije kod C. elegans rezultat hiperaktivnosti puta RNKi, koji je u normalnim uslovima
suprimiran aktivnošću enzma ADAR. Kod divljih sojeva C. elegans, ekspresija gena koji kontrolišu
hemotaksiju je pod kontrolom ravnoteže izmeĎu editovanja A-u-I i RNKi, procesa koji deluju na
dvolančane RNK formirane u transkriptima ovih gena. Još jedan primer antagonističkih efekata
14
editovanja RNK i RNKi kod C. elegans je sprečavanje utišavanja transgena sa invetovanim ponovljenim
sekvencama putem RNKi. Utišavanje ovakvih transgena sprečeno je editovanjem dvolančanih RNK
nastalih sparivanjem invetovanih ponovljenih sekvenci.
Pored toga što su enzimi ADAR u kompeticiji sa Dicerom za dvolančane RNK supstrate,
izoforma ADARp150 se čvrsto vezuje za obraĎene dvolančane siRNK, smanjujući njihovu efektivnu
koncentraciju u citoplazmi, a time i efikasnost RNKi (slika 7b). U ovom slučaju ADARp150 ne edituje
siRNK, tako da je ova njegova funkcija nezavisna od dezaminazne aktivnosti. Ovaj model interakcije
ADAR i RNKi potvrĎuju rezultati eksperimenta u kome su mišu injecirane nespecifične siRNK u velikoj
dozi. Nakon toga uočena je indukacija ekspresije ADAR, što ukazuje da je ADAR sastavni deo ćelijskog
mehanizma koji se javlja kao odgovor na siRNK. Endogeni molekuli siRNK koji bi mogli biti regulisani
sa ADARp150 još uvek nisu identifikovani, a sličan efekat proteini ADAR bi mogli imati na piRNK.
ADAR je ćelijski faktor koji ograničava potencijal siRNK u ćelijama sisara, smanjenjem
efektivne koncentracije siRNK i sprečavanjem njene inkorporacije u kompleks RISC. U prilog
ovome govori podatak da je utišavanje invazivnih nukleinskih kiselina (transpozona, virusne RNK i
transgena) sa siRNK značajno efikasnije kod organizama koji nemaju ADAR sistem, kao što su biljke i
gljive. Kod ovih organizama RNKi predstavlja jedini odbrambeni mehanizam protiv invazije transpozona
i virusa. Smatra se da je ADAR sistem mogao evoluirati kao protivtežnja RNKi kod organizama koji su
razvili savršeniji imunski sistem i drugačije mehanizme za odabranu od transpozona.
2.3.2. Efekat editovanja A-u-I na put miRNK
MikroRNK (miRNK) su male regulatorne RNK kodirane eukariotskim genomom, koje
post-transkripciono regulišu ekspresiju gena putem RNKi. S obzirom da ne moraju biti perfektno
komplementarne ciljnim molekulima RNK, jedna miRNK može regulisati veliki broj iRNK, a jedna
iRNK može biti regulisana sa većim brojem miRNK. Geni za miRNK se prepisuju u primarnu miRNK
(pri-miRNK), koja formira strukturu drška-petlja (slike 7a). Kompleks Drosha-DGCR8 endonukleolitički
seče pri-miRNK, čime nastaje prekursor miRNK (pre-miRNK) koji se transportuje u citoplazmu.
Pre-miRNK je u citoplazmi supstrat za kompleks Dicer-TRBP, koji endonukleolitičkim sečenjem stvara
dvolančanu miRNK dugačku oko 22 bp. Dvolančana miRNK stupa u interkciju sa nekim od proteina
Argonaut, formirajući utišavajući kompleks RISC, u okviru koga se dešava selekcija aktivnog lanca
miRNK (lanca "vodiča"), dok drugi lanac (lanac „putnik“) biva degradovan. MikroRNK usmerava
kompleks RISC ka ciljnom mestu, obično 3'-UTR-u odreĎene iRNK, dovodeći do translacione represije i
destabilizacije iRNK, ili endonukleolitičke degradacije.
Transkripcija gena za miRNK je obično kontrolisana promotorima drugih gena, tako da se
modulacija obrade miRNK smatra jednim od glavnih načina za regulaciju nivoa miRNK u ćeliji.
Editovanje A-u-I je, upravo, jedan od procesa koji bi moduliše biogenezu miRNK. Uočeno je kod mnogih
primarnih RNK (pri-miRNK), a postoje i in vitro dokazi za editovanje prekursora miRNK (pre-miRNK).
Sistematična pretraživanja editovanja pokazuju da se oko 6% pri-miRNK kod čoveka edituje, dok in vitro
ispitivanja editovanja nasumično odabranih pri-miRNK ukazuje da bi čak 50% pri-miRNK moglo biti
specifično editovano sa ADAR.
15
Slika 8. Efekti editovanja A-u-I u nekodirajućim transkriptima. a) Biogenza miRNK; b) Editovanje primarne
miRNA (pri-miRNK) može suprimirati ili pojačati njenu obradu sa Drosha. Pri-miRNK čija je obrada sa Drosha
suprimirana, može dalje podleći degradaciji sa endonukleazom Tudor-SN; c) Ako editovanje pri-miRNK na utiče na
obradu sa Drosha, ili ako je editovana buduća miRNK, takva pre-miRNK odlazi u citoplazmu, gde njena obrada sa
Dicerom može biti promenjena. d) Ukoliko editovanje nije uticalo na obradu pre-miRNK nastaće zrela editovana
miRNK koja može imati promenjen afinitet za ciljne iRNK ili može delovati na novu grupu ciljnih RNK. Editovanje
miRNK može dovesti i do promene izbora lanca putnika, i time opet do promene ciljnih molekula RNK.
Editovanje pri-miRNK može imati značajne posledice na biogenezu i ekspresiju miRNK, s
obzirom da kratki i neperfektni dvolančani regioni pri- i pre-miRNK dozvoljavaju enzimima ADAR da se
uključe u put biogeneze miRNK. Editovanje sa ADAR može uticati na obradu miRNK inhibicijom
endonukleolitičkog sečenja sa Drosha ili Dicerom (slika 8, b i c), što dovodi do smanjenja nivoa zrelih
miRNK. Hipereditovana pri-miRNK se dalje degraduje sa Tudor-SN (slika 8b). Ukoliko obrada miRNK
nije narušena editovanjem A-u-I, eksprimira se zrela miRNK koja ima A-u-I supstitucije, odnosno
editovana zrela miRNK (slika 8d). Editovana miRNK može imati promenjen afinitet za ciljne iRNK ili
može utišati set gena koji je različit u odnosu na set koji se utišava needitovanim parnjakom. Setovi
ciljnih iRNK molekula se naročito razlikuju ukoliko je editovanje izvršeno u regionu "semena" miRNK,
koji je ključan za prepoznavanje ciljne iRNK. Selekcija aktivnog lanca miRNK bazirana je na
termodinamičkoj stabilnosti 5'-kraja dvolančane miRNK, čija lokalna stabilnost može biti izmanjena
16
editovanjem. Takve izmene mogu uticati da za aktivni lanac bude izabran lanac „putnik“, koji deluje na
različitu grupu ciljnih iRNK. Iako još uvek nisu opisani takvi primeri, editovanje A-u-I bi moglo uticati i
na supresiju transporta pre-miRNK iz nukleusa u citoplazmu.
3'-UTR-ovi iRNK često podležu editovanju. Pokazano je da promena genomskog A u G u
3'-UTR-u dovodi do stvaranja novog ciljnog mesta za miRNK, tako da je moguće da editovanje
3'-UTR-ova može pojačati ili reprimirati utišavanje specifične iRNK. Slično, editovanje može
destabilizovati sekundarnu strukturu u 3'-UTR-u, dozvoljavajući kompleksu RISC da stupi u interakciju
sa prethodno nedostupnim ciljnim mestom. Kroz sve ove mehanizme, A-u-I editovanje ima potencijal
da brzo promeni nivo ekspresije gena kao odgovor na neki stimulus.
Nedavno je opisana uloga ADAR1 u obradi miRNK koja je nezavisna od njegove uloge u
editovanju RNK. Naime, pokazano je da ADAR1 formira kompleks sa Dicerom kroz direktne proteinprotein interakcije. ADAR1 povećava maksimalnu brzinu sečenja pre-miRNK sa Dicerom i olakšava
interakciju miRNK sa kompleksom RISC. ADAR1 "razlikuje" svoje funkcije u editovanju RNK i RNKi
formiranjem ADAR1/ADAR1 homodimera ili ADAR1/Dicer heterodimera, redom. Kod embriona Adar1
knockout miševa, koji imaju letalan fenotip, ekspresija miRNK je globalno inhibirana, što dovodi do
poremećene ekspresije velikog broja ciljnih gena i verovatno doprinosi letalnom fenotipu.
3.
REGULACIJA EDITOVANJA A-U-I
Specifični molekularni mehanizmi koji regulišu prostorni i vremenski nivo editovanja A-u-I su
uglavnom nepoznati. Prisustvo iRNK za ADAR proteine obično nije u korelaciji sa aktinošću proteina
ADAR u ćelijama, zbog čega se smata do postoji složena regulacija ovog procesa na posttranskripcionom i post-translacionom nivou. Ona uključuje alternativno splajsovanje (izoforme ADAR i
ADARB1 se razlikuju lokalizaciji, enzimskoj aktivnosti i/ili prepoznavanju ciljnih iRNK), formiranje
heterodimera sa ADARB2 i sa drugim partner proteinima (FMR1), regulaciju na nivou individualnih
ciljnih iRNK (kompeticija i koregulacija sa splajsovanem), post-translacione modifikacije (SUMOilacija
ADAR smanjuje editaznu aktivost) i regulaciju kroz lokalizaciju ADAR proteina u nukleusu.
4.
EDITOVANJE A-U-I I BOLESTI ČOVEKA
Heterozigotne mutacije u genu ADAR1, koje se nasleĎuju autozomno dominantno, dovode do
poremećaja pigmentacije kože (dyschromatosis symmetrica hereditaria). Poremećaji u editovanju RNK
vezuju se i za bolesti centralnog nervnog sistema i maligne bolesti. Smatra se da smanjenje efikasnosti
editovanja mesta Q/R u iRNK za GluR-B dovodi do smrti motoneurona kod bolesnika sa sporadičnom
amiotrofičnom lateralnom sklerozom, do apoptotoze neurona prilikom ishemije uzrokovane srčanim
udarom ili poremećajem cirkulacije u mozgu, a moglo bi biti povezano i sa epilepsijom. Postoje
indikacije da je imbalans u editovanju RNK vezan za razne neuropsihijatrijske bolesti. Pokazano je da je
obrazac editovanja 5-HT2CR iRNK značajno izmenjen u prefrontalnom korteksu samoubica, pacijenata
sa depresijom i šizofrenijom.
17
Značajno smanjenje nivoa editovanja Alu sekvenci opisano je kod različitih vrsta malignih
bolesti, i ono je delemično posledica smanjene aktivnosti svih enzima ADARs. MeĎutim, uzročna veza
hipoeditovanja i maligne transformacije nije poznata.
18
Download

Eitovanje A-u