UNIVERZITET U BEOGRADU
BIOLOŠKI FAKULTET
Doktorska disertacija
Fiziološke i biohemijske karakteristike
vegetativnog i reproduktivnog razvića in vitro
fotoperiodski zavisne biljke
Chenopodium rubrum L.
Mr Aleksandra Mitrović
Beograd, 2007.
U Beogradu, 09.03.207.
Komisija
Prof dr Zlatko Giba, Biološki fakultet
Dr Dušica Janošević, docent, Biološki fakultet
Dr Ksenija Radotić Hadži-Manić, docent, Centar za multidisciplinarne studije Univerzitet
u Beogradu
Prof dr Ljubinka Ćulafić, Biološki fakultet
Sadržaj
Skraćenice ...................................................................................................................................... 6
Sažetak ............................................................................................................................................... 7
Abstact ................................................................................................................................................ 8
1. UVOD......................................................................................................................... 9
1.1. Biljka Chenopodium rubrum L. .................................................................................................... 9
1. 1. 1. Fotoperiodske karakteristike biljke Chenopodium rubrum L. ........................................... 10
1.2. Aktivnosti antioksidativnih sistema u toku vegetativnog i reproduktivnog razvića.................... 11
1.2.1. Aktivnosti antioksidativnih enzima...................................................................................... 11
1.2.2. Askorbat i glutation ............................................................................................................. 12
1.2.3. Ukupna antioksidativna aktivnost ....................................................................................... 13
1.3. Fotoperiodizam .......................................................................................................................... 13
1.3.1. Merenje vremena u fotoperiodskoj kontroli cvetanja.......................................................... 13
1.3.2. Fitohrom ............................................................................................................................. 15
1.4. Materinski efekti obezbeđuju fenotipsku adaptaciju na lokalne uslove spoljašnje sredine ...... 16
1.4.1. Materinski efekti na karakteristike i klijanje semena .......................................................... 18
1.5. NO signali kod biljaka ................................................................................................................ 19
1.5.1. Biologija NO – eksperimentalni pristupi.............................................................................. 20
1.5.2. Demonstracija i kvantifikacija NO....................................................................................... 20
1.5.3. Uloga NO u rastenju i razviću............................................................................................. 20
1.5.4. NO i hormoni ...................................................................................................................... 22
1.6. Giberelini.................................................................................................................................... 22
2. CILJ RADA .............................................................................................................. 24
3. MATERIJAL I METODE .......................................................................................... 25
3.1. Gajenje biljaka Chenopodium rubrum u cilju dobijanja semena............................................... 25
3.2. Isklijavanje semena.................................................................................................................... 26
3.3. Gajenje biljaka in vitro................................................................................................................ 27
3.3.1. Hranljive podloge:............................................................................................................... 27
3.3.2. Različiti fotoperiodski režimi na kojima su gajene biljke C. rubrum in vitro....................... 28
3.3.3. Praćenje rastenja, cvetanja i sazrevanja semena.............................................................. 28
3.4. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima ......................................................................... 29
3.4.1. Ekstrakcije .......................................................................................................................... 29
3.4.2. Određivanje aktivnosti superoksid dismutaza (SOD)......................................................... 29
3
3.4.3. Određivanje aktivnosti peroksidaza (POD) ........................................................................ 29
3.4.4. Određivanje aktivnosti katalaze (CAT) ............................................................................... 30
3.5. Određivanje koncentracije proteina ........................................................................................... 31
3.6. Razdvajanje proteina ................................................................................................................. 31
3.7. Glutation..................................................................................................................................... 32
3.8. Askorbat (AA) i dehidroaskorbat (DHA)..................................................................................... 32
3.9. ABTS – test................................................................................................................................ 33
3.10. Statistička obrada podataka .................................................................................................... 34
4. REZULTATI I DISKUSIJA ....................................................................................... 35
4.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema u toku vegetativne i reproduktivne faze razvića C. rubrum
in vitro....................................................................................................................................................... 35
4.1.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema tokom klijanja semena C. rubrum .................................. 35
4.1.1.1. Klijanje semena C. rubrum .............................................................................................. 36
4.1.1.2. Aktivnosti CAT, POD i SOD tokom klijanja semena C. rubrum ...................................... 36
4.1.1.3. Koncentracije glutationa i askorbata tokom klijanja semena C. rubrum ........................ 39
4.1.1.4. Efekat giberelina na aktivnosti antioksidativnih sistema tokom klijanja C. rubrum ........ 41
4.1.2. Efekat starosti semena Chenopodium rubrum na antioksidativni status semena, klijanje,
rastenje i cvetanje ............................................................................................................................. 44
4.1.2.1. Efekat starosti semena na klijanje C. rubrum.................................................................. 44
4.1.2.2. Efekat starosti semena na rastenje i cvetanje C. rubrum................................................ 45
4.1.2.3. Efekat starosti semena C. rubrum na antioksidativni status semena ............................. 47
4.1.3. Ukupna antioksidativna aktivnost i aktivnosti antioksidativnih enzima u toku vegetativnog i
reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro ......................................................................................... 50
4.1.3.1. Efekat različitih fotoperiodskih uslova na rastenje, cvetanje i sazrevanje semena C.
rubrum in vitro............................................................................................................................... 50
4.1.3.2. Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti u toku vegetativnog i reproduktivnog
razvića C. rubrum in vitro.............................................................................................................. 53
4.1.3.3. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima u toku vegetativnog i reproduktivnog
razvića C. rubrum in vitro.............................................................................................................. 55
4.2. Efekat fotoperioda na vegetativno i reproduktivno razviće C. rubrum in vitro i materinski
efekat fotoperioda ................................................................................................................................... 62
4.2.1. Efekat fotoperioda na vegetativno i reproduktivno razviće C.rubrum in vitro ............................ 62
4.2.1.1. Efekat različitih fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro.............................................. 63
4.2.1.2. Efekat različitih fotoperioda na cvetanje C. rubrum in vitro ............................................. 67
4.2.1.3. Efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena C. rubrum in vitro .......................... 68
4.2.2. Materinski efekat fotoperioda ...................................................................................................... 71
4
4.2.2.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena, klijanje, rastenje, cvetanje i
donošenje semena C. rubrum in vitro.............................................................................................. 71
4.2.2.1.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena C. rubrum ................................ 71
4.2.2.1.2. Materinski efekat fotoperioda na klijanje semena C. rubrum ....................................... 74
4.2.2.1.3. Materinski efekat fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro ....................................... 76
4.2.2.1.4. Materinski efekat fotoperioda na cvetanje i sazrevanje semena C. rubrum in vitro.... 80
4.2.2.2. Materinski efekat fotoperioda na proteine semena C. rubrum ........................................... 85
4.3. Efekat natrijum nitroprusida (SNP) i kalijum cijanida (KCN) u toku vegetativnog i
reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro............................................................................................ 92
4.3.1. Efekat SNP i KCN na klijanje semena C. rubrum................................................................... 93
4.3.1.1. Efekat SNP na klijanje semena C. rubrum...................................................................... 93
4.3.1.2. Efekat SNP i GA3 na klijanje semena C.rubrum.............................................................. 95
4.3.1.3. Efekat KCN na klijanje semena C. rubrum...................................................................... 96
4.3.1.4. Efekat cPTIO, KCN, i SNP na klijanje C.rubrum. ............................................................ 98
4.3.2. Efekat SNP i KCN na rastenje C. rubrum in vitro ................................................................. 101
4.3.2.1. Efekat SNP na rastenje C. rubrum in vitro .................................................................... 101
4.3.2.2. Efekat SNP i GA3 na rastenje C.rubrum in vitro ............................................................ 103
4.3.2.3. Efekat KCN na rastenje C. rubrum in vitro .................................................................... 104
4.3.3. Efekat SNP i KCN na cvetanje i donošenje semena C. rubrum in vitro .............................. 106
4.3.3.1. Efekat SNP na cvetanje i donošenje semena C. rubrum in vitro .................................. 106
4.3.3.2. Efekat SNP i GA3 na cvetanje C. rubrum in vitro .......................................................... 109
4.3.3.3. Efekat KCN na cvetanje C.rubrum in vitro .................................................................... 110
5. ZAKLJUČCI ........................................................................................................... 113
6. LITERATURA ........................................................................................................ 115
5
Skraćenice
AA
askorbat
CAT
katalaza
cPTIO
karboksi 2-fenil-4,4,4,4,-tetrametilmidazolin-1oksi 3-oksid
DHA
dehidroaskorbat
GA
giberelna kiselina
GSH
redukovani glutation
GSSG
oksidovani glutation
KS
kontinualna svetlost
POD
peroksidaze
ROS
reaktivne vrste kiseonika
SNP
natrijum nitroprusid
SOD
superoksid dismutaze
UAA
ukupna antioksidativna aktivnost
6
Sažetak
Chenopodium rubrum L. sel 184 je obligatno kratkodnevna biljka. Kao rano
cvetajuća vrsta predstavlja pogodan objekat za ispitivanje ontogeneze in vitro. Biljka
cveta in vitro posle 15 dana pod adekvatnim fotoperiodskim režimom, a donosi seme
posle 10 nedelja. Praćeni su efekti različitih fotoperioda, azot monoksida (korišćenjem
natrijum nitroprusida (SNP) i KCN), i giberelina, na klijanje, rastenje, cvetanje,
donošenje semena i antioksidativni status biljaka u različitim fazama vegetativnog i
reproduktivnog razvića. Utvrđeni su i materinski efekti različitih fotoperioda na klijanje,
rastenje, cvetanje i donošenje semena potomstva.
Tokom klijanja semena dolazi do sekvencijalne ekspresije antioksidativnih
sistema. Pred izbijanje radikule catalaza (CAT), superoksid dismutaze (SOD) i
dehidroaskorbat (DHA) pokazuju maksimalnu aktivnost, a askorbat (AA) je detektovan
samo u to vreme. Maksimalan sadržaj ukupnog glutationa, kao i redukovane (GSH) i
oksidovane forme (GSSG) je izmeren u vreme izbijanja radikule, kada se javlja i
peroksidazna (POD) aktivnost i raste posle tog perioda. GA3 (160 μM) je suboptimalna
za klijanje, indukuje porast aktivnosti CAT i SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad
koncentracije AA i DHA, a ne utiče na glutation i POD.
Starost semena utiče na smanjenu klijavost, rastenje i cvetanje, kao i na
promenu antioksidativnog statusa semena. Aktivnosti CAT, SOD, kao i sadržaj
glutationa su znacajno niži, a “de novo” sinteza proteina počinje kasnije tokom
imbibicije starijih semena. GA3 (3 – 30 mM) smanjuje razliku u rastenju i cvetanju
između biljaka poreklom od semena različite starosti.
U različitim fazama rastenja i razvića, primećena je promena nivoa
antioksidativnih enzima. Najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja.
Ukupna antioksidativna aktivnost pokazuje obrnut trend promena u toku razvića u
odnosu na antioksidativne enzime, što ukazuje da i sadržaj drugih antioksidanata ima
ulogu u uklanjanju reaktivnih vrsta kiseonika u procesima razvica C. rubrum.
Biljke C. rubrum odgovaraju na fotoperiod kome su izložene u svim fazama
razvića. Fotoperiod kome su biljke izložene u prvih 6 dana života ostavlja trajni efekat
na rastenje do kraja ontogeneze, dok na cvetanje i sazrevanje semena ima uticaja i
fotoperiod koji zatim sledi.
Majke biljke C. rubrum u semenu ostavljaju informaciju, koja bi između ostalog
mogla biti na nivou proteina, o dužinama dana koje su iskusile u toku svog životnog
ciklusa. Materinski efekat fotoperioda se proteže kroz čitav životni ciklus potomstva: za
klijanje semena i rastenje potomstva, ključni značaj ima fotoperiod kome su majke
biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za cvetanje i donošenje semena
potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi posle indukcije cvetanja majki biljki.
SNP (10 i 50 μM) stimulira klijanje prvog dana i rastenje, dok cvetanje stimulira
10 μM, a više koncentracije odlažu cvetanje. KCN (10 μM) stimulira klijanje 1. dana, 10
– 200 μM nema efekta na izduživanje stabla, a stimulira razviće listova i cvetanje. GA3
(15 mM) stimulira klijanje (1. dana), rastenje i cvetanje. GA3 (15 mM) i SNP (50 μM)
pokazuju zbirni stimulatorni efekat na klijanje 1. dana, dok SNP umanjuje stimulatorni
efekat giberelina na rastenje i cvetanje.
7
Abstact
Chenopodium rubrum L. sel 184 is a qualitative short-day plant. As an early
flowering species, it is a suitable model for onthogenesis studying. Under suitable
photoperiodic conditions in vitro, plant flowers after 15 days, and produces seeds after
10 weeks. We investigated the effects of different photoperiods, NO (using sodium nitropruside (SNP) and KCN), and gibberellin, on germination, growth, flowering, seed
maturation and antioxidative status, all in different phases of vegetative and reproductive development. We determined maternal effect the photoperiod has on seed size,
germination, growth, flowering and seed maturation of ofspring.
We showed sequential expression of antioxidative systems during seed germination. Prior to radicle protrusion, catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and
dehidroascorbate (DHA) showed maximal activity, while presence of ascorbate (AA)
was only detected. Radicle protrusion was accompanied with maximal content of total
glutatione and GSH, while POD activity appeared and increased after. GA3 (160 μM)
had no effect on germination, induced an increase in CAT and SOD activity prior to
radicle protrusion and lowered AA and DHA concentrations. It had no effect on glutathione and POD activity.
Seed ageing lowered germination percentage, growth and flowering and affected
changes in antioxidative status of seeds. In old seeds, CAT and SOD activity, as well
as glutathione content were significantly lower, and de novo protein synthesis started
later during imbibition. GA3 (3 – 30 mM) lowered the difference in growth and flowering
between seeds different in age.
We showed changes in antioxidative enzymes activities in different phases of
development. The highest CAT activity was measured at the time of flowering. Total
antioxidative activity showed opposite changes during development as compared to the
antioxidative enzymes, suggesting that other antioxidants participate in the reactive
oxygen species removal during the C. rubrum development.
C. rubrum plants respond to photoperiod in all phases of development. The photoperiod the seedling is exposed to during the first 6 days, influences growth during the
whole life cycle, while flowering and seed maturation is more sensitive to the photoperiod following flower induction.
C. rubrum mother plants relay to their seeds a «message» about the day lengths
they experienced during their life cycle. The molecular form of that «message» could,
among other, be protein in nature. Maternal effect of photoperiod extends through the
whole life cycle of ofsprings: photoperiod during the first 6 days of mother’s life cycle
has the key influence on seed germination and ofspring growth, while for flowering and
seed maturation, the key influence has the photoperiod their mothers experienced later
in life cycles.
SNP (10 i 50 μM) stimulates germination and growth, 10 μM stimulates, while
higher concentrations delays flowering. KCN (10 μM) stimulates germination, 10 – 200
μM have no effect on stem elongation, while it stimulates leaf growth and flowering.
GA3 (15 mM) and SNP (50 μM) showed cumulative stimulatory effect on germination,
while SNP lowered stimulative effect of GA3 on growth and flowering.
8
1. Uvod
Ciklus razvića jednogodišnjih biljaka (ontogeneza) započinje klijanjem semena i
završava se obrazovanjem ploda i semena. U ontogenetskom razviću biljke, dva
procesa imaju kardinalni značaj. Prvi je klijanje semena, koje nastupa posle kraćeg ili
dužeg mirovanja semena i nastavlja se rastenjem klijanca i mlade biljke sa svim
vegetativnim organima. Drugi je cvetanje, koje predstavlja početak reproduktivne faze
razvića koja se završava obrazovanjem ploda i semena. Ovi procesi su usklađeni sa
smenom godišnjih doba i završavaju se pre nastupanja sezone koja je za rastenje
nepovoljna, u umerenom klimatskom pojasu, pre zime. Jednogodišnje biljke u zimskom
periodu umiru, ostavljajući seme iz koga će se razviti sledeća generacija.
1.1. Biljka Chenopodium rubrum L.
Chenopodium rubrum L. pripada familiji Chenopodiaceae, rodu Chenopodium.
Familija Chenopodiaceae: Biljke ove familije pripadaju formi skapoznih terofita.
U Srbiji su to isključivo zeljaste biljke, koje često imaju sukulentnu formu. To su
jednogodišnje, dvogodišnje, ili višegodišnje, jednodome, ili dvodome biljke. Listovi su
naizmenični ili naspramni, bez zalistaka. Cvetovi su jednopolni ili dvopolni, trodelni ili
petodelni, složeni u grozdaste cvasti. Listići jednostavnog cvetnog omotača, često su
okriljeni i kasnije otvrdnu. Plod je, po pravilu, suv. U okviru ove familije ima dosta
važnih kulturnih biljaka: industrijskih, furažnih i povrtarskih. Većina vrsta familije
Chenopodiaceae je jestiva. Koriste se mladi listovi i vrhovi izdanaka. Neke vrste su
kultivisane kao povrće (spanać, blitva, cvekla, šećerna repa), dok se u ishrani koriste i
listovi nekih samoniklih lobodnjača. Mladi listovi C. rubrum, takođe su jestivi prokuvani
(Grlić 1986).
Rod Chenopodium: Ovom rodu pripadaju zeljaste, jednogodišnje, ređe
višegodišnje biljke. Listovi su naizmenični, obićno trouglasto rombični i nepravilno
valovitog oboda. Cvetovi su dvopolni, sakupljeni u račvaste bezlisne cvasti. Cvetni
9
omotač je (3-4) 5-delan, njegovi listići su zeljasti, s leđne strane zadebljali i delimično ili
potpuno omotavaju zreli plod. Plod je jednosemena orašica (Slavnić 1972).
Chenopodium rubrum L. (Slika U1) je zeljasta jednogodišnja, jednodoma biljka
sa sposobnošću samooprašivanja. Dostiže visinu do preko pola metra. Stablo je
uspravno, golo, zeleno ili crvenkasto, prosto ili granato. Listovi su debeli, rombični ili
trouglasti, valoviti ili zubčasti po obodu. Cvetne glomerule su sitne, složene u lisnate, ili
bezlisne grozdove, skupljene u zbijene ili rastresite složene cvasti grozdastog tipa. Kod
vršnih cvetova lisnati omotač je sastavljen od 5 slobodnih, a kod bočnih od 3 srasla
lista. Prašnika ima 2-5, žiga 2. Semenka je mrko-crna.
Vrsta je rasprostranjena u Evropi, Maloj i Centralnoj Aziji i Severnoj Americi, u
Srbiji se najčešće sreće u Vojvodini. Raste na tlu bogatom mineralnim solima, najčešće
otvorenim, šljunkovitim i sunčanim mestima sa velikim oscilacijama vlažnosti tla
(Slavnić 1972).
Slika U1: Chenopodium rubrum: Levo – vegetativna biljaka pred cvetanje,
Desno – izgled biljke u cvetu, izgled cveta, ploda i semena.
1. 1. 1. Fotoperiodske karakteristike biljke Chenopodium rubrum L.
Različiti ekotipovi jedne iste vrste, mogu se razlikovati po svom fotoperiodskom
odgovoru. Tako je Cumming (1967) okarakterisao 6 različitih ekotipova ove vrste sa
različitih geografskih širina Severne Amerike, izučavajući uticaj fotoperioda i
temperature na cvetanje. Utvrdio je da se selekcija 184 (50 10 N, 105 35 W) na
10
temperaturi od 15 C, ponaša kao obligatno – kvalitativno kratkodnevna biljka, osetljiva
na male promene dužine dana, i sa dobro definisanim kritičnim dužinama noći od 8h.
C. rubrum L. sel. 184, je osetljiva na fotoperiodski stimulus za cvetanje već na
kotiledonarnom stadijumu razvića. Za fotoperiodsku indukciju cvetanja, dovoljno joj je 6
indukcionih ciklusa (Seidlová and Opatrná 1978). U kulturi in vitro u indukcionim
uslovima, cveta već 15 dana posle klijanja (Živanović et al. 1995), pa kao rano
cvetajuća vrsta (Cumming 1961), predstavlja prikladan objekat za izučavanje
ontogeneze.
1.2. Aktivnosti antioksidativnih sistema
u toku vegetativnog i reproduktivnog razvića
1.2.1. Aktivnosti antioksidativnih enzima
Pojava reaktivnih vrsta kiseonika (reactive oxygen species - ROS) u biljnim
ćelijama je povezana sa procesima u toku razvića biljaka, kao i njihovom interakcijom
sa spoljašnjom sredinom (Elstner 1982, Hendry and Crawford 1994). Slobodni radikali
neprekidno oštećuju različite molekulske vrste, a mogu čak i da oštete ćelijske
membrane i organele. Za neke od njih, kao što su H2O2 i O2- se pretpostavlja da imaju
signalnu ulogu (Baker and Orlandini 1995, Lamb and Dixon 1997). ROS se alternativno
proizvode i uklanjaju. Antioksidativni enzimi, superoksid dismutaze (SOD) (štiteći ćelije
od O2-), peroksidaze (POD) i katalaza (CAT) (katališući razlaganje H2O2), su glavne
komponente uključene u uklanjanje ROS (Van Loon 1986, Bowler et al. 1992, Khan
and Panda 2002) i na taj način učestvuju u regulaciji procesa u toku razvića biljaka ili
odgovora biljke na patogene ili abiotički stres.
Katalaza i peroksidaze, metabolišu H2O2 na različite načine (Marinescu et al.
2000), pri čemu različiti metaboločki putevi degradacije H2O2 verovatno odgovaraju
razlikama u metabolizmu biljaka, vezanim za različite faze razvića ili odgovorima na
biotički ili abiotički stres.
Sinteza proteina koji ulazi u sastav CAT je povezana sa fotosintetičkim i
fotorespiratornim putevima (Schmidt et al. 2002). Pošto je pokazano da H2O2 usko
povezan sa velikim brojem hormonski zavisnih procesa u toku razvića (Foyer and
11
Noctor 2003), pretpostavljeno je da kompleksna regulacija CAT na nivou translacije ima
ulogu da ograniči preteranu akumulaciju H2O2 , omogućavajući odvijanje CAT signalnih
funkcija (Luna et al. 2004). Rezultati koji se bave fiziologijom semena pokazuju ulogu
CAT tokom sušenja semena u sprečavanju oksidativnih oštećenja vezanih za
dehidrataciju, pri čemu H2O2 regulliše CAT gensku ekspresiju i transdukciju signala
dehidratacije (Bally et al. 2004). Takođe je pokazano da je i proces klijanja povezan sa
CAT aktivnošću (Bailly et al. 2002). Promena CAT aktivnosti je potvrđena i u procesima
rastenja i razvića (Bailey and McHargue 1943, Matters and Scandalios 1986).
Peroksidaze su najviše istraživani enzimi s obzirom na njihovu zastupljenost u
biljnim tkivima, ali postojanje različitih in vitro supstrata za POD i različitih izoenzima
prestavlja problem za utvrđivanje njihove fiziološke uloge (Marinescu et al. 2000).
Utvrđena je uloga POD u klijanju semena i rastenju klijanaca (Bellani et al. 2002),
rastenju i razviću (Bailey and McHargue 1943, Fielding ang Hall 1978), biosintezi
lignina u ćelijskim zidovima (Bruce and West 1989).
Superoksid dismutaze su grupa metaloenzima koja štiti ćelije od superoksid
radikala (O2-) katališući njegovu dismutaciju do molekularnog O2 i H2O2. Aktivacija O2
se dešava u različitim delovima ćelije (mitohondrije, hloroplasti, mikrozomi, glioksizomi,
peroksizomi, apoplast i citosol), pa su i SOD prisutne u svim tim delovima ćelije. SOD
su svrstane u dve familije. Cu/Zn SOD (uglavnom lokalizovana u citosolu ili
hloroplastima), i MnSOD (u mitohondrijama) i FeSOD (u hloroplastima) (Fridovich
1986). U normalnim uslovima, nastajanje i uklanjanje O2- je u ravnoteži, kako zaštitnim i
reparacionim mehanizmima, tako i mehanizmima koji minimiziraju produkciju slobodnih
radikala pre nego jednostavnim uklanjanjem (Giba et al. 1998). U uslovima stresa, SOD
predstavljaju prvu liniju odbrane od reaktivnih kiseoničnih vrsta (Alcher et al. 2002).
Uloga SOD takođe je utvrđena u procesima klijanja (Gidrol et al. 1994), kao i rastenja i
razvića (Matters and Scandalios 1986, Lall and Nikolova 2003).
1.2.2. Askorbat i glutation
Uklanjanje H2O2 se obavlja i oksido-redukcionim sistemom antioksidativnih
metabolita, askorbata i glutationa (Asada 2006). Glutation i askorbat imaju opštu
zaštitnu ulogu protiv oksidativnog stresa, regulišući redoks ravnotežu u ćeliji (Arigoni
12
1994,
May
et
al.
1998).
Pretpostavlja
se
da
odnos
askorbinska
kiselina/dehidroaskorbinska kiselina može da zaustavi, ili odloži deobu ćelija (de Pinto
et al. 1999).
1.2.3. Ukupna antioksidativna aktivnost
Merenje ukupne antioksidativne aktivnosti (UAA) predstavlja metod koji ukupnu
antioksidativnu aktivnost posmatra kao globalnu karakteristiku uzorka, nezavisno od
njenog sastava, ili kooperativnih efekata koji mogu postojati između različitih
antioksidanata koji su sastavni deo uzorka. UAA predstavlja kapacitet uzorka svežeg
biljnog materijala za uklanjanje slobodnih radikala (Arnao et al. 1999).
1.3. Fotoperiodizam
Relativna dužina dana i noći u toku 24 časa menja se tokom godine i uslovljava
ritmičnost u mnogim biološkim procesima. To je potpuno predvidiva promena
spoljašnjih faktora, jer se za svaku geografsku širinu zna koliko će dnevno osvetljenje
biti svakog dana tokom godine. Produžavanje, ili skraćivanje dana, otuda predstavljaju
najsigurniji signal živim bićima o tome koje godišnje doba dolazi (Nešković et al. 2003).
Fotoperiodizam je jedan od primera biološkog merenja vremena (Vince-Prue 1975). Za
biljke je od najveće važnosti da cvetaju u vreme koje će im omogućiti da pre zime
donesu plod.
1.3.1. Merenje vremena u fotoperiodskoj kontroli cvetanja
Prema fotoperiodskom odgovoru na cvetanje, biljke su podeljene u tri osnovna
tipa (Vince-Prue 1975):

biljke kratkog dana, koje cvetaju kada je broj časova svetlosti, u okviru 24časovnog ciklusa, manji od određene vrednosti (kritična dužina dana).

biljke dugog dana, koje cvetaju kada je broj časova svetlosti, u okviru 24časovnog ciklusa, veći od određene vrednosti (kritična dužina dana),

dnevno neutralne biljke, koje cvetaju bez obzira na fotoperiodske uslove.
13
Fotoperiodska klasifikacija biljaka nije zasnovana na konkretnoj dužini dana, već
govori o tome da li će cvetanje biti stimulirano kad se dužina dana smanjuje ili
povećava u odnosu na kritičnu. Preciznije je, zapravo, govoriti o kritičnoj dužini noći, jer
se u toku noći dešavaju značajni procesi vezani za cvetanje.
Kod ovih fotoperiodskih tipova postoje biljke sa obligatnim (kvalitativnim) i biljke
sa fakultativnim (kvantitativnim) odgovorom. Kvalitativne (kratko ili dugodnevne) cvetaju
samo na određenoj kritičnoj dužini dana, dok kod kvantitativno (kratko ili dugodnevnih)
biljaka određena dužina dana promoviše cvetanje, ali nije esencijalna za cvetanje
(Vince-Prue 1975). Ali čak i kod apsolutno fotoperiodski zavisnih vrsta, kritična dužina
dana može biti značajno modifikovana različitm faktorima sredine, na pr. mineralnim
sastavom podloge, temperaturom, svetlosnim fluksom, starošću biljke. Otuda
svrstavanje biljaka u jednu ili drugu grupu odgovora, validno je pod datim setom uslova
(Bernier et al. 1981).
Neke biljke imaju dvostruke fotoperiodske zahteve: dugo-kratkodnevne biljke će
cvetati na kratkom danu, samo ako su prethodno primile dovoljan broj dugih dana (u
jesen), dok će kratko-dugodnevne cvetati na dugom danu, ako su prethodno bile
izložene kratkom danu (u proleće). Mogu se razlikovati još dve grupe biljaka:
intermedijerne, koje će cvetati kada je dužina dana intermedijerna (ni suviše dugačak,
niti suviše kratak dan), i ambifotoperiodske biljke, koje će brzo cvetati na kratkom ili
dugom danu, ali će cvetanje biti odloženo na intermedijernim dužinama dana (VincePrue 1975).
Fotoperiodski zavisne biljke ne moraju sve vreme do cvetanja biti izložene
odgovarajućoj
dužini
dana.
Svaka
vrsta
zahteva
određen
broj
indukcionih
fotoperiodskih ciklusa, posle čega će procvetati bez obzira na dužinu dana kojoj bude
izložena. Osetljivost biljaka na fotoperiodski stimuslus varira sa starenjem, i obično se
povećava do određenog stepena (Vince-Prue 1975). Biljka C. rubrum je osetljiva na
fotoperiodski stimulus već u fazi razvića kotiledona, kada joj je dovoljno 6 indukcionih
fotoperiodskih ciklusa da bi procvetala (Seidlová and Opatrná 1978). Kod nekih biljaka,
uočeno je oscilovanje osetljivosti na fotoperiodski stimulus za cvetanje u zavisnosti od
starosti biljaka gde je starost izražena brojem listova (Pavlová et al. 1989, Mitrović et al.
2000).
Neke biljke, kako kratkog dana: Pharbitis nil (Bernier et al. 1981), Chenopodium
rubrum (Mitrović et al. 2003), tako i dugog dana: Sinapis, Rudbeckia (Bernier et al.
14
1981), Arabidopsis (Komeda et al. 1992), C. murale (Mitrović et al. 2003) su sposobne
da iniciraju cvetove i u mraku.
Opšte je prihvaćeno da fotoperiodsku draž najefikasnije primaju listovi. A
fitohrom ima funkciju merača dužine noći (Nešković et al. 2003).
1.3.2. Fitohrom
Prisutan je u svim delovima biljke (koren, stablo, list, lisne drške, kotiledoni,
hipokotili, vegetativni pupoljci, cvasti, nezreli plodovi), a najveća mu je koncentracija u
meristemskim tkivima (Smith 1995, Korneef et al. 1998). Fitohrom uzima učešće u
velikom broju procesa u životu biljke (Nešković et al. 2003):
-klijanje semena,
-izduživanje stabla,
-otvaranje apikalnog pupoljka i razviće listova,
-fotosinteza - složen enzimski sistem koji obavlja fotosintezu razvija se pod
zajedničkim dejstvom fitohroma i kriptohroma,
-sinteza antocijana i velikog broja različitih enzima,
-posredovanje u cvetanju i drugim fotoperiodskim pojavama kao i u
uspostavljanju endogenog ritma,
-regulacija aktivnosti jonskih kanala u mnogim ćelijama.
Fitohrom se sintetiše u obliku koji apsorbuje svetlost talasne dužine 660nm (Pr) i
u tom obliku se nalazi u biljkama koje rastu u mraku. Kada se osvetli crvenom
svetlošću, Pr se konvertuje u oblik čiji je maksimum apsorpcije na 730nm (Pfr). Ovaj
oblik započinje biološku reakciju.
crvena svetlost
Pr
daleko crvena svetlost
Pfr
fiziološki odgovor
Mrak
Pošto dnevna svetlost obuhvata sve talasne dužine vidljivog dela spektra, oba
oblika fitohroma su neprestano prisutna. Fitohrom neprekidno prelazi iz Pr u Pfr, čime
se akumuliraju i njegovi intermedijeri, čija uloga nije razjašnjena.
Utvrđeno je da postoje dva oblika fitohroma: tip I i tip II (Furuya 1993).
15
Kompleksnim molekularno biološkim istraživanjima, utvrđeno je postojanje familije gena
koja kodira apoproteine fitohroma: PHYA, PHYB, PHYC, PHYD, PHYE (Sharrock and
Quail 1989), mada neke biljke verovatno imaju i neke druge fitohrome. PHYA kodira
sintezu fitohroma tipa I, dok PHY B - E kodiraju fitohrome tipa II. Fitohromi tipa I i tipa II
se međusobno razlikuju po stabilnosti aktivne forme Pfr na svetlosti. Količina fitohroma
tipa I je na svetlosti niska, dok je u mraku, čak 9 puta veća od količine fitohroma tipa II.
Fitohtom tipa II je prisutan i kod zelenih i etioliranih biljaka, ali u manjim količinama.
Osim crvene i daleko crvene svetlosti, i plava svetlost, preko svojih receptora,
kriptohroma i fototropina, ima udela u životu biljaka.
Fitohrom A i B učestvuju u regulaciji morfogenetskih procesa u svim fazama
razvića biljke, od klijanja do cvetanja, ali se njihov relativni značaj menja tokom razvića.
Pretpostavlja se da phyA reguliše odgovore na daleko crvenu svetlost visokog
intenziteta i ima različite uloge tokom životnog ciklusa, dok je phyB odgovoran za
klasične crvena/daleko crvena svetlost reverzibilne reakcije (Smith 1995).
Značaj pojedinih fotoreceptora se može manjati u toku razvića biljke (Terzaghi
and
Cashmore
1995).
Razjašjavanjem
molekularnih,
ćelijskih
i
biohemijskih
mehanizama aktivnosti fitohroma preko velikog broja mutanata A. thaliana, otkrivene su
uloge pojedinačnih fitohroma u regulaciji različitih aspekata razvića biljaka. Različiti
fitohromi istovremeno imaju jasno određene, ali i preklapajuće uloge u fotomorfogenezi
biljaka (Wang and Deng 2002).
Pokazano je da je klijanje A. thaliana pod kontrolom: phyA, phyB i phyE (Hening
et al. 2002). Cvetanje A. Thaliana, kao i pirinča (Takano et al. 2005), je pod kontrolom
phyA, phyB i phyC (Monte et al. 2003). phyA ima vrlo značajnu ulogu u izduživanju
internodija i listova biljaka gajenih na svetlosti (Franklin et al. 2003). Odgovor
izbegavanja senke, koji je povezan sa izduživanjem internodija i petiola, a i sa
cvetanjem, je pod kontrolom phyB, phyD i phyE (Wang and Deng 2002).
1.4. Materinski efekti obezbeđuju fenotipsku adaptaciju
na lokalne uslove spoljašnje sredine
Biljke kao sesilni organizmi, tokom svog života, žive u određenim uslovima
spoljašnje sredine. Ipak, mogu biti izložene različitim uslovima spoljašnje sredine
16
rasejavanjem polena, ili semena, kao i lokalnim promenama sredinskih faktora. Biljke
na variranje faktora spoljašnje sredine odgovaraju fenotipskom plastičnošću. Odgovor
na spoljašnju sredinu može se proširiti i na potomstvo, i to kako odgovorom na
spoljašnju sredinu majčinske, tako i očinske biljke, mada je materinski efekat rašireniji
(Galloway 2005). Osim prezigotskih uticaja spoljašnje sredine, na koje utiču oba
roditelja, rano razviće mlade jedinke (semena) se odvija na matičnoj biljci.
Od adaptivnih materinskih efekata, se očekuje da smanje broj faktora spoljašnje
sredine koji utiču na smanjenje sposobnosti potomstva da preživi. Na primer: mlade
biljke Polygonum persicaria, poreklom od biljaka raslih na podlozi siromašnog
mineralnog sastava, imaju značajno razvijeniji korenov sistem od genetički istih
individua čije su majke biljke rasle na podlogama bogatim nutrijentima (Sultan 1996).
Slično, potomstvo biljaka gajenih u uslovima slabe osvetljenosti, pokazuje znatno
izraženije rastenje stabla u odnosu na potomstvo biljaka raslih u uslovima pune
osvetljenosti (Sultan 1996).
Materinski efekat sredine predstavlja mehanizam kojim majka biljka prilagođava
fenotipove potomstva da poveća “uspeh” u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije
iskusiti. U slučaju da se seme raseje u drugačiji habitat, materinski efekat sredine može
smanjiti njegovu sposobnost preživljavanja. Ipak, sposobnost preživljavanja će biti
smanjena samo u jednoj generaciji, jer će odgovor individua na novi habitat indukovati
odgovarajuće materinske efekte za sledeću generaciju (Galloway 2005).
Tri uslova moraju biti zadovoljena za razvoj adaptivnih materinskih efekata
(Donohue 2003): 1. materinski uslovi spoljašnje sredine, moraju da “predviđaju” uslove
sredine potomstva, 2. uslovi spoljašnje sredine kojima su izložene majke biljke, moraju
da povećavaju sposobnost preživljavanja kako potomstva, tako i roditeljske generacije,
3. mora da postoji interakcija između materinskog genotipa i uslova spoljašnje sredine.
Striktno genetičke adaptacije, koje predstavljaju odbrambenu materinsku
strategiju, očekuju se kada su variranja spoljašnje sredine veća od kretanja polena ili
semena. To se može uočiti između populacija sa genetičkim diferencijacijama
označenim kao lokalne adaptacije (Linhart and Grant 1996). Otuda, populacija koja
naseljava heterogenu sredinu, ima ograničenu mogućnost za rasejavanje semena, i
kontinuitet uzoraka faktora spoljašnje sredine između generacija, izabraće strategiju
materinskih efekata sredine da obezbedi fenotipsku adaptaciju na lokalne uslove
spoljašnje sredine (Galloway 2005).
17
Pokazano je da različiti faktori spoljašnje sredine mogu izazvati materinske
efekte na potomstvo. Oni su specifični, njihova ekspresija često zavisi od sredine u
kojoj se potomstvo razvija. Materinski efekat ispoljava se tokom čitavog života
potomstva, a može opstati kroz više generacija (Galloway 2005). Faktori spoljašnje
sredine za koje je uočeno da izazvaju materinski efekat su: mineralni sastav podloge
(Straton 1989), intenzitet svetlosti (Galloway 2005), temperatura (Lacey et al. 1997),
fotoperiod (Cook 1975, Gutterman 1978, Munir et al. 2001), nivo CO2 (Steinger et al.
2000).
1.4.1. Materinski efekti na karakteristike i klijanje semena
Kod većine biljnih vrsta, klijavost semena varira između i unutar populacija, i
između i u okviru individua. Neke od tih varijacija mogu biti ontogenetske, ali je veliki
broj njih fenotipski, uslovljen lokalnim uslovima pod kojima su semena sazrevala. To je
kombinacija mikrosredinskih faktora uslovljenih položajem semena na majci biljci i
abiotičkih faktora sredine (Gutterman 2000). U velikom broju slučajeva zabeležena je
promena klijavosti semena uslovljena promenjenim faktorima sredine u toku razvića i
sazrevanja semena na majci biljci (po Gutterman 2000): dužina dana, temperatura,
roditeljsko fototermalno okruženje, kvalitet svetlosti, nadmorska visina. Fener (1991,
1992) je obradio poznate podatke o efektima sredine na veličinu semena. Utvrđeno je i
da, kod mnogih biljnih vrsta, sudbina sledeće generacije ili generacija, bar što se
klijanja semena tiče, zavisi do izvesne mere, od uslova u kojima sazreva seme na majci
biljci (Datta et al. 1972a, b).
Fenotipski uticaj, uključujući i faktore sredine i materinski efekat, tokom
sazrevanja na klijanje semena, osiguravaju da čak i pod optimalnim uslovima, samo
određena »porcija« populacije semena isklija u toku jedne kiše ili čak sezone.
Očigledan
je
značaj
heteroblastičnosti
sa
stanovišta
preživljavanja
vrsta
dispergovanjem klijanja u vremenu i prostoru. Glavno pitanje je da li je to generalni
biohemijski put, ili su to (kod različitih biljnih vrsta) različiti biohemijski putevi (na
odgovarajućem stadijumu sazrevanja) na koje utiču položaj semena na majci biljci i/ili
efekti spoljašnje sredine koji određuju rezlike u klijavosti semena. Može se samo
spekulisati da tokom sazrevanja semena različiti faktori utiču na akumulaciju različitih
relativnih količina materija koje su kasnije uključene u proces klijanja, i da mogu
delovati kroz 3 glavna puta (Gutterman 2000):
18
1. Mogu da dovode do razvića semenog omotača sa različitim stepenom
permeabilnosti, u skladu sa dužinom dana.
2. Te materije mogu uzrokovati akumulaciju inhibitora klijanja u plodu, kao što je
uočeno kod paradajza i nekih drugih plodova.
3. Te materije mogu biti hormoni, na pr. etilen. Takođe i enzimi i druge materije
koje se akumuliraju u embrionima u različitim relativnim količinama u zavisnosti
od uslova sredine pod kojima semena sazrevaju, mogu uticati na klijanje.
Kod nekih vrsta Papilionaceae, dužina dana u vreme sazrevanja semena utiče na
propustljivost semenog omotača za vodu. Takođe je utvrđeno da se efekat dužine dana
transferuje iz listova do semena i utiče na razviće semenog omotača. Biohemija ovog
procesa, nije do sada otkrivena (Gutterman 2000).
Kod nekih biljnih vrsta, efekat faktora sredine, kao što je dužina dana, je različit na
cvetanje i na klijanje. Otuda je moguće da regulacija cvetanja i regulacija klijanja
uključuju različite biohemijske puteve, bez obzira da li su u pitanju biljke sa ili bez
određenih fotoperiodskih zahteva za cvetanje (Gutterman 2000).
1.5. NO signali kod biljaka
U skorije vreme, utvrđeno je da je azot monoksid (NO) ključni signalni molekul
kod biljaka (Neill et al. 2003). NO je mali gasoviti molekul rastvoran u vodi i mastima,
koji se poslednjih godina pokazao kao glavni signalni molekul “drevnog” porekla i svuda
prisutan (Durner et al. 1999). NO je gasoviti slobodni radikal, i može postojati u tri
interkonvertibilna oblika: slobodni radikal (NO), nitrozonium katjon (NO+), nitroxil anion
(NO-) (Stamler et al. 1992, Wojtaszek 2000).
Jednom produkovan, NO može da se kreće iz jedne ćelije u drugu ili između
ćelija. Kao reaktivni slobodni radikal, ima relativno kratko vreme poluživota, reda
veličine nekoliko sekundi (Neill et al. 2003). Brzo reaguje sa O2 dajući NO2, i brzo
degraduje do nitrita i nitrata u vodenom rastvoru, pa je opseg njegovog efekta
ograničen na ćelije u kojima je nastao ili ćelije u neposrednoj blizini. Da bi signalni
molekul bio efikasan, potrebno je da se brzo produkuje po potrebi, da indukuje
definisane efekte u ćeliji, i da brzo i efikasno bude uklonjen kada više nije potreban.
Nekoliko je potencijalnih izvora NO u biljkama i izgleda da je fiziološki značaj
19
svakog od njih za produkciju NO zavistan od vrste, ćelija odnosno tkiva, uslova pod
kojima se biljka gaji. Postoje dokazi da se produkcija NO kod biljaka odvija preko
enzima sličnih NO-sintetazi, nitrat-reduktazi, ili neenzimskih izvora (Neill et al. 2003).
1.5.1. Biologija NO – eksperimentalni pristupi
Egzogena primena NO kod biljaka i indukcija odgovora, naravno, sama po sebi
ne dokazuje da endogeni NO kontroliše određeni razvojni ili fiziološki proces koji se
proučava. NO se primenjuje na biljke i većinu organizama preko NO-donora, molekula
koji će osloboditi NO, nekada tek pošto su uneti u ćeliju. Ovaj pristup je tehnički
jednostavan u poređenju sa primenom gasa. Korišćeni su različiti NO donori, najčešće
natrijum nitroprusid (Stamler et al. 1992). Efekat donora može biti poništen primenom
uklanjača NO, na pr. PTIO (2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolin-1oksil 3-oksid) ili cPTIO
(2-(4-karboksifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolin-1-oksil-3-oxide) (Neill et al. 2003).
1.5.2. Demonstracija i kvantifikacija NO
Idealno bi bilo da se NO pouzdano može kvantifikovati na svom mestu delovanja
u ćeliji. Zapravo, NO kvantifikacija je problematična iz više razloga. Slično kao merenje
etilena, NO emisija iz biljaka moze biti praćena gasnom hromatografijom i masenom
spektrometrijom, hemiluminescencijom i korišćenjem fotoakustične spektroskopije (Neill
et al. 2003), EPR spektroskopije (Pagnussat et al. 2002).
Razvijene su NO-senzitivne fluorofore, kao sto je DAF-2DA, ćelijski permeabilni
molekul koji ne fluorescira dok se ne veže za NO pa se može primeniti za utvrđivanje
relativnog intraćelijskog sadržaja NO, korišćenjem fluorescentnog i konfokalnog
mikroskopa. Iako DAF-2DA ne reaguje sa ROS, ima dokaza o nespecifičnoj
fluorescenciji (Kojima et al. 1998).
1.5.3. Uloga NO u rastenju i razviću
Poznato je da biljke emituju NO pod normalnim uslovima rastenja. Međutim, NO
20
može da se akumulira u atmosferi iz različitih izvora, uključujući i industrijsko zagađenje
(Wildt et al. 1997). Štetni efekti NO na fotosintezu su primećeni pre više godina, da bi
zatim bilo uočeno da su efekti NO na rastenje koncentraciono zavisni (Anderson and
Mansfield 1979). Visoke doze (40-80 pphm) inhibiraju rastenje paradajza, dok ga niske
(0-20 pphm) ubrzavaju, što je potvrđeno i za zelenu salatu (Hufton et al. 1996) i grašak
(Leshem and Haramaty 1996).
NO donori su inhibirali rastenje hipokotila i stimulirali de-etiolaciju i povećanje
hlorofila kod krompira, salate i Arabidopsis-a (Beligni and Lamatina 2000). NO je
takođe povećavao sadržaj hlorofila u listovima graška, posebno u stominim ćelijama
zatvaračicama (Leshem et al. 1997). Ima pokazatelja da NO može imati anti-retencione
karakteristike, inhibicijom sinteze etilena (Leshem and Haramaty 1996).
Sazrevanje plodova je proces vezan za starenje promovisan etilenom, koji može
biti zaustavljen NO-om. Pojačana produkcija tokom sazrevanja plodova kao što su
banana i jagoda koincidira sa smanjenom emisijom NO-a. Osim toga, primena NO kod
povrća i voća, takođe odlaže senescenciju i produžava njihov život posle branja
(Leshem and Pinchasov 2000).
NO može da stimulira klijanje semena kod različitih biljnih vrsta. Primena NO
donora ukida dormanciju semena salate, što se poništava u prisustvu PTIO (Beligni
and Lamatina 2000). Efekat NO može objasniti i klijanje dormantnih semena izazvano
dimom koji sadrži azotne okside. Giba i saradnici (1998) su koristili različite NO donore
i odgovarajuće neaktivne komponente da pokažu da je klijanje Paulownia tomentosa
kontrolisano fitohromom, regulisano preko NO. Tako, efekat nitrita (a otuda i NO) na
klijanje ukazuje da je nivo nitrita u zemljištu, faktor koji određuje klijanje semena (po
Neill et al. 2003).
Najnovija istraživanja su, korišćenjem donora CN- (KCN, K3[Fe(CN)6] i
K4Fe(CN)6) pokazala (Bethke et al. 2006) da verovatno i SNP (oslobađanjem CN, a ne
NO) podiže nivo NO u tkivu, tako što inhibira katabolizam NO vezivanjem za citohrom c
oksidazu (enzim odgovoran za metabolizam NO).
Uloga NO utvrđena je i u razviću korena krastavca (Pagnusat et al. 2002).
Tretiranje klijanaca Arabidopsis-a, donorom NO (SNP), ubrzavalo je vegetativni rast, i
odlagalo cvetanje (He et al. 2004) i pokazano je da NO utiče na ekspresiju gena koji
kontrolišu tranziciju u cvetanje.
21
1.5.4. NO i hormoni
U nekim slučajevima NO učestvuje u biološkim procesima koje prvenstveno
kontrolišu signalni molekuli kao što su biljni hormoni (Neill et al. 2003). Hormoni mogu
biti transportovani sa jednog mesta na drugo i tamo indukovati NO sintezu. Takođe,
osetljivost na hormone može se menjati u različitim fazama razvića, ili kao odgovor na
stimulus iz spoljanje sredine, tako da je ćelijama potrebno da budu kompetentne da
odgovore na hormon putem NO sinteze. U oba slučaja, NO sinteza može biti
ograničena na određene target ćelije.
Citokinini indukuju NO sintezu kod kultura ćelija duvana, peršuna i Arabidopsis-a
(Tun et al. 2001). Pokazano je da NO učestvuje u ABA-indukovanom zatvaranju stoma
(Schroeder et al. 2001). Utvrđeno je da je auksinom indukovana sinteza NO u
korenovima krastavca (Pagnusat et al. 2002). He i saradnici (2004) su ukazali da bi NO
mogao da funkcioniše paralelno sa GA u regulaciji cvetanja Arabidopsis thaliana.
1.6. Giberelini
Pokazano je da se giberelini nalaze u svim nižim i višim biljkama. Sinteza
giberelina se u biljkama odvija u tkivima koja rastu, kao što su apikalni delovi stabla,
mladi listovi, korenovi, nezrela semena i plodovi. Naročito su semena mnogih biljaka
aktivna u sintezi giberelina. Sa mesta sinteze, giberelini se transportuju kroz biljku u
svim pravcima, iz korena – transpiracionim tokom, a iz apikalnih delova – floemom.
Giberelini, kao sastavni deo hormonskog kompleksa, ućestvuju u gotovo svim
razvojnim
procesima
u
biljci:
klijanje
semena,
izduživanje
stabla,
cvetanje,
determinacija pola, rastenje plodova, mirovanje pupoljaka. Efekti po kojima su
najprepoznatljiviji su stimulacija izduživanja stabla i specifičan efekat na sintezu enzima
koji hidrolizuju skrob pri klijanju semena žita (Nešković et al. 2003).
Poznato je ga egzogena primena giberelina može da ukine dormanciju
dormantnih semena, a takođe i da utiče na stimulaciju klijanja nedormantnih (Bewley
and Black 1982). Istovremeno, klijanje fotoblastičnih semena koje je pod kontrolom
fitohroma, dešava se preko stimulacije sinteze giberelina i njihovog oslobađanja iz
22
vezanih oblika. U intaktnom semenu, giberelini iz embriona se transportuju u aleuronski
sloj, gde dovode do sinteze α-amilaze i drugih hidrolitičkih enzima, koji u endospermu
hidrolizuju skrob. Produkti hidrolize se, preko skuteluma, vraćaju u embrion koji ih
koristi za rastenje, pre nego što klijanac postane autotrofan.
Giberelini su jedan od osnovnih činilaca u regulaciji rastenja stabla svih biljaka.
Njihov univerzalni efekat je stimulacija izduživanja stabla, posebno kod mutanata sa
skraćenim stablom, kao i u vezi sa cvetanjem dugodnevnih rozetastih biljaka.
Giberelini su predloženi kao deo specifičnog hormonskog kompleksa – florigena,
još sredinom prošlog veka (Chailakhyan 1958). Veliki diverzitet rezultata dobijenih
primenom giberelina u istraživanjima vezanim za cvetanje, Evans i saradnici (1994) su
objasnili različitom osetljivošću različitih biljnih vrsta na različite gibereline, primenjene u
odgovarajuće vreme i u kombinaciji sa odgovarajućim uslovima gajenja. Pretpostavili
su da postoje različiti giberelinski receptori u apeksu za izduživanje stabla i za rane
događaje vezane za tranziciju u cvetanje. Genetičke analize kontrole cvetanja
dugodnevne biljke Arabidopsis thaliana, u poslednjih 15-tak godina, omogućavaju
svrstavanje gena koji učestvuju u kontroli cvetanja u 4 promotivna puta: fotoperiodski,
autonomni, vernalizacijski i giberelinski put (Simpson and Dean 2002, Corbesier and
Coupland 2005).
23
2. Cilj rada
1. Praćenje aktivnosti antioksidativnih sistema u toku vegetativne i reproduktivne
faze razvića Chenopodium rubrum in vitro.

Praćenje aktivnosti antioksidativnih sistema u toku klijanja semena.

Utvrđivanje antioksidativnog statusa semena različite starosti, i praćenje efekta
starosti semena na klijanje, rastenje i razviće.

Utvrđivanje aktivnosti antioksidativnih enzima i ukupne antioksidativne aktivnosti
u različitim fazama vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro.
2. Praćenje efekta različitih fotoperioda tokom vegetativnog i reproduktivnog
razvića C. rubrum in vitro.

Ispitivanje materinskog efekta fotoperioda na klijanje, rastenje i cvetanje.

Analiza proteina semena u zavisnosti od fotoperioda na kojima su gajene majke
biljke.
3. Ispitivanje efekta SNP i KCN u različitim fazama vegetativnog i reproduktivnog
razvića C. rubrum in vitro, s ciljem da se utvrdi potencijalna uloga NO u ovim
procesima.

Ispitivanje efekta SNP, KCN, cPTIO, GA3 na klijanje, rastenje, cvetanje i
donošenje semena C. rubrum in vitro.
24
3. Materijal i metode
3.1. Gajenje biljaka Chenopodium rubrum
u cilju dobijanja semena
Originalno poreklo semena Chenopodium rubrum L., ecotype 184 je laboratorija
profesora Cumminga (Cumming 1959), a dobijeno je iz Instituta za botaniku u
Frajburgu (1984). Od tada se biljke gaje u stakleniku Instituta za biološka istraživanja
“Siniša Stanković”, kao i u kulturi in vitro, u Laboratoriji za kulturu biljnih ćelija, tkiva i
organa. Biljke su u cilju dobijanja semena, u stakleniku gajene u različitim sezonama
(proleće/leto, jesen/zima), a u kulturi in vitro na 16h/8h fotoperiodu.
Slika M1: C. rubrum a) biljke stare 3 meseca gajene u staklari tokom leta, b)
biljke stare 3 meseca gajene u staklari tokom zime, biljke gajene in vitro na 16h/8h
fotoperiodu stare 68 dana.
a)
c)
b)
Zrelo seme je mehanički čišćeno od pleve prosejavanjem kroz sita različite
gustine. Seme je, do korišćenja, čuvano u frižideru, na temperaturi od 8 ºC.
25
3.2. Isklijavanje semena
Sterilizacija semena:
-Sterilizacija suvog semena u Na-hipohloritu (4 %), 2 minuta,
-Ispiranje sterilnom destilovanom vodom kroz sterilni levak sa filter papirom,
-Prenošenje semena na jednoslojni filter papir u sterilne Petri kutije.
Isklijavanje je vršeno na jednoslojnom filter papiru, u petri kutijama, sa po 5 ml:
-destilovane vode
-rastvora GA3
(160 M, 15 mM)
- rastvora SNP
(10, 50, 100, 150, 200 M)
- rastvora KCN
(10, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 M)
- rastvora cPTIO
(100, 200 μM)
Tabela M1: Isklijavanje semena je vršeno smenom temperaturno/svetlosnog
režima:
Vreme (h)
24 h
24 h
24 h
24 h
24 h
24 h
24 h
t (C)
Svetlost/Mrak
32 C
10 C
32 C
Mrak
Svetlost
Određivanje procenta klijanja vršeno je na uzorcima od po 50 ili 100 semena, a
kao kriterijum je korišćena dužina radikule veća od 2 mm (Schopfer and Plachy 1984).
26
3.3. Gajenje biljaka in vitro
Isklijale biljčice (4 dana stare), sa potpuno razvijenim kotiledonima, postavljane
su na hranljive podloge i gajene pod različitim fotoperiodskim režimima 15, 65, ili 68
dana.
3.3.1. Hranljive podloge:
Podloge za gajenje biljaka sadržale su MS mineralni rastvor (Murashige and
Skoog 1962), saharozu (5%), agar (0.7 %), inozitol (100 mg/l). pH podloge je
podešavan na 5.7 pre sterilizacije.
Tabela M2:
Makroelementi (mg/l)
Mikroelementi (mg/l)
NH4NO3
1650
MnSO4 x 4 H2O
22.3
KNO3
1900
ZnSO4 x 7 H2O
8.6
CaCl2 x 2H2O
440
H3BO3
6.2
MgSO4 x 7H2O
370
KJ
0.83
KH2PO4
170
Na2MoO4
0.25
CuSO4 x 5 H2O
0.025
CoCl2 x 6 H2O
0.025
Na2FeEDTA x 2 H2O
37.2
FeSO4 x 7 H2O
27.8
Vitamin B1
0.1
Vitamin B6
0.5
Nikotinska kiselina
0.5
Glicin
2.0
U različitim eksperimentima su korišćeni:
- giberelna kiselina (GA3)
(3 mM, 15mM, 30 mM)
- natrijum nitroprusid (SNP)
(10, 50, 100, 150 M)
27
- kalijum cijanid (KCN)
(10, 50, 100, 200,1000 μM)
- karboksi PTIO (cPTIO)
(50, 100, 200 μM)
3.3.2. Različiti fotoperiodski režimi na kojima su gajene
biljke C. rubrum in vitro
1. 17 dana kontinualna svtlost (KS) (24h svetlost + 48 dana 14h/10h fotoperiod
2. 65 dana 14h/10h fotoperiod
3. 68 dana KS
4. 68 dana neprekidni mrak (24h mrak)
5. 6 dana 8h/16h fotoperiod + 62 dana 16h/8h fotoperiod
6. 6 dana 14h/10h fotoperiod + 62 dana 16h/8h fotoperiod
7. 68 dana 8h/16h fotoperiod
8. 68 dana 14h/10h fotoperiod
9. 68 dana 16h/8h fotoperiod
10. 15 dana 14h/10h fotoperiod
11. 6 dana 14h/10h fotoperiod + 9 dana 18h/6h fotoperiod.
3.3.3. Praćenje rastenja, cvetanja i sazrevanja semena
Parametri:
-
merena je visina biljaka,
-
određivan je broj listova,
-
određivano je cvetanje (kao kriterijum za cvetanje korišćen je potpuno
formiran cvet),
-
određivan je broj biljaka sa sazrelim semenima,
-
određivan je broj zrelih semena, i njihova masa nakon mesec dana sušenja,
-
određivan je procenat klijanja dobijenih semena.
28
3.4. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima
3.4.1. Ekstrakcije
Analizirani su semena, klijanci, i nadzemni deo biljke i koren. Uzorci su
zamrzavani u tečnom azotu, i cuvani na – 70 C, do pocetka ekstrakcija. Cela samena
i/ili /klijanci (dobijeni od 0.05 – 0.5 g suvog semena po uzorku), ili cele biljke bez korena
(0.2g) su sprašivani u tecnom azotu. Zaleđeni prah je dodavan u 2cm3 ekstrakcionog
pufera (0.25 M saharoza, 0.05 M Tris i 1 mM EDTA, pH 7.4). Posle centrifugiranja (15
min na 900 g), supernatant je korišćen za određivane aktivnosti POD, SOD i CAT, kao i
za merenje glutationa.
3.4.2. Određivanje aktivnosti superoksid dismutaza (SOD)
SOD aktivnost je određivana spektrofotometrijski:
a) po Misra and Fridowich (1972): merenjem procenta SOD-indukovane
inhibicije autooksidacije adrenalina na baznom pH, u ukupnoj zapremini od 3 cm3.
Rastvor adrenalina (0.3 mM adrenalina u 0.1M HCl) je pripreman pred merenje. Radna
mešavina: 0.05 M natrijum karbonatnog pufera pH 10.2, 0.1 mM EDTA, 0.1 cm3
rastvora adrenalina i različite količine enzima. Autooksidacija adrenalina je praćena
pomoću spektrofotometra Shimadzu UV’160 (Kyoto, Japan) na 480nm, tokom 10 min
na 26 - 30 C.
b) po McCord and Fridovich (1969) – Citohrom c test: na 550nm, 5min pri 25 C.
Pufer: 50mM kalijum fosfatni pufer pH7.8, 1mM EDTA, 0.02mM NaN3. Elucioni pufer:
kalijum fosfatni pufer pH 7.0 (100 mM). Ksantin 0.5mM (100 μl) + citohrom c 200mM
(50 μl) + ksantin oksidaza (11 μl/ml pufera) (50 μl) + ekstrakt, merenje apsorbancije na
na 550nm, 5min pri 25 C.
3.4.3. Određivanje aktivnosti peroksidaza (POD)
POD aktivnost je određivana spektrofotometrijski (na 470 nm) sa gvajakolom
29
kao supstratom u ukupnoj zapremini od 3 cm3. Radni rastvor je sadržao 50 mM
acetatni pufer pH 5.5, 92 mM gvajakol, 18 mM H2O2 i različite količine enzima.
Aktivnost je izračunavan iz ekstincionog koeficijenta za gvajakol 25.5 mM-1cm-1.
Izoelektro fokusiranje solubilnih POD: Solubilni POD izoenzimi su razdvajani
na pH gradijentu od 3 do 9 (korišćenjem 3% rastvora amfolita) na 7.5%
poliakrilamidnom gelu. Izoenzimi su bojeni na gelu sa 0.03 mM 4-hloro-1-naftol i 5 mM
H2O2 u Na-acetatnom puferu pH 5.5 10 min na 25 C.
3.4.4. Određivanje aktivnosti katalaze (CAT)
CAT aktivnost je određivana:
a) korišćenjem Clark polarografske elektrode na 28 C. Ekstrakt semena (0.2
cm3) je dodavan u 0.96 cm3 0.1 M Tris pH7.6 i oslobađanje kiseonika je inicirano sa
0.02 cm3 0.1 M H2O2. Stepen oslobađanja O2 je izračunavan i izražavan kao količina
oslobođenog O2 po minutu i mg proteina.
b) spektrofotometrijski na 240 nm, jedinica (U) definisana kao količina enzima
koja razlaže 1 μmol H2O2 po minuti na 25 C i pH 7.0.
U zapreminu od 3 ml u 100 mM kalijum natrijum fosfatnom pufer pH 7.0 dodaje
se H2O2 da absorbancija bude 0.850 nm, od 10 – 50 μl uzorka i meri se smanjenje
absorbancije na 240nm. Ekstincioni koeficijent za peroksid je 4.32 μM -1cm-1.
30
3.5. Određivanje koncentracije proteina
Koncentracija proteina je određivana
a) Bradford metodom (1976) sa goveđim serum albuminom kao standardom.
Rastvori:
1. Koncentrovana boja, Comassie brilliant blue G-250 (CBB G-250):
CBB G-250
(100 mg)
95% etanol
(50 ml)
H3PO4
(100 ml)
H2O
(do 200 ml)
2. Bradford-ov reagens:
Rastvor 1.
(100 ml)
H2O
(do 500 ml)
Reakciona smesa: 100 μl uzorka rastvorenog u puferu + 5 ml rastvora 2., stoji 5
min. Meri se absorbancija na 595 nm. Standardna prava se pravi sa BSA.
b) Modifikovanom metodom po Lowry et al. (1951):
100 μl ekstrakta se istaloži sa 10 μl 72 % TCA (15 mim), centrifugira se
20 min 10000g, talog se rastvara u 100 μl 0.8 M NaOH.
Lowry rastvor:
1. 2% rastvor Na2CO3 u 0.1 M NaOH
(98 ml)
2. 1% rastvor CuSO4 x 5H2O
(1 ml)
3. 2% rastvor KNa tartarat
(1 ml)
Reakciona smeša: 150 μl Lory rastvora + 10 μl uzorka rastvorenog u NaOH (15
min) + 30 μl folin-ciocaltenovog reagensa (1x razblaženog) (30 min). Merena je
absorbancija na 260 nm. Standardna kriva je rađena sa BSA.
3.6. Razdvajanje proteina
Razdvajanje proteina vršeno je natrijum dodecilsulfat poliakrilamid gel
elektroforezom (SDS-PAGE) po Laemmli – ju (1970):
Analiziran je sastav proteina semena (0.03 g suvih semena, imbibovanih u
mraku 2.5h).
31
Ekstrakcioni pufer: 0.25 M saharoza, 0.05 M Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4).
10% akrilamidni gel za razdvajanje (1.5 M Tris HCl pH 8.8, 30% akrilamid, 10%
SDS, 10% amonium persulfat, TEMED).
4% gel za koncentrovanje (1 M Tris-HCl, pH 6.8, 30% akrilamid, 10% SDS, 10%
amonium persulfat, TEMED).
Pufer za elektroforezu: 0.025 M Tris, 0.192 M Gly, 0.1 % SDS pH 8.3.
Pufer za obradu uzorka: 0.0625 M Tris HCl pH 6.8, 10% glicerol, 2% SDS,
0.002% brom fenol plavo, 5% β-ME.
Rastvor boje: 0.1% CBB G-250, 50% metanol, 10% sircetna kiselina.
Rastvor za obezbojavanje gela: 5% metanol, 7% sircetna kiselina.
Relativna vrednost intenziteta traka, određivana je softverskim paketom Image
Master Totallab verzija 1.11.
3.7. Glutation
Glutation je određivan po Griffith-u (1980). Ekstrakt semena je mešan sa duplom
zapreminom 5% 5-sulfosalicilne kiseline i centrifugiran 10 min na 2500 g. Pripremana
su 3 radna rastvora u puferu (125 mM kalijum fosfata, 6.3 mM EDTA, pH 7.5).
Rastvor 1. - 0.3 mM NADPH
Rastvor 2. – 6 mM 5.5-ditio-bis (2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB)
Rastvor 3. - 5 V/cm3 glutation reduktaze.
Za određivane ukupnog glutationa, mešani su 0.7 cm3 rastvora 1., 0.1 cm3
rastvora 2. i 0.2 cm3 ekstrakta. Reakcija je započinjana sa 0.01 cm3 rastvora 3., i
pećena na 30 C merenjem promena absorbancije na 412 nm tokom 2 min. Oksidovani
glutation (GSSG) je određivan derivatizacijom tiol grupe u redukovanom glutationu
(GSH) sa 2-vinilpiridinom u slabo kiselom rastvoru. GSH je određivan preko razlike dve
vrednosti.
3.8. Askorbat (AA) i dehidroaskorbat (DHA)
32
Cela semena i/ili klijanci su zamrzavani u tečnom azotu i ekstrahovani u 1 cm3
5% perhlorne kiseline. Homogenat je centrifugiran 10 min na 12000g i supernatant je
neutralisan sa 5 M kalijum karbonata do pH 5.6. Posle centrifugiranja 2 min na 12000
g, u ekstraktu je mereno opadanje absorbancije na 265 nm (Hewitt and Dickes 1961)
po dodavanju askorbat oksidaze (1U) iz Cucurbita-e (Sigma, St louis, USA) u mešavinu
koja sadrži 0.1 M kalijum fosfatni pufer (pH 5.6) i ekstrakt u ukupnoj zapremini od 3
cm3. DHA je meren kao AA posle redukcije ditiotreitolom (DTT). Reakcija je
započinjana dodavanjem 0.02 cm3 1 mM DTT u mešavinu (0.15 M kalijum fosfatni
pufer pH 7.6 i ekstrakt u ukupnoj zapremini od 3 cm3). AA i DHA koncentracije su
izračunavane korišćenjem koeficijenta absorbancije za askorbat na 262 nm (14.3 mmol1
cm-1).
3.9. ABTS – test
Korišćena je metoda po Arnao et al. (1999). Reakciona smesa sadržala je 2mM
ABTS, 15 M vodonik peroksida i 0.25 M HRP u 50 mM fosfatnog pufera (pH 7.5) u
ukupnoj zapremini 1 ml, na temperaturi od 24 - 26 C. Reakcija je praćena na 730 nm,
na UV 2501 PC Shimadzu spektrofotometru do stabilizovanja absorbancije, dobijene
formiranjem ABTS radikala. Tada su dodavane različite količine L-askorbinske kiseline,
ili drugih antioksidanasa, i određivano je smanjenje absorbancije, u vremenu od 130
sekundi, uključujući generisanje ABTS radikala izazvanog peroksidazom. Ukupna
antioksidativna aktivnost je izračunavana kao koncentracija, izražena u ekvivalentima
askorbinske kiseline (mol/l) (standard), koja proizvodi isti antioksidativni efekat kao
ispitivani uzorak.
Korišćena je peroksidaza iz rena (HRP). Koncentracija enzima je određivana
merenjem absorbancije na 430 nm ( = 100 mM-1cm-1). Koncentracija ABTS (2,2azino-bis-(3-etil-benztiazolin-6-sulfonic acid), određivana je na osnovu ekstinkcionog
koeficijenta 
340nm
= 36 mM-1cm-1, a vodonik peroksida 
askorbinske kiseline  340nm = 2.8 mM-1cm-1.
33
340nm
= 43.6 mM-1cm-1 i L-
3.10. Statistička obrada podataka
Dobijeni rezultati analizirani su statističko-grafičkim paketom STATGRAPHICS,
verzija 4.2 (STSC Inc. and
Statistical Graphics Corporation, 1985 -1989, USA),
analizom varijanse, procedura ANOVA, uz „multiple range“ testove bazirane na
confidens limitima, na nivou značajnosti p<0.05, ili neparametarskim Mann-Whitney
rang testom iz programskog paketa Axum 5.0 (version for Windows, Lucent
Technologies, USA). Grafička obrada podataka je delimično urađena i korišćenjem
programa Excel iz programskog paketa Microsoft Office 2003.
34
4. Rezultati i diskusija
4.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema u toku
vegetativne i reproduktivne faze razvića
C. rubrum in vitro
Kao što je u uvodu pomenuto, neprekidna produkcija i uklanjanje reaktivnih vrsta
kiseonika (ROS) je, osim kao pojava sa negativnim posledicama (oštećenja ćelijskih
membrana i organela), povezana i sa signalnom ulogom u procesima rastenja i razvića
biljaka (Elstner 1982, Hendry and Crawford 1994). Antioksidativni enzimi, katalaza
(CAT), superoksid dismutaze (SOD) i peroksidaze (POD), učestvuju u uklanjaju
superoksid radikala (O2-) odnosno vodonik peroksida (H2O2) (Van Loon 1986, Bowler et
al. 1992, Khan and Panda 2002), čime učestvuju u regulaciji procesa u toku rastenja i
razvića biljaka ili odgovora na patogene ili abiotički stres. Uloge CAT, SOD i POD
potvrđene su u svim fazama razvića biljaka, od sušenja semena, preko klijanja, do
rastenja i razvića. U uklanjanje H2O2 uključen je i oksido-redukcioni sistem
antioksidativnih metabolita, askorbat i glutation (Asada 2006).
4.1.1. Aktivnosti antioksidativnih sistema tokom
klijanja semena C. rubrum
Klijanje semena započinje imbibicijom, a završava se početkom izduživanja
embrionove osovine, najčešće radikule. U fiziološkom smislu, može se podeliti u tri
faze: imbibiciju (brzo inicijalno usvajanje vode, kao fizički proces karakterističan i za
suva semena), plato fazu (koja podrazumeva male promene sadržaja vode, ali visoku
metaboličku aktivnost) i fazu daljeg povećavanja sadržaja vode i istovremeno probijanje
radikule i rastenje (Giba et al. 2004). Plato faza, kao najznačajnija sa stanovišta
35
regulacije klijanja, uključuje aktivaciju specifičnih enzima u odgovarajuće vreme i
regulaciju njihove aktivnosti (Roberts 1972, Riley 1987).
4.1.1.1. Klijanje semena C. rubrum
Pratili smo klijanje do 4. dana, što predstavlja prvi plato na sigmoidalnoj krivoj
klijanja ovih semena (semena sakupljena sa biljaka gajenih tokom leta, stara 3 godine)
tj. obuhvata deo populacije semena koja najranije klijaju. Do probijanja radikule došlo je
trećeg dana od početka imbibicije, da bi 4. dana klijalo 34% semena.
1
100
2
3
4
5
6
7
8
10
H2O
90
10
GA3
9
80
8
70
Klijanje (%)
Grafikon R1: Efekat GA3
(160 M) na početne faze
klijanja semena C. rubrum;
* - zvezdicom označene
statistički značajne razlike
(p<0.05) procenta klijanja u
odnosu na klijanje u vodi trećeg
dana.
9
7
60
6
50
*
5
40
*
30
4
3
20
2
10
1
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
GA3 (160 M) inhibira klijanje, ali ne značajno (grafikon R1). Kod semena nekih
drugih biljaka (Satureja montana, Potosporum eugenoides, P. tenuifolium, P.
crassifolium), GA3 u istoj koncentraciji, nije imao efekta na klijanje (Moore et al. 1994,
Boscagli and Sette 2001).
4.1.1.2. Aktivnosti CAT, POD i SOD tokom klijanja semena C. rubrum
Sadržaj proteina (grafikon R2), kao i aktivnost CAT, SOD i POD (grafikon R3),
varirali su na sličan način kod semena isklijavanih na vodi i u rastvoru GA3.
36
Koncentracija proteina je rasla tokom imbibicije u destilovanoj vodi, s obzirom da
se proteini u klijajućim semenima sintetišu de novo, kao gradivni i regulatorni materijal
(Roberts 1972). Izoelektroforegram ukupnih proteina takođe pokazuje porast kako
kiselih tako i baznih proteina tokom klijanja (Slika R1), s tim što je promena izraženija
kod kiselih. Trake sa pI oko 4 i 8.8 su prisutne tokom čitavog praćenog perioda, dok se
4. dana klijanja broj proteinskih traka povećava i kod tretiranih i netretiranih
Grafikon R2: Sadržaj
proteina tokom klijanja
C. rubrum u destilovanoj H2O ili
GA3 (160 M);
* - zvezdicom označene
statistički značajne razlike
(p<0.05) u odnosu na klijanje u
vodi prvog dana, o – kružićem
označene statistički značajne
razlike (p<0.05) u odnosu na
klijanje u destilovanoj vodi istog
dana.
Koncentracija proteina [mg g-1 (d.w.)]
semena/klijanaca. Nove trake se pojavljuju između pI 4.6 i 5.1.
14
1
2
3
4
5
6
7
8
H2O
GA3
12
9
10
10
*
*
9
8
10
7
8
6
5
6
4
4
3
2
2
o
1
0
1
2
3
4
Klijanje (dani)
Kod kontrolnih semena nije bilo značajnog variranja aktivnosti CAT (grafikon R3
a) tokom klijanja, dok je aktivnost SOD opadala (grafikon R3 b). POD aktivnost nije bilo
moguće detektovati spektrofotometrijski tokom prva 2 dana imbibicije (grafikon R3 c).
Izmerena je 3. dana, da bi četvrtog dana došlo do značajnog povećanja POD aktivnosti
kod obe grupe semena (klijalih u vodi i rastvoru GA).
Na zimogramu solubilnih POD, detektiovani su i anjonski i katjonski izoenzimi. Iz
grupe anjonskih POD, izoenzim sa pI vrednošću oko 4, prisutan je tokom sva 4 dana
imbibicije, dok se dva izoenzima sa pI vrednostima oko 4.6 javljaju tek 4. dana.
Katjonski izoenzim sa pI vrednošću oko 8.5 je prisutan sve vreme, dok se izoenzim sa
pI vrednošću oko 8.8 pojavljuje, takođe, 4. dana (Slika R1). Nije uočena razlika između
POD zimograma semena imbibovanih na destilovanoj vodi i onih u rastvoru GA3.
Dobijeni rezultati pokazuju da CAT i SOD pikovi prethode POD maksimalnoj
aktivnosti. CAT i SOD pokazuju maksimalnu aktivnost u vreme pred izbijanje radikule
37
(grafikon R3), dok se značajna POD aktivnost uočava posle tog perioda. Gidrol et al.
(1994) je uočio da je pik aktivnosti SOD u ranim fazama imbibicije semena soje praćen
pikovima aktivnosti CAT i POD.
a
*
H2O
o
GA3
25
10
9
8
20
7
6
15
5
4
10
3
2
5
1
0
1400
SOD [U mg-1 protein-1]
Grafikon R3: Aktivnosti
a) CAT,
b) SOD i
c) POD tokom klijanja C. rubrum u
destilovanoj H2O ili GA3 (160 M);
* - zvezdicom označene statistički
značajne razlike (p<0.05) u odnosu
na prvi dan, o – kružićem
označene statistički značajne
razlike (p<0.05) u odnosu na
klijanje u destilovanoj vodi istog
dana, za grafikon pod c) * zvezdicom označena značajna
razlika (p<0.05) u odnosu na 3.
dan.
CAT [U mg-1 protein-1]
30
*
b
o
1200
1000
800
600
400
200
*
*
POD [U mg-1 protein-1 ]
0
c
0.5
*
*
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1
2
3
4
Klijanje (dani)
Aktivnost POD pokazuje različitu kinetiku u toku klijanja semena C.rubrum, u
poređenju sa CAT i SOD (grafikon R3). Iako POD aktivnost nije mogla biti detektovana
spektofotometrijski tokom prva dva dana imbibicije, jedan kiseli i jedan bazni izoenzim
38
je detektovan na zimogromu tokom čitavog perioda klijanja (slika R1 b), zbog veće
osetljivosti ovog metoda u odnosu na spektrofotometrijski metod. Značajno povećanje
aktivnosti POD 4. dana klijanja (grafikon R3 c) odgovara ekspresiji novih izoenzima na
zimogramu (slika R1 b).
Morohashi (2002) je pokazao da se POD aktivnost u semenu paradajza javlja
neposredno pred izbijanje radikule, i značajno raste posle toga. Mitchell and Barrett
(2000) su pronašli 3 tipa POD na zimogramu semena/klijanaca Viola carnuta, koji su se
postepeno pojavljivali tokom klijanja. Schopfer i saradnici (2001), su pokazali da se
tokom klijanja semena rotkve, POD aktivnost javlja sa pojavom radikule i značajno se
pojačava sa razvićem klijanca. I kod Brassica oleracea (Belani et al. 2002), je
pokazano da se POD aktivnost povećava u kasnijim fazama klijanja i ranim fazama
rastenja klijanaca. I naši rezultati pokazuju da se POD izoenzimi postepeno pojavljuju
tokom klijanja semena C.rubrum, i da je povećanje POD aktivnosti posle probijana
radikule povezano sa de novo produkcijom izoenzima.
Slika R1: Izoelektrofokusiranje proteina a) i peroksidaznih izoenzima b) tokom
klijanja C.rubrum. Svaka traka sadrži 0.02 cm3 ekstrakta. Slika je sastavljena iz
reprezentativnih različitih gelova; (-), (+) – netretirana i GA3 tretirana semena.
4.1.1.3. Koncentracije glutationa i askorbata tokom
klijanja semena C. rubrum
39
U toku prva 2 dana klijanja nije bilo značajnih variranja u koncentracijama GSH,
GSSG i ukupnog glutationa (grafikon R 4), nezavisno od toga da li se klijanje dešavalo
u vodi ili rastvoru GA3. Trećeg dana, došlo je do značajnog porasta sva tri parametra,
praćeno značajnim padom 4. dana (grafikon R4). Preko 80% pula glutationa je prisutno
u redukovanom stanju. Dobijeni rezultati pokazuju da se glutation sistem (grafikon R4)
u klijajućim semenima ponaša drugačije od aktivnosti antioksidativnih enzima (grafikon
R3). Maksimalan sadržaj ukupnog glutationa, kako i njegove oksidovane i redukovane
forme, je izmeren trećeg dana klijanja, kako kod semena klijalih u vodi tako i u rastvoru
GA3, što odgovara vremenu izbijanja radikule.
0.20
a
H2O
*
GA3
*
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
o
0.04
0.02
0.00
GSH [mol g-1 (d.w.)]
1.0
b
*
0.9
*
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
*
0.3
0.2
0.1
0.0
Ukupni glutation [mol g-1 (d.w.)]
Grafikon R4: Sadržaj
a) GSSG,
b) GSH, i
c) ukupnog glutationa, tokom klijanja u
destilovanoj H2O ili GA3 (160 M);
* - zvezdicom označena značajna
razlika (p<0.05) u odnosu na prvi dan,
o – kružićem označena značajna
razlika (p<0.05) u odnosu na klijanje u
destilovanoj vodi istog dana.
GSSG [mol g-1 (d.w.)]
0.18
1.1
c
1.0
*
*
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
1
2
3
Klijanje (dani)
40
4
Tomasi et al. (2001), takođe je uočio povećanje glutationa tokom prva 24h
klijanja semena bora, što je bilo praćeno njegovim padom. Odnos GSSG/GSH može
biti senzitivan indikator stresa (May et al. 1998). Više koncentracije GSH nego GSSG
tokom klijanja C.rubrum predstavlja indikator visokog antioksidativnog kapaciteta.
Grafikon R5: Sadržaj
a) askorbata i
b) dehidroaskorbata tokom klijanja
C. rubrum u destilovanoj H2O ili GA3
(160 M)
Askorbat [mol g-1 (d.w.)]
0.20
H2O
a
GA3
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
Dehidroaskorbat [mol g-1 (d.w.)]
0.00
0.07
b
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
1
2
3
Klijanje (dani)
4
Askorbat je detektovan samo 2. dana klijanja, pred izbijanje radikule. DHA je
prisutan sve vreme posmatranog perioda klijanja (grafikon R5). Ni drugi autori nisu
detektovali AA na početku imbibicije, dok je, u početnim fazama klijanja (Tommasi et al.
2001) i neposredno pred izbijanje radikule (Pallanca i Smirnoff 1999), primećen porast
AA koncentracije.
4.1.1.4. Efekat giberelina na aktivnosti antioksidativnih sistema
tokom klijanja C. rubrum
41
Iako GA3 (160 M) nije imao efekta na klijanje (grafikon R1), pokazivao je efekat
na određene antioksidativne parametre, u određenim fazama klijanja. Značajno
povećanje CAT i SOD aktivnosti (grafikon R3 a, b) i odgovarajući pad sadržaja proteina
(grafikon R2) kod semena imbibovanih u rastvoru GA3, drugog dana imbibicije, može
da ukaže na to da ovaj hormon deluje na metabolizam H2O2 i O2- u vreme pred izbijanje
radikule.
Koncentracija proteina u semenima tretiranim sa GA3, je značajno opadala
drugog dana imbibicije, a rasla je 3. i 4. dana (grafikon R2).
Činjenica da nije bilo razlike u POD izoelektroforetskom uzorku između
semena/klijanaca klijalih na vodi i na GA3, pokazuje da GA3 ne utiče na sintezu novih
POD izoenzima (Slika R1). 160 M GA3, je pomerao vreme pojave maksimalne
aktivnosti POD na vremenskoj skali (grafikon R3 c)
Značajno niža koncentracija GSSG kod semena klijalog na GA3, 4. dana klijanja
(grafikon R4) može biti posledica smanjene produkcije slobodno radikalskih vrsta posle
probijanja radikule. GA3 nije pokazao značajan efekat na glutation sistem (grafikon R4),
dok je indukovao opadanje sadržaja AA (grafikon R5 a) i DHA 2. dana klijanja (grafikon
R5 b).
Nema mnogo podataka koji se odnose na efekat GA3 na metabolizam ROS.
Schopfer et al. (2001) je pokazao da je, u slučaju klijanja rotkve, inhibicija produkcije
ROS izazvana tamno crvenom svetlošću i abscisinskom kiselinom, reverzibilna sa GA3.
Bethke et al. (2000) je objavio da su protoplasti aleuronskog sloja ječma tretirani sa
GA3 manje sposobni da metabolišu ROS, dok je Jones (1986) utvrdio da GA3 stimulira
produkciju peroksida u aleuronskom sloju ječma.
Tabela D1: Sekvencijalna ekspresija antioksidativnih sistema tokom klijanja semena C. rubrum.
Pre izbijanja
U vreme izbijanja
Posle izbijanja
radikule
radikule
radikule
CAT
maksimum aktivnosti
SOD
maksimum aktivnosti
POD
pojava aktivnosti
porast aktivnosti
AA
detektovan
DHA
maksimum aktivnosti
GSH i GSSG
maksimum aktivnosti
42
Tokom klijanja semena C. rubrum dolazi do sekvencijalne ekspresije antioksidativnih sistema
(tabela D1). Pred izbijanje radikule catalaza (CAT), superoksid dismutaze (SOD) i dehidroaskorbat
(DHA) pokazuju maksimalnu aktivnost, a askorbat (AA) je detektovan samo u to vreme. Maksimalan
sadrzaj ukupnog glutationa, kao i redukovane (GSH) i oksidovane forme (GSSG) je izmeren u vreme
izbijanja radikule, kada se javlja i peroksidazna (POD) aktivnost i raste posle tog perioda.
GA3 (160 μM) je suboptimalna za klijanje, indukuje porast aktivnosti CAT i SOD u vreme pred
izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a ne utiče na glutation i POD aktivnost tokom klijanja C.
rubrum.
43
4.1.2. Efekat starosti semena Chenopodium rubrum na
antioksidativni status semena, klijanje, rastenje i cvetanje
Starenje semena je praćeno gubljenjem vijabilnosti (Maguire 1972), tj.
produžavanjem vremena potrebnog za početak klijanja (Villers 1972). To je spoljašnji,
sumarni pokazatelj nagomilanih promena na hromozoma, membranama, proteinima
(time
i
enzimskim
strukturama),
tokom
mirovanja
semena.
Ove
promene
prouzrokovane su reaktivnim vrstama kiseonika (Villers 1972, Murthy and Sun 2000,
Schopfer et al. 2001) i posledica su nemogućnosti reparacionih mehanizama da
funkcionišu u suvom semenu (Villers 1972). Odloženo klijanje kod starih semena može
se tumačiti periodom potrebnim za popravke oštećenja nastalih delovanjem ROS
(Villers 1972). Samo klijanje obuhvata aktivaciju specifičnih enzima u vremenu i
regulaciju njihove aktivnosti (Roberts 1972, Riley 1987). Antioksidativni enzimi, SOD,
POD i CAT, i oksido-redukcioni sistem askorbata i glutationa učestvuju u uklanjaju
aktivnih vrsta kiseonika (Van Loon 1986, Bowler et al. 1992, Khan and Panda 2002).
4.1.2.1. Efekat starosti semena na klijanje C. rubrum
Testirana su semena različite starosti: 3 meseca, 3 godine i 12 godina. Procenat
klijanja sedmog dana nije bio značajno niži (65.5 %) kod 3 godine starog semena u
odnosu na (75 %) kod 3 meseca starog semena (grafikon R6), dok je procenat isklijalih
semena starih 12 godina bio svega 4 %. Međutim, klijanje 3 godine starih C. rubrum
semena je bilo odloženo u odnosu na 3 meseca stara semena (33.5 % u odnosu na 67
%, četvrtog dana od početka imbibicije), što potvrđuje smanjivanje vijabilnosti sa
starenjem semena (Torres et al. 1989, Villers 1972). I kod semena Phaseolus vulgaris
je pokazano da usled starenja dolazi do smanjenog procenta klijanja (Machasdo Neto
et al. 2001).
Efekat giberelina: iako su giberelini (GA3, GA4, GA7), obično efikasni u prekidu
dormancije kod velikog broja vrsta, kao i u stimulaciji klijanja kod nedormantnih semena
(Bewley and Black 1982), mi smo pokazali da na klijanje 3 godine starih semena C.
rubrum 160 M GA3 nema efekta (Dučić et al. 2003/4). I kod nekih drugih biljnih vrsta
44
tretman giberelinom nije imao efekta na klijanje (Moore et al. 1994, Boscali et al. 2001,
Jovanović et al. 2005).
100
90
3 meseca stara semena
80
Klijanje (%)
Grafikon R6 : Efekat starosti
semena na klijanje C.rubrum; * statistički značajno (p<0.05) u odnosu
na semena stara 3 meseca.
70
*
60
3 godine stara semena
50
40
*
*
*
*
*
4
5
6
30
20
12 godina stara semena
10
*
0
0
1
2
3
*
7
8
Vreme (dani)
4.1.2.2. Efekat starosti semena na rastenje i cvetanje C. rubrum
Biljke dobijene od semena starog 3 meseca u poređenju sa onima dobijenom od
semena starog 3 godine, značajno su se razlikovale po svim parametrima rastenja, kao
i cvetanju, posle 15 dana gajenja in vitro na 6(14h/10h) + 9(18h/6h) fotoperiodu.
(grafikon R7). Hipokotili kontrolnih biljaka, poreklom od 3 meseca starog semena, bili
su 2.5 puta duži (grafikon R7 a), dužina prve internodije 8 puta veća (grafikon R7 b),
dok je broj listova bio 2 puta veći (grafikon R7 c), u odnosu na biljke poreklom od 3
godine starih semena. Cvetalo je 81 % biljaka poreklom od 3 meseca starog semena u
odnosu na svega 14 % onih koje potiču od 3 godine starog semena (grafikon R7 d).
Slično je primećeno i kod biljke Phaseolus vulgaris, gde je uočena veliko variranje u
efektu mesečeve svetlosti na cvetanje u različitim eksperimentima u kojima je
korišćeno seme sve veće starosti (Kadman-Zahavi and Peiper 1987).
Efekat giberelina: GA3 ima jači stimulatorni efekat na rastenje i cvetanje biljaka
poreklom od 3 godine starog semena nego na biljke poreklom od 3 meseca starog
semena (grafikon R7). GA3 stimulira izduživanje hipokotila (grafikon R7 a) i prve
internodije (grafikon R7 b), i povećava broj listova (grafikon R7 c) biljaka poreklom od 3
godine starog semena, dok kod biljaka poreklom od 3 meseca starog semena stimulira
samo izduživanje prve internodije, bez efekta na ostale parametre rastenja.
45
18
16
a
3 meseca stara semena
3 godine stara semena
o
o
*
12
8
o
*
o
*
10
*
6
4
2
0
16
b
o
14
1. internodija (mm)
Grafikon R7: Efekat GA3 na
a) dužinu hipokotila,
b) dužinu prve internodije,
c) broj pravih listova,
d) cvetanje, biljaka C.rubrum poreklom
od semena starog 3 meseca i 3 godine ,
gajenih in vitro, na MS podlozi bez
šećera;
° - statistički značajno (p<0.05) u odnosu
na kontrolu, * - statistički značajno
(p<0.05) u odnosu na biljke dobijene od
semena starog 3 meseca.
Hipokotil (mm)
14
12
o
10
o
8
o
*
6
o
*
4
*
*
2
0
5
c
o
*
Broj listova
4
*
3
*
*
2
1
0
100
d
o
Cvetanje (%)
90
o
*
80
70
60
o
*
50
40
*
30
*
20
10
0
0
3
15
30
GA3 (mM )
Takođe je uočeno da je razlika u procentu cvetanja biljaka poreklom od semena
različite starosti (grafikon R7d), značajno manja na podlogama sa GA3. Na podlozi sa
15 mM GA3 cveta 68% biljaka dobijenih od 3 godine starog semena i 94% biljaka
46
dobijene od 3 meseca starog semena. Ranije je pokazano da GA3 stimulira cvetanje,
kako kod C.rubrum (Živanović et al. 1995), tako i kod C.murale (Mitrović et al. 2000).
4.1.2.3. Efekat starosti semena C. rubrum na antioksidativni status semena
Kako smo utvrdili značajne razlike u pogledu klijanja semena različite starosti
(grafikon R6), kao i rastenju i cvetanju biljaka poreklom od tih semena (grafikon R7),
pokušali smo da utvrdimo da li su osnove ovih razlika u vezi sa promenama
antioksdativnog statusa semena izazvanog starenjem.
Aktivnosti SOD, POD, i CAT i određivanje glutationa, vršeno je u uzorcima od po
Grafikon R8: Sadržaj proteina
u semenima C.rubrum različite
starosti, posle 2,5h imbibicije;
* - statistički značajno (p<0.05) u
odnosu na semena stara 3 godine.
Koncentracija proteina [mg/g dw]
0.5 g suvog semena, starog 3 i 12 godina, posle 2.5h imbibicije u destilovanoj vodi.
12
10
8
*
6
4
2
0
3
12
Starost semena (godina)
Sadržaj proteina, kao i CAT i SOD aktivnost, su bili značajno niži u semenima
starim 12 godina, u odnosu na semena stara 3 godine (Grafik R8, R9). Sadržaj proteina
je viši u mlađim semenima, jer se proteini sintetišu de novo tokom imbibicije (Roberts
1972), što ukazuje da su mlađa semena potentnija, odnosno da količina proteina može
biti pokazatelj starosti semena.
POD aktivnost nije detektovana ni kod mladih ni starih semena, što je u skladu
sa ranijim podacima (Dučić et al. 2003/4), gde je pokazano da je POD aktivnost ispod
nivoa detektovanja u prvih 48 sati imbibicije, a javlja se trećeg dana od početka
imbibicije, neposredno pred izbijanje radikule, što je u vezi sa de novo sintezom
izoenzima.
47
Enzimska aktivnost [U/g dw]
Grafikon R9: Aktivnosti
katalaze i superoksid dismutaze u
semenima C.rubrum različite starosti,
posle 2,5h imbibicije;
a) izražene na gram suve mase,
b) izražene na mg proteina;
*- statistički značajno (p<0.05) u
odnosu na semena stara 3 godine.
90
a
3 godine stara semena
12 godina stara semena
80
70
60
50
40
*
*
*
*
30
20
10
Koncentracija glutationa [mol/g dw] Enzimska aktivnost [U/mg proteina]
0
10
b
8
6
4
2
0
CAT
SOD
0.25
Grafikon R10: Sadržaj
glutationa u semenima C.rubrum
različite starosti, posle 2,5h
imbibicije;
* - statistički značajno (p<0.05) u
odnosu na 3 godine stara semena.
3 godine stara semena
12 godina stara semena
0.20
0.15
*
0.10
*
0.05
0.00
GSSG + GSH
GSSG
GSH
CAT i SOD aktivnost, izražene, kako na suvu masu (dw), tako i na miligram
proteina (U/mg proteina), pokazuju višu aktivnost u mladim semenima (grafikon R9 a,
b), ukazujući takođe, na veći antioksidativni potencijal mlađih semena. Kada je praćeno
klijanje semena C.rubrum, najveća aktivnost CAT i SOD je primećena u vreme
48
neposredno pred izbijanje radikule (24 – 48h od početka imbibicije) (Dučić et al.
2003/4). Pik SOD aktivnosti, takođe je uočen na početku imbibicije semena soje,
praćen pikovima aktivnosti CAT i POD (Gidrol et al. 1994).
I koncentracije GSH, GSSG i ukupnog glutationa su bile više kog mladog
semena posle 2.5h imbibicije (grafikon R10). Porast koncentracije glutationa u prvih
24h imbibicije uočen je i kod semena bora (Tomasi et al. 2001).
Starost semena utiče na antioksidativni potencijal semena, klijanje, rastenje i cvetanje biljaka C.
rubrum.
De novo sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije kod starijih semena. Aktivnosti CAT,
SOD, kao i sadržaj glutationa su značajno niži kod starijih semena. Dobijeni rezultati pokazuju da
utvrđivanje antioksidativne aktivnosti enzima semena može biti uključena u evaluaciju njegove starosti.
S obzirom da GA3 smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od mlađeg i
starijeg semena, tj. s obzirom da je njihova osetljivost na GA3 različita, može se pretpostaviti da tokom
starenja semena C. rubrum dolazi do promena u endogenom metabolizmu giberelina.
49
4.1.3. Ukupna antioksidativna aktivnost i
aktivnosti antioksidativnih enzima u toku
vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro
Pretpostavili smo da se nivo antioksidativnih enzima, a samim tim i ukupne
antioksidativne aktivnosti (UAA) menja tokom vegetativnog i reproduktivnog razvića C.
rubrum in vitro.
Za kratkodnevnu biljku C.rubrum, fotoperiod 14h/10h je indukcioni za cvetanje, i
izlaganje svega 6 indukcionih ciklusa u fazi razvića kotiledona je dovoljno da biljke
procvetaju posle 15 dana (Živanović et al. 1995, Mitrović 1998). Kontinualna svetlost
(KS), s druge strane, predstavlja neindukcione uslove. Gajenjem jedne grupe biljaka
neprekidno, 65 dana na indukcionom 14h/10h režimu, a druge grupe prvih 17 dana na
KS, a onda na 14h/10h fotoperiodu, pokušali smo da dovoljno, na vremenskoj skali,
odvojimo faze cvetanja, zametanja semena i sazrevanja semena biljaka iste starosti, da
bismo pokušali da utvrdimo eventualne promene u ukupnoj antioksidativnoj aktivnosti i
sadržaju antioksidativnih enzima vezane za različite faze razvića. Istovremeno, glavni
izvor ROS, pored terminalne oksidacije, je transport elektrona koji se dešava tokom
fotosinteze (Asada 2006) pa se usled gajenja na kontinualnoj svetlosti očekuje
pojačana aktivnost antioksidativnih sistema.
U ovim eksperimentima, korišćena su semena dobijena na biljkama gajenim in
vitro na 16h/8h fotoperiodu, stara godinu dana. Po isklijavanju semena, 4 dana stare
biljčice su postavljane na MS podlogu sa 5% saharoze, bez hormona. Ukupna
antioksidativna aktivnost kao i aktivnosti CAT, POD i SOD, određivani su u uzorcima
(po 0.2 g) stabla sa listovima, korena (uzorci uzimani 17., 37. i 65. dana gajenja) i
semena sazrelih na biljkama (uzorci uzimani 65. dana gajenja).
4.1.3.1. Efekat različitih fotoperiodskih uslova na rastenje,
cvetanje i sazrevanje semena C. rubrum in vitro
Biljke su, pre smrzavanja u tečnom azotu, merene, a rezultati koji se odnose na
visinu, broj pravih listova i broj sazrelih semena, prikazani su na grafikonima R12 –
R14.
50
Fotoperiod 14h/10h je indukcioni za kratkodnevnu biljku C. rubrum. Biljke gajene
na ovom fotoperiodu (grafikon R11) su u vreme prvog uzimanja uzoraka za biohemijske
analize (17. dan) procvetale (100%), dok su biljke koje su prvih 17 dana gajene na KS
ostale vegetativne, a cvetanje (100%) je kod njih registrovano 37. dana kada je
uzimana druga grupa uzoraka (grafikon R11).
60
kontinualna svetlost,
biljaka cvetalo.
- 100%
Visina (mm)
Grafikon R11: Efekat
različitih fotoperiodskih uslova na
rastenje C. rubrum in vitro; KS –
14h/10h
17d KS + 14h/10h
50
40
30
20
10
0
17
37
65
37
65
Vreme (dani)
18
14h/10h
16
Broj listova
Grafikon R 12: Efekat
različitih fotoperiodskih uslova na
broj listova C. rubrum gajenih in
vitro; KS – kontinualna svetlost.
17d KS + 14h/10h
14
12
10
8
6
4
2
0
17
Vreme (dani)
Interesantno je primetiti da 17. dana, kada bismo to najpre očekivali, nema
razlike u visini biljaka (grafikon R11) gajenih na 14h/10h i na KS, ali je ona uočljiva u
broju pravih listova (grafikon R12). Međutim 37. i 65. dana biljke koje su prvih 17 dana
gajene na KS a potom prebačene na 14h/10h fotoperiod su oko 2 puta više od biljaka
koje su svih 65 dana bile izložene 14h/10h fotoperiodu (grafikon R11, Slika R2). To je
svakako u vezi sa trenutkom prelaska u reproduktivnu fazu (tranzijentno zaustavljanje
rastenja u vreme cvetanja), koji je kod biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS bio
odložen za 17 dana.
51
Slika R2: Biljke C. rubrum gajene in vitro, na MS podlozi sa 5% glukoze, gajene
pod različitim svetlosnim uslovima; izgled biljaka u vreme uzimanja uzoraka.
17. dan
17 dana na KS
17 dana na 14h/10h
37. dan
37dana na 14h/10h
17 dana na KS + 20 dana na 14h/10h
65. dan
65dana na 14h/10h
17 dana na KS + 48 dana na 14h/10h
Kontinualna svetlost u prvih 17 dana gajenja stimulira razviće listova u odnosu
na 14h/10h fotoperiod (grafikon R12), i ovaj efekat se zadržava i kasnije posle
prebacivanja na 14h/10h fotoperiod.
Dužina dana kojoj su biljke izložene prvih 17 dana ima efekta i na sazrevanje
semena (grafikon R13) i na njhov broj, u odnosu na neprekidno gajenje na 14h/10h
fotoperiodu. Značajno veći broj sazrelih semena je sakupljen 65. dana na biljkama koje
su prvih 17 dana bile izložene neindukcionoj KS, pa prebačene na indukcioni 14h/10h
52
fotoperiod od onih koje su sve vreme gajene na 14h/10h fotoperiodu (grafikon R13). S
obzirom da su ove biljke indukciju za cvetanje primile tek po prebacivanju na 14h/10h
fotoperiod, pre smo mogli očekivati da je i sazrevanje semena odloženo. Možemo da
zaključimo da je i svetlosni tretman pre indukcije cvetanja bitan za zametanje i
sazrevanje semena, a ne samo dužina dana u vreme ili posle indukcije. Ovo je
razmatrano u sledećem poglavlju (4.2.), a o čemu govori i Cook (1975).
Grafikon R13: Efekat
različitih fotoperiodskih uslova na
broj zrelih semena po biljci C.
rubrum gajenih in vitro, KS –
kontinualna svetlost
Broj zrelih semena po biljci
6
14h/10h
5
17d KS + 14h/10h
4
3
2
1
0
17
37
65
Vreme (dani)
4.1.3.2. Određivanje ukupne antioksidativne aktivnosti u toku
vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro
Ukupna antioksidativna aktivnost (UAA) je parametar koji određuje kapacitet
uzorka svežeg biljnog materijala za uklanjanje slobodnih radikala. Merenje UAA
predstavlja metod koji ukupnu antioksidativnu aktivnost posmatra kao globalnu
karakteristiku uzorka, nezavisno od njenog sastava (Arnao et al. 1999). Čak i kada
bismo znali sve antioksidantne komponente nekog biljnog materijala, to ne bi
neophodno značilo da znamo i njegov antioksidativni kapacitet. Šta više, kooperativni
efekat koji može postojati između različitih antioksidanata, znači da UAA može biti veća
od zbira pojedinačnih antioksidativnih aktivnosti, ili da izolovanje neke pojedinačne
komponente neće davati sveukupnu sliku (Arnao et al. 1999).
Određivali smo ukupnu antioksidativnu aktivnost uzoraka stabla sa listovima,
korena i sazrelih semena sakupljenih na biljkama C. rubrum gajenim in vitro
korišćenjem 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), u različitim
fazama ontogeneze, pod različitim fotoperiodskim uslovima.
53
Grafikon R14: Efekat
različitih fotoperiodskih
uslova na ukupnu
antioksidativnu aktivnost
stabla sa listovima C.
rubrum gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost.
UAA [μmol ekv.askorb./g FW]
10
Stablo sa listovima
8
14h/10h
17d KS + 14h/10h
6
4
2
0
17
37
65
Vreme (dani)
Najveća UAA stabla sa listovima je izmerena kod biljaka koje su prvih 17 dana
gajene na KS (grafikon R14) i ona je 17. dana preko 2 puta veća od UAA kontrolnih
biljaka koje su gajene na 14h/10h fotoperiodu. Posle prebacivanja ove grupe biljaka,
17. dana na na 14h/10h fotoperiod (37. i 65 dana) UAA opada, i nema razlike u odnosu
na UAA biljaka koje su sve vreme gajene na 14h/10h fotoperiodu. Odnosno, efekat 17
dana kontinualne svetlosti na UAA se, u stablu sa listovima, gubi po prebacivanju na
14h/10h.
Kod biljaka koje su svih 65 dana gajene na 14h/10h fotoperiodu, blagi porast
UAA se uočava 37 dana (grafikon R14), dok nema razlike u UAA vrednostima 17. i 65.
dana. Ovaj porast UAA bi se, možda mogao povezati sa procesima vezanim za
početak sazrevanja semena.
UAA korena C. rubrum gajenih neprekidno na 14h/10h fotoperiodu (grafikon
R15) je najviša 17 dana. Uočavamo pad 37. dana, i porast 65. dana, kada se na
biljkama uočavaju znaci senescencije.
Kod korenova biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS, a onda prebačene na
14h/10h fotoperiod (grafikon R15), uočavamo da UAA raste od 17. do 65. dana.
Takođe uočavamo da KS, kojoj su biljke izlagane (17. dan) dovodi do značajnog
snižavanja UAA korena u odnosu na korenove biljaka gajenih na 14h/10h svetlosnom
režimu. Efekat prvih 17 dana kontinualne svetlosti na UAA se gubi po prebacivanju na
14h/10h i u ekstraktima korenova (grafikon R15).
Sazrela semena sakupljena 65. dana sa biljaka C. rubrum gajenih na 14h/10h
fotoperiodu pokazuju značajno nižu UAA (grafikon R16) u odnosu na semena
54
sakupljena sa biljaka koje su prvih 17 dana gajena na KS, pa prebačene na 14h/10h
fotoperiod (grafikon R16). To bi bila potvrda i ranije predpostavke da na sazrevanje
semena značajno utiče i dužina dana pre indukcije cvetanja, a ne samo dužina dana u
vreme i neposredno posle indukcije. Ali se mora uzeti u razmatranje i stepen maturacije
semena na biljkama koje su gajene na ova dva fotoperioda, s obzirom da su Bailly i
saradnici (2004) pokazali visoku aktivnost CAT i nisku POD i SOD aktivnost kod
normalno sazrelih suvih semena, dok je kod nezrelih semena utvrđeno obrnuto.
Grafikon R15: Efekat
različitih fotoperiodskih uslova
na ukupnu antioksidativnu
aktivnost korena C. rubrum
gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost
UAA [µmol ekv. askorb./g FW]
5
Koren
14h/10h
17d KS + 14h/10h
4
3
2
1
0
17
37
65
Vreme (dani)
Grafikon R16: Efekat
različitih fotoperiodskih
uslova na ukupnu
antioksidativnu aktivnost
sazrelih semena sakupljenih
sa biljaka C. rubrum gajenih
in vitro;
KS – kontinualna svetlost.
UAA [µmol ekv. askorb./ g FW]
6
Seme
5
14h/10h
17d KS + 14h/10h
4
3
2
1
0
17
37
65
Vreme (dani)
4.1.3.3. Određivanje aktivnosti antioksidativnih enzima
u toku vegetativnog i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro
Merili smo pojedinačne aktivnosti antioksidativnih enzima, CAT, POD i SOD u
uzorcima stabla sa listovima uzimanim 17., 37. i 65 dana u toku razvića C.rubrum in
55
vitro, gajenih na dva, prethodno opisana, fotoperioda (tokom svih 65 dana na 14h/10h
fotoperiodu ili prvih 17 dana na kontinualnoj svetlosti, a potom još 48 dana na 14h/10h
fotoperiodu).
Analizirajući podatke o aktivnosti CAT (grafikon R17, R18), POD (grafikon R19,
R20) i SOD (grafikon R21, R22) biljaka gajenih neprekidno na indukcionom, 14h/10h
fotoperiodu, uočavamo isti trend promene njihovih aktivnosti od 17. – 65. dana gajenja.
Jasno se uočava pad aktivnosti sva tri enzima 37. dana, što odgovara početku
sazrevanja semena biljaka koje su izložene indukcionom fotoperiodu. 17. dana
registrovana je najviša aktivnost CAT (grafikon R17, R18), POD (grafikon R19, R20) i
SOD (grafikon R21, R22) ovih biljaka, što odgovara punom cvetanju. 65. dana, a što
kod ovih biljaka odgovara završnim fazama sazrevanja semena (Slika R2), aktivnost
(izražena na gram sveže mase) sva 3 enzima raste (grafikoni R17, 19, 21) u odnosu na
37. dan, dok izražena na miligram proteina (grafikoni R18, 20, 22) nema razlike između
37. i 65. dana.
CAT aktivnost biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS, a potom prebačene
na 14h/10h fotoperiod (grafikon R17 i R18), pokazuje obrnut trend u odnosu na biljke
gajene neprekidno na 14h/10h fotoperiodu. Blagi porast CAT aktivnosti se uočava 37.
dana (grafikon R18), što kod ovih biljaka odgovara punom cvetanju, koje je odloženo za
17 dana u odnosu na biljke koje su gajene sve vreme na 14h/10h fotoperiodu, tj. koje
su indukciju za cvetanje primile još u fazi razvića kotiledona.
CAT aktivnost je najviša u fazi cvetanja: 17. dana kod biljaka gajenih na
indukcionom 14h/10h režimu, odnosno 37. dana kod biljaka koje su posle 17 dana na
KS prebačene na indukcioni režim. Apsolutne vrednosti su međutm značajno različite
(grafikon R18). CAT aktivnosti biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS, a potom
prebačene na 14h/10h režim, 17. i 65. dana su vrlo slične (grafikon R17, R18).
Veliku razliku, međutim, uočavamo u aktivnosti CAT i POD 17. dana između
biljaka koje su tih 17 dana gajene na KS i onih na 14h/10h fotoperiodu (grafikoni R17 –
20). Kontinualana svetlost je uticala na značajno sniženje aktivnosti CAT i POD, dok na
SOD aktivnost KS nije uticala (grafikoni R 17 – 22).
Transport elektrona koji se dešava tokom fotosinteze je glavni izvor ROS (Asada
2006) i usled gajenja na kontinualnoj svetlosti dolazi do pojačane produkcije ROS.
Procházková i Wilhelmová (2004) su pokazale da je sadržaj svih neenzimskih
antioksidanata (β-karotena i askorbata) viši u kotiledonima Phaseolus vulgaris izloženih
56
KS nego kod kontrolnih biljaka (gajenih na 16h/8h fotoperiodu), dok je istovremeno,
aktivnost antioksidativnih enzima bila niža. To odgovara i našim rezultatima: aktivnosti
CAT, POD i SOD (grafikoni R16 – 24) su 17. dana niže kod uzoraka stabla sa listovima
C.rubrum gajenih na KS nego kod biljaka gajenih na 14h/10h fotoperiodu nasuprot UAA
koja na istim uzorcima pokazuje značajno više vrednosti kod biljaka gajenih na KS.
700
14h/10h
17d KS + 14h/10h
600
CAT [U/g FW]
Grafikon R17: Efekat
različitih
fotoperiodskih
uslova na katalaznu aktivnost
(izraženu na gram sveže
mase) u stablu i listovima C.
rubrum gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost
500
400
300
200
100
0
17
37
65
Vreme (dani)
35
14h/10h
17d KS + 14h/10h
30
CAT [U/mg Proteina]
Grafikon R18: Efekat
različitih fotoperiodskih
uslova na katalaznu aktivnost
(izraženu na miligram
proteina) u stablu i listovima
C. rubrum gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost
25
20
15
10
5
0
17
37
65
Vreme (dani)
Kontinualna svetlost je izazivala ubrzano starenje listova rozete A. thaliana
(Hensel et al.1993). U kotiledonima pasulja Phaseolus vulgaris, sa dobro definisanom
prirodnom senescencijom, Procházková i Wilhelmová (2004) su pokazale opadanje
aktivnosti svih antioksidativnih enzima. Izlaganje kotiledona KS dovodilo je do
značajnog pada SOD i CAT aktivnosti u odnosu na kontrolu, dok na POD aktivnost KS
nije imala efekta.
U vezi sa rezultatima Procházkove i Wilhelmove (2004), treba primetiti da je
udeo kotiledona C.rubrum, koji prirodno podležu senescenciji (mada kotiledoni C.
57
rubrum imaju prilično dug život), čak značajno manji u uzorku biljaka gajenih prvih 17
dana na KS, što vidimo iz odnosa broja pravih listova razvijenih 17. dana na KS i
14h/10h fotoperiodu (grafikon R13) Na Slici R2 vidimo da su kotiledoni zeleni čak i 65.
dana gajenja. To jest pad aktivnosti antioksidativnih enzima izazvan kontinualnom
svetlošću 17. dana nije, ili bar
ne u velikoj meri, izazvan
senescencijom
kotiledona C.rubrum.
Grafikon R19: Efekat
različitih fotoperiodskih uslova
na peroksidaznu aktivnost
(izraženu na gram sveže
mase) u stablu i listovima C.
rubrum gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost
14h/10h
17d KS + 14h/10h
120
POD [U/g FW]
ubrzanom
140
100
80
60
40
20
0
17
37
65
Vreme (dani)
7
14h/10h
17d KS + 14h/10h
6
POD [U/mg Proteina]
Grafikon R20: Efekat
različitih fotoperiodskih
uslova na peroksidaznu
aktivnost (izraženu na
miligram proteina) u stablu i
listovima C. rubrum gajenih
in vitro; KS – kontinualna
svetlost.
5
4
3
2
1
0
17
37
65
Vreme (dani)
Merenje aktivnosti antioksidativnih enzima u listovima paradajza vršeno je u
različitim fazama razvića (Bailey and McHargue 1943). Pokazano je da aktivnosti CAT i
POD rastu sa sazrevanjem listova, i opadaju sa početkom senescencije. Porast
aktivnosti CAT i POD uočena je i u listovima krastavca od perioda maksimalnog
sazrevanja plodova do kraja plodonošenja (Marinescu et al. 2000). Razlika u aktivnosti
CAT, POD i SOD je pokazana i u listovima Impatiens flanaganiae u različitim fazama
58
razvića u zavisnosti od intenziteta svetlosti kojoj su biljke bile izložene (Lall and
Nikolova 2003).
POD (grafikon 19 i 20) i SOD (grafikon R21 i 22) aktivnosti biljaka koje su prvih
17 dana gajene na KS, pa prebačene na 14h/10h indukcioni režim, pokazuju isti trend –
porast od 17. do 65. dana. Aktivnosti POD i SOD su najniže u vegetativnim biljkama,
posle 17 dana na neindikcionoj KS, raste u vreme cvetanja, koje se dešava po
prebacivanju na indukcioni 14h/10h, 37. dana, a najviše su u vreme sazrevanja
semena, 65. dana.
350
300
SOD [U/g FW]
Grafikon R21: Efekat
različitih fotoperiodskih
uslova na aktivnost
superoksid-dismutaze
(izraženu na gram sveže
mase) u stablu i listovima C.
rubrum gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost
14h/10h
17d KS + 14h/10h
250
200
150
100
50
0
17
37
65
Vreme (dani)
16
Grafikon R22: Efekat
različitih fotoperiodskih
uslova na aktivnost
superoksid-dismutaze
(izraženu na miligram
proteina) u stablu i listovima
C. rubrum gajenih in vitro;
KS – kontinualna svetlost.
SOD [U/mg Proteina]
14
14h/10h
17d KS + 14h/10h
12
10
8
6
4
2
0
17
37
65
Vreme (dani)
Ako uporedimo UAA stabla sa listovima biljaka koje su svih 65 dana gajene na 14h/10h
fotoperiodu sa aktivnostima CAT, POD i SOD, vidimo obrnut trend promena od 17. do 65. dana. UAA
raste 37. dana (početak sazrevanja semena), dok je 17. i 65. dana (faza cvetanja i faza sazrevanja
semena) niža. Najviše aktivnosti sva tri antioksidativna enzima (CAT i POD najizraženije) se mogu
primetiti u vreme cvetanja, 17. dana, nešto su niže u vreme sazrevanja semena 65. dana, dok su najniže
aktivnosti 37. dana, što odgovara početku sazrevanja semena.
Kontinualna svetlost (17. dana) utiče na značajno (preko 2 puta) povećanje UAA, i obrnuto, utiče
na značajno smanjenje CAT i POD, nešto manje SOD aktivnosti, u odnosu na 14h/10h fotoperiod. Ovo
ukazuje da osim CAT, POD i SOD, i sadržaj drugih, enzimskih ili neenzimskih, antioksidanata ima ulogu
59
u uklanjanju ROS, bilo da su vezani za procese razvića C. rubrum, ili da predstavljaju odgovor na
spoljašnju sredinu (u našem slučaju na neprekidno osvetljavanje).
37. i 65. dana, kada su obe grupe biljaka gajene na 14h/10h fotoperiodu nema značajnih razlika
između njihovih UAA što ukazuje na veći efekat fotoperioda od efekta koji imaju faze razvića na UAA.
Slično se ne može uočiti u slučaju aktivnosti CAT, SOD i POD.
Najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja kod obe grupe biljaka – 17. dana kod
biljaka sve vreme gajenih na 14h/10h fotoperiodu, odnosno 37. dana kod biljaka koje su prvih 17 dana
gajene na KS.
60
Rezultati prikazani u ovom poglavlju ukazuju na sledeće zaključke:
1. Predstavljeni rezultati pokazuju sekvencijalnu ekspresiju antioksidativnih
sistema tokom klijanja semena C. rubrum. Pred izbijanje radikule CAT, SOD i DHA
pokazuju maksimalnu aktivnost, a AA je detektovan samo u to vreme. Maksimalan
sadrzaj ukupnog glutationa, kao i GSH i GSSG je izmeren u vreme izbijanja radikule,
kada se javlja i POD aktivnost i raste posle tog perioda.
GA3 (160 μM) inhibira klijanje C. rubrum, ali ne značajno, indukuje porast
aktivnosti CAT i SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a
ne utiče na glutation i peroksidaze.
2. Starenje semena utiče na promenu antioksidativnog statusa semena,
smanjenu klijavost, rastenje i cvetanje biljaka C. rubrum. CAT, SOD, kao i sadržaj
glutationa su značajno niži, a de novo sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije
starijih semena. Dobijeni rezultati pokazuju da utvrđivanje antioksidativne aktivnosti
enzima može biti uključena u evaluaciju starosti semena.
GA3 smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od semena
različite starosti tj. njihova osetljivost na GA3 je različita, pa se može pretpostaviti da
tokom starenja semena C. rubrum dolazi do promena u endogenom metabolizmu
giberelina.
3. U različitim fazama rastenja i razvića primećena je promena nivoa
antioksidativnih enzima. Kod biljaka gajenih neprekidno na indukcionom 14h/10h
fotoperiodu, uočavamo najviše aktivnosti sva tri antioksidativna enzima u vreme
cvetanja. Ukupna antioksidativna aktivnost pokazuje obrnut trend promena u toku
razvića, što ukazuje da osim CAT, POD i SOD, i sadržaj drugih, enzimskih ili
neenzimskih, antioksidanata ima ulogu u uklanjanju ROS u procesima razvića C.
rubrum.
Kontinualna svetlost utiče na značajno povećanje UAA, i obrnuto, utiče na
značajno smanjenje CAT i POD, nešto manje SOD aktivnosti, u odnosu na 14h/10h
fotoperiod. Ovo ukazuje da osim CAT, POD i SOD, i sadržaj drugih antioksidanata ima
ulogu u uklanjanju ROS (komplementarno delovanje svih antioksidativnih sistema), u
vezi sa procesima koji predstavljaju odgovor na neprekidno osvetljavanje.
Istovremeno, najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja, 17.
dana kod biljaka sve vreme gajenih na 14h/10h fotoperiodu, odnosno 37. dana kod
biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS.
61
4.2. Efekat fotoperioda na vegetativno
i reproduktivno razviće C. rubrum in vitro i
materinski efekat fotoperioda
4.2.1. Efekat fotoperioda na vegetativno i reproduktivno
razviće C.rubrum in vitro
Biljke, kao sesilni organizmi, ne mogu da “izaberu” svoje okruženje i moraju da
modifikuju svoje rastenje i razviće prema spoljašnjoj sredini. Takva plastičnost razvića
uključuje integraciju različitih signala iz spoljašnje sredine, što omogućava biljci da
sinhronizuje svoje rastenje sa sezonskim promenama. Svetlost je jedan od
najznačajnijih signala spoljašnje sredine koji reguliše razviće biljaka. Biljke registruju
kvantitet, kvalitet, periodičnost i smer svetlosti i prema njoj moduliraju mnoge fiziološke
odgovore, od klijanja, preko arhitekture odrasle biljke do reproduktivnog razvića
(Franklin and Whitelam 2004). Kod 22 vrste jednogodišnjih pustinjskih biljaka Izraela,
gajenim na kratkom ili dugom danu, uočena je velika razlika u broju listova pre
cvetanja, obliku listova, načinu grananja, veličini semena, boji semenog omotača,
(Gutterman and Evenari 1972).
Na osnovu ranijih istraživanja, koja su se ticala cvetanja i sa njim vezanog
rastenja (Živanović et al. 1995, Mitrović 1998), gajenja biljaka u staklari u cilju
produkcije semena (Mitrović et al 2002), uočili smo značajan uticaj dužine dana na
izgled i visinu biljaka C. rubrum, kao i značajan uticaj materinskog fotoperioda na
klijanje, rastenje i cvetanje ovih biljaka.
Biljke su gajene na različitim dužinama dana: 0h, 8h, 14h, 16h i 24h, kao i
kombinacijama ovih fotoperioda. U obzir su uzete ispitane karakteristike ove biljke: rano
cvetajuća vrsta (Cumming 1967), sa precizno definisanom kritičnom dužinom noći od
8h (Tsuchiya and Ishiguri 1981), sposobna da primi fotoperiodski stimulus za cvetanje
već u fazi razvića kotiledona kada joj je dovoljno svega 6 indukcionih fotoperiodskih
ciklusa (Seidlová i Opatrná 1978).
Metod kulture in vitro je odabran zbog preciznosti kontrole uslova spoljašnje
62
sredine kao i sastava podloge na kojoj biljke rastu (Scorza 1982). Iz ranijih istraživanja
(Mitrović 1998), odabrana je optimalna podloga za rastenje i cvetanje C. rubrum: MS
mineralna podloga sa 5% saharoze. Korišćena su semena sazrela na 13h/11h
fotoperiodu u staklari, stara 3 godine.Biljčice, dobijene od semena sterilno isklijavanog
u destilovanoj vodi, stare 4 dana, sa potpuno razvijenim kotiledonima, postavljane su
na podloge i izlagane različitim fotoperiodima, pri temperaturi od 25 ºC.
4.2.1.1. Efekat različitih fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro
Sa porastom dužine dana dolazi i do povećanja visine biljaka (grafikon R23). Pri
kraju životnog ciklusa (10. nedelja gajenja), biljke rasle na 24h – časovnom danu
(neindukcioni uslovi za cvetanje C.rubrum) su oko 2 puta više od biljaka gajenih na
16h/8h fotoperiodu, odn. čak oko 7 puta više od biljaka gajenih na 14h/10h fotoperiodu.
To je u skladu sa rezultatima Cook-a (1975), koji je pokazao da su biljke C. rubrum
gajene na 15h/9 fotoperiodu bile više, imale veći broj nodusa i duže internodije u
odnosu na biljke gajene na 12h/12h fotoperiodu. Ranije smo primetili da je rastenje
inhibirano na indukcionom fotoperiodu u odnosu na neindukcioni, kod C. rubrum i C.
murale (Mitrović 1998, Mitrović et al. 2000). Jedino biljke gajene u neprekidnom mraku
(24h mraka) ne prate trend odnosa visine i dužine dana (tj. noći), što je posledica
etioliranosti (grafikon R23).
Povećanje visine biljaka sa porastom dužine dana je još uočljivije na grafikonu
R24, na kome su izdvojene samo visine biljaka koje su svih 10 nedelja gajene na istoj
dužini dana. Može se uočiti i najintenzivnije rastenje na 16h/8h fotoperiodu, što
približno odgovara dužinama dana na kojima C.rubrum raste i donosi seme u prirodi.
Dužina dana u junu i julu je 15h 21min, odn 15h 33min, a krajem avgusta, kada seme
već sazreva, a biljke se suše, 14h 42min.
Takođe je važno primetiti da prvih 6 dana u životu biljke (fotoperiod kome su
tada izložene) ostavlja trajni efekat na njeno rastenje. Vidimo značajnu razliku u visini
biljaka izloženih svih 10 nedelja 14h/10h fotoperiodu i biljaka koje su prvih 6 dana
gajene na ovom fotoperiodu, a posle toga prebačene na 16h/8h fotoperiod (grafikon
R23). To bi se moglo i očekivati, jer su ove dve grupe biljaka samo prvih 6 dana, u
odnosu na 10 nedelja, gajene na istom fotoperiodu. Slično vidimo i za biljke izložene
63
svih 10 nedelja 8h/16h fotoperiodu u odnosu na one koje su samo prvih 6 dana gajene
na ovom fotoperiodu, a onda prebačene na 16h/8h fotoperiod. Međutim, čak i veću
razliku u visini (oko 2 puta) vidimo između biljaka koje su prvih 6 dana gajene na
8h/16h ili 14h/10h fotoperiodu, pa onda prebačene na 16h/8h, i biljaka koje su svih 10
nedelja gajene na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R23, Slika R3).
Grafikon R23: Efekat različitih fotoperioda na visinu C.rubrum.
110
24h/0h
100
90
Visina (mm)
80
70
16h/8h
60
50
40
6(8h/16h)+16h/8h
30
6(14h/10h)+16h/8h
0h/24h
20
14h/10h
8h/16h
10
0
1
2
3
4
5
6
Vreme (nedelja)
7
8
9
10
120
Grafikon R24:
Efekat dužine dana na
visinu C.rubrum.
Sa grafikona R23
izdvojeni podaci koji se
odnose na biljke koje su
neprekidno gajene na
istoj dužini dana.
100
80
Visina (mm)
60
40
20
6
5
4
0
24
Dužina dana
(h)
64
3
16
2
14
8
1
7
8
9
10
Vreme (nedelja)
Slika R3: Biljke gajene in vitro na različitim fotoperiodima, na kraju 10. nedelje.
8h/16h
14h/10h
6(8h/16h)
+
16h/8h
16h/8h
6(14h/10h)
+
16h/8h
24h svetlost
Uočava se tranzijentno zaustavljanje rastenja
C.rubrum (Opatrná et al. 1980, Ulmann et al. 1980,
Mitrović 1998) u vreme cvetanja (grafikon R27), što je
zavisno od fotoperioda na kome se biljke gaje (grafikon
R23). Što je duži indukcioni dan, kasnije započinje
cvetanje (grafikon R27), a samim tim i tranzijentno
zaustavljanje rastenja vezano za njega (grafikon R23).
Ali, što je dan kraći (8h, pa i 14h), rastenje se posle
cvetanja, skoro potpuno zaustavlja (grafikon R23, Slika
R3). Kako se i moglo očekivati, zaustavljanje rastenja se ne može uočiti jedino na
neindukcionim uslovima gajenja (grafikon R 23), tj. na 24 časovnom danu (biljke nisu
procvetale do 10. nedelje gajenja – grafikon R27).
Biljci C. rubrum je za indukciju cvetanja dovoljno izlaganje 6 indukcionih
fotoperiodskih ciklusa u fazi razvića kotiledona (Opatrná et al. 1980). Cook (1975) je
utvrdio da zametanje semena (broj i masu semena koja će sazreti) određuje 8 – 13
fotoperiodskih ciklusa kojima je biljaka izložena. Očigledno je (grafikoni R23, 24) da je
to period u zivotu biljke na koji ona odgovara i rastenjem i to kroz čitav životni ciklus.
Praćenjem broja listova koji se razvijaju na biljkama C.rubrum gajenim na
različitim fotoperiodima i kombinacije fotoperioda u prvih 6 dana i ostalih 9 nedelja
života (grafikon R25, 26), možemo uočiti sličan trend porasta broja listova sa
produženjem dana. I Cook (1975) je uočio značajno povećanje broja listova C.rubrum
na 15h danu u odn na 12h dan.
65
Grafikon R25: Efekat različitih fotoperioda na broj listova C.rubrum.
20
24h/0h
16h/8h
18
16
6(8h/16h)+16h/8h
6(14h/10h)+16h/8h
Broj listova
14
12
10
14h/10h
8
6
4
8h/16h
0h/24h
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Vreme (nedelja)
20
Grafikon R26: Efekat
dužine dana na broj pravih
listova C.rubrum.
Sa grafikona R25 izdvojeni
podaci koji se odnose na biljke
koje su neprekidno gajene na
istoj dužini dana.
15
Broj listova
10
5
0
3
24
16
14
4
5
6
7
8
9
10
Vreme
(nedelja)
2
81
Dužina dana (h)
Uočavamo i zaustavljanje porasta broja listova sa početkom sazrevanja semena
(grafikon R29). U neprekidnom mraku i na 8h/16h fotoperiodu povećanje broja listova je
zaustavljeno jos po završetku cvetanja, tj. oko treće nedelje života (grafikon R25).
Vrhovi ovih biljaka počinju da se suše oko 7. – 8. nedelje života, a semena se i ne
66
formiraju (grafikon R29). Na neprekidnoj svetlosti (24h svetlost) nije dolazilo do
cvetanja (grafikon R 27), a i porast broja listova je, manje više, linearan (grafikon R 25,
26).
Visoka korelacija između broja listova i procenta cvetanja, uočena je kod
C.rubrum gajenih u neprekidnom mraku i C.murale gajenih na indukcionim uslovima
(Mitrović 1998, Mitrović et al. 2000).
4.2.1.2. Efekat različitih fotoperioda na cvetanje C. rubrum in vitro
Cvetnje (grafikon R27, 28) se dešava ranije što je indukcioni dan kraći. Kod
biljaka gajenih 68 dana u neprekidnom mraku (dužina dana 0h), cvetovi se javljaju već
posle prve nedelje. Sa produženjem dana odlaže se cvetanje, najkasnije cvetaju biljke
na 16h danu. Važno je primetiti da osim dužine dana u prvih 6 dana, koliko je dovoljno
za indukciju cvetanja C.rubrum (Seidlová i Opatrná 1978, Cumming 1967), na cvetanje
(kao i na rastenje, što smo ranije primetili) ima uticaj i fotoperiod koji zatim sledi.
Grafikon R27: Efekat različitih fotoperioda na cvetanje C.rubrum.
100
90
80
Cvetanje (%)
70
6(8h/16h)
+
16h/8h
60
50
8h/16h
14h/10h
40
6(14h/10h)
+
16h/8h
16h/8h
0h/24h
30
20
10
24h/0h
0
1
2
3
4
5
6
Vreme (nedelja)
7
8
9
10
Na primer, ako posmatramo linije koje predstavljaju cvetanje biljaka gajenih svih
10 nedelja na 14h/10h fotoperiodu, biljaka koje su prvih 6 dana gajene na ovom
fotoperiodu, a onda prebačene na 16h/8h fotoperiod i biljaka koje su svih 10 nedelja
67
gajene na 16h/8h fotoperiodu, vidimo da prve najranije cvetaju. Prebacivanje posle
prvih 6 dana sa 14h/10h na 16h/8h fotoperiod odlaže cvetanje za nedelju dana, dok
biljke gajene svih 10 nedelja na 16h/8h fotoperiodu cvetaju još nedelju dana kasnije
(grafikon R27).
Slično vidimo i kad uporedimo cvetanje biljaka gajenih neprekidno na 8h/16h
fotoperiodu, onih koje su posle 6 dana na ovom fotoperiodu prebačene na 16h/8
fotoperiod i biljaka gajenih svih 10 nedelja na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R27). Biljke
gajene neprekidno na 8h/16h fotoperiodu cvetaju 50% druge nedelje, ali na ovom
fotoperiodu cveta svega 90% biljaka do kraja 10. nedelje. Prebacivanje posle prvih 6
dana sa 8h/16h na 16h/8h fotoperiod stimulira cvetanje druge nedelje, i nadalje, do
100% 6. nedelje. Ove biljke cvetaju (u sličnom procentu) 3 nedelje ranije od biljaka
gajenih neprekidno na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R27).
100
Grafikon R28: Efekat
dužine dana na cvetanje
C.rubrum.
Sa grafikona R27 izdvojeni su
podaci koji se odnose na biljke
koje su svih 10 nedelja gajene
na istoj dužini dana.
80
60
Cvetanje (%)
40
9
7
Vreme (nedelja)
20
5
3
0
1
24
16
14
8
Dužina dana
(h)
4.2.1.3. Efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena
C. rubrum in vitro
Dužina dana pokazuje efekat i na sazrevanje semena C.rubrum in vitro i to kako
na vreme sazrevanja semena (hronološka starost biljke) (grafikon R29), tako i na broj
68
sazrelih semena (grafikon R30). Sa povećanjem dužine dana, “ubrzava se” sazrevanje
semena (biljke ranije u toku ontogeneze donose seme), a povećava se i broj sazrelih
semena (grafikon R30). Sazrevanje semena (grafikon R29) dešava se 4 – 5 nedelja po
započinjanju cvetanja (grafikon R27) i slično kao i cvetanje pokazuje odgovor na dužinu
dana u vreme indukcije cvetanja i neposredno posle nje. To možemo videti ako
posmatramo linije koje predstavljaju broj biljaka sa zrelim semenom raslih na
fotoperiodima: 6(8h/16h) + 16h/8h, 6(10h/14h) + 16h/8h i 16h/8h. Najranije dolazi do
sazrevanja semena na biljkama koje su indukciju primile na 8h/16h fotoperiodu i dalje
gajene na 16h/8h (grafikon R29), što je u skladu i sa najranijim cvetanjem (grafikon
R27).
Grafikon R29: Efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena C.rubrum.
6(8h/16h)+16h/8h
16h/8h
Broj biljaka sa zrelim semenom (%)
100
90
6(14h/10h)+16h/8h
80
70
60
50
40
14h/10h
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8h/16h
0h/24h
Vreme (nedelja)
Biljke rasle neprekidno na 8h danu, kao i u neprekidnom mraku, ne donose
seme (grafikon R29). Vrhovi ovih biljaka već oko sedme nedelje života počinju da se
suše i na njima ne sazreva seme, dok hipokotili, čak i kotiledoni ostaju zeleni, (Slika
R3). Za razliku od C. rubrum, biljke Centaurium pulchellum, gajene u neprekidnom
mraku in vitro, produkovale su semena, ali ta semena nisu bila vijabilna (Cvetić et al.
2004).
69
Sa povećanjem dužine dana, dolazi i do povećanja visine biljaka kao i broja listova, odlaže se
cvetanje i biljke ranije donose seme.
Fotoperiod kome su biljke C. rubrum izložene prvih 6 dana (indukcija cvetanja) i fotoperiod koji
neposredno zatim sledi (evokacija cvetanja), određuju njihovo rastenje do kraja ontogeneze, cvetanje i
sazrevanje semena .
70
4.2.2. Materinski efekat fotoperioda
Uticaji faktora spoljašnje sredine tokom razvića majke biljke na morfološke i
fiziološke karakteristike semena (potomstvo) koje produkuju (Gutterman and Evenari
1972) u literaturi se nazivaju materinski efekti. Pokazano je da materinske efekte na
potomstvo mogu izazvati: mineralni sastav podloge, intenzitet svetlosti, temperatura,
fotoperiod, nivo CO2 (po Galloway 2005). Materinski efekti su specifični, a njihova
ekspresija često zavisi od sredine u kojoj se potomstvo razvija. Materinski efekat se
ispoljava tokom čitavog života potomstva, a može opstati kroz nekoliko generacija
(Galloway 2005).
Najveći broj istraživanja koja se tiču ispitivanja materinskih efekata različitih
faktora spoljašnje sredine na potomstvo, se tiču materinskih efekata na karakteristike
semena, najviše klijanje (Cook 1975, Bewley and Black 1982, Bertero et al. 1999,
Gutterman 2000), dok je mnogo manje podataka o materinskim efektima različitih
faktora spoljašnje sredine na dalje faze razvića potomstva.
4.2.2.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena,
klijanje, rastenje, cvetanje i donošenje semena
C. rubrum in vitro
4.2.2.1.1. Materinski efekat fotoperioda na broj i masu semena C. rubrum
Različiti fotoperiodi na kojima su gajene biljke pokazuju efekat i na broj semena
sazrelih po biljci (grafikon R30) Najveći broj semena po biljci sazreo je na biljkama
gajenim na najdužem indukcionom fotoperiodu koji smo primenili, 16h/8h, dok je na
14h/10h fotoperiodu sazrelo oko 10 puta manje semena. Ovo je u skladu sa Cook-ovim
(1975) rezultatima značajno veće brojnosti semena sazrelih na 15h/9h fotoperiodu u
odnosu na 12h/12h fotoperiod.
Semena su po sazrevanju (na 10 nedelja starim biljkama) sušena mesec dana
na sobnoj temperaturi i merena. Vidimo (grafikon R31) da masa semena raste sa
povećanjem dužine dana sa 14h na 16h (statistički značajno) na kome su gajene majke
biljke. Takođe masa semena raste i sa dužinom dana u vreme indukcije cvetanja (6
71
ciklusa 8h/16h odn, 14h/10h fotoperioda), i fotoperioda koji neposredno zatim sledi, ali
ne značajno. Na 8h danu, semena nisu sazrevala, te imamo vrlo uzak opseg odnosa
dužina dana i masa semena dobijenih in vitro.
Grafikon R30: Efekat različitih fotoperioda na kojima su sazrevala semena na
prosečan broj sazrelih semena po biljci na kraju 10. nedelje in vitro.
Broj zrelih semena po biljci
40
35
30
25
20
15
10
5
0
14h/10h
6(8h/16h)+16h/8h
6(14h/10h)+16h/8h
16h/8h
Fotoperiod na kome su gajene majke biljke
Ne sme se izuzeti iz razmatranja efekat in vitro gajenja biljaka, koji neprekidno
obezbeđuje optimalne uslove mineralnog sastava podloge, temperature, vlažnosti i
osvetljenosti. U prirodi, uz 15h/9h (od maja do avgusta) fotoperiod vezane su i visoke
temperature, i mali sadržaj vlažnosti vazduha. Prosečna masa 100 semena sazrevalih
in vivo na 15h/9h fotoperiodu je oko 4.5 puta manja od onih sazrelih na 16h/8h in vitro.
Bertero i saradnici (1999) su pokazali da je efekat fotoperioda primenjenog pre i posle
zametanja semena C. quinoa na masu semena, bio pod značajnim uticajem
temperature. Temperatura gajenja majki biljki Plantago lanceolata, značajno je uticala
na ukupnu masu semena i masu semenog omotača, iako veća semena ne sadrže veći
endosperm ili embrion. Veća masa semenog omotača verovatno značajno utiče na
klijanje (Lacey et al. 1997).
U ranijim istraživanjima (Mitrović et al. 2002) smo pokazali da su semena
sazrevala na biljkama gajenim in vivo od januara do maja, (dužina dana od 9h do 14h)
malobrojna i oko 4 puta teža od semena sazrevalih na biljkama gajenim od aprila do
72
avgusta (dužina dana od 14h do 15h 33 min). Slično je pokazao i Cook (1975): na
masu semena C.rubrum značajno utiče fotoperiod na kome se odvijaju fotoperiodska
indukcija i evokacija cvetanja. Biljke gajene na 15h/9h fotoperiodu imale su veći broj
manjih semena u odnosu na biljke gajene na 12h/12h fotoperiodu, a davanjem
određenog broja pulseva 15h/9h fotoperioda utvrdio je da je masa semena određena
između 4. i 8. dana razvića.
Grafikon R31: Efekat različitih fotoperioda na kojima su sazrevala semena na
masu semena.
0,04
Masa 100 semena (g)
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
14h/10h
8h/16h + 16h/8h
14h/10h + 16h/8h
16h/8h
Fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke
Kod kvantitativno kratkodnevne biljke C. quinoa (Bertero et al. 1999) uočeno je
da biljke gajene na KD do zametanja semena donose 4 puta krupnija semena od onih
koje su neprekidno gajene na dugom danu. Takođe, rezultati dobijeni na različitim
vrstama roda Chenopodium (po Bewley and Black 1982) govore u prilog bliske
povezanosti između uslova spoljašnje sredine i razvića semena. Biljke C. amaraticolor,
C. polyspermum i C. album gajene na dugim fotoperiodima produkuju sitna, dormantna
semena sa debelom semenjačom, dok one gajene na kratkim fotoperiodima daju
krupna, manje dormantna semena sa tankom semenjačom. Sve ovo može biti deo
zaštitne strategije rasejavanja semena o kojoj govori Gutterman (2002), utičući na
povećanje šanse vrste da preživi.
U prirodi, Chenopodium rubrum cveta pred jesen, te biljke primaju indukciju na
najdužim fotoperiodima, kada kasni letnji dani postaju kraći, a pošto je utvrđeno da se
veličina i potencijalni broj semena određuju neposredno po iniciranju reproduktivnog
73
razvića, prirodna indukcija ide u pravcu minimiziranja veličine semena i maksimiziranja
brojnosti semena (Cook 1975). Otuda, prirodna selekcija izgleda favorizuje fiziološke
mehanizme koji rade na fiziološki suboptimalnim fotoperiodima, koji maksimizuju
verovatnoću preživljavanja (Cook 1975).
Broj i srednja vrednost mase semena su najznačajniji pokazatelji reproduktivne
sposobnosti jednogodišnjih biljaka (Cook 1975). Adaptivni značaj veličine semena za
svaku vrstu, pokazan je konstantnošću srednje vrednosti mase semena. I u toku našeg
rada, utvrdili smo da masa semena uvek jednako odgovara na uslove gajenja biljaka.
Efekat kompeticije je rešen brojnošću semena, čineći veličinu semena najmanje
plastičnom komponentom (Cook 1975).
4.2.2.1.2. Materinski efekat fotoperioda na klijanje semena C. rubrum
Semena sakupljena sa biljaka, gajenih in vitro na različitim fotoperiodima
(detaljno opisano u poglavlju 4.2.1.), su korišćena za ispitivanje materinskog efekta
fotoperioda na klijanje. Semena su isklijavana sterilno u destilovanoj vodi, a klijanje je
praćeno svakih 24h u toku 4 dana.
Vidimo da razlika u dužini dana od samo 2h (14h i 16h) na kojoj su gajene majke
biljke in vitro i na temperaturi od 25 ºC ima efekta na klijanje semena (grafikon R32).
Semena koja su zametnuta i sazrevala na 16h dugom danu klijaju 22% prvog dana u
odnosu na 10% semena koja su zametnuta i sazrevala na 14h danu, i ta razlika sa
održava u sva 4 dana klijanja, ali 3. i 4. dana nije statistički značajna.
Zanimljivo je uporediti krive klijanja semena sakupljenih sa biljaka koje su prvih 6
dana gajene na 8h/16, a posle toga još 9 nedelja na 16h/8h fotoperiodu i onih koje su
svih 10 nedelja gajene na 16h/8h fotoperiodu (grafikon R32). Kod prvih, uočavamo
linearan porast procenta klijanja u prva 3 dana, bez izdvojenih delova populacije
semena po brzini klijanja, pri cemu je procenat klijanja ovih semena drugog dana 48%,
u odnosu na 35% semena sakupljenih sa biljaka gajenih na 16h/8h. Takođe, ako
uporedimo klijanje semena sakupljenih sa biljaka koje su prvih 6 dana gajene na
14h/10h fotoperiodu, a posle toga još 9 nedelja na 16h/8h, i onih koje su svih 10
nedelja gajene na 14h/10h fotoperiodu, vidimo da su krive njihovog klijanja vrlo slične i
istovremeno značajno različite od krive klijanja semena sakupljenih sa biljaka gajenih
74
svih 10 nedelja na 16h/8h fotoperiodu. Odnosno, fotoperiod kome su majke biljke
izložene u prvih 6 dana (u vreme kada su sposobne da prime fooperiodsku indukciju
cvetanja) ima značajno veći uticaj na klijanje na njima sazrelih semena nego fotoperiod
tokom sledećih 9 nedelja. To potvrđuje zaključke Cook (1975) o značajnom uticaju
fotoperioda u vreme cvetanja i neposredno posle toga na karakteristike semena. I
Gutterman and Evenari (1972) je kod 22 vrste jednogodišnjih pustinjskih biljaka Izraela,
gajenim na kratkom ili dugom danu, uočio veliku razliku u veličini semena, boji
semenog omotača, klijanju i dugovečnosti semena.
Grafikon R32: Materinski efekat fotoperioda na klijanje semena. Sa desne
strane grafikona označeni fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke.
100
16h/8h
6(14h/10h)+16h/8h
6(8h/16h)+16h/8h
14h/10h
90
80
Klijanje (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
Ranije smo utvrdili (Mitrović et al. 2002) da su semena sazrela u staklari zimi, na
kraćem danu i nižim temperaturama, klijala u značajno većem procentu u odnosu na
semena sazrevala leti na dužem danu i višim temperaturama. Kako smo in vitro, pri
temperaturi od 25 ºC dobili obrnut odnos dužine dana gajenja majki biljki i klijanja
njihovog semena, slično kao i u slučaju mase semena (u poglavlju 4.2.2.1.1.)
zaključujemo da fotoperiod i temperatura kojoj su biljke izložene pokazuju kombinovani
efekat kako na masu semena koja na njima sazrevaju, tako i na klijanje tih semena.
75
Kod Aegilops ovata (Datta et al. 1972a) semena sazrela na višim temperaturama su
bila lakša i klijala u višem procentu u odnosu na ona sazrela na nižim temperaturama.
Obrnut odnos između klijavosti semena i temperature u vreme njegovog sazrevanja
uočen je kod soje (Keigley and Mullen 1986) i kod Chenopodium album (Karssen
1970).
Gutterman and Evenari (1972) je pisao o zavisnosti vijabilnosti semena od
uslova kojima je biljka izložena u vreme sazrevanja semena, misleći najviše na dužinu
dana, temperaturu i kvalitet svetlosti. Semena Lactuca scariola dobijena od biljaka
premeštenih sa dugog na kratak dan na kraju faze razvića rozete, klijala su značajno
brže od onih sakupljenih sa biljaka koje su ostale na dugom danu (Gutterman and
Evenari 1972). Galloway (2005) je utvrdila korelaciju između vremena cvetanja majke
biljke Campanula americana i vremena klijanja semena.
4.2.2.1.3. Materinski efekat fotoperioda na rastenje C. rubrum in vitro
Četiri dana stare biljke poreklom od semena sazrelog na biljkama gajenim na
različitim fotoperiodima, sa potpuno razvijenim kotiledonima, (posle isklijavanja –
grafikon R32) postavljane su na podloge (MS sa 5% saharoze, bez hormona) i sve
gajene na 14h/10h fotoperiodu, i temperaturi od 25 ºC. Od 2-10 nedelje, praćeni su
visina, broj listova, cvetanje i donošenje semena (na grafikonima R33 - 36
predstavljeno debelim punim linijama). Paralelno su prikazani rezultati dobijeni
praćenjem rastenja materinskih biljaka (tankim isprekidanim linijama) na različitim
fotoperiodima (detaljno prikazano u poglavlju 4.2.1.1. na grafikonima R23 - 29).
Uočavamo značajan efekat materinskog fotoperioda na visinu biljaka (grafikon
R33, slika R4), posebno u kasnijim fazama razvića (7. – 10. nedelja). Tako su biljke
poreklom od semena zametnutog i sazrevalog na 14h/10h fotoperiodu najviše u
odnosu na biljke dobijene od semena sazrevalog na drugim fotoperiodima. Biljke
poreklom od semena sazrelog na majkama biljkama gajenim na 14h/10h fotoperiodu
su, istovremeno, oko 3 puta više (7. i 10. nedelje) od svojih majki (grafikon R33). Majka
biljka gajena na 14h/10h fotoperiodu “predviđa” da će se njeno potomstvo naći na istim
uslovima spoljašnje sredine (fotoperiod 14h/10h). Materinski efekat sredine predstavlja
76
mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi fenotipove potomstva da povećaju
uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije iskusiti (Galloway 2005).
Slika R4: Materinski efekat različitih fotoperioda na biljke C.rubrum, gajene na
14h/10h fotoperiodu; biljke stare 10 nedelja.
Biljke poreklom od semena sazrelog
na biljkama gajenim na 14h/10h fotoperiodu
Biljke poreklom od semena sazrelog
na biljkama gajenim na
6(14h/10h) + 16h/8h fotoperiodu
Biljke poreklom od semena sazrelog
na biljkama gajenim 16h/8h fotoperiodu
Biljke poreklom od semena sazrelog
na biljkama gajenim na
6(8h/16h) + 16h/8h fotoperiodu
77
Uočavamo da fotoperiod kome su majke biljke izložene u prvih 6 dana života
(vreme kada su sposobne da prime fotoperiodsku indukciju cvetanja, Seidlová i
Opatrná, 1978) ostavlja značajan efekat na visinu potomstva, i to mnogo veći nego
fotoperiod kome su izložene u 9 nedelja koje zatim slede (grafikon R33). Ako
uporedimo biljke dobijene od semena sazrevalog na majkama biljkama koje su prvih 6
dana bile izložene 14h/10h fotoperiodu, a ostalih 9 nedelja gajene na 16h/8h
fotoperiodu, sa onima koje su svih 10 nedelja gajene na 14h/10h fotoperiodu, vidimo
veliku sličnost (nema statistički značajnih razlika). Dok su biljke dobijene od semena
sazrevalog na biljkama koje su svih 10 nedelja gajene na 16h/8h fotoperiodu značajno
niže (oko 2 puta 7. i 10. nedelje).
Grafikon R33: Materinski efekat različitih fotoperioda na visinu biljaka C.rubrum
gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim tankim
linijama prikazane visine majčinskih biljaka koje su gajene na različitim fotoperiodima, i
sa kojih su sakupljena semena.
65
materinski efekat 14h/10h
fotoperioda na rastenje na
14h/10h fotoperiodu
60
majke biljke gajene na 14h/10h
fotoperiodu
55
50
materinski efekat 16h/8h
fotoperioda na rastenje na
14h/10h fotoperiodu
Visina (mm)
45
majke biljke gajene na 16h/8h
fotoperiodu
40
35
materinski efekat
6(8h/16h)+16h/8h fotoperioda
na rastenje na 14h/10h
fotoperiodu
majke biljke gajene na
6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodu
30
25
20
materinski efekat
6(14h/10h)+16h/8h fotoperioda
na rastenje na 14h/10h
fotoperiodu
majke biljke gajene na
6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodu
15
10
5
2
5
7
10
Vreme (nedelja)
Možemo primetiti da su biljke poreklom od semena sazrelog na biljkama koje su
u prvih 6 dana bile izložene 14h/10h fotoperiodu, značajno više od biljaka poreklom od
semena sazrelih na drugim fotoperiodima, bez obzira na fotoperiod koji zatim sledi.
78
Znači da biljke informaciju o dužini dana koju su iskusile u vreme indukcije cvetanja
prenose na potomstvo. Majka biljka predviđa da će se njeno potomstvo naći na
fotoperiodu koji je ona iskusila u toku indukcije cvetanja, što je evoluciono potpuno
opravdano sa stanovišta značaja ove faze razvića za ostavljanje potomstva.
Grafikon R34: Materinski efekat različitih fotoperioda na broj listova biljaka
C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim
tankim linijama prikazan broj pravih listova majčinskih biljaka koje su gajene na
različitim fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.
20
materinski efekat 14h/10h
fotoperioda na broj listova na
14h/10h fotoperiodu
18
majke biljke gajene na 14h/10h
fotoperiodu
16
materinski efekat 16h/8h
fotoperioda na broj listova na
14h/10h fotoperiodu
Broj listova
14
majke biljke gajene na 16h/8h
fotoperiodu
12
materinski efekat
6(8h/16h)+16h/8h fotoperioda
na broj listova na 14h/10h
fotoperiodu
majke biljke gajene na
6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodu
10
8
6
materinski efekat
6(14h/10h)+16h/8h fotoperioda
na broj listova na 14h/10h
fotoperiodu
majke biljke gajene na
6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodu
4
2
2
5
7
10
Vreme (nedelja)
Treba primetiti još jednu pojavu: na grafikonu R24 vidimo “kičmu” površi koja
odgovara visini biljaka gajenih na 16h/8h fotoperiodu, odnosno, biljke su najviše na
ovom fotoperiodu. Sa daljim produžavanjem dana dolazi do smanjenja visine biljaka.
Na grafikonu R33 vidimo da biljke poreklom od semena zametnutog i sazrevalog na
14h/10h fotoperiodu, kao i 6 dana (14h/10h) + 62 dana na 16h/8h fotoperiodu pokazuju
sličnu krivu rastenja materinskim biljaka gajenim na tom “najboljem” 16h/8h
fotoperiodu. I obrnuto, biljke poreklom od semena koje u toku svog zametanja i
sazrevanja nije “iskusilo” 14h/10h fotoperiod pokazuju slične krive rastenja kao
materinske biljke gajene na “neoptimalnom” 14h/10h fotoperiodu, tj. rastenjem
odgovaraju na fotoperiod kome su izložene. To je još jedan pokazatelj materinskog
79
efekta fotoperioda kojim majka biljka “prilagođava” fenotip potomstva (visinu)
spoljašnjoj sredini (fotoperiodu u našem slučaju) koju će potomstvo iskusiti (Galloway
2005).
Sličan efekat različitih fotoperioda na kome su rasle majke biljke uočava se i na
broj listova biljaka dobijenih iz njihovih semena (grafikon R34, slika R4), mada je nešto
slabije izraženo u odnosu na visinu (grafikon R33). Sličan efekat materinskog
fotoperioda na broj listova, takođe je ranije pokazan (Mitrović et al. 2002).
4.2.2.1.4. Materinski efekat fotoperioda na cvetanje i
sazrevanje semena C. rubrum in vitro
Efekat fotoperioda na kome su cvetale i zametale semena majke biljke se, osim
na rastenje, odražava i na vreme cvetanja potomstva (grafikon R35). Međutim,
materinski efekat fotoperioda na cvetanje je obrnut u odnosu na rastenje (grafikoni
R33, R34). To se moglo i očekivati, s obzirom da je cvetanje po svemu proces suprotan
rastenju. Već je pomenuto da u vreme cvetanja dolazi do tranzijentnog zaustavljanja
rastenja C.rubrum (Opatrná et al. 1980, Ulmann et al. 1980) i da je rastenje u
indukcionim uslovima inhibirano u odnosu na rastenje na neindukcionim (Mitrović
1998). Takođe je u prethodnom poglavlju (4.2.1.) pokazano da sa produženjem dana
dolazi do intenziviranja rastenja i odlaganja cvetanja. Osim toga, iz literature i prakse je
poznato da se cvetanje ubrzava u nepovoljnim uslovima spoljašnje sredine, u cilju
obezbeđivanja potomstva.
U ovom eksperimentu, gde su biljke poreklom od semena sazrevalog na
različitim fotoperiodima sve gajene na 14h/10h fotoperiodu, samo biljke sa materinskim
efektom ovog fotoperioda ne pokazuju razliku u cvetanju u odnosu na cvetanje
materinskih biljaka (grafikon R35). Vidimo da biljke poreklom od semena zametnutog i
sazrevalog na 6 dana (14h/10h) + 16h/8h fotoperiodu cvetaju 50% već druge nedelje u
odnosu na 34% cvetanja biljaka poreklom od semena sazrevalog na biljkama gajenim
svih 10 nedelja na 14h/10h fotoperiodu. Osim toga ove biljke cvetaju u sličnom
procentu kao biljke poreklom od semena sazrevalog na biljkama gajenim 10 nedelja na
16h/8h fotoperiodu. Međutim, biljke poreklom od semena zametnutog i sazrevalog na 6
(8h/16h) + 16h/8h fotoperiodu cvetaju 100% već 2. nedelje gajenja na 14h/10h
80
fotoperiodu. Potomstvo biljaka gajenih na različitim fotoperiodima cveta u značajno
višem procentu na 14h/10h fotoperiodu, u odnosu na cvetanje majki biljki na
fotoperiodima na kojima su bile gajene, kao i u odnosu na biljke poreklom od semena
sazrevalog na 14h/10h fotoperiodu. Potencijalno objašnjenje bi moglo biti da majke
biljke gajene na različitim fotoperiodima nisu “predvidele” da će se njihovo potomstvo
naći na 14h/10 h fotoperiodu, te je on za njih nepovoljan, pa biljke potomci ranije
cvetaju.
Grafikon R35: Materinski efekat različitih fotoperioda na cvetanje biljaka
C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama). Isprekidanim
tankim linijama prikazano cvetanje majčinskih biljaka koje su gajene na različitim
fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.
100
materinski efekat 14h/10h
fotoperioda na cvetanje na
14h/10h fotoperiodu
90
majke biljke gajene na 14h/10h
fotoperiodu
80
materinski efekat 16h/8h
fotoperioda na cvetanje na
14h/10h fotoperiodu
Cvetanje (%)
70
majke biljke gajene na 16h/8h
fotoperiodu
60
50
40
materinski efekat
6(8h/16h)+16h/8h fotoperioda na
cvetanje na 14h/10h fotoperiodu
30
majke biljke gajene na
6(8h/16h)+16h/8h fotoperiodu
materinski efekat
6(14h/10h)+16h/8h fotoperioda na
cvetanje na 14h/10h fotoperiodu
20
10
majke biljke gajene na
6(14h/10h)+16h/8h fotoperiodu
0
2
5
7
10
Vreme (nedelja)
Praćenjem početka sazrevanja semena na 14h/10h fotoperiodu, na biljkama
poreklom od semena sazrelog na različitim fotoperiodima (grafikon R36), vidimo da
najranije (u 5 nedelji) počinje sazrevanje semena na biljkama poreklom od semena
sazrevalog na 16h/8h fotoperiodu. Majke biljke gajene na 16h/8h fotoperiodu su
najkasnije cvetale (grafikon R35) i donosile semena (grafikon R36). Galloway (2005)
govori o mogućnosti da, u slučaju da se seme raseje u drugačiji habitat, materinski
efekat sredine može smanjiti njegovu sposobnost preživljavanja. U ovom slučaju,
81
materinski efekat 16h/8h fotoperioda, nije smanjio mogućnost potomstva da ostavi
seme na 14h/10h fotoperiodu.
Sazrevanje semena na biljkama poreklom od semena sazrevalog na 14h/10h
fotoperiodu je ubrzano u odnosu na majke biljke (grafikon R36). Na kraju 10. nedelje na
100% biljaka sazreva seme, u odnosu na svega 32.5% materinskih biljaka. Majka biljka
“predviđa” da će se njeno potomstvo naći na fotoperiodu (14h/10h) koji je ona iskusila u
toku cvetanja i zametanja semena, čime može da prilagodi fenotipove potomstva da
povećaju uspeh u spoljašnjoj sredini (Galloway 2005), u ovom slučaju da donesu veći
broj semena.
Grafikon R36: Materinski efekat različitih fotoperioda na sazrevanje semena na
biljkama C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano debelim linijama).
Isprekidanim tankim linijama prikazano sazrevanjesemena na majčinskim biljkama koje
su gajene na različitim fotoperiodima, i sa kojih su sakupljena semena.
materinski efekat
14h/10h fotoperioda
na sazrevanje semena
na 14h/10h
fotoperiodu
majke biljke gajene na
14h/10h fotoperiodu
100
Broj biljaka sa zrelim semenom
90
80
materinski efekat
16h/8h fotoperioda na
sazrevanje semena na
14h/10h fotoperiodu
70
60
majke biljke gajene na
16h/8h fotoperiodu
50
materinski efekat
6(8h/16h)+16h/8h
fotoperioda na
sazrevanje semena na
14h/10h fotoperiodu
majke biljke gajene na
6(8h/16h)+16h/8h
fotoperiodu
40
30
20
10
0
2
5
7
Vreme (nedelja)
10
materinski efekat
6(14h/10h)+16h/8h
fotoperioda na
sazrevanje semena na
14h/10h fotoperiodu
majke biljke gajene na
6(14h/10h)+16h/8h
fotoperiodu
Nema značajnih razlika u sazrevanju semena na biljkama poreklom sa
6(14h/10h) + 16h/8h i 6(8h/16h) + 16h/8h fotoperioda, kao ni sazrevanja semena na
njihovim matičnim biljkama (grafikon R36).
82
U literaturi je primećen materinski efekat mineralnog sastava podloge na
rastenje sve do cvetanja kod biljke Plantago major, a isti se uočavao do treće
generacije (Miao et al. 1991), dok je kod Plantago lanceolata uočen materinski efekat
visokih temperatura na klijanje, i verovatnoću za cvetanje (Lacey and Herr 2000).
Grafikon R37: Materinski efekat različitih fotoperioda na broj sazrelih semena
na biljkama C.rubrum gajenih na 14h/10h fotoperiodu (prikazano punim stubićima).
Isprekidanim tankim linijama prikazan broj sazrelih semena na majkama biljkama koje
su gajene na različitim fotoperiodima..
Broj sazrelih semena po biljci
40
35
30
25
20
15
10
5
0
materinski efekat
14h/10h fotoperioda na
broj semena sazrelih
na 14h/10h fotoperiodu
materinski efekat
6(8h/16h)+16h/8h
fotoperioda na broj
semena sazrelih
14h/10h fotoperiodu
materinski efekat
6(14h/10h)+16h/8h
fotoperioda na broj
semena sazrelih na
14h/10h fotoperiodu
materinski efekat
16h/8h fotoperioda na
broj semena sazrelih
na 14h/10h fotoperiodu
Materinski efekat fotoperioda se vidi i na broj sazrelih semena na 14h/10h
fotoperiodu (grafikon R37). Tako je najveći broj semena sazreo na biljkama čije su
majke biljke rasle i donosile seme na istom 14h/10h fotoperiodu. Značajno je manji broj
semena sazreo na biljkama poreklom od semena sa ostala tri fotoperioda. Istovremeno
broj sazrelih semena na biljkama poreklom od semena sa 14h/10h fotoperioda je i
značajno veći od broja semena sazrelih na njihovim majkama biljkama (grafikon R37).
Sasvim obrnuto važi za biljke poreklom sa ostala 3 fotoperioda, a gajene na 14h/10h
fotoperiodu. Broj sazrelih semena na ovim biljkama je bio značajno manji od broja
semena sazrelih na njihovim majkama biljkama koje su gajene na različitim
fotoperiodima (grafikon R37). Najmanje semena (0.39 semena po biljci) sazrelo je na
biljkama poreklom od semena sa 16h/8h fotoperioda.
83
Vidimo i potpuno obrnut odnos efekta dužine dana na broj sazrelih semena
namajkama biljkama i materinskog efekta fotoperioda na sazrevanje semena. Najviše
semena sazrevalo je na majkama biljkama gajenim na 16h/8h fotoperiodu, dok je na
14h/10h fotoperiodu najviše semena sazrevalo na biljakama poreklom od semena
sazrevalog na 14h/10h fotoperiodu. Drugim rečima, materinski efekat 14h/10h
fotoperioda se ogleda i u najboljoj “pripremljenosti” biljaka poreklom od semena sa
ovog fotoperioda da ostavi najbrojnije potomstvo, što je u skladu sa pisanjem Galloway
(2005).
Sa povećanjem dužine dana, sa 14h na 16h na kome su gajene majke biljke in vitro na 25 ºC
raste i masa semena. Obrnuto je pokazano za mase semena koja su dobijena gajenjem biljaka in vivo,
na temperaturi spoljašnje sredine. Možemo pretpostaviti kombinovani efekat fotoperioda i temperature,
kojoj su biljke izložene, na masu semena koja na njima sazrevaju.
Materinski efekat fotoperioda proteže se kroz čitav životni ciklus biljke C.rubrum, od klijanja,
preko rastenja, do cvetanja i donošenja semena. Za klijanje semena, visinu i broj listova potomstva,
ključni značaj ima fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života (indukcija
cvetanja majki biljki), dok za cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji
sledi posle indukcije cvetanja majki biljki.
Majke biljke C.rubrum u semenu ostavljaju “informaciju” o dužini dana koju su iskusile u toku
svog životnog ciklusa, i to je mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi fenotipove svog potomstva
da poveća svoj uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije iskusiti.
84
4.2.2.2. Materinski efekat fotoperioda na
proteine semena C. rubrum
Iz rezultata prikazanih u poglavlju 4.2.2. zaključili smo da majke biljke C. rubrum
“informaciju” o fotoperiodima kojima su bile izložene u toku svog životnog ciklusa
ostavljaju u semenu. Za klijanje semena i rastenje potomstva, ključni značaj ima
fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za
cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji je usledio
posle indukcije cvetanja majki biljki. Pretpostavili smo da bi ta “informacija” mogla biti,
između ostalog, sadržana i vidljiva u kompoziciji ukupnih proteina semena. Da bismo to
proverili, odredili smo ukupne koncentracije proteina (grafikon R 38) u semenima
sakupljenim sa biljaka gajenim na različitim fotoperiodima, i uradili razdvajanje proteina
semena (slika R5) poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE). Koristili smo po 0.03
g suvih semena, imbibovanih u mraku 2.5h. Osim 4 grupe semena koja su dobijena sa
biljaka gajenih na različitim indukcionim fotoperiodima i kombinacijama različitih
fotoperioda (opisano u poglavlju 4.2.1.), u analizu proteina semena uvrstili smo i
semena sakupljena sa biljaka koje su prvih 17 dana gajene na kontinualnoj svetlosti, a
potom prebačene na indukcioni 14h/10h fotoperiod (opisano u poglavlju 4.1.3.1.).
Ukupna koncentracije proteina, u uzorcima semena sakupljenih sa biljaka
gajenih na različitim fotoperiodima, bile su prilično ujednačene (grafikon R38). Najviša
ukupna koncentracija proteina utvrđena je u semenima koja su sakupljena sa biljaka
koje su prvih 17 dana gajene na KS, a potom prebačene na 14h/10h fotoperiod.
Posle SDS –PAGE elektroforeze, na gelu je utvrđeno postojanje ukupno 33
proteinske trake koje su sve prisutne u svim uzorcima semena. 16 od ovih proteina se
ne menjaju u zavisnosti od fotoperioda na kojima rastu majke biljke. Za 17 od njih je
uočena razlika u širini i intenzitetu traka u zavisnosti od fotoperioda na kojima su
gajene majke biljke (slika R5). Možemo pretpostaviti da više od polovine (17 od ukupno
33) proteina semena, finim promenama količine u semenu, predstavljaju “informaciju” o
fotoperiodu majke biljke koju ona, u svom smenu, ostavlja za potomstvo. Da bismo
kvantifikovali ove razlike, odredili smo relativne vrednosti intenziteta ovih 17 proteinskih
traka (grafikon R39).
85
Grafikon R38: Efekat različitih fotoperioda na kojima su gajene majke biljke na
ukupnu koncentraciju proteina semena.
Koncentracija proteina (mg/g dw)
50
40
30
20
10
0
14h/10h
6(8h/16h)+16h/8h
6(14h/10h)+16h/8h
16h/8h
17KS+14h/10h
Fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke
Slika R5: Efekat različitih fotoperioda na kojima su gajene biljke na razlike u
količinama pojedinih proteina semena (na gelu označene samo Rf vrednosti proteinskih
traka kod kojih je uočena razlika u širini i intenzitetu u uzorcima semena dobijenim sa
biljaka gajenih na različitim fotoperiodima).
86
80.000,00
450.000,00
80.000,00
Rf = 0.20
60.000,00
60.000,00
40.000,00
40.000,00
Rf = 0.44
Rf = 0.41
400.000,00
350.000,00
300.000,00
250.000,00
200.000,00
150.000,00
20.000,00
20.000,00
0,00
0,00
100.000,00
50.000,00
80.000,00
0,00
80.000,00
60.000,00
60.000,00
40.000,00
40.000,00
20.000,00
20.000,00
0,00
0,00
450.000,00
Rf = 0.51
Rf = 0.24
Rf = 0.58
400.000,00
350.000,00
300.000,00
250.000,00
200.000,00
150.000,00
100.000,00
Relativna vrednost intenziteta traka
50.000,00
80.000,00
0,00
450.000,00
80.000,00
Rf = 0.30
Rf = 0.72
60.000,00
60.000,00
40.000,00
40.000,00
20.000,00
20.000,00
0,00
0,00
Rf = 0.64
400.000,00
350.000,00
300.000,00
250.000,00
200.000,00
150.000,00
100.000,00
50.000,00
80.000,00
0,00
450.000,00
80.000,00
Rf = 0.33
60.000,00
60.000,00
40.000,00
40.000,00
20.000,00
20.000,00
0,00
0,00
Rf = 0.76
Rf = 0.66
400.000,00
350.000,00
300.000,00
250.000,00
200.000,00
150.000,00
100.000,00
50.000,00
0,00
450.000,00
80.000,00
80.000,00
Rf = 0.91
Rf = 0.36
60.000,00
Rf = 0.80
400.000,00
60.000,00
350.000,00
300.000,00
40.000,00
250.000,00
40.000,00
200.000,00
20.000,00
150.000,00
20.000,00
100.000,00
0,00
14h/10h
0,00
80.000,00
6(8h/16h) +
16h/8h
6(14h/10h) +
16h/8h
16h/8h
17KS +
14h/10h
50.000,00
0,00
450.000,00
Rf = 0.37
Rf = 0.83
400.000,00
350.000,00
60.000,00
300.000,00
250.000,00
40.000,00
200.000,00
150.000,00
20.000,00
100.000,00
50.000,00
0,00
0,00
14h/10h
6(8h/16h) +
16h/8h
6(14h/10h) +
16h/8h
16h/8h
17KS +
14h/10h
14h/10h
6(8h/16h) +
16h/8h
6(14h/10h) +
16h/8h
16h/8h
17KS +
14h/10h
Fotoperiodi na kojima su gajene majke biljke
Grafikon R39: Efekat različitih fotoperioda na kojima su gajene biljke na razlike u
količinama pojedinih proteina semena (Izraženo relativnim vrednostima intenziteta traka).
87
Vidimo značajne razlike u relativoj vrednosti intenziteta traka svih 17 proteina
(grafikon R39).
Posmatranjem promena relativnih vrednosti intenziteta ovih 17 proteinskih traka
semena u odnosu na fotoperiode kojima su bile izložene majke biljke u toku svog
životnog ciklusa, primetili smo, i izračunali, njihove korelacije sa dužinama dana kojima
su majke biljke bile izložene u različitim fazama razvića, kao i sa klijanjem tih semena.
Visoke korelacije su uočene za 12 proteinskih traka, a rezultati su predstavljeni u tabeli
R1.
Tabela R1: Korelacije između promena relativnih vrednosti intenziteta 12
proteinskih traka semena (grafikon R 39), i dužina dana kojima su majke biljke bile
izložene u različitim fazama razvića, ili klijanja.
Koeficijent
Proteinska traka
Dužina dana na kojoj su rasle majke biljke
korelacije
Rf = 0.58
r = 0.94
prvih 6 dana:
Rf = 0.64
r = 0.93
14h, 8h, 14h, 16h, 24h (grafikon R 39)
Rf = 0.66
r = 0.96
Rf = 0.80
prvih 12 dana:
r = 0.97
14h, (8h + 16h), (10h + 16h), 16h, 24h
Rf = 0.83
r = 0.81
(grafikon R 39 )
između 6 i 17. dana: 14h, 16h, 16h, 16h, 24h
Rf = 0.36
r = - 0.95
(grafikon R 39 )
Rf = 0.30
r = - 0.88
posle 17. dana:
14h, 16h, 16h, 16h, 14h (grafikon R 39 )
Rf = 0.37
r = - 0.90
Klijanje
Rf = 0.44
r = 0.85
Rf = 0.51
Procenat klijanja 2. dana prve 4 grupe semena
r = 0.94
(grafikon R 32, 39)
Rf = 0.76
r = 0.97
Rf = 0.91
r = 0.99
Na osnovu korelacija koje smo uočili (tabela R 1), vidimo da određeni proteini
semena pokazuju promene koncentracija (promene relativnih vrednosti intenziteta
traka) u zavisnosti od dužina dana kojima su majke biljke bile izložene u određenim
fazama životnog ciklusa, i to:
-proteini semena čije su Rf vrednosti 0.58, 0.64 i 0.66 mogli bi biti sastavni deo
“informacije” o dužini dana kojoj su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana,
-proteini čije su Rf vrednosti 0.80 i 0.83 mogli bi biti sastavni deo “informacije” o
dužini dana kojoj su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana i neposredno posle toga,
-protein čija je Rf vrednost 0.36 mogao bi biti sastavni deo “informacije” o dužini
88
dana kojoj su majke biljke bile izložene posle 6, a pre 17 dana,
-proteini čije su Rf vrednosti 0.30 i 0.37 mogli bi nositi “informaciju” o dužini dana
posle 17 dana.
Dodatno, promene relativnih vrednosti intenziteta traka proteina semena čije su
Rf vrednosti 0.44, 0.51, 0.76 i 0.91 u zavisnosti od fotoperioda kojima su bile izložene
majke biljke u toku svog životnog ciklusa, pokazuju visoke korelacije sa procentima
klijanja tih semena 2. dana (grafikon R 22). Ovi proteini bi, prema tome, mogli
učestvovati u regulaciji klijanja potomstva, kao jednog od procesa sa najvećim
značajem u ontogenetskom razviću biljke. Istovremeno, klijanje je i prvi proces u toku
ontogeneze potomstva za koji je logično da se dešava “isključivo” pod uticajem
“informacija” koje je u semenu ostavila majka biljka, pre nego što mlada jedinka može i
sopstveno “iskustvo” faktora spoljašnje sredine da “uvrsti” u dalje rastenje i razviće (što
smo pokazali u poglavlju 4.2.2.1.3.). U skladu sa ovim, Mazzaella i saradnici (2005) su
pokazali da se osvetljavanje semena Arabidopsis-a posle 5 dana imbibicije u mraku na
5 ºC, uglavnom preko phyB, prenosi kao informacija o spoljašnjoj sredini kakvu će
klijanac najverovatnije iskusiti. Odnosno, semena Arabidopsis-a, koja zahtevaju
vernalizaciju da bi klijala, mogu da prime informacije iz spoljašnje sredine, i uporede ih
sa “informacijama” koje je u semenu ostavila majka biljka, već posle 5 dana imbibicije.
Možemo, takođe, uočiti da je povećana koncentracija ukupnih proteina u
semenima koja su sakupljena sa biljaka koje su prvih 17 dana gajene na KS (grafikon
R38), a potom prebačene na 14h/10h fotoperiod, posledica povećanih koncentracija
svega 6 proteina čije su Rf vrednosti 0.41, 0.51, 0.58, 0.66, 0.80 i 0.83 (grafikon R 39).
Otuda možemo pretpostaviti da ovih 6 proteina učestvuju u “informaciji”, kako o
neprekidnom osvetljavanju u početnim fazama razvića, tj. prvih 17 dana razvića, tako i
o “odloženoj” indukciji cvetanja za 17 dana u odnosu na ostale 4 grupe semena koje su
sakupljene sa biljaka koje su indukciju za cvetanje primile još u fazi razvića kotoledona
(od prvog dana gajenja na podlogama).
Svi ovi rezultati ukazuju da biljka C. rubrum u semenu ostavlja “kalendar”
promena dužina dana koje je u svojoj ontogenezi iskusila, i da je taj “kalendar”, između
ostalog, vidljiv u relativnoj kompoziciji proteina semena.
Analiza strukture i lokalizacije rezervnih materija semena Chenopodium quinoa
(Prego et al. 1998) pokazala je da su proteinske rezerve lokalizovane uglavnom u
endospermu i embrionu, kao i da je struktura semena vrlo slična ne samo u okviru roda
89
Chenopodium, već i u okviru familije Chenopodiaceae.
Analiza proteina semena sakupljenih sa biljaka 20 populacija Chenopodium
incanum, pokazala je veću sličnost proteinskih traka kada su uzorci semena uzimani sa
biljaka bliskih, nego geografski udaljenih, lokaliteta, mada je bilo i izuzetaka (Crawford
1974). Razdvajanjem proteina semena SDS PAGE elektroforezom različitih vrsta roda
Chenopodium (Bhargava et al. 2005), uočena je kako razlika u širinama pojedinih
proteinskih traka, tako čak, i prisustvo odnosno odsustvo pojedinih traka u uzorcima
semena iste vrste, sakupljenih sa udaljenih lokaliteta. Ova istraživanja su sprovedena u
cilju utvrđivanja taksonomskih kategorija i porekla i evolucije kultivisanih biljaka.
U našem slučaju, postojanje svih proteinskih traka (33) u svim uzorcima
semena, je s jedne strane, potvrda genetičke uniformnosti semena koja se umnožavaju
u staklari Instituta poslednjih petnaestak godina, a istovremeno i potvrda da su razlike u
količinama pojedinih proteina semena rezultat različitih fotoperioda kojima su izlagane
biljke sa kojih su semena sakupljana.
Prikazani rezultati mogu biti potvrda na biohemijskom nivou, fiziološki pokazanih materinskih
efekata fotoperioda na rastenje i razviće: “informacije” o promenama dužina dana kojima su majke biljke
bile izložene u toku svog životnog ciklusa i koju u semenu “ostavljaju” potomstvu, mogle bi, između
ostalog, biti proteinske prirode.
Visoke korelacije između promena koncentracija nekih proteina semena sa dužinama dana
kojima su majke biljke bile izložene u određenim fazama životnog ciklusa, mogu ukazati da “materinski
proteinski zapis” predstavlja “kalendar” promena dužina dana u toku života majke biljke.
90
Rezultati prikazani u ovom poglavlju ukazuju na sledeće zaključke:
1. Biljke Chenopodium rubrum odgovaraju na fotoperiod kome su izložene
u svim fazama razvića: rastenjem, cvetanjem, vremenom sazrevanja semena i brojem
sazrelih semena. Sa povećanjem dužine dana, dolazi i do povećanja visine biljaka kao i
broja listova, odlaže se cvetanje, biljke ranije u toku ontogeneze donose seme, i
povećava se broj sazrelih semena i masa semena.
Fotoperiod kome su biljke C. rubrum izložene prvih 6 dana (indukcija cvetanja) i
fotoperiod koji neposredno zatim sledi (evokacija cvetanja) određuje njihovo rastenje
do kraja ontogeneze, cvetanje i sazrevanje semena.
2. Majke biljke C.rubrum u semenu ostavljaju “informaciju” o dužinama
dana koju su iskusile u toku svog životnog ciklusa, i to je mehanizam kojim majka
biljka može da prilagodi fenotipove potomstva da poveća uspeh u spoljašnjoj sredini
kakvu će najverovatnije iskusiti. Materinski efekat fotoperoda se kod biljaka C.
rubrum proteže kroz čitav životni ciklus potomstva.
Za klijanje semena, visinu i broj listova potomstva, ključni značaj ima
fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za
cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi
posle indukcije cvetanja majki biljki.
“Informacije” o promenama dužina dana (i njihovom redosledu), kojima su
majke biljke bile izložene u toku svog životnog ciklusa i koju u semenu “ostavljaju”
potomstvu, mogli bi biti, između ostalog, na nivou proteina.
91
4.3. Efekat natrijum nitroprusida (SNP) i
kalijum cijanida (KCN) u toku vegetativnog
i reproduktivnog razvića C. rubrum in vitro
Utvrđeno je da NO, kao ključni signalni molekul kod biljaka (Neill et al. 2003),
stimulira klijanje kod različitih biljnih vrsta (Giba et al. 1998, Beligni and Lamatina 2000,
Neill et al. 2003), u zavisnosti od koncentracije inhibira ili stimulira rastenje (Stamler et
al. 1992), odlaže senescenciju (Leshem and Pinchasov 2000), odlaže cvetanje u korist
rastenja (He et al., 2004). Sva ova i mnoga druga istraživanja podržavaju ideju da je
NO “do it all” molekul (Delledonne 2005) koji ima suštinsku ulogu tokom čitavog života
biljke. Uticaj NO na biljke i većinu organizama se ispituje primenom NO-donora, a
najčešće se koristi natrijum nitroprusid (SNP).
Bethke i saradnici (2006) su pokazali da kako SNP, tako i KCN, kalijum
fericijanid (K3[Fe(CN)6]) i kalijum ferocijanid (K4Fe(CN)6) smanjuju dormanciju A.
thaliana, generišući CN-. Osim toga, efekti CN-, nitrita i nitrata na smanjivanje ili
ukidanje dormancije bili su sprečeni “sakupljačem” NO c-PTIO. Takođe, su pokazali da
je količina oslobođenog NO gasa iz SNP vrlo mala, te da efekat SNP potiče od gasa
CN. Pretpostavili su da primena cijanida može imati za rezultat povišen unutarćelijski
nivo NO interagujući sa enzimima koji vrše detoksikaciju NO (Bethke et al. 2006).
Kod biljaka je pokazana signalna uloga NO i u hormonskim i odbrambenim
odgovorima. Guo i saradnici (2003) su utvrdil da se produkcija NO u vrhovima
korenova klijanaca A. thaliana značajno povećava u ABA tretiranim korenovima. ABA
takođe pojačava sintezu NO u stomama i dovodi do njihovog zatvaranja (Neil et al.
2002). Pagnussat i saradnici (2002) su pokazali da NO posreduje u auksinskoj kontroli
formiranja adventivnih korenova krastavca. Pokazano je i da NO ima suprotan efekat
etilenu, tj. da sprečava sazrevanje plodova jagode i avokada (Leshem and Pinchasov
2000). Citokinin, kao hormon koji inhibira senescenciju, stimulira produkciju NO (Tun et
al 2001). Međutim, pretpostavljeno je da giberelini i NO u regulaciji klijanja pšenice
učestvuju nezavisnim putevima (Zhang et al. 2005).
92
4.3.1. Efekat SNP i KCN na klijanje semena C. rubrum
Prvi otkriveni fenomen vezan za NO kod biljaka, bio je stimulacija klijanja
indukovana svetlošću, iako je delovanje nitrita i nitrata na stimulaciju klijanja poznata
još od početka 20. veka. Jedinjenja, kao SNP, promovišu klijanje posebno
fotoblastičnih semena, povećavajući njihovu osetljivost na svetlost. Ali i nefotoblastična
(Sisymbrium officinale, Karssen and Hilhorst 1992), i čak ni ona koja normalno ne
dolaze u kontakt sa zemljištem bogatim nitratima (familija Gentianaceae, Grubišić et al.
1995) odgovaraju na SNP. Takođe je pokazano da SNP, ili drugi NO donori, utiču na
phy A specifičnu indukciju klijanja A. thaliana (Batak et al. 2002).
Osetljivost dormantnih semena na azotne okside može da objasni promotivni
efekat dima, koji se razvija usled požara, na klijanje i to kao ekstremni slučaj
generalnog mehanizma kojim ekosistemi regulišu vreme i dinamiku klijanja različitih
vrsta u vezi sa sezonskim promenama spoljašnje sredine. Prenosioci ovih informacija
su azotni oksidi. Oni se u zemljištu nalaze kao gasovi u tragovima i pružaju informaciju
kako o nivou nitrata u zemljištu, tako i o mikrobialnoj aktivnosti, što je u vezi sa
sezonskim i klimatskim promenama spoljašnje sredine koju će klijanci iskusiti (Giba et
al. 2004).
4.3.1.1. Efekat SNP na klijanje semena C. rubrum
Da bismo ispitali efekat NO na klijanje C.rubrum, koristili smo NO donor SNP (10
– 200 μM).
U testovima klijanja korišćena su dva stoka semena, stara 3-4 godine,
sakupljena na dve dužine dana. Jedan stok je sakupljen na 13h danu (masa 100
semena = 0.0262  0.0011 g), a drugi na 14h danu (masa 100 semena = 0,0314 
0.0005 g). Dužina dana u vreme cvetanja i zametanja ovih semena nije registrovana.
Pošto su uočene razlike u klijanju ovih semena, rezultati su posebno predstavljeni na
grafikonu R40 A) i B).
SNP stimulira klijanje semena C.rubrum sazrelog na 13h/11h fotoperiodu, u
nižim koncentracijama (10 i 50 μM) i to samo u najranijim fazama klijanja (1. dan
klijanja), dok 150 μM SNP inhibira klijanje, takođe samo 1. dana klijanja, a taj efekat se
93
gubi do 4. dana klijanja (grafikon R40 A). Maksimalna stimulacija klijanja Paulownia
tomentosa (Giba et al. 2004) bila je postignuta sa 10-3 M SNP, dok je Bethke et al.
(2005) pokazao da para SNP (100 i 200 μM) stimulira klijanje i ukida dormanciju
Arabidopsis thaliana. Takođe je pokazano da SNP (do 200 μM) stimulira klijanje Sueda
salsa (familija Chenopodiaceae) (Li et al. 2005).
Grafikon R40: Efekat SNP (0 – 200 μM) na klijanje semena C.rubrum sazrelog
na A) 13h/11h fotoperiodu starog 3 godine i B) -14h/10h fotoperiodu, starog 4 godine.
100
A)
Klijanje (%)
80
Kontrola
SNP10
SNP 50
SNP100
SNP150
60
40
20
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
100
B)
Klijanje (%)
80
Kontrola
SNP 10
SNP 50
SNP 100
SNP 200
60
40
20
0
1
2
3
Vreme (dani)
94
4
Interesantno je primetiti da je efekat SNP na klijanje C. rubrum značajno manje
izražen (nema statistički značajnih razlika) kada je seme sazrelo na 14h/10h
fotoperiodu (grafikon R40 B). U prilog prethodnom poglavlju (4.2.2.1.2.) koje govori o
materinskom efektu fotoperioda, na kljanje, vidimo da semena sazrela na 14h/10h
fotoperiodu (grafikon R40 B) imaju drugačiju krivu klijanja (posmatramo klijanje
kontrolnih semena) u odnosu na semena sazrela na 13h/11h fotoperiodu (grafikon R40
A), ali da pokazuju i drugačiju osetljivost na SNP. U prva dva dana klijanja, kontrolna
semena sazrela na 14h/10h fotoperiodu klijaju svega 9 %, odn 15% (grafikon R40 B),
za razliku od semena sazrelih na 13h/9h fotoperiodu koja za isto vreme klijaju 35 %,
odn, čak 81 % (grafikon R40 A). Trećeg i četvrtog dana klijanja, ova se razlika gubi,
kada je u oba slučaja klijanje je blizu 100 % (grafikon R40 A, B).
Ranije su spomenuti podaci iz literature koji govore o razlici u veličini semena,
debljini semenjače, klijanju kada semena sazrevaju na kratkom, ili dugom danu
(Bewley and Black 1982, Bertero et al. 1999, Gutterman and Evenari 1972, Gutterman
2000, Gutterman 2002, Cook 1975, Mitrović et al. 2002). U našem slučaju, reč je o
razlici u dužini dana od samo 1h (13h, tj. 14h), tj. 1 mesec dana u sejanju, tj. kasnije i
sakupljanju semena. Ali bismo mogli pretpostaviti da kombinacija dužine dana i
specifične temperature u vreme zametanja i sazrevanja semena, može da dovede do
razlike i u debljini semenog omotača, što može da dovede i do sporijeg klijanja semena
sazrelih na 14h/10h fotoperiodu (grafikon R40 B), a takođe i do razlike u permeabilnosti
semenjače za SNP. Dodatno, ova semena se razlikuju i po starosti ( 3, odnosno 4
godine)
4.3.1.2. Efekat SNP i GA3 na klijanje semena C.rubrum
Za GA je pokazano da, najverovatnije, nema aditivni efekat sa NO na rane faze
klijanje pšenice (prvih 12 časova) i da bi ova dva molekula mogla da funkcionišu u
različitim signalnim kaskadama (Zhang et al. 2005). Pretpostavljeno je da bi NO mogao
da deluje kao rani stimulator β-amilaze da inicira klijanje, dok GA igra ključnu ulogu u
kasnijim fazama klijanja. Jovanović i saradnici (2005) su pokazali da nitrit giberelne
kiseline gubi svoju giberelinsku aktivnost posle nitrozilacije i stimulira klijanje P.
tomentoza i Stellaria media preko NO puta, kao i druga jedinjenja koja oslobađaju NO.
95
Iz rezultata prikazanih u poglavlju 4.3.1.1. smo odabrali koncentraciju od 50 μM
SNP (grafikon R40 A), a za 15 mM GA3 je ranije pokazano da ima najveći efekat na
rastenje i cvetanje C.rubrum (Mitrović 1998). Klijanje je praćeno svaka 24h tokom 4
dana u destilovanoj vodi, GA3 (15 mM GA3) i/ili SNP (50 M).
Pokazali smo (Dučić et al. 2003/4) da 160 M GA3 nema efekta na klijanje
C.rubrum. Ali koncentracija od 15 mM, koja je stimulirala rastenje i cvetanje C.rubrum
in vitro (Mitrović 1998) stimulira i klijanje u prva dva dana (grafikon R41). Pokazano je
da 50 M SNP stimulira klijanje, ali je 1. dana očigledan slab zbirni stimulatorni efekat
GA3 i SNP (grafikon R41). Ovaj efekat se kasnije u toku klijanja gubi. Trećeg i četvrtog
dana klijanja postignut je maksimalan procenat klijanja bez obzira na tretman (96 –
98%).
Grafikon R41: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) na klijanje semena
C.rubrum sazrelog na 13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.
100
Klijanje (%)
80
Kontrola
GA
SNP
GA+SNP
60
40
20
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
4.3.1.3. Efekat KCN na klijanje semena C. rubrum
Kao i u slučaju ispitivanja klijanja na SNP-u (grafikon R40), i ovde smo koristili
dva stoka semena, stara 3-4 godine, sazrela/sakupljena na dve dužine dana: 13h i 14h,
pa su zbog uočenih razlika rezultati su posebno predstavljeni na grafikonu R42 A) i B).
96
Vidimo da semena sazrela na 14h/10h (grafikon R42 A) fotoperiodu imaju
drugačiju krivu klijanja (posmatramo klijanje kontrolnih semena) u odnosu na semena
sazrela na 13h/11 fotoperiodu (grafikon R42 B), kao i da su procenti isklijalih semena 3
i 4. dana klijanja veći kod onih sazrelih na 13h/11h fotoperiodu.
Grafikon R42: Efekat KCN (10 – 1000 μM) na klijanje semena C.rubrum
sazrelog na A) 13h/11h fotoperiodu i B) sazrelog na 14h/10h fotoperiodu, starog 3
godine.
100
A)
Klijanje (%)
80
60
Kontrola
KCN 200
KCN400
KCN 800
40
20
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
100
B)
Klijanje (%)
80
Kontrola
KCN 10
KCN 50
KCN 100
KCN 200
KCN 1000
60
40
20
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
KCN (10 μM) stimulira klijanje prvog dana (grafikon R42 B), dok taj efekat
nestaje kasnije u toku klijanja. Više koncentracije KCN (100 - 1000 μM) inhibiraju
klijanje. Klijanje na 1000 μM KCN započinje tek 3. dana (grafikon R42 B), dok 4. dana
97
ova koncentracija stimulira klijanje.
Slično kao i na grafikonu R40 A) i B) koji pokazuju klijanje na SNP-u semena
sazrelih na različitim fotoperiodima, i na grafikonima R42 A) i B) koji pokazuju klijanje
na KCN, uočavamo različitu osetljivost semena sazrelih na dužinama dana od 13h i
14h na KCN. KCN (200 μM) inhibira klijanje semena, sazrelog na 13h/11h fotoperiodu,
prvog dana (30%) u odnosu na kontrolu (39%) (grafikon R40 A), dok ista koncentracija
KCN u slučaju semena sazrelog na 14h/10h fotoperiodu (grafikon R42 B), čak odlaže
početak klijanja na 2. dan.
Ako uporedimo efekte SNP (grafikon R40 B) i KCN (grafikon R42 B) na klijanje
C. rubrum, možemo da uočimo da je stimulatorni efekat 10 μM KCN više izražen nego
stimulatorni efekat iste koncentracije SNP.
4.3.1.4. Efekat cPTIO, KCN, i SNP na klijanje C.rubrum.
Već je pomenuto da egzogena primena NO kod biljaka i indukcija odgovora,
naravno sama po sebi ne dokazuje da endogeni NO utiče na određeni razvojni ili
fiziološki proces koji se proučava. Da bi se obezbedio pouzdan dokaz za ulogu NO,
korisno je pokazati da efekat donora NO može biti poništen primenom »uklanjača« NO,
kao
što
je
PTIO
(2-fenil-4,4,4,4-tetrametilimidazolin-1oksil
3-oksid)
ili
cPTIO
(karboksiPTIO) (Neill et al. 2003).
Grafikon R43: Efekat cPTIO (100 – 200 μM) na klijanje semena C.rubrum.
Semena sazrela na 13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.
100
90
80
Klijanje (%)
70
60
Kontrola
cPTIO 100
cPTIO 200
50
40
30
20
10
0
1
2
3
Vreme (dani)
98
4
Da bismo ispitali efekat “uklanjača” NO na klijanje C.rubrum , koristili smo cPTIO
(100 – 200 μM). (grafikon R43). Inhibicija klijanja izazvana cPTIO je daleko jače
izražena u ranijim fazama klijanja, tj u prva dva dana (grafikon R43), dok se 3. i 4. dana
gubi (nema statistički značajnih razlika). Pri tome nema statistički značajne razlike u
inhibiciji klijanja koju izaziva 200 μM i 100 μM cPTIO. To bi moglo da bude u skladu sa
podacima Zhang i saradnika (2005) koji su pokazali da NO kontroliše rane faze klijanja
pšenice (prvih 12 h), najverovatnije kao rani stimulator β-amilaze koja inicira klijanje. U
našem slučaju možemo pretpostaviti da su početne faze klijanja, kontrolisane
endogenim NO, inhibirane prisustvom cPTIO. Prvog dana klijanja inhibicija izazvana sa
100 μM cPTIO je oko 50%, dok 3. i 4. dana, kada je već postignut maksimum klijanja,
semena tretirana cPTIO “sustižu” kontrolna semena.
Grafikon R44: Efekat cPTIO (50 μM), KCN (50 μM) i SNP (50 μM) na klijanje
semna C.rubrum. Semena sazrela na 14h/10h fotoperiodu, starog 4 godine.
100
90
80
Klijanje (%)
70
60
KCN
KCN + cPTIO
SNP
SNP + cPTIO
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
Vreme (dani)
cPTIO srazmerno primenjenoj koncentraciji, pojačavao je dormanciju semena A.
thaliana, dok nije uticao na klijanje nedormantnih semena (Bethke et al. 2006). Bethke i
saradnici (2006) su pokazali da efekat SNP na ukidanje dormancije semena A. thaliana
može biti poništen dodavanjem iste koncentracije cPTIO, i da dalje povećavanje
99
koncentracije cPTIO nema efekta.
S obzirom da smo se odlučili za koncentraciju od 50 μM SNP, pa i KCN kao
najefektivnije u većini praćenih procesa, pokušali smo da pokažemo i zajednički efekat
cPTIO (50 μM) sa SNP ili KCN (grafikon R44).
Vidimo (grafikon R44) da cPTIO (50 μM) kada se nađe u medijumu za klijanje C.
rubrum zajedno sa KCN (50 μM), čak stimulira klijanje u odnosu na klijanje na KCN. Na
suprot tome, cPTIO (50 μM) zajedno u medijumu za klijanje sa SNP (50 μM), inhibira
klijanje u odnosu na klijanje na SNP-u, što je u skladu sa rezultatima Bethke et al
(2006). Oni su na semenu Arabidopsis thaliana pokazali da i SNP i CN i nitriti dovode
do povećanja količine NO, koja onda reaguje sa cPTIO i smanjuje njihov efekat na
klijanje.
SNP (10 i 50 μM) stimulira klijanje semena C.rubrum u najranijim fazama (1. dan).
I GA3 (15 mM) i SNP (50 M) stimuliraju najranije faze klijanja. Prvog dana klijanja, očigledan je
zbirni stimulatorni efekat GA3 i SNP, ali se on, kasnije u toku klijanja, gubi.
KCN (10 μM) stimulira klijanje C. rubrum u ranim fazama klijanja (prvog dana).
Veći stimulatorni efekat na klijanje C. rubrum pokazuje KCN (10 μM) u odnosu SNP (u istoj
koncentraciji)
cPTIO (100 i 200 μM) inhibira klijanje C. rubrum u ranijim fazama klijanja (u prva dva dana).
cPTIO (50 μM) zajedno u medijumu za klijanje sa SNP (50 μM), inhibira klijanje u odnosu na klijanje na
SNP-u, nasuprot tome, čak stimulira klijanje u odnosu na klijanje na KCN.
100
4.3.2. Efekat SNP i KCN na rastenje C. rubrum in vitro
4.3.2.1. Efekat SNP na rastenje C. rubrum in vitro
Po sterilnom isklijavanju semena, biljčice (4 dana stare) su postavljane na MS
podlogu sa 5% saharoze i različitim koncentracijama SNP (10 – 150 μM) i gajene 10
nedelja na indukcionom 14h/10h fotoperiodu.
Niže koncentracije SNP (10 i 50 μM) stimuliraju izduživanje stabla u prve tri
nedelje, ali se taj efekat gubi u kasnijim fazama razvića (grafikon R45). 100 i 150 μM
SNP inhibira izduživanje u odnosu na kontrolu, kroz čitav životni ciklus C.rubrum.
Stimulacija rastenja izazvana SNP (do 100 μM) pokazana je kod Arabidopsis-a, dok su
više koncentracije bile inhibitorne (He et al. 2004).
Grafikon R45: Efekat SNP (0 – 150 μM) na visinu stabla C.rubrum in vitro na
MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke poreklom od semena sazrelog na 16h/8h
fotoperiodu in vitro, starog 2 godine.
30
Visina (mm)
25
20
Kontrola
SNP 10
SNP 50
SNP 100
SNP 150
15
10
5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
10
Vreme (nedelja)
Uočavamo i tranzijentno zaustavljanje rastenja (grafikon R45) u vreme cvetanja
(grafikon R48) u 3. i 4. nedelji i kod kontrolnih biljaka i onih gajenih na SNP (10 i 50
μM). tj. ono je pomereno na 4. i 5. nedelju, kao i cvetanje (grafikon R42 i grafikon R48),
kod biljaka gajenih na 100 i 150 μM SNP. Odloženo cvetanje biljaka tretiranih SNP (10
– 100 μM) pokazano je i kod Arabidopsis thaliana (He et al. 2004).
101
Grafikon R46: Efekat SNP (10 – 150 μM) na broj pravih listova C.rubrum in vitro
na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.
12
Broj pravih listova
10
8
Kontrola
SNP 10
SNP 50
SNP 100
SNP150
6
4
2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
10
Vreme (nedelja)
Slika R5: Efekat SNP (10 – 150 M) na rastenje, cvetanje i sazrevanje semena
C.rubrum gajenih in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu, posle 10 nedelja
gajenja.
Kontrola
SNP
10 M
SNP
50 M
SNP
100 M
SNP
150 M
Kao i u slučaju izduživanja stabla, niže koncentracije SNP (10 i 50 μM)
stimuliraju formiranje listova (grafikon R 46), ali samo u prve dve nedelje, što je takođe
u skladu sa podacima He i saradnika (2004), dok više koncentracije SNP (100 i 150
μM) inhibiraju pojavu listova sve do 7. - 8. nedelje razvića, kada se taj efekat gubi.
102
4.3.2.2. Efekat SNP i GA3 na rastenje C.rubrum in vitro
Biljčice su posle sterilnog isklijavanja postavljane na MS podloge sa 5 %
saharoze i SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) i gajene na indukcionom 14h/10h fotoperiodu.
Grafikon R47: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) na rastenje C.rubrum in
vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke gajene od semena sazrelog na
13h/11h fotoperiodu, starog 3 godine.
30
Visina (mm)
25
20
Kontrola
GA
SNP
GA + SNP
15
10
5
0
1
2
4
Vreme (nedelja)
Grafikon R48: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (15 mM) na broj pravih listova
C.rubrum, gajenih in vitro na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.
7
Broj pravih listova
6
5
Kontrola
GA
SNP
GA + SNP
4
3
2
1
0
1
2
Vreme (nedelja)
103
4
Kao što je i u poglavlju 4.3.2.1. pokazano SNP (50 M) ima stimulatorni efekat
na izduživanje stabla C. rubrum (grafikon R47). Slično je ranije pokazano (Živanović et
al. 1995, Mitrović 1998, Mitrović et al. 2005) i za GA3 (15 mM), međutim na grafikonu
R47 vidimo da SNP “umanjuje” stimulatorni efekat giberelina na izduživanje stabla.
Tačnije, SNP (50 M) i GA3 (15 mM) zajedno u podlozi, stimuliraju izduživanje u
odnosu na kontrolu (2. i 4. nedelje), ali kao srednja vrednost pojedinačnih efekata SNP
i GA3. Vrlo sličan efekat SNP (50 M) i GA3 (15 mM) može se videti i na razviće listova
(grafikon R48).
4.3.2.3. Efekat KCN na rastenje C. rubrum in vitro
Da bismo uporedili efekte SNP i KCN na rastenje i cvetanje, kao što smo
prethodno uradili za klijanje, biljčice sa potpuno razvijenim kotiledonima, stare 4-5
dana, postavljali smo na MS podloge sa 5% saharoze i KCN (10 – 1000μM). Posle 15
dana gajenja, merili smo visinu biljaka (grafikon R49), broj pravih listova (grafikon R50)
i određivali smo procenat procvetalih biljaka (grafikon R51).
Vidimo da KCN (10 – 200 μM) nema značajan efekat na rastenje stabla
(grafikon R49), dok jedino 1000 μM KCN deluje inhibitorno. Na grafikonu R45 na kome
je prikazan efekat SNP na rastenje i vidimo da SNP stimulira rastenje u nižim
koncentracijama (10 i 50 μM), dok su više koncentracije (do 150 μM) inhibitorne.
Možemo zaključiti da KCN i SNP nemaju slične efekte na klijanje semena i na procese
daljeg rastenja C. rubrum.
20
18
16
Visina (mm)
Grafikon R49:
Efekat KCN (10 – 1000
μM) na rastenje C.rubrum
gajenim in vitro na MS
podlozi, na 14h/10h
fotoperiodu, 15 dana. Biljke
gajene od semena
sazrelog na 14h/10h
fotoperiodu, starog 3
godine.
14
12
10
8
6
4
2
0
0
10
50
100
KCN (μM)
104
200
1000
KCN u svim testiranim koncentracijama značajno stimulira razviće listova
(grafikon R50, Slika R6), što se takođe ne podudara sa podacima za efekat SNP na
razviće listova (grafikon R46) gde vidimo da samo 10 μM SNP stimulira razviće listova
posle dve nedelje gajenja in vitro.
4
3,5
Broj pravih listova
Grafikon R50:
Efekat KCN (10 – 1000
μM) na broj pravih listova
C.rubrum gajenim in vitro
na MS podlozi, na 14h/10h
fotoperiodu, 15 dana.
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
10
50
100
200
1000
KCN (μM)
Slika R6: Efekat KCN (10 – 1000
μM) na rastenje C.rubrum in vitro na MS
podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.
SNP (10 i 50 μM) stimulira izduživanje stabla i rastenje listova C.rubrum u prve dve nedelje
razvića, dok SNP (100 i 150 μM) deluju inhibitorno. Od 5 – 10 nedelje razvića, sve primenjene
koncentracije SNP (10 – 150 μM) deluju inhibitorno na rastenje.
I SNP (50 M) i GA3 (15 mM) stimuliraju izduživanje stabla i razviće listova C. rubrum, ali je
stimulatorni efekat GA3 izraženiji. Kada se nađu zajedno u podlozi, SNP “umanjuje” stimulatorni efekat
giberelina.
KCN (10 – 200 μM) nema značajan efekat na rastenje stabla C. rubrum, dok 1000 μM KCN
deluje inhibitorno. KCN (10 – 1000 μM) stimulira razviće listova C. rubrum.
105
4.3.3. Efekat SNP i KCN na cvetanje i donošenje semena
C. rubrum in vitro
4.3.3.1. Efekat SNP na cvetanje i donošenje semena C. rubrum in vitro
Zivot cvetnica je podeljen u dve odvojene faze: prvu vegetativnu u kojoj
meristem produkuje listove za kojom sledi druga – reproduktivna u kojoj meristem
produkuje cvetove. Genetičkim istraživanjima je utvrđeno da je prelazak iz vegetativne
u reproduktivnu fazu razvića kod Arabidopsis-a (Simpson and Dean 2002) kontrolisan
signalima iz spoljašnje sredine (fotoperiodom i vernalizacijom) i internim signalima,
(autonomnom i giberelinskom kontrolom).
Grafikon R51: Efekat SNP (10 – 150 μM) na cvetanje C.rubrum in vitro na MS
podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke poreklom od semena sazrelog na 16h/8h
fotoperiodu in vitro, starog 2 godine.
100
Cvetanje (%)
80
Kontrola
SNP 10
SNP 50
SNP 100
SNP 150
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
10
Vreme (nedelja)
Pokazano je da NO učestvuje u fotoperiodskoj i autonomnoj kontroli cvetanja, tj
može da integriše egzogene i endogene signale time što je nastajanje NO kako
kontrolisano spoljšnjim stimulusima tako se on i konstitutivno sintetiše (He et al 2004).
Tako se informacije iz spoljašnje sredine i “uputstva” iz same biljke sustiču u jednoj
tački – regulaciji nivoa NO, koji prenosi te signale na mrežu procesa koji dovode do
tranzicije u cvetanje, a regulisani su na nivou transkripcije. Time je obezbeđen
106
jedinstven nivo regulacije cvetanja. Pokazano je da egzogena primena SNP na klijance
Arabidopsis thaliana dovodil do odlaganja cvetanja i pojačanog vegetativnog rastenja
(He et al. 2004) i dati su farmakološki, fiziološki, molekularni i genetički dokazi da NO
vrši represiju i fotoperiodskog i autonomnog puta koji dovode do cvetanja. Iako je za
više gena utvrđeno da su pod regulacijom i svetlosti i NO-a, pretpostavljeno je da je
primarna uloga NO u prevođenju svetlosnog signala, dok je njegov efekat na cvetanje
posredan (He et al. 2004).
Grafikon R52: Efekat SNP (0 – 150 μM) na donošenje semena C.rubrum in vitro
na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu.
Broj biljaka sa zrelim semenom (%)
60
50
40
Kontrola
SNP 10
SNP 50
SNP 100
SNP150
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
10
Vreme (nedelja)
Slično kao i rastenje, samo 10 μM SNP stimulira cvetanje (grafikon R51), pa
druge nedelje na ovoj podlozi cveta 33% biljaka u odnosu na svega 4% kontrolnih. Više
koncentracije SNP (100 i 150 μM) inhibiraju cvetanje. Na podlozi sa 100 μM SNP
cvetanje je uočeno 3. nedelje, a na 150 μM tek 6. nedelje razvića. Vidimo da SNP (100
μM i 150 μM) odlažu cvetanje. U 7. nedelji i na podlozi sa 100 μM SNP cveta 100%
biljaka, a na 150 μM SNP svega 12.5% biljaka, što je u skladu sa podacima He et al.
(2004).
Sazrevanje semena (grafikon R52) započinje 4-5 nedelja posle početka cvetanja
(grafikon R51) u slučaju kontrolnih biljaka. Možemo primetiti da SNP (50 i 100 μM)
“ubrzavaju” sazrevanje semena. Takođe vidimo (grafikon R52) da je najveći broj biljaka
107
sa zrelim semenom 8. i 10. nedelje upravo na 50 μM SNP.
108
4.3.3.2. Efekat SNP i GA3 na cvetanje C. rubrum in vitro
Kako je već spomenuto, Simpson i Dean (2002) su pokazali da je tranzicija u
cvetanje kod Arabidopsis-a kontrolisana fotoperiodom i vernalizacijom, kao faktorima
spoljašnje sredine i autonomnom i giberelinskom kontrolom kao internim mehanizma
biljke. He i saradnici su pokazali da je nivo NO u biljci kontrolisan fotoperiodom i
autonomnim signalima, a povišenje nivoa NO funkcioniše u smislu odlaganja cvetanja
(He et al. 2004). S druge strane, Kulikowska-Gulewska i saradnici (2000) su
pretpostavili da giberelini igraju značajnu ulogu u fitohromski kontrolisanim procesima
koji dovode do cvetanja. Prema tome veza između NO i GA u kontroli cvetanja, mogla
bi se pretpostaviti na nivou fotoperiodske kontrole.
Grafikon R53: Efekat SNP (50 M) i/ili GA3 (5mg/l) na cvetanje C.rubrum in vitro
na MS podlozi, na 14h/10h fotoperiodu. Biljke gajene od semena sazrelog na 13h/11h
fotoperiodu, starog 3 godine.
100
90
80
Cvetanje (%)
70
60
Kontrola
GA
SNP
GA + SNP
50
40
30
20
10
0
1
2
4
Vreme (nedelja)
SNP (50 M) odlaže cvetanje (grafikon R53). Cvetanje se na podlozi sa SNP
javlja tek u drugoj nedelji gajenja, kada na kontrolnoj podlozi cveta već 54 % biljaka.
GA3 (15 mM) značajno stimulira cvetanje u prve dve nedelje gajenja. 80%, biljaka na
podlozi sa GA3 cveta u odnosu na svega 10% biljaka na kontrolnoj podlozi, na kraju
prve nedelje, dok cvetanje nije uočeno na podlozi sa SNP (50 M). SNP u podlozi
zajedno sa GA3 umanjuje stimulatorni efekat giberelina, i ovaj efekat se uočava tokom
109
sve 4 nedelje gajenja (grafikon R53). He et al. (2004) je ukazao da bi NO mogao da
funkcioniše paralelno sa GA u regulaciji cvetanja: GA je promovisao cvetanje kod nox1
Arabidopsis-a (mutant sa povišenim endogenim nivoom NO i patuljastim fenotipom), ali
nije mogao da revertuje patuljasti fenotip.
Naši podaci su u skladu sa gore navedenom literaturom, jer SNP kao donor
egzogenog NO odlaže/inhibira cvetanje C. rubrum in vitro, na indukcionom fotoperiodu,
GA3 stimulira cvetanje, što je i ranije pokazano (Mitrović 1998), dok ova dva jedinjenja
kada se nađu zajedno u podlozi “sabiraju” svoja inhibitorna odn. stimulatorna dejstva.
Na osnovu navedene literature (Simpson and Dean 2002, Kulikowska-Gulewska et al.
2000) i naših podataka, možda bismo mogli pretpostaviti da NO put regulacije cvetanja
(preko fotoperioda i autonomnimne kontrole) i giberelinski put (takođe povezan sa
fotoperiodom) nisu povezani.
4.3.3.3. Efekat KCN na cvetanje C.rubrum in vitro
Uočili smo da samo 10 μM SNP stimulira cvetanje (grafikon R51), dok više
koncentracije (do 150 μM) odlažu ili inhibiraju cvetanje što je u skladu sa podacima He i
saradnika (2004) na A. thaliana. KCN nema sličan efekat sa SNP ni na cvetanje, pošto
vidimo (grafikon R54) da 10 – 200 μM KCN blago stimulira cvetanje, dok samo 1000
μM KCN inhibira cvetanje.
100
80
Cvetanje (%)
Grafikon R54:
Efekat KCN (10 – 1000
μM) na cvetanje
C.rubrum gajenim in vitro
na MS podlozi, na
14h/10h fotoperiodu, 15
dana. Biljke gajene od
semena sazrelog na
14h/10h fotoperiodu
starog 3 godine.
60
40
20
0
0
10
50
100
200
1000
KCN (μM)
Tanaka i saradnici (1983) su pokazali da fericijanid, ferocijanid i KCN mogu
indukovati cvetanje kod kratkodnevne biljke Lemna paucinostata in vitro i to pod
110
neprekidnom svetlošću. Kombinovanjem pokrovki od gaze i stakla, indukcije kratkim
danom i dodavanjem KOH, zaključili su da raspadanjem fericijanida, ferocijanida i KCN
nastaje HCN koji je odgovoran za idukciju cvetanja L. paucinostata.
SNP (10 μM) stimulira cvetanje C. rubrum, dok više koncentracije SNP (100 μM 150 μM) odlažu
cvetanje.
SNP (50 i 100 μM) ubrzava sazreanje semena C. rubrum.
SNP (50 M) odlaže cvetanje, dok GA3 (15 mM) značajno stimulira cvetanje. Kada se nađu
zajedno u podlozi, SNP umanjuje stimulatorni efekat giberelina na cvetanje.
KCN (10 – 200 μM) stimulira cvetanje C. rubrum, dok samo 1000 μM KCN inhibira cvetanje.
111
Rezultati prikazani u ovom poglavlju ukazuju na sledeće zaključke:
SNP i KCN, pokazuju različite efekte na klijanje, rastenje i cvetanje C.rubrum (tabela D2).
Klijanje: 10 i 50 μM SNP stimulira klijanje 1. dana, dok 10 μM KCN stimuliraju klijanje 1. dana. cPTIO ne ukida stimulaciju
klijanja izazvanu KCN, već je čak i pojačava.
Rastenje: 10 i 50 μM SNP stimulira izduživanje stabla i razviće listova u prve dve nedelje, dok 10-200 μM KCN nema
efekta na izduživanje stabla, a stimulira razviće listova.
Cvetanje: 10 μM SNP stimulira cvetanje, dok 50-150 μM odlaže. KCN (10-200 μM) stimulira cvetanje.
Pokazali smo da NO (SNP) i GA3 imaju efekta na klijanje, rastenje i cvetanje C. rubrum, ali na osnovu podataka dobijenih
njihovim zajedničkim prisustvom u podlozi, možemo pretpostaviti da je njihova uloga u ovim procesima nezavisna, ili ako su na
istom transdukcionom putu, njihovo mesto aktivnosti je veoma udaljeno.
Tabela D2: Efekti SNP i KCN na klijanje, rastenje, cvetanje i sazrevanje semena C.rubrum.
SNP
(10-150 μM)
klijanje
visina
Rastenje
Broj
listova
Cvetanje
Sazrevanje
semena
10 i 50 μM
stimulira
1. dana
10 i 50 μM
stimulira
1. i 2. nedelje.
100 i 150 μM
inhibira.
10 μM
stimulira,
50-150 μM
odlaže
50-150 μM
ubrzava
SNP
GA3 (15 mM)
GA3
+
(15 mM)
SNP (50 μM)
zbirni
stimulira 1.
stimulatorni
dana
efekat 1. dana
cPTIO (50 μM)
+
SNP (50 μM)
cPTIO inhibira u
odnosu na SNP
1.-4. dana
_
stimulira
_
SNP umanjuje
stimulatorni
efekat
GA3
_
112
KCN
cPTIO (50 μM)
KCN
+
(10-1000 μM)
KCN (50 μM)
10 μM
cPTIO stimulira
stimulira
u odn na KCN
1. dana
10-200 μM
nema efekta,
_
1000 μM
inhibira
cPTIO
(50 μM)
inhibira 1. i
2. dana
_
_
stimulira
_
_
_
10-200 μM
stimulira
_
_
_
_
_
_
5. Zaključci
1
Tokom klijanja semena C.rubrum dolazi do sekvencijalne ekspresije
antioksidativnih sistema. Pred izbijanje radikule catalaza (CAT), superoksid
dismutaze (SOD) i dehidroaskorbat (DHA) pokazuju maksimalnu aktivnost, a askorbat
(AA) je detektovan samo u to vreme. Maksimalan sadrzaj ukupnog glutationa, kao i
redukovane (GSH) i oksidovane forme (GSSG) je izmeren u vreme izbijanja radikule,
kada se javlja i peroksidazna (POD) aktivnost i raste posle tog perioda.
GA3 (160 μM) ne utiče na klijanje C. rubrum, indukuje porast aktivnosti CAT i
SOD u vreme pred izbijanje radikule, i pad koncentracije AA i DHA, a ne utiče na
glutation i peroksidaze.
Starenje semena utiče na smanjenu klijavost, rastenje i cvetanje biljaka C.
rubrum i na promenu antioksidativnog statusa semena. CAT, SOD, kao i sadržaj
glutationa su značajno niži, a de novo sinteza proteina počinje kasnije tokom imbibicije
starijuh semena. Dobijeni rezultati pokazuju da utvrđivanje aktivnosti antioksidativnih
enzima može biti uključeno u evaluaciju starosti semena.
GA3 smanjuje razliku u rastenju i cvetanju između biljaka poreklom od semena,
različite starosti tj. njihova osetljivost na GA3 je različita, pa se može pretpostaviti da
tokom starenja semena C. rubrum dolazi do promena u endogenom metabolizmu
giberelina.
U različitim fazama rastenja i razvića primećena je promena nivoa
antioksidativnih enzima. Najviša CAT aktivnost se može uočiti u vreme cvetanja.
Ukupna antioksidativna aktivnost pokazuje obrnut trend promena u toku razvića u
odnosu na antioksidativne enzime, sto ukazuje da i sadržaj drugih antioksidanata ima
ulogu u uklanjanju reaktivnih vrsta kiseonika u procesima razvića C. rubrum.
2.
Biljke Chenopodium rubrum odgovaraju na fotoperiod kome su izložene u
svim fazama razvića: rastenjem, cvetanjem, vremenom sazrevanja semena i
brojem sazrelih semena. Sa povećanjem dužine dana, dolazi i do povećanja visine
113
biljaka kao i broja listova, odlaže se cvetanje, biljke ranije u toku ontogeneze donose
seme, i povećava se broj sazrelih semena i masa semena.
Rastenje do kraja ontogeneze, cvetanje i sazrevanje semena C. rubrum,
određeni su fotoperiodom koji su biljke iskusile u vreme indukcije i evokacije cvetanja.,
odnosno, rastenje i reproduktivno razviće C. rubrum, osetljivo je na fotoperiod tokom
tačno određenog i kratkog vremena u odnosu na trajanje njihovog životnog ciklusa.
Majke biljke C. rubrum u semenu ostavljaju „informaciju“, koja bi između
ostalog mogla biti na nivou proteina, o dužinama dana koje su iskusile u toku
svog životnog ciklusa i to je mehanizam kojim majka biljka može da prilagodi
fenotipove potomstva da poveća uspeh u spoljašnjoj sredini kakvu će najverovatnije
iskusiti.
Materinski efekat fotoperoda se kod biljaka C. rubrum proteže kroz čitav
životni ciklus potomstva: za klijanje semena i rastenje potomstva, ključni znacaj ima
fotoperiod kome su majke biljke bile izložene u prvih 6 dana svog života, dok za
cvetanje i donošenje semena potomstva, značajniji uticaj ima fotoperiod koji sledi posle
indukcije cvetanja majki biljki.
3.
SNP i KCN, pokazuju različite efekte na klijanje, rastenje i cvetanje
C.rubrum.
Klijanje: 10 i 50 μM SNP stimulira klijanje 1. dana, dok samo 10 μM KCN
stimulira klijanje 1. dana. cPTIO ne ukida stimulaciju izazvanu KCN, već je čak i
pojačava.
Rastenje: 10 i 50 μM SNP stimulira izduživanje stabla i razviće listova u prve
dve nedelje, dok 10-200 μM KCN nema efekta na izduživanje stabla, a stimulira razviće
listova.
Cvetanje: 10 μM SNP stimulira cvetanje, dok 50-150 μM odlaže. KCN (10-200
μM) stimulira cvetanje.
NO (SNP) i GA3 imaju efekta na klijanje, rastenje i cvetanje C. rubrum, ali na
osnovu podataka dobijenih njihovim zajedničkim prisustvom u podlozi, možemo
pretpostaviti da je njihova uloga u ovim procesima nezavisna, ili ako su na istom
transdukcionom putu, njihovo mesto aktivnosti je veoma udaljeno.
114
6. Literatura
Alcher, R.G., Erturk, N., Heath, L.S. (2002) Role of superoxide dismutases (SODs) in
controlling oxidative stress in plants. J. Exp. Bot. 53: 1331-1341.
Anderson, L., Mansfield, T.A. (1979) The effects of nitric oxide pollution on the growth
of tomato. Environ. Pollution 20: 113-121.
Arigoni, O. (1994) Ascorbate system in plant development. J. Biomembranes 26: 407419.
Asada, K. (2006) Production and scavenging of reactive oxigen species in chloroplasts
and their functions. Plant Physiol. 141: 391-396.
Arnao, M.B., Cano, A., Acosta, M. (1999) Methods to measure the antioxidant activity in
plant material. A comparative discussion. – Free Rad. Res. 32: 89-96,.
Baker, C.J., Orlandi, E.W. (1995) Active oxygen in plant patogenesis. Annu. Rev.
Phytopatol. 33: 299-321.
Bailly, C., Bogatek-Leszczynska, R, Come, D., Corbineau, F. (2002) Changes in
activities of antioxidant enzymes and lioxygenase during growth of sunflower
seedlings from seeds of different vigour. Seed Sci. Res. 12: 47-55.
Bailly, C., Leymarie, J., Lehner, A., Rousseau, Come, D., Corbineau, F. (2004)
Catalase activity and expression in developing sunflower seeds as related to
drying. J. Exp. Bot. 55(396):475-483.
Bailey, L.F., McHargue, J.S. (1943) Enzyme activity in tomato fruits and leaves at
different stages of development. Amer. J. Bot. 30(10): 763-766.
Batak, I., Dević, M., Giba, Z., Grubišić, D., Poff, K.L., Konjević, R. (2002) The effects of
potasium nitrate and NO donors on phytochrome A- and phytochrome B-specific
induced germination of Arabidopsis thaliana seeds. Seed Sci. Res. 12: 253-259.
Beligni, M.V. and Lamatina, L. (2000) Nitric oxide stimulates seed germination and
deetiolation, and inhibits hypocotyl elongation, three light-inducible responses in
115
plants. Planta 210: 215-221.
Bellani, L.M., Guarnier, M., Scialabba, A. (2002) Differences in the activity and
distribution of peroxidases from three different portions of germinating Brassica
oleracea seeds. Physiol. Plant. 114:102-108.
Bernier, G., Kinet, J-M., Sachs, R.M. (1981) The physiology of flowering. CRC Press,
Inc. Boca Raton, Florida.
Bertero, H.D., King, R.W. and Hall, A.J. (1999) Photoperiod-sensitive development
phases in quinoa (Chenopodium quinoa Willd.). Field Crops Res. 60, 231-243.
Bethke, P.C., Fath, A., Jones, R.L. (2000) Programmed cell death of barley aleurone
protoplasts: evidence of involvment ofreactive oxygen species. In: Plant Biology
2000. Abstract No.535. Amer.ican Society of plant biologists, San Diego.
Bethke, P.C., Libourel, I.G.L., Jones R.L. (2006) Nitric oxide reduces seed dormancy in
Arabidopsis. J. Exp. Bot. 57(3): 517-526.
Bewley J.D., Black, M. (1982) Viability, Dormancy, and Environmental control. In:
Physiology and Biochemistry of Seeds in Relation to Germination, vol. 2,
Springer-Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 60-199. Springer-Verlag Berlin
Heidelberg New York.
Bhargava, A., Rana, T.S., Shukla, S., Ohri, D. (2005) Seed protein elecrophoresis of
some cultivated and wild species of Chenopodium. Biol.Plant. 49: 505-511.
Boscagli, A., Sette, B. (2001) Seed germination enhancement in Satureia montana L.
ssp montana. Seed Sci. Technol. 29: 347-355.
Bowler, C., Van Montagu, M., Inzé, D. (1992) Superoxide dismutase and stress
tolerance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant mol. Biol. 43: 83-116.
Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding. – Annu.l
Biochem. 72: 248-254.
Bruce, R.J., West, C.A. (1989) Elicitation of lignin biosinthesis and isoperoxidase
activity by pectic fragments in suspension culture of castor bean. Plant Physiol.
91: 889-897.
116
Chailakhyan, M.Kh. (1958) Hormonale Faktoren des Pflanzenblühens. Biol. Zbl. 77:
641-662.
Cook, R.E. (1975) The photoindidtive control of seed weight in Chenopodium rubrum L.
Amer. J. Bot. 62: 427-431.
Corbesier, L., Coupland, G. (2005) Photoperiodic flowering of Arabidopsis: interating
genetic and physiological approaches to characterization of the floral stimulus.
Plant cell and Environ. 28: 54-66.
Crawford, D.J. (1974) Variation in the seed proteins of Chenopodium incanum. Bulletin
of the Torrery Botanical Club 101: 72-77.
Cumming, B.G. (1959) Extreme sensitivity of germination and photoperiodic reaction in
the genus Chenopodium (Toutn.) L. Nature 184: 1044-1045.
Cumming, B.G. (1961) Early flowering plants. In: Methods in developmental biology.
Ed. F.H. Will and N.K. Wesselss, Thomas Y. Cromwel, New York, 277-299.
Cumming, B.G. (1967) Early flowering plants. In: F.H. Will and N.K. Wesselss, Thomas
Y. Cromwell, (eds.), Methods in developmental biology, 277-299, New York.
Cvetić, T., Budimir, S., Grubišić, D. (2004) In vitro flowering of dark-grown Centaurium
pulchellum. Arch. Biol. Sci., Belgrade 56: 21-22.
Datta, S.C., Evenari, M. and Gutterman, Y. (1972a) Photoperiodic and temperature
responses of plants derived from the various heteroblastic caryopses of Aegilops
L. J. Indian Bot. Soc. 50 A, 546 – 559.
Datta, S.C., Gutterman, Y Evenari, M. (1972b) The influence of the origin of the mother
plant on yeald and germination of their caryopses in Aegilops ovata L. Planta 105,
155 – 164.
de Pinto, M.C., Francais, D., de Gara, L. (1999) The redox state of the ascorbatedehidroascorbate pair as a specific sensor of cell division in tobacco BY-2 cells.
Protoplasma 209: 90-97.
Delledonne, M. (2005) NO news is good news for plants. Currenr opinions in Plant
Biology 8: 390-396.
Donohue, K. (2003) Setting the stage: Phenotipic plasticity as habitat selection.
International J. Plant Sci. 164: 79-92.
117
Dučić, T., Lirić-Rajlić, I., Mitrović, A., Radotić, K. (2003/4) Expression of antioxidant
systems in Chenopodium rubrum seed germination. Biol. Plant. 47: 527-533.
Durner, J., Gow, A.J., Stamler, J.S., Glazebrook, J. (1999) Ancient origins of nitric oxide
signaling in biological systems. Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 96: 14206-14207.
Elstner, E.F. (1982) Oxygen activation and oxygen toxicity. Annu.Rev. Plant Physiol.
33: 73-96.
Evans, L.T., King, R.W., Mander, L.N., Pharis, R.P. (1994) The relative significance for
stem elongation and flowering in Lolium temulentum of 3β-hydroxilation of
gibberellins. Planta 192: 130-136.
Fielding, J.L., Hall, J.L. (1978) A biochemical and cytochemical study of peroxidase
activity in roots of Pisum sativum. II.Distribution of enzymes in relation to root
development. J. Exp. Bot.29: 983-991.
Foyer, C.H., Noctor, G. (2003) Redox sensing and signaling associated with reactive
oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physiol. Plant. 119: 355364.
Franklin, K.A., Praekelt, U., Stoddart, W. M., Billingham, O. E., Halliday, K. J.,
Whitelam, G.C. (2003) Phytochromes B, D, and E Act Redundantly to Control
Multiple Physiological Responses in Arabidopsis. Plant Physiol. 131: 1340–1346.
Franklin, K.A., Whitelam, G.C. (2004) Light signals, phytochromes and cross-talk with
other environmental cues. J. Exp. Bot. 55(395): 271-276.
Fridovich, I. (1986) Superoxide dismutases. Adv. Enzymol. 41: 35-97.
Furuya, M. (1993) Phytochromes: their molecular species, gene families and functions.
Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol.Bol. 44: 617-645.
Galloway, L.F. (2005) Maternal effects provide phenotipic adaptation to local
environmental conditions. New Phytologist 166: 93-100.
Giba, Z.,Todorović, S., Grubišić, D., Konjević, R. (1998) Occurrence and regulatory
roles of superoxide anion radical and nitric oxide in plants. Jugoslav Physiol.
Pharmacol. Acta 34: 447-461.
118
Giba, Z., Grubišić, D., Konjević, R. (2004) Nitric oxide and seed germination. In: Nitric
Oxide Signaling in Higher Plants. Eds. Jose R. Magalhaes, Rana P. Singh and
Leonidas P. Pasos, Studium Press, LLC, Houston, USA, pp. 239-275.
Gidrol, X., Lin, W.S., Degousee, N., Yip, S.F., Kush, A. (1994) Accumulation of reactive
oxigen species and oxidation of cytokinin in germinating soybeen seeds. Eur. J.
Biochem. 224: 21-28.
Griffith OW. (1980) Determination of glutathione disulphide using glutathione reductase
and 2-vinylpyridine. Anal. Biochem. 106: 207–212
Grlić, Lj. (1986) Enciklopedija samoniklog jestivog bilja. August Cesarec Zagreb, 102–
105.
Grubišić, D., Giba, Z., Konjević, R. (1995) Seed germination of Gentiana cruciata L.
Bulletin de l'Institut et du Jardin Botanique de l'Université de Belgrade 29: 93-100.
Gutterman, Y., Evenari, M. (1972) The influence of day length on seed coat colour, an
index of water permeability of the desert annual Ononis sicula Guss. J. Ecol. 60,
713 – 719.
Gutterman, Y. (1978) Germinability of seeds as a function of the maternal environment.
Acta Hort. 83: 49-56.
Gutterman, Y. (2000) Maternal effects on seeds during development. In: CABI
Publishing ed. Seeds: The ecology of regeneration in plant communities. 2nd ed.
M.Fenner, Wallingford, Oxon. pp. 59-84.
Gutterman, Y. (2002) Survival adaptations and strategies of annuals occurring in the
Judean and Negev deserts of Israel. Israel J. Plant Sci. 50: 165-175.
He, Y., Tang, R.H., Hao, Y., Stevans, R.D., Cook, C.W., Ahn, S.M., Jing, L., Yang, Z.,
Chen, L., Guo, F., Fiorani, F., Jackson, R.B., Crawford, N.M., Pei, Z.M. (2004)
Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition. Science 305: 1968-1971.
Hendry, G.A.F., Crawford, R.M.M. (1994) Oxigen and envirnmental stress in plants –
an overview. Proc.roy. Soc. Edinbourgh 102B: 1-10.
Hening, L., Stoddart, W.M., Dieterie, M., Whitelam, G.C., Schafer, E. (2002)
Phytochrome E contols light-induced germination of Arabidopsis. Plant Physiol.
128: 194-200.
119
Hensel, L.L., Grbic, V., Baumgarten, D.A., Bleecker, A.B. (1993) Developmental and
age-related processes that influence the longevity and senescence of
photosynthetic tissues in Arabidopsis. Plant cell 5: 553-564.
Hewitt, E.J., Dickes, G.J. (1961) Spectrophotometric measurements on ascorbic acid
and their use for the estimation of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in plant
tissues. Biochem. J. 78: 384-391.
Hufton, C.A., Besford, R.T., Welburn, A.R. (1996) Effects of NO (+NO2) pollution on
growth, nitrate reeuctase activities and associated protein contents in glasshouse
lettuce grown hydroponically in winter CO2 enrichment. New Phytologist 133: 495501.
Jones, R.L. (1986) Gibberellic acid and auxin influence the secretion of peroxidase. In:
Greppin, H., Penel, C., Gaspar, T. (ed.): Molecular and Physiological Aspects of
Plant Peroxidases. University of Geneva, Geneva, 295-308.
Jovanović, V., Giba, Z., Đoković, D., Milosavljević, S., Grubišić, D., Konjević, R. (2005)
Gibberellic acid nitrite stimulates germination of two species of light requiring
seeds via the nitric oxide pathway. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1048: 476-481.
Kadman-Zahavi, A., Peiper, D. (1987) Effects of moonlight on flower induction in
Pharbitis nil, using a single dark period. – Ann. Bot. 60: 621-623.
Karssen, C.M. (1970) The light promoted germination of the seeds of Chenopodium
album L. III.Effect of the photoperiod during growth and development of the plants
on the dormancy of the produced seeds. Acta Botanica Neerlandica 19, 81 – 94.
Karssen, C.M., Hilhorst, H.W.M. (1992) Seeds: The ecology of regeneration in plant
communities. CAB International, Wallingford. Ed. Fenner, M., pp. 327-348.
Keigley, P.J. and Mullen, R.E. (1986) Changes in soybean seed quality from high
temperatures during seed fill and maturation. Crop Science 26, 1212 – 1216.
Khan, M.H., Panda, S.K. (2002) Induction of oxidative stress in roots of Oryza sativa L.
in response to salt stress. Biol.Plant. 45: 625-627.
Kojima, H., Nakatsubo, N., Kikuchi, K., Kawahara, S., Kirino, Y., Nagoshi, H., Harata,
Y., Nagano, T. (1998) Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent
indicators: diaminofluoresceins. Analitical Chemistry 70: 2446-2453.
120
Komeda, Y., Araki, T., Tsukaya, H., Takahashi, T., Naito, S. (1992) Study of flowering
using late-flowering mutants of Arasbidopsis thaliana, with emphasis on flowering
in darkness. FNL 13: 44-47.
Korneef, M., Alonso-Blanco, C., Peeters, A.J-M., Soppe, W. (1998) Genetic control of
flowering time in Arabidopsis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49: 345370.
Kulikowska-Gulewska, H., Majewska, M., Kopcewicz, J. (2000) Gibberellins in the
contol of photoperiodic flower transition in Pharbitis nil. Physiol. Plant. 108: 202207.
Lacey, E.P., Smith, S., Case, A.L. (1997) Parental effects on seed mass: seed coat but
not embryo/endosperm effects. Am. J. Bot. 84(11): 1617.
Lacey, E.P., Herr, D. (2000) Parental effects in Plantago lanceolata L. III Measuring parental
temperature effects in the field. Evolution Int. J. Org. Evol. 54(4): 1207-1217.
Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of head of
bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Lall, N., Nikolova, R.V. (2003) Developmental changes of superoxide dismutase, peroxidase
and catalase isoenzyme profiles in leaves of Impatiens flanaganiae Hemsl. Associated
with variations in light intensity. South African J. Bot. 68: 518-524.
Lamb, C., Dixon, R.A. (1997) The oxidative burst in plant disease resistance. Annu.
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 251-275.
Leshem, Y.Y., Haramaty, E. (1996) The characterisation and contrasting effects of the
nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum
Linn foliage. J. Plant Physiol. 148: 258-263.
Leshem, Y.Y., Haramaty, E., Iluz, D., Malik, Z., Sofer, Y., Roitman, L., Leshem, Y.
(1997) Effect of stress nitric oxide (NO): interaction between chlorophyll
fluorescence, galactolipid fluidity and lipoxygenase activity. Plant Physiol.
Biochem. 35: 573-579.
Leshem, Y.Y. and Pinchasov, Y. (2000) Non-invasive photoacoustic spectroscopic
determination of relative endogenous nitric oxide and ethylene content
stoichiometry during the ripening of strawberries Fragaria anannasa (Duch.) and
121
avocados Persea americana (Mill.). J. Exp. Bot. 51: 1471-1473.
Li, W., Liu, X., Khan, M.A., Yamaguchi, S. (2005) The effect of plant growth regulators,
nitric oxide, nitrate, nitrite and light on the germination of dimorphic seeds of
Sueda salsa under saline conditions. J. Plant Res. 118: 207-214.
Linhart, X.B., Grant, M.C. (1996) Evolutionary significance of local genetic
differentiation in plants. Ann. Rev. Ecol. Systematics 27: 237-277.
Luna, C.M., Pastori, G.M., Driscoll, S., Groten, C., Bernard, S. (2004) Drough controls
on H2O2 accumulation, catalase (CAT) activity and CAT gene expression in
wheat. J. Exp. Bot. 56: 417-423.
Monte, E., Alonso, J.M., Ecker, J.R., Zhang, Y., Li, X., Young, J., Austin-Phillips, S.,
Quail, P.H. (2003) Isolation and characterization of phyC mutants in Arabidopsis
reveals complex crosstalk between phytochrome signaling pathways. Plant Cell
15: 1962-1980.
Machasdo Neto, N.B., Custodio, C.C., Takaki, M. (2001) Evaluation of naturally and
artificially aged seeds of Phaseolus vulgaris L. Seed Sci. Technol. 29: 137-149.
Maguire, J.D. (1972) Physiological disorders in germinating seeds induced by the
environment. In: W. Heydecker Ed. Seed ecology. Proceedings of the nineteenth
Easter school in agricultural science, University of Nottingham, Butterworths,
London. pp. 289-310.
Marinescu, G., Badea, E., Babeanu, C., Glodeanu, E. (2000) Peroxidase system
activity in leaves of cucumber plants as marker of growth stimulant treatment.
Plant peroxidase newsletter 14: 78-85.
Matters,G.L., Scandalios, J.G. (1986) Effect of elevated temperature on catalase and
superoxid dismutase during maize development. Differentiation 30:190-196.
May, M.J., Vernoux, T., Leaver, C., van Montagu, M., Inze, D. (1998) Glutathione
homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant
development. J. exp. Bot. 49: 649-667.
Mazzaella, M.A., Arana, M.V., Staneloni, R.J., Perelman, S., Rodriguez Batiller, M.J.,
Muschetti, J., Cerdan, P.D., Chen, K., Sanchez R., A., Zhu, T., Chory, J., Casal, J.
122
(2005) Phytochromr control of the Arabidopsis transcriptome anticipates seedling
exposure to light. The Plant Cell 17: 2507-2516.
Miao, S.L., Bazzaz, F.A., Primack, R.B. (1991) Persistance of maternal nutrient effects
in Plantago major: the third generation. Ecology 72: 1634-1642.
Mitchell, W.C., Barrett, S.H. (2000) Expression of peroxidase and glucose-6-phosphate
dehydrogenase isozymes in Viola cornuta L. during seed germination. Plant
Peroxidase Newsletter 15: 23-32.
Misra, H.P., Fridowich, I. (1972) The role of superoxide-anion in the autooxidation of
epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. – J. biol. Chem. 247:
3170-3175,.
Mitrović, A. (1998) Cvetanje kratkodnevne biljke Chenopodium rubrum L. i dugodnevne
biljke Chenopodium murale L. u kulturi in vitro, Magistarska teza, Biološki fakultet,
Univerzitet u Beogradu.
Mitrović, A., Živanović, B., Ćulafić, Lj. (2000) The effects of photoperiod, glucose and
gibberellic acid on growth in vitro and flowering of Chenopodium murale. Biol.
Plant. 43: 173-177.
Mitrović, A., Živanović, B., Ćulafić, Lj. (2002) Maternal effect on Chenopodium rubrum
L. seeds: seed size, germination, growth and flowering in vitro. Ekologija, Vol. 37,
No, 1-2, 53-58.
Mitrović, A., Živanović, B., Ćulafić, Lj. (2003) Effect of darkness on growth and
flowering of Chenopodium rubrum and C. murale plants in vitro. Biol. Plant. 46(3),
471-474.
Mitrović, A., Dučić, T., Lirić-Rajlić, I., Radotić, K., Živanović, B. (2005) Changes in
Chenopodium rubrum seeds aging. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1048, 505-508.
Moore, S., Banister, P., Jameson, P.E. (1994) The effect of low temperatures on seed
germination of some New Zealand species of Pittosporum. New Zeal. J. Bot. 32:
483-485.
Munir, J., Dorn, L.A., Donohue, K., Schmitt, J. (2001) The effect of maternal
photoperiod on seasonal dormancy in Arabidopsis thaliana (Brasicaceae). Amer.
J. Bot. 88(7): 1240-1249.
123
Murashige, T., Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
Murthy, U.M.N., Sun, W.Q. (2000) Protein modification by Amadori and Maillard
reactions during seed storage: roles of sugar hydrolysis and lipid peroxidation. J.
Exp. Bot. 51, No. 348, 1221-1228.
Neill, S.J., Desikan, R., Hancock, J.T. (2003) Nitric oxide signalling in plants. New
Phytologist 159: 11-35.
Nešković, M, Konjević, R., Ćulafić Lj. (2003) Fiziologija biljaka. NNK-International. 473525.
Opatrná, J., Ullmann, J., Pavlová, L., Krekule, J. (1980) Changes in organ growth of
Chenopodium rubrum due to suboptimal and multiple photoperiodic cucles with
and without flowering effect. Biol. Plant. 22: 454-464.
Pagnussat, G.C., Simontacchi, M., Puntarulo, S., Lamatina, L. (2002) Nitric oxide is
required for root organogenesis. Plant Physiol. 129: 954-956.
Pallanca, J.E., Smirnoff, N. (1999) Ascorbic acid metabolism in pea seedlings. A
comparison of D-glucosone, L-sorbosone, and L-galactono-1,4-lactone as
ascorbate precursors. Plant Physiol. 120: 453-462.
Pavlová, L., Součkova, D., Ullmann, J., Krekule, J. (1989) The transition to reproductive
phase in Chenopodium murale L. ecotype 197 – early flowering long-day plant.
Biol. Plant. 31(5): 386-391.
Prego, I., Maldonado, S., Otegui, M. (1998) Seed structure and localization of reserves
in Chenopodium quinoa. Ann. Bot. 82: 481-488.
Procházková, D., Wilhelmová, N. (2004) Changes in antioksidative protection in bean
cotyledons during natural and continuous irradiation-accelerated senescence.
Biol. Plant. 48: 33-39.
Riley, J.M. (1987) Gibberellic acid for fruit set and seed germination. California rare
Fruit Growers J. 19: 10-12.
Roberts, E.H. (1972) Oxidative processes and the control of seed germination. In:
Heydecker, W. (ed.): Seed Ecology. 189-218, Butterworts, London.
124
Schmidt, M., Dehne, S., Feirabend, J. (2002) Post-transcriptional mechanisms control
catalase synthesis during its light-induced turnover in rye leaves through the
availability of the hemin cofactor and reversible changes of the translation
efficiency of mRNA. The Plant J. 31: 601-613.
Schopfer, P., Plachy, C. (1984) Control of seed germination by abscisic acid: II Effect of
embryo water uptake in Brassica napus L. – Plant Physiol. 76: 155-160.
Schopfer, P., Plachy, C., Frahry, G. (2001) Release of reactive oxygen intermediates
(superoxide radicals, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals) and peroxidase in
germinating radish seeds controlled by light, gibberellin, and ascorbic acid. Plant
Physiol. 125: 1591-1602.
Schroeder, J.I., Allen, G.J., Hugouvieux, V., Kwak, J.M., Waner, D. (2001) Guard cell
signal transduction. Ann. Rev. pPant Physiol. Plant. mol. Biol. 52: 627-658.
Scorza, R. (1982) In vitro flowering. Hort. Rev. 4: 106-127.
Seidlová, F., Opatrná, J. (1978) Change of growth correlation in the shoot meristem as
the cause of dependance of flowering. Z. Planzenphysiol. 89: 377-392.
Sharrock, R.A., Quail, P.H. (1989) Novel phytochrome sequences in Arabidopsis
thaliana: Structure, evolution and differential expression of a plant regulatory
photoreceptor family. Genes Dev. 3: 1745-1757.
Simpson, G.G., Dean, C. (2002) Arabidopsis thaliana, the Rosetta stone of flowering
time? Science 296: 285-289.
Slavnić, Ž. (1972) Flora SR Srbije III, Srpska Akademija nauka i umetnosti, Odelenje
prirodno-matematičkih nauka, Beograd, 10-53.
Smith, H. (1995) Physiological and ecological function within the phytochrome family.
Ann. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 289-315.
Stamler, J.S., Singer, D.J., Loscalzo, J. (1992) Biochemistry of nitric oxide and its
redox-activated forms. Science 258:1898-1902.
Steinger, T., Gall, R., Schmid, B. (2000) Maternal and direct effects of elevated CO2 on
seed provisioning, germination and seedling growth in Bromus erectus. Oecologia
123: 475-480.
125
Straton, D.A. (1989) Competition prolongs expression of matenal effects in seedlings of
Erigeron annuus (Asteraceae). Amer. J. Bot 76(11): 1646-1653.
Sultan, S.E. 1996 Phenotipic plasticity for offsšring traits in Polygonum persicaria.
Ecology 77: 1791-1807.
Takano, M., Inagaki, N., Xie, X., Yuzurihara, N., Hihara, F., Ishizuka, T., Yano, M.,
Nishimura, M., Miyao, A., Hirochika, H., Shinomura, T. (2005) Distinct and
cooperative functions of phytochromes A, B, and C in the control of deetiolation
and flowering in rice. Plant Cell 17: 3311-3325.
Tanaka, O., Cleland, C.F., Ben-Tal, Y. (1983) Effect of fericijanide, ferocijanide and
KCN on growth and flowering in the short-day plant Lemna paucicostata 6746.
Plant and Cell Physiol. 24 (4): 705-711.
Terzaghi, W.B., Cashmore, A.R. (1995) Light regulated transcription. Annu. Rev. Plant
Ohysiol. Plant Mol. Biol. 46: 445-474.
Tomasi, F., Paciolla, C. de Pinto, M.C., de Gara, L. (2001) A comparative study of
glutathione and ascorbate metabolism during germination of Pinus pinea L.
seeds. J. exp. Bot. 52: 1647-1654.
Torres, M., Munoz, F., Cases, A., Ortega, T. (1989) Effect of age on the viability of
fennel seeds from cultivated plants. Acta Hort. 253: 113-120.
Tsuchiya, T., Ishiguri, Y. (1981) Role of the quality of light in the photoperiodic flowering
responce in four latitudinal ecotypes of Chenopodium rubrum L. Plant and Cell
Physiol. 22(3): 525-532.
Tun, N.N., Holk, A., Scherer G.F.E. (2001) Rapid increase of NO release in plant cell
cultures induced by cytokinin. FEBS Letters 509: 174-176.
Ullmann, J., Opatrna, J., Krekule, J., Pavlova, L. (1980) The Changes in the Growth
Pattern of Organs of Chenopodium rubrum Photoperiodicaly Induced to
Flowering. Biol. Plant. 22: 374-383.
Van Loon, L.C. (1986) The significance of changees in peroxidase in diseased plants.
In: Greppin, H., Penel, C., Gaspar, T. (ed.): Molecular and Physiological Aspects
of Plant Peroxidases. Pp. 405-418. University of Geneva, Geneva.
126
Villers, T. (1972) Ageing and the longevity of seeds in field conditions. In: W.
Heydecker Ed. Seed Ecology, Proceedings of the nineteenth Easter school in
agricultural science, University of Nottingham, Butterworths, London pp. 266-285.
Vince-Prue, D. (1975) Photoperiodism in plants. McGraw-Hill Book Company (UK)
Limited.
Wang, H, Deng, X.W. (2002) Phytochrome signaling mechanism. The Arabidopsis
Book. 2002 Amer. Soc. Plant Biol., 1-28.
Wildt J., Kley, D., Rockel, P., Segschneider, H.J. (1997) Emision of NO from several
higher plant species. J. geophysical Res. 102: 5919-5927.
Wojtaszek, P. (2000) Nitric oxide in plants: to NO or not to. Phytochemistry 54: 1-4.
Zhang, H., Shen, W.B., Zhang, W., Hu, L.L. (2005) A rapid response of β-amylase to
nitric oxide but not gibberellin in wheat seeds during the early stage of
germination. Planta 220: 708-716.
Živanović, B., Ćulafić, Lj., Filipović, A. (1995) The effects of hormones and saccharides
on growth and flowering of green and herbicides-treated Chenopodium rubrum L.
plants. Biol. Plant. 37: 257-264.
127
Download

Gajenje biljaka Chenopodium rubrum u cilju dobijanja semena