Protokol p
pro laborato
orní úlohu:
S
Separace směsi
s
pro
oteinů na zařízení pro
p izoeleektrickou fokusaci v
rozb
bíhavém toku
t
Úvod
Přirozenně se proteeiny se vysk
kytují ve vvelmi složitý
ých směsích. Pro jejicch analýzu je třeba
využívaat moderní separační
s
metody,
m
kterré umožní vyčlenit
v
ze vzorku pouuze ty proteeiny, jež
chceme studovat. Rozšířenou
u technikouu pro purifi
fikaci proteiinů je izoeelektrická fokusace.
fo
Klasickký mód kapiilární izoeleektrické fokkusace však není vhodn
ný pro separraci větších
h objemů
vzorku.
f
vee volném toku
t
(Obr č.
č 1) umožžňuje vstup
pní směs
Použití módu izoeelektrické fokusace
proteinůů kontinuáálně separo
ovat a zísskávat tak jednotlivéé frakce kkoncentrovaaných a
přečištěěných proteeinů. Tato metoda
m
um
možňuje matteriálově a instrumenttálně nenárročnou a
velmi leevnou frakcionaci proteeinů před jej
ejich další an
nalýzou.
Obrázek
k 1 – IEF ve voolném toku
Teorie k cvičení
Izoelekttrická fokussace (IEF) spadá
s
do poodmnožiny elektroforettických sepparací. Všecchny tyto
separačnní metody mají spoleečného jmennovatele vee využití ellektrického pole pro pohyb
p
a
separacii analytů. V případě IEF
I
jde o ppohyb anallytu v elekttrickém polli skrz pH gradient
(vytvořeený ze směěsi amfolyttů). Pomoc í IEF je možno
m
separovat pouzze látky, ktteré jsou
amfolytty (zpravidlla peptidy, proteiny alle i aminok
kyseliny). Tyto
T
látky m
mají dvě neebo více
disociujjících skupin s různými disociačníími konstan
ntami a v urččité oblasti pH se látkaa nachází
ve stavuu amfionu (obojetného iontu) s cellkovým náb
bojem rovný
ým nule. Taato oblast see nazývá
izoelekttrický bod.
Amfolyyty jsou tedyy nabity v závislosti nna pH ve ktterém se naacházejí. Přii aplikaci vysokého
v
napětí sse na základdě náboje zaačnou amfoolyty pohybovat k anod
dě nebo ke katodě. Při aplikaci
1
vysokého napětí se zároveň začne formovat pH gradient z tzv. nosných amfolytů. Jak se
amfolyt pohybuje k elektrodě skrze pH gradient, mění se i jeho náboj. V okamžiku, kdy
dosáhne pH oblasti, která je rovna jeho izoelektrickému bodu, změní se jeho celkový náboj na
nulu a elektroforetický pohyb ustane. Tento efekt se nazývá fokusace neboli zaostření. Pokud
se amfolyt pohne z fokusované zóny (např. difúzí), nabyde opět náboj různý od nuly a
fokusační pohyb ho vrátí zpět do zóny.
Nejčastěji využívané formáty pro IEF jsou gel a kapilára. U těchto formátů se rovněž
dosahuje nejvyšších účinností. Existuje ovšem i řada dalších formátů IEF. Může to být
například fokusace v komůrkách oddělených polopropustnými membránami, případně
fokusace v různých průtočných zařízeních. Právě posledně zmíněné se týká této laboratorní
úlohy.
Izoelektrická fokusace v rozbíhavém toku (DF-IEF)
Jedná se o průtočné zařízení (vzorek je kontinuálně dávkován, separován a odebírán), kde
probíhá separace na principu IEF. Bližší informace o konstrukci zařízení jsou dohledatelné
pod referencemi [1-4].
Prostor vymezený pro průtok kapaliny má lichoběžníkový tvar pro zvýšení účinnosti separace
viz Obr. č. 2 a 3. Dávkování vzorku probíhá na nejužší straně, zatímco separované frakce jsou
odebírány ze strany nejširší. Tento separační prostor je tvořen netkanou nasákavou textilií
(hydrofilizovaný polyethylen). Netkaná textilie má oproti tkaným textiliím výhodu v redukci
elektroosmotického toku, který negativně ovlivňuje účinnost separace. Dále je pro redukci
elektroosmotického toku do separované směsi přidáván neionogenní tenzid. Netkaná textilie
se rovněž netřepí při řezání do požadovaného tvaru a působí jako filtr pokud se ve vzorku
nacházejí pevné částice.
Úzký profil separačního prostoru na začátku separace umožňuje aplikaci vyšších proudů při
snížení odpadního tepla generovaného elektroforetickým pohybem molekul. Postupným
rozšiřováním separačního prostoru se fokusované zóny vzdalují a zároveň jsou, díky aplikaci
gradientu napětí ve směru toku, dále zaostřovány. Gradientu napětí je docíleno připojením
jednotlivých párů elektrod k elektroforetickému zdroji přes rezistory s různými hodnotami
odporu.
Pro zachování stejného délkového průtoku (cm·min-1) se s úspěchem využívají další vrstvy
netkané textilie, vrstvené směrem k úzkému konci. Toho opatření zabraňuje tvorbě vírů a
dalších dynamických jevů v kapalině, které vznikají při využití pouze jedné vrstvy netkané
textilie.
2
Celé separační ložže se nacháází v horizonntální, nebo
o mírně nakloněné rovvině a dálee na tuto
rovinu nnavazuje veertikální čásst, kde je neetkaná textillie rozdělen
na do proužk
žků, které sllouží pro
sběr jeddnotlivých frakcí a an
nodického a katodickéého odpadu. Odpadní proužky mají
m větší
šířku prro sběr celýých oblastí s extrémníím pH. Pro
oužky pro sběr
s
frakcí i odpadní proužky
fungují zároveň jakko hydrodyn
namická puumpa. Jeliko
ož sloupec kapaliny
k
neuustále nutí kapalinu
k
protékatt směrem ke
k konci pro
oužků, kde sse kapalina hromadí vee formě kappky než odk
kápne do
připraveených sběrnných nádobeek. Sběrný prostor je tvořen
t
otvorrem, který ppojme mikrrotitrační
destičkuu na šířku. Díky tom
mu je možnné sbírat 12
2 frakcí bu
uď do kom
můrek mikrrotitrační
destičkyy, nebo do těchto kom
můrek zasunnout 0,5 mll mikrozkum
mavky. Cellý systém je ovšem
velmi variabilní díkky využití netkané
n
texttilie a proto je možné počet frakcí dle potřeby
y změnit.
Zařízenní lze využít především
m pro prepparativní separaci pro
oteinů a peeptidů ze surových
s
roztokůů
díky
jeeho
schop
pnosti
konntinuálně
zpracováva
z
t
velké
množství
vzorku.
V separrovaných frrakcích je pak
p možné získat zak
koncentrovaaný a odsollený protein
n/peptid,
který lze následně přečišťovat
p
pomocí dallších sofistiikovanějších
h metod.
Obrázek
k 2 - schéma zařízení
z
pro DF-IEF
D
(A - annody, K - kato
ody)
3
Obrázek
k 3 – 3D schém
ma DF-IEF zaařízení
Prakticcká část
Materiáály a metod
dy
kálie:
Chemik
•
110 mM NaC
Cl
SIGMA-AL
S
LDRICH (Stt. Louis, MO
O, USA)
•
00,1 M NaOH
H
SIGMA-AL
S
LDRICH (Stt. Louis, MO
O, USA)
•
00,1 M KHSO4
SIGMA-AL
S
LDRICH (Stt. Louis, MO
O, USA)
•
10 % (m/v) Brij 58 (neeionogenní ttenzid)
SSIGMA-ALDRICH
•
kkovalentně obarvené sttandardy pro
roteinů (kat. číslo C199
92)
SSIGMA-ALDRICH
•
llyofilizovanný cytochrom-c (izolovvaný z hověězího srdce)
SSIGMA-ALDRICH
•
S
Směs DF 1000x obsahujjící koncenttrovanou sm
měs jednodu
uchých pufrrů
•
S
Směs barevvných markeerů izoelekttrického bod
du (komplettní pH gradi
dient)
•
S
Směs dvou barevných markerů izooelektrickéh
ho bodu (ok
kraje pH graadientu)
-
všecchny tři směěsi jsou přeedem připraaveny v zássobních lahhvích a uch
hovávány
dlouuhodobě v leednici pro ppotřebu IEF v rozbíhavém toku
4
-
složení všech směsí viz literatura [5-7]
Materiály a pomůcky:
•
Netkaná textilie (polyetylen, tloušťka 0,1 mm, Pegatex, Znojmo)
•
Šablony pro řezání netkané textilie
•
Skalpely, nůžky, podložka pro řezání, šablony, pravítka
•
Kádinky, odměrné baňky, vialky
•
Pipety, špičky
•
Mikrotitrační destičky s 12 podélnými komůrkami a 96 čtvercovými komůrkami
•
0,5 ml mikrozkumavky
•
Zubní zrcátko
Přístrojové vybavení:
Přístroje zapínejte vždy jen v přítomnosti vyučujícího!
•
Zařízení vytvořené pro DF IEF se třemi páry elektrod (vyrobeno v laboratoři)
•
Zařízení vytvořené pro DF IEF se dvěma páry elektrod (vyrobeno v laboratoři)
•
2x Peristaltická pumpa (ISMATEC, Glattbrugg, Švýcarsko)
•
Hadičky do peristaltické pumpy s vnitřním průměrem 0,38 mm
•
2x Programovatelný elektroforetický zdroj* EV232 (Consort bvba, Turnhout, Belgie)
*Před zapnutím zdroje se je vždy třeba ujistit, že vodiče jsou všude správně zapojené a
nikde není volně přístupná neizolovaná část vodiče!
•
2x Izolované dráty na propojení zdroje se zařízením + „banánky”
•
Teploměr s automatickým záznamem teploty (COMET SYSTEM, s.r.o., Rožnov pod
Radhoštěm, Česká Republika)
•
2x Chladicí box (Guzzanti GZ 48 G, Guzzanti, Praha, Česká Republika)
Pracovní postup
•
Na začátku cvičení je třeba připravit obě zařízení a separační lože. Pod vedením
cvičícího nařežte pomocí skalpelu, pravítka a podložky na řezání separační lože z
plátna netkané textilie podle poskytnutých šablon. Takto připravené separační lože
poté přiložte na obě zařízení. Při přikládání je výhodné lehce textilii navlhčit, aby lépe
přilnula na podklad. Po položení první vrstvy navrstvěte všechny ostatní vrstvy
(celkem 10 vrstev – od největší po nejmenší)
5
•
Takto připravené zařízení připojte pomocí drátů s „banánky“ k elektroforetickému
zdroji !pozor na správnou polaritu – červená k červené, černá k černé! a umístěte do
chladicího boxu (chlazeného na 10 °C). Dále umístěte hadičky do držáků na zařízení a
následně zaklapněte tyto hadičky do kazet peristaltických pump.
•
Následně spusťte peristaltické pumpy - u tříelektrodového zařízení nastavte průtok
0,45 ml·min-1 a u dvouelektrodového nastavte průtok 0,22 ml·min-1. Nasávající konce
hadiček ponořte do kádinek s 10 mM roztokem NaCl a celý separační prostor nechte
promýt 30 minut pro dokonalou kondicionaci separačního lože.
•
Po počáteční kondicionaci vyměňte u každého proplachovaného zařízení 10 mM
roztok NaCl za 50 ml vstupní směsi, kterou namícháte dle následujícího návodu:
Odměrná baňka 50 ml na 3-elektrodové z.:
2 ml 0,1 M NaOH
0,8 ml 0,1 M KHSO4
0,5 ml DF 100x
0,5 ml 10% (m/v) Brij
0,8 ml barevných pI markerů
Odměrná baňka 50 ml na 2-elektrodové z.:
2 ml 0,1 M NaOH
0,8 ml 0,1 M KHSO4
0,5 ml DF 100x
0,5 ml 10% (m/v) Brij
0,5 ml okrajových barevných pI markerů

Po výměně 10 mM NaCl za namíchanou směs následuje kompletní popis celého
zařízení včetně důležitých aspektů této separační metody.

Jakmile je objem netkané textilie kompletně nasycen separační směsí (cca 10-15 min),
zapněte za asistence vedoucího cvičení elektroforetický zdroj s hodnotami
limitovanými na 250 V, 12 mA, 6 W (6 mA a 3 W pro 2 elektrodové z.).

Následuje kontrola kontaktu elektrod se separačním ložem pomocí vizuální kontroly
příslušných diod na zařízení. Z důvodu jejich špatné přístupnosti je třeba využít zubní
zrcátko. Pokud některá z diod nesvítí, není příslušná elektroda v kontaktu se
6
separačním ložem. Oznamte tuto skutečnost vyučujícímu, který vzniklou situaci
vyřeší.

Po aplikaci elektrického pole je možné pozorovat počínající tvorbu pH gradientu a
fokusaci barevných markerů izoelektrického bodu.

Následuje asi 20 minut, ve kterých pozorujeme postupné ustavení pH gradientu na
celé délce separačního prostoru.

Poté zvyšte napětí na 300V a nechte dalších asi 10 minut proběhnout nové ustavení
pH gradientu. Během této doby sledujte zahřívání separačního lože pomocí teploměru
s automatickým záznamem teploty. Teplota by neměla vzrůst na více než 15 °C během
celého cvičení.

V posledním kroku přidejte 2 ml 0,1 M NaOH a 0,8 ml 0,1 M KHSO4 do směsi pro 3
elektrodové zařízení - ilustrace vzorku s vysokou koncentrací solí (1x zvýšení celkové
koncentrace). Následuje konzultace se cvičícím na téma vliv vysoké koncentrace soli
ve vzorku na separaci.

U zařízení se dvěma elektrodami přikápněte na začátek separačního lože 4 µl roztoku
barevných standardů proteinů. Opět ponechte cca 10 minut na stabilizování gradientu
a opět následuje konzultace pozorované kvality separace proteinů (šířka jednotlivých
zón). Poté pomocí špičky skalpelu přidejte na vstup separačního lože malý krystal
lyofilizovaného cytochromu – c. Tento se postupně rozpustí a opět vytvoří
fokusovanou zónu, která postupně migruje až do sběrných proužků.

Na závěr celého cvičení si vyzkoušejte podle pokynů cvičícího možné techniky sběru
frakcí.
Během celé doby cvičení, Vám bude v jednotlivých prolukách prezentována teorie týkající se
IEF spolu s ukázkou počítačové simulace IEF pomocí programu SIMUL 5 COMPLEX.
Následně budou diskutovány separační metody, které se mohou podílet na další separaci
frakcí získaných z IEF spolu s vysvětlením principu ortogonality. Podle časových možností
bude dále prezentován další z módů IEF – IEF v proužku z netkané textilie.
Literatura
[1] Šlais, K. (2008). Divergent flow isoelectric focusing. Electrophoresis, 29(12), 2451–7.
[2] Štastná, M., & Šlais, K. (2008). Single-input divergent flow IEF for preparative analysis
of proteins. Electrophoresis, 29(22), 4503–7.
7
[3] Mazanec, K., Bobalová, J., & Šlais, K. (2009). Divergent flow isoelectric focusing: fast
and efficient method for protein sample preparation for mass spectrometry. Analytical and
bioanalytical chemistry, 393(6-7), 1769–78.
[4] Štastná, M., & Šlais, K. (2010). Preparative divergent flow IEF without carrier ampholytes
for separation of complex biological samples. Electrophoresis, 31(3), 433–9.
[5] Stastná, M., & Slais, K. (2005). Colored pI standards and gel isoelectric focusing in
strongly acidic pH. Analytical and bioanalytical chemistry, 382(1), 65–72.
[6] Štastná, M., Trávníček, M., & Šlais, K. (2005). New azo dyes as colored isoelectric point
markers for isoelectric focusing in acidic pH region. Electrophoresis, 26(1), 53–9.
[7] Štastná, M., & Šlais, K. (2005). Colored pI standards and gel isoelectric focusing in
strongly acidic pH. Analytical and bioanalytical chemistry, 382(1), 65–72.
8
Download

Separace směsi proteinů na zařízení pro izoelektrickou fokusaci v