UNIVERZITET U BEOGRADU
Milan V. Žižić
METABOLIZAM I METABOLIČKI EFEKTI
VANADIJUMA KOD GLJIVE
PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS
doktorska disertacija
Beograd, 2013
UNIVERZITET U BEOGRADU
Milan V. Žižić
METABOLIZAM I METABOLIČKI EFEKTI
VANADIJUMA KOD GLJIVE
PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS
doktorska disertacija
Beograd, 2013
UNIVERSITY OF BELGRADE
Milan V. Žižić
METABOLISM AND METABOLIC
EFFECTS OF VANADIUM IN FUNGUS
PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS
Ph.D.Thesis
Belgrade, 2013
Mentori:
dr Goran Bačić, redovni profesor, Fakultet za fizičku hemiju, Univerzitet u Beogradu
dr Miroslav Živić, docent, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu
Članovi komisije:
dr Goran Bačić, redovni profesor, Fakultet za fizičku hemiju, Univerzitet u Beogradu
dr Miroslav Živić, docent, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu
dr Joanna Zakrzewska, viši naučni saradnik, Institut za opštu i fizičku hemiju, Beograd
dr Tijana Cvetić-Antić, docent, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu
dr Vuk Maksimović, viši naučni saradnik, Institut za multidisciplinarna istraživanja,
Univerzitet u Beogradu
Eksperimentalna istraživanja ovog rada izvedena su na Odseku Nauka o živim
sistemima Instituta za multidisciplinarna istraživanja Univerziteta u Beogradu i u NMR
laboratoriji Instituta za opštu i fizičku hemiju
Zahvaljujem se mentorima, dr Goranu Bačiću na učešću i pomoći u izradi ove
doktorske disertacije i dr Miroslavu Živiću koji je osim učešća u svim eksperimentima,
dragocenim savetima i preporukama doprineo nastajanju ovog rada.
Posebnu zahvalnost dugujem dr Joani Zakševskoj na svesrdnoj pomoći u izradi ove
disertacije, rukovođenju i izvođenju eksperimenata koji se tiču NMR spektroskopije kao
i učešću i pomoći u osmišljavanju svih ostalih eksperimenata.
Zahvaljujem se dr Tijani Cvetić-Antić na pomoći u biohemijskom delu disertacije i dr
Vuku Maksimoviću koji je zaslužan za ispitivanja HPLC metodom.
Veliki doprinos ovoj disertaciji dali su dr Ivan Sasojević bez čijeg angažovanja ne bi
bili obavljeni EPR eksperimenti i dr Jelena Bogdanović Pristov koja je zaslužna za
spektrofotometrijska ispitivanja predstavljena u ovoj disertaciji.
Hvala dr Željku Vučiniću, rukovodiocu projekta u okviru kojeg su izvršena ova
istraživanja. Takođe, zahvalio bih se koleginici Marini Stanić na saradnji i pomoći u
izvođenju eksperimenata
Na kraju, najveće hvala mojoj porodici na strpljenju i razumevanju, kao i moralnoj
podršci koju sam dobio.
METABOLIZAM I METABOLIČKI EFEKTI VANADIJUMA KOD GLJIVE
PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS
REZIME
U ovoj doktorskoj disertaciji je
31
P NMR metodom ispitivan uticaj vanadijuma
na fosfatni i energetski metabolizam gljive Phycomyces blakesleeanus, dok su
primenom EPR spektroskopije dobijeni podaci o načinu ulaska, mogućnosti redukcije i
obliku u kome se ovaj element može naći u micelijumu gljive. Kombinacija ove dve
biofizičke metode je omogućila da se u in vivo uslovima sagledaju metaboličke promene
u ćeliji koje je izazvao tretman vanadatom.
Fiziološki procesi kod gljiva su, u odnosu na biljke i životinje, veoma malo
istraženi. Do sada poznati podaci se odnose uglavnom na ispitivanja sprovedena na
kvascima dok su rezultati koji se odnose na ostale gljive veoma oskudni. Među njima,
razdeo Zygomycota je najslabije istražena grupa gljiva. Kao predstavnik ove klase, P.
blakesleeanus se nameće kao pogodan izbor iz više razloga a to su: jasno definisani
uslovi gajenja, brz rast i kratak životni ciklus, makroskopska veličina sporangiofora i
postojanje velikog broja mutanata za različite fiziološke procese. Sa druge strane
vanadijum je za mnoga živa bića esencijalni mikroelement čije izučavanje poprima sve
šire dimenzije zbog činjenice da ima insulin-mimetičko dejstvo te kao takav može biti
potencijalno medicinsko sredstvo. Vanadijum može predstavljati i ekološku opasnost
zbog svoje toksičnosti i povećanja njegove koncentracije u životnoj sredini zahvaljujući
ljudskoj aktivnosti. Gljive predstavljaju glavni put ulaska vanadijuma u ekosistem.
Uticaj ovog elementa na metabolizam gljiva je do sada relativno malo istraživan premda
je značaj njegovog usvajanja u gljivama višestruk. Naime, većina biljaka je mikoriznog
karaktera tako da vanadijum iz gljiva u procesima endomikorize može dospeti u biljke a
preko njih, u procesu ishrane, i u ljudski organizam. Osim toga, neke jestive gljive
bogate vanadijumom se koriste u tradicionalnoj medicini u lečenju dijabetesa, kancera i
hepatitisa. Stoga možemo reći da je značaj uticaja vanadijuma na metabolizam gljiva
višestruk.
Rezultati ovog rada pokazuju da vanadijum vrši značajne metaboličke promene
u fosfatnom metabolizmu gljive P. blakesleeanus. EPR istraživanja su pokazala da
gljiva ima sposobnost redukcije vanadata pa smo stoga ispitivali koji oblik vanadijuma
vrši ove promene. Kod P. blakesleeanus i vanadil i vanadat ulaze u ćeliju gde su oba
oblika fiziološki aktivna, ali preko različitih mehanizama, pri čemu je redukcija
vanadata u vanadil daleko intenzivnija u vanćelijskom odeljku posredstvom enzima sa
fericijanid reduktaznom aktivnošću. To je enzim sličan nitrat reduktazi izolovanoj kod
Saccharomyces cerevisae koji u sebi sadrži Mo-MPT kofaktor. Kao posledica enzimske
ekstracelularne redukcije vanadata dokazali smo da je V4+ prisutan barem u tri oblika:
van ćelije kao slobodan ili vezan za komponente ćelijskog zida i u ćeliji vezan za
odgovarajuće molekule. V4+ u ćelijskom zidu je najverovatnije vezan za polimer sličan
β-glukanu i hitozan. Posle popunjavanja mesta u ćelijskom zidu V4+ ulazi u ćeliju gde se
veže za unutarćelijske makromolekule. Pored V4+, i V5+ se vezuje za ćelijski zid gljive.
Međutim, kada se doda u većoj koncentraciji (70 µmol/g sveže mase micelijuma) i
prevaziđe mogućnosti enzima sa fericijanid reduktaznom aktivnošću da ga redukuje i
popuni vezivna mesta u ćelijskom zidu vanadat može ući u ćeliju pomoću fosfatnih
transportera. Manji deo se u citoplazmi redukuje neenzimskim reakcijama sa tiolskim
jedinjenjima dok se značajan deo vanadata ne redukuje. 31P NMR eksperimenti ukazuju
da se V4+ po ulasku u ćeliju akumulira u vakuoli vezan za molekule polifosfata i ne
izaziva metaboličke efekte u gljivi. Osim toga V4+ pri koncentraciji 0.1 mM negativno
utiče na rast micelijuma dok je takav efekat vanadata zabeležen tek na koncentraciji od
5 mM. Ovo ukazuje na veću toksičnost V4+ od V5+ što je u suprotnosti sa ranije
dobijenim rezultatima kod kvasaca.31P NMR eksperimenti pokazuju jasno da je V5+
odgovoran za promene u fosfatnom metabolizmu gljive. Uticaj ovog oblika vanadijuma
na fosfatni metabolizam gljive P. blakesleeanus smo pratili kroz promene u
intenzitetima signala fosfatnih jedinjenja
31
P NMR spektra. Dodavanjem 20 mM
koncentracije V5+ u micelijum gljive starosti 24 sata došlo je do porasta u intenzitetu
signala fosfatnih šećera koji odgovaraju po hemijskim pomacima :G6P, F6P, F1,6P,
G1P i najverovatnije F2,6P. Identifikacija ovih jedinjenja je sprovedena HPLC
metodom. Zaključili smo da vanadat kroz inhibiciju i aktivaciju enzima koji učestvuju u
metabolizmu glukoze uzrokuje promene u sadržaju ovih fosfatnih šećera. Tako smo
pretpostavili da u procesu glikogeneze vanadat inhibira enzime fosfoglukomutazu,
UDPG pirofosforilazu i glikogen sintazu dok pozitivno deluje na aktivnost enzima
glikogen fosforilaze. Imajući u vidu ranija saznanja o delovanju vanadata takođe smo
pretpostavili uticaj cAMP-a na ove enzime. Što se tiče enzima glikolitičkog procesa koji
je veoma zastupljen kao put razgradnje G6P, pretpostavka je da vanadat inhibira enzime
F2,6P2, F1,6P1 i GADPH dok pozitivno utiče na aktivnost enzima PFK1 i PFK2. Pored
porasta u sadržaju fosfatnh šećera, vanadat uzrokuje i promene u intezitetima signala
PPc, UDPG i ATP-a.
Važno je naglasiti da su za proučavanje metabolizma u ovom radu korišćene
biofizičke metode NMR-a i EPR-a koje su na nedustruktivan način omogućile praćenje
fizioloških procesa u ćeliji. Kombinovanjem rezultata ovih metoda dobijeni su podaci
koji po prvi put neposredno i in vivo ukazuju na mehanizam delovanja vanadijuma na
komplentan metabolizam gljiva. U pogledu toksičnosti, takvi podaci su potpuno
suprotni od onih koji su prethodno dobijeni kod kvasaca. Ovakav scenario jasno izdvaja
P. blakesleeanus od kvasaca na kojima je do sada istraživan metabolizam vanadijuma
kod gljiva.
Ključne reči: Phycomyces blakesleeanus, vanadijum, NMR, EPR, redukcija,
metabolizam, fosfatni šećeri, toksičnost
Naučna oblast: Biofizika
Uža naučna oblast: Molekularna biofizika
UDK broj: 577.121:577.32 (043.3)
METABOLISM AND METABOLIC EFFECTS OF VANADIUM IN FUNGUS
PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS
ABSTRACT
This disertation describes metabolism of vanadium and its influence on
phosphate and energy metabolism of fungus Phycomyces blakesleeanus performed by
31
P NMR spectroscopy, while the fungal ability and mechanisms of reduction, binding
and transport of this element in the cell investigated by EPR method. Combination of
these biophisycal methods make possible in vivo survey of vanadate provoked
metabolic changes. In general, very little is known about physiological processes in
fungi. Until now, the investigations were conducted mainly on yeasts, while the data
obtained from other fungal species are very scarce. Among them, the phylum of
Zygomycota is the least explored group of fungi. As their representative, P.
blakesleeanus is a species of choice for many reasons such as: well defined growth
conditions, intensive growth and short life cycle, macroscopic size of its
sporangiophores and a large number of mutants for diverse physiological proceses. On
the other hand, vanadium is essential ultratrace element for many living organisms and
posesses insulin-mimetic activity which nominates it as potential therephautic agent.
Vanadium may pose an environmental threat due to its potential toxicity and
anthropogenic activity-related increase of its level in the environment. Fungi are the
main route for vanadate entrance into the ecosystem, and its influence on fungal
metabolism is important even tough very little is known about it. Namely, majority of
plants are mychorhizial and vanadium can enter them via endomychoriza. In addition,
many species of edible vanadate- enriched mushroms are use as medical agents against
diabetes cancer and hepatitis. Because of that, we can say that the significance of
vanadium is multiple.
In present work we shown that vanadium has considerable influence on
phosphate metabolism of P. blakesleeanus. This fungus has a capability to reduce V5+ to
V4+ so the question was which form of vanadium causes metabolic changes. We
determined that P. blakesleeanus reduces V5+ to V4+ predominantly in the exracellular
compartement by means of the cell surface enzyme with ferricyanide reductase activity,
which most likely contains molibdenum-molibdopterin cofactor. The reduction
conducted by the cell wall and intracellular thiols seem to play only a minor role.
Following the reduction, V4+ is present in mycelium in at least three forms: as ‘free’
(vanadyl), cell wall bound, and intracellular bound V4+. In the cell wall, V4+ is most
likely bound to some β-glucan-like polymer and chitosan. V5+ also binds to cell wall.
Transport of V5+ occurs only at relatively high concentrations (70 µmol/g). The most
plausible explanation is that the high amount of vanadate exceeds binding capacity of
cell wall and the level of its competitors (i.e. phosphates) for phosphate transporter,
allowing its import into the cytoplasm. In the intracellular compartment, V5+ may be
further non-enzymatically reduced by thiols. 31P NMR results suggest that V4+ in the cell
is accumulated in vacuole, binding to PPn and has no effects on metabolic processes,
unlike vanadate. In additon, 0.1 mM concentration of V4+ has a negative influence on
micelium growth, while with vanadate, such effect are obsreved at concentrations of 5
mM and higher. This means that in P. blakesleeanus, V4+ is a more toxic species than
V5+, which is a completely opposite situation than in yeasts. 31P NMR data clearly show
that vanadate provokes considerable metabolic changes in phosphate metabolism of this
fungus. After addition of 20 mM vanadate the signal intensity of more resonance peaks
are changed. The increases are particulary observed in the intensity of sugar phosphate
signals. Identification of sugar phosphate species was conducted by HPLC
mesaurements and it was shown that treatment with vanadate is responsible for increase
of G6P, F6P,G1P, F1,6P and probably F2,6P. This changes are caused by inhibiton and
activation of many enzymes affected by vanadate. We propose that V5+ inhibits:
phosphoglucomutase, UDPG pyrophosphorilase, and glycogen synthase which are
participants of glycogen metabolism and F1,6P1, F2,6P2 and GADPH which are
intermediers in glycolysis. V5+ also increases activity of glycogen phosphorilase from
glycogen metabolism and PFK1 and PFK2 from glycolysis. In addition to changes in
sugar phosphate content, vanadate also increases levels of ATP and PPc NMR signals.
It is important to emphsize that biophisicals methods such as NMR and EPR are
used for non-destructive way investigation ofphysiological processes in cell. This is the
first evidence about direct and in vivo vanadium effects on complete phosphate fungal
metabolism obtained by the combination of these biophisical methods. As for the
toxicity, these results are completely different than those obtained in yeasts. This
scenario clearly differentiates P. blakesleeanus from yeasts, the only group of fungi
where vanadium metabolism is studied.
Key words: Phycomyces blakesleeanus, vanadium, NMR, EPR, reduction,
metabolism, sugar phosphate, toxicity
Scietific field: Biophysics
Narrower scientific field: Molecular biophysics
UDK clasification: 577.121:577.32 (043.3)
SKRAĆENICE
V5+-vanadijum u oksidacionom stanju +5, vanadat
V4+-vanadijum u oksidacionom stanju +4, vanadil
NMR-nuklearna magnetna rezonanca
EPR-elektronska paramagnetna rezonance
HPLC- tečna hromatografija visokih performansi
Pi- neorganski fosfati
PPn- polifosfati
PPc- centralne fosfatne grupe polifosfata
PPt- terminalne fosfatne grupe polifosfata
PPp-pretposlednji fosfatne grupe polifosfata
ATP-adenozin trifosfat
cAMP-ciklični adenozin monofosfat
UDPG- uridil difosfat glukoza
NADPH-nikotin adenin dinukleotid fosfat
G6P-glukoza 6 fosfat
G1P- glukoza 1 fosfat
F6P-fruktoza 6 fosfat
F1,6P- fruktoza 1,6 bisfosfat
F2,6P-fruktoza 2,6 bisfosfat
F1,6P1-fruktoza 1,6 bisfosfataza
F2,6P2-fruktoza 2,6 bisfosfataza
GAPD-gliceraldehid 3 fosfat
GADPH-gliceraldehid 3 fosfat dehidrogenaza
Gal1P-galaktoza 1 fosfat
Gal6P-galaktoza 6 fosfat
Gluam6P-glukozomin 6 fosfat
Gluac1P-glukuronska kiselina 1 fosfat
G6PD-glukoza 6 fosfat dehidrogenaza
PPP put-fosfatno pentozni put
DW- suva masa micelijuma
FW-sveža masa micelijuma
BMOV -bis maltol okso vanadijum
BEOV -bis etil hidroksi okso vanadijum
GSH- glutation
GSSG- glutation di sulfid
SADRŽAJ
REZIME
ABSTRACT
SKRAĆENICE
SADRŽAJ
1. UVOD
1
1.1. Fosfatni metabolizam............................................................................................4
1.1.1. Metabolizam ugljenih hidrata....................................................................4
1.1.2. Uloga fosfatnih šećera kod gljiva..............................................................6
1.1.3. Uloga i metabolizam polifosfata..............................................................10
1.2. Vanadijum...........................................................................................................13
1.2.1. Zastupljenost,uticaj i distribucija vanadijuma.........................................13
1.2.2. Hemija vanadijuma..................................................................................15
1.2.3. Vanadijum (V).........................................................................................16
1.2.4. Vanadijum (IV)........................................................................................18
1.2.5. Jedinjenja vanadijuma sa biološki značajnim molekulima......................18
1.2.6. Enzimi koji sadrže vanadijum................................................................19
1.2.7. Terapeutska primena vanadijuma............................................................21
1.2.8. Uticaj vanadijuma na aktivnost enzima...................................................25
1.2.9. Gljive i vanadijum...................................................................................26
2. CILJ ISTRAŽIVANJA
28
3. MATERIJAL I METODE
29
3.1. Eksperimentalni objekat......................................................................................29
3.1.1. Uzgoj P. blakesleeanus...........................................................................29
3.1.1.1.
Uzgoj spora..................................................................................29
3.1.1.2.
Uzgoj micelijuma za merenje......................................................30
3.1.2. Izolacija ćelijskog zida P. blakesleeanus ...............................................31
3.1.3. Ekstrakcija za HPLC...............................................................................32
3.1.4. Merenja prinosa biomase.........................................................................32
3.2. NMR eksperimenti..............................................................................................32
3.3. EPR eksperimenti................................................................................................33
3.4. HPLC eksperimenti.............................................................................................34
3.5. Biohemijska ispitivanja.......................................................................................35
3.6. Hemikalije...........................................................................................................36
3.7. Statistika..............................................................................................................36
4. REZULTATI
38
4.1. NMR istraživanja.................................................................................................38
4.1.1.
31
P NMR spektar gljive P. blakesleeanus................................................38
4.1.2. Uticaj starosti i načina gajenja na 31P NMR spektar micelijuma.............39
4.1.3. Uticaj vanadata na NMR spektar micelijuma različite starosti...............41
4.1.4. Uticaj vanadata na fosftani metabolizam gljive starosti 24 sata..............42
4.1.5. Koncentraciona zavisnost efekta vanadata na 31P NMR spektre.............45
4.1.6. Vremenska zavisnost efekta vanadata na 31P NMR spektre....................46
4.1.7. Uticaj vanadata na metabolizam G6P......................................................47
4.2. EPR istraživanja..................................................................................................48
4.2.1. Redukcija vanadata praćena EPR metodom............................................48
4.2.2. Načini redukcije vanadata.......................................................................50
4.2.3. Kinetika redukcije vanadata....................................................................53
4.2.4. Transport vanadata u ćeliju......................................................................56
4.3. Uticaj V4+ na 31P NMR spektar gljive..................................................................59
4.4. Toksičnost vanadata i vanadila............................................................................60
4.5. Identifikacija fosfatnih šećera HPLC metodom..................................................61
5. DISKUSIJA
65
6. ZAKLJUČCI
79
7. LITERATURA
81
8. BIOGRAFIJA
104
1.UVOD
Gljive (Fungi) predstavljaju veoma važnu grupu živih bića, koja po svojoj
raznovrsnosti, rasprostranjenosti ili biomasi nimalo ne zaostaje za druge dve grupe
višećelijskih eukariota, životinjama i biljkama. Međutim, gljive su daleko manje
istražene od biljaka i životinja i to na svim nivoima od taksonomskog do molekularnog.
Na primer, smatra se da do sada opisanih oko 100000 vrsta gljiva predstavlja manje od
3% od očekivanih oko 3,5-5,1 miliona (Blackwell 2011). Jedan od razloga ovako slabe
proučenosti je svakako taj, da gljivama sve do skora nije dat taksonomski nivo carstva,
već su proučavane ili kao jedan od delova carstva biljaka ili kao mikroorganizmi u
okviru mikrobioloških istraživanja. Kao praktična posledica ovakvog stanja danas ima
veoma malo naučnih časopisa i laboratorija, specijalizovanih za proučavanje gljiva. Ovo
je posebno izraženo u fiziološkim istraživanjima, gde se i danas, za razliku od
taksonomskih istraživanja, najveći broj radova na gljivama objavljuje u biljnim ili
mikrobiološkim časopisima.
Sve do polovine prošlog veka bilo je opšte prihvaćeno mišljenje da gljive
pripadaju carstvu biljaka (Lemery 1675) i da vode poreklo od predačke alge koja je
izgubila sposobnost fotosinteze (Atkinson 1915). Iako se ideja da se gljive odvoje od
biljaka u posebno carstvo javila relativno rano (Necker 1793), tek krajem šezdesetih
godina prošlog veka, sa nastankom taksonomskog sistema koji je klasifikovao živi svet
u pet carstava (Whitaker 1969), počinje ozbiljnije da egzistira među mikolozima, da bi
krajem osamdesetih godina postala opšte prihvaćena (Margulis & Schwartz 1988,
Cavalier-Smith 1989 Mayr 1990). Tokom devedesetih, zahvaljujući intenzivnim
molekularno-filogenetskim istraživanjima, napuštena je i dogma o biljnom poreklu
gljiva. Naime, danas je opšte privaćeno mišljenje da su životinje i gljive sestrinske
grupe (Baldauf & Palmer 1993, Keeling et al. 1998, Bricheux & Brugerolle 1997,
Roger et al. 1999, Baldauf 1999) koje vode poreklo od zajedničke predačke grupe
Choanoflagellata (Cavalier-Smith 1987, Cavalier-Smith 1998), a da biljke predstavljaju
posebnu evolutivnu liniju.
Poslednje tri decenije su donele velike promene i unutar carstva gljiva. Tako su
u carstvu gljiva su ostala pet filuma Ascomycota, Bazidiomycota, Glomeromycota,
1
Zygomycota i Chytridiomycota. Ascomycota i Basidiomycota su dve evolutivno
najmlađe grupe koje su evoluirale pre oko 300 miliona godina (Barbee & Taylor 1993)
sa jasno definisanim filogenetskom i taksonomskim odnosima. Za njih je pouzdano
pokazano da predstavljaju sestrinske grupe monofiletskog porekla tako da ih često
svrstavaju u isti filum Dikaryomycota (Berbee & Taylor 1992). Mnogo je nejasnija
situacija sa filumom Zygomycota, koji zajedno sa filumom Chytridiomycota stoji u
osnovi carstava gljiva, i koji se od odvojio od ostatka gljiva neposredno posle
Chytridiomycota (Burns et al. 1992; van de Peer & de Wachter 1997), pre oko 6001400 miliona godina (Heckman et al. 2001).
Položaj Zygomycota u osnovi Fungi, pa samim tim i viši stepen srodnosti sa
carstvom Animalia u odnosu na Dikaryomycota, čini ih veoma zanimljivim u
istraživanjima novih veza između gljiva i životinja. Na primer, pokazano je na osnovu
analiza dela sekvence citohroma c (Dayhoff 1976) i nukleotidne sekvence 5S
ribozomalne RNK (Anderson et al. 1982) da je vrsta Phycomyces blakesleeanus
(Zygomycota) podjednako filogenetski udaljena od viših gljiva koliko i od životinja
(Manella et al. 1987), dok su joj najsrodnije Chytridiomycota (Walker & Doolittle
1982). Iz istih razloga mogu biti veoma zanimljiva fiziološka istraživanja ove grupe.
Naime, dosadašnja fiziološka istraživanja gljiva, koja su uglavnom obavljana na
Ascomycota (o čemu će kasnije biti više reči) ukazuju na postojanje homologih procesa
između gljiva i biljaka, te bi možda detaljnije proučavanje fizioloških procesa kod
Zygomycota ukazalo na veze sa životinjama i na ovom nivou.
Fiziološki procesi kod gljiva, baš kao i u slučaju njihove opšte istraženosti, su
znatno manje poznati nego kod biljaka, a posebno životinja. Naime, kod gljiva postoji
svega nekoliko vrsta čija je fiziologija intenzivno istraživana. To su pre svega kvasci,
posebno Saccharomyces cerevisie, koji predstavlja jedan od najbolje istraženih
eukariotskih organizama (Bertl et al. 1998). Pored pekarskog kvasca, dobro su istražene
i Neurospora crassa (Perkins & Davis, 2000), Aspergillus spp. (Taylor et al. 1993) i
Schizosaccharomyces
plombe
koje
takođe
pripadaju
Ascomycota.
Iz
klase
Basidiomycota kao model sistemi u fiziološkim istraživanjima najčešće su korišćeni
Uromyces spp. i Ustilago maydis (Bölker 2001). Najslabije istražena grupa gljiva i sa
fiziološkog stanovišta su Zygomycota. Zapravo, samo jedna vrsta Phycomyces
blakesleeanus je u većoj meri i sistematski istraživana (Bregman et al. 1969; Cereda-
2
Olmedo & Lipson 1987). Međutim, i u slučaju P. blakesleeanus istraživanja su pre
svega bila usmerena na rast sporangiofora i to u najvećoj meri na njihovu fototropnu
reakciju (Cereda-Olmedo 2001), a u nešto manjoj meri i na geotropnu reakciju
sporangiofora (Schimek 1999), sintezu i strukturu ćelijskog zida (Gamow et al. 1987),
kao i na ispitivanje polnog razmnožavanja kod ove gljive (Sutter 1987). Ovako ciljana
istraživanja su uslovila da čitav niz procesa kod Zygomycota (npr. membranski
transport) ostanu gotovo u potpunosti nepoznati.
U istraživanju bilo kog opšteg fiziološkog procesa kod Zygomycota, vrsta P.
blakesleeanus se nameće kao prirodan izbor. Osnovni razlozi za to su: jasno definisani
uslovi gajenja, brz rast i kratak životni ciklus, makroskopska veličina njenih
sporangiofora i postojanje velikog broja mutanata za različite fiziološke procese
(Cereda-Olmedo & Lipson 1987). Imajući sve gore rečeno u vidu, u ovom radu je vrsta
P. blakesleeanus odabrana kao model sistem za istraživanje uticaja vanadijuma na
fosfatni metabolizam kod Zygomycota.
Među esencijalnim prelaznim elementima koji su toksični pri višim
koncentracijama, vanadijum je od posebnog značaja zbog velike rasprostranjenosti u
stenama, zemljištu i nešto manje u vodi (Scwartz & Milne 1971). Vanadijum je element
širokog spektra metaboličkih uticaja koji za posledicu imaju njegovu potencijalnu
upotrebu u medicini. Vanadijum se kao potencijalno sredstvo u lečenju dijabetesa sreće
još krajem 19 veka (Lyonnet et al. 1899). Njegov uticaj na fosfatni metabolizam, kao i
sa njim povezan metabolizam ugljenih hidrata, je kod gljiva relativno malo istraživan i
skoro svi eksperimentalni podaci se uglavnom odnose na kvasce (Lorentz et al. 1994,
Mannazzu et al. 1997). Značaj ispitivanja uticaja vanadijuma na metabolizam gljiva je
veliki s obzirom da je osnovni način ulaska ovog prelaznog metala u ekosistem upravo
preko gljiva (Anke et al. 2005). Sintetišući organometalne komplekse vanadijuma gljive
mogu smanjiti njegovu toksičnost (Mannazzu et al. 1997, Bisconti et al. 1997). Neke
gljive koriste polifosfate, dominantne oblike skladištenja fosfora, u detoksikaciji
organizma u prisustvu toksičnog oblika vanadijuma, vanadata. Funkcija polifosfata je
kod P. blakesleeanus sa aspekta rezervi fosfata i energije još nedovoljno ispitana.
Međutim, poznato je da uloga koju imaju polifosfati jasno odvaja gljive od ostalih
eukariota kod kojih je značaj ovih jedinjenja daleko manji, a povezuje sa prokariotima
3
gde ova jedinjenja takođe igraju ključnu ulogu u metabolizmu fosfata i energetskom
metabolizmu u celini (Kulaev et al., 1999).
1.1. Fosfatni metabolizam
Ukupan fosfatni metabolizam gljive Phycomyces blakesleeanus, za potrebe ovog
rada, možemo podeliti na dva dela. Jedan značajan deo se odnosi na fosfatne šećere, a
drugi na ostala fosfatna jedinjenja od kojih se po značaju posebno ističu polifosfati,
neorganski fosfati i molekuli ATP, s tim što je uloga polifosfata u samom
funkcionisanju metaboličkih procesa u gljivi nedovoljno ispitana.
1.1.1. Metabolizam ugljenih hidrata
Fosfatni šećeri predstavljaju u biohemijskom pogledu vezu između metabolizma
fosfata i ugljenih hidrata. Najjednostavniji ugljeni hidrati su monosaharidi ili prosti
šećeri. Metaboličkom razgradnjom monosaharida obezbeđuje se najveći deo energije
potrebne za druge procese. Esencijalni monosaharid, neophodan za pravilno
funkcionisanje i uopšte preživljavanje živih bića je glukoza. Najznačajniji put
metabolizma ugljenih hidrata je glikoliza kojom se glukoza metaboliše do piruvata,
generišući visoko energetska jedinjenja ATP i NAD(P)H (Voet & Voet 1995). Proces
glikolize obuhvata 10 enzimski zavisnih reakcija i igra ključnu ulogu u energetskom
metabolizmu, obezbeđujući značajnu količinu energije za mnoge biološke procese.
Glikolitički put počinje konvertovanjem glukoze, pod uticajem enzima heksokinaze, u
glukozu 6 fosfat (G6P). Ovaj fosfatni šećer se dalje može razgraditi u procesu glikolize,
fosfatno pentoznog (PPP) puta, i metabolit je u procesu sinteze glikogena (Slika 1). Kao
produkt glikolize, obrazuju se po dva molekula ATP-a i NADH za svaki molekul
glukoze od kojih NADH dalje ulazi u proces oksidativne fosforilacije u kome se
generišu dodatni molekuli ATP koji kod gljiva učestvuju u sintezi polifosfata (Kornberg
1995, Booth & Gudiotti, 1995, Kulaev et al., 1999 ). Alternativni model oksidacije
glukoze je PPP put kojim se generišu pentozni šećeri i NADP(H), neophodne u
biosintezi masti, aminokiselina, nukleotida i nukleinskih kiselina (Toivari 2007).
4
Slika 1. Putevi razgradnje glukoze. Ljubičaste strelice označavaju metabolizam
glikogena, plave glikolizu i proces direktno vezan za nju, dok zelene strelice pripadaju
fosfatno pentoznom putu (Voet & Voet 1995)
Enzimi dehidrogenaze u PPP putu imaju osnovnu ulogu pri redukciji NADP u
NADP(H). Glukoza 6 fosfat dehidrogenaza je prvi i ključni enzim koji određuje put
razgradnje glukoze u smeru fosfatno pentoznog ciklusa. NADP kao supstrat i NADP(H)
kao kompetitivni inhibitor određuju njegovu aktivnost (Stryer 1989), kao i ATP koji je
alosterički inhibitor ovog enzima (Levy et al.1979). U drugoj reakciji ovog ciklusa se 65
fosfoglukonolaktonat hidrolizuje do 6-fosfoglukonata koji se oksiduje u reakciji sa
NADP(H) do ribuloze 5 fosfata generišući i drugi molekul NADP(H). Ovim se završava
oksidativni deo razgradnje glukoze kroz PPP put. U neoksidativnim reakcijama ovog
puta dobijaju se pentozni šećeri: riboza 5 fosfat i eritroza 4 fosfat kao i intermedijeri
glikolize.
Živa bića obezbeđuju rezerve glukoze kao glavnog izvora energije
polimerizacijom viška ovog šećera u složenije polisaharide tj. glukane. Tako skladištena
glukoza može biti dostupna, u slučaju metaboličke potrebe, prostom razgradnjom ovog
šećera. Kod biljaka osnovni polisaharid je skrob, a kod životinja i gljiva glikogen.
Glikogen je razgranati polisaharid u kome su molekuli glukoze povezani u najvećoj
meri α-1-4 glikozidnim vezama, formirajući na taj način duže lance koji dalje stvaraju
bočne, granajući se preko α-1-6 glikozidnih veza (Chock et al. 1980). Glikogen se
razgrađuje u dva koraka do G6P. U prvom koraku enzim glikogen fosforilaza katalizuje
fosforilaciju glukozilnog terminalnog ostatka glikogena generišući glukozu-1-fosfat
(G1P). U drugoj reakciji fosfoglukomutaza potpomaže transfer G1P u G6P. Sinteza
glikogena je nešto složeniji proces jer se odigrava kroz tri reakcije. Kao i kod
razgradnje, enzim fosfoglukomutaza ubrzava proces stvaranja G1P iz G6P. Zatim enzim
UDP- pirofosforilaza katalizuje reakciju uridin 5 trifosfata i G1P u kojoj nastaju uridin
difosfoglukoza (UDPG) i polifosfati koji se odmah potom hidrolizuju (ΔG = -33.5
kJ/mol). U sledećoj rekciji enzim glikogen sintaza stimuliše pretvaranje UDPG u
glikogen prenoseći glikozilnu jedinicu UDPG do C4-OH grupe glikogenskog
neredukujućeg kraja formirajući α-1-4 glikozidnu vezu (Voet & Voet 1995).
1.1.2. Uloga fosfatnih šećera kod gljiva
Glukoza predstavlja glavni izvor energije neophodne za rast gljiva (Gotlieb
1960). Razgradnja glukoze u gljivama proizvodi energiju kroz procese glikolize ili PPP
puta, ciklusa limunske kiseline, elektronsko-transportnog lanca i oksidativne
fosforilacije. Gljive kao izvor ugljenika mogu koristiti i druge heksoze, polihidroksilne
alkohole i saharozu (Rodriges et al. 2005). U metabolizmu glukoze intezivno učestvuju
fosfatni šećeri kao intermedijeri. Metabolizam kod kvasaca se odvija uglavnom
glikolitičkim putem (oko 50%), ali i kroz fosfatno pentozni put (oko 30%) (Rodriges et
al. 2005). Osim kod kvasaca, glikoliza kao primarni način razgradnje glukoze je
6
dokazana kod Aspergilus niger, Penicillium chrysogenum, Penicillium oxalicium,
Ustilagio maydas, Uromyces phaseoli (Rodriges et al.2005). Za P. blakesleeanus je
poznato da se 65% ukupne razgradnje glukoze odvija glikolitičkim putem (Delvioix
1973). Osim na ovaj način, a u zavisnosti od starosti i načina gajenja glukoza se
metaboliše i u procesu sinteze glikogena (Rua et al. 1993). U svim gljivama uključujući
i kvasce glikogen ima dvojaku ulogu: kao rezerva ugljenika i energije i kao intermedijer
u procesima sinteze i razgradnje ugljenih hidrata (Kameron et al. 1988). Glikogen je
pored trehaloze, glukoze i hitina (Martinez-Cadena et al.1987) najprisutnija vrsta
ugljenih hidrata kod P. blakesleeanus (Hildenberg et al. 1987). Istraživanja na
micelijumu P. blakesleeanus su pokazala da se najveći deo glikogena nalazi u
citoplazmi kao slobodan (Tu i Malthora 1977) i u granulama koje sadrže i enzime koji
ga razgrađuju, u prvoj fazi rasta sporangiofora (Galland & Ootaki 1987). Njegovo
prisustvo u sporama nije zabeleženo (Furch 1981). Akumuliranje glikogena u
micelijumu P. blakesleeanus zavisi od uslova u kojima se nalazi gljiva. Zavisno od
uslova, kao i od faze rasta, ovaj polisaharid zauzima od 1 do čak 10% suve materije
micelijuma. Najveća koncentracija glikogena nađena je kod P. blakesleeanus koji kao
izvor ugljenika koristi sorbitol, dok je niska koncentracija nađena u gljivi koja je rasla
na acetatu. Maksimalni udeo u biomasi se postiže u toku eksponencijalne faze, odnosno,
oko 24 sata od početka rasta. Tada nivo preostale glukoze pada na oko polovinu početne
vrednosti. Na nivo glikogena u micelijumu P. blakesleeanus osim glukoze utiče i
prisustvo azota, a naročito prisustvo fosfata u medijumu. Naime, nivo glikogena prestaje
da raste devet sati nakon transfera micelijuma starog 24 sata u medijum koji ne sadrži
fosfate (Rua et al. 1993).
Osim glikogena veoma značajan rezervoar ugljenih hidrata kod P. blakesleeanus
je trehaloza. Oba ugljena hidrata se razgrađuju u nedostatku glukoze i u prisustvu
acetata. Njihova razgradnja je praćena povećanom aktivnošću enzima glikogen
fosforilaze, glukoamilaze i neutralne trehalaze (Rua et al. 1993). Ovakvi podaci su u
saglasnosti sa rezultatima dobijenim na kvascima za prva dva enzima (Collona et al.
1978, Jorge et al. 1997), te onim dobijenim u sporama P. blakesleeanus za enzim
trehalazu (Rua et al. 1987). U micelijumu gljive P. blakesleeanus, koji kao izvor
ugljenika neophodnog za rast koristi glukozu, najbrži rast je povezan sa visokim
sadržajem trehaloze i glikogena, pošto su oni prisutni kroz čitavu eksponencijalnu fazu
7
rasta. Pad u koncentraciji ova dva šećera počinje sa početkom stacionarne faze usled
nedostatka glukoze u medijumu. Po ovome se P. blakesleeanus razlikuje od kvasaca,
kod kojih se najveća koncentracija glukoze i glikogena postiže u početku stacionarne
faze rasta (Lilliue et al. 1980) ili Streptomyces antibioticus u kojoj oni dostižu
maksimalnu vrednost nakon nekoliko sati od početka stacionarne faze (Miguelez et al.
1997).
Metabolizam glikogena i trehaloze ugljenih hidrata kod P. blakesleeanus se
razlikuje kod dormantnih i aktiviranih spora, jer ga aktivacija spora stimuliše i menja
mu pravac (Van Laere & Carlier 1975). Neaktivirane spore P. blakesleeanus koriste
glukozu pretežno za sintezu trehaloze. Deo može biti metabolisan na druge načine,
uglavnom kroz, monofosfatni put, proizvodeći ugljendioksid, aminokiseline i supstance
nerastvorne u 80% etenolu (uglavnom proteine) (Van Laere & Carlier 1975). U
sporama P. blakesleeanus trehaloza čini oko 35% od ukupne suve mase spora (Rudolph
& Ochsen 1969). Sinteza trehaloze na račun glukoze ograničava pretvaranje glukoze u
G6P (Rua et al. 2008). Kod aktiviranih spora trehaloza se ubrzano razgrađuje do
glukoze usled povećanja aktivnosti (desetostruko) enzima trehalaze tako da je njena
koncentracija već 2 sata nakon početka klijanja mala, dok se koncentracija glukoze
značajno povećava (Van Asshe et al. 1972).
Aktivacija spora kod P. blakesleeanus može se izvesti fizičkim (termalna
aktivacija) i hemijskim putem (obično natrijum acetatom). Povećano usvajanje glukoze
kod termalno aktiviranih gljiva uslovljava i ubrzani metabolizam, tj. znatno je veće
pretvaranje glukoze u ugljendioksid i proteine nego pretvaranje u trehalozu. Ta
razgradnja se, generalno gledajući, prvenstveno odvija glikolitičkim putem što je
utvrđeno kako za spore aktivirane acetatom (Delvaux 1973) tako i za spore aktivirane
termalnim putem (Rudolph & Furch 1970). Proces aktivirnja spora donosi značajne
promene u metabolizmu ugljenih hidrata. Tu se izdvajaju: prolazni ali jako izraženi
porast koncentracije fruktoze 2,6 bisfosfata (F2,6P), aktivacija enzima trehalaze, koji
učestvuje u hidrolizi trehaloze i glicerol 3 fosfataze, enzima koji katalizuje sintezu
glicerola osnovne strukture triglicerida (Van Laere et al.1987).
Izolovana 1980 godine, F2,6P igra jednu od glavnih uloga u regulaciji
metabolizma ugljenih hidrata (Vandercammen et al. 1990). F2,6P je stimulator enzima
fosfofruktokinaze1 (PFK1) kod mnogih eukariotskih organizama uključujući i gljive
8
(Hers & Van Schaftingen 1982). Aktivnost ovog enzima u kvascima (Bartrons et al.
1982) i P. blakesleeanus (Van Laere 1983) izrazito raste sa mikromolarnim
koncentracijama F2,6P. Kod P. blakesleeanus je glikoliza kontrolisana aktivnošću
PFK1 (Van Laere 1983 et al.) i NAD(P)H zavisnom laktat dehidrogenazom (Soler et al.
1982 i Busto et al. 1983), koji reguliše stvaranje NAD(P). U kvascima se F2,6P brzo
sintetiše kada glukoze ima u višku te je njegova glavna uloga u podršci glikolize tj. u
kontroli odnosa PFK1 i fruktoza 1,6 bisfosfataze (F1,6P1). Dejstvo F2,6P na F1,6P1 kod
P. blakesleeanus do sada nije ispitivano. Snažan ali prolazni porast sadržaja F2,6P u P.
blakesleeanus se dešava pri aktivaciji spora, zajedno sa rastom i ostalih heksoza i
glicerola (Van Laere et al. 1983). Biosinteza ovog fosfatnog šećera zahteva prisustvo
fruktoze 6 fosfata (F6P) i ATP-a u većim koncentracijama, kao i aktivnost enzima
fosfofruktokinaze2 (PFK2) koji katalizuje ovu reakciju. F6P je jedva prisutna u
dormantnim sporama, ali aktivacijom se njena koncentracija višestruko uvećava (Van
Laere et al. 1983), dok je nivo ATP u dormantnim i aktiviranim sporama u ovoj gljivi
skoro isti. ATP u većim koncentracijama predstavlja alosterički inhibitor za PFK1, ali
čak i male vrednosti F2,6P su dovoljne za ponovnu aktivaciju ovog enzima (Voet &
Voet 1995). PFK2 u nekim organizmima zajedno sa fruktoza 2,6 bisfosfatazom (F2,6P2)
predstavlja deo bifunkcionalnog proteina. Kod najvećeg broja gljiva ovo su dva posebna
enzima (Vandercammen et al. 1990). Za razliku od koncentracije F2,6P u
Blastocladiella emersonii (Vandercammen et al. 1990) koja je konstantna tokom
procesa klijanja spora, nivo F2,6P u P. blakesleeanus karakteriše iznenadan trenutni rast
jer se promene koncentracije događaju u periodu od najduže 30 minuta od aktiviranja
spora (Van Laere et al. 1983).
U gljivama, PPP put je prvenstveno odgovoran za produkciju redukujućeg
molekula NADPH (Henkinson 1973). Procene stepena razgradnje G6P kroz PPP put
kod Saccharomyces cerevisiae variraju od svega 1-4% (Gancedo & Lagunas 1973) do
čak 44% (Gombert 2001). Takva razlika je uslovljena uslovima gajenja, a najviše
prisustvom kiseonika, jer se veći procenat razgrađuje u aerobnim uslovima. Ipak u
odnosu na ostale proučavane Saccharomycotina manji deo razgradnje glukoze ide kroz
PPP put (Blank et al. 2005). Produkti razgradnje fosfatno pentoznom putem, kod
kvasaca u 90% slučajeva ulaze u proces glikolize u vidu F6P i gliceraldehid 3 fosfata
(GAP) (Rodrigues et al. 2005). Ključni enzim koji reguliše PPP put je G6PD koji sa
9
G6P u prvoj reakciji generiše 1 molekul NADPH. Njegova funkcionalnost kod mnogih
gljiva zavisi od koncentracije substrata, NADP (Hankinson et al. 1973). Pokazano je da
u gljivi Aspergillus nidulans, Candida utilis i Dendryphiella salina nitrati stimulišu
oksidaciju glukoze fosfatno pentoznim ciklusom aktiviranjem G6PD i laktat
dehidrogenaze.
Osim
kod
ovih
enzima
rast
se
primećuje
i
u
aktivnosti
fosfoglukoizomeraze (Cove et al. 1974). Određene karakteristike ovog enzima su
izučavane kod N. crassa, Penicilium duponti i Penicillium notatum (Hankinson et al.
1973).
Razgradnja glukoze PPP putem u P. blakesleeanus je malo istraživana.
Delimično je izolovan enzim G6PD iz sporangifora ove gljive i kao i kod S. cerevisiae
je pokazana specifičnost NADP kao koenzima u ovom procesu, te inhibitorno dejsvo
povećane koncentracije ATP (Cohen et al. 1987). Saglasno tome, NADP zavisna
alkohol dehidrogenaza reguliše PPP put kroz redukciju acetilaldehida (Garces &
Medina 1985, Hartz et al. 1978). Slično enzimu laktat dehidrogenaza, kod termalno
aktiviranih spora P. blakesleeanus sa glukozom kao izvorom ugljenika, ovaj enzim ima
znatno veću aktivnost na kiseloj sredini nego na pH vrednosti 7 (Martinez-Cadena et
al. 1995).
Metabolizam ugljenih hidrata tesno je povezan i zapravo čini deo fosfatnog i
energetskog metabolizma. Naime već u prvoj reakciji razgradnje glukoze se javljaju
fosfati kao sastavni delovi intermedijera tj. fosfatnih šećera. Osim toga, u procesima
glikolize i PPP puta se generišu veoma važni činioci fosfatnog metabolizma kao što su
ATP i NADP(H), koji ujedno predstavljaju i glavne izvore energije za anaboličke
procese (Voet & Voet 1995). Fosfatni i za njega vezani energetski metabolizam kod
gljiva karakteriše niz specifičnosti u odnosu na znatno bolje proučene procese kod
biljaka i životinja, poput značajne uloge polifosfata i izuzetne složenosti i raznovrsnosti
respiratornog lanca. Tako hidroliza polifosfata po utrošku glukoze iz medijuma ukazuje
na njihovu ulogu kao rezervoara energije (Vagabov 1998).
1.1.3. Uloga i metabolizam polifosfata
Usvajanje fosfata kod gljiva predstavlja proces koji je neophodan za njihovo
preživljavanje. Gljive usvajaju neorganske fosfate koje ugrađuju u osnovne ćelijske
konstituente kao što su fosfolipidi, nukleinske kiseline i proteine. Takođe, jedna od
10
bitnih uloga fosfata u metabolizmu gljiva je u procesima fosforilacije. Značajan deo
fosfata u ćeliji nalazi se u obliku polifosfata (Archbegova & Nahalka 2011). Neorganski
polifosfati (PPn) predstavljaju linearne polimere sastavljene od nekoliko desetina do
nekoliko stotina ortofosfatnih ostataka (Pi) međusobno povezanih visokoenergetskim
fosfoanhidridnim vezama sličnim onima u ATP. PPn su jedinjenja nastala još tokom
abiotičke evolucije, na šta ukazuje njihovo prisustvo u vulkanskim stenama (West &
Ponnamperuma, 1970; Yamagata et al., 1991). Smatra se da su imali veoma važnu
ulogu abiotičkoj sintezi nukleinskih kiselina i drugih makromolekula (Kulaev, 1979;
Kulaev & Vagabov, 1983). Isto tako se smatra da su PPn i pirofosfati bili nosioci
energetskog metabolizma pre pojave ATP (Keefe & Miller, 1996; Kulaev & Vagabov,
1983; Wood & Clark, 1985). Naime, kod niza prokariota je pokazano da enzimi
polifosfat kinaza i AMP-fosfotransferaza mogu da katalizuju reakcije nastanka ATP iz
PPn (Kornberg, 1995; Bonting et al., 1991, 1993). Prisustvo mnogih enzima
polifosfatnog metabolizma je potvrđeno kod prokariota (Kornberg et al. 1999). Kod
eukariota je ovakva uloga polifosfata znatno manje istražena pošto je enzim polifosfat
kinaza, za koji se pretpostavlja da je odgovoran za sintezu polifosfata iz ATP do sada
izolovan samo kod kvasca Candida humicola (McGrath et al. 2005, Hooley et al. 2008)
Kod brojnih organizama, uključujući i gljive, jedna od osnovnih funkcija
polifosfata je skladištenje energije (Kornberg 1995). Naime, hidrolizom ovih jedinjenja
oslobađa se velika količina energije akumulirana u njihovim fosfoanhidridnim vezama.
Međutim niz enzima koji su uključeni u energetski metabolizam, a koristili su PPn kao
supstrat
kod
prokariota
(glukoza
6
kinaza,
AMP-fosfotransferaza
i
NAD-
fosfotransferaza), nisu nađeni kod kvasaca (Kulaev & Kulakovskaya, 2000). Ova uloga
PPn kod gljiva je ipak veoma značajna. Tako u toku eksponencijalne faze rasta kvasca u
medijumu sa dovoljno glukoze i fosfata dolazi do aktivne sinteze PPn, ali i do drastičnog
skraćivanja dužine lanca, što ukazuje da je energija dobijena hidrolizom PPn neophodna
za održavanje velike brzine rasta kvasca (Vagabov et al. 1998). Pored toga, u nedostatku
glukoze iz medijuma, iako je koncentracija fosfata još dovoljna, dolazi do intenzivne
hidrolize PPn, što ukazuje na njihovu ulogu kao rezerve energije (Vagabov et al. 1998).
Uloga PPn kao rezerve fosfata kod gljiva nije ništa manja nego kod prokariota.
Naime, pokazano je da prilikom prebacivanja kulture kvasca u medijum bez fosfata
dolazi do pada koncentracije PPn u vakuoli, citoplazmi i ćelijskoj membrani za red
11
veličine. Najznačajniju ulogu rezerve fosfata imaju PPn u vakuoli na šta ukazuju podaci
da posle 7 sati Pi gladovanja nivo PPn u vakuoli pada za čak 85% (Kulaev et al., 1999),
dok mutant kvasca koji nema vakuolu ne može da živi na medijumu bez fosfata
(Shirahama et al., 1996). Najvažniji enzimi koji omogućavaju korišćenje polifosfata su
egzopolifosfataze koji vrše hidrolizu fosfatnih ostataka sa krajeva molekula i koji su
rasprostranjeni i kod eukariota i kod prokariota (Lichko et al., 2003) i endopolifosfataze
koje hidrolizuju fosfoanhidridnu vezu između unutrašnjih Pi ostataka. Egzopolifosfataze
su enzimi koji se nalaze uglavnom u vakuolama ali u manjoj meri i u ostalim ćelijskim
odeljcima.
Značajne uloge PPn odigravaju u detoksikaciji od teških metala (Gonzalez &
Jensen, 1998; Keasling & Hupf, 1996; Keyhani et al., 1996), sintezi ćelijskog zida
(Tinsley & Gotschlich, 1995), kontroli aktivnosti gena (Kim et al., 1998; Kusano &
Ishihama, 1997; Rao et al., 1998; Shiba et al., 1997), kontroli homeostaze katjona
(Cramer & Davis, 1984; Durr et al., 1979) i aktivnosti enzima (Skorko, 1989) u toku
razvića.
Proces detoksikacije od teških metala se odvija zahvaljujući mehanizmu
vezivanja ovih katjona za PPn. Tako se proces detoksikacije kod bakterije Lactobacillius
plantarum koja ne sadrži superoksid dismutazu, enzima odgovornog za razgradnju
superoksida, odigrava mehanizmom vezivanja Mn2+ za polifosfate (Archibald et al.
1982). Regulacija ćelijske aktivnosti Ca2+ kod kvasaca zavisi takođe od njegovog
vezivanja za ove polianjonske molekule (Dunn et al. 1994). Osim toga, mehanizmi
detoksikacije vanadata kod Hansenulla polymorpha i Sacharomyces cerevisae se
obavljaju kroz vezivanje redukovane forme ovog metala za polifosfate (Mannazzu et al.
1997, Zorrodu et al. 1996). Vezivanje drugih metala na ovaj način takođe smanjuje
njihov toksični uticaj na određene organizme (Lee et al. 1994).
Izuzetno značajna je uloga PPn u kontroli homeostaze katjona. Ona je vezana za
vakuolu koja je mesto akumulacije polifosfata (Okorov et al., 1980; Wiemken & Durr,
1974). Na značaj ove funkcije PPn ukazuje podatak da pri visokoj aktivnosti katjona, i
kratkotrajnom odsustvu Pi u medijumu dolazi do veoma male hidrolize vakuoalarnih
PPn, dok se koncentracija Pi u citoplazmi održava na račun smanjenja Pi u vakuoli
(Lichko et al., 1982; Okorov et al., 1980).
12
Što se tiče podataka o ulozi polifosfata kod P. blakesleeanus pokazano je da
imaju dve osnovne uloge, energetsku i gradivnu (izvor fosfata), čiji se međusobni značaj
menja zavisno od faze razvića (Živić et al. 2007).
1.2. Vanadijum
1.2.1 Zastupljenost, distribucija i uticaj vanadijuma
Vanadijum je hemijski element, otkriven 1801 godine, koji se u periodnom
sistemu nalazi u 5B grupi. Današnje ime dao mu je Sefstrom 1830 godine i potiče od
Vanadisa, norveškog boga lepote, zbog osetljivosti na svetlost i kolorita boja koji s
dobijaju promenama pH i koncentracije njegovog rastvora. Naime, vanadijum u
različitim oksidacionim stanjima menja boje od žute preko plave do zelene i ljubičaste.
Vanadijum se nalazi u prirodi i nalazi se u nafti, uglju, tresetu, kamenom uglju,
bitumenu, uljnim škriljcima. Sirova nafta koja potiče iz Albanije i sadrži do 0.034%,
Urala koja ima do 0.061% i Venecuele, sa prosečnim udelom od čak 0.12%, je naročito
bogata ovim metalom (Rehder 2008a). Zastupljenost u ovim sirovinama potiče iz
prisutnosti vanadijuma u zemlji i stenama. Sa udelom od 0.015% vanadijum je u
Zemljinoj kori zastupljen kao i cink, što ga svrstava na 21 mesto među prisutnim
elementima (Rehder 2011). Akumulirani vanadijum u formi rude se teško nalazi.
Međutim, visoke koncentracije vanadijuma od 30 nM se nalaze u morskoj vodi što ga
posle molibdena čini najzastupljenijim prelaznim metalom u njoj (Trefrey 1989).
Koncentracije gvožđa u morima je na primer manje od 1 nM (Rehder 2008b). Osim
okeana, vanadijum je prisutan i u rekama i jezerima (Nriagu 1998).
U najvećem broju slučajeva prisustvo vanadijuma je praćeno visokim sadržajem
sumpora. Osim kompleksa koje gradi sa ovim elementom, nalazi se i u vidu jedinjenja
sa kiseonikom, natrijumom i hlorom. Jedinjenje V4+-porfirin je najstabilniji kompleks
porfirina u prirodi (Crans & Tracey 1998). Najveća koncentracija vanadijuma u kraškim
stenama, asfaltenu i geološki mlađim uljima je u oksidacionom stanju V4+. Takođe,
porfirinogeni su glavni oblici prisustva ovog prelaznog metala u sirovoj nafti. Prisustvo
vanadijuma u atmosferi u vidu kontinentalne prašine, okeanskog aerosola i vulkanskog
praha je uglavnom prirodnog porekla (Zoller et al. 1973, Byerrum et al. 1974).
13
Uticaj čoveka u globalnoj produkciji i oslobađanju vanadijuma u atmosferu u odnosu na
druge zagađivače je minoran tako da industralizacija nema neki efekat na prisustvo
ovog metala kao polutanta (Rehder 2008a). Međutim, prerađivanjem različitih vrsta
goriva koja sadrže vanadijum koji u formi oksida može dospeti u atmosferu gde ima
sposobnost oksidovanja sumpor dioksida u sumpor trioksid. Na taj način potpomaže
sintezu sumporne kiseline koja je jedna od komponenti kiselih kiša, što može biti jedan
od njegovih uticaja na život na zemlji (Rehder 2008a). Osim oslobađanja u procesima
industrijske proizvodnje antroplološki uzroci prisustva vanadijuma u zemljištu mogu
biti: oslobađanje iz ostataka neadekvatno skladištenih sirovina bogatih ovim elementom
gde se zbog malog isparavanja na visokim temperaturama može naći i do 50 mg/g V
(Mamane & Pirrone 1988): otpadne vode iz gradskih sistema i određene vrste đubriva
sa visokim sadržajem fosfata koji se koriste u poljoprivredi (Van Zinderen &
Jaworowski 1980).
Postoji više načina na koji ovaj element može dospeti u hranu. Naime,
izlučivanjem u zemljište i vode preko korena i semena se transportuje u biljke kao što su
pasulj, ječam, pšenica ili repa (Crans 1998). Za mnoge žive sisteme to je esencijalni
mikroelement (Rehder 1992). Kod sisara vanadijum je element prisutan u tragovima i
premda postoje istraživanja na miševima i pacovima, njegova uloga kod ovih
organizmama je još nedovoljno ispitana (Tsiani & Fantus 1997). Ljudi su dnevno
izloženi vanadijumu u veoma malim količinama putem hrane, vode i vazduha. U
zavisnosti od vrste hrane ovaj element je prisutan u količinama od 5 do 2500 µg/kg suve
mase (Anke et al. 2005). Postoje istraživanja u kojima je pokazano da dnevna količina
hranom unetog vanadata kod čoveka iznosi do 0.5 µg (Anke et al. 2005). Smatra se da
vanadat pentoksid u koncentracijama iznad 70 mg/m3 je smrtonosan, a utvrđena gornja
granica prisutnosti ovog toksičnog jedinjenja u radnim uslovima iznosi 0.5 mg/m3
(Cohen 1996).
Prve primene vanadijuma su zabeležene sredinom 19 veka kada se ekstrakt gala
tretmanom amonijum vanadatom koristio kao jedan vid mastila za pisanje (Van Doren
1968). Osim toga, vanadijum se koristio i u tekstilnoj industriji kao oksidant koji anilin
transformiše u crni anilin koji se koristio kao sredstvo za bojenje tkanine. Danas se
vanadijum pretežno koristi u industriji, i to zajedno sa gvožđem u proizvodnji ojačanih i
izdržljivih vrsta čelika (Hildenberg 1987). To čini oko 80% upotrebe ovog elementa u
14
industrijskoj proizvodnji. Značajne primene ovog metala u industriji u narednom
periodu baziraće se na upotrebi vanadijum pentoksida kao i na proizvodnji vanadijum
redukujućih i litijum-srebro-vanadijumskih oksidativnih baterija (Rehder 2008a), pa se
zbog neadekvatne reciklaže može očekivati njegovo povećano prisustvo u životnoj
sredini.
1.2.2 Hemija vanadijuma
Hemija vanadijuma je dosta složena jer je podložan oksido-redukcionim
promenama u zavisnosti od pH (Slika 2). Vanadijum može imati 6 oksidacionih stanja
(1-, 0, 2+, 3+, 4+, 5+) od čega su najstabilniji 3+, 4+, i 5+ (Rehder 1992).
Slika 2. Najzastupljeniji oblici vanadijuma pri različitim vrednostima pH u rastvoru.
Isprekidana vertikalna linija označava pH vrednost 7, dok dve paralelne kose
isprekidane linije ograničavaju opseg stabilnosti vode (Rehder 2008a).
Vanadijum se u zavisnosti od vrednosti pH nalazi u anjonskoj formi H2VO4- kao
vanadat, u oksidacionom stanju (+5) ili kao (+4) u obliku vanadilnog katjona VO2+
(Rehder 1992) i to su pored vanadijuma (+3), koji se takođe nalazi u obliku katjona,
oksidaciona stanja u kojima se vanadijum može sresti u prirodi.
Redoks potencijal za redukciju V5+ u V4+, pri pH vrednosti 7:
H2VO-4 +e- ↔ VO2++ 3H2O
iznosi -0.341 V i to je potencijal pri kome se vanadat redukuje do vanadila u aerobnim
uslovima pod uticajem ćelijskih komponenti kao što su glutation, askorbati, NADH,
fenolna jedinjenja ili proteini (Rehder 2003). Redukcija V4+ u V3+ se retko dešava pod
15
fiziološkim uslovima. Zato su istraživanja ovog oblika vanadijuma najmanje
zastupljena.
Tabela 1: Vrednosti elektrohemijskog potencijala redukcije u standardnim uslovima i u
uslovima približnim onima u citoplazmi
Vrsta čestice
VO2+/V3+ (VIV/VIII)
H2VO4-/ VO2+ (VV/VIV)
VO2+/VO2+ (VV/VIV)
E0 (V)
EpH=7(V)
+0.359
+1.31
+1.016
-0.462
-0.341
+0.19
Tako su za ispitivanja V5+, koji je dijamagnetik sa elektronskom konfiguracijom
d0, najprikladnije metode elektronske i vibracione kao i NMR spektroskopije. S druge
strane vanadil je paramagnetik sa jednim slobodnim elektronom u valentnoj ljusci (d1)
EPR je metoda od izbora za ispitivanje ovog oksidacionog stanja. Elektronska i
vibraciona spektroskopija kao i novije ESEEM i ENDOR spektroskopija su takođe
instrumentalne metode koje mogu dati doprinos u izučavanju karakteristika V4+
(Chasteen 1990). Za razliku od ova dva oblika, ispitivanje V3+ je otežano jer metode
koje se koriste često ne daju značajnije strukturne informacijame o ovom paramagnetiku
(d2). To je i jedan od razloga manje izučenosti ovog oblika vanadijuma (Crans 1998).
1.2.3. Vanadijum (V)
Sa stanovišta zastupljenosti vanadijum u oksidacionom stanju +5 je najznačajniji
oblik ovog elementa u prirodi. Jedna od najznačajnijih osobina vanadata je sličnost u
strukturi i naelektrisanju sa fosfatima. Upoređujući strukturu vanadata i fosfata uočljiva
slična tetraedarska struktura (Slika 3) sa suštinski istim rasporedom naelektrisanja i
sličnim vrednostima pK za vanadat (3.5, 7.8 i 12.5) i fosfat (2.1, 7.2 i 12.7) (Chasteen
1990). Ovakva sličnost uslovljava čitav niz efekata vanadata na žive sisteme. Tako je
predlozeno da se vanadat može transportovati u ćeliju pomoću fosfatnih transportnih
sistema (Bowman 1983, Bowman et al. 1983). Pokazano je da vanadati mogu formirati
estarske veze nalik onima kod fosfata (Grosser & Tracey 1990), što može biti uzrok
mnoštva bioloških efekata, a naročito promene aktivnosti enzima koji su regulisani
procesima defosforilacije i fosforilacije (Tsiani & Fantus 1997).
16
Slika 3: Struktura vanadata i fosfata
Pored sličnosti postoji i niz razlika između vanadata i fosfata. U uslovima
neutralnog pH monomer vanadata se nalazi pretežno u monoanjonskoj formi dok fosfati
egzistiraju u dianjonskom obliku. Za razliku od stabilnog H3PO4, H3VO4 prelazi u VO2+
formu koja je najzastupljenija pri pH vrednosti 1. Termodinamički podaci pokazuju da
visoka stabilnost ovog oblika V5+ potiče od većeg koordinacionog broja u odnosu na
H3VO4 oblik (Cruywagen et al. 1996).
H3VO4+H2O ↔ H2VO4- + H3O+
pK 3.5
H2VO4-+H2O ↔ HVO42- + H3O+
pK 7.8
HVO4+OH- ↔ VO43- + H3O+
pK 12.5
Pri približno neutralnim uslovima sredine H2VO4- i HVO42- oligomerizuju u
dimerne, trimerne i pentamerne strukture, što je analogno polimerizaciji fosfata u
pirofosfate, oligofosfate i polimerne strukture koje sadrže više anhidridnih veza. Upravo
činjenica da su ove strukture fosfata stabilne u vodenom rastvoru za razliku od
vanadatnih oblika (Crans et al. 1990) čini osnovnu razliku ovih grupa jedinjenja. Osim
toga, suprotno fosfatima, vanadati učestvuju u oksidredukcionim procesima, često
menjajući svoje oksidaciono stanje (Baes et al. 1976).
To znači da, pod fiziološkim uslovima, može lako doći do menjanja vanadatne
oksidovane u redukovanu vanadilnu formu. Naime, u ćeliji vanadat se može redukovati
u vanadil koji se veže za glutation i proteine, što smanjuje sposobnost inhibiranja
aktivnosti različitih enzima (Macara et al. 1980, Elberg et al. 1994). Sa druge strane,
vanadil u odsustvu glutationa, cisteina, DTT i 2-merkaptoetanola biva oksidovan u
vanadat (Crans et al.2010). Vanadat se u vodenom rastvoru može nalaziti kao
monomer, dimer, tetramer, dekamer. Svi V5+ oblici mogu biti prisutni u određenom
opsegu pH i na pH=7 najverovatnija je pojava cikličnog tetramera vanadata. U manjoj
17
koncentracij moguće je prisustvo tetra, di, mono i penta vanadata. Sa zakišeljavanjem
rastvora počinje dominantno formiranje dekavanadata (Rehder 2008a). Različiti oblici
vanadata u ćeliji mogu imati različite efekte što znači da u istoj ćeliji vanadat može
inhibirati ili stimulisati isti enzim (Crans et al. 1994).
1.2.4. Vanadijum (IV)
V4+ gradi monookso komplekse u vodenom rastvoru u obliku stabilnog vanadil
jona, VO2+. Iako je to najčešći oblik ove vrste vanadijuma, V4+ se može naći i u drugim
oblicima. Tu se pre svega izdvaja amavadin V4+, jedinjenja prisutnog u gljivama roda
Amanita koje predstavlja 1:2 kompleks vanadijuma i liganda (S,S)-2,2 hidroksilamino
dipropanske kiseline (Kneifel & Bayer 1986), kao i ogoljeni jon V4+. Ipak dominantna
forma V4+ je vanadil. Vanadilni jon je stabilan u rastvoru jedino u kiselim uslovima
sredine i pri pH 3 je najzastupljeniji oblik vanadijuma (Rehder 2008a). Sa porastom pH
raste verovatnoća za njegovom deprotonizacijom te se na pH oko 4 pretvara u
hidrolizovanu VO+ formu. V4+ gradi jedinjenja sa različitim vrstama proteina među
kojima su serum albumin, karboksipeptitaze, nukleaze i fosfataze (Crans 1989)
međutim karakter tih veza je drugačiji nego kod vanadata, usled čega je vanadat znatno
jači inhibitor enzima fosfataze u odnosu na vanadil (Tsiani & Fantus 1997). Zbog toga,
kao i zbog svojstva da u uslovima nešto povećanog pH gradi nerastvorne vanadilhidrokside, nema efikasne primene neorganskog vanadila u medicinske svrhe (Rehder
2008a). Ipak, sve češća su istraživanja ovog oblika vanadijuma, zbog činjenice da neka
njegova jedinjenja sa organskim ligandima daju dobre terapeutske rezultate koji su
slični onima dobijenim sa vanadatom ali uz znatno manji stepen toksičnosti (Tsiani &
Fantus 1997). To se pre svega odnosi na jedinjenja BMOV (bis maltol okso vanadijum)
i BEOV (bis etil hidroksi okso vanadijum) o kojima će biti više reči u narednim
poglavljima. Takođe, upotreba vanadila kao suplementa u ishrani je poslednjih godina
značajno porasla. Naime jedinjenje vanadil sulfata se koristi kao dodatak sredstvima
koja se upotrebljavaju za povećanje ukupne mišićne mase (Rehder 2008a).
1.2.5. Jedinjenja vanadijuma sa biološki značajnim molekulima
Interakcija vanadijuma sa drugim jedinjenjima u ćeliji zavisi od njegove
intracelularne koncentracije i od ćelijskog sastava. Istraživanja su pokazala sposobnost
18
vezivanja vanadata sa mnogim značajnim jedinjenjima kao što su NAD, GDP, ADP,
OH i SH grupe (Crans et al. 1995). Te interakcije dovode do različitih bioloških efekata
vanadata
kao što su insulin-mimetičko dejstvo, uticaj na nivo cikličnog adenozin
monofosfata (cAMP), efekti na metabolizme ugljenih hidrata, masti i fosfatni
metabolizam (Macara et al. 1980, Crans et al. 1989) itd. Najzastupljeniji redoks partner
u citoplazmi je svakako glutation u svojoj redukovanoj (GSH) ili oksidovanoj (GSSG)
formi. To je tripeptid koji se sastoji od glutaminske kiseline, cisteina i glicina. EPR
istraživnja su se pokazala kao efikasan metod u određivnju formiranja vanadilnoglutationskih jedinjenja (Costa Pessoa et al. 2002).
Vanadati se lako vežu sa neorganskim jedinjenjima kao što su fosfati, peroksidi i
hidroksilamini. Mnoge funkcije vanadata, pre svega stimulacija i inhibicija enzima,
potiče od strukturne sličnosti sa fosfatima. Vanadati stimulatorno deluju na fosforilaciju
enzima, što ima posebani značaj u smislu njegovog insulinskog delovanja, dok V4+
može biti uključen u produkciju superoksid anjon radikala. V5+-peroksidna interakcija je
takođe od velikog značaja u kontekstu ispitivanja “insulinskih” svojstva vanadata.
Vanadat reaguje sa peroksidima gradeći jedinjenja koja imaju bolja insulin-mimetička
svojstva od samog V5+ ali nestabilnost peroksovanadata smanjuje mogućnost primene
ovih kompleksa (Fantus et al. 1989, Kadota et al. 1987). Treća navedena neorganska
komponenta, hidroksilamin, je u vanadat zavisnim haloperoksidazama antagonist za
perokside (Rehder 2008a). Osim toga, organska jedinjenja koja u svojoj strukturi sadrže
hidroksilamidne NH2OH grupe grade ligandni sistem amavadina.
1.2.6. Enzimi koji sadrže vanadijum
U prirodi su poznate tri klase enzima koje sadrže vanadijum. To su prvenstveno
vanadijum nitrogenaze i vanadijum haloperoksidaze, a takođe značajna uloga ovog
elementa može biti i u nitrat zavisnim reduktazama.
Uloga vanadijuma u procesu fiksacije azota je otkrivena polovinom prošlog veka
(Rehder 2003) Naime, bakterije Azotobacter vinelandii i Azotobacter chroococcum kao
i cijanobakterija Anabaena sp koriste vanadijum kao zamenu za molibden u njegovom
odsustvu, ili na nižim temperaturama, u aktivnom centru enzima nitrogenaze (Rehder
2008b).
19
Slika 4: Struktura vanadijum nitrogenaze (Rehder 1999)
Vanadijum nitrogenaza, iako ređa i manje izučavana, ima neke prednosti u
odnosu na osnovni enzim koji sadrže molibden. Tako, ona ima jače dejstvo na nižim
temperaturama (Miller & Eady 1988), vrši delimičnu redukciju acetilena do etana
(Dilworth et al. 1993) i ima izraženu aktivnost kao hidrogenaza (Dilworth & Eady
1991).
Vanadijum zavisne haloperoksidaze, koje katalizuju oksidaciju halida, u svojoj
strukturi sadrže vanadijum u V5+ oksidacionom obliku. Ovi enzimi pokazuju značajnu
fosfataznu aktivnost samo u prisustvu vanadata. Eksperimentalna primena efekata
vanadijum haloperoksidaze se najčešće sreću u medicinskim istraživanjima (Hemrika et
al. 1997). Značajne su tri vrste ovih jedinjenja: bromo, hloro i jodo peroksidaze.
Posebnost ove vrste u odnosu na ostale haloperoksidaze je njihova rezistentnost na
visoku koncentraciju peroksida i organskih rastvarača kao i aktivnost u širokom opsegu
temperatura (Rehder 2008a). Prisustvo vanadijuma u pomenutim enzimima je otkriveno
u mrkim algama kao što su Ascophyllum nodosum i Laminaria csaccharina (De Boer et
al 1986, Butler 1991, Wever & Tromp 1991).
Nitrat-reduktaze su enzimi koji katalizuju dvo-elektronsku redukciju nitrata u
nitrite. Uobičajeno je da ovi enzimi sadrže kao kofaktor molibden, gde se on oksiduje iz
4+ u 6+ oblik. Nitrat-reduktaze u kojima se umesto molibdena nalazi vanadijum
izolovane su iz bakterija Thioalkalivibrio nitratreducens i Pseudomonas isachenkovii
(Rehder 2008b).
20
1.2.7. Terapeutska primena vanadijuma
Vanadijum je postao posebno privlačan istraživačima u drugoj polovini
dvadesetog veka zbog činjenice da ovaj element u različitim oblicima može imati
značajne efekte na metaboličke tokove u ćeliji. U studijama objavljenim sedamdesetih
godina prošlog veka je pokazano da vanadatni jon uspešno inhibira dejstvo enzima
Na/K ATP-aze kao i drugih fosfohidrolaza (Goldwaser et al. 2000). Istraživanja
vanadata kao neke vrste terapeutskog sredstva poprimila su značajne razmere početkom
osamdesetih godina prošlog veka. Naime, serija ispitivanja su pokazala sposobnost
ortovanadata, metavanadata i vanadil sulfata da slično insulinu utiču na usvajanje
glukoze i proces metabolizma u skeletnim mišićima i ćelijama masnog tkiva (Tolman
1979, Shechter & Karlich 1980).
Slika 5: Mehanizam delvanja insulina (Rehder 2008a)
Mehanizam stimulacije usvajanja glukoze se sastoji iz nekoliko faza (Slika 4).
Ćelijski insulinski receptor je tetramerni trans-membranski protein koji se sastoji iz α i β
podjedinice. U prvom koraku se insulin veže za intracelularnu α subjedinicu receptora
izazivjući autofosforilaciju tirozina na β subjedinici kao i drugih substrata sa unutrašnje
strane ćelije. Upravo fosforilacija ovih substrata dovodi do prenosa signala od
insulinskog receptora do vezikule koja sadrži nosač Glut4, protein odgovoran za
transport glukoze u ćeliju, usled čega se vezikula transportuje do ćelijske membrane,
Glut4 se ugrađuje u nju. Povećanje koncentracije Glut4 u ćelijskoj membrani dovodi i
21
do povećavanja usvajanja glukoze u ćeliju. U odsustvu insulina ili u nedostatku
odgovora na njegovo lučenje autofosforilacija je sprečena enzimom protein tirozin
fosfatazom što uzrokuje prekid lanca fosforilacije i aktiviranja glukoznog transportera.
Vanadat, ulazeći u ćeliju, inhibira dejstvo fosfataza. Naime on se čvrsto veže za aktivna
mesta enzima formirajući kovalentne veze sa OH, ЅH, ili NH2 grupama aminokiselina, i
inhibirajući aktivnost fosfataza u procesu defosforilacije. Rezultat takvog dejstva je
očuvanje neprekidnosti puta prenosa signala od receptora do transportera. Insulinski
efekti vanadata su najpre pronađeni u masnim tkivima pacova gde je vanadat direktno
aktivirao proces usvajanja heksoza (Dubyiak et al. 1980), oksidaciju glukoze (Shechter
et al. 1980) i lipogenezu, dok je inhibirao lipolizu (Shechter et al. 1986). Zato je
medicinska primena vanadata uglavnom usmerena na istraživanja poremećaja
prouzrokovanih nedostatkom insulina, a to su diabetes tipa 1 i diabetes tipa 2.
Ispitivanja efekata vanadata u cilju pronalaženja sredstva sa insulinskim dejstvom i
njegovo ponašanje u živim sistemima je najčešće vršeno na životinjama i to pre svega
pacovima, kao i na izolovanim skeletnim mišićima, adipocitima, jetri (Goldwaser et al.
2000) i izolovanim eritrocitima čoveka (Benabe et al. 1987). Međutim njegova upotreba
kod ljudi za sada nije odobrena.
Čovek je skoro svakodnevno izložen uticaju malih koncentracija vanadijuma i
poznato je da se on u nekom obliku nalazi u krvnoj plazmi u koncentraciji od 200 nM
što je skoro deset puta veća koncentracija od one koja se nalazi u morskoj vodi. To
može ukazivati na njegovu biološku funkciju. Kada dospe u ljudski organizam jedan
deo vanadijuma dolazi do gastroenteralnog trakta gde se, ako je u obliku vanadata,
jedan deo redukuje i taloži kao nerastvorni vanadil hidroksid i tako izbacuje iz
organizma (Rehder 2008a). Drugi deo vanadijuma se apsorbuje u krv gde se u oksidoredukcionim procesima veže za transportne proteine serin albumin i naročito transferin.
Na kraju vanadat ili vanadil dospeva u tkiva i organe. Najduže se zadržava u kičmi, jetri
i bubrezima i maksimalna koncentracija u tim organima je oko 0.3 mg/kg (Thompson &
Orvig 2006). Postoji nekoliko razloga zašto se jedinjenja vanadijuma ne koriste u
terapeutske svrhe. Najvažniji razlog je svakako toksičnost ovog elementa kada se nađe
intracelularno u većoj koncentraciji (Hope 1994). Toksičnost vanadijuma i njegovih
jedinjenja postala je polje od velikog interesa kod istaživača zbog sve veće prisutnosti
ovih jedinjenja u životnoj sredini, što je posledica njihovih korišćenja u industrijskoj
22
proizvodnji (Zoroddu 1999). Koncentracije vanadata iznad mikromolarnih izazivaju
mutacije i promene u mnogim značajnim metaboličkim procesima (Wilsky et al. 1990).
Osim toga, vanadat i jedinjenja koja ga sadrže, pokazuju potencijalno kancerogene
efekete (Huang et al.2000). Ovakvo delovanje vanadata je pokazano kod miševa i
embrionalnih ćelija hrčka (Hwang et al. 2003). Takođe, studije su pokazale da vanadat
može izazvati rinitis, faringitis, hronični kašalj i dijareju kod ljudi te dehidraciju i smrt
eksperimentalnih miševa (Roschin et al.1980, Domingo et al. 1995). Iz ovih razloga je
dosadašnja upotreba vanadata kao terapeutskog sredstva u lečenju dijabeta ograničena
(Domingo et al. 2002).
Ipak, u poslednje vreme u cilju pronalaženja leka protiv dijabetesa kao i samog
korišćenja vanadijuma kao preparata dozvoljenog za ljudsku upotrebu, testirana su
različita jedinjenja vanadijuma i organskih liganda koji umanjuju toksičnost ovog
elementa (Thompson & Orvig 2009). Kao jedna od najprikladnijih takvih jedinjenja
smatraju se BMOV (bis maltol okso vanadijum) i BEOV (bis etil hidroksi okso
vanadijum) koji su sličnog sastava. Vremenom je čak BMOV postao merilo sa kojim se
porede sva ostala hipoglikemična vanadijumova jedinjenja (Thompson & Orvig 2004,
Thompson et al. 1999). BEOV se već 50 godina koristi kao dodatak ukusa u pekarskoj
industriji, nekim pićima i zdravstveno je odobren aditiv u ljudskoj ishrani (Renhard
1971). I jedno i drugo jedinjenje pokazuju insulinsko dejstvo (Thompson & Orvig 2004,
Mc Neill et al. 1992, Orvig et al. 1995). Studije izvedene na pacovima dijabetesom
izazvanim streptozotocinom (Mc Neill et al. 1992) su pokazale značajan potencijal i
efikasnost heliranih jedinjenja u odnosu na dosad uobičajena istraživanja sa vanadil
sulfatom kao manje toksičnim oblikom vanadijuma (Dai et al. 2006). Kod ljudi je
pokazano da je efikasnost BEOV tri puta veća od vanadil sulfata (Zhang et al. 2008,
Nielsen 1995, Poucheret et al. 1998). Takođe, unosom iste količine BEOV i vanadil
sulfata u organizam znatno su manje izraženi štetni efekti vanadijuma na bubrege, jetru i
gastroenteralni trakt dok je prisutnost vanadijuma u kostima tri puta duža u slučaju
uzimanja BEOV (Thompson & Orvig 2006). Ono što je svakako cilj u ovakvim
istraživanjima je sa što manjom dozom ovih kompleksa povećati biološku aktivnost
vanadijuma u cilju lečenja, te je stoga efikasnost prethodno navedenih organskih
jedinjenja od krucijalnog značaja za pronalaženje adekvatnog leka protiv dijabetesa
(Thompson et al. 2009).
23
Osim primene u lečenju dijabetesa, pretpostavlja se da vanadijumova jedinjenja
mogu biti od pomoći u lečenju tuberkoloze, infekcija koje uzrokuju amebe, HIV-a,
herpesa i naročito nekih oblika kancera. Pozitivni rezultati u primeni vanadijuma u
tretmanu prethodno navedenih obolenja do sada su pokazana in vitro u uslovima koji
simuliraju stvarne uslove u ćeliji i njihovo potvrđivanje u in vivo uslovima bi imalo
veliki doprinos u oblasti medicine (Rehder 2008a).
1.2.8. Uticaj vanadijuma na aktivnost enzima
Kao fosfatni analog vanadat inhibira enzime fosfatnog metabolizma: ATP-aze
(Karlish et al. 1979), RNA-aze (Lindquist et al. 1973), adenilat kinaze (Lopez et al.
1976) i mnoge druge. Osim toga, nađeno je da vanadat inhibira brojne kiselinske (Van
Etten et al. 1974) i alkalne fosfataze (Lopez et al. 1976) uključujući protein tirozin
fosfatazu (Duckworth et al. 1988, Lu et al. 2001) i fosfoprotein fosfataze (Morinville et
al. 1998). Blokiranje enzima vanadatom je dokumentovano u više enzima metabolizma
ugljenih hidrata. Osim toga vanadat je poznat i kao stimulator velikog broja enzima kao
što su glukoza 6 fosfat dehidrogenaza, ribuloza 5 fosfat epimeraza, fosfoglukoza
izomeraza, adenilat ciklaza (Schwabe et al. 1979), piruvat kinaza i fosfolipaza (Tsiani i
Fantus 1997).
Istraživanja na pacovima obolelim od diabetesa su pokazala da natrijum-vanadat
obnavlja nivo G6P u masnim tkivima, jetri i skeletnim mišićima te snižava nivo glukoze
u krvi kod glodara obolelih od oba tipa dijabetesa (Shechter et al. 2003). U skeletnim
mišićima pacova vanadat ima ulogu aktivatora usvajanja heksoznih šećera, sinteze
glikogena, i glikolize (Goldwasser et al. 2000). Dodatno, hroničnim tretmanom
vanadatom rastu njegovi insulinski efekti što dovodi do potpune normalizacije procesa
glikolize i aktivnosti enzima glikogen sintaze (Munoz et al. 1992). Istraživanja vršena
na pacovima i glodarima pokazuju da vanadat inhibira brojne enzima metabolizma
ugljenih
hidrata
kao
što
su
glukoza-6-fosfataza,
fruktoza
2,6
bisfosfataza,
fosfoglukomutaza, fosfoglicerat mutaza i glikogen sintaza (Meyerovitch et al. 1991).
Uticaj vanadata na metabolizam masti i proteina kod životinja nije previše
proučavan. Ipak poznato je da vanadat inhibira lipolizu i stimuliše lipogenezu u
adipocitima pacova (Fantus et al. 1990) ima insulinsko dejstvo u izolovanim
hepatocitima i da inhibira oslobađanje VLDL holesterola (Jackson et al. 1988). Svi
24
prethodno navedeni rezultati se odnose na jedinjenja u kojima se vanadat nalazi u formi
monomera, a najčešće kao natrijum ortovanadat. Međutim, vanadijumske soli, kao
inhibitori i aktivatori mnogih reakcija metabolizma živih organizama, se sreću i u
oblicima dimera, tetramera, pentamera i dekamera (Rehder 2003). U zavisnosti od
oblika u kome se nalaze mogu da imaju i različite efekte na enzime. Tako je poznato da
je monomer vanadata aktivator enzima glukoza 6 dehidrogenaza dok je isti enzim
inhibiran vanadatovim dimerom i tetramerom (Cohen et al. 1987). Takođe, tetramer
vanadata u mišićima zečeva inhibira glikolizu na mestu razgradnje F1,6P sprečavajući
dejstvo enzima aldolaze. Monomeri vanadata ne pokazuju vidljiv efekat na istom
uzorku. Osim toga, tetrameri vanadata inhibiraju dejstvo enzima fosfoglukoizomeraze
(Crans et al. 1990).
1.2.9. Gljive i vanadijum
Gljive se odlikuju sposobnošću usvajanja i akumuliranja brojnih metala među
kojima su kadmijum, gvožđe, arsen, bakar, nikl, srebro i vanadijum (Kalac & Svoboda
2000). One predstavljaju glavni put ulaska vanadijuma u ekosistem (Lepp et al. 1987).
Kao što smo rekli u poglavlju 1.2.1 ovaj element u gljive može dospeti direktno iz
zemljišta ili voda bogatih ovim elementom. Osim toga, vanadijum koji se oslobađa u
procesima vađenja ruda i uopšte industrijskoj proizvodnji atmosferskom putem može
takođe dospeti u zemljište, gde ga gljive usvajaju. Značaj usvajanja vanadijuma od
strane gljiva je veliki i odvija se na barem dva načina. Jedan od njih podrazumeva
transport akumuliranog vanadijuma sa gljiva na biljke. Naime, poznato je da oko 90%
biljaka mikoriznog karaktera i da veliki deo vode sa rastvorenim mineralnim materijama
iz zemljišta se usvaja posredstvom micelije mikoriznog partnera (Schusler et al 2001).
Svakako naznačajniji oblik mikorize je endomikoriza koja obezbeđuje prisvajanje
metala i fosfora u biljku (Sharif & Claassen 2011). Na taj način i vanadijum ulazi u
proces lanca ishrane i posrednim putem dospeva u ljudski organizam. Osim toga, gljive,
a posebno Basidiomycete, su niskokalorična hrana sa povećanim sadržajem minerala,
esencijalnih aminokiselina, vitamina i vlakana (Han et al. 2011). Pošto u sebi ne sadrže
skrob i proste šećere koriste se u ishrani kod ljudi obolelih od dijabetesa. Među njima
poseban značaj imaju gljive bogate vanadijumom koje se u tradicionalnoj medicini
smatraju sredstvom borbe protiv ove vrste oboljenja. Istraživanja su pokazala da
25
konzumiranjem Comanita comatus (Han et al. 2009) i Cordyceps sinensis (Han et al.
2011) nivo šećera u krvi kod obolelih jedinki miševa se drastično smanjuje. Osim toga,
ekstrakt gljive Ganoderma lucidum, koja je takođe bogata vanadijumom, pokazuje
odlične efekte protiv nekih vrsta kancera, hipertenzije i hepatitisa (Han et al. 2006).
Podaci o metabolizmu vanadijuma u gljivama su veoma oskudni i uglavnom su
zasnovani na ispitivanjima dve vrste kvasaca iz klase Saccharomycotina (Ascomycota):
Saccharomyces cerevisiae i Hansenula polymorpha (Mannazzu 2001). Ipak dobijeni
rezultati ne daju jednoznačne i pouzdane podatke o načinu ulaska i metabolizmu
vanadijuma. Prema nekim istraživanjima vanadat ulazi u ćeliju kroz fosfatni transportni
sistem, nakon čega je redukovan do vanadila pod dejstvom glutationa i drugih
redukujućih sredstava (Willsky et al. 1984). Slični podaci dobijeni su u ispitivanjima u
kojima su ćelije Sacharomyces cerevisiae gajene na medijumu koji je sadržao vanadat
(Zoroddu et al 1996, Zorrodu and Masia 1997). Sa druge strane, postoje istraživanja u
kojima je pokazano da se redukcija vanadata dešava ekstracelularno te da on u
redukovanom obliku ulazi u ćeliju (Bode et al. 1990, Bisconti et al. 1997). Rezultati
dobijeni u tim eksperimentima govore da u toku inkubacije sa vanadatom u ćeliju ulazi
vanadil koji može biti lako odstranjen ispiranjem sa EDTA, ukazujući time na
ekstracelularno lociranje ovog katjona.
Što se tiče ispitivanja filamentoznih gljiva koje čine većinu u carstvu gljiva do
sada postoji veoma malo poznatih činjenica. Efekat vanadijuma je praćen na nivou
membranskog potencijala, odnosno inhibicije ATP-aze na ćelijskoj membrani P.
blakesleeanus (Živanović et al. 2001) i Neurospora crassa (Bowman 1983, Bowman et
al. 1983). Takođe je pokazano da postoje dva fosfatna transportna sistema, kroz koje
vanadat kao fosfatni analog ulazi u gljivu (Bowman et al. 1983) i sprečava njen dalji rast
(Kuroda et al. 1980), od kojih je drugi pogodniji jer ne zavisi od pH i veća mu je
vrednost Km, a ulazak vanadata kroz njega je moguć u slučaju nedostatka fosfata
(Lowendorf et al. 1975). Pored svega toga, ipak se usvajanje fosfata i vanadata istim
transportnim sistemom razlikuju. Ulazak vanadata u ćeliju je linerno zavistan tokom 3060 sekundi i zavisi od pH, dok usvajanje fosfata linearno se dešava tokom 5 minuta i
nezavisno je od pH (Kuroda et al. 1980).
U smislu toksičnosti postoje vrste koje su tolerantne na vanadat zbog
inaktivacije transportnog sistema (Kanik-Ennulat et al. 1995, Mannazzu et al. 1997) ili
26
zbog mogućnosti brze sekrecije toksičnog vanadata kroz prethodno redukovanje u
vanadilnu formu (Willsky et al. 1984, Zoroddu et al. 1996). U vrstama Neurospora
crassa i Candida albicans otpornost na prisustvo vanadata potiče baš od defekta na
fosfatnom transportnom sistemu što za posledicu ima nemogućnost ulaska vanadata u
ćeliju (Bowman 1983, Mahatny et al. 1991). Kod Saccharomyces cerevisiae tolerantnih
na vanadat taj efekat nije posledica nemogućnosti ulaska ovog anjona (Zoroddu et al.
1991). Osim toga, vanadijum uzrokuje vakuolizaciju i utiče na fosfatni metabolizam,
povećavajući nivo polifosfata kod Hansenula polymorpha (Manazzu 1997), To je u
saglasnosti sa rezultatima dobijenim na amebi Dictiostelium ameboe (Klein et al. 1989).
Kod Hansenula polymorpha a i kod Sacharomyces cereviseae (Zoroddu et al. 1996) je
ovaj proces posledica redukovanja vanadata u vanadil jone koji se sjedinjuju sa
polifosfatima što predstavlja detoksikacioni proces koji predhodi izbacivanju jona
metala iz ćelije (Wood & Wang 1983). Uticaj vanadata na fosfatni metabolizam na
nivou polifosfata praćen je kod nekih vrsta Sacharomyces cerevisiae, gde porast nivoa
polifosfata tj. njihova sinteza je uzrokovana inhibicijom enzima egzopolifosfataze
(Guranowski et al. 1998).
27
2. CILJ ISTRAŽIVANJA
Osnovni cilj disertacije je određivanje uticaja vanadijuma u +4 i +5 obliku,
mogućnost i mesta redukcije, mehanizam ulaska ovih oblika, uticaj na fosfatni
metabolizam, na rast i razvoj gljive Phycomyces blakesleeanus. . U tom smislu bilo je
neophodno:
1. Metodom EPR spektroskopije utvrditi da li gljiva P. blakesleeanus redukuje
vanadat i u zavisnosti od toga utvrditi mehanizme kojima se odvijaju ti procesi.
2. Utvrditi mesta redukcije i oblike vanadijuma prisutne u ćeliji i van nje kao i
mehanizam kojim vanadijum ulazi u ćeliju.
3. Metodom
31
P NMR spektroskopije utvrditi koji oblik vanadijuma izaziva
metaboličke promene u gljivi P. blakesleeanus i kako uticaj vanadijuma zavisi
od starosti gljive.
4. Utvrditi i uporediti kvalitativne i kvantitativne efekte vanadijuma na
31
P NMR
spektre micelijuma P. blakesleeanus određene starosti u zavisnosti od
koncentracije i vremena dejstva.
5. Identifikovati i kvantifikovati izolovana jedinjenja pomoću HPLC i
31
P NMR
metode.
6. Merenjem prinosa biomase i 31P NMR spektroskopijom utvrditi uticaj oba oblika
vanadijuma na rast i razvoj micelijuma u zavisnosti od koncentracije, tj. odrediti
njihovu toksičnost.
28
3.MATERIJAL I METODE
3.1. Eksperimentalni objekat
Kao eksperimentalni objekat u ovom radu je korišćen divlji soj NRRL 1555
gljive Phycomyces blakesleeanus (Burgeff).
3.1.1. Uzgoj Phycomyces blakesleeanus
3.1.1.1 Uzgoj spora
Vegetativne spore gljive P. blakesleeanus su čuvane u zamrzivaču u
koncentraciji od 107 spora/ml. Pre sađenja štok spora je razblažen do koncentracije od
102 spora/ml i inkubiran 15 minuta na temperaturi od 49 oC, da bi se aktivirao proces
klijanja. Spore su sađene na čvrstom krompirovom medijumu. Krompirov medijum je
pripreman tako što je 200 g krompira kuvano sat vremena u 1 l destilovane vode. Potom
je krompir proceđen kroz dvoslojnu gazu i zapremina filtrata dopunjena do 1 l. Filtrat je
ponovo zagrevan do ključanja. U ključali filtrat je dodavano 15 g agara, 20 g glukoze, 1
mg vitamina B1 i 15 g ekstrakta kvasca. Dobijen medijum je autoklaviran 35 minuta na
temperaturi od 105 oC, nakon toga je sterilno razlivan u petri kutije prečnika 9 cm i
visine 1 cm do nivoa od oko 0.5 cm i ostavljan da se ohladi. 100 μl aktiviranih spora je
dodavano u svaku petri kutiju. Gljive su gajene u komori za uzgoj, smeštene u
plastičnim kutijama i izložene kontinuiranom osvetljenju pomoću belog flourescentnog
svetla jačine 10 W/m2. Temperatura u komori je bila 20 oC, a relativna vlažnost vazduha
oko 95%. Posle 4 dana rasta, gljive su dostizale zadnji stepen razvoja sporangiofora.
Zrele sporangiofore su zatim potapane u vodu gde su njihove opne pucale što je dovelo
do oslobađanja spora. Takav rastvor je razblažen sa vodom u odnosu 1:1,4 i na taj način
smo dobili štok spora koncentracije 107 koji je čuvan u zamrzivaču i korišćen u za uzgoj
micelijuma za eksperimente.
29
3.1.1.2. Uzgoj micelijuma za merenja
Pre sađenja, vegetativne spore gljive P. blakesleeanus su razblaživane 10 puta,
do koncentracije od 106 spora/ml i inkubirane 15 minuta na temperaturi od 49 oC, da bi
se aktivirao proces klijanja. Spore su sađene u standardni tečni minimalni medijum
(Sutter, 1975) sastava: 36.7 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4 x 7H2O, 0.376 mM CaCl2, 3
μM tiamin x HCl, 1 μM limunska kiselina x H2O, 3.7 μM Fe(NO3)3 x 9H2O, 3.5 μM
ZnSO4 x 7H2O, 1.8 μM MnSO4 x H2O, 0.2 μM CuSO4 x 5H2O, 0.2 μM NaMoO4 x
2H2O, ali sa duplom koncentracijom glukoze i L-asparagina (220 mM glukoze, 26.6 mM
L-asparagina). Duple koncentracije glukoze i L-asparagina su korišćene da bi se
osigurala dovoljna količina izvora ugljenika i azota tokom rasta gljive. Pre sađenja,
minimalni medijum je je autoklaviran 35 minuta na temperaturi od 105 oC. Potom je
razlivano po 30 ml minimalnog medijuma, u erlenmajere zapremine 100 ml. U svaki
erlenmajer je dodavano po 3 ml aktiviranih spora, tako da je konačna koncentracija
spora u medijumu bila oko 105 spora/ml. Broj zasađenih erlenmajera je zavisio od
stupnja razvića gljive koji je korišćen u NMR, EPR i HPLC eksperimentima. Da bi se
omogućila konstantna oksigenacija medijuma u toku gajenja erlenmajeri, u kojima su
gljive barbotirane, su postavljani na mešalicu smeštenu u komori za uzgoj u kojoj je
obezbeđeno stalno osvetljenje belim flourescentnim svetlom jačine 10 W/m2 i
temperatura od 20 oC.
U određenim eksperimentima su, umesto standardnog minimalnog medijuma,
korišćeni medijumi u čijem sastavu nije bilo gvožđa ili molibdena. Rastvor
mikroelemenata koji su neophodni za rast micelijuma, u ovim eksperimentima, je
napravljen bez gvožđa, odnosno molibdena. Osim toga, štok spora koji je korišćen u
ovim eksperimentima je dobijen uzgojem micelijuma na čvrstom minimalnom
medijumu (3% agar) bez molibdena, odnosno gvožđa. Micelijum korišćen za
eksperimente i zrela gljiva sa formiranim sporangioforama i sporangijama su prikazani
na Slici 6.
30
А
B
Slika 6: Micelijum gljive P. blakesleeanus starosti 24 sata proceđen na vakumu (А) i
gljiva P. blakesleeanus gajena na čvrstom medijumu (B)
Za potrebe EPR i NMR eksperimenta, micelijum je filtriran pomoću vakuuma i
ispiran minimalnim medijumom sa 0.2 mM KH2PO4, bez mikroelemenata, pH = 3.85,
koji definišemo kao eksperimentalni medijum.
3.1.2 Izolacija ćelijskog zida P. blakesleeanus
Ćelijski zid je izolovan u medijumu koji je sadržao: 50 mM TRIS, 50 mM NaCl
i 0.05% Triton X-100, pH =7.2. Pre homogenizacije, micelijum je ispran a tečnost je
izvučena vakumom. Homogenizovanje micelijuma je vršeno u izolacionom medijumu
3x5 sekundi uz pomoć Polytron homogenizer (Kinematica) pri čemu je odnos mase
micelijuma i zapremine izolacionog medijuma iznosio 1:4. Homogenat je filtriran kroz
četvoroslojnu gazu, a filtrat je centrifugiran na 1000xg, 20 minuta. Talog je ispran tri
puta rastvorom TRIS 7.2 i pri svakom ispiranju centrifugiran ponovo na 1000xg, 15
minuta. Talog dobijen nakon trećeg ispiranja je korišćen u daljim eksperimentima. U
eksperimentima u kojima je ispitivana sposobnost izolovanog ćelijskog zida da redukuje
vanadat, 30 mg ćelijskog zida je inkubirano sa 7 µmol/gr V5+. U pokušaju da se odredi
koji sastojak ćelijskog zida je u najvećoj meri odgovoran za vezivanje vanadila, 30 mg
izolata ćelijskog zida, 10 mg/ml hitozana (Sigma Aldrich), glukuronska kiselina
(izolovana iz gljive prema metodi korišćenoj na P. blakesleaanus (Datema et al. 1977)),
odosno α i β-glukani, su inkubirani sa V4+ (7 µmol/gr) 5 minuta. Nakon toga su pažljivo
31
isprani dva puta sa eksperimentalnim medijumom. Količinu od 30 mg ćelijskog zida
smo izmerili na vagi proizvođača Sartorius tačnosti 10-4g i takav uzorak preneli na
teflonski držač koji smo stavili u EPR spektrometar radi merenja.
3.1.3. Ekstrakcija za HPLC
Da bi se ekstrahovali fosfatni šećeri za potrebe HPLC analize filtrirani
micelijum je usitnjen u avanu u prisustvu 0.5 M perhlorne kiseline (HClO4) u odnosu
1:5. Usitnjavanje je vršeno na ledu, a zatim je suspenzija prebačena u epruvetu u kojoj
je, sa povremenim mešanjem, stajala na ledu 15 minuta. Nakon toga je smesa
centrifigirana na ultracentrifugi 10 minuta na 10000xg. Izdvojen je supernatant i
podešen mu je pH na 7 (pomoću 2M rastvora KOH)). Takav uzorak je čuvan u
zamrzivaču na -80°C do početka merenja.
3.1.4 Merenja prinosa biomase
Za merenja biomase micelijum je uzgajan u erlenmajerima od 12 do 48 sati u
tečnom medijumu ili za potrebe ispitivanja toksičnosti vanadijuma u petri kutijama 24
sata bez i u prisustvu natrijum orto vanadata (u koncentracijama 1, 5, 7,10 i 20 mM),
odnosno vanadil sulfata (u koncentracijama 0.1, 0.5, 1 i 5 mM). pH medijuma je
podešavan na 4.5 (sa KOH), što je i optimalan pH za rast P. blakesleeanus (Burkholder
& McVeigh, 1940). Nakon navedenog vremena micelijum je filtriran pomoću vakuuma i
ispiran eksperimentalnim medijumom. Njegova suva masa je određivana na vagi
proizvođača Sartorius tačnosti 10-4g.
3.2 NMR eksperimenti
U NMR ispitivanjima 0.6-0.8 g sveže mase ovako prikupljenog micelijuma je
potom suspendovano u 2 ml aerisanog eksperimentalnog medijuma, i preneto u NMR
kivetu prečnika 10 mm. Natrijum vanadat ili vanadil sulfat su dodavani uzorku do
konačne koncentracije od 20 mM (80 µmol/g). 31P NMR merenja su vršena na Bruker
MSL 400/Apollo spektrometru, sa rezonantnom frekfencijom za
31
P od 161.978 MHz.
Spektri su snimani u vremenskom domenu od 2K, dužina pulsa je bila 14 μs (450)
vreme ponavljanja pulsa 300 ms, a spektralna širina 8000 Hz. Vreme akumulacije
spektra je bilo 6-8 minuta. Pre Fourier transformacije vršeno je eksponencijalno
32
množenje signala sa faktorom od 20 Hz. Metilen difosfonična kiselina sa relativnim
hemijskim pomakom 17.05 ppm u odnosu na 85% H3PO4 je korišćena kao spoljašnji
standard. Rastvor G6P je dodavan uzorcima sa vanadatom u tako da je njegova konačna
koncentracija bila 1.5 mM. Za potrebe ispitivanja uticaja vanadata na različite starosti
micelijuma gljive, pomoću NMR metode, sađeno je od 1 do 4 erlenmajera u zavisnosti
od starosti gljivе.
3.3 EPR eksperimenti
U EPR eksperimentima, masi od 30 mg micelijuma je dodavan natrijum vanadat
i vanadil sulfat u koncentracijama 7, 35 i 70 µmol/g sveže mase micelijuma. U
eksperimentima sa ispiranjem, 0.3 g micelijuma je ispirano na ultracentrifugi 2 puta sa
eksperimentalnim medijumom nakon dodavanja V5+ ili V4+. 30 mg ispranog micelijuma
je korišćeno za merenja EPR metodom. U eksperimentima u kojima je micelijum
ispiran sa 50 mM EDTA ispiranje je vršeno pomoću vakuum filtracije, nakon čega su
snimani supernatant i isprani micelijum.
Askorbat i glutation (GSH) su u ispitivanjima korišćeni kao jedinjenja sposobna
da redukuju vanadat u vanadil i priprema uzoraka za ta merenja je tekla na sledeći
način: 0.6 g micelijuma je inkubirano 1 sat sa V5+ (7 ili 70 µmol/g) a zatim isprano sa
eksperimentalnim medijumom. Askorbat (3.5 µmol/g) ili glutation (3.5 µmol/g) su
dodavani i inkubirani sa polovinom uzorka dok je druga polovina korišćena kao
kontrola. U eksperimentima u kojima su ispitivani mogući putevi ulaska vanadijuma u
ćeliju, korišćeni su lantan hlorid (LaCl2) u koncentraciji od 1 mM i fosfat (KH2PO4) u
koncentraciji od 36.7 mM. Kao sredstvo za denaturaciju proteina, SDS je upotrebljivan
u koncentrciji od 0.5 M, a urea u koncentraciji od 6 M. Koncentracija fericijanida u
eksperimentima u kojima je ispitivan mehanizam redukcije V5+ je iznosila 35 µmol/g,
dok je u istim eksperimentima kadmijum hlorid (CdCl2), inhibitor enzima fericijanid
reduktaze, korišćen u dve koncentracije: 2 i 20 µmol/g.
U EPR eksperimentima, uzorci micelijuma (30 mg) su stavljani na teflonski
držač, dok su tečni uzorci stavljani u cevčicu od istog materijala. Spektri su snimani na
temperaturi od 20 °C, na Varian E104-A EPR spektrometru koji radi na frekvenciji
9.452 GHz (X-band) i podešen je na sledeći način: opseg polja je 1000 G, modulaciona
33
amplituda je 10 G, modulaciona frekvencija 100 kHz, mikrotalasna snaga 100 mW,
vremenska konstanta 64 ms, i vreme snimanja uzorka 4 minuta.
3.4. HPLC eksperimenti
Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) je rađena na Waters
Breeze sistemu (Waters, Milford, MA) koji je povezan sa Waters 2465 pulsnim
elektrohemijskim detektorom sa zlatnom elektrodom prečnika 3mm i referentnom
vodoničnom elektrodom. Razdvajanje šećera je izvedeno na CarboPac (Dionex
Sunnyvale, CA) koloni tipa PA1 dimenzija 250 x 4 mm, uz odgovarajuću CarboPac PA1
pretkolonu. Za gradijentnu eluciju, korišćen je 100 mM natrijum hidroksid (NaOH)
(J.T. Baker, Deventer, Holland) sa niskim sadržajem karbonata koji skraćuju retenciona
vremena i negativno utiču na rezoluciju signala. Zbog činjenice da fosfatne šećere
karakterišu znatno duža retenciona vremena primenjen je gradijent koncentracije
natrijum-acetata u mobilnoj fazi čime je vreme potrebno za razdvajanje fosfatnih oblika
monosaharida skraćeno na razumnih 45 minuta, uz dobru rezoluciju pikova od interesa.
Signal je detektovan u pulsnom modu sa sledećim pulsnim ciklusom: E1= +0.05V
tokom 400 ms; E2= +0.75 V tokom 200 ms; E3= -0.15 V tokom 300 ms, dok je vreme
merenja bilo 180 ms. U cilju smanjenja šuma i dobijanja stabilne bazne linije koristili
smo istu koncentraciju NaOH mobilnim fazama. 100 mM NaOH–faza А 100 mM
NaOH + 500 mM NaAc–faza B se menjaju tokom analize na sledeći način:
1
2
3
4
Vremе
(minuti)
0.01
10.00
30.00
45.00
Protok
(ml/min)
1.00
1.00
1.00
1.00
%A
%B
50.0
30.0
0.0
50.0
50.0
70.0
100.0
50.0
Vremenska skala je data u razmacima od 0.2 s, dok je naponska u razmacima od 200
mV.
34
Slika 7: Kalibraciona kriva za fruktozu korišćenjem Waters 2465 elektrohemijskog
detektora
Identifikacija svih molekula vršena je na osnovu poređenja retencionih vremena
sa onima dobijenim iz komercijalnih standarda prethodno propuštenim kroz HPLC. Za
svako identifikovano jedinjenje, napravljene su kalibracione prave pomoću Empower 2
(Waters, MA, USA) programa za akviziciju i obradu podataka. Kvantifikacija je vršena
poređenjem površine i visine pika komponente sa odgovarajućim površinama i visinama
pikova standarda iz kalibracione prave.
3.5 Biohemijska ispitivanja
Za određivanje koncentracije SH grupa smo predhodno filtrirani i isprani
micelijum resuspendovali u eksperimentalnom medijumu u odnosu 1:5 na sledeći način:
za kontrolu smo 500 mg micelijuma rastvorili u 100 µl destilovane vode, za V5+
eksperimente smo 500 mg micelijuma rastvorili u 50 µl 0.2 M V5+ i 50 µl destilovane
vode dok smo za određivanje koncentracije SH grupa u prisustvu V4+ istu količinu
micelijuma rastvarali u 100 µl 0.1 M V4+. Nakon polučasovne inkubacije sa vanadatom
i vanadilom dodatim u koncentraciji od 100 µmol/g uzorak micelijuma je opran i
supernatant uklonjen. Isprani micelijum je usitnjen u avanu i resuspendovan u
ekstrakcionom rastvoru, koji se sastoji od TRIS rastvora čiji pH je dodatkom HCl
podešen na pH 7.2. Odnos mase micelijuma i zapremine ekstrakcionog rastvora bio je
1:3. Homogenat je uz mešanje držan na ledu 30 minuta, a zatim centrifugirana na
35
12000xg 10 minuta. Izdvojeni supernatant je korišćen za utvrđivanje koncentracije
sulfhidrilnih grupa. Koncentracija sulfihidrilnih grupa je određena spektrofotometrijski
gde smo u svojstvu reagensa koristili 5,5 ditiobis (2-nitrobenzoična kiselina) (DTNB)
po metodi Ellmana (Ellman 1959). Tioli reaguju sa ovim reagensom raskidajući njegove
disulfidne veze čime se dobija jonizovani 2-nitro-5-tiobenzoat (NTB) koji je žute boje.
NTB je kvantifikovan spektrofotometrijski, na talasnoj dužini 412 nm apsorpcioni
koeficijent je iznosio 13.6 M-1cm-1. Koncentracija SH grupa je izražavana u µmol po mg
proteina. Koncentracija proteina u ekstraktu micelijuma je određivana po proceduri
Bradforda (Bradford 1976). Efekat V5+ na redukciju fericijanida je praćen pomoću
ranije utvrđene metode (Thorstensen & Romslo 1988). Nakon filtracije i ispiranja
eksperimentalnim medijumom 50 mg micelijuma resuspendovali u rastvoru koji se
sastojao od 50 mM acetatnog pufera čiji je pH 6.5 i 5% glukoze i inkubirali ga u 1 ml
prethodno navedenog medijuma sa fericijanidom (1mM) i vanadatom (0.5 ili 1mM) 20
minuta na 37 °C. Nakon hlađenja na ledu uzorak je centrifugiran 10 minuta na 10000xg.
Zatim 875 µl izdvojenog supernatanta je pomešano sa 125 µl 3M NaAc., 125 µl 0.2M
natrijum citrata, 62.5 µl batofenontrolin sulfonata i 62.5 µl 3.3 mM FeCl3 rastvorenog u
0.1 M sirćetnoj kiselini. Merenja su vršena na spektofotometru proizvođača Shimidzu
(Tokio, Japan) na talasnoj dužini 535 nm i apsorpcionom koeficijentu 12.556 M-1cm-1.
Uzeto je da je procenat redukcije bez vanadata bio 100%.
3.6. Statistika
Statistička analiza je izvođena pomoću Mann-Witney U-testa na 5% nivoa
značajnosti ( P ≤ 0.05) koristeći Sigma Stat program V2 ( Aspire Softwer International,
Ashburn, VA, USA). Svi eksperimenti su izvođeni najmanjnje tri puta.
3.7. Hemikalije
Za pripremu 0.2 M rastvora NaOH sa minimalnim prisustvom karbonata, 10.5
ml rastvora natrijum hidroksida (J.T. Baker, Deventer, Holland) je rastvoreno u 1 l
prethodno degazirane dejonizovane vode. Degasiranje vode je korišćeno radi
izbegavanja reakcije između NaOH i CO2 kojom se stvaraju karbonati. Karbonati
skraćuju retenciona vremena i negativno utiču na rezoluciju signala. Za identifikaciju i
36
određivanje koncentracije fosfatnih šećera u micelijumu metodom HPLC korišćeni su
standardi za F1P, F6P, F1,6P i G6P.
Rastvor 200 mM natrijum ortovanadata (Na3VO4) je pripreman po metodi
Gordona (Gordon 1991). U vodi je rastvoren prah Na3VO4 u potrebnoj koncentraciji.
Takav rastvor je zagrejan do ključanja i nakon što se ohladio, pH mu je podešen na 10
korišćenjem rastvora NaOH. Pri ovoj vrednosti pH rastvor postaje žut. Ovakva boja
potiče od polimerizovanja monomera u dekamere vanadata. Ponovnim zagrejavanjem
do ključanja rastvor se obezbojio. Kada se ohladio, ponovnim dodavanjem NaOH
podesili smo pH na 10. U ovom slučaju odstupanje pH rastvora nakon kuvanja je manje
nego u prvom slučaju. Žutu boju smo izgubili ponovnim kuvanjem. Ovaj postupak smo
ponovili dok se pH rastvora nije u potpunosti stabilizovao. Dobijeni štok smo podelili u
plastične mikroepruvete u količini od po 1ml i čuvali do početka eksperimenata u
zamrzivaču na -20°C.
Štok vanadil sulfata koncentracije 100 mM je pripreman u eksperimentalnom
medijumu. Štokovi GSH i askorbata koncentracije 10 mM, lantan hlorida (LaCl2)
koncentracije 200 mM, kalijum fericijanida (K3(FeCN)6) koncentracije 1M, kadmijum
hlorida (CdCl2) koncentracije 250 μmol su takođe dobijeni pripremom u
eksperimentalnom medijumu. Glukuronska kiselina je izolovana iz P. blakesleeanus
ranije utvrđenom metodom (Datema et al. 1977), dok su glukani izolovani tehnikom
primenjenom kod kvasaca (Laugier et al. 2012). Sve hemikalije su nabavljene od
proizvođača Sigma-Aldrich (Taufkirchen).
37
4. REZULTATI
Uticaj vanadijuma na metabolizam gljive P. blakesleeanus praćen je sa više
aspekata korišćenjem različitih metoda pogodnih za određivanje načina ulaska, promene
oksidacionog stanja, mesta gde se ova promena odigrava, kao i uticaja vanadijuma na
metabolizam gljive. Da bi se mogao odrediti uticaj vanadata na fosfatni metabolizam
gljive prvo će biti prikazani rezultati koji, koristeći
31
P NMR metodu, definišu
karakteristike fosfatnog metabolizma u zavisnosti od uslova gajenja i starosti gljive.
4.1 NMR istraživanja
4.1.1 31P NMR spektar gljive Phycomyces blakesleeanus
31
P NMR spektar micelijuma gljive starog 24 sata prikazan je na Slici 8.
Slika 8: 31P NMR spektar micelijuma gljive starosti 24 sata.
Tri najizraženija signala u spektru, na hemijskim pomacima od -22.5 ppm (11),
0.9 ppm (3) i 1.5 ppm (2) pripadaju centralnim grupama polifosfata (PPc), odnosno
neorganskom fosfatu iz vakuole (Piv) i citoplazme (Pic). Signal α fosfata nukleotid dvai trifosfata je smešten na -10.2 ppm (α-ATP, 6), β fosfata nukleotid tri fosfata na -19.2
ppm (β-ATP, 9), dok je signal γ fosfata nukleotid trifosfata i β fosfata nukleotid
difosfata smešten na -5.4 ppm (γ-ATP, 4). Signal na oko 3.5 ppm potiče od fosfata iz
fosforilisanih šećera (SP, 1). Signal krajnjih fosfatnih ostataka iz PPn (PPt) i pirofosfata
38
(PPi) se nalazi na -6.8 ppm (5), dok je signal pretposlednjih fosfatnih ostataka iz PPn
(PPp) na -20.2 ppm (signal 10). Signal NADP(H), kao i prva rezonancija uridildifosfat
glukoze (UDPG) se nalazi na -10.7 ppm (7), dok se druga rezonancija UDPG nalazi na 12.4 ppm (8).
Dobijeni spektar je kvalitativno sličan spektrima dobijenim kod drugih vrsta
gljiva (Beauvoit et al. 1989, Hesse et al. 2000, Pilatus & Techel 1991; Yang et al., 1993
Pfeffer & Shachar-Hill 1996), ali odnos intenziteta signala PPc i neorganskih fosfata
(Pi) je značajno manji, što može biti posledica specifičnosti ispitivane vrste i/ili uslova
gajenja. Razdvojeni signali za Piv i Pic su uočeni samo u nekim spektrima. Mogućnost
razlikovanja ovih signala je zavisila od stupnja razvića gljive P. blakesleeanuss, što je
najverovatnije posledica razlika u vrednosti pH citoplazme i vakuole (Roberts, 1986) u
različitim delovima gljive. S toga će se dalje u radu ova dva signala posmatrati kao
jedinstveni signal unutarćelijskog neorganskog fosfata (Pi).
4.1.2.Uticaj starosti i načina gajenja na 31P NMR spektar micelijuma
Spektri micelijuma gljive starosti od 12 do 48 sati gajenih u erlenmajerima
prikazani su na Slici 9A. Na slici se vide jasne promene u izgledu spektara u različitim
stupnjevima razvića gljive, od kojih su najizrazitije promene u intenzitetima signala PPc
i Pi. U NMR spektrima gljiva starosti do 24 sata intenziteti oba signala rastu. Nakon
toga signal koji potiče od PPc značajno opada te je njegova detekcija ovom metodom
kod gljiva starosti veće od 36 sati, pri datim uslovima gajenja, praktično nemoguća.
Gubitak signala PPc dovodi do značajnog pada odnosa intenziteta signala PPc i Pi
(PPc/Pi). Istovremeno, spektri gljiva starosti do 24 sata ukazuju na činjenicu da fosfati u
micelijumu ne nastaju hidrolizom polifosfata, već se najvećim delom usvajanju iz
medijuma, a jedan njihov deo se istovremeno akumulira u obliku polifosfata.
Upoređujući ove podatke sa onima dobijenim kod gljiva gajenih u petri kutijama (Slika
9B) može se uočiti sličan trend promena PPc/Pi u prvoj polovini eksponencijalne faze
rasta (do 24 sata) (Slika 10). Nakon toga, odnos intenziteta ova dva signala kod gljiva
gajenih u erlenmajerima naglo i monotono opada, dok kod gljiva gajenih u petri
kutijama PPc/Pi nastavlja da raste do 36 sata starosti posle čega sledi značajno blaži pad.
Intenziteti signala ostalih fosfatnih jedinjenja u micelijumu gajenom u erlenmajerima se
takođe menjaju sa starošću gljive. Tako se sa starenjem micelijuma do 24 sata povećava
39
signal β-ATP-a. Nakon toga signal β-ATP opada i njegov intenzitet je u micelijumu
starosti 44 sata čak za 80% manji. Signali ostala dva ATP signala rastu tako da je
intenzitet signala α-ATP u spektru micelijuma starosti 44 sata za 30% a γ-ATP za 85%
veći od intenziteta odgovarajućih signala u spektru micelijuma starog 24 sata. Od tri
signala koje daje molekul ATP jedino β-ATP zavisi samo od koncentracije ATP, dok
druga dva zavise od zbira koncentracija ATP i ADP ali i još nekih molekula. Signal γATP na NMR spektru je kombinacija signala γ-ATP-a i β-ADP-a. Intenzitetu signala αATP-a doprinose i α-ADP i AMP (Evans et al. 1977) tako da promene u njegovoj visini
mogu biti posledica promene bilo koje komponente ili njihove kombinacije. S toga će se
signal poreklom od β-ATP koristi za procenu energetskog stanja ćelije. Intenzitet
signala PPt opada i njegova vrednost u spektru gljive starosti 44 sata je za 75% manji od
one koja je dobijena u spektru gljive stare 24 sata. Intenzitet signala fosfatnih šećera se
ne menja sa starošću gljive.
Slika 9: 31P NMR spektri micelijuma starosti 20-44 sati gajenog u erlenmajerima (A) i
petri kutijama (B)
40
A
50
B
PPc/Pi
Biomasa
2,0
40
30
1,0
PPc/Pi
Biomasa (g)
1,5
20
0,5
10
0
10
20
30
Vreme (min)
40
50
10
15
20
25
30
35
40
45
0,0
50
Vreme (min)
Slika 10: Zavisnost biomase (prazni kružići) i PPc/Pi (puni kružići) odnosa od starosti
gljive gajene u erlenmajerima (A) i petri kutijama (B). Isprekidana linija predstavlja
sigmoidalnu zavisnost biomase u vremenu (kriva rasta).
Kao mera rasta micelijuma je korišćena biomasa (Slika 10 prazni kružići).
Prema očekivanjima zavisnost biomase od uzrasta gljive je jasno sigmoidalna (r2=0,993,
F=477,6, P<0.001). Eksponencijalna faza rasta počinje kod gljiva starih 16 sati, a
završava se u 36 satu starosti, kada micelijum ulazi u stacionarnu fazu rasta (Slika 10A).
Upoređujući ove podatke sa onima koje smo dobili gajenjem gljiva u petri kutijama
zaključujemo da je eksponencijalna faza rasta micelijuma u erlenmajerima kraća, što je
uslovljeno razvojem reproduktivnih struktura (sporangija i sporangiofora) kod gljiva
gajenih u petri kutijama koje kod onih gajenih u erlenmajerima u potpunosti odsustvuju.
4.1.3. Uticaj vanadata na NMR spektre micelijuma različite starosti
Uticaj različitih oblika vanadijuma na fosfatni metabolizam P. blakesleeanus je
ispitivan neposredno nakon njegovog dodavanja u micelijum. Najpre smo proučavali
efekat vanadata na 31P NMR spektre gljive čija je starost bila od 12-48 sati. Kao i kod
kontrolnih uzoraka tako i pri ovim tretmanima se može uočiti da uticaj vanadata zavisi
od starosti gljive. Tako je uticaj vanadata na 31P NMR spektre u ranim fazama razvića
gljive veoma značajan, dok je kod starijih uzoraka kod kojih se signal PPc ne može
detektovati, neuočljiv. Za detaljnija ispitivanja efekata vanadata na fosfatni
41
metabolizam, smo stoga odabrali uzorak starosti 24h kod koga se najjasnije mogu
detektovati kako signali fosfatnih jedinjenja, tako i uticaj V5+ na njih (Slika 11).
Slika 11: 31P NMR spektri uzoraka micelijuma starosti od 20 do 44 pre (A) i posle(B)
dodavanja 20 mM vanadata
4.1.4. Uticaj vanadata na fosfatni metabolizam gljive starosti 24 sata
Na Slici 12 su prikazani efekti 20mM V5+ na
31
P NMR spektre micelijuma
starosti 24 sata koji su gajeni u uslovima standardne (A) i dodatne (B) oksigenacije.
Uticaj aeracije je vidljiv već u kontrolnim spektrima što se ogleda kroz razliku u
odnosima intenziteta signala PPc/Pi. Takođe, uticaj vanadata u tim uslovima je izraženiji
što i ne čudi s obzirom da je ovo strogo aerobna gljiva. Nakon tretmana vanadatom,
odnos intenziteta signala PPc/Pi je značajno porastao tako da je kod micelijuma gajenog
u aerisanim uslovima veći za 20% od odgovarajućeg u uzorku koji je rastao bez dodatne
oksigenacije. Zbog toga su istraživanja u ovom radu uglavnom vršena na micelijumima
gajenim u uslovima dodatne oksigenacije.
42
Slika 12: 31P NMR spektri kontrolnog i uzorka tretiranog vanadatom micelijuma gljive
starog 24 sata u uslovima standardne (A) i dodatne (B) oksigenacije
Značajne promene intenziteta signala pojedinih fosfatnih jedinjenja prisutnih u
31
P NMR spektru micelijuma P. blakesleeanus neposredno nakon tretmana 20 mM
vanadatom (Tabela 2) pokazuju da je uticaj vanadata na fosfatni i energetski
metabolizam gljive višestruk. Desetominutnim delovanjem, 20 mM koncentracija V5+
uzrokuje pojavljivanje snažnog signala na oko 3.35 ppm što znači da je došlo do porasta
u koncentracije nekih fosfatnih šećera. Tu pre svega mislimo na G6P, G1P, F6P, F1,6P i
F2,6P jer hemijski pomaci ovih metabolita se nalaze baš u opsegu 3-4 ppm (Evans et al.
1977, Lohmeir-Vogel et al. 1995, Hesbain-Frisque et al. 1981).
Tabela 2: Hemijski pomaci i intenziteti u 31P NMR spektru gljive starosti 24 sata.
Jedinjenje
PPc
β ATP ili Ppp
UDPG
NADPH
α-ATP
Ppt
γ-ATP
Pi
Fosfatni šećeri
kontrola
ppm
int
-22.51 42915
-20.19 14600
-12.38 7849
-10.64 11786
-9.77
7593
-6.54 11215
-5.58
6264
0.89
25645
3.46
6789
+20 mM V5+
ppm
int
-22.51
59304
-19.71
10028
-12.40
4638
-10.69
5699
-10.01
7815
-5.91
12965
-5.24
11753
1.17
21117
3.35
16550
43
Ovaj podatak bi mogao ukazivati na uticaj vanadata na neke od enzima koji
učestvuju prvenstveno u glikolizi i glikogenezi. NMR spektar micelijuma tretiranog
vanadatom donosi, osim pojave snažnih signala u domenu fosfatnih šećera, i promene u
intenzitetima signala ostalih fosfatnih jedinjenja (Tabela 2), što jasno govori o uticaju
ovog oblika vanadijuma na celokupni fosfatni metabolizam gljive P. blakesleeanus.
Intenzitet signala PPc po dodatku vanadata raste za 40% u odnosu na kontrolu, što
ukazuje da vanadat stimuliše sintezu polifosfata. Pore toga, tretman vanadatom dovodi
do smanjenja intenziteta signala koji po hemijskom pomaku pripadaju terminalnim
delovima PPn ili pirofosfata i smanjenja intenziteta signala neorganskih fosfata za 20%ovo ukazuje da se sinteza polifosfata odvija kako spajanjem kraćih lanaca u duže, čime
se smanjuje broj vršnih fosfatnih ostataka, tako i de novo iz ortofosfatnih monomera.
Kao rezultat tih promena odnos PPc i Pi se znatno povećava. Takođe, signal UDPG, koji
je glavni indikator rasta (Živić et al. 2007), se smanjuje za skoro 50%. Identično
smanjenje karakteriše i intenzitet signala koji potiče od NADP(H) i drugog atoma
fosfora u UDPG (Tabela 2), što ukazuje da dodatak vanadata izaziva snažno smanjenje
UDPG, ali da nema uočljiv efekat na NADP(H).
Vanadat utiče takođe na nivo ATP-a u micelijumu. Naime površina signala γATP-a je nakon dodatka vanadata porasla za skoro (66±4)%. Smanjivanje površine
primetili smo kod signala β-ATP i to za (20±7)%, dok je mali rast (7%) uočen u
površini signala α-ATP (Slika 13).
Slika 13: Odnos površina signala ATP pre i posle tratmana sa vanadatom.*-označava
statističku značajnost od 5%, ** -statističku značajnost 1% od 3 merenja.
44
Signal koji smo označili kao β-ATP potiče isključivo od molekula ATP-a i pad
njegove površine znači da se ATP, dodavanjem V5+, troši tj. njegova koncentracija se
smanjuje. Kako istovremeno površina γ-ATP signala, koji potiče kako od ATP-a, tako i
od ADP-a, značajno raste, to se može reći da taj rast potiče od druge komponente
signala a to je ADP, odnosno da dodatak vanadata dovodi do hidrolize ATP u ADP.
4.1.5. Koncentraciona zavisnost efekata vanadata na 31PNMR spektre
Ispitivanja uticaja vanadata na
31
P NMR spektar gljive nastavili smo ispitujući
njihovu zavisnost od koncentracije vanadata. Rezultati su prikazani na Slici 14.
Slika 14: 31P NMR spektri 24 sata starog micelijuma pri različitoj koncentraciji
vanadata.
Očito da se uticaj vanadata na fosfatni metabolizam javlja i na koncentracijama
manjim od 20 mM.
62000
PPc
58000
SP
γ−ATP
Intenzitet (PPc)
56000
20000
15000
54000
52000
50000
10000
48000
46000
44000
Intenzitet (SP, γ−ATP)
60000
5000
42000
40000
0
5
10
15
20
25
Koncentracija V5+
Slika 15: Zavisnost intenziteta fosfatnih šećera (crni kružići), PPc (plavi kružići) i γATP-a (zeleni kružići) od koncentracije dodatog vanadata u tri puta ponovljenom
eksperimentu.
45
Porast signala fosfatnih šećera, PPc i γ-ATP-a (koji je ovde uzet kao indikator
promene sadržaja ADP) čiji intenziteti u neposredno nakon dodavanja V5+ najviše rastu,
je uočljiv već pri 10 mM vanadatu i u slučaju sva tri signala gotovo linearno prati dalji
porast njegove koncentracije (Slika 15). Međutim, naša istraživanja smo bazirali na
eksperimentima u kojima smo gljivi dodavali 20 mM, odnosno praračunato po masi 80
μmol/g, vanadat jer u toj koncentraciji izaziva najveće promene i daje najinformativniji
spektar.
4.1.6. Vremenska zavisnost efekata vanadata na 31PNMR spektre
Do sada su prikazani rezultati eksperimenata u kojima je ispitivano dejstvo
vanadata neposredno nakon njegovog dodavanja gljivi. Pokazano je da je efekat veoma
značajan. Međutim, postavlja se pitanje da li se i kako on menja u vremenu. Na Slici 16
su prikazani intenziteti signala fosfatnih šećera, γ-ATP-a i PPc snimljeni u različitim
vremenskim intervalima nakon dodavanja 20 mM koncentracije vanadata.
20000
60000
PPc
55000
SP
γ-ATP
18000
16000
14000
50000
12000
45000
10000
40000
8000
35000
Intenzitet (SP, γ-ATP)
Intenzitet (PPc)
65000
6000
30000
4000
0
5
10
15
20
25
30
35
Vreme (min)
Slika 16: Vremenska zavisnost efekta 20 mM vanadata na intenzitete 31P NMR signala
na osnovu 3 merenja.
Sa slike se vidi da vanadat izaziva najveće promene neposredno nakon
dodavanja i da vremenom intenzitet signala fosfatnih šećera raste ali slabijim
intezitetom, što može biti posledica postepene redukcije vanadata u vanadil. Osim toga i
intenziteti ostala dva signala koja su dodavanjem V5+ pretrpela najveće promene se
vremenom ne smanjuju s tom razlikom što intenzitet signala γ-ATP-a ostaje konstantan
dok se intenzitet PPc signala značajno uvećava. Stoga možemo reći da dodavanje
vanadata izaziva trajne i progresivne metaboličke promene u micelijumu gljive.
46
4.1.7 Uticaj vanadata na metabolizam G6P
Pošto smo videli da V5+ uzrokuje značajan porast signala fosfatnih šećera,
dodavali smo G6P u cilju potvrđivanja i moguće tačnije identifikacije ovih metabolita.
NMR spektri iz ovih eksperimenata prikazani su na Slici 17A. Dobijeni rezultati, osim
što potvrđuju hipotezu da vanadat uzrokuje povećanje intenziteta signala fosfatnih
šećera ukazuju da dodatkom G6P nakon tretmana vanadatom se javlja novi signal.
Njegov vrh odgovara hemijskom pomaku od oko 5 ppm koji odgovara hemijskom
pomaku kompleksa F6P i enzima F2,6P2 (E-F6P) kada je F6P u velikoj koncentraciji
(Okar et al. 1995). Osim toga, pojavljuje se i nešto manji signal za koga po hemijskom
pomaku pretpostavljamo da pripada F1,6P i/ili F2,6P. To je svakako posledica dodatne
količine G6P u micelijumu, ali i blokiranja enzima glikogeneze i glikolize koji su
odgovorni za metabolizam ovog fosfatnog šećera.
Slika 17: (A) NMR spektri micelijuma, micelijuma tretiranog sa V5+ i micelijuma kojem
smo nakon V5+ dodali G6P (24 sata) i (B) NMR spektri dobijeni dodavanjem G6P u
micelijum starosti 20 sati pre dodavanja vanadata (donji spektar) i posle dodavanja
vanadata (gornji spektar)
Ulogu V5+ smo potvrdili eksperimentima u kojima smo upoređivali efekte
vanadata na NMR spektar micelijuma tretiranog sa G6P (Slika 17B). Ovi rezultati
pokazuju da dodavanje G6P u kontrolni micelijum ne izaziva promene u spektru već
one nastupaju tek nakon dodavanja vanadata. Ovakvi podaci ističu činjenicu da je
dodatna promena u intenzitetima signala fosfatnih šećera dodatkom G6P posledica
efekata vanadata na proces razgradnje glukoze tj. G6P.
47
4.2 EPR istraživanja
4.2.1. Redukcija vanadata praćena EPR metodom
Kako iz eksperimenata opisnim u poglavlju 4.1 nismo precizno utvrdili koji
oblik vanadata tačno izaziva metaboličke procese u gljivi ispitivali smo mogućnosti
redukcije V5+ u gljivi neposredno nakon njegovog dodavanja. Sposobnost gljive P.
blakesleeanus da redukuje vanadat ispitivana je EPR spektroskopijom, metodom koja je
efikasna u detekciji signala paramagnetnih supstancija u ćeliji i van nje. Kako se pod
povoljnim fiziološkim uslovima V5+ redukuje do V4+, koji je paramagnetan, to se tok
ove reakcije kod P. blakesleeanus može pratiti kroz detekciju EPR signala koji potiče
od V4+. Dodavanjem 7 μmol/g V5+ u micelijum gljive i snimanjem uzorka nakon
inkubacije od 40 minuta uočili smo pojavu EPR signala karakterističan za V4+, nastalog
redukcijom vanadata (Slika 18). Da bi to potvrdili, snimili smo spektar vanadila (V4+) u
eksperimentalnom medijumu i dobili spektar koji se sastoji od osam linija kao posledica
sprezanja nesparenog elektrona V4+ i nuklearnog spinskog momenta vanadijuma
(McBride 1979).
Slika 18: EPR spektri čistog micelijuma, vanadila nakon delovanja vanadata 40 minuta,
ispranog uzorka nakon tretmana sa vanadatom i njihovo upoređivanje sa spektom
slobodnog vanadila merenog dodavanjem vanadila u minimalni medijum .Zvezdica
označava ukupni V4+,puni kvadrat vezani V4+i krug označava slobodni V4+.
Upoređivanjem EPR signala V4+ u eksperimentalnim medijumu i u micelijumu
može se primetiti da pored linija karakterističnih za slobodni V4+ EPR spektar
micelijuma karakteriše prisustvo dodatnih linija. Da bi odredili poreklo linija koje ne
potiču od slobodnog vanadila posle inkubacije od 40 minuta sa 7 μmol/g V5+ micelijum
je ispiran eksperimentalnim medijumom i potom sniman (Slika 18, dole). Ako se
uporede EPR spektri neispranog i ispranog micelijuma uočljivo je da je u spektru
48
ispranog micelijuma deo linija u potpunosti nestao i da one potiču od slobodnog
vanadila, deo ostao nepromenjen pošto potiču od vezanog V4+ dok je intenzitet dela
linija samo smanjen pošto potiču od ukupnog V4+. Po jedna reprezentativna linija za
svaki od oblika V4+ je odabrana i označena sa zvezdicom (ukupni V4+), punim
kvadratom (vezani V4+) i krugom (slobodni V4+) da bi na dalje bila korišćena za
kvantifikaciju datog oblika.
Ovakav rezultat nas je naveo na zaključak da je u gljivi P. blakesleeanus došlo
do redukcije V5+ u V4+, te da se on u njoj nalazi u slobodnom i vezanom obliku. Ovde je
važno naglasiti da značajno manja amplituda ispranog uzorka ne podrazumeva manju
koncentraciju vezanog V4+ pošto na amplitudu signala utiče kako anizotropija tako i
efekat širenja signala.
4.2.2. Načini redukcije vanadata
Da bi utvrdili da li redukcija V5+ u V4+ predstavlja enzimsku ili neenzimsku
reakciju, micelijum gljive je tretiran sa 0.5% SDS ili 6 M ureom pre dodavanja vanadata
(Slika 19). Kao što je poznato, SDS i urea izazivaju denaturaciju proteina.
+V 5+
urea + V 5+
SDS + V 5+
Slika 19. EPR spektri micelijuma tretiranog sa 35µmol/g V5+,6M ureom, i 35µmol/g
V5+, i 0.5% SDS-om i 35µmol/g V5+,
Rezultati prikazani na Slici 19 pokazuju da je posle ovih tretmana gljiva gotovo u
potpunosti izgubila sposobnost da redukuje vanadat u V4+. To znači da je glavni
mehanizam ovog procesa enzimski.
U potrazi za enzimom koji vrši redukciju vanadata u vanadil počeli smo od
ispitivanja enzima sa fericijanid reduktaznom aktivnošću čije je postojanje na
49
spoljašnjoj strani ćelijske membrane P. blakesleeanus već pokazano (Baroja-Mazo et
al.2004). Za određivanje stepena redukcije V5+ u V4+ koja se odvija uz pomoć ovog
enzima, koristli smo amplitudu centralne linije EPR spektra V4+ (na Slici 18 označena sa
zvezdicom), jer ona predstavlja sumu slobodnog i vezanog V4+. Dobijeni podaci
ukazuju da enzim sa fericijanid reduktaznom aktivnošću može da redukuje V5+ (Slika
20). Naime, poredili smo intenzitete centralnih linija spektra u uslovima kada je
micelijum rastao na kompletnom minimalnom medijumu (kontrola), i medijumu bez
gvožđa (-Fe). Micelijum gajen bez gvožđa je pokazao skoro dva puta veći kapacitet za
redukciju V5+ što je u saglasnosti sa povećanom ekspresijom enzima sa fericijanid
raduktaznom aktivnošću (Barojo-Mazo et al. 2004).
Slika 20: Vremenski zavisne promene amplitude V4+ signala nakon tretmana sa V5+:
kontrole, medijuma bez gvožđa (-Fe),, micelijuma sa Cd2+ (2 μmol/g) i 10x Cd2+ (20
μmol/g) i micelijuma sa fericijanidom [Fe(CN)6]3- (35 μmol/g).
Pošto smo pretpostavili da je ovaj enzim odgovoran za redukciju V5+ ispitivali
smo dejstvo njegovih inhibitora na ovaj proces. Tako je dodavanje 2 μmol/g Cd2+,
inhibitora fericijanid reduktaze, dovelo do pada amplitude centralne linije spektra sa 324
na 160, što znači da se redukcija vanadata smanjila za oko 50%. Skoro potpunu
inhibiciju redukcije (78%) dobili smo desetostrukim povećanjem koncentracije dodatog
Cd2+, a isti rezultat dobili smo, i dodavanjem fericijanida, koji bi trebao da bude
preferentni supstrat fericijanid reduktaze (Slika 20). Dodavanjem 35 μmol/g fericijanida
u micelijum sa vanadatom, dobili smo EPR spektar koji osim slabog inteziteta V4+ linija
sadrži i liniju koja ne potiče od V4+ (Slika 21A). Da bi utvrdili poreklo tog signala
koristili smo MgO/Mn2+ spoljašnji standard i odredili da g-vrednost najintezivnijeg pika
u spektru iznosi 1.976. Simulaciju EPR spektra izveli smo koristeći parametre: g =
50
1.976 i A = 33 10-4 cm-1 (Burgmayer et al. 2007), i identifikovan je signal Mo5+ u
molibden-molibdopterin (Mo-MPT) kofaktoru.
Slika 21:(A) Upoređivanje signala V4+ micelijuma koji je 30 minuta inkubiran sa V5+
(35 μmol/g) sa signalima micelijuma i micelijuma koji je rastao na medijumu bez
molibdena (-Mo) koji su tretirani V5+ i fericijanidom (35 μmol/g) kao i sa simulacijom
Mo-MPT signala(Mo-MPT).(B) Uticaj V5+na redukciju fericijanida
Učešće enzima sa fericijanid-reduktaznom aktivnošću i Mo-MPT kao kofaktorom u
redukciji V5+ je pokazana i u eksperimentima u kojima smo gljivi koja je rasla bez
prisustva molibdena dodali V5+ i fericijanid (Slika 21A). Sa slike je jasno da se ovim
tretmanom drastično smanjuje signal V4+ što potvrđuje da redukcija vanadata u vanadil
zavisi od molibdena. U prilog prethodnim rezultatima idu i podaci da stepen redukcije
fericijanida opada sa porastom koncentracije vanadata u medijumu (Slika 21B).
Međutim, iako veoma smanjen, signal vanadila se ipak javlja posle dodavanja vanadata
micelijumu gajenom bez prisustva molibdena (Slika 22A) što ukazuje na sposobnost
gljive da redukuje V5+ i nekim drugim putem ali u značajno manjoj meri.
Zato smo ispitivali u kom delu ćelije bi takav proces mogao da se odigra. Dodavanje
V5+ izolovanom ćelijskom zidu je rezultovalo EPR spektrom V4+ malog intenziteta,
ukazujući na malu sposobnost ćelijskog zida da redukuje vanadat (Slika 22B).
51
Slika 22:Signal V4+ u micelijumu koji je rastao na medijumu sa i bez prisustva
molibdena (-Mo) nakon polučasovne inkubacije sa vanadatom (A) i V4+ u ćelijskom zidu
kome je dodat vanadat (7 μmol/g)(V).
Pošto se redukcija vanadata ne odvija samo pod uticajem enzima sa fericijanidreduktaznom aktivnošću (Slika 22A), ispitivali smo stepen redukcije V5+ u citoplazmi
gljive gde nema uticaja ovog enzima. U tu svrhu merili smo promene u sadržaju SH
grupa u prisustvu V5+ i V4+. Koncentracija SH grupa u netretiranom micelijumu bila je
(0.295±0.010) µmol/mg proteina. Dodatak vanadata je doveo do statistički značajnog
pada u koncentraciji SH grupa na 0.171±0.004 µmol/mg proteina (P<0.05), baš kao i
dodavanje V4+ kada je koncentraciji SH grupa pala na 0.216±0.039 µmol/mg proteina
(P<0.05). To se može objasniti neenzimskom intracelularnom redukcijom vanadata i
vanadila (Slika 23). Ovaj efekat je znatno izraženiji u slučaju redukcije V5+. Kako je
standardni redoks potencijal za V5+/ V4+ i V4+/ V3+ reakcije oko 1.0 odnosno 0.34 V
(Rehder 2008a) očekivano je da V5+ i V4+ oksiduju slobodne tiole (redoks potencijal za
reakciju CysSH/CysSSCys je oko –0.22 volta).
Slika 23: Sadržaj SH grupa u micelijumu i nakon dodavanja V5+, odnosno V4+*
označava statističku značajnost (P<0.05).
52
Imajući ove podatke u vidu, naši rezultati ukazuju i na mogućnost
intracelularnog formiranja V3+ nakon tretmana. Redukcija izazvana SH grupama, kao i
sposobnost izolovanog ćelijskog zida da vrši redukciju vanadata u V4+ objašnjava
činjenicu da ni Cd2+ni fericijanid ne mogu u potpunosti blokirati ovaj proces.
4.2.3. Kinetika redukcije vanadata
Da bi se ispitala kinetika redukcije V5+ u V4+ u toku 60 minuta od dodatka 7
μmol/g vanadata micelijumu na svakih 5 minuta su snimani EPR spektri (Slika 24). Na
prvi pogled je uočljivo značajno povećanje inteziteta V4+ u vremenu. To ukazuje da
dolazi do značajne redukcije redukcije V5+ u V4+. Kako je već pokazano da se nastali
V4+ može nalaziti kao slobodan i vezan (poglavlje 4.2.1), odvojeno je praćena kinetika
nastanka ova dva oblika, pri čemu je linija u spektru označena kružićem korišćena za
kvantifikaciju vezanog, a ona označena kvadratom za kvantifikaciju slobodnog V4+
(Slika 24).
Slika 24: EPR spektar V4+ u micelijumu starom 24 sata nakon tretmana sa vanadatom
4+
(7 μmol/g) i identifikacija slobodnog (kvadrat) i vezanog (kružić) V
Na Slici 26A je predstavljena vremenska zavisnost promena intenziteta ova dva
signala. Na isti način je praćena vremenska zavisnost promene intenziteta ove dve linije
EPR spektra ali posle dodatka 7 μmol/g vanadila micelijumu. Reprezentativni spektri su
dati na Slici 25, a vremenska zavisnost promena intenziteta linija vezanog i slobodnog
V4+ na Slici 26B.
53
Slika 25: EPR spektar vanadila u micelijumu starom 24 sata nakon tretmana sa
vanadilom (7 μmol/g) i dentifikacija slobodnog (kvadrat) i vezanog (kružić) V4+
Dobijeni rezultati ukazuju da su dva nezavisna procesa odgovorna za promene
amplitude slobodnog V4+ u vremenu u micelijumu kome je dodat vanadat (Slika 26A).
Slika 26: Kinetika slobodnog (kvadrati)i vezanog (kružići) V4+ nakon tretmana
micelijuma sa vanadatom (A) i vanadilom (B)
Do 40 minuta, amplituda linije slobodnog V4+ (Slika 26A pun kvadrat) raste
eksponencijalno, sa vremenskom konstantom od 8,7 minuta (r2= 0.993). Nakon toga,
porast intenziteta je linearan do 60 minuta i to brzinom 2,27 arbitrarnih jedinica po
minuti (a.u/min). S druge strane, amplituda intenziteta linija vezanog V4+ raste
eksponencijalno sa τ = 7,81 minuta (r2 = 0,989), dostižući maksimalnu vrednost 30
minuta nakon dodavanja vanadata (Slika 26A). Ovakve promene su posledice dva
procesa: redukcije V5+ i vezivanja V4+. Činjenica da su vremenske konstante redukcije i
vezivanja slične, ukazuje da su ova dva procesa međusobno povezana, te da se dešavaju
54
u istom delu ćelije. Za razliku, brzine promena intenziteta linija V4+ nakon dodavanja
vanadila u uzorak pokazuju da nakon tretmana, vremenom dolazi do gotovo
eksponencijalnog
smanjivanja
amplitude
slobodnog
vanadila
sa
vremenskom
konstantom od τ = 6,29 minuta. Signal koji potiče od vezanog V4+ raste i to različitim
brzinama: do 25 min eksponencijalno, sa vremenskom konstantom od 5.2 minuta (r2 =
0,998), a od 25 minuta linearno sa konstantnom brzinom promene inteziteta od 0,914
a.u/min.
Da bi odredili da li se vezivanje V4+ događa intracelularno ili ekstracelularno
micelijum je nakon tretmana vanadata dodatno ispiran i sa EDTA koja ima veliku
sposobnost kompleksiranja jona metala (Kvez (V)=1,4x104 L/mol), te se očekivalo da će
istisnuti V4+ iz obrazovanih kompleksa. Tako je, nakon dodavanja vanadata (7 μmol/g) i
njegovog petominutnog delovanja, ispiranje micelijuma sa EDTA dovelo do potpunog
nestanka vezane forme V4+. Istovremeno, pojavio se snažan signal kompleksa V4+EDTA kako u supernatantu tako i u micelijumu (Slika 27). EPR spektar V4+-EDTA
kompleksa je sličan spektru slobodnog V4+ jer to predstavlja rastvorljivo i malo
jedinjenje koje dopušta brze rotacije čime poništava mnoge anizotropske efekte kao i
jake spin-spin interakcije između susednih jona V4+. Signal V4+-EDTA u supernatantu
potiče od V4+ koji je nastao ekstracelularnom redukcijom V5+ u ćelijskom zidu, dok
pojava njegovog signala u ispranom micelijumu jasno potvrđuje prisustvo V4+ molekula
i unutar ćelije gde je ovaj vezan za jedan ili više većih biomolekula.
V
5+
5 min
micelijum
pranje
+
supernatant
Slika 27: Signali V4+ nakon inkubacije micelijuma 5 minuta sa V5+(7 μmol/g), V4+EDTA kompleksa nakon ispiranja prethodnog uzorka sa 50 mM EDTA i supernatanta.
55
Potvrda o vezivanju vanadila u ćelijskom zidu gljive dobijena je u
eksperimentima u kojima je izolovani ćelijski zid inkubiran 5 minuta sa vanadilom, a
zatim ispran vodom na centrifugi u cilju odstranjivanja slobodnog V4+ (Slika 28).
Slika 28: Signali vezanog V4+ u ćelijskom zidu, β-glukana i hitozana koji je 5 minuta
stajao inkubiran sa vanadilom a zatim ispran radi odstranjivanja slobodnog vanadila.
Upoređivanjem sa spektrima u kojima smo V5+ dodavali micelijumu uviđa se
sličnost koja se ogleda u pojavi linija koje pripisujemo signalu vezanog oblika V4+.
Takođe, sa Slike 28 se uočava i podudarnost sa signalom V4+ sa β-glukanom i
hitozanom (10 mg/ml). Osim ovih, slične eksperimente smo izveli i sa α-glukanom i
glukuronskom kiselinom, ali rezultati su pokazali da oni ne mogu praviti komplekse sa
V4+.
4.2.4. Transport vanadijuma u ćeliju
Pošto smo utvrdili da se redukcija vanadata dešava kako ekstracelularno tako i
intracelularno postavlja se pitanje kojim putem vanadijum ulazi u ćeliju i da li je taj
proces koncentraciono zavisan.
Pre svega smo ispitivanja ulaska vanadijuma u obliku V5+ u citoplazmu vršili
inkubacijom micelijuma P. blakesleeanus od 1 sat sa dve različite koncentracije
vanadata, a zatim takve uzorke isprali (Slika 29). Nakon toga dodali smo askorbat ili
GSH, koji su poznati kao jaka redukujuće sredstva, i pratili da li dodatno redukuju V5+.
Uticaj ovih jedinjenja na redukciju vanadata je moguć i intracelularno, zbog činjenice
da se oni preko specifičnih transportera lako transportuju u citoplazmu (Ganguli &
Kumar 2007), i ekstracalularno, jer se dodaju spolja. Da bi utvrdili mesto redukcije,
56
nakon dodavanja askorbata ili GSH, micelijum smo ponovo ispirali. Rezultati su
prikazani na Slikama 29 i 30.
Slika 29: EPR spektar V4+,ispranog dva puta, najpre nakon inkubacije manjom (levo) i
većom (desno) koncentracijom vanadata od 1 sat, a zatim dodatka askorbata (3.5
μmol/g) i inkubiranja takođe 1 sat
Askorbat u koncentraciji 3.5 µmol/g dovodi do porasta EPR signala (Slika 29)
što znači da vrši redukciju vanadata. Dalje, signal slobodnog V4+ se u potpunosti gubi
nakon drugog ispiranja micelijuma koji je izložen dejstvu niže koncentracije vanadata,
pa možemo reći da se V4+ u vidu slobodnog jona ne nalazi u citoplazmi. Dodavanjem
vanadata u većoj koncentraciji takođe dolazi do smanjivanja signala V4+ ispiranjem, ali
se on i dalje mođe detektovati. Ovakvi rezultati ukazuju da se dobar deo vanadata
vezuje u ćelijskom zidu, ali i da V5+ ulazi u ćeliju pri višim koncentracijama.
Slika 30: EPR spektar V4+,ispranog dva puta, najpre nakon inkubacije 7 μmol/g
koncentracijom vanadata od 1 sat, a zatim nakon dodatka GSH (3.5 μmol/g) i
inkubiranja takođe 1 sat
57
Slične podatke dobili smo i u eksperimentima sa GSH (Slika 30). Micelijum
smo inkubirali šest sati sa GSH koncentracije 3.5µmol/g, nakon toga mu dodali V5+ (7
μmol/g), i onda ga isprali. Rezultat takvog postupka bio je gubitak signala EPR koji
potiče od slobodnog V4+. To ukazuje da se pri niskim koncentracijama vanadata, baš
kao i u slučaju eksperimenata sa askorbatom, redukcija dešava uglavnom
ekstracelularno.
Slika 31: Vremenska zavisnost intenziteta EPR V4+ signala micelijuma tretiranog
vanadatom u dve koncentracije, sa i bez prisustva neorganskih fosfata (Pi) (36.7 mM).
Kada je u pitanju mehanizam ulaska vanadata u ćeliju prvo smo ispitivali ulogu
fosfatnih transportera pošto je njihovo postojanje i uloga u transportu vanadata kod
gljive Neurospora crassa već pokazana (Bowman 1983). Da bi smo ispitali da li su
fosfatni transporteri zaista odgovorni za ulazak V5+ u P. blakesleeanus, pratili smo
promene amplitude signala slobodnog vanadila u micelijumu izloženom dejstvu dve
koncentracije vanadata: niskoj (7 µmol/g) pri kojoj V5+, po prethodno dobijenim
rezultatima sa askorbatom, ne ulazi u citoplazmu i većoj koncentraciji (70µmol/g) kada
ulazi u ćeliju. Potrebno je još jednom ukazati na činjenicu da se samo mali deo vanadata
kada on uđe u ćeliju tu i redukuje, jer se redukcija dešava uglavnom eksracelularno.
Dodavanjem 36.7 mM fosfata (što predstavlja koncentraciju fosfata u medijumu na
kome su gljive uzgajane) dobili smo rezultate prikazane na Slici 31. Kao što je i
očekivano, pri niskoj koncentraciji vanadata, fosfati nemaju nikakav uticaj na EPR
spektar. Međutim, nakon tretmana sa vanadatom u većoj koncentraciji, fosfati
58
sprečavaju njegov ulazak u ćeliju što omogućuje njegovu intenzivniju ekstracelularnu
redukciju do V4+ i porast EPR signala.
S druge strane transport vanadilnog katjona u ćeliju bi mogao da se odvija preko
katjonskih kanala. Inkubacija sa lantan hloridom (inhibitorom katjonskih kanala) nema
efekat na proces redukcije u micelijumu, intenzitet centralne linije se ne menja u odnosu
na kontrolu. Ispiranjem uzorka signal V4+ se drastično smanjuje i intenzitet centralne
linije pada za 55%, dok se ostale linije spektra gotovo u potpunosti gube (Slika 32).
Efekat je različit od dobiljenog ispiranjem uzorka u koji je prethodno dodat samo
vanadat i gde je signal od V4+ smanjuje za oko 30%, a uočljivo je i prisustvo svih osam
linija u spektru (Slika 32). Ovakav rezultat nam govori da celokupni signala slobodnog
V4+ u uzorku sa lantanom, za razliku od kontrolnog uzorka, potiče od ekstracelularnog
V4+, odnosno da je lantan, blokirajući katjonske kanale blokirao ulazak vanadila u
citoplazmu.
Slika 32: EPR spektri micelijuma inkubiranog vanadatom (70 μmol/g) i LaCl3 30
minuta, i istog uzorka koji je nakon toga ispran
4.3. Uticaj V4+ na 31P NMR spektar gljive
U prethodnim eksperimentima videli smo da V4+ katjonskim kanalima ulazi u
ćeliju i da u njoj u manjoj meri može nastati i redukcijom V5+ pomoću tiolnih jedinjenja
poput glutationa. Zato smo, da bi utvrdili uticaj vanadila na metabolizam fosfata, pratili
njegove efekte na
31
P NMR spektre micelijuma P. blakesleeanus. Rezultati efekta 20
mM V4+ na micelijum su prikazani na Slici 33.
59
Slika 33: Uticaj 20 mM vanadila na NMR spektar micelijuma starog 24 sata i promene
intenziteta signala osetljivih na prisustvo V5+ ili V4+.
U delu spektra u kome se nalaze signali fosfatnih šećera gde je vanadat pokazao
najveći efekat nisu zabeležene nikakve promene. Vanadil je doveo do značajnog pada
intenziteta signala PPc i do malog porasta signala Pi, pa time i značajnog pada odnosa
PPc i Pi (Slika 33, insert), tj. suprotne efekte u odnosu na vanadat. Razlog smanjivanja
intenziteta signala PPc nakon dodatka V4+ može se objasniti njegovim paramagnetnim
osobinama. Naime, u procesu vakuolizacije V4+ se vezuje za polifosfate i na taj način
kao paramagnetik utiče na širenje linije i pad intenziteta signala PPc u spektru.
4.4. Toksičnost vanadata i vanadila
Zbog različitih metaboličkih efekata V5+ i V4+ ispitali smo njihov uticaj na rast
micelijuma P. blakesleeanus. Micelijum je uzgajan 24 sata na medijumu sa različitim
koncentracijama jona posle čega su određivani suva masa micelijuma (DW) i odnos
PPc/Pi . Rezultati su prikazani na Slici 34.
60
Slika 34: Uticaj vanadata i vanadila, na razvoj micelijuma
Podaci ukazuju da vanadat u koncentracijama od 1 mM i 5mM stimuliše rast
gljive jer dovodi do statistički značajnog porasta biomase u odnosu na kontrolu
(P<0.05;n=3). Koncentracija od 7 mM dovodi do statistički značajnog pada u biomasi
micelijuma (P<0.05, n=3). Uzgoj na 7 mM vanadatu dovodi do statistički značajnog
pada odnosa PPc/Pi, dok niže koncentracije ne ispoljavaju statistički značajan uticaj. Za
razliku od V5+, V4+ inhibira rast micelijama već pri koncentracijama od 1 mM i 5 mM
što ukazuje da je u pogledu uticaja na P. blakesleeanus vanadil toksičniji od vanadata.
Veća toksičnost vanadila se može uočiti i u odnosu na PPc/Pi koji je statistički značajno
niži u odnosu na kontrolu već pri najnižoj koncentraciji vanadila od 0.5 mM (P<0.05).
4.5. Identifikacija fosfatnih šećera HPLC metodom
Za identifikaciju fosfatnih šećera, čije povećano prisustvo smo pretpostavili na
osnovu
31
P NMR, je korišćena je HPLC metoda. Rezultati dobijeni ovom metodom
ukazuju da tretman vanadatom dovodi do porasta koncentracije sledećih fosfatnih
šećera: G6P, G1P, F6P i F1,6P a sa velikom verovatnoćom i F2,6P (Slika 35). Nasuprot
tome, tretman sa istom koncentracijom vanadila doveo je do značajno manjih promena
u sadržaju fosfatnih šećera (Slika 36). Na Slikama 35 i 36 su prikazani hromatogrami
micelijuma gljive stare 24 sata pre (donji zapis) i posle tretmana sa 20 mM V5+,
odnosno 20 mM V4+ (gornji zapis).
61
Slika 35: HPLC hromatogrami micelijuma gljive starog 24 sata, pre i posle dodavanja
vanadata.Plavim oznakama su obeleženi signali koji bi prema retencionim vremenima
mogli pripadati fosfatnim šećerima
Slika 36: HPLC hromatogrami micelijuma gljive starog 24 sata, pre i posle dodavanja
V4+ Plavim oznakama su obeleženi signali koji bi prema retencionim vremenima mogli
pripadati fosfatnim šećerima
Pomoću standarda izvršena je identifikacija i određene su koncentracije sledećih
šećera: G6P, G1P, F6P i F1,6P. Efekti vanadata i vanadila na koncentracije ovih šećera
su date na Slici 37 i u Tabeli 3.
62
5
*
Kontrola
+20 mM V5+
+20 mM V4+
Koncentracija (μmol/g)
4
*
3
*
2
*
*
1
0
G1P
G6P
F6P
F1,6P
Slikа 37: Koncentracije ispitivanih fosfatnih šećera u micelijumu pre i posle dodatka
V5+ i V4+ . * označava statističku značajnost (P<0.05).
Najveće promene desile su se u koncentraciji G6P koja se tretmanom vanadatom
povećala za čak 2,28 puta, dok je u slučaju vanadila efekat izostao. Iako u manjoj meri
tretman vanadatom je doveo i do statistički značajnog povećanja heksoznih šećera F6P
(48%) i F1,6P (31%) koji su kao i G6P metaboliti glikolitičkog procesa. U slučaju G1P
takođe je samo vanadat izazvao statistički značajan porasta koncentracije (Tabela 3,
Slika 36). To je jedini od ispitivanih fosfatnih šećera koji nije intermedijer u razgradnji
glukoze glikolitičkim putem. Promena u njegovoj koncentraciji pod dejstvom vanadata
iznosi 32%, i u odnosu na promenu u koncentraciji G6P je dosta manja što dodatno
potvrđuje činjenicu da je vanadat blokirao reakciju prelaska G6P u G1P.
Tabela 3: Koncentracija fosfatnih šećera u µmol/mg sveže mase u netretiranim
micelijumu i micelijumu gljive sa V5+, V4+.
Kontrola
+V5+
+V4+
G1P
1.098±0.106 1.448±0.087 1.127±0.012
G6P
1.915±0.090 4.380±0.211 2.172±0.070
F6P
1.001±0.209 1.651±0.106 0.977±0.080
F1,6P
2.249±0.278 2.965±0.039 1.874±0.103
63
Osim šećera koji su identifikovani pomoću standarda u hromatogramu
micelijuma tretiranog sa vanadatom, pojavljuje se pik sa retencionim vremenom od 31
minuta čija je površina više od dva puta veća od iste u kontrolnom uzorku, a koji po
tablicama retencionih vremena koje odgovaraju ovom tipu kolone (www.dionex.com/enus/webdocs/5047-AN122_LPN1029-03.pdf) pripadaju F2,6P, fosfatnom šećeru koji nije
učesnik glikolize ali ima izuzetno kompleksan uticaj na ovaj proces, a čije prisustvo je
pretpostavljeno na osnovu 31P NMR. Takođe, upoređujući dobijena retenciona vremena
sa onim koje je dao proizvođač kolone može se zaključiti da je tretman vanadatom
izazvao značajno povećanje šećera glukuronske kiseline (glukuronska kiselina 1 fosfat
(Gluac1P) sa retencionim vremenom 30 minuta), što može biti posledica hidrolize
UDPG, i glukozoamino 6 fosfata (Gluam6P, 17 minuta) nastalog iz F6P. Tretman sa
vanadilom je doveo do porasta površine pika dva šećera, a koji bi prema podacima
proizvođača kolone trebali da pripadaju galaktoze 1 fosfat (Gal1P, 8 minuta) i galaktoze
6 fosfat (Gal6P, 19 minuta) (Slika 36).
64
5.DISKUSIJA
Rezultati predstavljeni u ovoj tezi pokazuju da vanadijum u gljivi P.
blakesleeanus izaziva značajne metaboličke efekte i da je njegovo dejstvo posebno
izraženo na aktivnost enzima koji učestvuju u metabolizmu fosfata. Pokazali smo i da P.
blakesleeanus može usvajati vanadijum u najmanje dva oksidaciona stanja: V5+ i V4+. P.
blakesleeanus redukuje V5+ kako ekstracelularno tako i intracelularno, i redukcija
vanadata vrši se uglavnom enzimskim putem, a samo manji deo neenzimski.
31
P NMR spektri micelijuma gljive su pokazali da neposredno nakon tretmana
vanadatom dolazi do promene u intezitetima većine signala u spektru. Međutim, pre
nego što se odgonetnu mehanizmi pomoću kojih vanadijum dovodi do tako drastičnih
promena u
31
P NMR spektru, bilo je neophodno odgovoriti na niz pitanja koja se tiču
metabolizma vanadijuma u gljivi P. blakesleeanus. Iako je efekat izazvan dodatkom
vanadata, poznato je da se vanadat u živim sistemima lako redukuje do vanadilnog
katjona (Rehder 2008a), te se postavlja pitanje da li i ova gljiva ima sposobnost
redukcije vanadata do vanadila i ako je ima koji je njen mehanizam. Odgovor na ovo
pitanje nije od značaja samo za P. blakesleeanus ili za razdeo Zygomycota, kojem
pripada, već i za gljive uopšte. Naime, gotovo svi podaci o metabolizmu vanadijuma
kod gljiva, su dobijeni proučavanjem svega dve vrste askomicetnih kvasaca (klasa
Sccharomycotina),
grupe
jednoćelijskih
gljiva
veoma
specifične
fiziologije,
Saccharomyces cerevisiae i Hansenula polymorpha (Mannazzu 2001). Jedini podaci u
slučaju filamentoznih gljiva, čija morfološka organizacija je karakteristična za veliku
većinu gljiva, pa i P. blakesleeanus, su dobijeni na Neurospora crassa, gde je pokazano
da se vanadat transportuje u ćeliju pomoću fosfatnog transportera (Bowman 1983;
Bowman et al. 1983). Imajući u vidu ovako slabu izučenost metabolizma vanadijuma
kod gljiva jasno je da postoji čitav niz nerazjašnjenih pitanja. Jedno od njih se tiče i
sposobnosti gljiva da redukuju vanadat do vanadila. Tako je kod S. cerevisiae pokazano
da samo vanadat – rezistentni soj (SC-1) može da redukuje vanadat do vanadila
(Bisconti et al., 1997), dok je kod H. polymorpha ova sposobnost široko zastupljena
(Zoroddu et al., 1991).
Rezultati koje smo dobili u ovim istraživnjima, su nedvosmisleno i jasno
pokazala da divlji soj gljive P. blakesleeanus može da redukuje V5+ u V4+ (Slika 19).
65
Ovaj proces se odigrava uglavnom u ekstracelularnom odeljku i podrazumeva kako
enzimske tako i neenzimske reakcije. Ključni enzim koji je odgovoran za redukciju
vanadata u V4+ je enzim koji sadrži Mo-MPT kofaktor i poseduje izraženu aktivnost
fericijanid reduktaze. Prisustvo na ćelijskoj površini enzima koji ima sposobnost da
redukuje fericijanid je već pokazana kod P. blakesleeanus (Baroja-Mazo et al. 2004),
međutim njegova biološka aktivnost je ostala nerazjašnjena. Ovaj enzim pokazuje slične
karakteristike sa NAD(P)H zavisnom nitrat reduktazom izolovanom kod kvasaca (Slika
38) (Barbier et al. 2005) i to: redukcija fericijanida, NAD(P)H kao donor elektrona
(Baroja-Mazo et al. 2004) i Mo-MPT kofaktor.
Slika 38: Shema enzima molibden-zavisna nitrat reduktaze izolovanog kod
Sacharomyces cerevisiae (Barbier et al. 2005)
Međutim, poznato je da P. blakesleeanus ne može da raste na medijumu koji kao jedini
izvor azota ima nitrate, pokazujući time zanemarljivu aktivnost nitrat reduktaze (Garces
et al. 1985). S druge strane, treba naznačiti da genom gljive P. blakesleeanus sadrži
kofaktor
za
biosintezu
proteina
koje
sadrže
Mo-molibdopterin
(http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY). U NAD(P)H zavisnoj reduktazi kod
kvasaca, citohrom b predaje jedan elektron po ciklusu kojim redukuje Mo6+ Mo-MPT
kofaktora u dve jednoelektronske reakcije do Mo4+ (Barbier et al. 2005).
Dvoelektronski transfer može biti uključen i u aktivnost fericijanid-reduktaznog enzima
u gljivi P. blakesleeanus samo što krajnji akceptor elektrona nisu nitrati. Mo6+ kao i
Mo4+ su EPR neaktivne čestice. Prisustvo Mo5+- MPT intermedijera u micelijumu
tretiranim vanadatom i fericijanidom ukazuje da transfer elektrona do Mo-MPT
kofaktora može biti sprečen pod takvim okolnostima pa je aktivnost ovog enzima u
66
odnosu na V5+ inhibirana. To potvrđuju i rezultati u kojima je signal V4+ u micelijumu
gajenom na medijumu bez molibdena značajno opao. S druge strane, sama pojava tog
signala u ovim uslovima govori o mogućoj redukciji vanadata i na drugi način. Važno je
naglasiti da su ovo prvi podaci koji neposredno ukazuju na mehanizam redukcije
vanadata kod gljiva. Naravno, neophodna su dodatna istraživanja pre svega u cilju
indentifikacije enzima koji ispoljava opisanu aktivnost.
Kao posledica enzimske ekstracelularne redukcije vanadata dokazali smo da je
4+
V
prisutan barem u tri oblika: van ćelije kao slobodan, ili vezan za komponente
ćelijskog zida i u ćeliji opet kao slobodan i vezan za odgovarajuće molekule. Spektri u
kojima se intenzitet 8 linija koje su karakteristične za V4+ gubi nakon ispiranja uzorka
kojem smo dodali V5+ ukazuje na prisustvo vanadila u slobodnom obliku van ćelije. U
pogledu prisustva u ćelijskom zidu u ovom radu smo pokazali da se i V5+ i V4+ vezuju u
njemu. Vezivanje vanadila za komponente ćelijskog zida jasno pokazano postojanjem
EPR signala vanadila i posle ispiranja micelijuma pretretiranog sa 7 μmol/g vanadatom
sa vodom (Slika 18), koji je, međutim, u potpunosti nestajao posle ispiranja sa EDTA
(Slika 27), molekulom koji ima visok afinitet za katjone. Pored toga dodavanje vanadila
izolovanom ćelijskom zidu gljive je rezultovalo EPR spektrom koji je u potpunosti
odgovarao onom dobijenom posle ispiranja micelijuma vodom (Slika 28). V4+ u
ćelijskom zidu je najverovatnije vezan za neki polimer koji je sličan β-glukanu i
hitozanom. Hitozan je značajna komponenta ćelijskog zida Zygomycota (Bergman
1969), a pokazano je da ga karakteriše veliki kapacitet za heliranje vanadijuma
(Muzzarelli 1977, Thama et al. 2001). Sa druge strane, iako P. blakesleeanus u svom
ćelijskom zidu ne sadrži β-glukane, pokazano je prisustvo glukoze u njemu (Van Laere
et al. 1977). Kako spektar koji smo dobili nakon dodavanja vanadila u β-glukan,
pokazuje velike sličnosti sa spektrom vezanog vanadila, može se pretpostaviti da pored
hitozana, određeni polimeri nastali iz glukoze, koji imaju strukturu sličnu β-glukanu,
mogu predstavljati vezna mesta za V4+ u ćelijskom zidu. Kinetička analiza pokazuje da
se procesi redukcije vanadata do vanadila i vezivanja vanadila za ćelijski zid odvijaju
paralelno (Slika 26). Kinetika vezivanja vanadila je dvofazna što ukazuje da posle
popunjavanja veznih mesta u ćelijskom zidu deo vanadila ulazi u ćeliju gde takođe
formira komplekse sa velikim intracelularnim molekulima.
67
Pored vanadila i vanadat se vezuje za ćelijski zid. To pokazuju eksperimenti u
kojima je kapacitet ćelijskog zida za vanadil daleko veći kada se on direktno doda, nego
kada nastaje redukcijom iz vanadata, što se može objasniti činjenicom da je vanadat
zauzeo deo veznih mesta u ćelijskom zidu (Slika 27). U prilog ovom zaključku idu i
uočena razlika u maksimalnim vrednostima signala nakon tretmana sa V4+ (na početku
tj nakon 5 minuta) i V5+ (nakon 60 minuta) koja ukazuje da se dodati vanadat nije u
potpunosti redukovao. Upoređujući podatke sa Slike 26 konstatujemo da se samo 40%
dodatog V5+ sigurno redukovalo. Preostali sadržaj V5+ nije redukovao, ili ako se
redukovao, nastali vanadil je usled anizotropije EPR nevidljiv.
Postojanje V4+ u citoplazmi nastalog redukcijom vanadatom pokazali smo
dobijanjem značajnog signala ovog oblika u uzorku koji je tretiran sa 7 μmol/g V5+ i
EDTA a zatim ispran (Slika 27). V4+ ulazi u ćeliju najverovatnije kroz katjonske kanale
osetljive na lantan, baš kao i kod S. cerevisiae (Bode et al. 1990), što je potvrđeno u
eksperimentima u kojima je tretman sa lantanom za razliku od kontrole doveo do
potpunog nestanka EPR signala slobodnog vanadila posle ispiranja micelijuma sa
vodom (Slika 32). Na ovaj način su potvrđene indikacije o ulasku V4+ u ćeliju koje su
dali kinetički eksperimenti. 31P NMR eksperimenti ukazuju da se V4+ po ulasku u ćeliju
akumulira u vakuoli vezan za molekule polifosfata, slično kako kod H. polymorpha
(Mannazzu et al. 1997). Naime, vanadil za razliku od vanadata ne pokazuje efekte na
metabolizam fosfatnih šećera (slike NMR spektra i HPLC hromatograma) koji se odvija
u citoplazmi, ali za razliku od vanadata značajno smanjuje signal PPc, koji su najvećim
delom locirani u vakuoli (Živić et al. 2005), uz neznatni porast signala neorganskih
fosfata (Slika 33), što se može objasniti širenjem NMR linije ovih molekula usled
vezivanja paramagnetika za njih.
Za razliku od vanadila, vanadat ulazi u ćeliju tek pri znatno višim
koncentracijama (70 μmol/g). To su pokazali eksperimenti u kojima je deo značajan deo
slobodnog vanadila koji je nastao redukcijom iz vanadata usled dodatka askorbata
prethodno ispranom micelijumu nije mogao biti ispran vodom (Slika 29). Ovakav
zaključak potvrđuju i
31
P NMR eksperimenti u kojima vanadat pokazuje efekte na
fosfatne šećere tek pri koncentracijama većim od 7 mM ( Slika 14). Podaci dobijeni
NMR metodom u tom smislu pokazuju da povećavanjem koncentracije dodatog
vanadata njegovi efekti na intenzitete signala postaju sve izraženiji. Potvrdu o
68
koncentracionoj zavisnosti uticaja vanadata na gljivu dobili smo i iz eksperimenata u
kojima je pokazano da V5+ usporava rast gljive tek pri koncentracijama većim od 5 mM
(Slika 34), odnosno da je značajno manje toksičan od vanadila koji rast usporava već pri
koncentraciji od 1 mM. Manja toksičnost vanadata koja je krajnje neočekivana imajući
u vidu rezultate dobijene na kvascima ili sisarima (Bisconti et al. 1997, Meyerevitz
1991) upravo ima uzrok u tome što vanadil pri znatno manjim koncentracijama ulazi u
ćeliju gde može da ispolji svoje negativne efekte. Kada uđe u ćeliju vanadat ima snažno
dejstvo na metabolizam različitih fosfatnih jedinjenja, naročito fosfatnih šećera intermedijera procesa glikolize i glikenogeneze što su jasno pokazali
31
P NMR
eksperimenti (vidi niže). Kako se ovi procesi odvijaju u citoplazmi jasno je da se
značajan deo vanadata, za razliku od vanadila zadržava u ovom ćelijskom odeljku.
Pored toga u citoplazmi jedan mali deo vanadata se posredstvom tiolnih jedinjenja
poput glutationa redukuje do vanadila (Slika 23).
Put kojim vanadat ulazi u ćeliju su baš kao i kod N. crassa fosfatni transporteri
(Bowman 1983). Ovo je pokazano u eksperimentu u kojem je samo pri visokim
koncentracijama vanadata dodatak fosfata u medijum imao snažan stimulatoran efekat
na njegovu redukciju (Slika 30). Naime, kod N. crassa fosfatni transporter ima veći
afinitet za fosfate nego za vanadat (Bowman et al. 1983), tako da fosfati deluju kao
kompetetivni inhibitori transporta vanadata. Kako je pokazano da je redukcija vanadata
u ekstracelularnom odeljku pomoću enzima sa aktivnošću fericijanid reduktaze
mnogostruko veća nego neenzimska redukcija u ćeliji pomoću tiolnih jedinjenja (Slike
21-23) očekivano je da će inhibicija ulaska vanadata u ćeliju omogućiti njegovu
intenzivniju redukciju. Ulazak vanadata u ćeliju tek pri visokim koncentracijama je
verovatno posledica dva sinergistička procesa veoma efikasne redukcije do vanadila i
visokog afiniteta ćelijskog zida za vanadat na koji su već indirektno ukazali kinetički
eksperimenti (Slika 26 i diskusija oko nje). Dakle, tek kada je koncentracija vanadata
toliko velika da saturiše enzim sa fericijanidnom reduktaznom aktivnošću i vezna mesta
u ćelijskom zidu višak vanadata će se transportovati u ćeliju pomoću fosfatnog
transportera.
Generalno, kod P. blakesleeanus i vanadil i vanadat ulaze u ćeliju gde su oba
oblika fiziološki aktivna, ali preko različitih mehanizama, pri čemu je redukcija
vanadata u vanadil daleko intenzivnija u ekstracelularnom odeljku. Ovakav scenario
69
jasno izdvaja P. blakesleeanus od kvasaca na kojima je do sada istraživan metabolizam
vanadijuma kod gljiva. Naime, kod kvasaca postoje dva oprečna stava u odnosu na
transport u ćeliju, redukciju i fiziološku aktivnost vanadata i vanadila. Prema prvom i
vanadat i vanadil se mogu transportovati u ćeliju, ali se redukcija vanadata vrši pretežno
u ćeliji, neenzimski posredstvom tiolnih jedinjenja (Willsky et al. 1984, Zoroddu et al.
1996, Zoroddu & Masia, 1997). Prema ovoj hipotezi vanadat je fiziološki aktivna forma
pošto se vanadil neposredno po redukciji transportuje bilo van ćelije ili u vakuolu u
procesu detoksifikacije (Willsky et al., 1984; Zoroddu et al., 1996; Mannazzu et al.,
1997; Mannazzu et al., 1998). Nasuprot tome druga hipoteza tvrdi da se redukcija
vanadata do vanadila odvija isključivo van ćelije i da samo nastali vanadil kroz
katjonske kanale može da uđe u ćeliju gde ispoljava fiziološke efekte (Bode et al. 1990,
Bisconti et al., 1997, Antipov et al. 2000). Oba mehanizma se svode na potpunu
redukciju kao neki vid zaštitnog mehanizma od uticaja toksičnog vanadata. Toksičnost
vanadata je eksplicitno pokazana kroz podatak da koncentracija od 2.5 mM V5+ inhibira
rast, dok duplo veća koncentracija vanadila stimuliše razvoj ćelija kod kvasaca (Wilsky
et al. 1984). Međutim, u pogledu toksičnosti, takvi podaci su potpuno suprotni od onih
koje smo dobili u eksperimentima prikazanim u ovom radu kod P. blakesleeanus.
Rezultati nedvosmisleno pokazuju da je u slučaju ove gljive toksičnost vanadila veća od
toksičnosti vanadata. Šta više, V5+ pokazuje stimulatorni efekat na rast micelijuma jer
manje koncentracije ovog anjona doprinose povećanju njegove biomase. Dakle kod P.
blakesleeanus, toksičniji V4+ ulazi u vakuolu gde se veže za polifosfate, dok V5+
ulaskom u vakuolu izaziva metaboličke promene. Ovi rezultati ukazuju na veliku
raznolikost gljiva u odnosu na metabolizam vanadata i nalažu veliku opreznost prilikom
bilo kakvih generalizacija naročito na osnovu rezultata dobijenih na tako specifičnoj
grupi kakvi su askomicetni kvasci.
Već je ukazano da 31P NMR eksperimenti pokazuju da vanadat ispoljava daleko
intenzivnije i složenije efekte na fosfatni metabolizam gljive u odnosu na vanadil.
Uočljivo je da su po dodatku vanadata najznačajnije promene nastupile u opsegu koji po
hemijskim pomacima odgovara fosfatnim šećerima i to: G6P, G1P, F6P, F1,6P i F2,6P
u približno neutralnoj sredini koja je nastala dodavanjem vanadata (Evans et al. 1977,
Hesbain-Frisque et al. 1981). Eksperimenti koje smo izveli dodavanjem V5+ i G6P, a
zatim uporedili sa onim u kojima smo micelijumu dodali samo G6P pokazuju da je
70
vanadat u potpunosti odgovoran za metaboličke promene u gljivi, jer samo dodavanje
G6P nema nikakav uticaj na signale NMR spektra. Kako se ovom metodom usled
gustine signala na istom mestu i efekta širine signala tj mogućnosti preklapanja
različitih pikova ne može jasno utvrditi već samo pretpostaviti o kojim je fosfatnim
šećerima reč, dileme smo razrešili njihovom identifikacijom HPLC metodom. Ovi
rezultati su dokazali da je vanadat u micelijumu nakon ulaska doveo do značajnih
promena u metabolizmu ugljenih hidrata tj u sadržaju navedenih šećera. Osim toga,
primetili smo porast još nekih signala u tretiranim uzorcima za koje pretpostavljamo da
pripadaju F2,6P,
Gluac1P i Gluam6P. Fosfatni šećeri kod P. blakesleeanus vode
poreklo od glukoze, glavnog izvora ugljenika neophodnog za razvoj micelijuma, koja se
u gljivi skladišti u obliku trehaloze, glikogena (Rua et al.2008) i hitina (Muzareli 1977).
Glukoza se u micelijumu u aerobnim uslovima metaboliše do G6P uz pomoć enzima
heksokinaze. Metabolizam ovog šećera se dalje nastavlja kroz procese glikogeneze (Rua
et al. 1993), glikolize (Delvaux et al. 1973, Rudolph & Furch 1970) dok transformacija
ovog šećera u micelijumu putem fosfatno pentozng puta do sada nije poznata.
Polazeći od činjenice da je prisustvo glikogena u micelijumu P. blakesleeanus
starosti 24 sata značajno (Rua et al. 1993), NMR rezultati pretpostavljaju, a HPLC
merenja nedvosmosleno potvrđuju, da je neposredno nakon dodavanja 20mM V5+ došlo
do promena u koncentracijama metabolita koji učestvuju u glikogenezi. To se naročito
odnosi na sadržaj G1P ali i UDPG-a. Naime, G6P u reakciji katalizovanoj enzimom
fosfoglukomutazom se pretvara u G1P i dalje uz pomoć enzima UDPG pirofosforilaze i
glikogen sintaze preko UDPG u glikogen. Razmatrajući HPLC podatke vidi se da je
povećanje G1P značajno, ali da je u odnosu na porast koncentracije drugih fosfatnih
šećera, a naročito G6P, manje. Promena u sadržaju G1P osim transformisanjem iz G6P
može poticati i od razgradnje glikogena. Naime, sadržaj glikogena u ukupnoj biomasi
micelijuma kod P. blakesleeanus varira između 1 i 10 % i maksimalnu vrednost ima u
eksponencijalnoj fazi rasta tj na 24h (Rue et al. 1993). Ti podaci se odnose na uslove u
kojima se kao izvor ugljenika neophodnog za razvoj micelijuma koristi 2% glukoza. U
našim eksperimentima smo radi što boljeg rasta koristili medijum u kome je duplirana
koncentracija glukoze. Enzimi odgovorni za sintezu glikogena su fosfoglukomutaza,
UDPG-pirofosforilaza te glikogen sintaza koja je alosterički zavisna od koncentracije
ATP (veća koncentracija ATP povećava aktivnost ovog enzima) (Johnson 1992). U
71
razgradnji glikogena učestvuju enzimi glikogen fosforilaza koji ga redukuje do G1P i
fosfoglukomutaza koji katalizuje reakciju transformacije G1P do G6P. Poznato je da
vanadat inhibira dejstvo enzima fosfoglukomutaze, kod kvasaca i u mišićima zeca
(Benabe et al. 1987 i Tsiani & Fantus 1997). Ovakav vanadatni efekat ukazuje da do
povećanja koncentracije G1P ne može doći na račun G6P već samo na račun smanjenja
koncentracije glikogena najverovatnije kroz istovremenu stimulaciju njegove razgradnje
i inhibiciju njegove sinteze. Sinteza ovog polisaharida direktno zavisi od koncentracija
G1P i UDPG. Pošto neposredno nakon tretmana vanadatom sadržaj G1P raste a
koncentracija UDPG u micelijumu opada na šta ukazuju podaci iz NMR istraživanja,
može se reći da je do zastoja u formiranju glikogena došlo na nivou sinteze UDPG,
odnosno inhibicijom enzima UDPG pirofosforilaza vanadatom. Razlog zbog koga se
dešava pad signala UDPG na NMR spektru može biti to što je reakcija prelaska G1P u
UDPG termodinamički nepovoljna bez dodatnog inputa energije. Energija od 33 kJ se
za taj proces obezbeđuje hidrolizom polifosfata (Voet & Voet 1995). Kao što se vidi iz
rezultata, dobijenih NMR metodom, vanadat je umesto hidrolize stimulusao sintezu
polifosfata, te potrebna energija za prethodni proces nije obezbeđena. To znači da se
kod gljive P. blakesleeanus sprečava stvaranje UDPG inhibicijom enzima UDPGpirofosforilaze (Shema 1). Osim toga u našim istraživanjima neposredno nakon dodatka
vanadata moguća je i inhibicija sinteze glikogena blokiranjem enzima glikogen sintaze
(Shema 1), jer je taj enzim alosterički zavisan od koncentracije ATP koja dodatkom V5+
opada. To bi značilo da se preostala UDPG u micelijumu troši u drugim biohemijskim
procesima kao što je na primer sinteza glukuronske kiseline, jer koncentracija Gluac1P
se nakon tretmana vanadatom povećavaju (Slika 36 podaci iz HPLC merenja). Kako se
koncentracija G1P povećava pod dejstvom vanadata on najverovatnije ima uticaj i na
stimulaciju aktivnosti enzima glikogen fosforilaze odnosno hidrolize glikogena do G1P.
Mehanizam pomoću kojeg bi vanadat mogao stimulisati razgradnju glikogena je
povećanje koncentracije cAMP koji je tesno uključen u regulaciju glikogenolize. cAMP
preko enzima protein kinaze ima antiinsulinsko dejstvo (Pilkis et al. 1982) što znači da
inhibira glikogenezu a aktivira glikogenolizu. Vanadat stimuliše aktivaciju adenalit
ciklaze, enzima koji katalizuje reakciju nastanka cAMP-a iz ATP-a, u ćelijama masnog
tkiva kod pacova (Mannazzu 2001, Schwabe et al. 1979), u izolovanim ćelijama jetre
pacova (Gomez-Foix et al. 1988), kao i kod Sacharomyces cereviseae (Francios et al.
72
1984). Povećanje koncentracije cAMP stimuliše aktivnost enzima cAMP-zavisne
protein kinaze koja katalizuje reakcije fosforilacije serina i treonina enzima glikogen
sintaze i glikogen fosforilaze, na taj način inhibirajući aktivnost prvog a stimulišući
aktivnost drugog (Shema 1) (Voet & Voet 1995). Poznato je da kod sporangiofora P.
blakesleeanus povećanje koncentracije cAMP uzrokuje stimulaciju razgradnje
glikogena tj. stimulaciju enzima glikogen fosforilaze (Tu & Malthora 1977). Mogućnost
da cAMP ne utiče na proces razgradnje glikogena u micelijumu takođe postoji s
obzirom da su istraživanja na pacovima (Gomez-Foix et al. 1988), kao i kod gljive
B.emersonii (Vandercammen et al. 1990) pokazala da je stimulisanje razgradnje
glikogena vanadatom potpuno nezavisno od povećanja koncentracije cAMP jer kod
kina
za
njih V5+ ne utiče na promenu koncentracije ovog molekula.
kin
aza
Shema 1:Pretpostavljena mesta dejstva vanadata ne enzime u procesima sinteze i
razgradnje glikogena. Crvene i zelene strelice označavju enzime koje V5+ inhibira,
odnosno stimuliše.
U svakom slučaju aktiviranje enzima fosforilaze i inhibicija sintaze pod uticajem
5+
V
je u korelaciji sa rezultatom koji smo dobili o porastu koncentracije G1P. To je u
suprotnosti sa ulogom vanadata u hipoglikemičkim adipocitima pacova kao i u
skeletnim mišićima gde on stimuliše glikogen sintazu (Goldwasser et al. 2003), što je
konzistentno njegovom od ranije poznatom insulinskom delovanju. Efekat koji V5+
pokazuje u metabolizmu glikogena u stvari predstavlja anti-insulinsko delovanje,
svojstveno glukagonu, koje je već demonstrirano u izolovanim hepatocitima pacova
(Gomez-Foix et al. 1988).
73
Proces glikolize kod gljive P. blakesleeanus je do sada malo ispitivan mada se
zna da je to glavni put razgradnje glukoze u tek aktiviranim sporama (Van Laere et al.
1977) i u micelijumu (Delvaux et al. 1973). Procenat učešća glikolize u razgradnji
glukoze se u našem slučaju povećava inhibicijom procesa sinteze glikogena i trehaloze
jer micelijum sadrži veću koncentraciju G6P koja bi mogla da uđe u glikolitički put
razgradnje ovog šećera. Prva reakcija tog ciklusa kojom se iz G6P dobija F6P bi trebalo
da bude dodatno stimulisana vanadatom (Tsiani & Fantus 1997). To potvrđuju rezulati
dobijeni HPLC metodom o povećanju koncentracije tog heksoznog šećera nakon
tretmana vanadatom. Povećana koncentracija F6P, koja je nakon dodavanja 20 mM V5+
detektovana u micelijumu, je prvi uslov za aktivaciju daljeg procese glikolize koji se
nastavlja transformisanjem ovog fosfatnog šećera u F1,6P. Koncentracija ovog
metabolita takođe raste nakon tretmana vanadatom. Međutim, pre objašnjenja zašto se
to dešava treba istaći sledeću pojavu. Kod P. blakesleeanus je ranije utvrđeno (Van
Laere et al. 1983) da u kratkom vremenskom intervalu nakon aktivacije spora,
takozvanog termalnog šoka, dolazi do povećanja koncentracije F2,6P, fosfatnog šećera
koji nije direktni učesnik glikolize, ali itekako utiče na njen tok stimulacijom enzima
PFK1 što je efekat koji je pokazan i uispitivanjima na mišićima zeca (Van Schaftingeen
et al.1981). Formiranje ovog fosfatnog šećera nakon dejstva vanadatom dokazano je i u
jetri pilića (Rider et al. 1990) i hepatocitima pacova (Gomez-Foix et al.1988), a
posledica je stimulisanja enzima PFK2 u prisustvu molekula ATP i istovremenom
inhibicijom enzima F2,6P2 (Tsiani & Fantus 1997). Porast nivoa F2,6P u
eksperimentima sprovedenim u ovom radu nakon tretmana vanadatom se sa velikom
verovatnoćom može pretpostaviti iz rezultata HPLC eksperimenata. Dodatni razlog za
to je što se zna da povećana koncentracija glukoze tj G6P i F6P, utiče na porast ovog
metabolita kako u P. blakesleeanus (Van Laere et al. 1983) tako i u Saccharomyces
cerevisiae (Francois et al. 1984). U eksperimentima koje smo sproveli u ovom radu
dodavanje G6P nakon tretmana vanadatom je uslovio pojavu dodatnih NMR signala
koji po hemijskim pomacima odgovaraju E-F6P, F6P,G6P F1,6P i F2,6P (Hesbain–
Frisque et al. 1981, Okar et al. 1995). To je u suprotnosti sa rezultatima dobijenim u
ispitivanjima na hepatocitima pacova gde je akumulacija F2,6P praćena smanjenjem
nivoa heksozo 6 fosfatnih šećera (Gomez-Foix et al.1988). Takođe, nakon dodavanja
vanadata registrovali smo porast signala heksoza koji nije prolazan i kratkotrajan kao u
74
slučaju tek aktiviranih spora. Kratkotrajnost u porastu ovih jedinjenja neposredno nakon
aktivacije spora P. blakesleeanus nije uzrokovan gubitkom aktivnosti PFK2 enzima
(Van Laere et al. 1983) već najverovatnije povećavanjem aktivnosti F2,6P2. To znači da
se u našim eksperimentima F2,6P sintetiše tako što vanadat u micelijumu gljive P.
blakesleeanus inhibira enzim F2,6P2 blokirajući njegovu defosforilaciju kao i kod gljive
B. emersonii (Vandercammen et al. 1990). Sa druge strane, pad vrednosti signala ATP
(verovatno na račun cAMP) u gljivi nakon dodavanja V5+ ide u prilog porastu
koncentracije F2,6P, jer se on troši na fosforilaciju F6P i sintezu F2,6P.
Razmatrajući NMR, a naročito HPLC rezultate vidimo da je došlo i do
značajnog porasta u nivou F1,6P nakon dodavanja vanadata. Bitnu ulogu u tome imaju
prethodno navedeni F2,6P i ATP. Pad intenziteta NMR signala β-ATP-a
koji je
alosterički inhibitor enzima PFK1 stimulatorno deluje na sintezu F1,6P. Naime, PFK1
ima dva mesta za vezivanje molekula ATP, kao supstrata (R) i kao inhibitora (T). Pri
visokim koncentracijama ravnoteža R-T se pomera ka neaktivnom T stanju te je tada
ATP inhibitor za ovaj enzim. Suprotno tome, u malim koncentracijama ATP se vezuje
kao supstrat, tj. postaje stimulator pomenutog enzima (Voet & Voet 1995). Sa druge
strane, mikromolarna koncentracija F2,6P u P. blakesleeanus je aktivator PFK1, a
dodatno i deinhibitor ATP aktivnosti na ovaj enzim (Van Laere 1983, Vandercammen et
al. 1990). Uz sve to, i povećanje koncentracije F6P, koji je alosterički stimulator enzima
PFK1 (Voet & Voet 1995) pozitivno utiče na njegovo dejstvo. Ali da bi signal F1,6P bio
toliko povećan trebalo bi da vanadat blokira neki enzim u sledećim koracima glikolize.
V5+ je generalno poznat kao blokator nekoliko enzima u glikolitičkom putu uključujući i
gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GADPH) (Climent et al. 1981, Gresser & Tracey
1991), fosfoglukomutazu i fosfogliceromutazu kod kvasaca i u mišićima zeca (Carreras
et al. 1980, Carreras et al. 1982, Vives-Corrons et al. 1981,). Vanadat bi inhibicijom
enzima GADPH uticao na porast koncentracije F1,6P u gljivi. Interakcija V5+ sa SH
grupama u micelijumu koju smo opisali u rezultatima ovog rada može biti indicija
takvog efekta. Naime, poznato je da vanadat može reagovati sa SH grupama enzima
GADPH koji se ovim putem inaktivira (Crans 1991) što je pokazano i kod erirtocita gde
se V5+ redukuje do V4+ oksidujući SH grupe cisteina (Benabe et al. 1987). Inhibiciju
GADPH pomenutim mehanizmom izazivaju i jodoacetat (Evans et al. 1977) i etakrinska
kiselina (Klahr et al. 1976), što se ogleda u velikom porastu NMR signala F1,6P.
75
Shema 2: Pretpostavljena mesta delovanja vanadata u glikolizi. Crvene i zelene strelice
označavju enzime koje V5+ inhibira, odnosno stimuliše, dok žute označavaju enzime na
koje ne deluje.
U prilog činjenici da se glikoliza nakon formiranja F1,6P inhibira govore i
podaci o padu nivoa ATP koji se troši pri fosforilaciji enzima PFK1 i PFK2, a sintetiše
se u daljem procesu kroz piruvatni metabolizam i oksidativnu fosforilaciju. Doprinos
cAMP koji preko enzima protein kinaze stimuliše enzime F1,6P1 i F2,6P2 u ovom
procesu najverovatnije nije značajan, jer njegovo dejstvo u prisustvu povećane
koncentracije F6P (Van Laere et al. 1983) i mikromolarne F2,6P (Van Laere 1983) je
zanemarljivo kod P. blakesleeanus. To je u suprotnosti sa rezultatima na Sacharomyces
cerevisiae (Francois et al. 1984) gde cAMP stimuliše i na izolovanim ćelijama jetre
pacova gde on inhibira aktivnost PFK enzima (Hers et al.1985), ali i u saglasnosti sa
podacima dobijenim u istraživanjima na Neurospora crassa, amebi Dictyostelium
discoideum (Aragon et al. 1986) i gljivi B. emersonii (Dumbrava & Pall 1987).
G6P može u nekom manjem procentu da se razgrađuje u PPP putu. U svakoj
reakciji PPP puta učestvuju 3 molekula G6P i krajnji produkti su ribuloza 5 fosfat (iz
koje se epimerizacijom i izomerizacijom dobijaju F6P i gliceraldehid 3-fosfat) i 6
molekula NADPH. Sadržaj jednog od konačnih produkata puta, F6P, nakon tretmana sa
vanadatom se povećava, pa bi to moglo ukazivati na činjenicu na stimulisanje ovog puta
razgradnje glukoze, ali u literaturi nema podataka o promenama nivoa pentoznih šećera.
PPP put do sada nije detaljnije ispitivan kod P. blakesleeanus. Ono što se zna je da je
enzimska aktivnost tri piridinska enzima metabolizma ugljenih hidrata kod P.
blakesleeanus, G6PD, laktat dehidrogenaze i malat dehidrogenaze svetlosno zavisna, tj.
76
stimuliše je plava svetlost (De Arriaga et al. 1986). Aktivnost jedinog fosfatnog enzima
među njima koji katalizuje prvu reakciju PPP ciklusa je regulisana koncentracijom
NADP-a (Adams & Beutler 1995), što je pokazano i istraživanjima na sporangioforama
P. blakesleeanus (De Arriaga et al. 1986) kao i kod Sacharomyces cereviseae (Cohen et
al. 1987) .Uticaj vanadata na ovaj enzim zavisi od oblika u kojem se V5+ nalazi. Naime,
pokazano je da monomeri vanadata deluju kao aktivatori enzima G6P dehidrogenaze
(Tsiani & Fantus 1997) za razliku od dimera i tetramera koji je inhibiraju (Crans et al
2000). Ipak V5+ u obliku monomera kod kvasaca inhibira početnu reakciju PPP puta
smanjujući koncentraciju NADP (Cohen et al.1987) koji je neophodan u prvom koraku
razgradnje G6P ovim putem. Rezultati koje smo dobili u našim eksperimentima
pokazuju da se sadržaj NADP(H) u gljivi nakon tretmana vanadatom ne menja pa
možemo zaključiti da V5+ nema efekat koji je pokazan u ispitivanjima na Sacharomyces
cereviseae (Cohen et al. 1987). Kako se kao krajnji produkti ovog procesa javljaju F6P i
GADP koji su učesnici glikolitičkog procesa to se direktni rezultati toka ovog procesa
mogu smatrati manje bitnim, a i ako ih ima to mogu biti samo doprinosi rezultatima
dobijenih efektima vanadata na glikolizu.
Osim značajnog uticaja na koncentracije fosfatnih šećera u micelijumu P.
blakesleeanus, dodavanje V5+ utiče i na sadržaj ostalih fosfatnih jedinjenja izazvao
uočljive promene. Kao što se vidi iz NMR rezultata, signal PPc je dodatkom vanadata
porastao, pa je zbog toga kao i zbog istovremenog smanjivanje signala fosfata odnos
intenziteta ova dva signala značajno povećan u odnosu na kontrolu. Takvog efekta nije
bilo u eksperimentima sa malom koncentracijom vanadata što je i očekivano jer smo
prethodno zaključili da u tom slučaju V5+ ne ulazi u ćeliju. Porast signala PPc pod
uticajem V5+ je je utvrđen ranije i kod H. polymorpha i Saccharomyces cerevisae
(Manazzu et al. 1997, Lorenz et al. 1994). U ispitivanjima na Saccharomyces cerevisae
(A364A) kod kojih kao posledica ulaska vanadata u ćeliju u većim koncentracijama
dolazi do povećanja odnosa signala PPc i Pi, utvrđeno je inhibitorsko dejstvo V5+ u
koncentraciji od 10 mM na enzim egzopolifosfatazu (Lorenz et al. 1994). Isti efekat
vanadat pokazuje i prema enzimu p4A koji ima osobine egzopolifosfataze (Guranowski
et al. 1998). Egzopolifosfataza je inače odgovorna za hidrolizu PPn tj generisanje
neorganskog fosfata na račun polifosfata. Ovaj enzim je u vakuoli prisutan i kod P.
blakesleeanus i u zavisnosti od uslova i starosti ćelije pokazuje aktivnost u hidrolizi
77
polifosfata (Živić et al. 2007). Kako se ulaskom u ćeliju samo manji deo V5+ redukuje
(Slika 23) možemo pretpostaviti da preostali sadržaj neredukovanog vanadata,
inhibirajući egzopolifosfatazu, doprinosi rastu signala centralnih polifosfata tj rastu
odnosa polifosfata i fosfata. Zato zaključujemo da dodavanjem gljivi V5+ u
koncentracijama od najmanje 10 mM njegov manji deo se redukuje, dok veći izaziva
promene u fosfatnom metabolizmu gljive P. blakesleeanus.
78
6. ZAKLJUČCI
1. Osnovni zaključak ovog rada je da je korišćenjem biofizičkih metoda na
nedestruktivan način detaljno okarakteristan mehanizam jednog složenog
biološkog procesa. Uspešnost kombinacije primenjivanja NMR i EPR metode,
kao unikatnih tehnika za nedestruktivno opisivanje bioloških pojava, se ogleda u
činjenici da smo u in vivo uslovima detektovali i opisali efekte vanadijuma na
fosfatni i energetski metabolizam i utvrdili njegovo ponašanje u ćeliji.
2. Pokazali smo da gljiva P. blakesleeanus može da redukuje V5+ do V4+ i odredili
mehanizam
reakcije.
Naime,
većina
dodatog
vanadata
se
redukuje
ekstracelularno posredstvom enzima sa fericijanid reduktaznom aktivnošću i Mo
MPT kofaktorom. Manji deo V5+ se redukuje unutar ćelije pod dejstvom
jedinjenja sa sulfihidrilnim grupama.
3. Utvdili smo vezivna mesta oba oblika vanadijuma i ukazali na mehanizme
ulaska u ćeliju. Naime, i V5+ i V4+ se vežu u ćelijskom zidu gljive. V4+ u
ćelijskom zidu je najverovatnije vezan za neki polimer koji je sličan β-glukanu i
hitozan. Posle popunjavanja vezivnih mesta u ćelijskom zidu, V4+ ulazi
katjonskim kanalima u ćeliju gde se takođe veže za velike intracelularne
molekule. V5+ u ćeliju može ući u ćeliju kada se doda u većoj koncentraciji pri
kojoj prevazilazi kapacitet enzima sa fericijanid reduktaznom aktivnošću da ga
redukuje i kada su sva vezivna mesta u ćelijskom zidu popunjena. V5+ fosfatnim
transporterima ulazi u ćeliju.
4. Dokazali smo da je metabolički aktivna forma vanadijuma V5+. Ovaj efekat je
koncentraciono zavisan. Dodavanjem više od 10 mM V5+ dolazi do porasta
sadržaja fosfatnih šećera i to G6P, F6P, F1,6P, G1P i najverovatnije F2,6P.
Metabolički efekti vanadata su praćeni 31P NMR spektroskopijom i detektovani
su kod gljiva starosti od 12 do 28 sati, pri čemu su efekti naizraženiji kod
micelijuma starog 24 sata. Ovi efekti ogledaju se osim u promenama intenziteta
signala fosfatnih šećera, i u porastu intenziteta signala PPc i γ-ATP-a i padu
intenziteta signala β-ATP-a.
5. Na osnovu dobijenih rezultata smo pretpostavili koji metabolički putevi su
uključeni u dejstvo V5+. To se odnosi na inhibiciju enzima fosfoglukomutaze,
79
UDPG pirofosforilaze i glikogen sintaze u procesu metabolizma glikogena kao i
enzima PFK1, PFK2 i GADPH u procesu glikolize. Osim toga pretpostavili smo
da su enzimi glikogen fosforilaza, PFK1 i PFK2 stimulisani dejstvom vanadata.
Uticaj vanadata na enzime glikogen sintazu i glikogen fosforilazu se u ovim
pretpostavkama odvija posredno preko enzima cAMP protein kinaze koja je
aktivirana vanadatom stimulisanom adenalit ciklazom.
6. Gajenjem na medijumima sa različitim koncentracijama V5+ i V4+ zaključili smo
da je V4+ toksičniji od V5+ pri manjim koncentracijama što je suprotno uticaju
ovih oblika vanadijuma na rast i razvoj Saccharomyces cerevisiae. Štaviše V5+
stimuliše razvoj micelijuma do koncentracije od 5 mM, dok V4+ i pri 0.5 mM
koncentraciji sprečava razvoj micelijuma P. blakesleeanus.
80
7. LITERATURA
1.
Archbegova, L. and Nahalka, J. (2011). Polyphosphate - an ancient energy source
and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories 10: 63-76.
2.
Anke, M., Illing-Guenther H., and Schaefer U. (2005). Recent progress on
essentiality of the ultratrace element vanadium in the nutrition of animal and man.
Biomed. Res. Trace Elem. 16, 208-214.
3.
Antipov A.N., Lyalikova N.N. and L’vov N.P. (2000). Vanadium-binding protein
excreted by vanadate-reducing bacteria. IUMB Life 49: 137-141.
4.
Aragon, J.J., Sanchez, V. and Boto, L. (1986). Fructose 2,6-bisphosphate in
Dictyostelium discoideum. Independence of cyclic AMP production and inhibition
of fructose-l,6-bisphosphatase. European Journal of Biochemistry 161: 757-761.
5.
Archibald, F.S. and Fridovich, I. (1982). Investigations of the state of the manganese
in Lactobacillius plantarum. Arch. Biochem. Biophys. 215: 589-596.
6.
Atkinson, G.F. (1915 Andersen, J., Andresini, W. and Delihas, N. (1982). On the
phylogeny of Phycomyces blakesleeanus nucleotide sequence of 5 S ribosomal
RNA. J. Biol. Chem. 257: 9114-9118.). Phylogeny and relationships in the
ascomycetes. Ann. Missouri Botan. Gardens 2:315-376.
7.
Baes, J., Charles F. and Mesmer, R. E. (1976). In The Hydrolysis of Cations Baes,
J., Charles F. and Mesmer, R. E., eds.; John Wiley & Sons:New York,.
8.
Baldauf, S. L. and Palmer, J. D. (1993). Animals and fungi are each other's closest
relatives, congruent evidence from multiple proteins. Proc. Natl. Acad. Sci., USA
90: 11558-11562.
9.
Baldauf, S. L., and Doolittle, W. F. (1997). Origin and evolution of the slime molds
(Mycetozoa). Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 12007–12012.
10. Baldauf, S.L. (1999). A search for the origins of animals and fungi: Comparing and
combining molecular data. American Naturalist 154: 178-S188.
11. Barbier, G.G., and Campbell, W.H. (2005). Viscosity effects on eukaryotic nitrate
reductase activity.J. Biol. Chem. 280, 26049-26054
12. Baroja-Mazo, A., Del Valle, P., Rúa, J., Busto, F., De Cima, S., and De Arriaga, D.
(2004). A transplasma membrane redox system in Phycomyces blakesleeanus:
81
properties of a ferricyanide reductase activity regulated by iron level and vitamin
K3. J. Bioenerg. Biomembr. 36, 481-92.
13. Bartrons, R., Van Schaftingeen, E., Vissers, S, and Hers, H.G. (1982). The
stimulation of yeast phosphofructokinase by fructose-2,6-bisphosphate. FEBS
Letters 143: 137-140.
14. Beauvoit, B., Rigoulet, M., Guerin, B. and Canioni, P. (1989). Polyphosphates as a
source of high energy phosphates in yeast mitochondria: a
31
P NMR study. FEBS
Lett. 252: 17-21.
15. Benabe, J., Echegoyen, L.A., Belinda Pastranall, B. and Martinez-Maldonado, M.
(1987). Mechanism of inhibition of glycolysis by vanadate. Journal of Biological
Chemistry 262 (20): 9555-9560.
16. Berbee, M. L., and Taylor, J. W. (1992). Two ascomycete classes based on fruitingbody characters and ribosomal DNA sequence. Mol. Biol. Evol. 9: 278-284.
17. Berbee, M. L., and Taylor, J. W. (1993). Dating the evolutionary radiations of the
true fungi. Can. J. Bot. 71: 1114-1127.
18. Bergman, K., Burke, P.V., Cerda-Olmedo, E., David, C.N., Delbruck, M., Foster,
K.W., and Goodell, E.W. (1969). Phycomyces. Bacteriol. Rev. 33: 99-157
19. Bertl, A., Bihler, H., Reid, J.D., Kettner, C., and Slayman, C.L. (1998a).
Physiological characterization of the yeast plasma membrane outward rectifying K+
channel, DUK1 (TOK1), in situ. J. Membr. Biol. 162: 67–80.
20. Bisconti, L., Pepi, M., Mangani, S., and Baldi, F. (1997). Reduction of vanadate to
vanadyl by a strain of Saccharomyces cerevisiae. BioMetals 10, 239-246.
21. Bishayee, A., Waghray, A., Patel, M. A., and Chatterjee, M. (2010). Vanadium in
the detection, prevention and treatment of cancer: the in vivo evidence. Cancer
Lett. 294, 1–12.
22. Blackwell, M. (2011). The fungi:1, 2, 3...5.1 millions species? Am. J. Bot. 98(23):
428-436.
23. Blank, L.M., Lehmbeck, F. and Sauer, U. (2005) Metabolic-flux and network
analysis in fourteen hemiascomycetous yeasts. FEMS Yeast Research 5(6-7):
545−558.
24. Bode, H. P., Friebel, C., and Fuhrmann, G. F. (1990). Vanadium uptake by yeast
cells. Biochim. Biophys. Acta 1022, 163-170.
82
25. Bölker, M (2001). Ustilago maydis – a valuable model system for the study of
fungal dimorphism and virulence. Microbiol. 147: 1395-1401.
26. Bonting, C. F., Korstee, G. J., and Zehnder, A. J. (1991). Properties of
polyphosphate: AMP phosphotransferase of Acinetobacter strain 210A. J.
Bacterial. 173: 6484-6488.
27. Bonting, C. F., Kortstee, G. J., and Zehnder, A. J. (1993) Properties of
polyphosphatase of Acinetobacter johnsonii 210 A. Antonie van Leeuwenhoek 64:
75-81.
28. Booth, J. W. and Guidotti, G. (1995). An alleged yeast polyphosphate kinase is
actually diadenosine-5’, 5-Pl,P4-tetraphosphate α,ß-phosphorylase. J. Biol. Chem.
270: 19377-19382.
29. Bowman, B. J. (1983). Vanadate uptake in Neurospora crassa occurs via phosphate
transport system. J. Bacteriol. 153, 286-291.
30. Bowman, B. J., Allen, K. E., and Slayman, C.W. (1983). Vanadate-resistant mutants
of Neurospora crassa are deficient in a high-affinity phosphate transport system J.
Bacteriol. 153, 292-296.
31. Bradford, M. M. (1976). Rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.
Biochem. 72, 248-254.
32. Bricheux, G., and Brugerolle, G. (1997). Molecular cloning of actin genes in
Trichomonas vaginalis and phylogeny inferred from actin sequences. FEMS
Microbiol. Lett. 153: 205–213.
33. Burgeff, H. (1925). Über arten und artkreuzung in der gattung Phycomyces Kunze.
Flora 40: 118-119.
34. Burgmayer, S. J., Kim, M., Petit, R., Rothkopf, A., Kim, A., BelHamdounia, S.,
Hou, Y., Somogyi, A., Habel-Rodriguez, D., Williams, A., and Kirk, M. L. (2007)
J. Inorg Biochem. 101, 1601-1616.
35. Burkholder, P.R., McVeigh, I. 1940. Growth of Phycomyces blakesleeanus in
relation to varied environmental conditions. Am. J. Bot. 27:634-640.
36. Busto, F., De Arriaga, D. and Soler, J. (1983). ATP, ADP and AMP on the
regulation of lactate dehydrogenase activity of Phycomyces blakesleeanus. Int. J.
Biochem. 15: 73-78.
83
37. Butler, A, Soedjak, H.S. and Tschirret-Guth, R.A. (1991). Chlorination catalyzed by
vanadium. J Inorg Biochem 43: 405-410.
38. Byerrum, R.U., Eckardt, R.E., Hopkins, L.L., Libsch, J.F., Rostoker, W., Zenz, C.,
Gordon, W.A., Mountain, J.T., Hicks, S.P. and Boaz, T.D. et al. (1974). Vanadium.
Washington, DC, National Academy of Sciences, 1-117.
39. Carreras, J., Bartons, R. and Grisolia, S. (1980). Vanadate inhibits 2,3bisphosphoglycerate
dependent
mutases
but
does
not
affect
the
2,3-
bisphosphoglycerate independent phosphoglycerate mutases. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 96: 1267-1273.
40. Carreras J, Climent F, Bartrons R, Pons G. (1982). Effect of vanadate on the
formation and stability of the phosphoenzyme forms of 2,3-biphosphoglyceratedependent phosphoglzcerate mutase and of phosphoglucomutase. Biochim Biophys
Acta. 705(2): 238-242.
41. Catalan, R.E.; Martinez, A.M.; Aragones, M.D. (1980). Effects of vanadate on the
cyclic AMP-protein kinase system in rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun.
96(2): 672-677
42. Cavalier-Smith, T. (1987). The origin of Fungi and pseudofungi. In Evolutionary
Biology of the Fungi (ed. A. D. M. Rayner, C. M. Brasier and D. M. Moore),
(Symp. Br. Mycol. Soc. 13), pp. 339-353. Cambridge University Press.
43. Cavalier-Smith, T. (1989). Systems of kingdoms. In McGraw Hill Yearbook of
Science and Technology, pp. 175-179.
44. Cavalier-Smith, T. (1998). A revised six-kingdom system of life. Biol. Rev. 73: 203266.
45. Ceredá-Olmedo, E. (2001). Phycomyces and the biology of light and color. FEMS
Microbiol. Rev. 25: 503-512.
46. Ceredá-Olmedo, E. and Lipson, E.D., eds. (1987) Phycomyces. Cold Spring Harbor
Laboratory.
47. Chasteen, N.D. (1984). The biochemistry of vanadium. Struct. Bonding 53: 104–38.
48. Chasteen, N. D. (1990). Vanadium in Biological System. Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, Netherlands.
49. Chock, P.B., Rhee, S.G. and Stadtman, E.R. (1980). Interconvertible enzyme
cascades in cellular regulation. Annu. Rev. Biochem. 49: 813-843.
84
50. Climent, F., Bartrons, R., Pons, G. & Carreras, J. (1981) Effect of vanadate on
phosphoryl transfer enzymes involved in glucose metabolism. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 101, 570–576.
51. Cohen, M.D. (1996). Vanadium and its immunotoxicology. Toxicol. Ecotoxicol.
News 3: 132–135.
52. Cohen, M.D., Sen, A.C. and Wei, C-I. (1987). Vanadium inhibition of yeast glucose
6 dehydrogenase. Inorganica Chimica Acta 138: 179-186.
53. Colonna, W.J., Magee, P.T. (1978). Glycogenolytic enzymes in sporulating yeast. J.
Bacteriol. 134: 844-853.
54. Costa Pessoa, J., Tomaz, A.I., Kiss, T., Kiss, E. and Buglyó, P. (2002). The Systems
VO2+ - gluthatione and related ligands: a potentiometric and spectroscopic study. J.
Biol. Inorg. Chem. 7: 225-240.
55. Crans, D. (2000). Chemestry and insulin-like properties of vanadium (IV) and
vanadium (V) compounds. J. of Inorg. Biochem. 80: 123-131.
56. Crans, D., Bunch, R.L. and Theisen, L.A (1989). Interaction of trace levels of
vanadium(IV) and vanadium(V) in biological systems. J. Am. Chem. Soc., 111:
7597-7607.
57. Crans, D., Mahroof-Tahir, M. and Keramidas, A.D. (1995). Vanadium chemistryand
biochemistry of relevancefor use of vanadium compounds as anti-diabetic agents.
Mol. Cell. Biochem. 153: 17-24.
58. Crans, D., Smee, J.J., Jason, J. S., Gaidamauskas, E., and Yang, L. (2004). The
chemistry and biochemistry of vanadium and the biological activities exerted by
vanadium compounds Chem. Rev. 104, 849-902.
59. Crans, D. and Tracey, A.S. (1998). The chemistry of vanadium in aqueous and
nonaqueous solution. In; Tracey et al. Vandium. ACS Symposium Series, American
Chemical Society: Washington, DC.
60. Crans, D. C., Willging, E. M., and Butler, S. R. (1990). Vanadate tetramer as the
inhibiting species in enzyme reactions in vitro and in vivo. J. Am. Chem. Soc. 112,
427-432.
61. Crans, D., Zhang, B., Gaidamauskas, E., Keramidas, A.D. Willsky, G.R. and
Roberts.C. (2010). Is vanadate reduced by thiols under biological conditions?
85
Changing the redox potential of V(V)/V(IV) by complexation in aqueous solution.
Inorg. Chem., 49: 4245-4256.
62. Cramer, C.L. and Davis, R.H. (1984). Polyphosphate-cation interaction in the
amino-containing vacuoles of Neurospora crassa. J. Biol. Chem. 259: 5152-5157.
63. Cruywagen, J.J., Heyns, J.B. and Westra, A.N. (1996). Protonation wquilibria of
mononuclear vanadate-thermodynamic evidence for the expansion of the
Coordination-number in V02+. Inorganic Chemistry 35(6): 1556-1559.
64. Dai, S., Thompson, K.H and McNeill, J.H. (1994). One-year treatment of
streptozotin-induced diabetic rats with vanadyl sulfate. Pharmacol. Toxicol. 74:
101-109.
65. Datema, R., van den Ende, H., and Wessels, J. G. H. (1977). The hyphal wall of
Mucor mucedo1. polyanionic polymers Eur. J. Biochem. 80, 611-619.
66. Dayhoff, M.O. (1976). Atlas of protein sequence and structure. National Biomedical
Research Foundation, Washington 5(2).
67. De Arriaga, D., Montero, S., Busto, F. and Soler, J. (1986). Partial purification and
some kinetic properties of glucose 6 dehydrogenase from Phycomyces
blakesleeanus. Biochimie 68: 293-302.
68. De Arriaga D., Teixido F., Busto F. and Soler J. (1984). The nature of the substrate
inhibition of cytoplasmic malate dehydrogenase from Phycomyces blakesleeanus.
Biochimica Biophysica Acta 784: 158-163.
69. De Boer, E., Tromp, M.G.M., Krenn, G.E. and Wever, R. (1986). Vanadium(V) as
an essential element for haloperoxidase activity in marine brown algae: purification
and characterization of a vanadium(V)-containing bromoperoxidase from
Laminaria saccharina. Biochim Biophys Acta 872: 104–115.
70. Delvaux, E. (1973). Some aspects of germination induction in Phycomyces
blakesleeanus by an ammonium acetate pretreatment. Arch. Mikrobiol. 72: 175181.
71.
Diez, M., Rua, J., Busto, F. and Soler, J. (1988). Analysis of the effects of light on
carbohydrate metabolism in Phycomyces sporangiophores and mycelia. Int. J.
Biochem. 20 (8): 801-806.
86
72. Dilworth, M.J., and Eady, R.R. (1991). Hydrazine is a byproduct of dinitrogen
reduction by the vanadium-nitrogenase from Azotobacter chroococcum. Biochem.
J. 277: 465–468.
73. Dilworth, M.J, Eldridge, M.E and Eady, R.R. (1993). The molybdenum and
vanadium nitrogenases of Azotobacter chroococcum: effect of elevated temperature
on N2 reduction. Biochem. J. 289: 395-400.
74. Domingo, J.L. (2002). Vanadium and tungsten derivatives as antidiabetic agents: a
review of their toxic effects. Biol. Trace. Elem. Res. 88: 97-112.
75. Domingo, J.L., Gommez, M., Liobet, J.M., Corbella, J. and Keen, C.L. (1995).
Toxicology of vanadium compounds in diabetic rats: The action of chelating agents
on vanadium accumulation. Mol. Cell Biochem. 153: 233-240.
76. Dubyak, G.R. and Kleinzeller, A. (1980). The insulin-mimetic effects of vanadate in
isolated rat adipocytes. Dissociation from effects of vanadate as a (Na+/K+)
ATPase inhibitor. J Biol Chem. 255(11): 5306–5312.
77. Duckworth, W.C., Solomon, S.S., Liepnieks, J.J., Hamel, F.G., Hand, S., and Peavy,
D.E. (1988) Insulin-like effects of vanadate in isolated rat adipocytes.
Endocrinology 122: 2285-2289.
78. Dumbrava, V.A. and Pall,,M.L. (1987). Regulation of fructose 2,6-bisphosphate
levels in Neurospora crassa. Biochim. Biophys. Acta 925: 210-217.
79. Dunn, T., Gable, K. and Beeler, T. (1994). Regulation of cellular Ca2+ by yeast
vacuoles. J. Biol. Chem. 269: 7273-7278
80. Durr, M., Urech, K., Boller, T., Wiemken, A., Schwencke, J., and Nagy, M. (1979).
Sequestration of arginine by polyphosphate vacuoles of yeast Saccharomyces
cerevisiae. Arch. Eicrobiol. 121: 169-175.
81. Elberg, G., Li, J. and Shechter, Y. (1994). Vanadium activates or inhibits receptor
and non-receptor protein tyrosine kinases in cefl-freeexperiments, depending on its
oxidation state: possible role of endogenous vanadium in controlling cellular
protein tyrosine kinase activity. J Biol Chem 269: 9521–9527.
82. Ellman, G. (1959). Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 82, 70-77.
83. Evans, F.E. and Kaplan, N.O. (1977).
31
P nuclear magnetic resonance studies of
HeLa cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74(11): 4909-4913.
87
84. Fantus, I.G., Ahmad, F. and Deragon, G. (1990). Vanadate augments insulin binding
and prolongs insulin action in rat adipocytes. Endocrinology 127: 2716–2725.
85. Fantus, I.G., Kadota, S., Deragon, G., Foster, B. and Posner, B.I. (1989).
Pervanadate [peroxide(s) of vanadate] mimics insulin action in rat adipocytes via
activation of the insulin receptor tyrosine kinase. Biochemistry 28: 8864–8871
86. Francois, J., Van Schaftingen, E. and Hers, H.G. (1984). The mechanism by which
glucose increases fructose 2,6 bisphosphate concentration in Saccharomyces
cereviseae. A cyclic AMP-dependent activation of phosphofructokinase 2. Eur. J.
Biochem. 164: 369-373.
87. Francois, J., Villanueva, M.E. and Hers, H.-G. (1988). The control of glycogen
metabolism in yeast. 1. Interconversion in vivo of glycogen synthase and glycogen
phosphorylase induced by glucose, a nitrogen source or uncouplers. Eur. J.
Biochem. 174: 551-559
88. Furch, B. (1981). Spore germination: heat mediated event. In The Fungal Spore:
Morphogenetic Controls 41: 3-434. Edited by G. Turian & H. R. Hohl. New York:
Academic Press.
89. Galland, P. and Ootaki, T. (1987). Differentiation and cytology. In Phycomyces.
281-316. Edited by E. Cerdi-Olmedo & E. D. Lipson. Cold Spring Harbor, NY:
Cold Spring Harbor Laboratory.
90. Gamow, I.R., Ruiz-Herrera, J. and Fischer, P.E. (1987). The cell wall of
Phycomyces. In: Cerda-Olmedo, E. and Lipson, E.D., (eds.) Phycomyces. Cold
Spring Harbor Laboratory, 223-316.
91. Ganguli, D., Kumar, C. and Bachhawat, A.K. (2007). The alternative pathway of
glutathione dagragation is mediated by a novel protein complex involving three
new genes in Saccharomyces cereviseae. Genetics, 175: 1137-1151.
92. Garces, R. and Medina, J. (1985). Light-dependent decrease in alcohol
dehydrogenase in Phycomyces. Exp. Mycol. 9: 94-98.
93. Garcés, R., Pollock, J. A., and Lipson, E. D. (1985). Examination of Phycomyces
blakesleeanus for nitrate reductase as a possible blue light photoreceptor. Plant
Science 40: 173-177.
94. Gonzales, H. and Jensen, T. E. (1998). Nickel sequestering by polyphosphate bodies
in Stafilococcus aureus. Microbios 93: 179- 185.
88
95. Goldwaser, I., Gefel, D., Gershonov, E., Fridkin, M. and Shechter, Y. (2000).
Insulin-like effects of vanadium: basic and clinical implications. Journal of
Inorganic Biochemistry 80: 21–25
96. Gordon, J. (2001). Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase
inhibitor. Methods Enzymol. 201, 477-482.
97. Grosser, M.J. and Tracey, A.S. (1990). Vanadates as phosphate analogs in
biochemisty. In Chasteen, N.D. eds. Vanadium in Biological Systems. Dordrecht,
Kfuwer Academic, 63-79.
98. Han, C., Yuan, J., Wang,Y., and Li L. (2006). Hypoglycemic activity of fermented
mushroom of Coprinus comatus rich in vanadium. J. Trace Elem. Med. Biol. 20,
191-196.
99. Han, C., Cui, B., and Qu, J. (2009). Comparison of vanadium-rich activity of three
species fungi of basidiomycetes. Biol. Trace Elem. Res. 127, 278-283.
100. Han, C., Wei, H. and Guo, J. (2011). Anti-inflammatory effects of fermented and
nonfermented Sophora flavescens: a comparative study. BMC Complementary and
Alternative Medicine 11: 100-105.
101. Hartz, T.K., Houston, M.R. and Lockwood, L.B. (1978). Substrat specifity and
kinetic properties of NADP-dependent alcohol dehydrogenase of Phycomyces
blakesleeanus. Mycologia 70: 586-593.
102. Heckman, D. S., Geiser, D. M., Eidell, B. R., Stauffer, R. L., Kardos N. L. and
Hedges, S. B. (2001). Molecular evidence for the early colonization of land by
fungi and plants. Science 293: 1129-1133.
103. Hemrika, W., Renirie, R., Dekker, H.L. and Barnett, R. (1997). From phosphatases
to vanadium peroxidases: A similar architecture of the active site. Wever, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94: 2145-2149.
104. Hers, H.G., Francois, J. and Van Schaftingen, E. (1985). Fructose 2,6 bisphosphate
versus cyclic cAMP in the liver and in the lower eukaryotic cells. Current Topics in
Cellular Regulation 27: 399-410.
105. Hers, H.G. and Van Schaftingen, E. (1982). Fructose-2,6-bisphosphate two years
after its discovery. Biochemical Journal 206: 1-12.
89
106. Hesbain-Frisque, A-M., Van Schaftingen, E. and Hers, H-G. (1981). Structure and
configuration of fructose 2,6-bisphosphate by 31P and 13C nuclear magnetic
resonance Eur. J. Biochem. 117: 325-327.
107. Hesse, S.J.A., Rujijiter, G.J.G., Dijikema, C. and Visser, J. (2000). Measurements of
intracellular (compartmental) pH by
31
P NMR in Aspergillus niger. J. Biotechnol.
77: 5-15.
108. Hildenberg, W., Burke, P.V and Sandmann, G.S. (1987). Metabolic pathways. In
Cerdo-Olmeda E. And Lipson, E.D.(esc) Phycomyces. Cold Spring Laboratory,
Cold Spring Harbor.
109. Hilliard, H.E. (1987). Vanadium. The minerals yearbook - minerals and metals. 917927.
110. Hooley, P, Whitehead M.P, Brown, M.R. (2008). Eukaryote polyphosphate kinases:
is the 'Kornberg' complex ubiquitous? Trends Biochem Sci. 33(12) :577-582
111. Hope, B.K. (1994). A global biogeochemical budget for vanadium. Biochemistry 37:
1–13.
112. Huang, C.,Zhang, Z., Ding, M., Li, J., Ye, J., Leonard, S.S., Shen, H-M.,
Butterworth, L., Lu, Y., Costa, M., Rojanasakul, Y., Castranova, V., Vallyathan, V.
and Shi, X. (2000). Vanadate jnduces p53 transactivation through hydrogen
peroxide and causes apoptosis. J. Biol. Chem. 275(40): 32516-32522.
113. Hwang, J-T., Lee. M., Jung, S-N., Lee, H-J., Kang, I., Kim, S-S. and Ha, J. (2003).
AMP-activated protein kinase activity is required for vanadate-induced hypoxiainducible factor 1a expression in DU145 cells. J. Biol. Chem. 278(41): 3965339661.
114. Jackson, T.K., Safhanick, A.I., Sparks, J.D., Sparks, C.E., Bolognino, M. and
Amatruda, J.M. (1988). Insulin- mimetic effects of vanadate in primary cultures of
rat hepatocytes. Diabetes 37: 1234-1240.
115. Johnson, L.N. (1992). Glycogen phosphorylase: control by phosphorylation and
allosteric effectors. FASEB J. 6: 2274-2282.
116. Jorge, J.A., Polizeli, M.L.T.M., Thevelein, J.M., Terenzi, H.F. (1997). Trehalases
and trehalose hydrolysis in fungi. FEMS Microbiol. Lett. 154: 165-171.
90
117. Kadota, S., Fantus, I.G., Deragon, G., Guyda, H.J., Hersh, B. and Posner, B.I.
(1987). Peroxide(s) of vanadium: a novel and potent insulin-mimetic agent which
activatesthe insulinreceptor kinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 259-266.
118. Kalac, P., and Svoboda, L. (2000). A review of trace element concentrations in
edible mushrooms. Food Chem. 69, 273-281.
119. Kanik-Ennulat, C., Montalvo, E. and Neff, N. (1995). Sodium orthovanadateresistant mutants of Saccharomyces cerevisiae show defects in Golgi mediated
protein glycosylation, sporulation and detergent resistance. Genetics 140: 933–43.
120. Karlish, S.J.D., Beaugé, L.A. and Glynn, I.M. (1979). Vanadate inhibits (Na+/K+)
ATP-ase by blocking a conformational change of the unphosphorylated form.
Nature; 282: 333–5.
121. Keasling, J. D. and Hupf, G. A. (1996). Genetic manipulation of polyphosphate
metabolism affects cadmium tolerance in Escherichia coli. Appl. Environ.
Microbiol. 62: 743-746.
122. Keefe, A.D. and Miller, S.L. (1996). Potentially prebiotic synthesis of condensed
phosphates. Orig. Life Evol. Biosph. 26: 15-25.
123. Keyhani, S., Lopez, J. L., Clark, D. S., and Keasling, J. D. (1996). Intracellular
polyphosphate content and cadmium tolerance in Anacystis nidulans R2.
Microbios. 88: 105-114.
124. Kim, H. Y., Schllctman, D., Shankar, S., Xie, Z. D., Chakrabarty, A. M., and
Kornberg, A. (1998). Alginate, inorganic polyphosphate, GTP and ppGpp synthesis
co-regulated in Pseudomonas aeruginosa: implications for stationary phase survival
and synthesis of RNA/DNA precursors. Mol. Microbiol. 27: 717-725.
125. Klahr, S. (1976). The effect of diuretic on kidney intermediary metabolism. In
Martinez-Maldonado,M., eds, Methods in Pharmacology. Renal Pharmacology
Plenum Press, New York 4A: 167-197.-etakrinska kiselina inh. GADPH preko SH
grupa) Benabe)
126. Kneifel, H. and Bayer, E. (1986). Stereochemistry and total synthesis of amavadin,
the naturally occurring vanadium compound of Amanita muscaria. J. Am. Chem.
Soc. 108: 3075 - 3077.
127. Kornberg, A. (1995). Inorganic polyphosphate: toward making a forgotten polymer
unforgottable. J. Bacterial. 177: 491-496.
91
128. Kornberg, A., Rao, N.N. and Ault-Rich, D. (1999). Inorganic polyphosphate: a
molecul of many functions. Annu. Rev. Biochem. 68, 89-125
129. Kulaev, I, and Kulakovskaya, T. (2000). Polyphosphate and phosphate pump. Annu.
Rev. Microbiol. 54: 709-734.
130. Kulaev, I. S. (1979). The biochemistry of inorganic polyphosphates. J. Wiley and
Sons, Chichester, New York
131. Kulaev, I. S. and Vagabov, V. M. (1983). Polyphosphate metabolism in
microorganisms. Adv. Microbial. Physiol. 24: 83-171.
132. Kulaev, I., Vagabov, V. and Kulakovskaya, T. (1999). New aspects of inorganic
polyphosphate metabolism and function. J. Biosci. Bioeng. 88: 111-129.
133. Kuroda, H., Warncke, J., Sanders, D., Hansen, U-P., Allen, K.E. and Bowman, B.J.
(1980). Effects of vanadate on the electrogenic proton pump in Neurospora. In
R.M. Spanswick, W. J. Lucas, and J. Dainty (eds.), Plant membrane transport:
current conceptual issues. Elsevier-North Holland, Amsterdam. 507-508.
134. Kusano, S. and Ishihama, A. (1997). Functional interaction of Escherichia coli RNA
polymerase with inorganic polyphosphate. Genes to Cells 2: 433-441.
135. Laugier, O.B., Spasić, S.D., Mandić, V., Jakovljević, D. and Vrvić, M.M. (2012).
The effects of repetitive alkaline/acid extractions of Saccharomyces cerevisiae cell
wall on antioxidative and bifidogenic efficacy. Int. J. Food Sci.Technol. 47: 369375.
136. Lee, R.M, Hartman, P.A., Stahr, H.M., Olson, D.G. and Williams, F.D. (1994).
Antibacterial mechanism of long chain polyphosphate in Staphylococuss aureus. J.
Food Prot. 57: 289-294.
137. Lemery, N. (1675). Cours de Chymie contenant la maniere de faire les operations
qui sont en usage dans la medecine, par une methode facile avec des raisonnements
chaque operation, pour l'instruction de ceux qui veulent s'appliquer a cette science.
Lemery, Paris.
138. Lepp, N. W., Harrison, S. C. S., and Morrell, B. G. (1987). A role of Amanita
muscaria L. in the circulation of cadmium and vanadium in the non-polutted
woodland. Environ. Geochem. Health 9, 61-64.
139. Levy, H.R. (1979). Glucose-6-phosphate dehydrogenases. Adv. Enzymol. Rel. Areas
Mol. Biol. 48: 97-192.
92
140. Lichko, L. P., Okorokov, L. A., and Kulaev, I. S. (1982). Participation of vacuoles
in regulation of K+, Mg2+ and orthophosphate ions in cytoplasm of the yeast
Saccharomyces carlsbergensis. Arch. Microbiol. 132: 289-293.
141. Lichko, L.P., Andreeva, N.A., Kulakovskaya, T.V. and Kulaev, I.S. (2003).
Exopolyphosphatases of the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 3:
233-238.
142. Lillie,
S.H.,
Pringle,
J.R.
(1980).
Reserve
carbohydrate
metabolism in
Saccharomyces cerevisiae: responses to nutrient limitation. J. Bacteriol. 143: 13841394.
143. Lindquist, R.N., Lynn, J.L. and Lienhard, G.E. (1973). Possible transition-state
analogs for ribonuclease. The complexes of uridine with oxovanadium (IV) ion and
vanadium (V) ion. J Am Chem Soc.; 95: 8762–8.
144. Lohmeier-Vogel, E.M. Hahn-Hagerdal, B. and Vogel, H.J. (1995). Phosphorus-31
and Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Studies of Glucose and Xylose
Metabolism in Candida tropicalis Cell Suspensions. Applied and Enviromental
Microbiology 61(4): 1414–1419.
145. Lopez, V., Stevens, T. and Lindquist, R. N. (1976). Vanadium ion inhibition of
alkaline phosphatase-catalyzed phosphate ester hydrolysis. Arch. Biochem.
Biophys. 175: 31-38.
146. Lowendorf, H.S., Bazinet, G.F. and Slayman, C.W. (1975). Phosphate transport in
Neurospora: derepression of a high-affinity transport system during phosphorus
starvation. Biochim. Biophys. Acta. 389: 541-549.
147. Lu, B., Ennis, D., Lai, R., Bogdanovic, E., Nikolov, R., Salamon, L., Fantus, C., LeTien, H. and Fantus, I.G. (2001). Enhanced sensitivity of insulin-resistant
adipocytes to vanadate is associated with oxidative stress and decreased reduction
of vanadate (+5) to vanadyl (+4). J. Biol. Chem. 276(38): 35589-35598.
148. Lyonnet, B., Martz, M. and Martin E. (1899). L'emploi thérapeutique des dérivés du
vanadium. La presse médicale 32: 191–192.
149. Macara, I.G., Kustin, K. and Cantley, L.C. (1980). Glutathione reduces cytoplasmic
vanadate: Mechanism and physiological implications. Biochim Biophys Acta 629:
95-106.
93
150. Mamane, Y. and Pirrone, N. (1998). Vanadium in the Atmosphere. In: Vanadium in
the Environment-Part. In, Jerome O. Nriagu (Editor). Chemistry and Biochemistry.
John Wiley & Sons Inc., New York. 37-71.
151. Mannazzu, I. (2001). Vanadium detoxification and resistance in yeast: a minireview.
Annals of Microbiology, 51: 1-9.
152. Mannazzu, I., Guerra, I., Ferretti, R., Pediconi, D. and Fatichenti, F. (2000).
Vanadate and dopper induce overlapping oxidative stress responces in the
vanadate-tolerant yeast Hansenula polymorpha. Biochimica and Biophysica Acta,
1475: 151-156.
153. Mannazzu, I., Guerra, I., Strabbioli, R., Masia, A., Maestrale, G.B., Zoroddu, M.A.
and Fatichenti, F. (1997). Vanadium affects vacuolization and phosphate
metabolism in Hansenula polymorpha. FEMS Microbiology, 147: 23-28.
154. Mannella, C.A,, Frank, J. and Delihas, N. (1987). Interrelatednes of 5S RNA
sequences investigated by correspondence analysis. J.Mol.Evol. 24: 228-235.
155. Margulis, L. and Schwartz, K.V. (1988). Five Kingdoms: An illustrated guide to the
phyla of life on Earth, 2nd eds. Freeman, W.H., XVI + 376 New York
156. Martinez-Cadena, G., Saavedre-Calixto, J., Messina-Valencia, G., DominguezGutierrez, G. and Novoa-Martinez, G. (1995). Effect of carbon source and pH of
the growth medium on spore germination in Phycomyces blakesleeanus. Arch.
Microbiol. 164: 231-234.
157. Martinez-Cadena, G. and Ruiz-Herrera, J. (1987). Activation of chitin synthetase
from Phycomyces blakesleeanus by calcium and calmodulin. Arch. Microbiol. 148:
280-285.
158. Mayr, E. (1990). A natural system of organisms. Nature 348 491.
159. McBryde, M. (1979). Mobility and reactions of VO2+ on hydrated smectite surfaces
1. Clays and clay minerals 27(2): 91-96.
160. McGrath, J.W., Kulakova, A.N., Kulakov, L.A. and Quin, J.P. (2005). In vitro
detection and characterization of polyphosphate synthesizing activity in the yeast
Candida humicola G-1. Res. Microbiology 156: 485-491.
161. McNeill, J.H, Yuen, V.G, Hoveyda, H.R. and Orvig,C. (1992). Bis (maltolato)
oxovanadium(IV) is a potent insulin mimic. J. Med. Chem. 35: 1489-1491
94
162. Meyerovitch, J., Rothenberg, P., Shechter, X., Bonner-Weir, S. and Kahn, C.R.
(1991). Vanadate normalizes hyperglycemiain two mouse models of non–insulindependentdiabetesmellitus. J. Clin Invest 87: 1286-1294.
163. Miguelez, E.M., Fernandez, M., Hardisson, C. (1997). Nitrogen starvation-induced
glycogen synthesis depends on the development stage of Streptomyces antibioticus
mycelium. FEMS Microbiol. Lett. 153: 57-62.
164. Miller, R.W and Eady, R.R. (1988). Molybdenum and vanadium nitrogenases of
Azotobacter chroococcum. Low temperature favours N2 reduction by vanadium
nitrogenase Biochem. J. 256: 429-432.
165. Morinville, A., Maysinger, D. and Shaver, A. (1998). From Vanadis to Atropos:
vanadium compounds as pharmacological tools in cell death signalling. Trends
Pharmacol Sci. 19: 452–60.
166. Munoz, P., Guma, G., Camps, M., Furriols, M., Testar, X., Palacin, M. and
Zorzanoll, A. (1992). Vanadate stimulates system A amino acid transport activity in
skeletal muscle. J. Biol. Chem. 267(15): 10381-10388.
167. Muzzarelli, R. A. A. (1977) Chitin, Pergamon Press, Oxford, UK
168. Necker, N. J. de (1783). Traité sur la mycitologie ou discours historique sur les
champignons en general, dans lequel on demontre leur veritable origine et leur
génération; d'ou dependent les effets pernicieux et funestes de ceux que l'on mange
avec les moyens de les éviter. Matthias Fontaine, Mannheim.
169. Nielsen, F.N. (1995). Vanadium in mammalian physiology and nutrition, in metal
ions in biological systems In: Sigel, H. and Sigel, A. (eds.), Vanadium and its role
in life. Marcel Dekker, Inc., New York/Basel/Hong Kong, 31: 543–574
170. Nriagu, J.O. (1998). Vanadium in the Environment. in Adv. Environ. Science
Technol. John Wiley & Sons, Inc: New York 30 and 31.
171. Okar, D.A., Kakalis, L.T., Narula, S.S., Armitage, I.M. and Pilkis, S.J. (1995).
Identification of transient intermediates in the bisphosphatase reaction of rat liver 6phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase by 31P NMR spectroscopy
Biochem. J. 308: 189-195.
172. Okorokov, L.A., Lichko, L.P., and Kulaev, I.S. (1980). Vacuoles: the main
compartment of potassium, magnesium and phosphate ions in Saccharomyces
carlsbergensis cells. J. Bacteriol. 144: 661-665.
95
173. Orvig, C., Thompson, K.H., Battell, M. and McNeill, J.H. (1995). Vanadium
compounds as insulin mimics. Met. Ions Biol. Syst. 31: 571-594.
174. Perkins, D.D. and Davis, R.H. (2000). Neurospora at the millennium. Fungal Gen.
Biol. 31: 153-167.
175. Pfeffer, P.E. and Shachar-Hill, Y. (1996). Plant/Microbe symbioses. In: ShacharHill Y, Pfeffer P.E. (eds.) Nuclear magnetic resonance in plant biology. American
Society of Plant Physiologist, Rockville, Maryland USA 77-107.
176. Pilatus, U. and Techel, D. (1991).
31
P-NMR-studies on intracellular pH and
metabolite concentrations in relation to the circadian rhythm, temperature and
nutrition in Neurospora crassa. Bioch. Biophys. Acta 1091: 349-355.
177. Pilkis S.J, El-Maghrabi, M.R, McGrane, M., Pilkis, J., Fox, E. and Claus, T.H.
(1982). Fructose 2,6-bisphosphate: a mediator of hormone action at the fructose 6phosphate/fructose 1,6-bisphosphate substrate cycle. Mol Cell Endocrinol. 25(3):
245–266.
178. Poucheret, P., Verma, S., Grynpas, M.D. and McNeill, J.H. (1998). Vanadium and
diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry 188(1-2): 73-80.
179. Preet, A., Gupta, B.L., Yadava, P.K. and Baquuer, N.Z. (2005). Efficacy of lower
doses of vanadium in restoring altered glucose metabolism and antioxidant status in
diabetic rat lenses. J. Biosci. 30(2): 221-230.
180. Rao, N. N., Liu, S., and Komberg, A. (1998). Inorganic polyphosphate in
Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent responce. J. Bacterial.
180: 2186-2193.
181. Rehder D. (1992). Structure and function of vanadium compounds in living
organisms. BioMetals 5: 3–12.
182. Rehder, D. (2003). Biological and medical aspects of vanadium. Inorg. Chem.
Commun. 6: 604-617.
183. Rehder, D. (2008a). Bioinorganic vanadium chemistry. J. Wiley and Sons,
Chichester, New York.
184. Rehder, D. (2008b). Biological and medical effects of vanadium. Is vanadium a
more versatile target in the activity of primordial life forms than hitherto
anticipated? Org. Biomol. Chem. 6: 957-964.
96
185. Rehder. D. (1999). The coordination chemistry of vanadium as related to its
biological functions. Coordination chemistry review 182(1): 297-322.
186. Rehder, D. (2011). Transport, accumulation, and physiological effects of vanadium.
In Sherameti, I. and Varma, A. (esc). Detoxification of heavy metals. Soil Biology
30: 205-220.
187. Rennhard, H.H. (1971). The metabolism of ethyl maltol and maltol in the dog. J
Agric. Food Chem. 19(1): 152-154.
188. Rider, M.H., Bartrons, R. and Hue, L. (1990). Vanadate inhibits liver fructose-2,6bisphosphatase. Eur. J. Biochem. 190: 53-56
189. Roberts, J.K.M. (1986). NMR methods for determination of intracellular pH. In:
Linskens, H.F. and Jackson, J.F. eds. Modern methods of plant analysis, Nuclear
Magnetic Resonance, Springer-Verlag, 2: 106-124.
190. Roger, A. J., O. Sandblom,W. F. Doolittle, and H. Philippe. 1999. An evaluation of
elongation factor 1α as a phylogenetic marker for eukaryotes. Mol. Biol. Evol. 16:
218–233.
191. Roschin, I.V., Ordzhonikidze, E.K. and Shalganova, I.V. (1980). Vanadiumtoxicity, metabolism, carrier state. J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. 24: 377383.
192. Rua, J., Busto, F., De Arriaga, D. and Soler, J. (1993). Glycogen in Phycomyces
blakesleeanus: influence of growth conditionsand nutrient limit ation. Journal of
General Microbiology 139: 217-222.
193. Rua, J., De Cima, S., Del Valle, P., Gutierrez-Larranzar, M., Busto, F. and De
Arriaga, D. (2008). Glycogen and trehalose mobilization by acetic acid in
Phycomyces blakesleeanus: dependence on the anion form. Research in
Microbiology 159: 200-206.
194. Rua J., Rodriguez-Aparicio L. B., Busto F. and Soler J. (1987). Effect of light on
several metabolites of carbohydrate metabolism in Phycomyces blukesleeanus. J.
Bact. 169: 904-907.
195. Rudolph, H. and Furch, B. (1970). Untersuchungen zur Aktivirung von
sporenhomogenaten durch Warmebehandlung. Arch. Mikrobiol. 72: 175-181.
196. Rudolph, H. and Ochsen, B. (1969) Trehalose-Usatz warmeaktivierter Sporen von
Phycomyces blakesleeanus. Arch. Mikrobiol. 65: 163-171.
97
197. Sharif, M. and Claassen, N. (2011). Action mechanisms of arbuscular mycorrhizal
fungi in phosphorus uptake by Capsicum annuum L. Pedosphere 21(4): 502–511.
198. Shiba, T., Tsutsumi, K., Yano, H., Ihara, Y., Kameda, A., Tanaka, K., Takahashi,
H., Munekata, M., Rao, N. N., and Konberg, A. (1997). Inorganic polyphosphate
and the induction of ROS expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11210-11215.
199. Schaftingen, E., Hue, L. and Hers, H-G. (1980). Fructose 2,6-bisphosphate, the
probable structure of the glucose and glucagon-sensitive stimulator of
phosphofructokinase. Biochem. J. 192: 897-901.
200. Schimek, C., Eibel, P., Grolig, F., Horie, T., Ootaki, T. and Galland, P. (1999).
Gravitropism in Phycomyces: a role for sedimenting protein crystals and floating
lipid globules. Planta 210:132-142.
201. Schusler, A., Schwarzott, D. and Walker, C. (2001). A new fungal phylum, the
Glomeromycota: phylogeny and evolution. Mycol. Res. 105: 1413–1421.
202. Schwabe, U., Puckstein, C., Hammerman, H., Sochtig, E. (1979). Activation of
adenylate cyclase by vanadate. Nature 277: 143–145.
203. Scwartz, K. and Milne, D.B. (1971). Growth effects of vanadium in the rat. Science,
174: 426-428.
204. Shechter, Y., Goldwaser, I., Mironchik, M., Fridkin, M. and Gefe, D. (2003).
Historic perspective and recent developments on the insulin-like actions of
vanadium; toward developing vanadium-based drugs for diabetes. Coordination
Chemical Review 237: 3-11.
205. Shechter, Y. and Karlish, S.J.D. (1980). Insulin-like stimulation of glucose
oxidation in rat adipocytes by vanadyl (IV) ions. Nature 284: 556-558.
206. Shechter, Y. and Ron. A. (1986). Effect of depletion of phosphate and bicarbonate
ions on insulin action in rat adipocytes. J. Biol. Chem. 261(32): 14945-14950.
207. Shirahama, K., Yazaki, Y., Sakano, K., Wada, Y., and Ohsumi, Y. (1996). Vacuolar
function in the phosphate homeostasis of the yeast Saccharomyces cerevisiae.
Plant. Cell. Physiol. 37: 1090-1093.
208. Sigel, A. and Sigel, H.A. (1995) (eds). Vanadium and its role for life; Metal ions in
Biological Systems, Marcel Dekker, Inc.: New York. 31. b. Srivastava, A.K.;
Chiasson, J.-L. (eds.) Vanadium Compounds: Biochemical and Therapeutic
Applications: Focused issue in Mol. Cell. Biochemistry, 153.
98
209. Skorko, R., Osipuk, J., and Stetter, K.O. (1989). Glycogen-bound polyphosphate
kinase from Archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. J. Bacterial. 171: 51625164.
210. Soler, J., De Arriaga, D., Busto, F. and Cadenas, E. (1982). Lactate dehydrogenase
from Phycomyces bllakesleeanus. Biochem. J., 203: 383-391.
211. Sutter R. P. (1975) Mutations affecting sexual development in Phycomyces
blakesleeanus. Proc. natn. Acad. Sci.U.S.A. 72: 127-130.
212. Stryer, L. (1989). Biochemistry, 3rd edn, W.H.Freeman and Co., San Francisco,
CA.
213. Sutter, R.P. (1987). Sexual development. In: Phycomyces Cerda-Olmedo, E. and
Lipson, E.D., eds. Cold Spring Harbor Laboratory 223-316.
214. Tani, C., Ohtomo, R., Osaki, M., Kuga, Y. and Ezawa, T. (2009). ATP-dependent
but proton gradient-independent polyphosphate-synthesizing activity in extraradical
hyphae of an arbuscular mycorrhizal fungus. Applied and Environmental
Microbiology 7044-7050.
215. Taylor, J. W., Bowman, B., Berbee, M. L. and White. T. J. (1993). Fungal model
organisms: phylogenetics of Saccharomyces, Aspergillus and Neurospora. Syst.
Biol. 42: 440-457.
216. Thama, L.X., Nagasawa, N., Matsuhashi, S., Ishioka, N.S., Ito, T., Kume, T. (2001).
Effectof radiation-degraded chitosan on plants stressed with vanadium. Radiat.
Phys. Chem. 61: 171-175
217. Thompson, K.H., Lichter, J., LeBel, C., Scaife, M.C., McNeill, J.H. and Orvig, C.
(2009). Vanadium treatment of type 2 diabetes: A view to the future. Journal of
Inorganic Biochemistry 103: 554-558.
218. Thompson, K.H., McNeill, J.H. and Orvig, C. (1999). Vanadium compounds as
insulin mimics. Chem. Rev. 99: 2561–2571.
219. Thompson, K.H. and Orvig, C. (2004). Vanadium compounds in treatment of
diabetes. Met.Ions Biol. Syst. 41: 221-252.
220. Thompson, K.H. and Orvig, C. (2006). Vanadium in diabetes: 100 years from Phase
0 to Phase I. Journal of Inorganic Biochemistry 100: 1925–1935.
99
221. Thorstensen, K., and Romslo, I. (1988). Uptake of iron from transferring by isolated
rat hepatocytes. An redox-plasma membrane mediated process. J. Biol. Chem. 263:
8844-8850.
222. Tolman, E.L, Barris, E., Burns, M., Pansini, A. and Pmtidge, R. (1979). Effects of
vanadium on gfucose metabolismin vitro. Life Sci. 25: 1159–1164.
223. Trefrey, J.H. and Metz, S. (1989). Role of hydrothermal precipitates in the
geochemical cycling of vanadium. Nature 342: 531–533.
224. Tsiani, E. and Fantus, I.G. (1997). Vanadium compounds, biological actions and
potential as pharmacological agents. TEM, 8: 2
225. Tinsley, C. R. and Gotschlich, E. C. (1995). Cloning and characterization of the
meningococcal polyphosphate kinase gene: production of polyphosphate synthesis
mutant. Infect. Immun. 63: 1624-1630.
226. Toivari, M. (2007). Engineering the pentose phosphate pathway of Saccharomyces
cerevisiae for production of ethanol and xylitol. Doctoral thesis, University of
Helsinki.
227. Tu, J.C. and Malhotra, S.K. (1977). Plasma membrane of Phycomyces: sequential
changes in the structure during spore formation. Cytobios 20:121-132.
228. Vagabov, V.M., Trilisenko, L.V., Shchipanova, I.N., Sibeldina, L.A. and Kulaev,
I.S. (1998). Changes in inorganic polyphosphate length during growth of
Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. (Moskow) 67: 154-157.
229. Van Assche, J.A., Carlier, A.R., De Kersmaeker, H.I. (1972). Trehalase activity in
dormant and activated spores of Phycomyces blakesleeanus. Planta 103: 327-333.
230. Van de Peer, Y. and De Wachter. R. (1997). Evolutionary relationships among the
eukaryotic crown taxa taking into account site-to-site rate variation in 18S RNA. J.
Mol. Evol. 45: 619–630.
231. Vandercammen, A., Francois, M.J., Torres, B.B, Maia, J.C.C. and Hers, H-G.
(1990). Fructose 2,6 bisphosphate and carbohydrate metabolism during the life
cycle of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Journal of General
Microbiolog , 136: 137-146.
232. Van Doren, J.B. (1968). Gmelins Handbuch der Anorganischen Chemie, Vanadium,
Teil A, Lieferung 1 (System No. 48), Verlag Chemie, Weinheim. J. Chem. Educ.
45(1) A75
100
233. Van Etten, R. L., Waymack, P. P. and Rehkop, D. M. (1974). Transition metal ion
inhibition of enzyme-catalyzed phosphate ester displacement reactions. J. Am.
Chem. Soc. 96: 6782-6785
234. Van Laere, A. (1983). Stimulation of Phosphofructokinase from Phycomyces
blakesleeunus and some other fungi by micromolar concentrations of Fructose 2,6bisphosphate. Journal of General Microbiology, 129, 3281-3285.
235. Van Laere, A.J. and Carlier, A.R. (1975). Glucose metabolism of dormant and heatactivated spores of Phycomyces blakesleeanus Burgeff. Planta (Berl.) 125. 217225.
236. Van Laere, A., Schaftingen, E., and Hers, H-G. (1983). Fructose 2,6-bisphosphate
and germination of fungal spores. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 80: 6601-6605.
237. Van Laere, A.J., Van Assche, J.A., Carlier, A.R. (1980) Metabolism and chemical
activation of Phycomyces blakesleeanus spores. Exp. Mycol. 4: 260-268.
238. Van Laere, A., Van Assche, J.A. and Furch, B. (1987). The sporangiospore:
dormancy and germination. In Cerdo-Olmeda E. And Lipson, E.D.(esc)
Phycomyces. Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, 247-249.
239. Van Schaftingeen, E. and Hers, H. G. (1981). Inhibition of fructose- 1,6bisphosphatase by fructose 2,6-bisphosphate. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the USA 78: 2861-2863.
240. Van Schaftingeen, E., Jett, M F., Hue, L. and Hers, H.G. (1981). Control of liver 6phosphofructokinase by fructose-2,6-bisphosphate and other effectors. Proceedings
of the National Academy of Sciences of the USA 78: 3483-3486
241. Van Zinderen Bakker, E.M. and Jaworowski, J.F. (1980).
Effects of vanadium
in the Canadian environment. Ottawa, National Research Council of Canada.
242. Vives-Corrons, J.L., Jou, J.M., Ester, A., Ibars, M., Carreras, J., Bartrons, R.,
Climent, F. and Grisolía, S. (1981). Vanadate increases oxygen affinity and affects
enzyme activities and membrane properties of erythrocytes. Biochem Biophys Res
Commun. 103(1): 111-117.
243. Voet, D. and Voet, J. (1995). Biochemistry. J. Wiley and Sons, Chichester, New
York.
244. Walker, W.F. and Doolittle, W.F. (1982). Nucleotide sequences of 5S ribosomal
RNA from four oomycete and chytrid water moulds. Nucleic Acid Res. 10: 5717
101
245. West, M.W. and Ponnamperuma, C. (1970). Chemical evolution and the origin of
life: a comprehensive bibliography. Space Life Sci. 2: 225-295.
246. Wever, R, and Tromp, M.G.M. (1991). Structure and function of vanadium
bromoperoxidases. J Inorg Biochem 43: 404-449
247. Whittaker, R.H. (1969). New Concepts of Kingdoms of Organisms. Science 163:
150-160.
248. Wiemken, A. and Durr, M. (1974). Characterization of amino acid pools in the
vacuolar compartment of Saccharomyces cerevisiae. Arch. Microbiol. 101: 45-57.
249. Willsky, G.R. (1990). Vanadium in Biological Systems: Physiology and
Biochemistry; In: Chasteen, N. D., (eds). Kluwer Academic Publishers: Boston.
250. Willsky, G.R. and Dosch, S.F. (1986). Vanadium metabolism in wild type and
respiratory-deficient strains of S. cerevisiae. Yeast 2: 77-85
251. Willsky, G.R., White, D.A. and McCabe, B.C. (1984). Metabolism of added
orthovanadate to vanadyl and high-molecular weight vanadates in Saccharomyces
cerevisiae. J. biol. Chem. 259(13): 273-13 281.
252. Wood, H. G. and Clark, J. E. (1988). Biological aspects of inorganic
polyphosphates. Ann. Rev. Biochem. 57: 235-260.
253. Yamagata, Y., Watanabe, H., Saitoh, M. and Namba, T. (1991). Volcanic
production of polyphosphates and its relevance to prebiotic evolution. Nature 352:
516-519.
254. Yang, Y. C., Bestos, M., and Chen, K. J. (1993). Effect of osmotic stress and growth
stage on cellular pH and polyphosphate metabolism in Neurospora crassa as
studied by
31
P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta
1179: 141-147.
255. Zakrzewska J., Žižić M., Živić M. (2005) The effects of anoxia on content of
Phycomyces blakesleeanus micelium studied by 31P NMR. Annals of the New York
Academy of Sciences 1048: 482-486.
256. Zoller, W.H., Gordon, G.E., Gladney, E.S. and Jones, A.G. (1973). The sources and
distribution of vanadium in the atmosphere. In:Kothy, E.L., eds. Trace elements in
the environment. Washington, DC, American Chemical Society 123: 31-47.
257. Zoroddu, M.A. (1999). Vanadium uptake by yeast. Annals of the New York
Academy of Sciences, 879: 288–291.
102
258. Zoroddu, M.A. and A. Masia. (1997). A novel dimeric oxovanadium species
identified in Saccharomyces cervisiae cells. Biochem. Biophys. Acta 1358: 249–
254.
259. Zoroddu, M.A., Fruianu, M., Dallocchio, R. and Masia, A. (1996). Electron
paramagnetic resonances studies and effects of vanadium in Saccharomyces
cereviseae. BioMetals, 9: 91-97.
260. Živanović, B., Köhler, K., Galland, P. and Weisenseel, M. (2001). Membrane
potential and endogenous ion current of Phycomyces sporangiophores. Electro
Magnetobiol. 20: 343-362.
261. Živić, M., Zakrzewska, J.,Žižić, M., Bačić, G. (2007).
31
P NMR study of
polyposphate levels during different growth phases of Phycomyces blakesleeanus.
Antonie van Leeuwenhoek 91(2): 169-177.
262. http://.dionex.com/en-us/webdocs/5047-AN122_LPN1029-03.pdf
263. http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY/
103
8.BIOGRAFIJA
Мilan Žižić, diplomirani fizičar, rođen je 10.04.1977. godine u Podgorici gde je
završio osnovnu školu i gimnaziju. Prirodno-matematički fakultet u Podgorici upisao je
školske 1995/96 godine a diplomirao 2001. godine. Pripravnički staž odradio je na
Institutu za javno zdravlje Crne Gore 2002-2003 godine. 2004. Godine upisao je
doktorske studije na Univerzitetu u Beogradu, smer Biofizika.. Do sada je bio uključen
u više naučnih projekata: "Membrane i apoplast: uloga u spoljašnjem i oksidativnom
stresu i biohemijskoj redoks regulaciji simplasta."- projekat 1934 (2003–2006,
Ministarstvo za nauku i tehnološki razvoj republike Srbije), "Biofizička istraživanja
membranskih procesa: interakcija membranskih receptora i kanala sa spoljašnjim
faktorima i intracelularna organizacija "- projekat 143016B (2006-2010, Ministarstvo za
nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije) i "Interakcija membrana sa unutarćelijskim
i apoplastičnim prostorom: izučavanja bioenergetike i signalizacije koristeći biofizičke i
biohemijske metode"-projekat OI173040 (2011-2014, Ministarstvo prosvete i nauke
Republike Srbije).
Dosadašnje publikacije vezane za temu :
Kategorija M20:
1. M. Žižić, M. Živić, I. Spasojević, J. Bogdanović Pristov, M. Stanić, T. CvetićAntić, J. Zakrzewska, „The interactions of vanadium with Phycomyces
blakesleeanus mycelium: enzymatic reduction, transport and metabolic effects“
Res. Microbiol., 2012, http://dx.doi.org/10.1016/j.resmic.2012.08.007.
(M22, IF 2.763)
2. M. Živić, J. Zakrzewska, M. Žižić, G. Bačić "31P NMR study of polyposphate
levels during different growth phases of Phycomyces blakesleeanus" Antonie
van Leeuwenhoek, 2007, 91(2):169-177.
(M 23, IF 1.964)
Kategorija М33:
1. M. Žižić, I. Spasojević, M. Živić, J. Bogdanović Pristov, M. Stanić, S. Križak, J.
Zakrzewska, „The mechanism of vanadate reduction in Phycomyces
blakesleeanus mycelium“, Regional Biophysics Conference 2012, KladovoBelgrade, Serbia, September 03-07, Proceedings, 42-44.
104
2. M. Žižić, I. Spasojević, M. Stanić, M. Živić, J. Zakrzewska, „EPR investigations
of vanadate reduction in mycelium of Phycomyces blakesleeanus“ Physical
Chemistry 2012, 11th International Conference of Applied Aspects of Physical
Chemistry, September 24-28, Belgrade, Serbia, Proceedings, 388-390.
3. M. Stanić, M. Žižić, M. Živić, J. Zakrzewska, „Vanadium toxicity in
Phycomyces blakesleeanus“, Physical Chemistry 2012, 11th International
Conference of Applied Aspects of Physical Chemistry, September 24-28,
Belgrade, Serbia, Proceedings, 609-611.
105
Прилог 1.
Изјава о ауторству
Потписани
број индекса
Mилан Жижић
1/03
________
Изјављујем
да је докторска дисертација под насловом
Метаболизам и метаболички ефекти ванадијума код гљиве Phycomyces
blakesleeanus
•
резултат сопственог истраживачког рада,
•
да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена
за добијање било које дипломе према студијским програмима других
високошколских установа,
•
да су резултати коректно наведени и
•
да нисам кршио ауторска права и користио интелектуалну својину других
лица.
Потпис докторанда
У Београду, ________18.03.2013_____
106
Прилог 2.
Изјава o истоветности штампане и
електронске верзије докторског
рада
Име и презиме аутора ___________Милан Жижић_________________________
Број индекса ________________________1/03______________________________
Студијски програм _______________Биофизика___________________________
Наслов рада _______Метаболизам и метаболички ефекти ванадијума код___
гљиве Phycomyces blakesleeanus________________________________________
Ментор _______________________др Горан Бачић________________________
Потписани ___________ Милан Жижић _____________________________
Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској
верзији коју сам предао за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума
Универзитета у Београду.
Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања
доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране
рада.
Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне
библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду.
Потпис докторанда
У Београду, _______18.03.2013___________
107
Прилог 3.
Изјава о коришћењу
Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални
репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под
насловом:
Метаболизам и метаболички ефекти ванадијума код гљиве Phycomyces
blakesleeanus
која је моје ауторско дело.
Дисертацију са свим прилозима предао сам у електронском формату погодном за
трајно архивирање.
Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета
у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу
лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио.
1. Ауторство
2. Ауторство - некомерцијално
3. Ауторство – некомерцијално – без прераде
4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима
5. Ауторство – без прераде
6. Ауторство – делити под истим условима
(Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис
лиценци дат је на полеђини листа).
Потпис докторанда
У Београду, ____18.03.2013___
108
Download

metabolizam i metabolički efekti vanadijuma kod gljive